Guia de Practicas Microbiologia 2023 PDF

Herbert L. Flores R.
Biólogo - Microbiólogo
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UNIVERSIDAD PERUANA UNION

FACULTAD DE INGENIERIA
E.P. INGENIERIA AMBIENTAL
GUIA DE PRÁCTICA
Herbert L. Flores R.
Biólogo. Herbert Larry Flores Reátegui

Curso de Microbiología Ambiental
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Universidad Peruana Unión

Guía de Práctica – Microbiología Ambiental
© Autor-Editor
Herbert L. Flores Reátegui
2023
1ª. edición
Universidad Peruana Unión
Facultad de Ingenierias
E.P. Ingenieria Ambiental
Chullunquiani
Juliaca, Perú
ISBN:
Hecho el Depósito Legal en la Biblioteca Nacional del Perú Nº
Todos los derechos reservados, esta publicación no puede ser reproducida, en todo ni en parte, ni registrada en, o trasmitida por, un
sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni por ningún medio, sea mecánico, fotoquímico, electrónico, magnético,
electroóptico, por fotocopia o por cualquier otro, sin permiso previo por escrito por el autor.

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Blgo. HERBERT LARRY FLORES REATEGUI
Institución : Universidad Peruana Unión

Facultad : Ingeniería y Arquitectura
Escuela Profesional : Ingenería Ambiental
Guía de Práctica : Microbiología Ambiental
Codigo : 01318086
Dirección : Km 6 Chullunquiani
Departamento : Puno
Provincia : San Román
Teléfono Celular : 977563430
Correo Electrónico : helarry@hotmail.com
Semestre : Tercero
Ciclo : 3
Año : 2023

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NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO
1. Llegar siempre a la hora.
2. Deberás ingresar con los implementos de bioseguridad requeridos (mandil,

guantes, barbijo y gorro de laboratorio).
3. Colocar sus prendas, mochilas u otra indumentaria que no será usado en el

laboratorio en el lugar correspondiente para ello.
4. Siempre deberás guardar respeto hacia tus compañeros y hacia el maestro,

lo cual contribuirá a un buen desarrollo de las prácticas y esto será factor
determinante para evitar accidentes.
5. No fumar.
6. No ingerir alimentos, golosinas o bebidas.
7. No introducir guitarras, grabadoras, reproductores, celulares u otros aparatos

eléctricos.
8. No usar materiales de laboratorio para colocar alimentos o tomar líquidos.
9. Nunca debes trabajar sólo en el laboratorio, siempre debe de estar presente

el profesor titular de la asignatura o el técnico de laboratorio, de lo contrario
no se podrá realizar la práctica.
10. Está prohibido jugar en el laboratorio.
11. Siempre deberás respetar y usar el equipo de protección personal indicado en

cada práctica. Por lo tanto, antes de iniciar la práctica, es necesario leer con
cuidado su contenido a fin de saber cuáles serán las precauciones a tomar.
12. Al final del trabajo de laboratorio deberás colocar los residuos y el vidrio roto
en los recipientes que se hayan destinado específicamente para tal fin.
13. Es indispensable que en todos los trabajos experimentales se tenga

precaución y limpieza.
14. Siempre deberás lavarte las manos antes de salir del laboratorio.

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NORMAS DE TRABAJO
1. Al presentarte al laboratorio deberás vestir una bata de algodón de manga

larga, zapatos cerrados y el pelo recogido.
2. Sobre la mesa de trabajo deberás tener únicamente lo necesario para anotar

puntos relevantes de la práctica.
3. Cada equipo deberá traer medio metro de franela, la cual deberá estar limpia
y semi-húmeda al momento de trabajar; que permita en un momento
necesario absorber cualquier sustancia que se derrame.
4. Antes de realizar cualquier práctica deberás revisar si el material y los

reactivos están limpios, completos y en buenas condiciones de manejo.
5. Al finalizar la práctica, dejar limpio el material utilizado y limpiar bien la mesa

de trabajo con la franela, a fin de no dejar residuos de sustancias.
6. Cualquier material o instrumento que se rompa en el transcurso de la práctica,

el equipo que tenga la responsabilidad de él estará obligado a reponerlo en
un plazo que no exceda de diez días naturales. Para ello deberá llenarse un
vale por el material averiado y entregarse al maestro responsable del grupo.
7. No introducir una espátula dentro de un frasco de sustancia si no está limpia,

evitando así introducir impurezas.
8. Cualquier accidente o anomalía deberá ser notificado inmediatamente al

docente o al auxiliar de laboratorio.

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RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD
Las principales causas de accidentes dentro de un laboratorio se deben al

desconocimiento, imprudencia, descuido y/o falta de precaución al momento de
manipular las sustancias, los materiales y el equipo con los que se trabaja. Otra
causa importante puede ser la falta de mantenimiento constante a los equipos e
inmuebles y el almacenamiento inadecuado de reactivos.
Cada uno de ustedes puede contribuir, tomando en cuenta las siguientes

recomendaciones que ayudarán a evitar accidentes.
1. En los trabajos con sustancias explosivas usar una mínima cantidad.
2. La lámpara de alcohol se debe encender cuando la operación de una práctica

lo exija, en caso contrario no se justifica su uso.
3. Al prender la lámpara de alcohol se deberán alejar sustancias volátiles. Si

durante una reacción hay desprendimiento de gases, aleje éstos del fuego y
de su área de trabajo, ya que al ponerse en contacto con el aire y el fuego,
podría originar una explosión.
4. Los líquidos inflamables no se deben calentar directamente con la flama, sino

mediante baños de aceite, agua, arena u hornillos eléctricos.
5. Antes de iniciar la práctica, revisar todas las conexiones para evitar cualquier
fuga posible, evitando la acumulación de los gases, que puedan traer consigo
una explosión.
6. Para percibir olores, no se debe poner el rostro encima del recipiente, deben
arrastrar los gases con la mano.
7. Los tubos de ensayo no se deben calentar por el fondo, sino por la parte media
del tramo que contenga la sustancia: deben estar inclinados y no apuntar
hacia el operador u otra persona que se encuentre junto.
8. Los tubos de ensayo calientes, con líquidos o no, deben colocarse en una
gradilla de alambre o dentro de un vaso de precipitados.
9. Los sólidos y los líquidos que se derramen en cualquier lugar del laboratorio
deben limpiarse inmediatamente.

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10. La dilución de ácidos concentrados deberá hacerse en un recipiente de vidrio

pyrex añadiendo lentamente el ácido al agua resbalándolo por las paredes del
recipiente y agitando suavemente. Nunca añadir agua al ácido, ya que puede
formarse vapor con violencia explosiva.
11. Cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen ácidos,

la operación deberá hacerse bajo una campana extractora.
12. Observar con atención toda la información que proporciona la etiqueta del
frasco de reactivo.
13. Operar con precaución y no golpear sobre la mesa los frascos con reactivos
(sólidos o líquidos) evitando derramar su contenido y salpicar a los que estén
a su alrededor.
14. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo.
15. Nunca succiones con la boca.
16. Pregunta a tus profesores cómo y dónde depositar los residuos.
17. Memorice la ubicación de los dispositivos de seguridad, como son: equipo

contra incendios, regadera de seguridad, equipo de primeros auxilios y
mantas.

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BIOSEGURIDAD
I. INTRODUCCION
La Bioseguridad es el conjunto de normas y procedimientos que garantizan el control de los

factores de riesgo, la prevención de impactos nocivos y el respeto de los límites permisibles sin
atentar contra la salud de las personas que laboran y/o manipulan agentes biológicos, físicos,
químicos, psicofisiológicos y ergonómicos; e igualmente, garantiza que el producto de los
mismos no atente contra la salud de la comunidad, ni contra el ambiente. Por otra lado las
normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de
microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en los Servicios de
Salud.
Por otra parte, el proceso de atención al paciente genera diariamente residuos de diversa índole
que ameritan una manipulación correcta, pues de ello depende no solo la prevención de
accidentes de trabajo y enfermedades profesionales, sino también la prevención de
enfermedades en la población de usuarios y la comunidad en general. Por otro lado el problema
de las infecciones intrahospitalarias son un serio problema de salud en todos los hospitales del
mundo especialmente en nuestra región.
Existen diversos mecanismos responsables de la transmisión de patógenos adquiridos en los

diferentes ambientes laboratoriales de las universidades y ambientes hospitalarios, las vías
principales de contagio son las manos. Sin embargo, también existen otras formas de infectarse
si no se tiene conocimiento de los agentes y su mecanismos y/o formas de transmision.
II. RESUMEN
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III. RESULTADO DE APRENDIZAJE
Identifica las situaciones de riesgo en los laboratorios de la universidad en las cuales desarrolla
sus practicas laboratoriales con la finalidad de prevenir accidentes.
IV. RECOJO DE LA COMPETENCIA
El estudiante conoce, adquiere y practica las principales medidas de bioseguridad.
V. CONSTRUCCION DE LA COMPETENCIA
El 25 de mayo de 2005, la 58 Asamblea Mundial de la Salud aprobó la Resolución WHA58.29,

Enhancement of Laboratory Biosafety. Ante la situación de emergencia creada por los riesgos
de pandemia de gripe aviar y otras enfermedades con potencial epidémico, la OPS apoya la
adopción de esta resolución en la Región de las Américas. Considerando que la bioseguridad
forma parte de los elementos esenciales del sistema de gestión de la calidad y que la
vulnerabilidad de la comunidad ante la difusión natural, accidental o intencional de los agentes
biológicos de alto riesgo para la salud y el medio ambiente, se reduce implementando medidas
preventivas en el laboratorio y/o cualquier instalación de salud o afines.
5.1. Bioseguridad: La bioseguridad es la aplicación de conocimientos, técnicas y equipamientos

para prevenir a personas, laboratorios, áreas hospitalarias y medio ambiente de la exposición
a agentes potencialmente infecciosos o considerados de riesgo biológico. La bioseguridad, a
través de medidas científicas organizativas, define las condiciones de contención bajo las
cuales los agentes infecciosos deben ser manipulados con el objetivo de confinar el riesgo
biológico y reducir la exposición potencial de:
 Personal de laboratorio y/o áreas hospitalarias críticas.

 Personal de áreas no críticas
 Pacientes y público general, y material de desecho
 Medio ambiente
5.2. Principios de la bioseguridad:
5.2.1. Universalidad: Las medidas deben involucrar a todos los pacientes, trabajadores y
profesionales de todos los servicios, independientemente de conocer o no su serología. Todo
el personal debe seguir las precauciones estándares rutinariamente para prevenir la exposición
de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan originar
accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del
paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para todas las personas,
independientemente de presentar o no enfermedades.

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Precauciones estándares: Tienen por objeto reducir el riesgo de transmisión de agentes

patógenos transmitidos por la sangre y otros tipos de agentes patógenos de fuentes tanto
reconocidas como no reconocidas. Los elementos clave son: 1. Higiene de las manos, 2.
Uso de los guantes, 3. Protección facial (ojos, nariz y boca), 4. Uso de la bata, 5. Prevención
de pinchazo de aguja y lesiones con otros instrumentos afilados, 6. Higiene respiratoria y
etiqueta de la tos (cubrirse nariz y boca al toser/estornudar), 7. Limpieza ambiental
(desinfección del entorno), 8. Manipulación, transporte y proceso de ropa, 9. Eliminación de
desechos, 10. Equipo para atención de pacientes (manipulación apropiada).
5.2.2. Uso de barreras: Comprende el concepto de evitar la exposición directa a sangre y otros
fluidos orgánicos potencialmente contaminantes, mediante la utilización de materiales
adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilización de barreras (ej.
guantes) no evitan los accidentes de exposición a estos fluidos, pero disminuyen las
probabilidades de una infección.
5.2.3. Medios de eliminación de material contaminado: Comprende el conjunto de dispositivos y

procedimientos adecuados a través de los cuales los materiales utilizados en la atención de
pacientes, son depositados y eliminados sin riesgos.
5.3. Elementos básicos de la bioseguridad: Los elementos básicos para una buena seguridad
biológica para la contención del riesgo provocado por los agentes infecciosos son tres:
5.3.1. Prácticas de trabajo: Son elementos básicos y a la vez el más importante para la protección
de cualquier tipo de trabajador. Las personas que por motivos de su actividad laboral están en
contacto, más o menos directo, con materiales infectados o agentes infecciosos, deben ser
conscientes de los riesgos potenciales que su trabajo encierra y además han de recibir la
formación adecuada en las técnicas requeridas para que el manejo de esos materiales
biológicos les resulte seguro. Por otro lado, estos procedimientos estandarizados de trabajo
deben figurar por escrito y ser actualizados periódicamente.
5.3.2. Equipo de seguridad (o barreras primarias): Se incluyen entre las barreras primarias tanto los
dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad de un proceso (como por ejemplo, las
cabinas de seguridad) como los denominados equipos de protección personal (guantes,
calzado, pantallas faciales, mascarillas, etc).
5.3.3. Diseño y construcción de la instalación (o barreras secundarias): La magnitud de las

barreras secundarias dependerá del agente infeccioso y de la manipulación que se realice.
Vendrá determinada por la evaluación de riesgos. En muchos de los grupos de trabajadores en
los que el contacto con este tipo de agentes patógenos sea secundario a su actividad
profesional, cobran principalmente relevancia las normas de trabajo y los equipos de protección
personal.

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5.4. Normas Generales
1. Evite el contacto de la piel y mucosas con la sangre y otros líquidos corporales provenientes
de cualquier paciente, y no solamente tome medidas de precaución con aquellos que ya
tengan diagnosticada una enfermedad infecciosa.
2. Use siempre guantes para todo procedimiento realizado en los pacientes y que implique el
contacto con sangre y otros fluidos corporales que se consideren líquidos de precaución
universal, piel no intacta, membranas mucosas o superficies contaminadas con sangre.
3. Lávese las manos inmediatamente antes y después de realizar cualquier procedimiento, o

de tener contacto con sangre o líquidos corporales, o de atender cualquier paciente.
4. Los guantes nunca son un sustituto del lavado de las manos, dado que la calidad de los
guantes es variable y no previenen las punciones.
5. Use mascarilla y gafas de protección durante los procedimientos que generen gotas de
sangre o líquidos corporales; con esta medida se previene la exposición de las membranas
mucosas de la boca, la nariz y los ojos.
6. Emplee delantales protectores (impermeables) cuando durante el contacto con un paciente

exista la posibilidad de generar salida explosiva o a presión de sangre o líquidos corporales:
drenaje de abscesos.
7. Ponga especial atención en la manipulación de los utensilios de trabajo de manera que se

puedan evitar todos los accidentes con agujas, bisturíes y cualquier elemento
cortopunzante. Para ello se recomienda, además de la concentración en las actividades,
evitar todo procedimiento de reempaque de agujas, ruptura de láminas de bisturí o
cualquier tipo de manipulación diferente al uso indicado.
8. Todos los implementos cortopunzantes deben descartarse en cajas de bioseguridad.
9. Cuando presente piel no intacta por lesiones exudativas o dermatitis, evite el contacto
directo con pacientes que puedan estar eliminando sangre o líquidos corporales
activamente.
10. No comer, beber, fumar, beber líquidps en el laboratorio.
11. Llevar el cabello recogido, no usar esmalte de uñas.
12. Lavarse las manos antes y después de trabajar con muestras de cultivos.

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5.5. Normas de convivencia en el laboratorio
1. El acceso al laboratorio estará limitado solo para el personal autorizado.
2. El acceso al laboratorio será con EPP (mandil, guantes, gorro, barbijo).
3. Mantenerlimpia el área de trabajo antes y después de realizar su práctica.
4. No debe consumir ningún tipo de alimentos o bebidas.
5. No realizer ruidos y evitar movimientos innescesarios dentro del laboratorio.
6. Emplear y trasladar los equipos según correspondan con autorización del docente o
personal responsible del laboratorio.
7. Los productos serán proporcionados por el docente o personal responsible.
8. Evita tocar muestras potencialmente infecciosas, tóxicas u otras de riesgo sin la protección.
9. En ningún caso deberá pipetar con la boca.
10. Los derrames y accidentes debe ser reportados al docente o personal encargado.
11. Los productos inflamables no deberán estar expuestos a Fuentes de calor.
12. Dejar apagando los equipos y ordenar los instrumentos según sea el caso.
VI. MATERIALES
Agua.
Jabón líquido.
Papel toalla.
Diapositivas.
Guantes.
Mascarilla.
Mandil.
Gorro.
Diapositivas.
Videos.
Bolsas de bioseguridad.

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VII. PROCEDIMIENTOS
Lavado de manos: Ignaz Semmelweis (1818–1865): Padre del control de las infecciones.
Pasos del lavado de manos

1. Subir la manga de la ropa sobre los codos, quítate los objetos de las manos y muñecas.
2. Mójate las manos con suficiente agua.
3. Enjabónate y frótate las manos hasta cuatro dedos sobre el pliegue de la muñeca.
4. Friccionar las manos con movimientos de rotaciónhasta obtener espuma, hacienda énfasis
en los espacios interdigitales, uñas y reborde cubital.
5. Permanecer con el jabón por espacio de 20 segundos aproximadamente.
6. Enjuágate bien las manos con abundante agua a chorro.
7. Sécate las manos empleando papel.
8. Cierra el caño usando el papel.
9. Elimina el papel.
Calsado de guantes:
1. Lavarse y secarse las manos
2. Abrir la bolsa de modo que la parte interna quede hacia usted y los puños de los guantes
hacia arriba.
3. Tome los guantes por el puño (sin tocar la parte externa) y colóquelos con los pulgares
unidos hacia adelante.
4. Introduzca despacio la mano derecha en el guante derecho de modo que cada dedo
coincida con el dedo del guante.
5. Con la mano enguantada tome el otro guante introduciendo los dedos debajo del doblez del
puño sin contaminarlo.
6. Introduzca la mano izquierda en la misma forma que indica el numeral 4
7. Ajuste los guantes si es necesario
8. Al finalizar el procedimiento retire el primer guante tomándolo de la parte externa del puño.
9. Retire el segundo guante tomándolo de la parte interna del puño.
10. Colocar guantes en recipiente para desechos peligrosos, deje el área limpia y ordenada.
Retiro de los guantes

1. Tomar el borde inferior del guante y colocarlo sobre el dedo pulgar.
2. Repetir la misma maniobra con el guante contrario.
3. Quitarse el guante enganchándolo por la palma de la mano con el dedo índice de la mano
enguantada.
4. Con el dedo pulgar de la mano descubierta, introducirlo entre el guante y la palma de la
mano.
5. Jalar hacia afuera y liberar el guante.

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VIII. RESULTADOS
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IX. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES
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X. RECOMENDACIONES Y/O SUGERENCIAS
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XI. CUESTIONARIO
10.1. ¿Qué es bioseguridad?
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10.2. ¿Cuales son los niveles de bioseguridad?
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10.3. ¿Cuales son los procesos estandarizados del lavado de manos en el Ministerio de
Salud?
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10.4. ¿Cuales son los principales EPP que debemos siempre utilizer en el laboratorio?
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10.5. Haga una lista de las primeras diez normas de bioseguridad que debemos conocer
en nuestro laboratorio
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XII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
11.1 Texto
Manual de Bioseguridad (2005). Organización Mundial de la Salud; Tercera Edición. Ginebra
11.2. Enlaces de Internat
http://www2.paho.org/hq/index.php?option=com_content&view=article&id=54
60%3A2011-bioseguridad-mantenimiento&catid=3612%3Alaboratory-
services-contents&Itemid=3952&lang=es
http://enfermeriaqxcuarto.blogspot.pe/2012/03/calzado-de-guantes.html
http://www.minsa.gob.pe/portada/especiales/2014/lavadomanos/materiales.h
tml
11.3. Videos
https://www.youtube.com/watch?v=wyO7Wt1GF3Y

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XIII. ANEXOS
Pasos del lavado de manos

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Calzado de los guantes
Retiro de los guantes

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Equipos de Protección Personal
Colores de los depósitos de residuos según el Sistema internacional

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Señalizaciones
Uso de los EPP en el laboratorio

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PRACTICA N° 1
MICROSCOPIA
I. INTRODUCCION
En el informe que se presenta a continuación podremos

conocer los inicios de la microscopia, las investigaciones que
se vienen desarrollando para poder obtener observaciones
microscópicas cada vez más sensibles, eficaces y con mejor
resolución.
Podremos conocer como los primeros científicos debieron

enfrentarse a los problemas de aberraciones ópticas,
imágenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los cuales
se mantuvieron hasta mediados del siglo XIX que aparecieron los lentes objetivos
que reducían con una apertura numérica entre 0.65 y 1.25.
En las últimas décadas se ha incrementado la aplicación de la microscopía óptica en

los laboratorios de investigación de una amplia variedad de disciplinas Biológicas, el
rápido desarrollo de diferentes métodos como los de fluorescencia, contraste de fases
y de campo oscuro entre otros, que sumados a los avances en la digitalización y
análisis de imágenes, han permitido a los microscopistas obtener resultados rápidos,
cuantificables y confiables de una gran variedad de especímenes biológicos.
Al margen de estos avances, iremos descubriendo en esta práctica las bases del
funcionamiento de algunos tipos de microscopios ópticos los cuales se presentan en
esta práctica sobre microscopia, y con los cuales nos debemos familiarizar.
II. RESUMEN
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III. RESULTADO DE APRENDIZAJE
Describe las partes del microscopio
El estudiante conoce las partes del microscopio, lo usa y cuida.
5.1. HISTORIA DEL MICROSCOPIO
El microscopio se invento, hacia 1610 por Galileo, según los italianos, o por Jansen,
en opinión de los holandeses.
La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la
"Accademia dei Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que
publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja.
Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia

aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la
circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke
publica su obra Micrographia.
A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek, utilizando

microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos,
bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.
Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que

aumentaron su estabilidad y facilidad de uso, pero no desarrollaron mejoras ópticas.
Las mejoras ópticas surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del
microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión
sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000.
A principios de los años 30 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios
ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo
existía un deseo de observar los detalles estructuras celulares.
El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fue el primer tipo de microscopio

electrónico desarrollado este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar
la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X.
Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM)

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5.2. EL MICROSCOPIO
Un microscopio es un instrumento que amplifica una imagen y permite la observación

de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una
lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de
0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo
a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para
captar la información.
Podemos clasificar los microscopios según su descubrimiento:
 Microscopio simple o lupa: lente convergente situada entre el ojo y el objeto.
 Microscopio compuesto: formado por 2 sistemas de lentes: oculares y objetivos.
 Microscopio moderno: produce una imagen aumentada e invertida.
Formado por tres sistemas de lentes.
Condensador: situado entre la fuente de luz y la muestra. Concentra el haz

luminoso sobre la preparación.
Objetivo: produce una imagen real y aumentada, situado entre el objeto y el
revolver.
Ocular: formado por dos lentes convergentes, produce una imagen virtual y
aumentada, situados entre el ojo y el revolver.
5.3. PARTES DEL MICROSCOPIO

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5.3.1. Parte Mecánica
a. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular, es el apoyo

de las demás piezas del microscopio, es pesado para asegurar su estabilidad.
b. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie;
sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrará el microscopio cuando
se traslada durante los trabajos.
c. Tubo del Ocular: Está colocado en la parte superior del microscopio, donde
están acoplados los oculares, que pueden tener movimiento vertical, con ayuda
de una cremallera sobre la columna.
d. Revólver o Disco Giratorio: Está debajo del tubo ocular donde están
acoplados los objetivos, es giratorio para facilitar el cambio de los objetivos.
e. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada, circular o rectangular, con un
orificio central que permite el paso de la luz a través de ella. Su función es
sostener las placas con los preparados biológicos que se van observar
f. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina, cuya función es sujetar y

mover la placa que se va a estudiar. Posee dos tornillos que permiten
movimientos horizontales (hacia adelante, hacia atrás, hacia la derecha y hacia
la izquierda) del portaobjeto.
g. Mecanismos de Movimiento: Está integrado por el tornillo macrométrico y el

micrométrico
Tornillo Macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo del

preparado a observar; su función es lograr un enfoque más o menos claro o
aproximado del objeto.
Tornillo Micrométrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado, pero
lentamente, casi imperceptiblemente, permite desplazamientos muy finos de
la platina o del tubo del ocular. Durante la observación y enfoque este tornillo
debe estarse moviendo permanentemente; su función es darle nitidez al
enfoque.
5.3.2. Parte óptica
Esta integrada por los objetivos, oculares y el aparato de iluminación (espejo,

diafragma, condensador y filtros).
a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. Ellos se acoplan al

revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos. Los más usados
son: objetivos de 4x, 10x; 40x, y 100x (inmersión).

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b. Ocular: Están colocados en la parte superior del tubo ocular. Está formado por
dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Su finalidad es aumentar la
imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la
misma. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran más
cerca del ojo. Hay oculares de 3.5x; 5x; 6,3x; 10x; 12.5x; 15x; 20x y 25x.
c. Aparato de iluminación: Está conformado por la fuente de luz, el diafragma,

el condensador y los filtros.
d. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial, cuando es natural (solar) o

procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio, un espejo recoge
la luz del medio y la refleja a través del objeto y del sistema de lentes.
e. Diafragma: Ubicado entre la fuente de luz y el condensador, inmediatamente

debajo de la platina, su función es regular la intensidad de luz que atraviesa el
objeto. El diafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia
atrás agranda o achica el orificio central, dejando pasar mayor o menor
cantidad de luz respectivamente.
f. Condensador: Es un elemento cónico que posee un sistema de dos lentes

convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al
objetivo por el agujero de la platina. Existe un tornillo manual que permite
guardar la altura del condensador.
g. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe

un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. Los
filtros son elementos de cuarzo o de vidrio, pueden ser de color azul, amarillo
o verde.
h. La luz: Es una forma de energía transportada continuamente por el espacio a

velocidades muy elevadas (330.000 Km/s en el vacío). La luz está formada por
pequeños corpúsculos que salen de un foco luminoso en forma de ondas. La
luz blanca está constituida por una gama de colores del espectro visible, estos
son: rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul y violeta.
i. Lentes: Las lentes son el componente más importante del microscopio; se

fabrican de vidrio u otros materiales transparentes. Pueden ser convexas o
cóncavas en ambas superficies, planas en una cara o tener cualquier
combinación de éstas dos formas en su superficie.
Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas.
Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de luz, es decir, los concentra
para formar una imagen real.
Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz, sin formar imagen real.

-27-

VI. MATERIALES
Equipos
 Microscopio compuesto
Materiales
 Láminas porta objetos
 Laminas cubre objetos
 Goteros
Material de bioseguridad
 Mandil
 Guantes
 Barbijo
 Gorro
 Jabón líquido
Otros
 Lapiceros
 Libreta de apuntes
VII. METODOS
6.2.1. USO Y MANEJO
1. Quitar la funda de protección.
2. Verificar que la fuente este al voltaje requerido 220 ó 110.
3. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina

completamente.
4. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
5. Comenzar la observación con el objetivo de 4x que ya debe está en posición si

la preparación es de bacterias.
6. Para enfocar realice el siguiente procedimiento:
a. Acercar al máximo el lente del objetivo a la preparación, empleando el

tornillo macrométrico.
b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo
nítida la muestra, girar con el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

-28-

c. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y

suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el
enfoque fino.
d. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por
ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la
preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con
el objetivo de inmersión.
7. Empleo del objetivo de inmersión:
a. Bajar totalmente la platina.

b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el
aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino
entre éste y el de x40.
d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. Terminar de girar el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la
lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota
ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico.
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no
se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía
de aceite.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y
se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. Nunca se
debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel lente el
cual es especial para óptica.
8. Una vez limpio todas las partes importantes del microscopio colocar los
objetivos de tal forma que no le de la luz proveniente de la fuente lumínica
directamente cuando se encienda otra vez.
9. Bajar la intensidad de la luz con la perilla hasta que quede completamente

apagado.
10. Desenchufar.
11. Colocar la funda de protección.

-29-

5.2.1 Cuidados del microscopio

Es importante tener en cuenta los siguientes cuidados y
precauciones al usar el microscopio:
Cuando se transporte el microscopio tómelo siempre con las dos

manos. Nunca tenga objetos adicionales en sus manos.
Al colocar el microscopio sobre la mesa, sitúelo a unos 10 o 15
cm del borde.
Si se requiere limpiar los lentes utilice sólo el papel y solución
destinada para tal fin. No utilice ningún otro tipo de papel.
Cuando termine de trabajar deje el microscopio en el lente
objetivo de 4X.
5.2.2 Partes del microscopio compuesto y sus funciones:
 Base: Parte inferior del microscopio.

 Columna o Brazo: Estructura rígida situada en la parte posterior
del microscopio, sostiene el tubo binocular y la platina.
 Tubo: Pieza vertical que sostiene el revólver y el lente ocular.
 Revólver: Sistema giratorio localizado en la parte inferior del
tubo, al cual se incorporan los lentes objetivos.
 Tornillo macrométrico: Sirve para alejar o acercar el tubo y la
platina, permite enfocar la imagen.
 Tornillo micrométrico: Sirve para dar claridad a la imagen.
 Platina: Lámina con un orificio central en donde se coloca la
muestra que se desea observar.
 Carro: Sistema de pinzas colocado encima de la platina. Sirve
para desplazar la muestra hacía adelante y hacía atrás, y de
derecha a izquierda.
 Oculares: Lentes convergentes situados en la parte superior del
tubo. Aumentan la imagen que proviene del objetivo.
 Objetivos: Lentes convergentes incorporados en la parte inferior
del revólver. Aumenta la imagen del objeto observado.
 Condensador: Sistema de lentes convergentes encargados de
concentrar los rayos de luz en el centro del orificio de la platina.
Sirve para enfocar la luz hacia el objeto que se va a examinar.
 Diafragma o Iris: Esta situado debajo de la platina,
inmediatamente debajo del condensador. Sirve para regular la
entrada de luz al condensador y se acciona mediante una
palanca.
 Fuente de luz: Bombilla o espejo incorporado al microscopio.

-30-

5.2.3 Preparación de una placa temporal.
 Tome un portaobjetos y un cubreobjetos. Asegúrese de que

estén limpios.
 Coloque el portaobjetos sobre la mesa y siembre la muestra
(Letras de papel periódico y trozo de hilo) en el centro de este.
 Deje caer una gota de agua sobre la muestra
 Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos formando un
ángulo de 45 grados entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
Déjelo caer lentamente para evitar la formación de burbujas en
la placa.
5.2.4 Observación de la muestra
 Colocar la placa ya preparada sobre la platina de tal manera que

quede bien ajustada. Enfoque con el objetivo de menor aumento
utilizando el tornillo macrométrico. Abra el diafragma hasta que
obtenga una buena iluminación de la muestra. Utilice el tornillo
micrométrico para obtener mayor nitidez.
 Luego gire lentamente el revólver para colocar el objetivo 10X.
Utilice el tornillo micrométrico para obtener una imagen nítida.
No utilice el tornillo macrométrico; éste no es necesario si usted
enfocó correctamente con el objetivo de menor aumento. Si se
requiere abra un poco el diafragma para aumentar la entrada de
luz.
 Al terminar su observación gire lentamente el revólver y coloque
el objetivo de menor aumento y retire el portaobjetos.
 Cuando termine de usar el microscopio coloque el control de la
luz en 0 y apague el microscopio. Desconéctelo, enrolle el
cordón y cúbralo con el cobertor plástico o caja. Guarde el
microscopio en el locker correspondiente.

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VIII. RESULTADOS
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DIBUJAR SUS OBSERVACIONES

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XI. CUESTIONARIO
10.1 ¿Porqué es útil el microscopio?
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10.2 ¿Cuáles son los principales cuidados que se deben tener en cuenta en el
uso del microscopio?
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Alberts, Bruce. Biología Molecular de la Célula. 2da. Edición. Barcelona: Editorial

Omega; 1994)
Gloede, W. Vom Lesestein zum Elektronenmikroskop. VEB Verlag Technik. Berlin;

1986.
Rogers, kirsteen. Gran Libro del Microscopio. 1ra Edición. Madrid: Ediciones
Alcobendas; 2007.
Wikipedia. El microscopio. [Internet]. Madrid: [Consultado el 20 ju Julio del 2010]

Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio
Educar. Los microscopios. [Internet] Buenos Aires: [Consultados el 20 de julio del

2010]
Disponible en:
http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/del-microscopio-a-
la-tomografia-computada-tecnologias-para-mirar-por-dentro/los_microscopios.php
Danival. El Microscopio. [Internet] La Coruña: [Consultado el 20 de julio del 2010]

Disponible en:
http://danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/microscopio/_madre_microscop.
html

-34-

XIII. ANEXOS
ANEXO 1
HISTORIA DEL MICROSCOPIO OPTICO
Algunos descubrimientos en la historia de la microscopía óptica

1611 Kepler sugirió la manera de construir un microscopio compuesto
Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas pequeñas celdillas en
1655
los cortes de corcho a las que denominó "células".
Leeuwenhoek informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años más
1674
tarde observó por primera vez bacterias.
Brown publicó sus observaciones microscópicas de las orquídeas, y describió
1833
claramente el núcleo celular.
Schleiden y Schwann propusieron la teoría celular, afirmando que la célula
1838
nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y los animales.
1857 Kolliker describió las mitocondrias de las células musculares.
Abbé analizó los efectos de la difracción en la formación de la imagen en el
1876
microscopio y mostró la manera de optimizar el diseño de los microscopios.
Flemming describió con gran claridad el comportamiento de los cromosomas
1879
durante la mitosis de las células animales
Retzius describió muchos tejidos animales con una precisión que aún no ha sido
superada por ningún especialista en microscopía óptica. En las dos décadas
1881
siguientes, tanto él como Cajal y otros histólogos, diseñaron métodos de tinción y
establecieron las bases de la anatomía microscópica.
Koch utilizó colorantes de anilina para teñir microorganismos e identificó las
bacterias que causan la tuberculosis y el cólera. En las dos décadas siguientes,
1882
otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur, identificaron los agentes causantes de
otras muchas enfermedades examinando al microscopio preparaciones teñidas.
Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abbé, que permitieron a los
1886 especialistas en microscopía la resolución de estructuras situadas en los límites
teóricos de la luz visible.
Golgi observó por primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando células
1898
con nitrato de plata.
Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica autorradiográfica
1924
para localizar el polonio radiactivo en las muestras biológicas.
Lebedeff diseñó y construyó el primer microscopio de contraste interferencial. En
1930 1932, Zernicke inventó el microscopio de contraste de fases. Estos dos adelantos
permitieron observar por primera vez células células vivas no teñidas en detalle.
Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes para detectar
1941
antígenos celulares.
Nomarski ideó y patentó el sistema de contraste interferencial para el microscopio
1952
óptico., que aún lleva su nombre.
1981 Allen e Inoué perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video-amplificada.
N.T. Generalmente se considera que el primer microscopio compuesto fue construído por los
holandeses H. Jansen y Z. Jansen en 1590.

-35-

PRACTICA N° 02
OBSERVACION Y RECONOCIMIENTO DE CELULAS PRO Y EUCARIOTAS
I. INTRODUCCION
Todos los seres vivos están formados por unidades muy pequeñas,
generalmente invisibles a simple vista llamadas células.
La célula es la unidad morfológica y funcional de todo ser vivo, es el elemento

de menor tamaño que puede considerarse vivo. Cada célula es un sistema
abierto que intercambia materia y energía con su medio. En una célula ocurren
todas las funciones vitales, de manera que basta una sola de ellas para tener
un ser vivo (que será un ser vivo unicelular).
Existen dos tipos de células fundamentales: procariotas y eucariotas.
Células procariotas: Se llama procariota a las células sin núcleo celular

definido, es decir cuyo material genético se encuentra disperso en el
citoplasma. Estructuralmente son las más simples y pequeñas. Como toda
célula, están delimitadas por una membrana plasmática que contiene pliegues
hacia el interior (invaginaciones) algunos de los cuales son denominados
laminillas y otro es denominado mesosoma y está relacionado con la división
de la célula.
Células eucariotas: Se llama célula eucariota a las células que tienen un

núcleo definido gracias a una membrana nuclear donde contiene su material
hereditario. Las células eucariotas tienen un modelo de organización mucho
más complejo que las procariotas. Su tamaño es mucho mayor y en el
citoplasma es posible encontrar un conjunto de estructuras celulares que
cumplen diversas funciones y en conjunto se denominan organelas celulares.
Entre las células eucariotas podemos distinguir dos tipos de células que
presentan algunas diferencias: son células animales y vegetales.

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II. RESUMEN
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III. RESULTADO DEL APRENDIZAJE
Observa los movimientos de los microorganismos (bacterias, algas,

protozoarios y hongos).
Identifica las células pro y eucariotas.
El estudiante aplica técnicas y aplicaciones sobre la preparación y

observación de muestras.

-37-

Todos los seres vivos están formados por unidades muy pequeñas,
generalmente invisibles a simple vista llamadas células. Este nombre fue dado
por su descubridor Roberto Hooke, en 1665 y significa celda pequeña.
PROCARIOTAS EUCARIOTAS
Núcleo rodeado por una membrana.
ADN localizado en una
Material genético fragmentado en
región: Nucleoide, no rodeada por una
cromosomas formados por ADN y
membrana.
proteínas.
Por lo general células grandes, (10-
Células pequeñas 1-10 µm 100 µm), Algunos son microbios, la
mayoría son organismos grandes.
División celular directa, principalmente División celular por mitosis, presenta
por fisión binaria. No hay centríolos, huso mitótico, o alguna forma de
huso mitótico ni microtúbulos. ordenación de microtúbulos.
Sistemas sexuales escasos, si existe Sistemas sexuales frecuentes.

intercambio sexual se da por Alternancia de fases haploides y
transferencia de un donador a un diploides mediante Meiosis y
receptor. Fecundación
Escasas formas multicelulares Los organismos multicelulares
Ausencia de desarrollo de tejidos muestran desarrollo de tejidos
Formas anaerobias estrictas,
facultativas, microarerofílicas y Casi exclusivamente aerobias
aerobias
Ausencia de mitocondrias: las
enzimas para la oxidación de Las enzimas están en las
moléculas orgánicas están ligadas a mitocondrias
las membranas
Flagelos compuestos, (9+2)
Flagelos simples formados por la
formados por tubulina y otras
proteína flagelina
proteínas
En especies fotosintéticas, las
enzimas necesarias están ligadas a
las membranas. Exitencia de Las enzimas para la fotosíntesis se
fotosíntesis aerobia y anaerobia, con empaquetan en los cloroplastos.
productos finales como azufre, sulfato
y Oxígeno

-38-

VI. MATERIALES
Materiales
Agua procedentes de flores u otros similares

Azul de metilen
Microscópio
Pipeta
Gradilla
Láminas porta objetos
Laminillas cubre objetos
Aceite de inmsersión
Mechero Bunsen o de alcohol
Asa de colle en aro
Otros
Hoja de apuntes
VII. PROCEDIMIENTO
7.1. Observación directa
1. Tomar con la pipeta una gota de muestra conteniendo microorganismos

viables y colocar sobre una lamina porta objetos.
2. Colocar sobre la platina del microscopio
3. Enfocar con el objetivo de menor aumento (4 X)
4. Una vez ubicado cambiar de objetivos hasta 40 X
5. Antes de cambiar al objetivo de 100 X aplicar una gota de aceite de

inmersión
6. Anotar lo observado
7.2. Observación con azul de metileno
Observación microscópica de microorganismos en suspensión a con lámina

fijada
1. A la gota de agua agregar una gota de azul de metileno y cubrir con

la lámina cubre objetos.
2. Proceder igual que en los procedimiento de observación directa.

-39-

Observación microscópica de microorganismos en lámina fijada
1. Colocar una gota de agua y con un asa de colle en aro y hacer un

frotís en la lámina porta objetos.
2. Flamear la lámina.
3. Dejar secar.
4. De ser possible fijar con methanol por un minutos
5. Agregar 3 ml de azul de metileno y dejar que actúe por 10 a 15

minutos.
6. Enjueagar con agua a chorro suave para evitar que la muestra se

desprenda.
7. Dejar secar a medio ambiente.
8. Colocar una gota de aceite de inmersión para observer la muestra

fijada.
9. Anote sus observaciones.
VIII. RESULTADOS
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XI. CUESTIONARIO
10.1. ¿Qué tipo de microorganismos se puede observar en estas muestras?,

describa sus observaciones.
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10.2. Describa cinco diferencias principales de las células observadas
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PRACTICA N° 03
TINCIÓN DE GRAM
I. RESUMEN
La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el

laboratorio bacteriológico y con el que el lector debe estar perfectamente
familiarizado. Su utilidad práctica es indiscutible y en el trabajo microscópico
de rutina del Laboratorio de Microbiología las referencias a la morfología
celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan
justamente en la tinción de GRAM. Esta tinción se denominada así por el
bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base
de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, grampositivas y gramnegativas (simplemente designan dos grupos
morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias gram-positivas y gram-
negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula bacteriana sirve
para dar su tamaño y forma al organismo así como para crear una barrera
física contra el medio ambiente externo. El material de la pared celular que le
da rigidez es el peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa
y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo
de ácido teicoico. La pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene
una capa mucho más delgada, (solo una unidad de espesor) únicamente de
peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de
fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Las bacterias Gram + retienen
el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso.
Las bacterias Gram- no son capaces de retener el cristal violeta después de
la decoloración, y son teñidas de rojo con el colorante de contraste safranina
dando un color rosa suave. La tinción de Gram es capaz de predecir el tipo de
bacteria que está causando la infección, conociéndolo La diagnostica y la trata
más fácilmente. Los virus no pueden detectarse mediante tinción de Gram
puesto que carecen de la pared que capta el colorante.
II. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
Realizar la tinción Gram.
2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
2.2.1. Observar la morfología y estructura de los microorganismos a través de

los colorantes.
2.2.2. Diferenciar a las bacterias gram positivas y gram negativas.

-44-

III. MARCO TEORICO Y CONCEPTUAL
3.1. LA TINCIÓN DE GRAM O COLORACIÓN DE GRAM
La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en
muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que
desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.
3.2. FUNDAMENTOS DE DIFERENCIACIÓN DE GRAM POSITIVO Y GRAM

NEGATIVO
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes

celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular
de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano,
además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la
pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido
lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado
solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína).
Bacteria Gram Positiva
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada,

y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de
composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoproteínas.
La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.

-45-

Bacteria Gram Negativa
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es
el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a

que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes
orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de
peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el
complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con
mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del
solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y
manteniendo la coloración azul-violácea.
Causas que alteran la tinción de Gram

 Edad de la bacteria.
 Errores del operador.
 Uso de antibióticos
3.3. DEBEN DESTACARSE ALGUNOS ASPECTOS CRUCIALES DE LA

TINCIÓN DE GRAM:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El

yodo por sí solo tiene poca afinidad con las células.
2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la
tinción las células grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto
y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados
satisfactorios.
3) Cultivos más viejo de 24 horas pueden perder su habilidad de retener el
complejo cristal violeta - yodo.

-46-

El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada.

Algunos organismos son más grampositivos que otros y algunos son gram-
variables, es decir, unas veces grampositivos y otros gramnegativos.
3.4. MORFOLOGIA ULTRAMICROSCOPICA
3.4.1. PARED CELULAR
Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas

mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en
inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es
una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden
destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes
de la pared celular son los aminoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas.
Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas
formando el polímero complejo que forma la pared celular. Entre los
constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las
bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-
negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas
que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del
mecanismo de la reacción al gram
3.4.2. MEMBRANA CITOPLASMATICA
Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o

envoltura, que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está
formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas
empotradas. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de
suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que
controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de
los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la división
celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado
Mesosoma
3.4.3. CITOPLASMA
El material celular contenido dentro de la membrana citoplásmica puede

dividirse en tres partes, región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es
rica en RNA, región nuclear o cromatínica, que es rica en DNA, y la parte
líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado
con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200
A de diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma.
Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el
equivalente en las bacterias de los microsomas, o partículas que se
encuentran en las células animales y vegetales.

-47-

3.4.4. ESTRUCTURAS CITOPLASMATICAS
Nucleoide (cuerpo cromatínico): Las células bacterianas no contienen el

núcleo característico de las células de las plantas y animales superiores. Sin
embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una
estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en
este espacio, es único y circular, doble hélice sin proteínas.
Ribosomas: Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S

para formar un complejo 70S).
Plásmidos: Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la

resistencia a drogas, toxinas y otros factores.
Endosporas: Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides

o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas,
o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos
de los géneros Bacillus y Clostridium caracterizan, en parte, por su propiedad
de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de
bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de
esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas
durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo
del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la
síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora.
3.4.5. MORFOLOGIA BACTERIANA
Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la
deficinión "taxonómica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tinción
y la forma que presentan las células bacterianas. En lo relativo a la coloración,
ya hemos explicado anteriormente que hablamos de microorganismos Gram-
positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram negativos
cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas básicas: en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una

tinción GRAM:
COCOS: Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división

celular. Diplococos, aparecen por pares. Estreptococoss, tienden a
unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos
irregulares, a veces de gran tamaño.
BACILOS: grandes variaciones morfológicas: fusiformes,
estreptobacilos, cocobacilos.
ESPIRALES: Treponemas, Borrelias, Utilizamos el término
Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una
misma especie.

-48-

IV. MATERIALES Y METODOS
4.1 MATERIALES
4.1.1 MATERIALES
Asa de colle
Lamina portaobjetos
Mechero
Pipeta
Tubo de ensayo
4.1.2 EQUIPOS
Microscopio
4.1.3 REACTIVOS
Batería de gram
4.1.4 OTROS
Agua destilada
Solución salina
4.2 METODOS
4.2.1. PREPARACION DEL FROTIS
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriológica y esperar

que enfríe un poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con ésta tomar un poco de
muestra.
Una vez obtenida una pequeña cantidad de la muestra (con el asa),
hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual
servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lámina portaobjetos,
proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina,
de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como producto una
espiral en la parte media de la lámina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero
para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo
(sólo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar
la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es
aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano.

-49-

4.2.2. TINCION
Con un asa de siembra tome una colonia y extiéndala en un porta objeto

con el fin de preparar un frotis bacteriano y fije la preparación
Tiña con cristal violeta durante 60 segundos.
Deshechar el exceso de colorante.
Añadir lugol, esperar un minuto.
Enjuagar con agua de caño a baja presión.
Decolorar con etanol al 95%, 30 segundos.
Enjuagar con agua de caño a baja presión.
Añadir el colrante de contraste, safranina, esperar 1 minuto.
Lavar con agua.
Observar al microscopio a 40X y 100X.
V. RESULTADOS

-50-


-51-

VI. CONCLUSIONES Y DISCUSIONES
VII. RECOMENDACIONES Y/O SUGERENCIAS
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS


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Herbert L. Flores R.

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Biólogo. Herbert Larry Flores Reátegui

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Universidad Peruana Unión

Biólogo. Herbert Larry Flores Reátegui

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Blgo. HERBERT LARRY FLORES REATEGUI

Institución : Universidad Peruana Unión

Biólogo. Herbert Larry Flores Reátegui

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NORMAS DE CONDUCTA EN EL LABORATORIO

1. Llegar siempre a la hora.

2. Deberás ingresar con los implementos de bioseguridad requeridos (mandil,

3. Colocar sus prendas, mochilas u otra indumentaria que no será usado en el

4. Siempre deberás guardar respeto hacia tus compañeros y hacia el maestro,

6. No ingerir alimentos, golosinas o bebidas.

7. No introducir guitarras, grabadoras, reproductores, celulares u otros aparatos

8. No usar materiales de laboratorio para colocar alimentos o tomar líquidos.

9. Nunca debes trabajar sólo en el laboratorio, siempre debe de estar presente

10. Está prohibido jugar en el laboratorio.

11. Siempre deberás respetar y usar el equipo de protección personal indicado en

13. Es indispensable que en todos los trabajos experimentales se tenga

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1. Al presentarte al laboratorio deberás vestir una bata de algodón de manga

2. Sobre la mesa de trabajo deberás tener únicamente lo necesario para anotar

4. Antes de realizar cualquier práctica deberás revisar si el material y los

5. Al finalizar la práctica, dejar limpio el material utilizado y limpiar bien la mesa

6. Cualquier material o instrumento que se rompa en el transcurso de la práctica,

7. No introducir una espátula dentro de un frasco de sustancia si no está limpia,

8. Cualquier accidente o anomalía deberá ser notificado inmediatamente al

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Las principales causas de accidentes dentro de un laboratorio se deben al

Cada uno de ustedes puede contribuir, tomando en cuenta las siguientes

1. En los trabajos con sustancias explosivas usar una mínima cantidad.

2. La lámpara de alcohol se debe encender cuando la operación de una práctica

3. Al prender la lámpara de alcohol se deberán alejar sustancias volátiles. Si

4. Los líquidos inflamables no se deben calentar directamente con la flama, sino

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10. La dilución de ácidos concentrados deberá hacerse en un recipiente de vidrio

11. Cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen ácidos,

14. No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo.

15. Nunca succiones con la boca.

16. Pregunta a tus profesores cómo y dónde depositar los residuos.

17. Memorice la ubicación de los dispositivos de seguridad, como son: equipo

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La Bioseguridad es el conjunto de normas y procedimientos que garantizan el control de los

Existen diversos mecanismos responsables de la transmisión de patógenos adquiridos en los

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III. RESULTADO DE APRENDIZAJE

IV. RECOJO DE LA COMPETENCIA

El estudiante conoce, adquiere y practica las principales medidas de bioseguridad.

El 25 de mayo de 2005, la 58 Asamblea Mundial de la Salud aprobó la Resolución WHA58.29,

5.1. Bioseguridad: La bioseguridad es la aplicación de conocimientos, técnicas y equipamientos

 Personal de laboratorio y/o áreas hospitalarias críticas.

5.2. Principios de la bioseguridad:

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