Mordecai Etal. 2019 Trad

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BREVE INFORME
Salmón salvaje en peligro de extinción

infectado por virus recién descubiertos
Gideon J Mordecai1 *, Kristina M Miller2 *, Emiliano Di Cicco2,3, Angela D Schulze2 ,
Karia H. Kaukinen2 , Tobi J Ming2, Shaorong Li2 , Amy Tabata2 , Amy Teffer4 ,
David A. Patterson5 , Hugh W. Ferguson6 , Curtis A Suttle1,7,8,9*
1Departamento de Ciencias de la Tierra, el Océano y la Atmósfera, Universidad de British

Columbia, Vancouver, Canadá; 2Estación Biológica del Pacífico, Pesca y Océanos
Canadá, Nanaimo, Canadá; 3Fundación del Salmón del Pacífico, Vancouver, Canadá;
4Departamento de Ciencias Forestales, Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Canadá;
5Fisheries and Oceans Canada, División de Ciencias, Gestión Cooperativa de Recursos
Instituto, Escuela de Recursos y Gestión Ambiental, Simon Fraser
Universidad, Burnaby, Canadá;6 Facultad de Medicina Veterinaria, St. George's
Universidad, True Blue, Granada; 7Departamento de Microbiología e Inmunología,
Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Canadá; 8Departamento de Botánica,
9 Instituto de los Océanos y
Universidad de Columbia Británica, Vancouver, Canadá;
Pesca, Universidad de British Columbia, Vancouver, Canadá
Resumen El colapso de las poblaciones icónicas clave de salmón rojo (Oncorhynchus nerka) y chinook
(Oncorhynchus tshawytscha) en el Pacífico nororiental es motivo de gran preocupación. Se cree que las
enfermedades infecciosas pueden contribuir a la disminución, pero se sabe poco sobre los virus
endémicos del salmón del Pacífico. La secuenciación metatranscriptómica y la vigilancia de salmones
Chinook cultivados muertos y moribundos revelaron un nuevo arenavirus, reovirus y nidovirus. La
*Para correspondencia: secuenciación reveló dos variantes diferentes de arenavirus, cada una de las cuales infecta al chinook salvaje
gmordecai@eoas.ubc.ca (GJM); y al salmón rojo. Arenavirus localizado por hibridación in situ principalmente en células sanguíneas. Las
Kristi.Saunders@dfo-mpo.gc.ca
encuestas de población de más de 6000 juveniles de salmón rojo y chinook salvajes mostraron distribuciones
(KMM); suttle@science.ubc.ca
divergentes de virus, lo que implica diferentes procesos epidemiológicos. El descubrimiento en salmones de
(CAS)
cultivo muertos y moribundos de virus previamente no reconocidos que también están ampliamente
Conflicto de intereses: Los distribuidos en el salmón salvaje, enfatiza el papel potencial que las enfermedades virales pueden desempeñar
autores declaran que no
en la dinámica de la población de las poblaciones de peces salvajes y la amenaza que estos virus pueden representar para
existen intereses contrapuestos.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.001
Financiamiento: Ver página 12
Recibido: 11 Abril 2019

Aceptado: 16 julio 2019
Introducción Las
Publicado: 03 septiembre 2019
especies de salmón del Pacífico (Oncorhynchus spp.) han sustentado los ecosistemas costeros y las
Editor revisor: Richard A.
poblaciones indígenas que rodean el Océano Pacífico Norte durante decenas de milenios. Hoy, a través de su
Neher, Universidad de Basilea,
historia de vida anádroma, el salmón continúa transportando nutrientes entre ambientes acuáticos y terrestres
Suiza
(Cederholm et al., 1999), suministrando las principales fuentes de alimento para orcas y leones marinos (Wasser
Derechos de autor Mardoqueo et al. Este et al., 2017; Willson y Halupka, 1995; Chasco et al., 2017; Thomas et al., 2017) y proporcionan medios de vida
el artículo se distribuye bajo los
económicos para las comunidades locales (Noakes et al., 2002). En el Pacífico nororiental, se han producido
términos de la licencia Creative
disminuciones generalizadas de salmón Chinook (O. tshawytscha) y salmón rojo (O. nerka) en los últimos 30
Commons Attribution License,
años, lo que ha llevado a algunas poblaciones al borde de la extirpación (Peterman y Dorner, 2012; Heard et al.,
que permite el uso y la
redistribución sin restricciones
2007; Miller et al., 2011; Jeffries et al., 2014), y motivo de gran preocupación para los grupos indígenas, los
siempre que se acredite el autor pescadores comerciales y recreativos y el público en general. Aunque se desconoce el número exacto de
original y la fuente. desove de salmón en los ríos, hay grandes disminuciones en el salmón rojo durante un
Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 1 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas
eLife digest Las especies clave son animales y plantas que desempeñan un papel fundamental en el
mantenimiento de los ecosistemas en los que viven, por lo que su conservación es una alta prioridad. El
chinook y el salmón rojo son dos de esas especies. Estos peces juegan un papel central en los ecosistemas
costeros del Pacífico nororiental, donde han sustentado a las poblaciones indígenas durante miles de años.
Las últimas tres décadas han visto grandes disminuciones en las poblaciones de chinook y salmón rojo.
Un factor que puede estar involucrado en estas disminuciones es la infección viral. En los últimos diez años,
los avances en las tecnologías de secuenciación del ADN han llevado al descubrimiento de muchos virus
nuevos, y Mordecai et al. utilizó estas tecnologías para buscar nuevos virus en el salmón del Pacífico.
Primero, Mardoqueo et al. buscó virus en salmones muertos y moribundos de granjas y descubrió
tres virus previamente desconocidos. A continuación, examinaron estos virus en salmón de piscifactoría,
salmón de criadero y salmón salvaje para determinar su distribución. Dos de los virus estaban presentes en
peces de las tres fuentes, mientras que uno de los virus solo se encontró en peces de piscifactoría. El hecho de
que los tres virus se distribuyan de manera diferente plantea interrogantes sobre cómo se transmiten los virus
dentro y entre las poblaciones de salmón de piscifactoría, de criadero y salvaje.
Estos hallazgos ayudarán a los esfuerzos de conservación del salmón al informar hasta qué punto estos virus
están presentes en las poblaciones de salmón salvaje. El trabajo futuro se centrará en determinar los riesgos que
estos virus representan para la salud del salmón e investigar el potencial de intercambio entre las poblaciones
de salmón de criadero, de cultivo y salvaje. Si bien el salmón del Pacífico de cultivo puede presentar algún riesgo
de transmisión a sus contrapartes silvestres, también ofrece la oportunidad de estudiar procesos de enfermedades
que no son fácilmente observables en el salmón silvestre. A su vez, dichos datos pueden usarse para desarrollar
políticas para minimizar el impacto de estos agentes infecciosos y mejorar la supervivencia de las poblaciones de salmón sa
gran área geográfica (Peterman y Dorner, 2012). De manera similar, las poblaciones de salmón Chinook se
encuentran en solo un pequeño porcentaje de sus niveles históricos, y más de 50 poblaciones están extintas (Heard et al., 20
Se cree que las enfermedades infecciosas pueden contribuir a la disminución del salmón (Miller et al., 2011),
pero se sabe poco sobre los agentes infecciosos, especialmente los virus, endémicos del salmón del Pacífico.
Las enfermedades infecciosas han sido identificadas como un factor potencial en la pobre supervivencia marina
temprana en el salmón migratorio; una respuesta inmune a los virus se ha asociado con la mortalidad en smolts
migratorios silvestres y adultos (Miller et al., 2011; Jeffries et al., 2014), y en mortalidades no especificadas de
salmón en corrales de red marinos en Columbia Británica (BC) (Miller et al., 2017; Di Cicco et al., 2018). Por
ejemplo, las respuestas inmunitarias a virus como el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV) y
virus potencialmente no descubiertos se han asociado con la mortalidad en salmones juveniles silvestres (Jeffries et al., 201
Esta es una observación importante, ya que la mortalidad de los salmones juveniles puede ser tan alta como ~90
% en la transición del agua dulce al ambiente marino (Clark et al., 2016). Juntos, estos sugieren que hay virus no
descubiertos que pueden contribuir a la disminución de la supervivencia del salmón del Pacífico, pero ha faltado
un esfuerzo concertado para buscar virus que puedan contribuir a la mortalidad.
Aquí, se implementó el descubrimiento de virus para detectar virus asociados con la mortalidad. En conjunto,
la secuenciación de salmones de acuicultura muertos o moribundos y muestras de salmón silvestre vivo, la
hibridación in situ y los estudios epidemiológicos revelaron que virus previamente desconocidos, algunos de los
cuales están asociados con enfermedades, infectan al salmón silvestre de diferentes poblaciones.
Resultados y discusión Los peces se

examinaron frente a un panel de biomarcadores de detección de enfermedades virales (VDD) que aclara un
patrón transcripcional conservado indicativo de una respuesta inmune a la infección viral de ARN activa (Miller
et al., 2017). Por ejemplo, en un estudio anterior, mostramos que el 31 % del salmón del Atlántico moribundo se
encontraba en un estado de enfermedad viral, y no se sabía que la mitad de estos fueran positivos para ningún
virus de ARN conocido (Di Cicco et al., 2018). Los individuos que eran fuertemente positivos para VDD, pero
negativos para cualquier virus del salmón conocido (p. ej., orthoreovirus de Piscine, virus de la necrosis
eritrocítica, virus de la necrosis pancreática infecciosa, virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, virus de
la anemia infecciosa del salmón y paramixovirus del salmón del Pacífico) se sometieron a secuenciación
metatranscriptómica. La secuenciación reveló transcripciones virales pertenecientes a miembros de Arenaviridae, Nidovirale

tres grupos evolutivamente divergentes de virus de ARN (Figura 1) que pueden ser altamente patógenos
Nidovirus bovino TCH5

Arenavirus del pez sapo de Wenling
! 100
100
100
1 Arenavirus del pez sapo de Wenling
2 Pescarenavirus del salmón 1 !
100
Salmón pescarenavirus 2
# 100
100
100
Virus similar al toro de Xinzhou
Torovirus hebius popei de Hainan

Morelia viridis nidovirus 100
Nidovirus 1 de la pitón bola

Virus de la serpiente del Instituto Haartman 100
Torovirus de la serpiente rata mandarina de Guangdong
virus cas 100 85
100 100 Torovirus de la serpiente de bandas rojas de Guangdong
virus de la Universidad de Giessen Torovirus de la serpiente de agua china de Guangdong
99
virus puerta de oro Bafinivirus del salmón Chinook
90 100
virus de la RUTA
100
Virus de la dorada
77
virus de la universidad de helsinki Torovirus porcino
100
Torovirus caprino
Lujo mammarenavirus 100
Virus Lunk NKS-1 100 virus de Breda
100
100
Arterivirus del tiburón fantasma de Nanhai
Coriomeningitis linfocítica mamarenavirus 100
Merino Walk mamarenavirus Arterivirus hebius popei de Hainan

100 100
99
Arterivirus del oligodón formosanus de Hainan
Okahandja mamarenavirus
Virus de la enfermedad de la zarigüeya tambaleante
Lassa mamarenavirus 100
Virus de la arteritis equina
100 99
Luna mamarenavirus
100 100 Arterivirus de la rata de bolsa africana
45
virus mopeia 98
100 Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino
100
100
Mobala mamarenavirus 69
Arterivirus de rata 1
Gairo mamarenavirus 100 Virus del mono mono del Estado Libre
44 67
100 Ippy mamarenavirus Virus del colobo rojo de Kibale 2
100 85
Mammarenavirus Mariental Virus del colobo rojo de Kibale 1
100 100 Kafue un poco chacma virus del babuino
100
Mammarenavirus del Cañón del Oso 100 100
Virus del babuino amarillo Mikumi 1 100
64 Mammarenavirus de Whitewater Arroyo
Virus del babuino del suroeste 1
40 Tamiami mamarenavirus 90
Mamarenavirus flexal virus pebjah

100 93
100 75 Virus de la fiebre hemorrágica de los simios
Proteína L [mammarenavirus paraguayo Arterivirus del mono DeBrazzas
Mamarenavirus pirital Virus de la musaraña de Olivier 1
100
51 Allpahuayo mamarenavirus Arterivirus de la tortuga de estanque de cabeza ancha china
69
100
Cali mamarenavirus Arterivirus de la serpiente verde mayor de Guangdong
100
Oliveros mamarenavirus Garza nocturna coronavirus HKU19
mamarenavirus latino 100 silbón coronavirus HKU20
Chapare mammarenavirus Polla de agua común coronavirus HKU21
100 81
100 Mammarenavirus brasileño 100
Gorrión coronavirus HKU17
82
Tacaribe mamarenavirus 100 Coronavirus porcino HKU15
100
100
Urraca-robin coronavirus HKU18
100 90 Mammarenavirus argentino 100
100
El alta del coronavirus HKU13-3514
Machupo mamarenavirus
Coronavirus de ojo blanco HKU16 100
100
Cupixi mamarenavirus 100
Zorzal coronavirus HKU12-600
67
Mammarenavirus de la Serra do Navio
Ballena beluga coronavirus SW1
Guanarito mammarenavirus 100
virus de la bronquitis infecciosa
100
Turquía coronavirus
coronavirus de eslizón de agua chino de guangdong
0.5 Betacoronavirus HKU24
100100 Conejo coronavirus HKU14

82
coronavirus bovino
"
86
coronavirus humano HKU1
100
Virus de la hepatitis murina cepa JHM
100
100 Rata coronavirus Parker
63 Betacoronavirus Erinaceus/VMC/DEU/2012
Reovirus de la carpa herbívora GCRV918 100
Betacoronavirus humano 2c EMC/2012
76
Wenling minipizza pez murciélago reovirus 1 100
Pipistrellus bate coronavirus HKU5
96,6 100
78.5
Tylonycteris murciélago coronavirus HKU4
Wenling minipizza pez murciélago reovirus 3
Murciélago coronavirus HKU9
100
Reovirus de la carpa herbívora americana Bat Hp-betacoronavirus/Zhejiang2013
73.5 100
100 Murciélago coronavirus BM48-31/BGR/2008
100
Reovirus de la carpa herbívora GZ1208 SARScoronavirus
100 97
100
Aquareovirus C Wencheng Sm musaraña coronavirus
Murciélago coronavirus HKU2
100 100
Aquareovirus chinook de otoño BtRf-AlphaCoV/YN2012
100 Reovirus del halibut del Atlántico 100
BtMr-AlphaCoV/SAX2011
coronavirus humano 229E
100
66.5
Micropterus salmoides reovirus Alfacoronavirus camello
100 100
100 Coronavirus de murciélago relacionado con NL63
Scophthalmus maximus reovirus 100
Coronavirus humano NL63
58.4 100
Etheostoma fonticola aquareovirus 63 BtNv-AlphaCoV/SC2013
58
50.4 Murciélago coronavirus 1A
Reovirus del salmón chum CS 100
100 59
Miniopterus murciélago coronavirus HKU8
100
Reovirus del salmón del Atlántico TS 100
BtRf-AlphaCoV/HuB2013
Rousettus murciélago coronavirus HKU10
Reovirus GCRV104 56
Murciélago coronavirus CDPHE15/USA/2006
100 100
Chinook Aquareovirus ! 100
Scotophilus murciélago coronavirus 512
99.2 Virus de la diarrea epidémica porcina
100
Pangasius aquareovirus hurón coronavirus
100 100
Piscine orthoreovirus Cepa de coronavirus de visón WD1127

100
Virus de la peritonitis infecciosa felina 100
Ortoreovirus de la pteropina coronavirus entérico porcino
CoronavirusAcCoV-JC34
100 ortoreovirus aviar 100
¡ Coronavirus de rata Lucheng Rn
100
100
100
Reovirus del pato real 69 Microhyla fissipes virus similar a la corona !
Nidovirus del salmón del Pacífico
ps
77.5 Reovirus del pato
Virus tipo Beihai Nido 1
98
virus de escoba Menos virus
78.6
100 virus nse &'()%*"+)*(,-.'$,% /
Ortoreovirus reptil CH1197/96 88 virus de la casuarina
99.6 100 99 virus hana
Orthoreovirus reptiliano 47/02
100
61
99
Dianke virus 100 #-0'1'"+% 2"345'+
Bush viper reovirus Virus Nam Dinh
100
Mammalian orthoreovirus
100
99
Virus cavaly
aplysia californica virus similar al nido +,)*6*7"(.'$"8'+9 :%*5'%0
Reovirus porcino SHR-A 65.6 Virus cabeza amarilla
Mammalian orthoreovirus 4 Ndelle 100
98
Virus asociado a branquias
Virus del cangrejo ermitaño de Beihai 4
;+<,(.,1(".,%
100
100 Virus tipo Wenling nido 1
Virus tipo Beihai Nido 2
0.2
0.5
Figura 1. Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en alineaciones MAFFT de la proteína replicasa predicha de (A) Pescarenavirus del salmón y arenavirus relacionados, (B)
Aquareovirus Chinook y Aqua y orthoreovirus relacionados y (C) Nidovirus del salmón del Pacífico y Nidovirales relacionados.
Las secuencias de este estudio están marcadas con un asterisco, la barra de escala representa el número de sustituciones de amino por sitio, las etiquetas de los nodos muestran el soporte
de arranque y los grupos de huéspedes se muestran por color. Los árboles tienen raíces en el punto medio, por lo que no representan necesariamente la relación ancestral de los virus.
Las alineaciones de aminoácidos se han proporcionado en los datos de origen de la Figura 1.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.003 Los
siguientes datos de origen y suplementos de figura están disponibles para la figura 1: Datos
de origen 1. Alineación de aminoácidos de Arenavirus.

DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.006 Fuente
de datos 2. Alineación de aminoácidos de nidovirus.
de datos 3. Alineación de aminoácidos de reovirus.
de datos 4. Árbol filogenético de Arenavirus.
de datos 5. Árbol filogenético de reovirus.
de datos 6. Árbol filogenético de nidovirus.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.011 Figura
suplemento 1. Organización y cobertura del genoma.
Suplemento de figura 1: datos de origen 1. Secuencias de nucleótidos genómicos virales.

(Yun y Walker, 2012; Liang et al., 2014; Weiss y Leibowitz, 2011).

Uno de los desafíos del descubrimiento viral en peces es que la proporción de transcritos virales en
bibliotecas metatranscriptómicas de vertebrados es pequeña en comparación con el número de transcritos del huésped y
otras secuencias contaminantes (Geoghegan et al., 2018; Zhang et al., 2019). Sin embargo, estábamos
capaz de lograr genomas completos de codificación cercana para los tres nuevos virus (Figura 1—suplemento
de figura 1A y B). La organización genómica de los virus recién descubiertos era consistente con
virus relacionados en peces. Por ejemplo, SPAV tiene tres segmentos genómicos, como se muestra en otros
arenanaviros en peces (Shi et al., 2018). Detección mediante RT-PCR de alto rendimiento de >6000 Chinook juveniles salvaje
y el salmón rojo mostraron distribuciones geográficas diferentes de peces infectados, lo que refleja diferencias
en los patrones epidemiológicos de transmisión y dinámica de infección para cada uno de los virus
(Figura 2).
La distribución y abundancia de los diferentes virus varió notablemente. Los arenavirus eran relativamente
comunes (Figura 2—suplemento de la figura 1) y geográficamente generalizados en los salmones chinosok y
sockeye del nilo juveniles migratorios en el ambiente marino (Figura 2, Figura 2—figura
suplemento 2). Mientras que el nidovirus se localizó espacialmente y se observó predominantemente a altas
prevalencia durante varios años en salmones Chinook que salen de criaderos de agua dulce (Figura 2). Finalmente,
el reovirus se detectó solo en salmón Chinook de piscifactoría (Figura 2 y Figura 2—suplemento de figura 1).
Con la excepción de su descubrimiento relativamente reciente en serpientes (Stenglein et al., 2012) y peces
sapo (Shi et al., 2018), se pensaba que los arenavirus solo infectaban a los mamíferos. los arenavirus
informados aquí comparten menos del 15% de similitud de secuencia de aminoácidos (en el RdRp) con los de
mamíferos y serpientes, y definen un nuevo grupo evolutivo monofilético, los pescarenavirus
(Figura 1A). La ausencia de una clara homología de secuencia en la glicoproteína, la diferencia en el genoma
segmentación (Shi et al., 2018), así como el análisis filogenético de la replicasa demuestran que
Los pescarenavirus comparten un ancestro común pero antiguo con los arenavirus que infectan a serpientes y
mamíferos. Recomendamos que estos arenavirus que infectan a los peces se asignen al nuevo género
Pescarenavi rus, mientras que los que infectan al salmón Chinook y al salmón rojo se asignen a la especie Salmon
pescarenavirus (SPAV), cepas 1 y 2, respectivamente.
El salmón Chinook de cultivo positivo para SPAV-1 mostró patología y síntomas consistentes con
enfermedad que incluye inflamación del bazo y el hígado, así como necrosis de túbulos e hiperplasia en
el riñón. Clínicamente, el salmón se presentó con líquido amarillo en el ciego pilórico y la vejiga natatoria,
branquias pálidas con hemorragia en la superficie y anemia. Chinook salvaje y salmón rojo que probaron
positivos para infección por arenavirus, pero que estaban clínicamente sanos cuando fueron muestreados,
mostraron pocas lesiones histológicas. La hibridación in situ reveló que los arenavirus se concentraron
principalmente en células similares a macrófagos, melanomacrófagos, glóbulos rojos (RBC) y endoteliocitos (Figura 3). Esta
Los hallazgos son consistentes con la localización de arenavirus en mamíferos y serpientes, aunque en contraste
a las serpientes y los peces, los glóbulos rojos de los mamíferos no están nucleados, por lo que la similitud probablemente solo se extienda
a las células nucleadas. SPAV-1 y 2 compartieron tropismo celular similar dentro de Chinook y salmón rojo,
respectivamente (Figura 3—suplemento de figura 1). En una de las ocho muestras de Chinook examinadas,
se informó hepatitis crónica activa moderada y se identificó tinción para SPAV-1 en el área
afectado por la inflamación (Figura 3C y D), mientras que en las otras muestras SPAV-1 se limitó a
células reticuloendoteliales en el tejido hepático o en los sinusoides. Se observaron más lesiones en muertos
Chinook de granja, donde la progresión de la enfermedad es más avanzada. Nuestras observaciones indican que
los arenavirus se replican en los glóbulos rojos y ocurren en los macrófagos y leucocitos que consumen las
células infectadas. Además, los cambios patológicos observados en peces infectados con arenavirus,
incluyendo anemia, y se esperarían lesiones en las branquias, los riñones y el hígado para los virus que infectan
las células rojas de la sangre. Estos resultados son la primera evidencia empírica de infección por arenavirus en
peces y sugieren que el SPAV, como muchos otros arenavirus, tiene el potencial de ser un agente causante de la enfermeda
La secuenciación del salmón Chinook cultivado también reveló un nidovirus y un reovirus no descritos
previamente. El análisis filogenético del reovirus, llamado Chinook aquareovirus (CAV), predice que es
parte del género Aquareovirus (Figura 1B). En lugar de estar más estrechamente relacionados con los reovirus
conocidos del salmón (Winton et al., 1981), los grupos CAV con un número creciente de aquareovirus, algunos
de los cuales se sabe que causan enfermedades hemorrágicas y han provocado graves pérdidas a la acuicultura en
China (Nibert y Duncan, 2013; Wang et al., 2012). Los signos clínicos observados (anemia, oscuridad
bazo y riñones llenos de sangre) en salmones Chinook de piscifactoría muertos con altas cargas de CAV son
consistentes con una manifestación hemorrágica.

Figura 2. Mapas epidemiológicos de pescarenavirus 1 y 2 del salmón (SPAV-1 y SPAV-2), aquareovirus Chinook (CAV) y nidovirus del salmón del Pacífico (PsNV) en
la costa de la isla de Vancouver. Las muestras individuales se muestran en el lugar donde se recolectaron, las muestras negativas son negras y las muestras positivas se
colorean y clasifican según el número de copias del virus. Se agregó un pequeño grado de ruido aleatorio a la longitud y la latitud para evitar el trazado excesivo.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.012 Los

siguientes datos de origen y suplementos de figura están disponibles para la figura 2:
Datos de origen 1. Datos de origen (número de copia de RT-PCR y lugares de muestreo) para los mapas epidemiológicos.
Figura suplemento 1. Resumen de RT-PCR para SPAV-1 y 2, PsNV y CAV utilizando la plataforma Biomark Fluidigm.
Figura suplemento 2. Mapas epidemiológicos de Washington a Alaska de Salmon pescarenavirus 1 y 2 (SPAV-1 y SPAV-2).
El nuevo nidovirus, llamado nidovirus del salmón del Pacífico (PsNV), está más estrechamente relacionado
con el microhyla alphaletovirus 1 descrito recientemente, que forma un grupo hermano de los coronavirus
(Bukhari et al., 2018). Esta secuencia, junto con PsNV, son basales para todas las demás familias de Nidovirus, y
su larga longitud de rama sugiere que cada uno pertenece a un género diferente (Figura 1C). Si bien no todos los
coronavirus causan enfermedades graves, muchos sí lo hacen, como el SARS y el MERS, que causan infecciones
respiratorias graves (de Wit et al., 2016).
Tanto el SPAV-1 como el SPAV-2 estaban relativamente extendidos a lo largo de la costa del suroeste de la
Columbia Británica, en el salmón chinook y el salmón rojo capturados en el océano. Actualmente, no está claro
qué está impulsando las diferencias en la prevalencia de SPAV-1 y SPAV-2 entre las regiones, pero el virus
parece transmitirse a los salmones juveniles en todo el sur de Columbia Británica poco después de que ingresan
al océano, un período conocido por ser crítico para su salud. supervivencia (Beamish et al., 2012a). SPAV-1
también fue relativamente común en las poblaciones de Chinook cultivadas. La distribución de SPAV-1 en las poblaciones d

! "
# ps
% &
Figura 3. Tinción de hibridación in situ de SPAV-1 en salmón Chinook. La mancha roja indica la localización del ARN viral así como las transcripciones virales. (A)
Bazo: tinción mayormente localizada en los macrófagos (flechas) ubicados alrededor de los sinusoides, aunque eritrocitos positivos dispersos (puntas de flecha)
también están presentes (barra de escala 50 mm). (B) Riñón posterior: el virus parece localizarse principalmente en los capilares peritubulares (vasos portales renales) y
macrófagos (flechas) (barra de escala 100 mm). (C) Hígado: los nódulos de inflamación se concentran principalmente en un área muy marcada. (barra de escala 100 mm),
el rectángulo punteado está ampliado en (D) y muestra linfocitos y macrófagos en el nódulo inflamatorio (varios de los cuales son positivos para el virus).
Figura 3 continúa en la página siguiente

Figura 3 continuación
(barra de escala 20 mm). (E) Corazón: hay macrófagos positivos (flechas) entre las fibras del miocardio esponjoso, junto con varios rojos positivos
células sanguíneas (punta de flecha) y células endoteliales (puntas de flecha abiertas). (barra de escala 100 mm). (F) Intestino: la tinción para SPAV-1 se localiza principalmente en el
tejido linfoide asociado al intestino (flechas). (barra de escala 100 mm).
El siguiente suplemento de figura está disponible para la figura 3:
Figura suplemento 1. Tinción de hibridación in situ de SPAV-2 en salmón rojo.

costa oeste de la isla de Vancouver que SPAV-2, que fue más frecuente en la costa este de la isla de Vancouver, cerca de las
islas Discovery y el estrecho de Johnstone, y rara vez se detectó en el salmón rojo
salmón en el norte de BC y Alaska (Figura 2—suplemento de figura 2).
En la costa este de la isla de Vancouver, el estrecho de Johnstone y las islas Discovery han sido identificados como un
cuello de botella potencial para el crecimiento y la supervivencia de los salmónidos juveniles (Healy et al.,
2017). La disponibilidad de presas para el salmón rojo juvenil en el norte del Estrecho de Johnstone es extremadamente baja,
lo que resulta en una limitación de alimentos y una mayor competencia por las presas (Beamish et al., 2012a;
McKinnell et al., 2014; Godwin et al., 2015; Godwin et al., 2018). Estas regiones de alta SPAV-2
infección podría representar una parte estresante de la emigración de salmón rojo juvenil, lo que posiblemente resulte en
mayor susceptibilidad a la infección. Además, SPAV-2 se detectó en cargas altas en peces muestreados de
regiones donde las instalaciones de acuicultura de peces son abundantes y, en consecuencia, la infestación de piojos de mar es alta
(Price et al., 2011]. Sigue siendo una pregunta abierta si un huésped alternativo podría desempeñar un papel en el virus .
transmisión entre peces, y/o resultar en una mayor susceptibilidad a la infección (Valdés Donoso et al., 2013).
La distribución de CAV fue marcadamente diferente de SPAV. No se detectó CAV en ningún juvenil.
salmón Chinook salvaje o de criadero, a pesar de ser detectado en peces de cultivo tanto en el oeste como en el este
costas de la isla de Vancouver. Más del 20% de los peces de acuicultura Chinook moribundos dieron positivo para CAV,
con la mayoría de las detecciones ocurriendo en peces al menos 1,5 años después de la entrada al océano, mucho más allá del momento en que
Se muestrearon salmones migratorios. Por lo tanto, la infección por CAV puede tardar un tiempo considerable en desarrollarse,
o ser una infección que solo adquieren los peces mayores. CAV también se detectó en un pequeño número de
salmón del Atlántico de piscifactoría (siete detecciones positivas de 2816 peces analizados). La agrupación monofilética
de CAV con otras enfermedades que causan aquareovirus y la consistencia con la enfermedad hemorrágica
sugieren que es importante monitorear el virus en peces cultivados y potencialmente en adultos silvestres que regresan
después de varios años en el mar.
La distribución de PsNV estuvo fuertemente asociada con un puñado de criaderos de mejoramiento de salmón, pero
también se detectó en el 18 % de los Chinook de acuicultura y en el 3 % de los Chinook silvestres (Figura 2—suplemento de la
figura 1). En los peces de criadero, la infección por PsNV se localizó principalmente en el tejido branquial (Figura 4A), lo que
recuerda a la enfermedad respiratoria causada por los coronavirus de mamíferos relacionados, como MERS y
SRAS (Figura 1C). PsNV es de particular preocupación ya que prolifera mientras los peces se someten a smoltifi cation, un
proceso durante el cual el tejido branquial se somete a una reconfiguración celular para prepararse para el agua salada. En
particular, se observó proliferación branquial sin causa conocida en algunos salmones de cultivo.
infectados con PsNV. En uno de los criaderos, donde se realizó el muestreo previo y posterior a la liberación, el
el virus aumentó en prevalencia durante el desarrollo de smolt en agua dulce, se detectó poco después de la liberación y
apenas se detectó en el mes posterior a la entrada al océano (Figura 4B). Esto sugiere que
los peces infectados eliminaron la infección o no sobrevivieron después de ingresar al medio marino.
La segunda interpretación es consistente con las tasas más bajas de supervivencia en el océano en los peces producidos a partir de
criaderos versus salmón salvaje (Beamish et al., 2012b).
Las enfermedades virales son una amenaza potencial para las poblaciones de peces silvestres; sin embargo, se sabe poco sobre los virus que circulan en
salmón salvaje, de piscifactoría o de criadero. Aquí, a través de encuestas metatranscriptómicas, revelamos varios virus
previamente desconocidos que se descubrieron en peces de acuicultura muertos y moribundos, y se los mostramos a
también ocurren en peces silvestres y criados en criaderos. Dependiendo de la especie viral y huésped, los virus
van desde ser localizado hasta generalizado, desde infectar <1% a >20% de los peces, y ser de
dentro de los límites de detección a cargas muy altas. Nuestros resultados son consistentes con algunos de estos virus.
siendo agentes causantes de enfermedades, por lo que es fundamental comprender sus posibles roles en la mortalidad del
salmón y la disminución de las poblaciones de salmón salvaje, y sus posibles interacciones con los peces de redil
cría en granjas y criaderos. Descubrimiento viral en individuos moribundos seguido de extensa

•
•
Muestra
4000
• • C0308
• • C0309
• C0310
• • C0311
•
• • C0312
• • • C0313
• • C0314
2000 ••
• C0315
•
•
• • Control negativo
•
• •
•
•
•
• • • •• •
•• • •
• • •• •• • • •• •••
•
•
0 •• • • •••• •••• ••• ••• ••••• • • •
Vacío Cerebro Branquia Corazón Riñón Hígado

Tejido
52
Ambiente
75 agua dulce
Agua de mar
58
50 97
164
4
25
194 147
149 25 39
35
52
0
2013ÿ04 2013ÿ05 2013ÿ06 2014ÿ04 2014ÿ05 2014ÿ06 2015ÿ04 2015ÿ05 2015ÿ06 2016ÿ04 2016ÿ05 2016ÿ06
Fecha (añoÿmes)
Figura 4. Localización y detecciones de nidovirus del salmón del Pacífico en un solo criadero de mejoramiento de salmón. (A)
Cantidad relativa promedio de nidovirus del salmón del Pacífico en tejidos disecados de ocho Chinook. Cada muestra se corrió y graficó
por duplicado. (B) Prevalencia del nidovirus del salmón del Pacífico en peces recolectados en agua dulce y salada en un solo criadero
de mejoramiento de salmón durante cuatro años. Los datos mostrados son la prevalencia de amplificaciones positivas por encima del
límite de detección calculado (95%). Los números muestran el tamaño de la muestra y las barras de error muestran los intervalos de
confianza binomiales de Wilson.
la vigilancia y la localización histopatológica son herramientas poderosas hacia los objetivos finales de
identificar los agentes causantes de enfermedades y comprender el impacto de los agentes infecciosos en
las poblaciones silvestres. Estos conocimientos son cruciales, ya que se espera que los salmones juveniles
que no tienen una salud óptima tengan tasas más bajas de supervivencia en la naturaleza. La vigilancia
continua y el conocimiento de las infecciones virales endémicas y emergentes en estas especies icónicas de salmón es

materiales y métodos
Extracciones de ácidos nucleicos
Las muestras fueron proporcionadas por Fisheries and Oceans, Canada Aquaculture Management Division
y Programa de Mejora del Salmón. El Programa de Salmón del Nilo Juve del Instituto Hakai recolectó muestras
adicionales. Las muestras de criadero se identifican mediante el corte de aletas y, en este estudio, los peces silvestres
también podría incluir peces de criadero sin marcar. El ADN se extrae para la detección de virus de ADN, bacterias y
parásitos de los mismos tejidos de los que extraemos el ARN para detectar los virus de ARN. Nucleico
extracciones de ácido en las muestras de auditoría (ocho tejidos: branquias, aurícula, ventrículo, hígado, ciego pilórico, bazo,
riñón de cabeza y riñón posterior) fueron como se describió anteriormente (Laurin et al., 2019). por lo salvaje
Muestras de chinook y salmón rojo, la homogeneización con Tri-reactivo se realizó en un molino mezclador
(Qiagen, Maryland) en cada tejido de forma independiente (cinco tejidos: branquias, hígado, corazón, cabeza, riñón y
cerebro). Los homogeneizados de tres reactivos se separaron orgánicamente utilizando bromocloropropano, con la
Eliminación de la capa acuosa que contiene ARN para la extracción de ARN y la capa orgánica inferior que contiene ADN
capa separada de los orgánicos usando un TNES-Urea Buffer (Asahida et al., 1996).
Para las extracciones de ADN, se procesó el ADN de una mezcla de 250 ml (5 tejidos que contribuyeron con 50 ml
cada uno) de cada una de las capas acuosas de tejido TNES utilizando el kit BioSprint 96 DNA Blood (Qiagen,
Maryland) y el instrumento BioSprint 96 (Qiagen, Maryland), ambos basados en las instrucciones del fabricante. El
ADN se cuantificó utilizando lecturas de espectrofotómetro realizadas en el Infinite M200Pro
espectrofotómetro (Tecan Group Ltd., Suiza) y normalizado a 62,5 ng/ml usando el Freedom
Unidad de manejo de líquidos Evo (Tecan Group Ltd., Suiza), según las instrucciones del fabricante.
De igual forma, se procesó un pool de 100 ml (5 tejidos aportando 20 ul cada uno) de la capa acuosa.
para ARN utilizando el kit Magmax96 for Microarrays RNA (Ambion Inc, Austin, TX, EE. UU.) con un Biomek
Instrumento automatizado de manejo de líquidos NXP (Beckman-Coulter, Mississauga, ON, Canadá), ambos
basado en las instrucciones del fabricante. La cantidad de ARN se analizó mediante espectrofotómetro.
lecturas y normalizado a 62,5 ng/ml con un instrumento automatizado de manipulación de líquidos Biomek NXP
(Beckman-Coulter, Mississauga, ON, Canadá), según las instrucciones del fabricante. ARN de tejido mixto
(1 mg) se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de mezcla maestra VILO en superíndice (Invitrogen,
Carlsbad, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Secuenciación metatranscriptómica
Aplicamos un panel de biomarcadores del huésped (genes) que, cuando se expresan conjuntamente, son indicativos
de un estado de enfermedad viral (VDD) (Miller et al., 2017). Muestras que mostraron un estado de enfermedad viral positivo, pero f
no positivo para virus según nuestro panel de detección de 45 microbios (como se describe en Bass et al.,
2019), fueron seleccionados para la secuenciación de alto rendimiento de ARN (doble RNA-seq) para descubrir nuevos virus
agentes
Se evaluó la calidad del ARN total de las muestras mixtas de tejido utilizando el chip Total RNA Pico
en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA) y cuantificado con el kit Qubit RNA Br
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añadió una dilución 1/100 de la mezcla de control 1 de Spike-In de ARN de ERCC
(Ambion, Carlsbad, CA) a cada muestra de ARN total antes del agotamiento ribosomal y la preparación de la biblioteca.
Las bibliotecas de secuenciación y la eliminación de ribosomas se realizaron con Epicenter ScriptSeq
Complete Gold Kit (Epidemiology) (Illumina, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incluía
un control positivo (Universal Human Reference RNA) (Agilent, Santa Clara, CA)
y control negativo (sin ARN total). El ARN total empobrecido en rRNA se purificó usando el Zymo
Kit RNA Clean and Concentrate-5 (Zymo Research, Irvine, CA) según las instrucciones del fabricante y cuantificado
usando el kit Qubit RNA HS (Invitrogen, Carlsbad, CA). El índice de ScriptSeq
Se añadieron cebadores inversos al ADNc durante el paso final de amplificación, que involucró 14
ciclos El cDNA marcado en el terminal 3' y la biblioteca amplificada final se purificaron usando el Agencourt
Sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA). El tamaño final de la biblioteca se determinó utilizando el HS
chip de ADN en el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent, Santa Clara, CA) y la concentración fue
determinado utilizando el kit Qubit dsDNA HS (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las bibliotecas de muestras se normalizaron
a 4 nM, se agruparon adecuadamente y se desnaturalizaron y diluyeron para obtener una biblioteca final de 17 pM. Previo
a la carga en un kit v3 de 2 300 pb (Illumina, San Diego, CA), se incorporó un 2 % de phiX. Finalmente, se
Se realizó un ciclo de secuenciación de 251 pb de extremos emparejados en el sistema Illumina MiSeq (Illumina, San
Diego, CA), con cuatro muestras con código de barras y agrupadas para cada ejecución.

Para secuenciar SPAV-2, PsNV y CAV, las muestras se prepararon con el mismo método que el anterior,
pero la BC Cancer Agency las secuenció con un protocolo HiSeq (2 125) (cuatro muestras diferentes
indexadas en un carril).
Análisis de secuencias La
calidad de las lecturas sin procesar se verificó mediante FASTQC (v0.11.7) (https://www.bioinformatics.bab
raham.ac.uk/projects/fastqc/). Las lecturas de baja calidad o las regiones de las secuencias del adaptador
se eliminaron con Trimmomatic (v0.36) (Bankevich et al., 2012). Las lecturas se alinearon con el genoma
del salmón del Atlántico mediante bwa mem (v0.7.17-r1188) y se conservaron las lecturas no mapeadas.
Las lecturas no asignadas se equilibraron luego con Trimmomatic y se ensamblaron en contigs con el
ensamblador de genoma SPAdes (v3.9.1) (Bankevich et al., 2012). Los contigs virales putativos se
identificaron alineando los contigs traducidos usando DIAMOND (v0.9.16.117) (Buchfink et al., 2015) a la
base de datos nr. Se usaron alineaciones de referencia de todas las lecturas de los cóntigos virales para
garantizar que no se produjeran artefactos de ensamblaje y que los cóntigos se recortaran adecuadamente
con Geneious (V10.1.3). Las secuencias ensambladas están disponibles en Genbank (BioProject:
PRJNA547678, números de acceso de Genbank: MK611979 - MK611996) y las lecturas de secuenciación
sin procesar se han cargado en Sequence Read Archive (SAMN11974798 - SAMN11974801).
Análisis filogenético La
filogenia de cada virus se resolvió en función de las secuencias de aminoácidos de replicasa (CAV y SPAV)
y ORF1ab (PsNV) predichas, ya que las secuencias de nucleótidos eran demasiado diferentes para alinearse de mane
Las alineaciones se generaron con MAFTT (v7.42) (Katoh y Standley, 2013) empleando el algoritmo E-INS-
i. Este algoritmo de alineación es adecuado para secuencias evolutivamente distintas con motivos
conservados (como la polimerasa de ARN viral) que están incrustados en residuos largos que no se
pueden alinear. Los nuevos virus del salmón se alinearon con otros genomas virales con similitud de
aminoácidos compartidos según lo detectado por DIAMOND (Buchfink et al., 2015). Además, se incluyeron
genomas virales que se sabe que están relacionados evolutivamente con estos. Luego, las múltiples
alineaciones de proteínas se usaron para construir filogenias usando el complemento PhyML 3.0 (Guindon
et al., 2010) dentro de Geneious con 100 correas de arranque para generar valores de soporte de rama. Los
árboles tienen raíces en el punto medio solo para mayor claridad y no representan necesariamente la relación ancest
Desarrollo y cribado de ensayos Se importaron

contigs de secuencias virales ensambladas de la muestra adecuada al software Primer Express v3.0.1
(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) donde se diseñaron ensayos de qPCR Taqman utilizando
parámetros predeterminados (archivo complementario 1). Luego, estos ensayos se probaron con el
sistema qPCR basado en microfluidos Fluidigm BioMark siguiendo el mismo protocolo que se describe a
continuación, excepto con los nuevos pares de cebadores virales incluidos en el paso STA y los controles.
A partir de estas pantallas iniciales, se eligió el ensayo más consistente y se construyeron estándares de
APC para incluirlos en futuros paneles de microbios Fluidigm BioMark qPCR. El límite teórico de detección
específico del ensayo se calculó como se describió anteriormente (Miller et al., 2016). El límite de detección
se aplicó para categorizar peces con amplificaciones por encima del umbral de detección del 95 %, que es
la concentración del analito en la matriz de la muestra que se detectaría con alta certeza estadística (95 %
del tiempo). Se generaron mapas epidemiológicos a partir de estos datos con el límite de detección aplicado.
Los mapas se crearon dentro de R utilizando ggplot2 (Wickham, 2016) y ggmap (Kahle y Wickham, 2013).
RT-PCR
Para todas las muestras, después de la transcripción inversa, el ADNc resultante se combinó con el ADN
normalizado en una proporción de 1:1 y se usó como molde para el paso de amplificación de diana
específica (STA). El STA implica una preamplificación de todos los cebadores que se ejecutarán en una
sola matriz dinámica a bajas concentraciones (0,2 mM de cada uno de los cebadores) y, al finalizar, se
eliminó el exceso de cebadores tratándolos con Exo-SAP-IT (Affymetrix, Santa Clara, CA) de acuerdo con
las instrucciones del fabricante y luego diluido 1:5 en tampón de resuspensión de ADN (Teknova, Hollister, CA).
La matriz dinámica de expresión génica 96.96 (Fluidigm Corporation, CA, EE. UU.) se ejecutó de acuerdo
con el procedimiento descrito anteriormente (Miller et al., 2016). Específicamente, se utilizó una mezcla molde de 5 m

preparado para cada muestra que contiene 1 TaqMan Universal Master Mix (sin UNG), 1 muestra GE
Reactivo de carga (Fluidigm PN 85000746) y cada una de las mezclas de muestras diluidas en STA. cinco ml de
La mezcla de ensayo se preparó con 1 de cada uno de los ensayos TaqMan qPCR apropiados (sonda de agente en
FAM-MGB y sonda de construcción positiva artificial (APC) en NED-MGB, 10 mM de cebadores y 3 mM de
sondas) y 1 reactivo de carga de ensayo (Fluidigm PN 85000736).
Se agregaron controles antes de ejecutar la matriz dinámica (Miller et al., 2016). Nota, clones de APC
a todos los ensayos estaban contenidos en un solo grupo diluido en serie, cargado en último lugar, lo que minimiza la probabilidad de
contaminación de cualquier clon único de APC. Una vez que se completaron la carga y la mezcla de la matriz dinámica
dentro del controlador IFC HX, la matriz se transfirió al instrumento BioMark HD y
procesado utilizando el programa GE 96 96 Standard TaqMan para qPCR que incluye un inicio en caliente seguido de 40
ciclos a 95 ÿC durante 15 s y 60 ÿC durante 1 min (Fluidigm Corporation, CA, EE. UU.). Los datos
se analizaron con el software de análisis de PCR en tiempo real (Fluidigm Corporation, CA, EE. UU.).
Las muestras de smolt de Chinook positivas para PsNV de 2014 se utilizaron para la localización de tejidos (Figura 4A).
Las branquias, el hígado, el corazón, el riñón y el cerebro se homogeneizaron individualmente, se procesaron para la extracción de ARN (como
descrito anteriormente), y se usó 1 ug de ARN normalizado para la transcripción inversa. ADNc resultante para
cada tejido individual se usó como plantilla para la cuantificación relativa de PsNV usando un ABI 7900HT
(ABI) en placas ópticas de 384 pocillos. El volumen de reacción de qPCR fue de 12 ml, que comprendía 6 ml de 2X
Mezcla maestra de expresión génica TaqMan (ABI PN 4369016), 4,3 ml de agua, 0,22 ml de mezcla directa
y cebadores inversos (concentración final de 900 nM de cada uno), 0,24 ml de cada sonda (concentración final de 200 nM;
sonda específica de ensayo y sonda de control de APC) y 1 ml de molde de ADNc. La temperatura
los ciclos incluyeron una retención de 2 min (50 ÿC), una desnaturalización de 10 min (95 ÿC) y 40 ciclos de desnaturalización
(95ÿC por 15 s), recocido y extensión (60ÿC por 60 s). Condiciones de amplificación en el ABI 7900
no estaban optimizados para esta plataforma, sino que reflejaban fielmente los utilizados en la plataforma BioMark. Las
muestras analizadas en ABI no se sometieron a enriquecimiento STA. Se construyeron curvas estándar
utilizando los mismos estándares de clones de APC añadidos con CHSE DNA que en BioMark. diluciones en serie
se realizaron para obtener concentraciones de 24, 1.2 102, 6 102, 3 103, 1.5 104, 1.5 105 copias
del clon por reacción. Estándares de clones, muestras desconocidas, controles positivos y negativos fueron
todos se ejecutan por duplicado. El software ABI calcula el número relativo de copias en función de la dilución en serie de
la curva estándar.
Histopatología
Antes del descubrimiento de estos virus, los signos clínicos de enfermedad y las lesiones histopatológicas eran
evaluado para aproximadamente 230 salmones Chinook de cultivo muestreados en el programa de Auditoría. En
consecuencia, branquias, músculo esquelético, bazo, hígado, corazón, riñón anterior y posterior, ciego pilórico y
cerebro de once muestras de Chinook (ocho peces salvajes y tres peces de piscifactoría) y diez salmones (todos
peces silvestres) positivos para SPAV fueron analizados histopatológicamente para evaluar la presencia de lesiones. Todos
Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se deshidrataron a través de un gradiente ascendente de
soluciones alcohólicas, embebidas en parafina, cortadas a 3,5 mm de espesor y teñidas con hematoxilina y eosina (H y E)
de rutina para evaluación morfológica al microscopio óptico.
Hibridación in situ (ISH)

RNA-ISH se realizó utilizando el ensayo RNAscope 2.5 HD Duplex (Advanced Cell Diagnostics, Newark,
California, EE. UU., catálogo n.° 322500) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, consecutivo
secciones de muestras de salmón Chinook y sockeye utilizadas para el análisis histopatológico fueron
se desparafinaron incubando durante 60 min a 60 °C y las peroxidasas endógenas se inactivaron con peróxido de hidrógeno
durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se hirvieron durante 30 minutos en reactivos de
recuperación de objetivos de RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Newark, California, EE. UU.) y se incubaron durante 30 minutos.
min en el reactivo RNAscope Protease Plus antes de la hibridación. Los portaobjetos se hibridaron
con sondas RNAscope contra una porción del genoma de SPAV-1 y SPAV-2 (Advanced Cell Diagnostics, Newark, California,
EE. UU., catálogo #513591-C2 y 538881-C2, respectivamente). Una sonda RNAscope
contra el gen doméstico Coil-p84 en salmón Chinook (Advanced Cell Diagnostics, Newark, California, EE. UU., catálogo n.°
512391) se utilizó como sonda de control positivo para confirmar la eficacia del
sondas y la viabilidad de las muestras. Dos muestras negativas para SPAV-1 y SPAV-2
se usaron como controles negativos para confirmar la ausencia de fondo y (o) cruce no específico

reactividad del ensayo. La amplificación de la señal se realizó de acuerdo con las instrucciones del
fabricante, seguida de una contratinción con hematoxilina de Gill y visualización mediante microscopía
de campo brillante.
Agradecimientos
Agradecemos a Jeffrey Joy, Veronica Paglowski, Jan Finke, Thomas Waltzek, Ben Neuman y Humberto Debat por sus consejos y
ayuda con el análisis, a la División de Manejo de Acuicultura del DFO, al Programa de Mejoramiento del Salmón y al Programa de
Salmón Juvenil del Instituto Hakai por el suministro de muestras y a todos el barco y las tripulaciones de campo que recolectaron
las miles de muestras. Agradecemos a Amy Chan y a todos los miembros del laboratorio Suttle por sus comentarios a medida
que se desarrollaba el proyecto. Esta investigación fue apoyada por fondos para la Iniciativa Estratégica de Salud del Salmón
(SSHI, por sus siglas en inglés), que es parte del Proyecto de Supervivencia Marina del Mar de Salish. El SSHI busca descubrir los
microbios presentes en el salmón de la Columbia Británica que pueden estar socavando la productividad del salmón del Pacífico
y está financiado por la Pacific Salmon Foundation (PSF), Genome British Columbia y Fisheries and Oceans, Canadá. Esta es la
publicación número 32 del Proyecto de Supervivencia Marina del Mar de Salish (marinesurvivalproject.com).
Información Adicional
Fondos
financiador Número de referencia de la subvención Autor
Fundación Salmón del Pacífico sshi Gedeón J Mardoqueo

kristina molinero
Emiliano Di Cicco
Ángela D. Schulze
Karia H. Kaukinen
Tobi J Ming
Shaorong Li
amy tabata
amy tefer
Genoma Columbia Británica sshi Gedeón J Mardoqueo

kristina molinero
Emiliano Di Cicco
Ángela D. Schulze
Karia H. Kaukinen
Tobi J Ming
Shaorong Li
amy tabata
amy tefer
Mitacs sshi Gedeón J Mardoqueo
Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de
datos, o la decisión de enviar el trabajo para su publicación.
Contribuciones de autor
Gideon J Mordecai, Conceptualización, Análisis formal, Investigación, Visualización, Metodología,
Redacción—borrador original, Redacción—revisión y edición, Dirigió los análisis y preparó las cifras;
Kristina M Miller, Conceptualización, Recursos, Supervisión, Adquisición de fondos, Investigación,
Administración del proyecto, Redacción—revisión y edición, Concepción del estudio; Emiliano Di Cicco,
Análisis formal, Investigación, Redacción—borrador original, Patología conducida, histopatología e
hibridación in situ; Angela D Schulze, Investigación, Metodología, Secuenciación realizada, extracciones
de ácidos nucleicos y análisis moleculares; Karia H Kaukinen, Investigación, Metodología, Muestreo de
campo realizado, extracciones de ácidos nucleicos y análisis moleculares, incluida la localización de tejidos por R
Tobi J Ming, Investigación, Metodología, Muestreo de campo realizado, extracciones de ácidos nucleicos
y análisis moleculares; Shaorong Li, Curación de datos, Investigación, Metodología, Extracciones de
ácido nucleico realizadas y análisis moleculares; Amy Tabata, conservación de datos, muestreo de
campo realizado, extracciones de ácidos nucleicos y análisis moleculares; Amy Teffer, Investigación, Redacción—
Realización de muestreos de campo, extracciones de ácidos nucleicos y análisis moleculares; david a patterson,

Conceptualización, investigación, redacción: revisión y edición, muestreo de campo realizado, extracciones de

ácidos nucleicos y análisis moleculares; Hugh W Ferguson, Investigación, Redacción—revisión y edición,
Patología conducida, histopatología e hibridación in situ; Curtis A Suttle, Recursos
Supervisión, Redacción—revisión y edición, Concepción del estudio
Autor ORCID
Gedeón J Mardoqueo https://orcid.org/0000-0001-8397-9194 Curtis A Suttle

https://orcid.org/0000-0002-0372-0033
Carta de decisión y respuesta del autor

Carta de decisión https://doi.org/10.7554/eLife.47615.061
Respuesta del autor https://doi.org/10.7554/eLife.47615.062
Archivos adicionales
Archivos complementarios .
Archivo complementario 1. Tabla de cebadores y ensayos taqman utilizados en este estudio.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.019 .
Archivo complementario 2. Comandos utilizados en la canalización bioinformática.
DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615.020 .
Formulario de reporte transparente DOI: https://

doi.org/10.7554/eLife.47615.021
Disponibilidad de
datos Los genomas virales ensamblados se depositaron en Genbank con los números de acceso MK611979–
MK611996 y las lecturas de secuenciación se enviaron al Sequence Read Archive con el acceso: PRJNA547678.
Se generaron los siguientes conjuntos de datos:
base de datos y
Autor(es) Año Título del conjunto de datos URL del conjunto de datos identificador
Gedeón J Mardoqueo, 2019 Salmón salvaje en peligro de extinción https://www.ncbi.nlm. Lectura de secuencia NCBI
kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/sra/PRJNA547678 Archivo,
Emiliano Di Cicco, _ PRJNA547678
Ángela D. Schulze,
Karia H. Kaukinen,
tobi j ming,
Shaorong Li, Amy
Tábata, Amy Teffer,
david a patterson,
Hugh W. Ferguson,
Curtis A Suttle
Gedeón J Mardoqueo, 2019 Salmón salvaje en peligro de extinción https://www.ncbi.nlm. Banco de generación del NCBI,
kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nucore/?term= MK611979

Emiliano Di Cicco, MK611979
Ángela D. Schulze,
Karia H. Kaukinen,
tobi j ming,
Shaorong Li, Amy
david a patterson,
Hugh W. Ferguson,
Curtis A Suttle
kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611980

Ángela D. Schulze,
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Curtis A Suttle
infectado por virus recién descubiertos MK611987

kristina m miller, nih.gov/nucore/?term=


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tobi j ming,
Shaorong Li, Amy
david a patterson,
Hugh W. Ferguson,
Curtis A Suttle

Ángela D. Schulze,
Karia H. Kaukinen,
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Salmón salvaje en peligro de extinción

1Departamento de Ciencias de la Tierra, el Océano y la Atmósfera, Universidad de British

Recibido: 11 Abril 2019

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 1 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Resultados y discusión Los peces se

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 2 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Nidovirus bovino TCH5

Torovirus hebius popei de Hainan

Nidovirus 1 de la pitón bola

Merino Walk mamarenavirus Arterivirus hebius popei de Hainan

Mamarenavirus flexal virus pebjah

100100 Conejo coronavirus HKU14

Piscine orthoreovirus Cepa de coronavirus de visón WD1127

de origen 1. Alineación de aminoácidos de Arenavirus.

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 3 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

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Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 4 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

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Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 5 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 6 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Figura suplemento 1. Tinción de hibridación in situ de SPAV-2 en salmón rojo.

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 7 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Vacío Cerebro Branquia Corazón Riñón Hígado

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 8 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 9 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Desarrollo y cribado de ensayos Se importaron

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 10 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Hibridación in situ (ISH)

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 11 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Fundación Salmón del Pacífico sshi Gedeón J Mardoqueo

Genoma Columbia Británica sshi Gedeón J Mardoqueo

Mitacs sshi Gedeón J Mardoqueo

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 12 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

Conceptualización, investigación, redacción: revisión y edición, muestreo de campo realizado, extracciones de

Gedeón J Mardoqueo https://orcid.org/0000-0001-8397-9194 Curtis A Suttle

Carta de decisión y respuesta del autor

Formulario de reporte transparente DOI: https://

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kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611980

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 13 de 18

Breve informe Ecología Microbiología y Enfermedades Infecciosas

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611981

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611982

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nucore/?term= MK611983

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611984

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nucore/?term= MK611985

kristina m miller, infectado por virus recién descubiertos nih.gov/nuccore/?term= MK611986

infectado por virus recién descubiertos MK611987

Mordecai et al. eLife 2019;8:e47615. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.47615 14 de 18