Ing.

en Agrobiotecnología
Genética Microbiana Avanzada- 2022

Microorganismos ambientales como

fuente de enzimas de interés
biotecnológico

Dra. Eleonora Campos

Lab. Enzimas Agroindustriales para Bioprocesos
IABIMO, INTA-CONICET
campos.eleonora@inta.gob.ar
Microorganismos provenientes de ambientes con características
particulares de interés
➢ Hongos Estrategias:
➢ Bacterias ➢ Cultivo
➢ Archea ➢ Metagenómica

(Last Universal Common Ancestor)

2
Temperatura Crecimiento óptimo
Termófilos 50°-70° (pueden crecer a temperaturas mesófilas: 25°-40°)
Hipertermófilos 80°-110°
Psicrófilos <15°C a 4° (tiempos de duplicación de E. coli a 37°C)

Halófilos requieren NaCl para crecer [sal]

Halotolerantes 0 to 1.0 M
Halofilos moderados de 0.4 a 3.5 M
Halófilos extremos 2.0 a 5.2 M (óptimo aprox 3.0 M)
pH
Acidófilos óptimo pH entre 1 y 5.5; sin crecimiento a pH neutro.
Alcalófilos crecimiento óptimo a pH~ 9 y crecen muy lento a pH ≤ 6.5 (o no crecen)
Extracción
de ADN

¿Qué problemas pueden surgir en:

-utilización de aislamientos nativos? ¿Soluciones?
-búsqueda bioinfomática de secuencias?
-screening funcional?
 Biotecnología industrial
Es la obtención de productos comerciales a gran escala utilizando micro-
organismos, generalmente modificados.
Características de los microorganismos de uso industrial:
-ser capaz de crecer a gran escala en un medio relativamente barato
-producir la sustancia de interés en un tiempo relativamente corto de cultivo
-tener alguna forma de reproducción (ej. Esporas) para poder ser inoculada en biorreactores
-ser no patógeno (para humanos, plantas y animales)
-estar genéticamente caracterizados (de manera de permitir modificaciones)

Biorreactor: el recipiente donde se llevan a cabo las fermentaciones (independientemente

del proceso bioquímico) con parámetros controlados (pH, temperatura, aireación, agitación)

100L
Escala de laboratorio: entre 1 y 10 L
Escala Planta piloto: 100 a 3000 L
Escala industrial: 10000 a 300000 L
 Metabolitos primarios Metabolitos secundarios

Se forman durante la fase Se forman cerca o durante la fase estacionaria de

exponencial de crecimiento crecimiento, de manera altamente dependiente de
las condiciones de cultivo.
Las enzimas que digieren polímeros (celulosa, xilano, pectina, almidón), proteínas
y lípidos tienen numerosas aplicaciones comerciales.

Amilasas

Proteasas

Pectinasas

Celulasas
a1-4 b1-4
 Introducción
Aplicaciones industriales de enzimas activas sobre
polisacáridos de pared celular vegetal

•Extracción,
• Bio-modificación Remoción de polvo • Producción de clarificación y
de fibras de espacios entre etanol de segunda estabilización de
• Reducción de la fibras generación, jugos, cervezas,
vinos y aceite de
viscosidad de la Aumento de brillo solventes y ácidos oliva: menor
pulpa Mayor textura y orgánicos viscosidad, mejor
• Aumento del brillo suavidad textura y mayor
• Eliminación de Bioconversión aroma por liberación
tintas y Jabones de compuestos
volátiles
blanqueado para ropa
Alimentos
Papel

•Actividad inmuno- • Degradación de

•Bio-stoning de componentes no
jeans moduladora,
antimicrobiana y digeribles en granos
•Bio-polish de anticancerígena de • Mejora de la calidad
algodón XOS nutricional de forrajes
Textil
Prebióticos Alimentación
animal

Kuhad et al., 2011

 Aplicaciones de enzimas en biorrefinerías celulósicas

Biocombustibles: son combustibles obtenidos a partir de fuentes renovables

de biomasa, con el fin de sustituir en parte los combustibles tradicionales
derivados del petróleo.
Los biocombustibles líquidos más desarrollados son: bioetanol y biodiesel.

Etanol: se utiliza como combustible para vehículos, en mezcla con nafta, en

una proporción aprox 10 %, sin necesidad de adaptación de los motores.

Brasil (mezclas desde 1976). El mínimo es de 25% (25% etanol: 75 % nafta).

USA: E10 (10%), E15 (15%) (E85 o flex, entre 51 y 83% etanol)
Argentina: aumento de corte de 12% a 15% (2017)

-Bioetanol de primera generación (1G): se obtiene a partir biomasa

azucarada (caña de azúcar, sorgo azucarero) o amilácea (maíz, cereales).

-Bioetanol de segunda generación o celulósico (2G): se obtienen a partir de

la celulosa presente en la biomasa (desechos agrícolas, forestales, pasturas).
 Biomasa lignocelulósica
Feedstocks o recursos biomásicos o biomasa lignocelulósica: residuos de cosecha o
de poda forestal, desechos de procesamiento, cultivos energéticos específicos,
pasturas, residuos celulósicos municipales.

Alta disponibilidad

Muy heterogénea

Hemicelulosa
(xilano)
25-40% Polisacáridos
estructurales
Celulosa
35-50%
Lignina
5-25%

https://www.energy.gov/eere/bioenergy/biomass-resources
11
 Ejemplo: Caña de azúcar (Tucumán- INTA Famaillá)

RAC

Bagazo

12
 Pared celular de las plantas

Primaria
Secundaria

13
Loix et al., 2017; https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01867
 Sacarosa

Pre-tratamiento:
25-30% Adecuación del tamaño
Almidón Apertura de la fibra (tratamientos
termo-físico químicos)

70-75%
 Celulosa
Es un homopolímero de unidades de D-glucosa, unidas por enlaces β-1,4

celobiosa

La unidad química de la celulosa es la

β-D-glucosa, pero la unidad estructural
es la celobiosa

© Pearson Education, Inc. 15

 Hemicelulosa
➢ El xilano es la hemicelulosa más abundante de la pared celular vegetal de plantas terrestres
➢ Es un heteropolímero ramificado de cadenas cortas (GP 50-200), cuyo esqueleto principal
son moléculas de D-xilosa, unidas de manera β-1,4
➢ La composición y abundancia de las ramificaciones depende de la biomasa de origen

NR: no reductor
R: reductor
L-fucosa D-galactosa

16
 Nomenclatura y conceptos básicos
Fórmula de monosacáridos: proyección de Fischer y conformación de silla

Extremos reductores y no-reductores

(proyección de Haworth)
Essentials in Glycobiology, 4th edition,
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK579918/
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 Nomenclatura en símbolos para monosacáridos (SNFG)
Symbol Nomenclature for Graphical Representation of Glycans, Glycobiology 25: 1323-1324, 2015, Glycobiology 29:620-624, 2019
Table 1. Monosaccharide symbol nomenclature
SHAPE White Blue Green Yellow Orange Pink Purple Light Blue Brown Red
(Generic)

Filled Hexose Glc Man Gal Gul Alt All Tal Ido
Circle

Filled HexNAc GlcNAc ManNAc GalNAc GulNAc AltNAc AllNAc TalNAc IdoNAc
Square

Crossed Hexosamine GlcN ManN GalN GulN AltN AllN TalN IdoN
Square

Divided Hexuronate GlcA ManA GalA GulA AltA AllA TalA IdoA
Diamond

Filled Deoxyhexose Qui Rha 6dGul 6dAlt 6dTal Fuc

Triangle
DeoxyhexNAc QuiNAc RhaNAc 6dAltNAc 6dTalNAc FucNAc
Divided
Triangle

Flat Di-deoxyhexose Oli Tyv Abe Par Dig Col

Rectangle
Pentose Ara Lyx Xyl Rib
Filled Star

3-deoxy-nonulosonic Kdn Neu5Ac Neu5Gc Neu Sia

Filled acids
Diamond

3,9-dideoxy- Pse Leg Aci 4eLeg

Flat nonulosonic acids
Diamond

Flat Unknown Bac LDmanHep Kdo Dha DDmanHep MurNAc MurNGc Mur
Hexagon
Assigned Api Fru Tag Sor Psi
Pentagon
 Enzimas que actúan sobre carbohidratos

Clasificación en familias en base a su estructura y filogenia (CAZY database)

•Glicosil Hidrolasas (GHs) : hidrólisis y/o rearreglo de uniones glicosídicas

•Glicosil Transferasas (GTs) : formación de uniones glicosídicas

•Polisacárido Liasas (PLs) : clivaje no-hidrolítico de uniones glicosídicas

•Esterasas de carbohidratos (CEs) : hidrolisis de esteres de carbohidratos

•Actividades Auxiliares (AAs) : enzimas redox que actuan en conjunción con las
CAZymas. Agrupa enzimas ligninolíticas y mono-oxigenasas líticas de
polisacáridos (LPMO)

Módulos de unión a carbohidratos (CBMs): módulos no-catalíticos asociados a

las enzimas descriptas.
 Números EC: Enzyme Commission numbers (IUBMB)
https://iubmb.qmul.ac.uk/
➢ Sugerido por la International Union of Biochemistry and Molecular Biology
➢ Es una clasificación numérica para enzimas, basada en la reacción que catalizan.
EC A.B.C.X
A-Tipo general de reacción (del 1 al 6)
EC 1. Oxidoreductasas
EC 2. Transferasas
EC 3. Hidrolasas (enlaces C-O, C-N, C-C y otros)
EC 4. Liasas
EC 5. Isomerasas
EC 6. Ligasas
B-Subclase (naturaleza del enlace): EC 3.2.- glicosil hidrolasas (glicosidasas)
C-Sub-subclase (relacionado al sustrato): EC 3.2.1.- O-glicosidasas
X-Número de serie dentro de su subclase: EC 3.2.1.1 α-amylase
EC 3.2.1.2 β-amylase
EC 3.2.1.4 cellulase
EC 3.2.1.6 endo-1,3(4)-β-glucanase
EC 3.2.1.8 endo-1,4-β-xylanase

20
www.cazy.org
Búsqueda

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 Actividad EC Principales familias GH (CAZy)

Celobiohidrolasa I
EC 3.2.1.176 GH7 (h), GH48 (b)
(extremo reductor)

Celobiohidrolasa II
EC 3.2.1.91 GH6, GH5, GH9, GH48
(extremo no reductor)

Endoglucanasas EC 3.2.1.4 GH5, GH6, GH7, GH8 (b), GH9

β-glucosidasas EC 3.2.1.21 GH1, GH3

Xilanasas EC 3.2.1.8 GH10, GH11, GH30, GH5, GH8

β-xilosidasas EC 3.2.1.37 GH43, GH51

LPMO EC 1.14.99.54 AA9 (antes GH61) (h), AA10 (b)

(h)- solo en hongos/ (b)- solo en bacterias

 Estructura (arquitectura) de dominios

Celulasas libres Más de

(estructura más un CBM
frecuente)

CBM y
Celulosomas
Dockerina

Módulos de
función
desconocida Más de un CD
(X)
Hidrólisis enzimática de la celulosa

24
Hidrólisis enzimática del xilano

25
Estrategias de los microorganismos que degradan polisacáridos

26
Descubrimiento durante la 2° guerra mundial en el Pacifico Sur de un
hongo que degradaba el algodón de las carpas y los uniformes de los
soldados: Trichoderma reesei productor de celulasas (Elwyn T. Reese)

Xylanases
EGL6, Xyloglucanse, cel 74
A) (1,3- 2,4%)
Xyn I, GH11, (0.25%)
Xyn II GH11 (0.1%)
Xyn III GH10 (nd)
Xyn IV GH5 (0.05-0.1%)
 Fermentación
La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico realizado por levaduras y
algunas clases de bacterias, que consiste en la transformación del azúcar en
alcohol etílico y dióxido de carbono.

Fermentación hexosas (C6) Saccharomyces cerevisiae

pH entre 5 y 7
Temp entre 30ºC y 35ºC

Problemas en la producción de bioetanol:

-fermenta solo ciertos mono y disacáridos
(glucosa, fructosa, maltosa y sacarosa) pero no
pentosas
-Etanol: tóxico cuando llega a 10-12%

Modificación de levaduras por ingeniería

genética para mejorar la tolerancia a etanol y
permitir el uso de pentosas

Utilización de más de una cepa de levaduras

 Fermentación de las pentosas

Scheffersomyces (Pichia) stipitis

Las pentosas obtenidas durante la

hidrólisis de la hemicelulosa son
principalmente xilosa y arabinosa.
Pichia sp. (levaduras) pueden asimilar
pentosas, pero su tasa de producción de
etanol es 5 veces menor que la
observada en S. cerevisiae.

29
30
 Hidrólisis y Fermentación Separadas (SHF)

Es un proceso secuencial o en etapas:

-En primer lugar se hidroliza la fracción sólida del material lignocelulósico pre-
tratado, con enzimas para generar azúcares fermentables (glucosa y xilosa).
Esto ocurre en las condiciones de pH y temperatura óptimas para la hidrólisis
(50°C, pH5, 24 a 72 h)

-Una vez que la hidrólisis se completa, el fluido se pasa a otro reactor y se

agrega la levadura que es la encargada de fermentar los azúcares a etanol.
Las condiciones óptimas son 30-34-5°C, pH 5-6, 24 a 72 h.

-Cada etapa del proceso puede ser optimizada (tiempo de reacción,

temperatura, pH, dosis de enzimas, carga del sustrato).

-Permite el reciclado de las enzimas y levaduras.

31
 Sacarificación y Fermentación Simultánea (SSF)
Se realizan la hidrólisis y fermentación en el mismo bioreactor. Ventaja, no
hay que movilizar fluidos que tienen alta carga de sólidos.

La temperatura es la adecuada para el microorganismo (menor que la

óptima de las enzimas). Este proceso opera en condiciones no óptimas
para la hidrólisis ya que hay diferencia en condiciones óptimas de pH y
temperatura de hidrólisis y fermentación. Por eso, el tiempo de proceso es
mayor en SSF que en SHF.

Las levaduras fermentan la glucosa a etanol tan pronto como la glucosa es

producida, esto previene la acumulación de azúcares y disminuye la
inhibición por producto final, aunque hay que tener en cuenta que la
producción de etanol (5 a 10%) puede generar inhibición de las enzimas.

La lignina no se degrada y por lo tanto aumenta la fracción de lignina en el

reactor y esto causa dificultades, como la adsorción de enzimas y
microorganismos.

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 Sacarificación y co-fermentación simultánea (SSCF)
Inclusión de la fermentación de las pentosas en el proceso SSF

Se puede alcanzar con el uso de cultivos mixtos o un microorganismo

recombinante capaz de co-fermentar ambos tipos de azúcares (hexosas y
pentosas)

En el primer caso, es necesario que ambos microorganismos

fermentadores sean compatibles en cuanto a requerimientos de O2, pH y
temperatura.

En general, los microorganismos fermentadores de pentosas tienen

menor tasa de crecimiento que los fermentadores de hexosas, lo que
resulta en una mayor conversión a etanol de hexosas que de pentosas.

La mejor aproximación es la utilización de un mismo microorganismo

modificado genéticamente para utilizar hexosas y pentosas. Es decir,
incorporar en microorganismos fermentadores de hexosas la vía de
fermentación de las pentosas.
33
 Bioprocesos consolidados (CBP)
Se utiliza una comunidad microbiana para la producción de celulasas y
fermentación, por lo cual la producción de enzimas, la hidrólisis
enzimática y fermentación ocurren al mismo tiempo, en un solo bioreactor.

Es el proceso más integrado aunque todavía está en desarrollo ya que

tiene muy baja eficiencia.

Dr. Lee Lynd, Darmouth College/ Mascoma

Bioresources 2(4) · November 2007 Herring et al. 2016. Biotechnol. Biofuels34