Guia para El Funcionamiento de Los Laboratorios de Ensayo de Aguas

Guía para el Funcionamiento de los Laboratorios de Ensayo de Aguas.
Parte II: Criterios para la verificación y validación de los métodos

físico-químicos y microbiológicos
GUIA PARA EL FUNCIONAMIENTO

DE LOS LABORATORIOS DE
ENSAYO DE AGUAS
PARTE II
CRITERIOS PARA LA VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN

DE LOS MÉTODOS DE ENSAYOS FÍSICO-QUÍMICOS Y
MICROBIOLÓGICOS (Revisión 1)
Fecha: 31 de octubre de 2022
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EQUIPO REDACTOR
Coordinador:
CANAL DE ISABEL II, S.A. Pedro Pablo Morillas
Miembros activos:
AGUAS- AÑARBE Itziar Larumbe

Joan Boix
AGUAS DE BARCELONA
Antonio Cabeza de la Fuente
Carmen Moreno
AGUAS MUNICIPALIZADAS DE ALICANTE
José Gallardo
AQUALIA-FCC Jesús Manuel Esteban
CONSORCIO DE AGUAS DE TARRAGONA Josepa Fabregas
CONSORCI BÈSOS TORDERA Carles Carrión
CONSORCIO DE AGUAS DE BILBAO Estíbaliz Alda
EMASA Mª Carmen Assiego de Larriva
EMASESA Manuel Borrego

Cristina Sancho
EMATSA
Dolors Martínez
GAMASER Carina González
Mª José Vázquez
INTERLAB
Inmaculada Simón
IPROMA - EUROFINS Begoña Asensi
LAB. OLIVER - RODES Marta Pedemonte
LABAQUA Mª Pilar González
LABORATORIO LGA Olga Gutiérrez
LABs & TECHNOLOGICAL SERVICES AGQ SL Ramón Bouza

Mikel Manzanos
SERVICIOS DE LA COMARCA DE PAMPLONA
Iñaki Etxarri
PROAGUAS COSTABLANCA José Luis Alarcón
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Expertos en ensayos microbiológicos:
AGUAS DE BARCELONA Belén Galofré
EMASESA Lucila Cuberos
EMATSA Pilar Caballero
IPROMA - EUROFINS Inmaculada Solís
LAB. OLIVER-RODES Miriam Monedero
Agradecemos su colaboración al resto de expertos del resto de empresas

participantes, así como a los redactores de las revisiones anteriores de este
documento.
En memoria de Lluís Vázquez (Aguas de Barcelona). Nuestro amigo y compañero.
Descanse en paz.
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CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 6
2. OBJETO ....................................................................................................................... 7
3. SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO .............................................................. 8
4. VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS (36, 37, 38, 39) .............................. 11
4.1. VERIFICACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS .................................... 11
4.2. VALIDACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS ....................................... 13
4.2.1. VALIDACIÓN EN ENSAYOS FISICO-QUIMICOS CUALITATIVOS .. 14
4.2.2. VALIDACIÓN EN ENSAYOS FISICO-QUIMICOS CUANTITATIVOS 16
4.3. INCERTIDUMBRE DE ENSAYOS FÍSICO-QUÍMICOS ............................ 29
A) ESTIMACION DE LA COMPONENTE DE INCERTIDUMBRE DE
B)
PRECISIÓN INTERMEDIA (uR) .......................................................................... 31
SESGO (usesgo) ....................................................................................................... 32

ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE DEL
B.1) A partir de datos de material de referencia matricial...................................... 32

B.2) A partir de muestras adicionadas .................................................................... 34
B.3) A partir de datos de ejercicios de intercomparación ...................................... 35
4.4. VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN EN ENSAYOS MICROBIOLOGICOS ... 38
4.4.1. MÉTODOS MICROBIOLOGICOS CUALITATIVOS .............................. 41
A) Límite de detección (LD) ............................................................................. 41
B) Otros parámetros .......................................................................................... 43
4.4.2. MÉTODOS MICROBIOLOGICOS CUANTITATIVOS ........................... 45
A) Sensibilidad, Especificidad, Tasa de falsos positivos, Tasa de falsos
negativos, Eficiencia............................................................................................... 46
B) Precisión (Repetibilidad) .............................................................................. 49
C) Precisión (Reproducibilidad)........................................................................ 50
D) Tasa de Recuperación relativa...................................................................... 53
E) Incertidumbre del RECUENTO ................................................................... 54
4.5. INCERTIDUMBRE DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS ............................ 56
4.6. MÉTODOS DE FABRICANTES Y KITS COMERCIALES ............................ 65
4.7. MÉTODOS ON LINE ......................................................................................... 66
4.7.1. Introducción ...................................................................................................... 66
4.7.2. Verificación/validación .................................................................................... 66
4.8. MÉTODOS IN SITU ........................................................................................... 68
4.9. ASIGNACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE AL MÉTODO DE ENSAYO ...... 69
4.10. OTRAS CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE .............................. 69
4.11. CRITERIOS GUIA PARA LA EXPRESIÓN DE RESULTADOS ................. 69
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A) PARÁMETROS FÍSICO – QUÍMICOS........................................................... 69

B) PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS .......................................................... 71
5.- PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD......................................................... 73
6. ACTUALIZACIÓN DE LA VERIFICACIÓN O LA VALIDACIÓN DEL
MÉTODO ....................................................................................................................... 74
7. CONTROL DE LOS DATOS Y GESTIÓN DE LA INFORMACIÓN .................... 74
8. REFERENCIAS ......................................................................................................... 76
9. ANEXOS .................................................................................................................... 80
ANEXO I: EVALUACIÓN DE LA LINEALIDAD ................................................. 81
ANEXO II: EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ............................................. 87
ANEXO III: CÁLCULO DE LA PRECISIÓN .......................................................... 89
........................................................................................................................................ 89
ANEXO IV: EVALUACIÓN DE LA VERACIDAD ............................................... 94
ANEXO V: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE CON MATERIAL DE
REFERENCIA ........................................................................................................... 97
ANEXO VI: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE
CONTROL INTERNO ............................................................................................. 101
ANEXO VII: COMPARACIÓN PARA EL CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE
ASOCIADA A LA ADICIÓN ................................................................................. 110
ANEXO VIII: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE DATOS
DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN ..................................................... 112
ANEXO IX: OBTENCIÓN DEL VALOR DE REFERENCIA EN MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS ............................................................ 118
ANEXO X: CÁLCULO DE LA SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, TASA DE
FALSOS POSITIVOS, TASA DE FALSOS NEGATIVOS, SELECTIVIDAD Y
EFICIENCIA ............................................................................................................ 122
ANEXO XI: VERIFICACIÓN DE LA REPETIBILIDAD SEGÚN INDICE DE
DISPERSIÓN DE POISSON ................................................................................... 125
ANEXO XII: CÁLCULO DE LA REPRODUCIBILIDAD SEGÚN LA UNE-EN
ISO 19036 ................................................................................................................. 127
ANEXO XIII: VERIFICACIÓN DE LA TASA DE RECUPERACIÓN RELATIVA
CUANDO LA NORMA INCLUYE CRITERIOS ................................................... 131
ANEXO XIV: CÁLCULO DE LA TASA DE RECUPERACIÓN RELATIVA
CUANDO LA NORMA NO INCLUYE CRITERIOS ............................................ 134
ANEXO XV: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN ENSAYOS
MICROBIOLÓGICOS ............................................................................................. 136
ANEXO XVI: EXPRESION DE RESULTADOS ................................................... 141
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1. INTRODUCCIÓN
Este documento constituye la segunda parte de la Guía para el funcionamiento

de los Laboratorios de Ensayos de Aguas, editada por la Asociación Española de
Abastecimientos de Agua y Saneamiento (AEAS) a través de sus Comisiones
Segunda y Quinta. En él, se tratan aspectos esenciales relacionados con las
actividades de ensayo, fundamentales dentro de los Sistemas de Gestión, como
son la elaboración de los procedimientos de ensayo, la validación y estimación
de incertidumbre, así como el control y expresión de los datos obtenidos.
Se publica la revisión 1 con el fin de atender e intentar dar respuesta a la nueva

versión de la norma UNE-EN ISO/IEC 17025, así como a cambios derivados del
ámbito regulador.
La elaboración de la documentación y, en particular, el desarrollo de los métodos

de ensayo que el laboratorio utiliza para llevar a cabo el análisis de sus muestras
son una parte fundamental de todo este proceso. Por otro lado, el laboratorio
debe aplicar métodos que satisfagan los requerimientos del cliente y que sean
apropiados para los ensayos que realiza; las actividades de verificación y
validación constituyen la forma de demostrar que se cumplen los requisitos
particulares para un uso específico previsto.
En esta guía se proponen diversas pautas para la verificación y validación de los

métodos de ensayo en determinaciones físicas, químicas y microbiológicas que
permiten asegurar la idoneidad de los mismos, debiendo evaluarse parámetros
como veracidad, precisión e incertidumbre de medición. En cualquier caso, debe
asumirse que estas actividades suponen siempre una ponderación entre costes,
tiempos de ejecución, riesgos asumibles y capacidades técnicas disponibles.
Es necesario además establecer pautas para la expresión de los resultados

obtenidos en relación con la incertidumbre declarada de forma que puedan
tomarse decisiones sobre el cumplimiento o no de especificaciones.
También debe asegurarse que tanto los cálculos realizados en la aplicación de

los métodos de ensayo, como la transferencia de los resultados obtenidos, están
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sujetos a verificación. Por ello, deben validarse las aplicaciones informáticas

desarrolladas por el laboratorio para obtener, procesar y registrar los datos
derivados en su actividad, con el objetivo de demostrar que son adecuadas al
uso previsto.
En este documento se incluyen definiciones tomadas de referencias concretas

reconocidas. Además, está disponible el documento ‘Glosario de términos’ para
su consulta.
2. OBJETO
El objeto del presente documento es proponer una sistemática que permita llevar
a cabo las actuaciones necesarias para la adecuada selección de métodos de
ensayo, la verificación o validación de los mismos, la evaluación de incertidumbre
de medición, así como establecer pautas para la expresión de resultados de forma
que se pueda garantizar el mantenimiento de la competencia técnica de los
laboratorios. Para ello se aportan criterios homogéneos de funcionamiento
basados en la experiencia, profesionalidad, coherencia y buena práctica de los
laboratorios integrantes del Grupo de Trabajo, de tal forma que el mismo pueda
ser un referente a tener en cuenta.
El Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social recomienda este documento

para la validación de métodos de ensayo (consultar el enlace
https://www.mscbs.gob.es/profesionales/saludPublica/saludAmbLaboral/calidad
Aguas/preguntasFrec.htm#22).
Los ejemplos incluidos en esta guía deben interpretarse como tal, ya que pueden
existir otras alternativas igualmente válidas.
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3. SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO
Los documentos relacionados con los métodos de ensayo son procedimientos

escritos, actualizados y aprobados que describen de forma específica las
actividades de las que son objeto, para garantizar y asegurar que el personal que
hace uso de ellos disponga de la información necesaria para proceder
correctamente.
Los documentos o procedimientos utilizados por el laboratorio deben contemplar

todas las actividades que este realice, tanto de ensayo como de apoyo al mismo,
como pueden ser la toma, manipulación, transporte y conservación de muestras,
el uso y funcionamiento de equipos e instrumentos de medición, la verificación o
validación y la evaluación de la incertidumbre de medición, el aseguramiento de
la validez de los resultados, el análisis, evaluación y tratamiento de datos, etc.
Su contenido debe ser tal que evite errores de interpretación y que permita la
reconstrucción de las actividades de ensayo desarrolladas.
Los métodos de ensayo deben ser seleccionados de forma que satisfagan las
especificaciones de los clientes y las partes interesadas, así como los requisitos
reglamentarios vigentes que puedan ser de aplicación. En un laboratorio de
ensayo de aguas, las opciones de las que se dispone son los métodos
normalizados, los métodos basados en normas o documentos normativos,
incluidos los métodos de fabricantes y kits, y los métodos desarrollados
internamente por el propio laboratorio.
Los métodos normalizados se basan en normas internacionales, nacionales o

documentos publicados por organismos y entidades de reconocido prestigio.
Estos documentos suelen incorporar información que corrobora su validez
técnica, lo que simplifica en gran medida los trabajos de puesta en marcha de
métodos en un laboratorio ya que a este le basta con verificar su capacidad para
llevarlo a cabo en esas condiciones (ver apartado 4).
Cuando el método normalizado no contempla todas las especificaciones para que

se pueda llevar a cabo el ensayo, se debe completar con aquellos aspectos
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necesarios para su realización. En ese caso se trata de métodos basados en

normas, y se debe confirmar y validar que las aportaciones incluidas mantienen
el método de ensayo adecuado para el uso previsto (ver apartado 5).
Finalmente, en algunos casos particulares podría no disponerse de un método

normalizado que tomar como referencia; en este caso el laboratorio debe definir
y desarrollar su propio método. Antes de su uso en rutina, el laboratorio debe
realizar las pruebas necesarias para confirmar que se adecúa al uso previsto y
contempla todos los requerimientos que le son de aplicación, bien de los clientes
o en general de las partes interesadas. Puede incluso que la validación individual
del laboratorio no sea suficiente, debiendo recurrirse a colaboraciones externas
con otros laboratorios o entidades independientes.
En caso de que el laboratorio disponga de más de un procedimiento de ensayo

para una misma determinación, deberá utilizar aquel que sea el adecuado para
el uso previsto y deberá informar al cliente del método seleccionado. Si el cliente
especifica un método concreto, el laboratorio debe informar al cliente si dicho
método no es adecuado.
En algún caso, como son los ensayos microbiológicos, el laboratorio tendrá la

opción de implantar métodos alternativos, que han sido validados por
comparación con un método ya normalizado (de referencia) y de acuerdo a un
estándar aceptado (1,2,3). Son generalmente reconocidos por la comunidad
científica o bien por la administración pública, como equivalentes al método de
referencia (4). Para la adopción de este tipo de métodos, el laboratorio deberá
realizar las pruebas que demuestren su correcta implantación en el mismo
sentido que las indicadas para los métodos normalizados. El laboratorio deberá
aportar documentación que evidencie la equivalencia respecto al método
normalizado (1).
En cuanto al contenido y estructura de los documentos donde se describen los

métodos de ensayo, existen varias alternativas, siendo un ejemplo de contenido
el siguiente:
1. Identificación apropiada.
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2. Ámbito de aplicación.
3. Descripción del tipo de muestra a ensayar.
4. Parámetros y rangos a determinar.
5. Documentos de referencia.
6. Aparatos y equipos, incluyendo las especificaciones técnicas.
7. Patrones y materiales de referencia necesarios.
8. Condiciones ambientales requeridas y cualquier período de estabilización
necesario.
9. Descripción del procedimiento, incluyendo lo siguiente:
a. Colocación de marcas de identificación, transporte, almacenamiento y
preparación de los objetos de ensayo.
b. Comprobaciones a realizar antes de comenzar el trabajo.
c. Verificación del correcto funcionamiento de los equipos y, cuando
proceda, calibración y ajuste de los equipos antes de utilizarlos.
d. Método de registro de observaciones y resultados.
e. Medidas de seguridad que tengan que adoptarse.
10. Criterios o requisitos de aceptación/rechazo.
11. Datos que deban registrarse y método de análisis y presentación.
12. Incertidumbre o procedimiento para evaluar la incertidumbre.
Cuando el laboratorio decide contar con un procedimiento interno para la

aplicación de una norma o documento normativo, el contenido del primero no
debe entrar en contradicción con la norma aplicada, pero sí complementarla con
información no relacionada con el fundamento y el desempeño del método.
El laboratorio debe asegurarse que conoce los posibles cambios que surjan en
las versiones de las normas o documentos normativos que aplique, y que tiene
capacidad para evaluar los cambios que se producen, cómo afectan a su actividad
y qué medidas tiene que poner en marcha para incorporar esos cambios en sus
ensayos de rutina. Estas actuaciones deben quedar registradas.
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4. VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS (36, 37, 38, 39)
4.1. VERIFICACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS
Es esencial para los laboratorios que el proceso de selección de métodos permita:
• Conocer el estado del arte para aquellos ensayos que quieren incorporar a
sus actividades de rutina.
• Aplicar métodos ya consensuados y reconocidos, existiendo mayor
homogeneidad en las técnicas aplicadas y facilitando la comparabilidad de
resultados.
• Reducir las actuaciones internas de confirmación de la idoneidad de los
métodos seleccionados. En la medida que el laboratorio aplica directamente
normas o documentos normativos disminuye la necesidad de demostrar su
validez, ya que estos ya han sido objeto de validación mediante estudios
colaborativos siendo adecuados para su uso previsto definido en el alcance
correspondiente.
De acuerdo con este último punto, el laboratorio debe ‘comprobar’ su capacidad

para aplicar el método normativo seleccionado, corroborando la información de
desempeño que se incluye y demuestre que el método funciona adecuadamente
en el laboratorio; es decir, el laboratorio no debe validar el método recogido en
una norma o documento normativo cuando lo aplica tal cual, por lo que la carga
de trabajo puede ser sustancialmente menor frente a las actividades de validación
propiamente dichas.
Así, si la norma incluye información relativa a interferencias para la matriz o

matrices de aplicación en el laboratorio, este no deberá complementar esta
información con estudios adicionales. Confirmará la posibilidad de aplicar el
intervalo de trabajo ya declarado y su capacidad para conseguir la veracidad y
precisión señaladas. Si la norma incluye referencia expresa a los instrumentos de
medición y el laboratorio los utiliza, no se deberían diseñar experimentos internos
para confirmar la función de respuesta del método en el intervalo declarado.
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La verificación de un método por parte del laboratorio debería incluir una

correlación estadística con el método validado existente antes de su uso. Este
mismo planteamiento se aplica a la evaluación de la incertidumbre.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que no todos las normas o documentos
normativos publicados son iguales. Si en ellos no se describen actividades de
validación o las características de desempeño no están validadas, o solo
parcialmente, la verificación no es directamente posible y es necesaria la
validación.
El rendimiento del método debería demostrarse mediante el cumplimiento de las

especificaciones marcadas, incluyendo veracidad, precisión y otros parámetros,
para lo cual puede recurrirse al uso de:
• Muestras blanco o medios no inoculados (microbiología), para evaluar posible

contaminación;
• Muestras de control fortificadas para evaluar la recuperación;
• Duplicados de muestras para evaluar la precisión;
• Patrones de verificación de la calibración/ajuste;
• Muestras de control de calidad y su evaluación mediante el uso de gráficos
de control; y
• Ejercicios de intercomparación adecuados al uso (matrices representativas,
parámetros analíticos, niveles de concentración, etc.).
También debe realizarse la verificación de modificaciones menores frente al

documento normativo (por ejemplo, cambio del tipo columna cromatográfica,
cambio del medio de cultivo no selectivo, variación en las diluciones, pequeña
variación en temperaturas de incubación).
Los parámetros necesarios que considerar en el proceso de verificación

dependerán del tipo de método y de muestras sometidas a ensayo. Se debería
utilizar un número estadísticamente significativo de muestras en el proceso de
evaluación, cubriendo todas las matrices de los ensayos de rutina. La evaluación
de la veracidad (sesgo) y de la precisión deben ser siempre consideradas.
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Para los análisis de trazas, el laboratorio debería confirmar los límites de

detección y de cuantificación. Para los métodos cualitativos, conviene realizar
estudios de correlación con métodos validados existentes o comparaciones con
resultados conocidos.
El laboratorio deberá validar un método cuando se realizan cambios significativos

frente al contenido de la norma o documento normativo (matriz a ensayo
diferente de la declarada, cambio de técnica, diferente disolvente de extracción,
cambios en la formulación de un medio de cultivo selectivo, diferente método de
confirmación, cambios en los tiempos de incubación).
4.2. VALIDACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS
En general, la validación debe confirmar que el método del laboratorio se

comporta de forma adecuada en todo el rango de concentraciones habituales y
en las matrices de ensayo a analizar. Por tanto, es necesario especificar estas
características antes de realizar la validación.
Este proceso comprende un conjunto de pruebas sistemáticas y programadas

que tenga en cuenta todas las etapas del análisis de rutina, incluyendo
preparación (extracción, pre-concentración, etc.) y cualquier tratamiento
aplicado a las mismas que permita comprobar las características de medición en
las que se basa el método de ensayo para el uso pretendido.
La amplitud del proceso de validación depende de varios factores, tales como la

naturaleza del método (cualitativo o cuantitativo), la existencia de normas
internacionales, el establecimiento de matrices equivalentes (6), etc.
El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado

para la validación, la especificación de los requisitos y una declaración sobre la
aptitud del método para el uso previsto (5).
Finalmente, debe considerarse la revalidación del método a partir de datos de

intercomparaciones, controles de calidad internos o externos, etc. en caso
necesario.
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4.2.1. VALIDACIÓN EN ENSAYOS FISICO-QUIMICOS CUALITATIVOS
En estos métodos, ya sean sensoriales o instrumentales, la precisión no puede

ser expresada como una desviación estándar o desviación estándar relativa, pero
puede ser expresada como tasas de verdaderos y falsos positivos y negativos, de
modo que la concentración de corte puede ser determinada estableciendo las
tasas de falsos positivos y negativos en una cantidad de niveles por encima y por
debajo de la concentración de corte esperada. Este valor es el límite de decisión,
y se fija para un nivel de significación determinado en cada protocolo.
Además del establecimiento del límite de decisión, la caracterización del sistema

de medida se realiza evaluando sensibilidad y especificidad.
Para estos métodos se entiende por:
Sensibilidad – probabilidad de que la respuesta analítica resulte positiva cuando

en la muestra estudiada está realmente presente el analito o sustancia de interés
en el límite de decisión o por encima de él. Se calcula como:
=
+ )
Se considera que el método tiene buena sensibilidad cuando el valor obtenido es

≥ 0,95.
Especificidad – probabilidad de que la respuesta analítica resulte negativa debido

a que en la muestra estudiada NO existe físicamente el analito o sustancia de
interés, o se encuentra por debajo del límite de decisión. Se calcula como:
=
+ )
Se considera que el método tiene buena especificidad cuando el valor obtenido

es ≥ 0,95. Donde:
(A) Número de ensayos Positivos con testigos positivos verdaderos
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(B) Número de ensayos Positivos con testigos negativos verdaderos
(C) Número de ensayos Negativos con testigos positivos verdaderos
(D) Número de ensayos Negativos con testigos negativos verdaderos
La lectura de los resultados se expresa según la tabla siguiente:
Valor de la Característica
Presente Ausente
RESULTADO Positivo A B A+B
OBTENIDO Negativo C D C+D
A+C B+D
4.2.1.1.- Ensayos de cribado (barrido)
Las técnicas de barrido (o cribado), denominadas habitualmente como screening,

generan una respuesta binaria (sí/no, presencia/ausencia) cuyo principal interés
radica en su utilización como etapa previa a la cuantificación, en caso de ser
necesaria, cribando las muestras. Únicamente se someten a un análisis
cuantitativo aquellas muestras cuya respuesta es positiva, es decir, aquellas en
las que se detecte la presencia de un analito por encima de un nivel permitido
(límite de decisión). Estos ensayos resultan particularmente interesantes para
analizar muestras cuyos analitos tienen una baja probabilidad de estar presentes.
Límite de decisión
Puede establecerse a partir del límite de cuantificación declarado en la validación

de un método cuantitativo o bien basándose el en límite de detección del propio
método de screening. La detección de un determinado analito a un nivel de
concentración establecido debe expresarse con un nivel de confianza
determinado, no siendo necesario establecer un criterio estricto para el número
de falsos positivos, si bien debe garantizarse que se detecten al menos el 95%
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de las muestras positivas (es decir, no superar una probabilidad de falso rechazo
del 5%).
Como criterio general se establece como límite de decisión el 50% del LQ,
cualquier modificación a este criterio debe quedar recogido en el protocolo de
validación.
Sensibilidad
Se evalúa esta característica a partir del análisis de blancos o muestras naturales

de muy baja carga. Se debe contar con un número significativo de muestras
analizadas (al menos 20), en condiciones de precisión intermedia. Se establece
como criterio de aceptación que la señal obtenida sea inferior a 1/3 del LQ en el
95% de los casos.
4.2.2. VALIDACIÓN EN ENSAYOS FISICO-QUIMICOS CUANTITATIVOS
Los parámetros que pueden caracterizar la validación de un método de ensayo

físico-químico son: selectividad, intervalo de trabajo, linealidad, sensibilidad,
límite de detección, límite de cuantificación, robustez, precisión, veracidad
(sesgo) e incertidumbre. En función del método, el laboratorio deberá evaluar
todos estos parámetros o bien una parte de ellos en su validación.
4.2.2.1. INTERVALO DE TRABAJO Y FUNCIÓN DE RESPUESTA DE LA TÉCNICA

Es el intervalo en el que el parámetro analítico puede ser determinado con una
veracidad y precisión establecidas (10)y proporciona resultados con una
incertidumbre aceptable (9).
Los ensayos para establecer el intervalo de trabajo deben realizarse para

diferentes niveles de concentración, incluyendo el límite de cuantificación del
método, así como la concentración máxima definida. De manera general, el límite
de cuantificación es específico para cada analito y cada matriz.
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En el caso de límites superiores de concentración, para el análisis de aguas se

considera aceptable aplicar diluciones sobre muestras, si bien deben cumplirse
los criterios de calidad definidos.
La función de respuesta de una técnica indica la aptitud del mismo para obtener
resultados proporcionales a la concentración del analito (10). Se establece
generalmente analizando una serie de patrones que cubran el intervalo deseado
de la calibración instrumental. En aguas, es habitual utilizar patrones preparados
por el propio laboratorio directamente sobre agua para uso en análisis de
laboratorio (11).
NOTA: Si existen interferencias debidas a la matriz que no pueden ser eliminadas o controladas,
debe evaluarse la necesidad de emplear patrones de calibración preparados sobre matrices o
utilizar el método de adiciones.
Para el estudio de la función de respuesta, las normas técnicas recomiendan

trabajar en un intervalo de 3 a 7 niveles de concentración (12). En la medida de
lo posible se establecerá una distribución de los niveles de forma equidistante.
En el caso que estén regulados Valores Paramétricos o Niveles de Calidad
Aceptable se recomienda incluir estos valores como nivel de control.
Estas mismas normas indican que un mayor número de niveles de calibración no

influyen en una mejora significativa en la fiabilidad de los resultados.
Una primera forma intuitiva y sencilla de evaluar la función de respuesta es la

representación gráfica (ver ejemplo del Anexo I, parte 1) de los datos de
calibración y su correspondiente regresión, aunque este método aporta una
información principalmente visual que puede ser incompleta. A partir de esta
representación, se obtiene el coeficiente de determinación (r2) (ver ejemplo
del Anexo I, parte 2). Este coeficiente proporciona la correlación entre las
variables concentración y señal analítica. Su valor se encuentra siempre
comprendido entre 0 y 1, siendo 1 el valor de mejor correlación, pero
dependiendo de la técnica analítica. De forma general, se pueden aceptar valores
mayores o iguales a 0,99.
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Si bien, el coeficiente de determinación es una herramienta para determinar, de

forma preliminar, la linealidad de la recta de regresión en su conjunto no evalúa
el grado de ajuste de cada uno de los puntos experimentales que intervienen,
por lo que su empleo no es suficiente para establecer la función de respuesta de
un método. Por lo tanto, es necesario completar dicho estudio con alguna de las
siguientes opciones:
A) Análisis de residuales de regresión (14). El residual es, para cada

nivel de concentración, la diferencia entre el valor obtenido una vez
realizado el ajuste y el valor de referencia del patrón empleado. Estos
valores se pueden representar en un gráfico donde la coordenada X es
la concentración teórica e Y es la residual y se evalúan tal y como se
indica en el ejemplo del Anexo I, parte 3. Como criterio de aceptación el
laboratorio puede partir del tratamiento estadístico de los resultados
obtenidos en sus pruebas de confirmación de la función respuesta del
método, en condiciones de repetibilidad.
B) Desviación del factor de respuesta en todo el intervalo de trabajo

(RSDfr). El factor de respuesta se define como el cociente entre la señal
del instrumento para una concentración (habiendo restado la señal de la
ordenada en el origen) y la propia concentración del analito. Sus valores
deben ser aproximadamente constantes y, para comprobarlo, se calcula
la desviación estándar de la serie formada por los factores de respuesta
en todo el intervalo de trabajo. El valor de RSDfr depende del método de
ensayo, pudiendo variar desde un 10% (métodos espectrofotométricos)
hasta un 25% (métodos cromatográficos) (12) (ver ejemplo del Anexo I,
parte 1, parte 4).
Aunque es recomendable trabajar en intervalos lineales, cuando las condiciones

instrumentales no lo permitan o sea necesario trabajar en un intervalo más
amplio para evitar diluciones sistemáticas, se podrá recurrir a una función
matemática no lineal que permita establecer la relación entre concentración y
señal analítica. En cualquier caso, se deben establecer criterios de aceptación
que aseguren la conveniencia y bondad de este tipo de ajuste (15).
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En todos los casos (lineales y no lineales), se deberían establecer controles que

garanticen el mantenimiento de la respuesta y la obtención de resultados con la
precisión y veracidad requeridas (15,16).
4.2.2.2. SELECTIVIDAD
La selectividad es la capacidad de un método para determinar exacta y

específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en la
matriz bajo condiciones de prueba establecidas (6,7). En algunos casos puede ser
necesario efectuar estudios de selectividad/especificidad o confirmación de la
identidad (9) para evaluar la existencia de interferencias (10)y deberán establecerse
las medidas para su control.
Es imposible considerar todas las interferencias potenciales, por lo que es

importante contemplar las referencias bibliográficas y el conocimiento previo del
método con el fin de acotar el estudio. En ausencia de referencias bibliográficas,
el estudio de interferencias puede hacerse mediante el análisis de matriz con bajo
contenido en analito y presencia de interferentes de forma natural o adicionados.
El método se considera selectivo siempre y cuando se cumplan los objetivos de

recuperación y precisión prefijados.
4.2.2.3. SENSIBILIDAD
La sensibilidad de un método analítico se corresponde con el cociente entre el

cambio en la respuesta de un instrumento y el cambio correspondiente en el
estímulo, generalmente concentración de analito (17).
En sistemas instrumentales, la sensibilidad está representada por la pendiente de

la recta de calibración que puede ser determinada mediante procedimiento de
ajuste por mínimos cuadrados (7).
Los ensayos de validación pueden servir para establecer un valor de sensibilidad

de referencia que podrá verificarse a lo largo del tiempo en los ensayos de rutina,
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considerando un nivel de variabilidad aceptable y predefinida (7). En el Anexo II

se muestra un ejemplo al respecto.
4.2.2.4. LÍMITE DE DETECCIÓN (LD)
En términos generales, el límite de detección es la menor cantidad o

concentración de un analito que puede detectarse de manera fiable o
diferenciada por un método específico en una matriz determinada. (7)
La bibliografía propone distintas opciones para su estimación, resumidas en la

tabla I.
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Tabla I: Métodos de estimación del límite de detección y del límite de

cuantificación
REFERENCIA LÍMITE DE DETECCIÓN (LD) LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)

También lo denomina límite de determinación. No
=3· considera adecuado establecerlo como un múltiplo fijo
dondeS0 es la desviación típica de la media de del límite de detección (típicamente 2). No se
IUPAC
6 determinaciones completas e independientes recomienda aquí el uso de este tipo de límite en la
THOMPSON
sobre una muestra natural con baja validación. Prefiere establecer una concentración a
concentración de analito partir de la cual la incertidumbre es aceptada y
convenida entre el laboratorio y el cliente
= !̅ + 3 ·
= !̅ + 10 ·
donde !̅ es la media de una serie de
dondeS0 es la desviación típica de la media de medidas
determinaciones sobre un blanco de muestra, o
realizadas del mismo modo que las definidas para el
PS 15 con una muestra de muy bajo contenido, y S0
LD.
es la desviación típica de la media de un mínimo
O bien a partir del límite de detección:
=3·
de 7 determinaciones completas e
independientes
> 0:
10 ·
Si
Puede calcularse del mismo modo que en la
=
%
&
referencia anterior, o bien puede calcularse
instrumentalmente mediante la siguiente Donde Sb es la desviación típica del valor de la
3· %
expresión: ordenada de la recta obtenida por regresión lineal, y
=
&
NATA
m su pendiente.
< 0:
Donde Sb es la desviación típica del valor de la
− + 10 · %)
Si
ordenada de la recta obtenida por regresión
=
&
lineal, y m su pendiente.
=5·
No define su cálculo, pero indica que el método de
dondeS0 es la desviación típica relativa de la
análisis utilizado será capaz, como mínimo, de medir
media de una serie de determinaciones sobre
un blanco de muestra. concentraciones iguales al valor paramétrico con un
límite de cuantificación igual o inferior al 30 % del
RD140/2003
También es: valor paramétrico pertinente
=3·
RD 902/2018
,
donde S1 es la desviación típica relativa dentro A partir del 1 de enero de 2020 es utilizado como
de un lote de una muestra natural que contenga criterio de funcionamiento de los métodos
baja concentración del parámetro
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4.2.2.5. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN (LC)
El límite de cuantificación corresponde al nivel mínimo de concentración

establecido en el proceso de validación desarrollado para una matriz determinada
en el que se cumplen los valores objetivos de veracidad y precisión, o
incertidumbre. Estos valores suelen ser superiores a los obtenidos en el resto del
intervalo de medida y pueden diferir de los establecidos en textos legales para
otros niveles diferentes de concentración (18).
La bibliografía propone distintas opciones para su estimación, resumidas en la

tabla I. En cualquier caso, el laboratorio deberá comprobarlo experimentalmente
en sus matrices de ensayo para el intervalo de trabajo definido para cada método
como, por ejemplo:
Preparar un volumen suficiente del agua matriz representativa del ámbito de

aplicación del método sin que contenga el analito a medir. De no ser posible,
el laboratorio prepara una solución lo más representativa posible de la matriz
a estudio.
Fortificar este material con una cantidad de analito en un valor de

concentración correspondiente al límite de cuantificación establecido. Dividir
el volumen total en, al menos, cinco alícuotas idénticas que se ensayan en
condiciones de precisión intermedia, y repitiendo el análisis de cada alícuota,
al menos, dos veces en condiciones de repetibilidad. Hay que tener en cuenta
el tiempo de estabilidad de la muestra para la matriz evaluada. Si no se puede
garantizar esta estabilidad, realizar tantas preparaciones como sea necesario.
Se obtiene así una matriz de datos como sigue:
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Repeticiones
Serie
1 … r
1 x1,1 … x1,r
… … … …
i xi,1 … xi,r
… … … …
n xn,1 … xn,r
A partir de los resultados, calcular la media !̅-. y la desviación estándar ̅

-/
del conjunto de valores. Se acepta el valor estimado como límite de

cuantificación (LC) cuando se cumple:
!̅-/ − 2 · -/ > LC – 60% · LC
!̅-/ + 2 · -/ < LC + 60% · LC
4.2.2.6. ROBUSTEZ
Es la medida de la capacidad de permanecer inalterados frente cambios en las

condiciones experimentales tales como tiempo de conservación de los reactivos,
pH, temperatura, etc., que pueden afectar a los resultados de un mismo método
aplicado en diferentes condiciones (7).
En el caso que el laboratorio utilice métodos no basados en norma o bibliografía

de referencia, se recomienda que investigue y documente si variaciones en las
condiciones de medida pueden provocar cambios significativos en los resultados
obtenidos. Deberían identificarse y controlarse las posibles fuentes de variación
e incluirse en el estudio de valores de precisión y veracidad desarrollado durante
la validación del método. Estos estudios pueden ser llevados a cabo sobre
blancos, muestras dopadas con concentración conocida, materiales de referencia,
ejercicios de intercomparación, etc.
4.2.2.7. PRECISIÓN
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Es el grado de concordancia entre los valores obtenidos por medidas repetidas

en la misma muestra o similares en condiciones determinadas de repetibilidad,
precisión intermedia y reproducibilidad (17). La medida de la precisión se expresa
habitualmente en términos de imprecisión y se determina como desviación
estándar del conjunto de los resultados obtenidos. A menor precisión, mayor
desviación estándar. Se relaciona con errores aleatorios.
En los estudios de validación, la precisión debe evaluarse en condiciones de

precisión intermedia, es decir, variando en lo posible los equipos, los analistas u
operadores, las condiciones ambientales, las muestras, etc. El laboratorio deberá
tener en cuenta si debe realizar además un estudio de precisión en condiciones
de repetibilidad, es decir, mismo procedimiento de medición, mismos operadores,
mismo sistema de medida, mismas condiciones de operación y mismo lugar en
un corto periodo de tiempo (20).
La desviación estándar de precisión intermedia (SRW) debe calcularse sobre, al

menos, 7 grados de libertad (10). Se puede expresar como un coeficiente de
variación o desviación estándar relativa.
∑ !5 − !̅ )6
= 3
12
−1
SRW (%) = (SRW /x8)*100
Las formas más comunes de estimar la precisión intermedia son:
- Muestras de control estables que cubran todo el proceso analítico. Cuando

una muestra de control estable cubre todo el proceso analítico y tiene una
matriz similar a las muestras reales, la precisión intermedia a ese nivel de
concentración puede ser estimada del análisis de muestras de control. En
este caso, la desviación estándar de precisión puede calcularse como la
desviación de todo el conjunto de datos disponibles. Deberán incluirse
muestras a distintos niveles de concentración. El valor numérico de la
precisión intermedia se obtiene como 912 = 12
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- Muestras de control para diferentes matrices y niveles de concentración.

Cuando una solución de control sintética se usa como control de calidad,
y la matriz de la muestra de control no es similar a la matriz de las
muestras reales, debemos de tener en cuenta las incertidumbres de las
diferentes matrices. En este caso, se deberá tener en cuenta los siguientes
términos:
o Duplicados de muestras reales (fortificadas o no) (SRW)
o Muestras de control sintéticas (SRW)
El valor de la precisión intermedia se obtiene de la composición de las 2

componentes anteriores, tanto la calculada con las soluciones de control
sintéticas utilizadas en los controles de calidad (SRW,stand), y la asociada al
efecto matriz, a partir de los duplicados de muestras reales (SRW):
912 = : 6
12,<=>?@ + 6
A
- Muestras de control inestables, sin existencia de materiales de referencia

o muestras de control. La reproducibilidad puede ser estimada mediante
el análisis de duplicados de muestras reales. Sin embargo, solamente se
obtiene la componente de repetibilidad. Sería necesario considerar alguna
otra fuente de imprecisión a largo plazo, tal como la incertidumbre de los
equipos, por ejemplo.
La desviación estándar de repetibilidad (SRW) se calcula del mismo modo que la

desviación estándar de precisión intermedia (SRW). Se puede expresar como un
coeficiente de variación o desviación estándar relativa.
En caso de que se hayan determinado ambas, se obtiene una precisión

combinada equivalente a:
6
= 3 +
A 6
= 12
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La determinación de la precisión debe realizarse en el intervalo de trabajo a varios

niveles de concentración, incluyendo el límite de cuantificación y el nivel superior
de concentración. Es importante que las condiciones de medida para el estudio
de la precisión sean representativas de las condiciones reales en las que se va a
aplicar el ensayo. Para el cálculo de la precisión se podrán emplear entre otros
los valores obtenidos mediante el uso de material de referencia certificado,
ejercicios de intercomparación y muestras reales (fortificadas o no).
En el Anexo III de este documento se incluye un ejemplo de cálculo para un

ensayo realizado sobre matriz de agua de consumo.
4.2.2.8. VERACIDAD DE LA MEDIDA (SESGO)
La veracidad describe la proximidad que existe entre el valor medio de un número

infinito de medidas repetidas y el valor de referencia asignado a la misma. La
veracidad se expresa mediante el término de sesgo, el cual se relaciona con
errores sistemáticos y guarda una relación inversa con la veracidad del método
(10,17).
Se calcula mediante la siguiente expresión:
D − VEFG
sesgo b) = V
sesgo b %) = ∗ 100
D JIKLM
I
NOPQ
NOTA: Algunos textos legales (Directiva y su transposición y R.D.140/2003) incluyen como criterio
de calidad del método el parámetro exactitud, pero está definido como la diferencia entre el valor
obtenido de la media de una serie de réplicas y el valor exacto de un material de referencia. Esta
definición concuerda con la de veracidad según los documentos internacionales de referencia
empleados para la elaboración de la presente guía (17, 20, 22).
El sesgo se puede determinar empleando alguno de los siguientes métodos:
- Empleo de materiales de referencia, preferiblemente certificados y

matriciales.
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- Comparación del método con un método de referencia con error conocido.
- Participación en ejercicios de intercomparación.
- Empleo de muestras fortificadas con patrones trazables. En este caso, el

sesgo se calcula a partir de la recuperación (7).
La recuperación (R) se calcula como:
C1 − C2)
R %) = ∗ 100
C3
Siendo:
o C1: concentración medida en muestra fortificada

o C2: concentración medida en muestra sin fortificar
o C3: concentración de la fortificación realizada
En el estudio de la recuperación en el límite de cuantificación, se

recomienda el uso de matrices donde el valor de concentración de la
muestra sin fortificar (C2) sea inferior al límite de detección, de modo que
C2 puede considerarse ‘cero’. Si no es así, puede recurrirse a diluciones
máximas sin eliminar el efecto matriz (ej.: 30% del valor obtenido) o
mezcla de matrices. De forma general, la concentración mínima de la
fortificación (C3)
En el caso en que la matriz sin fortificar proporcione señal experimental el

laboratorio deberá establecer un criterio para decidir como usa el valor
obtenido frente a la fortificación correspondiente (por ejemplo, confirmar
el valor experimental utilizando el método de las adiciones, aproximación
en torno al límite de cuantificación o el límite de detección, etc.).
En cualquier caso, la fortificación mínima debe ser tal que no se produzca

solapamiento en los intervalos de confianza de los valores de C1 y C2.
Con objeto de contemplar la variación entre series, el sesgo se debe determinar

en condiciones de precisión intermedia y en todo el intervalo de trabajo
incluyendo, al menos, el límite de cuantificación y el nivel superior de
concentración.
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El sesgo se puede calcular como una media de las desviaciones obtenidas

respecto a un valor de referencia en, al menos, 6 grados de libertad (10).
Los resultados analíticos obtenidos en la rutina diaria podrían, en principio, ser

corregidos partiendo de los datos de recuperación obtenidos. Sin embargo,
existen ciertas limitaciones para aplicar esta corrección (23).
En el Anexo IV a este documento se incluye un ejemplo de cálculo para un ensayo

realizado sobre una matriz de agua de consumo y otra matriz de agua residual.
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4.3. INCERTIDUMBRE DE ENSAYOS FÍSICO-QUÍMICOS
Se define incertidumbre de medida como el parámetro no negativo que

caracteriza la dispersión de los valores atribuidos a la magnitud que se desea
medir, a partir de la contribución de las componentes consideradas (17).
La incertidumbre proporciona una idea de la calidad del resultado, ya que

muestra un intervalo alrededor del valor estimado dentro del cual se encuentra
el valor considerado verdadero con una probabilidad determinada y permite
comparar resultados obtenidos por varios laboratorios o con diferentes
metodologías analíticas (24).
Para su cálculo se deben tener en cuenta la contribución de dos componentes:

la componente del error sistemático (a) y la componente del error aleatorio (b),
que se suman cuadráticamente, obteniéndose la incertidumbre combinada (uc),
mediante la siguiente fórmula:
uU = :u6V + u6W
Finalmente, el cálculo de la incertidumbre expandida U, proporciona el intervalo

en el que se espera encontrar el valor verdadero con una determinada
probabilidad. Esta incertidumbre se obtiene multiplicando la incertidumbre
combinada (uc) por un factor de cobertura (k).
U = k uc
Normalmente, se utiliza el valor de k=2, que implica una probabilidad del 95%
de contener el valor verdadero, asumiendo una distribución normal (17).
Dado que el valor de incertidumbre obtenido puede variar significativamente

dependiendo de la matriz o del rango de concentración, la estimación debe
hacerse en las distintas matrices a las que aplica el método y en distintos rangos
debiéndose incluir el nivel del límite de cuantificación.
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La incertidumbre de medida puede ser estimada por diferentes procedimientos.

Su elección dependerá fundamentalmente de la información experimental y
bibliográfica disponible. Los más utilizados son:
a) Estimación por componentes.

b) Estimación con datos experimentales de validación, control de calidad o
ejercicios de intercomparación.
Actualmente, éste último es el más utilizado en los laboratorios ya que las

principales fuentes de variabilidad son evaluadas en el estudio de validación del
método y durante el proceso del control de calidad.
La combinación de las componentes de incertidumbre debidas a la veracidad del

método (error sistemático) y a la precisión (error aleatorio) puede dar una
aproximación aceptable en la estimación de la incertidumbre de un método
analítico (20).
Es importante tener en cuenta que, para evaluar la componente aleatoria, los

ensayos de validación deben ser diseñados de forma que se hayan tenido en
cuenta las fuentes de variabilidad más significativas (condiciones de ensayo,
efectos de la matriz, variabilidad instrumental, etc.) a partir de un número de
datos suficientemente representativo.
El cálculo de la incertidumbre combinada se realizará de la siguiente forma:
uU = :u6XY + u6ZFZ[\
donde:
uc Incertidumbre combinada
uRW Incertidumbre típica de precisión intermedia dentro del laboratorio
usesgo Incertidumbre típica del sesgo
Para realizar la suma cuadrática, todas las componentes deben estar en términos
absolutos, en cuyo caso, uc también lo estaría, o en términos relativos (%), en
Página 30 de 142
cuyo caso, la uc estaría también expresada en %. En ningún caso, se deberá

transformar a valores relativos una incertidumbre combinada calculada en
términos absolutos.
Finalmente, se calculará la incertidumbre expandida:
U = k * uc
donde:
U Incertidumbre expandida
k factor de cobertura (normalmente, k=2 para una probabilidad del 95%)
uc Incertidumbre combinada
A) ESTIMACION DE LA COMPONENTE DE INCERTIDUMBRE DE PRECISIÓN

INTERMEDIA (uR)
Si la precisión intermedia dentro del laboratorio tiene en cuenta todas las posibles
fuentes de contribuciones a la incertidumbre, su desviación estándar para una
matriz o matrices equivalentes (6) y una concentración determinada establecerá
la componente de precisión intermedia de la incertidumbre.
El valor de la incertidumbre típica de precisión intermedia (uRW) puede asociarse

a la dispersión (SRW) de los ‘n’ resultados obtenidos en la medida de una muestra,
es decir:
∑ x` − x8)6
uXY = SXY = 3
n−1
donde:
xi cada uno de los resultados obtenidos
!̅ valor medio de los resultados obtenidos
n número de mediciones realizadas en condiciones de precisión intermedia,

al menos, 7 grados de libertad.
En el caso de expresar uRW en términos relativos:
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uX
uXY %) = ∗ 100
x8
NOTA: Cuando el laboratorio no tiene acceso a muestras de control estables o los datos de
validación o control de calidad no se han obtenido en la misma matriz que las muestras de rutina
y se utilizan soluciones estándar, se debe calcular una componente adicional de incertidumbre
para considerar el efecto matriz. Esta componente adicional se puede estimar a partir de gráficos
de recorridos derivados de actividades de control interno del laboratorio, obtenidos con muestras
naturales (20).
B) ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE DEL SESGO

(usesgo)
La componente de la incertidumbre del sesgo es la correspondiente a los errores

sistemáticos y se puede calcular teniendo en cuenta dos componentes:
• Incertidumbre del sesgo (usesgo)
• Incertidumbre del valor de referencia (uMR)
La estimación de la incertidumbre del sesgo (usesgo) puede ser obtenida mediante

la utilización de materiales de referencia, de pruebas de recuperación o de
ejercicios de intercomparación. A continuación, se expone cada uno de estos
casos.
B.1) A partir de datos de material de referencia matricial
Para cada uno de los materiales de referencia empleados, la estimación de esta

componente será (21):
sIeFf`V 6
uZFZ[\ = 3u6cX + d h + b6
√n
donde:
uMR incertidumbre típica del material de referencia
sVmedia desviación estándar de las mediciones realizadas

sobre el material de referencia
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n número de repeticiones realizadas (al menos, 6

grados de libertad)
b valor numérico del sesgo (V media – Vref)
Para el cálculo de uMR se pueden dar generalmente dos situaciones:
• El certificado del material de referencia expresa límites indicando el nivel

de confianza, del tipo xMR ± U con un intervalo de confianza del 95%
(k=2). Este caso describe una distribución de tipo normal y su
incertidumbre típica se calcularía como U/k.
• El certificado expresa límites, pero sin especificar el nivel de confianza. En
este caso, la distribución se puede considerar de tipo rectangular y la
incertidumbre típica se calcularía como U/√3.
Para diferentes matrices (equivalentes) y/o diferentes concentraciones, debe

realizarse el cálculo para cada una de ellas. Hay que tener en cuenta que si las
diferencias en veracidad o incertidumbre son significativas para los diferentes
materiales de referencia empleados, bien sea por concentración o matriz, es
necesario estimar la incertidumbre separadamente para cada uno de ellos (20).
En caso de no detectarse diferencias significativas en los valores obtenidos por

el método anterior, podría realizarse también una estimación mediante el uso de
la media cuadrática de los valores:
uZFZ[\ = :u86cX + MCZFZ[\

6
donde:
• Dkl
j media aritmética de las incertidumbres típicas de los
materiales de referencia utilizados
kmnonpq = :
∑ rs )t
ukl
• media cuadrática de los sesgos individuales
• bi sesgo de cada uno de los materiales de referencia empleados

• nMR nº de materiales de referencia utilizados en el cálculo
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NOTA: Si los materiales de referencia tienen distintos valores de concentración, se recomienda

trabajar en términos relativos.
En el Anexo V se muestra un ejemplo al respecto con un material de referencia.
B.2) A partir de muestras adicionadas
La estimación de la componente de la incertidumbre de sesgo puede hacerse a

partir de recuperaciones de adiciones conocidas en matrices reales (8) y estimando
la recuperación del analito añadido.
En este caso, habría que añadir a la componente de incertidumbre de sesgo de

la recuperación, la componente de la incertidumbre de la concentración del
analito añadido (20).
9<v<wx yxA ?5zv{ = :| 6

<v<wx + 9>@
6
Donde:
o | =:
∑ %} )~
<v<wx ?•€
media cuadrática de los sesgos de las adiciones
realizadas (nad número de adiciones realizadas)

o 9>@ Incertidumbre estándar de la adición realizada (sus componentes
varían en función de la naturaleza del material adicionado; ej.: material
volumétrico)
La estimación de esta componente puede obtenerse estimando por separado la

incertidumbre debida a la concentración del material de referencia y la debida al
volumen añadido (20).
En el Anexo VI y Anexo VII, se incluye el desarrollo de estos conceptos y un

ejemplo de aplicación.
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B.3) A partir de datos de ejercicios de intercomparación
También se puede estimar la componente de la incertidumbre debida al sesgo

mediante la utilización de resultados de ejercicios de intercomparación. En este
caso, los datos deben ser tratados en valores relativos (%).
Al menos, se deben tener seis resultados de muestras diferentes (20)
correspondientes a una o varias rondas de ejercicios de intercomparación.
La estimación de la componente de la incertidumbre se realiza de forma similar

a la utilizada con material de referencia. Sin embargo, el resultado de
incertidumbre debida al sesgo obtenido a partir de intercomparaciones puede ser
mayor que a partir de material de referencia, debido a que el valor certificado del
material de referencia está normalmente mejor definido que el valor conocido o
consenso en los ejercicios de intercomparación.
La fórmula a utilizar es:
uZFZ[\ = :MCZFZ[\
6 + u8UEFG )6
donde:
| =:
∑ %} )~
<v<wx •}‚ƒ
media cuadrática de los sesgos obtenidos en
las intercomparaciones
5 sesgo individual para cada uno de los ejercicios de

intercomparación, es decir, diferencia relativa entre el valor
asignado y el obtenido por el laboratorio
Nint número de ejercicios de intercomparación
u8UEFG media de los valores de la incertidumbre relativa de los

valores asignados calculada como
∑ 9„Av…5
8888888
9„Av… =
†5?=
ucrefi incertidumbre relativa del valor asignado para cada

muestra de intercomparación
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Nint número de ejercicios de intercomparaciones
Nota: En algunos casos, 98„Av… es demasiado alta y no es válida para estimar usesgo.
Si las diferencias individuales (bi) y las incertidumbres del valor asignado (ucrefi)
varían significativamente entre las diferentes intercomparaciones, puede ser
necesario realizar la estimación de la incertidumbre de forma separada para cada
caso.
La contribución debida a la incertidumbre de valor asignado (ucrefi) se puede

obtener (20):
a) Directamente del organizador del ejercicio de intercomparación
b) Si se usa la mediana o media robusta para calcular el valor

asignado:
9„Av…5 = 1,25 !
12,5
‡ y,5
c) Si se usa la media aritmética como valor asignado:
9„Av…5 =
12,5
‡ y,5
ucrefi Incertidumbre relativa del valor asignado a la muestra del ejercicio

de intercomparación i
SRW,i Desviación estándar relativa de reproducibilidad del ejercicio de

intercomparación i
np,i Número de participantes en el ejercicio de intercomparación i
En el Anexo VIII se muestra un ejemplo a partir de resultados de ejercicios de

intercomparación.
Como resumen de las formas de cálculo de incertidumbre, se adjunta la siguiente

tabla:
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Incertidumbre Expandida: U = k * uc(K: factor de cobertura, normalmente K=2 para una probabilidad del 95%)
Incertidumbre Combinada: jˆ = :jtl‰ + jtnonpq uRW: Incertidumbre típica de precisión intermedia dentro del laboratorio
usesgo: Incertidumbre típica de veracidad o sesgo
Nota: Siempre que se quiera expresar la Incertidumbre expandida en %, se deberán pasar todas las componentes a valor relativo antes de realizar la suma cuadrática.
A. Componente de Reproducibilidad B. Componente de Sesgo
Se puede obtener:
B1) A partir de datos de material de referencia matricial:
• Con un material de referencia:

6
9<v<wx = 39Š1 +d h + 6
6 D
N
√
‹ŒD : desviación estándar de las mediciones realizadas del material de referencia en

uMR: incertidumbre típica del material de referencia.
condiciones de precisión intermedia intralaboratorio

b: valor numérico del sesgo (diferencia entre la media de los valores obtenidos y el
Si se utilizan muestras reales o MR valor de referencia)
matricial: n: nº de repeticiones realizadas
Con distintos materiales de referencia:9<v<wx = :98Š1

6
+| 6
<v<wx
∑ x` − x8)6
•
uXY = SXY = 3
n−1
D kl : media aritmética de las incertidumbres típicas de los materiales de referencia
j
SRW: desviación estándar de los ‘n’ utilizados
kmnonpq = :
∑ nonpqs )t
resultados obtenidos en la medida de
ukl
una muestra : media cuadrática de los sesgos individuales
x8: valor medio de los resultados

xi: cada uno de los resultados obtenidos sesgoi: sesgo de cada uno de los materiales de referencia empleados
nMR: nº de materiales de referencia utilizados en el cálculo
n: nº de iteraciones realizadas en
obtenidos
B2) A partir de muestras adicionadas:
condiciones de precisión intermedia.
9<v<wx = :| 6
<v<wx + 9>@
6
•Ž‹•‹•‘ = :
∑ ‹•‹•‘’ )t
Nota: SRW Puede obtenerse también a
“”•
partir de datos de control de calidad. : media cuadrática de los sesgos de las adiciones realizadas
Utilizando Límite de control (LC) a 95%
nad: nº de adiciones realizadas
de confianza
uad: incertidumbre típica de la adición realizada (ISO 11352-2012, apdo. 8.3.4)
LC= 2 SRW
B3) A partir de datos de interlaboratorios (Utilizar siempre datos en %):
9<v<wx = :| + –98„Av… —
6 6
<v<wx
˜
888888
™š•› =
∑ ˜™š•›’
œ’“•
media de los valores de la incertidumbrede los valores asignados
ucref i: incertidumbre del valor asignado de cada interlaboratorio (ver 6.1.10, B3)
Nint: nº de interlaboratorios
MCZFZ[\ = :
∑ ZFZ[\ž )~
Ÿž
, media cuadrática de los sesgos obtenidos en los interlaboratorios
¡
sesgoi: sesgo obtenido en cada interlaboratorio
Nint: nº de interlaboratorios
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4.4. VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN EN ENSAYOS MICROBIOLOGICOS
Al igual que en los ensayos físico-químicos, tanto la caracterización inicial

(validación) como la verificación de los ensayos microbiológicos debe intentar
reproducir las condiciones reales de los mismos. Esto puede conseguirse
utilizando muestras naturales o, en su defecto, muestras inoculadas
preferiblemente no esterilizadas para que exista microbiota interferente, con un
nivel conocido de microorganismos diana. En el caso de la matriz agua de
consumo, también puede resultar útil contaminar con agua continental o residual,
para ampliar la flora acompañante. El laboratorio debe tener en cuenta que la
inoculación de una matriz con microorganismos diana sólo simula la presencia de
éstos de forma natural. No obstante, a menudo es la mejor y la única solución
disponible.
Una particularidad a tener en cuenta en este tipo de ensayos consiste en la

dificultad de disponer de valores de referencia estables, lo que condiciona el
desarrollo del proceso de validación en comparación con los ensayos físico-
químicos.
En función de la respuesta obtenida por el método utilizado, los métodos

microbiológicos pueden clasificarse en:
• Cualitativos: Denominados también “de investigación”, son métodos de

análisis cuya respuesta es la presencia o ausencia del analito
(microorganismo) detectado directa o indirectamente en una cierta
cantidad de muestra (1).
• Cuantitativos: Denominados “de detección y recuento” son métodos de

análisis cuya respuesta es la cantidad de analito (microorganismo) medido
directamente (recuento en masa o volumen) o indirectamente (NMP,
absorbancia de color, impedancia, etc.) en una cierta cantidad de muestra
(1).
Para métodos cuantitativos y tomando como base lo indicado en la norma UNE-

EN ISO 13843 (2) se puede establecer qué parámetros deberían estudiarse para
la caracterización inicial de un método (validación) y cuáles para la
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verificación. La caracterización es un proceso consistente en proporcionar

información sobre las características de funcionamiento probables de dicho
procedimiento en unas determinadas circunstancias. Y la verificación se centra
en proporcionar evidencia de que el laboratorio es capaz de producir datos de
funcionamiento similares a los establecidos en la caracterización primaria.
Habitualmente la caracterización de un procedimiento es realizada por un único

laboratorio, normalmente apoyado con un estudio colaborativo. Es la realizada
por la entidad que desarrolla el método normalizado. En el caso de un laboratorio
que desarrolla un método propio, también tendría que llevar a cabo la
caracterización completa del mismo.
Cuando un laboratorio aplica un método normalizado o alternativo, lo que

hace es verificar los resultados obtenidos por el laboratorio inicial que desarrolló
el método. Como no siempre se dispone de los datos de la caracterización inicial,
se han incluido en esta guía algunos que pueden ser utilizados como referencia.
Por último, cuando se trate de métodos basados en una norma existente, el

laboratorio debe demostrar que las modificaciones incluidas no alteran el
fundamento de la misma.
El objeto de esta guía es recoger la forma de cálculo de los parámetros para la

verificación de un método en el laboratorio, no para la caracterización inicial del
mismo.
Respecto a los métodos cualitativos, estos deben ser verificados estimando, como
mínimo, el límite de detección (25). En caso de que existiera algún requisito
normativo o legal, además, se extenderá el alcance de la verificación a
parámetros tales como sensibilidad, especificidad, falsos positivos, falsos
negativos o eficiencia.
Se incluye a continuación la tabla según la norma UNE-EN ISO 13843 y

comentarios para adaptarla a ensayos de aguas según UNE-EN ISO 17025:
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Caracterización
Parámetros Verificación
inicial
Sensibilidad  
Especificidad  
Tasa de falsos positivos  
Tasa de falsos negativos  
Selectividad   (3)
Eficiencia  
Límite superior  -
Repetibilidad   (1)
Reproducibilidad   (1)
Robustez  -
Tasa de recuperación relativa   (2)
Incertidumbre del recuento   (4)
(1) El cálculo de la reproducibilidad se incluye cuando se trate de métodos que se

usan para comprobar el cumplimiento normativo, en estos casos no sería
imprescindible el cálculo de la repetibilidad.
(2) Se incluye para establecer los criterios del control de calidad de recuperación.
(3) No se considera necesario, teniendo en cuenta los métodos habituales de

ensayos en agua.
(4) Opcional, ya que se incluye en la incertidumbre global del método
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4.4.1. MÉTODOS MICROBIOLOGICOS CUALITATIVOS
A) Límite de detección (LD)

Es el menor número de microorganismos que pueden detectarse en una muestra
con un nivel aceptable de confianza. Desde el punto de vista teórico, aplicando
la distribución de Poisson, cabe esperar un valor aproximado de 3 ufc/volumen
analizado.
El estudio se debe realizar sobre muestras de matriz representativa con ausencia

del microorganismo diana y requiere el empleo de suspensiones de inoculo con
niveles de concentración bajos.
Se propone el siguiente esquema de trabajo en agua matriz:
• Analizar una alícuota blanco para demostrar que la muestra no tiene el

microorganismo diana.
• Preparar varias alícuotas de dicha muestra, que deberán ser fortificadas con
el material de referencia en concentraciones progresivamente menores,
partiendo de una concentración máxima de 20 ufc por alícuota.
• Analizar 10 repeticiones de cada nivel de fortificación, obteniendo para cada
una de ellas un valor de “ausencia” o “presencia”.
Se adjunta a continuación el esquema de trabajo descrito anteriormente.
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Paso 1. Preparación del banco de diluciones
Paso 2. Fortificación de alicuotas de matriz y realización del procedimiento
Paso 3. Repetición del paso 2 diez veces en condiciones de reproducibilidad.
Paso 4. Elaboración del cuadro de resultados para la obtención del valor del LD.
Se establece como criterio del límite de detección el menor nivel de

concentración que proporcione al menos un 90% de réplicas positivas
(presencia).
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Para el caso de métodos normalizados en los que se indiquen criterios, se podrá

llevar a cabo la evaluación del límite de detección con un mínimo de 3
repeticiones en las condiciones anteriormente indicadas. En estos casos, las tres
réplicas deben ser positivas (presencia).
Cuando no se indican criterios se llevarán a cabo las 10 repeticiones tal como han
quedado recogidas en este apartado.
B) Otros parámetros
El objetivo del estudio de estos parámetros es evaluar la influencia de la
microbiota acompañante en la detección del microorganismo diana.
A continuación, se indican los parámetros a evaluar (2):
• Sensibilidad: Fracción del número total de muestras positivas

correctamente asignadas por el método. Se evalúa como:
¢
¢+£
• Especificidad: Fracción del número total de muestras negativas

correctamente asignadas por el método. Se evalúa como:
• Falsos positivos: Fracción del número total de muestras positivas

observados incorrectamente asignados. Se evalúa como:
• Falsos negativos: Fracción del número total de muestras negativas

observados incorrectamente asignados. Se evalúa como:
• Eficiencia: Fracción de muestras correctamente asignados. Se evalúa

como:
+
†
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Donde
• A= número de presuntivos positivos encontrados positivos

• B = número de presuntivos negativos encontrados positivos
• C = número de presuntivos positivos encontrados negativos
• D = número de presuntivos negativos encontrados negativos
• N= número total de muestras examinadas es: A +B +C +D
La lectura de los resultados se expresa según la tabla siguiente:
RESULTADO PRESUNTIVO
+ -
RESULTADO + A B A+B
ENCONTRADO - C D C+D
A+C B+D N
Siempre que sea posible se deben usar muestras naturales con microbiota
acompañante, pero, de no ser así, se inoculará la muestra con microorganismos
interferentes. El rango y la distribución de la microbiota interferente deberían ser
representativos de los niveles habituales en las matrices de trabajo.
El número mínimo de muestras replicadas no debería ser inferior a 20 (10

presuntos positivos y 10 presuntos negativos) y se pueden establecer los
siguientes criterios, indicados en la Guía SEIMC (40)
PARAMETROS VERIFICACIÓN (%)
Sensibilidad >90
Especificidad >90
Falsos positivos <10
Falsos negativos <10
Eficiencia >90
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4.4.2. MÉTODOS MICROBIOLOGICOS CUANTITATIVOS
En este caso, la verificación comprenderá todo el rango de trabajo establecido

en el método que permita un tratamiento estadístico fiable de los valores.
Los niveles de trabajo se establecerán en función de la técnica a utilizar (26):
• Técnica de incorporación en placa y reparto en placa: el número de

colonias típicas debe estar entre 10 y 300 ufc (la suma de las colonias
típicas y atípicas no debe superar las 300 ufc) para placas de 90-100 mm
de diámetro.
• Técnica de filtración en membrana: el número de colonias típicas debe
estar entre 20 y 80 ufc para filtros de 47-50 mm de diámetro.
• Técnica del Número Más Probable: en función del número de
pocillos/tubos utilizados.
Se propone la siguiente tipología de muestras, y en este orden:
1. Muestras que contengan el/los microorganismos de forma natural. Para

recuperación, en este caso la primera opción serían muestras naturales
SIN presencia del microorganismo diana. Cuando si tengan el
microorganismo diana, hay que tener la precaución de adicionar el
microorganismo diana en cantidades superiores, por ej. a 5 veces la
cantidad presente en la muestra original.
2. Muestras contaminadas con otra matriz que sí contenga el/los
microorganismos a estudio.
3. Muestras naturales contaminadas con material de referencia.
4. Muestras esterilizadas contaminadas con material de referencia.
Se recomienda preparar un volumen superior al requerido, ya que la

homogeneización de la muestra también forma parte del ensayo.
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En cuanto a la obtención de los valores de referencia en microbiología, debe

tenerse en cuenta la dificultad añadida de trabajar con organismos vivos. Para la
obtención del valor de referencia, habitualmente pueden utilizarse:
A. Estandarización a partir de una cepa de referencia, mediante titulación en

un medio de cultivo no selectivo con un mínimo de tres réplicas. Como
criterio orientativo, se propone:
a. Que la dispersión de las réplicas sea inferior a la RSD de Poisson

,
√/
( ).
b. El índice de Dispersión de Poisson (valor relativo calculado según

UNE EN ISO 13843) (2).
B. Uso del valor de referencia proporcionado por un material de referencia

de valor certificado.
C. Resultados de ejercicios de intercomparación.
D. Comparación con métodos de referencia.
En el caso B, podemos optar por comparar los resultados de nuestro

procedimiento de ensayo con el valor certificado para el material de referencia.
Alternativamente, un material de referencia de valor certificado puede titularse
siguiendo las indicaciones del ejemplo (Anexo IX), lo que facilita la tarea de
preparación de stock de cultivo, diluciones, etc.
A) Sensibilidad, Especificidad, Tasa de falsos positivos, Tasa de falsos

negativos, Eficiencia
Se preparan, al menos, 5 muestras que contengan un número de colonias dentro

del rango de trabajo (entre organismos diana y no diana) por porción ensayada.
Es importante que dichas muestras tengan una contaminación natural, cuando
no se disponga de ellas se pueden contaminar con agua continental o agua
residual mejor que con cepas de referencia, para que la relación entre la flora
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acompañante y las colonias diana sea lo más parecido posible a las condiciones
reales.
Se procesan las muestras, se incuban y se confirman las colonias presuntivas, tal

como indique el método, incluyendo las pruebas de confirmación si es método
las requiere.
Se aíslan colonias típicas y no típicas de cada una de las muestras, un mínimo de

30 colonias en total y sobre ellas se realizan ensayos confirmativos adicionales.
Estos métodos pueden ser kits comerciales de identificación, ensayos para
sistemas enzimáticos, test de composición química (ej. Maldi-TOF), métodos
moleculares, etc. Se clasifican los resultados encontrados en alguno de estos
tipos:
A: Número de colonias asignadas por el método como colonias diana cuya

identidad es corroborada por el ensayo de identificación adicional. Verdaderos
positivos.
B: Número de colonias NO asignadas por el método como colonias diana, que si

son asignadas como tales por el ensayo de identificación adicional. Falsos
negativos.
C: Número de colonias asignadas por el método como colonias diana, cuya

identidad NO es corroborada por el ensayo de identificación adicional. Falsos
positivos.
D: Número de colonias NO asignadas por el método como colonias diana, cuya

identidad NO es corroborada por el ensayo de identificación adicional. Verdaderos
negativos.
Con los resultados obtenidos se calculan los siguientes parámetros:
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METODO
+ -
+ A B A+B
REFERENCIA
- C D C+D
A+C B+D N
• Sensibilidad = A/(A+B)*100, es decir la fracción del total de las colonias

positivas correctamente asignadas por el método.
• Especificidad = D/(C+D)*100, es decir la fracción del total de las colonias

negativas correctamente asignadas por el método.
• Falsos positivos = C/(A+C)*100, es decir la fracción de colonias positivas

asignadas por el método erróneamente.
• Falsos negativos = B/(B+D)*100, es decir la fracción de negativas

asignadas por el método erróneamente.
• Eficiencia = (A+D)/N*100, es decir la fracción de resultados asignados

correctamente por el método.
Se pueden tener en cuenta los valores guía recogidos en la UNE-EN ISO 13843
para métodos de recuento de colonias, como los siguientes:
• Sensibilidad: generalmente superior al 90%.

• Especificidad: generalmente superior al 80%.
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B) Precisión (Repetibilidad)
La precisión se define como el grado de concordancia entre resultados de ensayos

independientes obtenidos con el mismo método, sobre idéntico material de
ensayo, en las mismas (repetibilidad) o distintas (precisión intermedia-
reproducibilidad) condiciones de medición (26).
Se puede evaluar procesando un mínimo de 3 muestras, con niveles de

organismos diana diferentes dentro del rango de recuento válido de la placa.
Cada una de ellas se repite 10 veces en condiciones de repetibilidad.
Para la interpretación de resultados se pueden emplear dos formas de cálculo:
• Calcular el Índice de Dispersión de Poisson (IDP), que sigue la distribución

X2. Si el valor experimental obtenido es superior al teórico, es posible
extraer como conclusión la presencia o no de sobredispersión.
• Calcular la varianza operativa relativa media y obtener una Desviación
Estándar Relativa de repetibilidad en porcentaje. En este caso es
necesario establecer un criterio previo.
El Índice de Dispersión de Poisson no requiere establecer a priori un criterio a

cumplir. Se calcula sobre una serie de recuentos paralelos con la siguiente
fórmula:
¥∑ 6
− ∑ 5)
6
¥∑ 6
¤AJ, = = − ¦
6 5 5
∑ 5 ∑ 5
5
Donde r es el número de observaciones paralelas (habitualmente 10) y ni es la

observación iésima (cada uno de los valores obtenidos).
El valor obtenido se compara con el valor teórico según la distribución X2. El valor
crítico de probabilidad de 0,05 para (10-1) grados de libertad es: 16,919. Si el
valor obtenido es menor que 16,919 se puede concluir que la dispersión NO es
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significativamente diferente a la prevista por la distribución de Poisson. Se incluye

un ejemplo en el Anexo XI (“VERIFICACIÓN DE LA REPETIBILIDAD”).
Aplicando el IDP no se cuantifica el valor de la sobredispersión. Únicamente nos

indica si hay sobredispersión o no.
En el caso que interese cuantificar la sobredispersión, se podría calcular la

Varianza Operativa Relativa (uo2), que se calcula mediante la siguiente fórmula,
aplicada a cada una de las series. Una vez calculada la media de los 3 resultados,
para obtener una Desviación Estándar Relativa en porcentaje se calcula la raíz
cuadrada de la varianza operativa relativa por 100.
6
− !̅
96 =
!̅ 6
Donde
s2 es la varianza de las observaciones paralelas
!̅ es la media aritmética de las observaciones paralelas
9 = ‡96 · 100
C) Precisión (Reproducibilidad)
Puede evaluarse, al menos, de dos formas: siguiendo la norma UNE-EN ISO

13843 o según la norma UNE-EN ISO 19036 para el cálculo de la incertidumbre.
El planteamiento de los experimentos es el mismo, y los resultados que se

obtienen son similares.
Para calcular este parámetro cuando no se tiene un criterio de precisión indicado

en una norma, se debe procesar un mínimo de 10 muestras con niveles de
organismos diana diferentes, en condiciones de reproducibilidad (diferentes
analistas, diferentes estufas, diferentes lotes de medios de cultivo, etc.), a lo
largo del tiempo y de forma que se cubra todo el rango de recuento válido en
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placa, según el método. Cada día se harán dos replicados en distintas condiciones
de medición.
Para el caso de métodos normalizados en los que se indiquen criterios de

precisión, se propone que la evaluación de la precisión consista en la realización
de un mínimo de 3 ensayos de muestras positivas.
• Norma UNE-EN ISO 13843
Para métodos basados en el recuento de colonias se evalúa estudiando la

sobredispersión obtenida, para lo cual se calcula la Varianza Operativa Relativa
(uo2) de cada una de las 10 muestras, mediante la siguiente fórmula:
6
− !̅
96 =
!̅ 6
Donde
s2 es la varianza de las observaciones paralelas
!̅ es la media aritmética de las observaciones paralelas
Nota: en este caso se trabaja con los resultados en ufc (no en logaritmos).
La fórmula procede de la siguiente y refleja que la varianza total se debe a la

distribución de Poisson y a todos los factores de sobredispersión aleatorios.
6
= !̅ + 96 · !̅ 6
Una vez calculada la Varianza Operativa Relativa de cada una de las muestras, se
calcula la Varianza Operativa Relativa media de todos los experimentos
realizados.
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En ambos casos, una vez calculada la Varianza Operativa Relativa media, la

expresión final de la reproducibilidad, en porcentaje, sería la raíz cuadrada de la
varianza operativa relativa media por 100.
9 = ‡96 · 100
• Norma UNE-EN ISO 19036
Se calcula como la desviación estándar de reproducibilidad SRW (27):
1 ¨5© − ¨5ª )6
?
=§ ¦
12
2
5«,
Donde:
yiA, es el dato transformado en Log10 de la réplica A (ufc/volumen filtrado

(mL))
yiB, es el dato transformado en Log10 de la réplica B (ufc/volumen filtrado

(mL))
i, es el número de muestras
n es el número de repeticiones(n≥10)
Aunque es función del método y del rango a estudio, como valor orientativo en
ausencia de otro criterio, se puede establecer un valor de SRW inferior o igual a
0,20.
Teniendo en cuenta que la variabilidad relativa de una cantidad es igual a la

variabilidad absoluta de su logaritmo natural (neperiano), para expresar la
variabilidad obtenida (en logaritmo) en un valor relativo (%), se convierte el valor
obtenido en logaritmos en base 10 a logaritmo natural, mediante un factor de
conversión que es 2,303 y se multiplicar por 100 para expresarlo en %. Siguiendo
con el ejemplo de SRW= 0,20, le correspondería un 46%.
En cualquier caso, la variabilidad obtenida corresponde al rango de trabajo

incluido en los estudios. Es posible incluir inicialmente el rango completo de
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trabajo y posteriormente, el control de calidad determinará si es necesario o no

revisar el esquema del estudio de la precisión por tramos con el objetivo de
estudiar también la incertidumbre por tramos, si se estima necesario.
Se incluye ejemplo en el Anexo XII.
D) Tasa de Recuperación relativa
La estimación de la recuperación se evalúa a partir de valores de referencia (25).
Para ello, se requiere comparar los resultados obtenidos con los valores
esperados. Habitualmente se realizan 10 experimentos.
Aunque los recuentos comprendidos entre 10 ufc y el límite superior de cada

método se encuentran dentro del rango de precisión óptimo, se recomienda
realizar cálculos de recuperación en niveles de concentración superiores a 20 ufc,
para una menor influencia de la variabilidad de los resultados a ese nivel tan bajo
(<20 ufc).
La estimación de la recuperación se evalúa a partir de valores de referencia (25).
Para ello, se requiere comparar los resultados obtenidos con los valores
esperados. Se calcula como:
%¬ = 10J@ ∗ 100
-
J ∑?5«,
=
5
5 = ®¯ °¬5 ) − ®¯ ° 5 )
Donde:
- VRi es el valor de referencia obtenido según el apartado 4.2.2. para cada

experimento.
- VLi es el valor obtenido por el laboratorio aplicando el método de ensayo

para cada experimento.
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- di es la diferencia entre el logaritmo del valor de referencia y el obtenido

por el laboratorio para cada experimento.
- ̅ es la media de los di obtenidos
- n es el número de experimentos (n≥10)
Para el caso de métodos normalizados en los que se indiquen criterios de

recuperación obtenidos a partir de un número n de réplicas, se propone que la
evaluación de la recuperación consista en la realización de un mínimo de 3
ensayos de muestras en las mismas condiciones que las declaradas en el método
normalizado seleccionado.
En el caso que las normas de referencia no establezcan valores mínimos de

recuperación del método, se pueden utilizar como criterios iniciales los recogidos
en la norma UNE-EN ISO 11133 para el control de medios de cultivo. En estos
casos será necesario realizar un mínimo de 10 experimentos y establecer los
criterios posteriores de control de calidad ajustados a los resultados propios
obtenidos en la validación.
En el Anexo XIII se incluye un ejemplo de verificación de la recuperación en el

caso de un método del que sí se dispone de referencias en la norma y en el Anexo
XIV cuando no se dispone de ellas.
Con los resultados obtenidos también es posible comprobar si estadísticamente

existen diferencias significativas entre los valores de referencia y los valores del
método. Para esto se puede calcular la t de Student y compararla con la t de las
tablas al 95% y según los grados de libertad de los experimentos. Si la tcal es ≤
ttab no existen diferencias significativas entre los valores de referencia y los
obtenidos en el método.
E) Incertidumbre del RECUENTO
La fiabilidad de los recuentos se determina realizando recuentos repetidos de las

placas o tubos obtenidos en el ensayo, dentro de un intervalo de tiempo corto.
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Se trata de leer dos veces las mismas placas, en condiciones uniformes y calcular
la varianza relativa de cada par de datos, mediante la siguiente fórmula:
!, − !6 6
9Av{,-
6
= 2d h
!, + !6
Siendo x1 y x2 los datos de los recuentos por duplicados. Se realiza la media de

los resultados obtenidos con los distintos pares de datos y su raíz cuadrada debe
ser <0,1 (2).
Nota: si el laboratorio realiza una evaluación de la incertidumbre global del método, no es

necesario realizar esta estimación para el recuento (ver 4.5).
La tabla siguiente presenta un resumen de todo lo comentado en el apartado 4.4
Numero
ACTIVIDAD
Criterios para el número de ensayos de
TIPO MÉTODO RECOMENDADA
ensayos a realizar verificación a
GUIA AEAS
realizar
NORMA
Existen criterios en la norma n=3
REFERENCIA
Existen criterios en la norma, pero no
se puede reproducir exactamente la
metodología descrita para su n=10
BASADO EN VERIFICACIÓN (2)
evaluación (seguir metodología Guía
NORMA DE
AEAS)
REFERENCIA (1)
No existen criterios en la norma o se
n=10
ha realizado algún cambio menor
el laboratorio ha participado en el (4)

EQUIVALENTE A estudio
PRESENTACIÓN
UN MÉTODO DE
DOCUMENTACIÓN (3) El laboratorio no ha participado en el
REFERENCIA n=10
estudio
No es objeto de esta guía describir
esquemas completos de validación de
métodos microbiológicos puesto que
la mayoría de los métodos usados en -
laboratorios de microbiología de
DESARROLLADO CARACTERIZACIÓN aguas usan normas de referencia o
POR EL INICIAL métodos basados en normas
LABORATORIO (VALIDACIÓN)
Sería recomendable tener en cuenta
los mismos parámetros que la
verificación y todos los que el -
laboratorio considere necesarios para
tener el método bajo control
(1) Cambios menores (ej. prueba de confirmación).
(2) Ver Apartado verificación para parámetros a estudiar.
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(3) El laboratorio debe disponer de documentación avalada por comité expertos o por autoridad
correspondiente, que certifique la equivalencia entre métodos como resultado de un estudio
intercolaborativo.
(4) El laboratorio debe calcular la equivalencia de sus propios datos.
4.5. INCERTIDUMBRE DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
La estimación de la incertidumbre en ensayos microbiológicos se limita a los

métodos de recuento y su alcance debe tener en cuenta el tipo de matriz y
microorganismo a analizar. No se aplica a métodos cualitativos ni NMP (25).
Como en otros ámbitos, no existe un único modelo para llevar a cabo una
estimación de incertidumbre, si bien suele tenerse en cuenta sólo la componente
de precisión. Dada la particularidad experimental de este tipo de ensayos, no
puede realizarse una estimación adecuada de la contribución del sesgo en la
incertidumbre de medida, aun cuando se disponga de material de referencia
certificado, por lo que no se considera esta componente en sí misma (27) aunque
hay métodos (ejemplo, Legionella) en los que esta contribución puede ser incluso
mayor que la precisión.
Puede ocurrir que los métodos normalizados indiquen expresamente un valor de

incertidumbre de medida, en cuyo caso, el laboratorio deberá confirmar su
capacidad de ensayo frente al valor indicado.
El cálculo de la estimación de la incertidumbre se puede llevar a cabo mediante

dos modelos diferentes: UNE-EN ISO 19036 e ISO 29201, que son las normas
específicas de incertidumbre, y en los que se obtiene una estimación de la
incertidumbre para cada resultado de muestra ensayada (C).
También es posible emplear el modelo basado en la UNE-EN ISO 13843,

aplicando después el mismo planteamiento de las dos normas anteriores al
resultado de una muestra, como se explicará más adelante.
Modelo según UNE-EN ISO 19036:2020 (27)
La norma ISO 19036 considera tres componentes de la incertidumbre:
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• Incertidumbre técnica.
• Incertidumbre debida a la matriz.
• Incertidumbre de la distribución.
Respecto a la “incertidumbre técnica” proporciona tres opciones de cálculo,
siendo la primera de ellas la que corresponde a la “reproducibilidad
intralaboratorio” y es la que se recoge en este documento.
La “incertidumbre debida a la matriz” se refiere a la variación entre

resultados cuando se analizan diferentes porciones tomadas de la misma muestra
recibida en el laboratorio (no se refiere a la incertidumbre del muestreo).
Por último, respecto a la “incertidumbre de la distribución”, incluye las

componentes en métodos de recuento (incertidumbre de Poisson e
incertidumbre debida a las confirmaciones).
• Incertidumbre técnica:
La estimación de la incertidumbre técnica (utech) se realiza a partir de la
desviación estándar de reproducibilidad calculada a partir de experimentos
intralaboratorios, según se indica en el apartado 4.4.2 con la siguiente fórmula:
utech = SRW
1 ¨5© − ¨5ª )6
?
=§ ¦
12
2
5«,
Para obtener el valor de SRW, los ensayos deben realizarse asegurando un número
suficiente de colonias en el contaje de las placas.
El cálculo de la desviación estándar en forma logarítmica estabiliza la variación
de la reproducibilidad en los diferentes niveles de concentración siempre que no
sea necesario introducir datos de recuentos bajos en su cálculo, por lo que en
estos casos, no será necesario evaluar la incertidumbre para diferentes niveles
de concentración, aunque las muestras estudiadas deberían cubrir el nivel
habitual de contaminación del laboratorio.
Página 57 de 142
El cálculo de la desviación estándar también puede realizarse a partir de las

réplicas remitidas por el laboratorio en ejercicios de intercomparación siempre
que se hayan hecho en condiciones de reproducibilidad.
• Incertidumbre debida a la matriz:

En el caso de muestras de aguas se puede considerar un material suficientemente
homogéneo, por lo que esta componente será muy pequeña y se puede
despreciar.
• Incertidumbre de la distribución de Poisson:

En métodos basados en técnicas de recuento, la variabilidad intrínseca depende
del número total de colonias que se han tomado para el cálculo del resultado.
Se calcula mediante la siguiente fórmula:
1
0,4343
9±® = =
10)
®
‡∑ ‡∑
Nota: la upoisson2 sería 0,1886/∑C, que es también una forma habitual de verla
expresada.
• Incertidumbre de las confirmaciones
En métodos basados en técnicas de recuento en los que se obtienen colonias
presuntivas y solo se estudian algunas de ellas para obtener el número de
colonias confirmadas, se puede tener en cuenta esta componente de la
incertidumbre, aunque puede llegar también a ser despreciable. No aplica en
métodos en los que se confirman TODAS las colonias (ej. Enterococos).
Finalmente, la norma UNE-EN ISO 19036 incluye el concepto de Incertidumbre
técnica corregida, de forma que a la variabilidad obtenida en los experimentos
de reproducibilidad se le resta la variabilidad intrínseca de Poisson de esos
resultados de validación y así es posible conocer la variabilidad que le
corresponde exclusivamente al método.
Una vez calculadas las distintas contribuciones de la incertidumbre, con los

resultados obtenidos, se calcula la incertidumbre estándar combinada,
Página 58 de 142
basada en todas las componentes estudiadas (para métodos de recuento de

colonias).
9„ ¨) = :9=v„
6
+ 9³x5<<x?
6
Cuando uPoisson/utech sea < 0,2 es posible no incluir la uPoisson, pero si es superior
no es posible eliminarla, es decir a partir de un determinado número de colonias,
se podría suprimir este término porque es despreciable.
Modelo según ISO 29201:2012(32)
El cálculo se realiza teniendo en cuenta dos componentes: variabilidad

operacional y variabilidad intrínseca del método.
• La variabilidad operacional (equivale a la incertidumbre técnica de la

norma ISO 19036) es la combinación de las incertidumbres asociadas con
los procesos técnicos del método de trabajo, que incluye homogeneidad,
diluciones, incubación y lectura de resultados. Esta estimación puede
realizarse mediante una aproximación global como la diferencia entre la
incertidumbre estándar relativa por reproducibilidad intralaboratorios y la
variabilidad intrínseca.
• La variabilidad intrínseca del método (equivale a la incertidumbre de la
distribución de la norma ISO 19036) es una variación inevitable que está
asociada con la distribución de las partículas en la suspensión final y con
la detección instrumental. Las suspensiones microbiológicas
habitualmente siguen una distribución de Poisson.
Los cálculos se resumen en la tabla siguiente.
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Algoritmo general: 9 = :9x,Av{

6
+ 9@,Av{
6
Incertidumbre relativa de reproducibilidad operacional (9x,Av{ )
96 x,Av{ = 6
12 − 9@,Av{
6
6
12 9@,Av{
6
∑?5«, 6
0,1886
=
6 15
12 9@,Av{
6
=
¶v@5>
Donde:
Siendo:
• Cmedia: media del recuento de colonias
®¯ − ®¯ 65 )
6
=
6 ,5
de C1i y C2i
125
2 Este cálculo se realiza para cada par de
Donde:
réplicas de la misma muestra.
• C1i: primera réplica de recuento de
colonias.
El cálculo de la incertidumbre estimada
• C2i: segunda réplica de recuento de
para el conjunto de pares de muestras se
colonias de la misma muestra
∑?5«, 9@,Av{
6
realizará con la fórmula:
9@,Av{ =
natural o dopada que C1i
n es el número de muestras en las 6
que se realizan los duplicados (n

Donde n es el número de muestras en
6
mayor o igual a 10
Este cálculo ( 15
las que se realizan los duplicados (n
) se realiza para cada
mayor o igual a 10).
par de réplicas de la misma muestra.
Incertidumbre intrínseca al método (9@,Av{ )

0,1886
9@,Av{
6
=
∑
Donde ∑C es la suma del total de número de colonias contadas en todas las

placas en las que se realiza contaje para la muestra ensayada.
Página 60 de 142
Nota aclaratoria. Estos dos modelos realmente corresponden al mismo

planteamiento:
• La incertidumbre operacional calculada según ISO 29201 equivale a la

incertidumbre técnica corregida según la UNE-EN ISO 19036, ya que en
ambos casos no se incluye la incertidumbre intrínseca de los experimentos
realizados para el cálculo de la reproducibilidad.
• Si no se corrige la incertidumbre técnica según la UNE-EN ISO 19036, hay
que compararla con la ISO 29201 pero aplicada a un resultado de una
muestra, no con la incertidumbre obtenida.
Modelo según UNE-EN ISO 13843(2)
También es posible estimar la incertidumbre de un método a partir de los datos

de reproducibilidad calculados según la norma UNE-EN ISO 13843 y recogidos en
el apartado 4.4.2. Una vez calculada la Varianza Operativa Relativa media y
expresada en porcentaje, esa sería la incertidumbre del método:
9 = ‡96 · 100
En este caso, para aplicar la incertidumbre obtenida a una muestra concreta,

debemos seguir el planteamiento de las otras dos normas e incorporar la
variabilidad de la distribución de Poisson, si es necesario.
Finalmente, en cualquiera de los tres modelos anteriores, el cálculo de la

incertidumbre expandida (U), se realizará multiplicando la incertidumbre
obtenida (uc) por un factor de cobertura k. El valor de k=2 ofrece
aproximadamente un intervalo de confianza del 95%, y es el más usado
habitualmente.
U = k uc
Una vez estimada la incertidumbre expandida, ésta se podrá expresar como

intervalo de recuento de colonias o bien como porcentaje. No es necesario
expresar la misma con más de dos cifras significativas.
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Siguiendo el modelo de la UNE-EN ISO 13843 se obtiene la incertidumbre

directamente en porcentaje, pero con los modelos UNE-EN ISO 19036 e ISO
29201 el resultado se obtiene en logaritmo y para expresar la incertidumbre en
términos relativos, se pueden aplicar esta fórmula:
9 %) = 2,3 · 9 ®¯) ∗ 100
Ejemplo:
Para un ensayo de Bacterias coliformes con una incertidumbre operacional o

incertidumbre técnica corregida utechcorregida = 0,08 (log) se procesan 10 ml y se
obtiene un resultado de 70 ufc. El resultado sería 7x102 ufc/100 ml (2,9
expresado en logaritmo).
0,4343
Calculamos uPoisson mediante la siguiente fórmula y se obtiene 0,0519.
9±® =
√70
®
Calculamos uPoisson/utech = 0,0519/0,08 y el resultado es 0,6, al ser mayor que 0,2

no es posible despreciar la contribución de la incertidumbre de la distribución de
Poisson.
Aplicamos la fórmula de la incertidumbre estándar combinada mediante la

siguiente fórmula:
9„ ¨) = ‡0,086 + 0,05196 = 0,10 (log)
Multiplicamos por 2 para calcular la incertidumbre expandida y se obtiene:
U = 2* 0,10 = 0,19 (log)
El resultado de la muestra sería entonces 2,9 ±0,19 (log).
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La tabla siguiente resumen la información desarrollada en el apartado de verificación de métodos microbiológicos.
Método Criterios
PARAMETROS VERIFICACIÓN cuantitativo cuantitativo Anexo

Cualitativo cualitativo
Recuento colonias NMP Recuento colonias NMP
Sensibilidad Requerido Requerido Requerido >90 (4) >90 (5) >90 (5)
Especificidad Requerido Requerido Requerido >90 (4) >80 (5) >80 (5)
Falsos positivos Requerido Requerido Requerido <10 (4) <10 <10 X
Falsos negativos Requerido Requerido Requerido <10 (4) <10 <10
Eficiencia Requerido Requerido Requerido >90 (4) >90 (5) >90 (5)
- IDP < chi2 IDP < chi2
Varianza Varianza
Repetibilidad (Precisión) - Opcional Opcional operativa relativa operativa XI
-
< valor relativa <
reproducibildad valor repro
-
Reproducibilidad (Precisión) - Requerido Requerido < 46% (0,20 en ulog) XII
-
Si no existen en la ISO, ver

XV / XIII
ejemplo de cálculo en anexo XV
Tasa Recuperación relativa - Requerido Requerido -
Si existen en la ISO, ver ejemplo
XIV
en anexo XIV
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Método Criterios
PARAMETROS VERIFICACIÓN cuantitativo cuantitativo Anexo

Cualitativo cualitativo
Recuento colonias NMP Recuento colonias NMP
Mínima
concentración
90%
Limite detección Requerido - - - -
Presencia
(valores 3-5
UFC)
Incertidumbre recuento - Opcional Opcional - Intralab<0,1 Intralab<0,1 XVI
Incertidumbre método - Requerido (3) - <0,40 (ulog) - XVII
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4.6. MÉTODOS DE FABRICANTES Y KITS COMERCIALES
El uso de Kits comerciales se ha implantado en los laboratorios, como métodos

de análisis que, mediante su especificidad y rapidez, suponen una mejora en
ciertos análisis dentro del laboratorio. Hay que tener en cuenta que, en algunos
casos, el empleo de kits comerciales es la única vía disponible para la ejecución
de determinados métodos de ensayo.
Se define kit comercial como un conjunto de medios y productos suficiente para

un determinado fin, de tal forma que su presentación comercial constituye un
método de análisis para su aplicación directa. (34). En el mercado, actualmente se
dispone de kits comerciales para análisis en el campo microbiológico, físico-
químico, molecular, etc., incluyendo determinaciones tanto cuantitativas,
cualitativas como semi-cuantitativas.
Dado la especificidad de los kits, el laboratorio debería conocer las opciones

disponibles en el mercado, para la elección del kit comercial más adecuado al
tipo de muestras, teniendo en cuenta la matriz, rango de analitos, presencia de
interferencias, etc. Esta información, junto con las instrucciones de uso, son
información clave para su utilización en el laboratorio, pudiendo ser necesario,
cuando así se requiera, desarrollar procedimientos internos para completarlas.
Pueden darse los siguientes escenarios:
a) Kit con Certificado de validación del fabricante
De acuerdo con lo indicado anteriormente, el laboratorio deberá comprobar

que cumple con las especificaciones y parámetros de desempeño.
b) Kit sin Certificado de validación del fabricante
El laboratorio deberá realizar una validación completa del método asociado al

kit comercial.
c) Kit bajo regulación normativa
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Cuando el kit ha sido validado siguiendo una norma de referencia, únicamente

habrá que comprobar si el informe de validación emitido por el proveedor
cumple con los requisitos establecidos en dicha norma.
Esta validación se podrá realizar tanto por parte del proveedor, como por
parte del laboratorio, siendo aceptable en ambos casos, siempre y cuando se
garantice el cumplimiento de la norma de referencia.
4.7. MÉTODOS ON LINE
4.7.1. Introducción
Los métodos de ensayo que utilizan equipos de medición on-line (en continuo)
pueden estar basados, o no, en normas de referencia. En este sentido, serían de
aplicación los mismos criterios descritos en esta guía, en función de si el método
sigue una norma de referencia, o no, para demostrar, mediante verificación o
validación, que se cumplen los requisitos para el uso específico previsto.
4.7.2. Verificación/validación
El principal problema de los equipos de medición on-line es que, en ocasiones, el
equipo no está acondicionado para poder medir en modo off-line un material de
referencia que permita realizar el control de calidad y evaluar la verificación/
validación, ni patrones de calibración para poder realizar la calibración
instrumental. En estos casos sería recomendable llevar a cabo una verificación/
validación en un laboratorio permanente, previa a su instalación en continuo,
analizando patrones de concentración conocida (en la matriz en la que se van a
realizar posteriormente los ensayos en continuo) y sometiendo al equipo a
diferentes condiciones ambientales y temporales para evaluar la robustez del
método.
En el caso de que el equipo on-line admita la posibilidad de poder analizar (en

modo off-line) patrones de calibración, materiales de referencia, muestras
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fortificadas, etc., se podrán aplicar los mismos criterios para evaluar los
parámetros, según proceda, que caracterizan la verificación/validación descritos
en esta guía, es decir: función respuesta, selectividad, sensibilidad, límite de
detección, límite de cuantificación, robustez, precisión, veracidad y cálculo de
incertidumbre.
A continuación, se describen algunas particularidades que influyen en la

evaluación de los parámetros que caracterizan la verificación/validación:
• Evaluación de la función respuesta: cuando venga preestablecida de

fábrica y el equipo no permita recalibrar con patrones que cubran el
intervalo deseado de la calibración instrumental, normalmente se permitirá
algún tipo de ajuste (a un punto). En estos casos se deberá evaluar la
sensibilidad mediante la verificación de la variabilidad de la pendiente a lo
largo del tiempo.
• Límite de cuantificación, precisión, veracidad y evaluación de la
incertidumbre: si el equipo permite el modo off-line, se analizarán
materiales de referencia o muestras fortificadas preparadas por el
laboratorio, en caso contrario, esta comprobación experimental deberá
realizarse aislando el equipo en un laboratorio permanente (previa a su
instalación) tal y como se describe al principio de este apartado.
• Robustez: se deberán comprobar los cambios en las condiciones
experimentales, que puedan afectar a los resultados, normalmente
conservación de los reactivos, temperatura y cambios en la concentración
en la muestra que el equipo analiza en continuo. Para evaluar todos estos
factores se pueden analizar, de forma sincronizada, diferentes tomas de
muestra (que sean representativas en el tiempo) con otro método de
ensayo de referencia1 y realizar una comparación mediante un contraste
de significación entre las dos poblaciones de resultados (p. ej. estadístico
1
El método de referencia indicado podrá basarse en la misma metodología o fundamento químico
empleado por el equipo on-line (preferible) o bien, utilizar otra metodología siempre y cuando sea un
método validado/verificado previamente.
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t para datos emparejados2) para comprobar que no existan errores

sistemáticos, estadísticamente significativos, entre los dos métodos.
4.8. MÉTODOS IN SITU
Los parámetros que habitualmente se determinan in situ como pueden ser: cloro,
temperatura, oxígeno disuelto, etc., deberán validarse al igual que el resto de los
parámetros en el laboratorio.
La validación se realizará con los equipos de campo y en algunos casos por

comparación con algún método de referencia.
Por tratarse de parámetros no estables en el tiempo puede ocurrir que no existan

materiales de referencia, en estas situaciones la repetibilidad (r) puede estimarse
analizando las muestras por duplicado y representando en un gráfico-R la
diferencia en valor absoluto entre los valores de ambas muestras calculado en
porcentaje sobre la media de ambos datos. La desviación estándar de los
resultados se puede estimar sobre el valor medio del rango de duplicados de
muestras estableciendo como límites de control ±2s.
Para el cálculo de la precisión intermedia (R) lo habitual es analizar la muestra

mediante un método normalizado o de referencia y el método del laboratorio
(utilizando el equipo de campo) calculando la desviación entre ambos resultados.
La evaluación de la incertidumbre se hará componiendo repetibilidad y precisión

intermedia de acuerdo con la expresión:
¹ = ‡¥ 6 + ¬ 6
En el caso de disponer de patrones o materiales de referencia del parámetro a

verificar se realizará de igual manera que para cualquier otro parámetro del
laboratorio.
2
Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, James N. Miller, Jane C. Miller, Seven Edition,
Prentice Hall.
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4.9. ASIGNACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE AL MÉTODO DE ENSAYO
A partir de los valores de incertidumbre expandida obtenidos en los estudios

realizados (distintos niveles, incluyendo el límite de cuantificación, y en las
matrices de estudio), se establecerá una incertidumbre del método acorde con
los resultados obtenidos. Los criterios a seguir pueden ser:
A) Establecer diferentes valores de incertidumbre del método según el nivel

de concentración en caso de que sean muy diferentes.
B) Tomar como incertidumbre del método la más desfavorable evaluada en

los niveles de concentración estudiados. Este criterio penaliza los niveles
de concentración con incertidumbres menores.
Cuando sea aplicable, se incluirá una declaración sobre la incertidumbre de

medición estimada; la información sobre la incertidumbre es necesaria cuando
sea pertinente para la validez o aplicación de los resultados de los ensayos,
cuando así lo requieran las instrucciones del cliente o cuando la incertidumbre
afecte al cumplimiento con los límites de una especificación. (5)
4.10. OTRAS CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE
En determinadas situaciones puede ser necesario considerar los resultados de la

evaluación de la incertidumbre asociada a la toma de muestras o el muestreo. Se
recomienda la lectura de la Parte III de la Guía de Laboratorios (28)
4.11. CRITERIOS GUIA PARA LA EXPRESIÓN DE RESULTADOS
A) PARÁMETROS FÍSICO – QUÍMICOS

Es habitual expresar los resultados de ensayo como:
[(y ± U) unidades] o [y (unidades) ± U (%)]
donde:
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y es el resultado numérico obtenido por el laboratorio
U es la incertidumbre expandida que proporciona un intervalo dentro del

cual se sitúa el valor de la medida con una probabilidad determinada,
normalmente el 95%.
El laboratorio debe expresar los resultados de medida en función de la

incertidumbre obtenida. Una recomendación general (29) es que la incertidumbre
se exprese con dos cifras significativas y el valor numérico del resultado debe
redondearse de forma que el último decimal se corresponda con el último dígito
de la incertidumbre, reflejando así la capacidad de medida en la práctica. En
ambos casos pueden aplicarse las reglas habituales de redondeo (29):
- El valor numérico de la incertidumbre expandida debe expresarse con dos

cifras significativas.
- El valor numérico final del resultado de medida se redondeará a la cifra
menos significativa del valor de la incertidumbre expandida asignada a
resultados de medida.
- El redondeo se realizará según las directrices contenidas en la sección 7
de la GUM y la ISO 80000-1:2009, para ello, las reglas del redondeo serán:
o Si sólo hay un múltiplo entero más cercano al número dado, éste
se acepta como número redondeado. Para número <5 se elimina
esta cifra y para >5 se aumenta en una unidad la cifra anterior.
o Si es un 5, se selecciona el número par como el número
redondeado.
EJEMPLO:
El intervalo de trabajo para un analito es de 0,10 mg/L a 80 mg/L.
- La incertidumbre en el LOQ, teniendo en cuenta que la incertidumbre obtenida

en la validación es de un 21%; según esto:
0,10 mg/L * 21 % = 0,021 mg/L, por lo que, en el LOQ la expresión sería:
(0,100 ± 0,021) mg/L
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- Para calcular hasta qué concentración tendríamos que expresar el resultado con
2 decimales, tendríamos que ver a partir de qué concentración ya obtendríamos
una incertidumbre de 0,10 mg/L, dicho valor sería 0,47 mg/L:
(0,47 ± 0,10) mg/L
- Para el siguiente rango tendríamos que buscar a partir de qué valor de

concentración tendríamos un valor de incertidumbre de 10 mg/L. En este caso
vemos, que hasta 47 mg/L la incertidumbre se podría expresar con 1 decimal
(9,9 mg/L en el caso de 47 mg/L).
- Tendríamos un rango intermedio de 0,48 mg/L a 47 mg/L donde la incertidumbre
se expresaría con dos decimales, y a partir de 48 mg/L ya se podría expresar sin
decimales, por las cifras significativas serían unidades y decenas.
En algunos casos puede ser suficiente el uso de una cifra significativa en la

expresión de la incertidumbre, sin embargo, debe considerarse la coherencia de
la expresión final, así como su uso para la toma de decisiones. Un ejemplo se
puede consultar en el Anexo XII.
Cuando la legislación indica la expresión de resultados asociada a los valores

paramétricos o niveles de calidad aceptables que se regulan, el laboratorio deberá
atender a dicha especificación. Sin embargo, puede haber casos en los que sea
apropiado utilizar una cifra significativa adicional.
Existen parámetros cuyo valor se calcula a partir de resultados individuales. En

caso de que alguno de estos resultados sea menor del límite de cuantificación
deberán seguirse las indicaciones de la legislación vigente (30). En los casos en
que no haya ninguna especificación sobre cómo realizar la suma en caso de
valores por debajo del límite de cuantificación, el laboratorio establecerá y
documentará el criterio.
B) PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS
Existen varios textos normativos (26,31,32) que dan indicaciones sobre las
particularidades de la expresión de resultados como consecuencia de la
distribución estadística de los recuentos microbianos, así como de la necesidad
de informar la estimación de la incertidumbre en función del uso previsto del
resultado del ensayo.
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Sin embargo, debe considerarse prioritario el cumplimiento del requisito 7.8.1 de

la norma UNE EN ISO/IEC 17025:2017, relacionado con el contenido de los
informes de ensayo:
“Los resultados de cada ensayo, calibración, series de ensayos o calibraciones

efectuados por el laboratorio deben ser informados en forma exacta, clara, no
ambigua y objetiva, de acuerdo con las instrucciones específicas de los métodos
de ensayo o calibración”
Son claros ejemplos de esta situación resultados como 6 ufc/vol donde se indica
como conveniente acompañar el valor numérico con el texto “numero estimativo”
o “recuento estimado”, o cuando el recuento está comprendido entre 1 y 3
ufc/vol, que debería informarse como “organismo detectado”’.
El resultado informado debe proporcionarse de forma que permita la toma de

decisiones, por tanto, en el apartado de expresión de resultados de los
procedimientos de ensayo microbiológicos se contemplarán los requerimientos
de las normas que procedan, incluyendo un texto adicional en el que se indique
que se informará siempre con el valor numérico de recuento obtenido en los
informes de ensayo. De esta forma, el procedimiento de ensayo podría indicar:
“De acuerdo con la norma UNE-EN ISO 8199, los resultados obtenidos para la
determinación de un determinado microorganismo en una matriz dada se ajustan a la
expresión
Número de colonias Criterios de expresión según UNE-EN ISO 8199

0 ufc/placa 0 ufc/volumen analizado
De 1 o 2 ufc/placa Presencia/volumen analizado
De 3 a 9 ufc/placa X ufc/volumen analizado (Recuento estimado)
De 10 a 80 ufc/placa X ufc/volumen analizado
> 80 ufc/placa >ufc max/volumen analizado
En el informe de ensayo los resultados se expresan con el recuento obtenido en las
lecturas de las placas. Por debajo de 10 ufc/vol, el resultado se considera como recuento
estimado debido al efecto de sobredispersión”
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El laboratorio podrá incluir una llamada en sus informes de ensayo para aquellos
resultados comprendidos entre 1 y 9 ufc/vol indicando, por ejemplo:
“Según la norma UNE-EN ISO 8199 los recuentos comprendidos entre 1 o 2

ufc/vol suponen la presencia del organismo, y los comprendidos entre 3 y 9
ufc/vol son un número estimativo”
Para métodos basados en recuento de colonias. El resultado calculado se

redondea a dos cifras significativas. Si la tercera cifra es inferior a 5, no se
modifica la anterior; si es igual o superior a 5, la cifra anterior se incrementa en
una unidad.
Para NMP, como los valores proceden de un análisis estadístico, con frecuencia
presentan un número decimal en las tablas. Cuando se da un resultado, deben
expresarse redondeados al valor del número entero más próximo.
Debe tenerse en cuenta que pueden existir requisitos particulares para la

expresión de resultados en documentos normativos específicos para los ensayos
que se realicen (33).
5.- PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD
A partir de los resultados finales obtenidos es posible establecer las pautas

generales para las actividades de aseguramiento de la validez de resultados,
proponiendo:
a) Esquema de control interno: uso de MRC, muestras naturales adicionadas,

agua de laboratorio adicionada, frecuencia, etc.
b) Indicador para la evaluación de los datos: recuperación, veracidad, precisión,
incertidumbre.
c) En lotes de gran tamaño, concretar la necesidad de intercalar o no controles
internos, además de al principio y final del lote, y cómo se evalúan.
d) Si se asignan blancos de ensayo y como se tratan con respecto a los
resultados de rutina.
e) Las familias de ensayo identificadas a partir de la confirmación de matrices
representativas.
f) Características del esquema de control externo.
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Para mayor detalle consultar la Parte I de la Guía de Laboratorios (6).
6. ACTUALIZACIÓN DE LA VERIFICACIÓN O LA VALIDACIÓN DEL

MÉTODO
Los laboratorios deben comprobar a lo largo del tiempo la adecuación de los

datos obtenidos en la verificación o validación inicial, teniendo en cuenta:
• datos recientes de los controles de calidad internos,
• nuevos datos obtenidos de la participación en ensayos de

intercomparación,
• revisiones de las normas aplicables,
• documentos legales o reglamentarios con directrices específicas para los

respectivos campos de ensayo.
Debe tenerse en cuenta que la incertidumbre estándar para un método de ensayo

de rutina nunca debe ser menor que la precisión a largo plazo para el mismo
método y mismo tipo de muestra.
Si la incertidumbre estándar es significativamente menor que la desviación

estándar observada dentro del laboratorio, la estimación de la incertidumbre
debe ser revisada inmediatamente (35).
En los casos en que se realicen cambios de importancia en el método que puedan

afectar a los parámetros de desempeño del mismo, será necesario realizar de
nuevo el cálculo de veracidad, precisión e incertidumbre de acuerdo a las
condiciones actuales de trabajo.
7. CONTROL DE LOS DATOS Y GESTIÓN DE LA INFORMACIÓN
Las aplicaciones informáticas usadas por el laboratorio para el cálculo,

tratamiento o transferencia de resultados deben estar validadas para confirmar
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su adecuación al uso previsto. Se recomienda además contar con instrucciones

del uso de dichas aplicaciones. Además, los cálculos y la transferencia de
resultados deberán contar con un programa de comprobación sistemática, en
particular cuando se haya realizado alguna actualización o cambio significativo.
La extensión de las pruebas de validación varía en función del tipo de soporte

lógico utilizado por el laboratorio. El software comercial se considera
suficientemente validado, pero las parametrizaciones y configuraciones
particulares (hojas de cálculo) deberán validarse.
Para validar una hoja de cálculo se tienen que comprobar los siguientes puntos:
1. Que los cálculos que contiene la hoja son los que aparecen descritos en
los procedimientos a los que aplican.
2. Que las celdas que componen las fórmulas en la hoja de cálculo están
vinculadas a las celdas de datos correctamente.
3. Que los resultados obtenidos son los correctos.
Para la hoja de cálculo se deberían establecer los niveles de acceso por usuario,
cuáles son las celdas de ENTRADA (aquellas donde los usuarios pueden ingresar
los datos), qué fórmulas o cálculos tiene la hoja de cálculo (funciones) y cuáles
son las celdas de SALIDA.
Es necesario verificar que las celdas que no son de entrada de datos estén
bloqueadas y así evitar modificaciones accidentales. Además, los datos
soportados y guardados en estas aplicaciones estarán protegidos contra
manipulaciones indebidas que puedan cuestionar la integridad y confidencialidad
de los datos almacenados.
La sistemática de validación debe estar documentada y debe quedar evidencia

de las pruebas realizadas para la validación.
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8. REFERENCIAS
0. Glosario de términos.
1. UNE-EN ISO 16140-2:2016 Microbiología de la cadena alimentaria. Validación

de métodos. Parte 2: Protocolo para la validación de métodos alternativos
(registrados) frente a los métodos de referencia. (ISO 16140-2:2016).
2. UNE-EN ISO 13843:2018 Calidad del agua. Requisitos para el establecimiento

de las características de funcionamiento de los métodos microbiológicos
cuantitativos. (ISO 13843:2017).
3. UNE-EN ISO 17994:2014 Calidad del agua. Requisitos para la comparación de

la tasa de recuperación relativa de microorganismos por dos métodos
cuantitativos. (ISO 17994:2014).
4. Orden SCO/778/2009, de 17 de marzo, sobre métodos alternativos para el

análisis microbiológico del agua de consumo humano.
5. UNE-EN ISO/IEC 17025:2017. Evaluación de la conformidad. Requisitos

generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de calibración.
6. Guía para el funcionamiento de los laboratorios de ensayos de aguas. Parte

I: criterios para el aseguramiento de la validez de los resultados. Asociación
Española de Abastecimientos de Agua y Saneamiento (AEAS). Junio 2022.
7. General Accreditation Guidance – Validation and verification of quantitative

and qualitative tests methods. January 2018. NATA.
8. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM-CITAC Guide

CG 4. 3rd Edition (2012). Traducción al español de 2015.
9. The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method

Validation and Related Topics (2014). Traducción al español de 2016.
10. Guide to Method Validation for Quantitative Analysis in Chemical Testing

Laboratories (PS15). INAB. Issue 3 February 2016.
Página 76 de 142
11. UNE-EN ISO 3696:1996 Agua para uso en análisis de laboratorio.

Especificación y métodos de ensayo. (ISO 3696:1987).
12. Guide to Method Flexibility and Approval of EPA Water Methods. EPA.
December 1996.
13. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. APHA,
AWWA, WEF. 23rd Edition, 2017.
14. Calibración lineal. Jordi Riu, Ricard Boqué. Departamento de Química

Analítica y Química Orgánica, Universitat Rovira i Virgili. Tarragona. Técnicas
de Laboratorio, 284 (2003) 676-680.
15. ISO 8466-2:2001. Water quality -- Calibration and evaluation of analytical

methods and estimation of performance characteristics -- Part 2: Calibration
strategy for non-linear second-order calibration functions.
16. ISO 8466-1:2021 Water quality -- Calibration and evaluation of analytical

methods -- Part 1: Linear calibration function.
17. International Vocabulary of Metrology – Basic and general concepts and

associated terms (VIM). BIMP. 3rd edition (2012).
18. Real Decreto 140/2003, de 7 de febrero, por el que se establecen los criterios
sanitarios de la calidad del agua de consumo humano. Texto consolidado.
19. Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis

(IUPAC technical reports) Pure Appl. Chem. Vol 74, pp 835–855, 2002.
20. ISO 11352:2012. Water quality -- Estimation of measurement uncertainty

based on validation and quality control data.
21. Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental

Laboratories. NORTEST TECHNICAL REPORT 537. Edition 3. Approved 2011-
11.
22. UNE-ENV ISO 13530:2000 Calidad del agua. Guía para el control de la calidad
analítica en el análisis del agua3.
3
Aun cuando esta norma ha sido derogada se mantiene en tanto tenga sustitución o revisión.
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23. Harmonized guidelines for the use of recovery information in analytical

measurement. IUPAC, Pure Appl. Chem. 71, 337–348. 1999.
24. Incertidumbre en métodos analíticos de rutina. Alicia Maroto. Tesis Doctoral

Departamento de Química Analítica y Química Orgánica. Instituto de Estudios
Avanzados. Universitat Rovira i Virgili. 2002.
25. CEA-ENAC - 20 Rev. 1 Criterios Específicos de Acreditación. Análisis

microbiológico (mayo 2017).
26. UNE-EN ISO 8199:2019 Calidad del agua. Requisitos y orientaciones

generales para el recuento de microorganismos mediante cultivo. (ISO
8199:2018).
27. UNE-EN ISO 19036:2020 Microbiología de la cadena alimentaria. Estimación

de la incertidumbre de la medición para determinaciones cuantitativas. (ISO
19036:2019).
28. Guía para el funcionamiento de los laboratorios de ensayos de aguas. Parte

III Criterios para la toma de muestras – Revisión 1. Asociación Española de
Abastecimientos de Agua y Saneamiento (AEAS). Abril 2019
29. EA guidelines on the expression of uncertainty in quantitative testing. EA-

4/16 G Rev. 00 (December 2003).
30. Real Decreto 817/2015, de 11 de septiembre, por el que se establecen los

criterios de seguimiento y evaluación del estado de las aguas superficiales y
las normas de calidad ambiental.
31. UNE-EN ISO 7218:2008 Microbiología de los alimentos para consumo humano
y alimentación animal. Requisitos generales y guía para el examen
microbiológico. (ISO 7218:2007). Amd. 1 – 2013.
32. ISO 29201:2012. Water quality – the variability of test results and the
uncertainty of measurement of microbiological enumeration methods.
33. Accreditation for Microbiological Laboratories. EURACHEM. 2nd Edition 2013.
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34. G-ENAC - 20 Rev. 1 Guía para la selección y utilización de kits de ensayo por
los laboratorios acreditados (Enero 2017).
35. Measurement uncertainty revisited: Alternative approaches to uncertainty

evaluation. EUROLAB Technical Report No. 1/2007. March 2007.
36. Technical Note 17 — June 2012 Issued: August 2004 Amended and reissued:
December 2006, April 2009, March 2012, June 2012 Guidelines for the
validation and verification of quantitative and qualitative test methods.
37. PS24 Minimum verification requirements for ISO 17025 & ISO 15189 testing
laboratories. Issue 1 February 2016
38. How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verification. 2007 ALACC
Guide
39. Validación y Verificación analítica de los métodos microbiológicos.

Procedimientos en Microbiología Clínica. 2013. SEIMC. Sociedad Española de
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica
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9. ANEXOS
Anexo I Ejemplo de estudio de función de respuesta
Anexo II Ejemplo de cálculo de sensibilidad
Anexo III Ejemplo de cálculo de precisión
Anexo IV Ejemplo de cálculo de sesgo
Anexo V Ejemplo de cálculo de incertidumbre con material de referencia
Anexo VI Ejemplo de cálculo de incertidumbre con control interno
Anexo VII Ejemplo comparativo de las dos formas indicadas en la guía para el
cálculo de la incertidumbre asociada a la adición
Anexo VIII Ejemplo de cálculo de incertidumbre con ejercicios de intercomparación
Anexo IX Obtención del valor de referencia en métodos microbiológicos
Anexo X Ejemplo de cálculo de la sensibilidad, especificidad, tasa de falsos

positivos, tasa de falsos negativos, selectividad y eficiencia
Anexo XI Ejemplo de verificación de la repetibilidad según Índice de Dispersión de

Poisson
Anexo XII Ejemplo de cálculo de la reproducibilidad según la norma UNE-EN ISO

19036
Anexo XIII Ejemplo de verificación de la tasa de recuperación relativa cuando las

normas de referencia incluyen criterios
Anexo XIV Ejemplo de cálculo de la tasa de recuperación relativa cuando las normas
de referencia no incluyen criterios
Anexo XV Ejemplos de estimación de incertidumbre en ensayos microbiológicos
Anexo XVI Ejemplos sobre expresión de resultados
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ANEXO I: EVALUACIÓN DE LA LINEALIDAD
Para poder considerar que un modelo de línea recta es válido, en el gráfico de residuales,
se debe observar que:
1) El número de residuales positivos es aproximadamente igual al número

de residuales negativos
2) Los residuales están distribuidos aleatoriamente
3) Todos tienen aproximadamente el mismo valor absoluto
4) No deben mostrar tendencias
Las cuatro situaciones tipo que pueden observarse en los gráficos de residuales son:
a) Cumple con los requisitos anteriormente mencionados. Situación correcta.

b) El valor de los residuales aumenta con la concentración: indica que la
incertidumbre asociada a cada punto experimental aumenta con la
concentración y que probablemente serían más adecuados otros métodos de
regresión para calcular los coeficientes de la recta de calibrado (ej. mínimos
cuadrados ponderados).
c) Probablemente se está intentando ajustar a una línea recta datos
experimentales que quizás se ajustarían mejor a una curva.
d) Presencia de un punto discrepante (outlier) en nuestro conjunto de datos
experimentales. Los puntos discrepantes pueden estar causados, por ejemplo,
por un error humano o por una falta de linealidad.
A continuación, se adjunta un ejemplo de los cuatro casos citados anteriormente dentro

del apartado de linealidad.
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1) Representación gráfica.
A partir de los datos de concentración y señal, siendo x la concentración e y la señal, se
hace la representación gráfica correspondiente.
De esta manera se pueden detectar visualmente la existencia de valores aberrantes.
Caso 1
450000
Concentración (µg/L) Señal y = 4224x + 730
400000
0 234
350000
1 4557
300000
5 20960
250000
Señal
10 40926
200000
50 219110
150000
100 419847
100000
50000
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración (µg/L)
Representación gráfica adecuada visualmente.
Caso 2
600000
y = 4742x + 17434
Concentración (µg/L) Señal
0 234 500000
1 4557 400000
5 20960
Señal
10 40926 300000
50 405230 200000
100 419847
100000
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentración (µg/L)
Representación gráfica con valores aberrantes.
Se observa que gráficamente no es una recta adecuada pero habría que realizar estudios
adicionales para identificar qué valor es el aberrante.
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2) Coeficiente de determinación (r2).

A partir de los datos de concentración y señal, siendo x la concentración e y la señal, se
obtienen los valores de la pendiente (a), la ordenada en el origen (b) y el coeficiente de
determinación (r2) de la recta.
Si establecemos un criterio de linealidad de r2 > 0,995 tendríamos:
Caso 1
Concentración (µg/L) Señal y = ax+b

0 234 a = 4224
1 4557 b = 730
r2 = 0,9995
5 20960
Cumple criterio de linealidad.
10 40926
50 219110
100 419847
Caso 2
Concentración (µg/L) Señal y = ax+b

0 234 a = 4742
1 4557 b = 17434
5 20960 r2 = 0,8598
No cumple criterio de linealidad.
10 40926
50 405230
100 419847
3) Análisis de residuales de regresión.

A partir de los datos de concentración y señal, se obtiene la ecuación de la recta. Con la
ecuación de la recta se determinan las concentraciones calculadas y se obtiene los
residuales de regresión como, la diferencia entre la concentración calculada y la teórica.
Si establecemos un criterio para la tolerancia de los residuales < 10%, calculada como
el residual de regresión entre la concentración teórica por 100 (en valor absoluto),
tenemos:
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Caso 1
Tolerancia de los
Concentración Concentración Residual de
Señal residuales
(µg/L) calculada regresión
< 10%
0 234
1 4557 0,91 -0,094 9,4
5 20960 4,79 -0,211 4,2
10 40926 9,52 -0,485 4,9
50 219110 51,69 1,695 3,4
100 419847 99,21 -0,787 0,8
Representación gráfica de residuales:
y=ax+b
a = 4224
b = 730
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Caso 2
Toleracia de los
Concentración Concentración Residual de
Señal residuales
(µg/L) calculada regresión
< 10%
0 234
1 4557 -2,72 -3,716 - 371,6
5 20960 0,74 -4,256 - 85,1
10 40926 4,94 -5,046 - 50,5
50 405230 81,78 31,781 63,6
100 419847 84,86 -15,136 - 15,1
Representación gráfica de residuales:
y=ax+b
a = 4742
b = 17434
4) Desviación del factor de respuesta.

A partir de los datos de concentración y señal, se calculan los factores de respuesta para
cada una de las concentraciones como la relación entre la señal y la concentración
obtenida para dicha señal.
Si establecemos un criterio para el factor de respuesta del 10%, calculado como la RSDfr
entre el promediofr por 100, tenemos:
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Caso 1
Concentración Factor de
Señal y = ax+b
(µg/L) respuesta.
a = 4224
0 234 b = 730
1 4557 4323
5 20960 4145
10 40926 4069
50 219110 4378
100 419847 4196
Promediofr = 4222 RSDfr = 127 (RSDfr/Promediofr) x 100 = 3%
Caso 2
Concentración Factor de
Señal y = ax+b
(µg/L) respuesta.
a = 4742
0 234 b = 17434
1 4557 4323
5 20960 4145
10 40926 4069
50 405230 8100
100 419847 4196
Promediofr = 4967 RSDfr = 1754 (RSDfr/Promediofr) x 100 = 35%
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ANEXO II: EVALUACIÓN DE LA SENSIBILIDAD
Estudio de la sensibilidad en ICP-MS para la determinación de Li
Considerando la pendiente de la regresión lineal como indicadora de la sensibilidad del

método, se propone controlar que ésta se mantiene cuando se analizan muestras en
rutina.
Para ello, suponiendo que los valores de la pendiente se comportan como una
distribución normal, se toman los datos de la pendiente de las diferentes rectas
realizadas durante la validación y se calcula el valor medio, la desviación estándar (Sd) y
el coeficiente de variación, pudiéndose establecer a partir de los valores obtenidos unos
intervalos de confianza:
• Límite de aviso: Valor medio de la pendiente más dos veces su desviación

estándar
• Límite de alarma: Valor medio de la pendiente más tres veces su desviación
estándar
• Coeficiente de variación: Se establece un criterio de aceptación del 10%
Fecha Recta Pendiente

02/05/2012 y=4749x + 282 4749
09/05/2012 y=4460x + 398 4460
15/05/2012 y=4636x + 200 4636
21/05/2012 y=4640x + 626 4640
30/05/2012 y=3802x + 313 3802
06/06/2012 y=3951x + 317 3951
13/06/2012 y=4054x + 302 4054
Valor medio 4327

Sd 383
CV% 8,9
ESTU
Límites de confianza
Límites de aviso X±2Sd 4327±766 3561 – 5093
Límites de alarma X±3Sd 4327±1149 3178 – 5476
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Debido a que el método de determinación de Li por ICP emplea patrón interno para la
cuantificación y en la construcción de la recta de calibrado se utilizan valores relativos,
es necesario establecer un criterio adicional que demuestre que la sensibilidad del equipo
es aceptable.
Se propone establecer un valor mínimo de lectura del patrón, una vez optimizadas las
condiciones del equipo. Para ello, a partir de los valores del patrón interno de 1 ppb de
Indio obtenidos durante la validación, se calcula el valor medio de las lecturas y su
desviación estándar y se establece como criterio de aceptación el valor medio menos
tres veces la desviación estándar.
TER
Fecha Respuesta Patrón interno 1 ppb Indio
02/05/2012 66934
09/05/2012 60540
15/05/2012 59622
21/05/2012 59338
30/05/2012 61185
06/06/2012 59641
13/06/2012 64662
V medio 61703
Sd 2942
Criterio de aceptación (X-3Sd) 52879
MIN
MIN
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ANEXO III: CÁLCULO DE LA PRECISIÓN
PARTE A: EJEMPLO DE CÁLCULO DE PRECISIÓN CON MUESTRAS

REALES ESTABLES QUE CUBREN TODO EL PROCESO ANALITICO
El estudio de precisión en la validación puede realizarse con materiales de referencia,

muestras adicionadas o muestras reales.
A. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO
• Límite de cuantificación: 0,100 mg/L

• Rango de trabajo: 0,100-15,0 mg/L
B. MATERIALES DE REFERENCIA UTILIZADOS EN LA VALIDACIÓN
Se trata de materiales de referencia matriciales con las siguientes concentraciones e

incertidumbres:
MR1 0,150 ± 0,006 mg/L
MR2 1,250 ± 0,015 mg/L
MR3 14,10 ± 0,28 mg/L
C. PRECISIÓN INTERMEDIA (SRW)
∑ !5 − !̅ )6
= 3
12
−1
∑ !5
!=
%) = · 100
1
12
!̅
SRW desviación estándar por precisión intermedia
!
Valor medio obtenido del material de referencia en condiciones de
precisión intermedia.
n Nº de repeticiones
!5 Cada uno de los resultados obtenidos
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MR1 MR2 MR3

Día Analista (0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
1 A 0,146 1,11 13,5
2 B 0,149 1,20 13,3
3 A 0,153 1,21 13,8
4 B 0,151 1,20 13,4
5 A 0,145 1,24 13,9
6 B 0,152 1,23 13,1
7 B 0,142 1,15 13,5
8 A 0,159 1,16 13,4
9 A 0,142 1,23 14,2
10 B 0,146 1,24 13,8
SRW 0,0054 0,0437 0,3349
! 0,149 1,197 13,60
SRW(%) 3,6 3,7 2,5
D. REPETIBILIDAD (SRW)
∑ !5 − !̅ )6
= 3
A
−1
∑ !5
!=
%) = · 100
A
A
!̅
Sr desviación estándar de repetibilidad
!
Valor medio obtenido del material de referencia en condiciones de
repetibilidad.
n Nº de repeticiones
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MR1 MR2 MR3

Día Analista (0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
1 A 0,149 1,25 13,7
1 A 0,149 1,23 13,7
1 A 0,153 1,26 13,8
1 A 0,151 1,25 13,9
1 A 0,148 1,24 14,0
1 A 0,150 1,23 13,7
1 A 0,149 1,22 13,9
1 A 0,153 1,23 14,0
1 A 0,152 1,22 14,1
1 A 0,149 1,21 14,0
SRW 0,0018 0,0158 0,1476
! 0,150 1,231 13,88
SRW(%) 1,2 1,3 1,1
PARTE B: EJEMPLO DE CÁLCULO DE PRECISIÓN CON MUESTRAS DE

CONTROL ESTABLES QUE CUBREN TODO EL PROCESO ANALITICO
El estudio de precisión debe realizarse con soluciones de control de calidad en agua

destilada, y duplicados de muestras reales en la matriz y rango estudiados.
A. DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO

• Límite de cuantificación: 1,00 mg/L
• Rango de trabajo: 1,00-50,0 mg/L
B. MATERIALES UTILIZADOS EN LA VALIDACIÓN
- Soluciones de control de calidad de 2 y 10 mg/l, en agua destilada.

- Duplicados de muestras reales.
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C. MUESTRAS DE CONTROL SINTETICAS
Los resultados de las soluciones de control de calidad en agua destilada han sido los
siguientes:
Control 10
N Control 2 (mg/l)
(mg/l)
1 1,94 10,1
2 1,90 9,9
3 1,94 9,5
4 1,97 10,8
5 2,07 10,9
6 1,91 10,5
7 2,08 10,2
8 2,05 9,4
9 2,01 9,3
10 2,089 10,7
11 1,91 10,3
12 2,99 10,2
13 1,98 10,9
14 2,07 9,5
15 2,01 9,2
16 1,91 10,6
17 1,95 9,8
18 1,97 9,7
19 2,03 10,2
Promedio !̅
20 2,02 10,0
2,040 10,085
Desviación estándar
0,23 0,54
SRW,stand
Coeficiente de variación
11,37% 5,37%
Cv = SRW,stand,i,rel
SRW (control)
8,89%
SRW,stand
∑
Donde:
6
=3
6 1º,<=>?@,5,Av{
1º,<=>?@
y>=Ax?v<
para n = 2 patrones
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D. DUPLICADOS
Los resultados de las soluciones de control de calidad en agua destilada han sido los
siguientes:
Duplicado 1 Duplicado 2 Recorrido

N Media Recorrido
(mg(l) (mg(l) relativo
1 34,40 35,00 34,70 0,6 0,017
2 81,3 80,7 81,00 0,6 0,007
3 6,31 6,13 6,22 0,18 0,029
4 44,8 42,9 43,85 1,9 0,043
5 30,5 29,6 30,05 0,9 0,030
6 13,2 12,8 13,00 0,4 0,031
7 1,22 1,26 1,24 0,04 0,032
8 44,2 42,5 43,35 1,7 0,039
9 26,30 26,10 26,20 0,2 0,008
10 5,24 5,25 5,25 0,01 0,002
11 3,75 3,91 3,83 0,16 0,042
12 23,8 24,7 24,25 0,9 0,037
Promedio (tanto por uno) 0,026
SRW (%) = Promedio/1,128 (al ser duplicado) 2,35%
E. CALCULO DE PRECISION INTERMEDIA

Para el cálculo de la precisión intermedia para muestras de control estables que cubre
todo el proceso analítico, se utiliza la expresión siguiente:
91º = : 6
1º,<=>?@ + 6
A
Obteniéndose el siguiente resultado de precisión intermedia:
SRW,stand (control) 8,89%
SRW (duplicados) 2,35%
Precisión intermedia, uRw 9,20%
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ANEXO IV: EVALUACIÓN DE LA VERACIDAD
Caso 1. MATERIAL DE REFERENCIA MATRICIAL
Para el cálculo del sesgo en la validación de un método de determinación de

Hg mediante la técnica de fluorescencia atómica, se analizan diferentes
réplicas de un material de referencia de 0,200 ± 0,001 µg/L en matriz agua
de consumo humano.
Se realizan un mínimo de 7 réplicas en condiciones de reproducibilidad:
Réplica V (µg/L)
1 0,209
2 0,230
3 0,228
4 0,231
5 0,181
6 0,193
ŒD
7 0,211
0,212
Con los datos obtenidos se calcula el sesgo tal y como se ha descrito en el

apartado 5.2.8:
D − VEFG
V
D − VEFG
sesgo b) = V ¯® %) = ∗ 100
°Av…
Obteniéndose los siguientes resultados:
sesgo (b) 0,012
sesgo (b%) 5,9
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Caso 2. MUESTRAS FORTIFICADAS CON PATRONES TRAZABLES
Se pretende conocer el sesgo de un método para la determinación de nitritos

en aguas continentales, en el rango de su límite de cuantificación, cuyo valor
es 0,01 µg/l.
• No se dispone de material de referencia matricial de agua continental y

por lo tanto ha de prepararse sin perderse el efecto matriz.
• Se dispone de matriz real con concentración de analito igual a 0,01 µg/l.
• Se dispone de MR con concentración de analito igual a 2,000 ± 0,003
µg/L
• Se realiza la fortificación buscando el valor del analito próximo a valores
del LC.
Volumen de Concentración
Concentración inicial Concentración Volumen de Volumen
muestra teórica obtenida
de la muestra (µg/L) de MR (µg/L) MR (ml) final
(ml) de la fortificación
0,01 49 2,000 1 50 ml 0,0498
Tras realizar n mediciones (siendo n ≥ 10) de la muestra fortificada en

condiciones de reproducibilidad se obtiene un valor medio de estas medidas de
0,0511µg/l.
En este caso, al emplear muestras fortificadas, el sesgo se calcula a partir de la

recuperación (R), que se calcula como:
C1 − C2)
R %) = ∗ 100
C3
Siendo:
o C1: concentración medida en muestra fortificada
 1 = 0,0511
o C2: concentración medida en muestra sin fortificar

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2= = 0,0098
, ,∗ , »¼
, ½

o C3: concentración de la fortificación realizada
3= = 0,04
6∗ , ,
, ½

¬ %) = × 100 = 103
, ½,,J , ¼¾
, »
RECUPERACION (%) 103
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ANEXO V: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE CON MATERIAL DE

REFERENCIA
Se estima la incertidumbre de la determinación de P por ICP, en agua continental. El

método tiene un límite de cuantificación de 0,100 mg/L P y el rango de trabajo es 0, 100
a 15,0 mg/L P. Se han diseñado una serie de pruebas para la validación consistentes en
el análisis de distintos MR certificados, en matriz agua continental, en condiciones de
reproducibilidad (distintos días, distintos analistas, distintas calibraciones…).
Nota: Si el laboratorio ya dispone de datos de control de calidad realizados con material de

referencia matricial puede utilizar estos para el cálculo de la incertidumbre siguiendo este mismo
ejemplo
Las concentraciones e incertidumbres de los materiales de referencia utilizados son:
MR1 0,153 ± 0,006 mg/L
MR2 1,250 ± 0,015 mg/L
MR3 14,10 ± 0,28 mg/L
Las incertidumbres (U) están expresadas como expandidas para una k=2.
Se obtienen los resultados siguientes:
MR1 MR2 MR3

Resultado (0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
1 0,146 1,11 13,5
2 0,149 1,20 13,3
3 0,153 1,21 13,8
4 0,151 1,20 13,4
5 0,145 1,24 13,9
6 0,152 1,23 13,1
7 0,142 1,15 13,5
8 0,159 1,16 13,4
9 0,142 1,23 14,2
10 0,146 1,24 13,8
11 0,146 1,20 13,6
12 0,148 1,25 13,5
13 0,141 1,24 14,0
14 0,149 1,24 13,8
15 0,159 1,19 13,4
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Se estima la incertidumbre para cada rango de trabajo estudiado. Se realiza el cálculo

en términos relativos (%).
La incertidumbre expandida (U) del método se calcula como:
¹ = Á ∗ 9/
Donde k es el factor de cobertura (para una distribución normal y un 95% de

probabilidad su valor es k=2) y uC es la incertidumbre combinada estándar.
El cálculo de la incertidumbre combinada estándar se realiza atendiendo a la ecuación:
9/ = :912 6 + 9Âv<wx 6
uR Incertidumbre reproducibilidad dentro del laboratorio.
uSesgo Incertidumbre debida al sesgo.
A. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE INCERTIDUMBRE CORRESPONDIENTE

A LA REPRODUCIBILIDAD (uRW):
912 = 12
912
912 %) = × 100
!̅
= :
∑ À} J À̅ )~
12 ?J,
! Valor medio obtenido
SRW Desviación estándar para una concentración determinada.
!=
∑ À}
?
(mg/L)
n es el Nº de repeticiones
Los resultados obtenidos para los tres materiales de referencia son:
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MR1 MR2 MR3

(0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
SRW 0,006 0,04 0,29
¤ 0,149 1,21 13,61
jl‰ %) 3,739 3,33 2,16
B. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE INCERTIDUMBRE CORRESPONDIENTE

AL SESGO (usesgo):
sID 6
uZFZ[\ = 3u6cX + d h + b6
√n
uMR incertidumbre típica del material de referencia
¹ 100
9Š1 %) = ∗
2 °1
U=Incertidumbre expandida del material de referencia
VR = Valor del material de referencia
sID desviación estándar de las mediciones realizadas sobre el material de referencia
n número de repeticiones realizadas
ÂÃ
D
%) = ∗ 100
D
N √?
√ °1
valor numérico del sesgo (°8 − °1 )

°8
b
Valor medio de las medidas realizadas sobre el material de referencia
|°8 − °1 |
VR Valor del material de referencia
b %) = 100 ∗
°1
Los resultados obtenidos son:
MR1 MR2 MR3
(0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
uMR(%) 1,96 0,60 0,99
%)
D
N
√
0,937 0,83 0,54
b (%) 2,92 3,52 3,45
usesgo (%) 3,639 3,66 3,63

Página 99 de 142
Para el cálculo de la incertidumbre combinada estándar:
9/ = :912 6 + 9Âv<wx 6
MR1 MR2 MR3

(0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
uRW (%) 3,739 3,33 2,16
usesgo (%) 3,639 3,66 3,63
jm %) 5,217 4,95 4,23
¹ %) = 2 ∗ 9/ %)
El cálculo de la incertidumbre expandida es:
MR1 MR2 MR3

(0,153 mg/L) (1,250 mg/L) (14,10 mg/L)
Å %) 10,4 9,9 8,5
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ANEXO VI: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE

CONTROL INTERNO
Se estima la incertidumbre de la determinación de sodio por el método de emisión

atómica en agua de consumo humano, siendo el Límite de cuantificación del método de
0,5 mg/L
CASO 1: A PARTIR DE DATOS DE MUESTRA ADICIONADAS
CASO 2: A PARTIR DE DATOS DE PATRON DE CONTROL (sin matriz) Y GRAFICOS DE

DUPLICADOS DE MUESTRAS REALES (solo se estima la componente de reproducibilidad
de la incertidumbre. Para el cálculo de la componente del sesgo se pueden utilizar alguno
de los otros métodos descritos en la guía)
CASO 1: El protocolo de control de calidad del laboratorio tiene establecido que

periódicamente determinará el sodio en una muestra de agua de consumo humano
adicionada con 10 mg/L de sodio. Diez de los resultados obtenidos en el control de
calidad de dicho método a lo largo del año son utilizados en este ejemplo para la
estimación de la componente de incertidumbre.
Debe tenerse en cuenta que el resultado de incertidumbre obtenido con el patrón de

10mg/L puede no ser aplicable a todo el rango de trabajo. En ese caso, deberá repetirse
el proceso a diferentes niveles de concentración.
Todas las componentes de la incertidumbre se han calculado en valor relativo (%)
Para la adición se ha utilizado un patrón de 1000 mg/L de Na. En el certificado

correspondiente al patrón se indica que la concentración es de 1002 con una
incertidumbre expandida de 4.1 mg/L para una k=2.
La adición se realiza usando una micropipeta de 100 µL y adicionando sobre 10 ml de

muestra por lo que la concentración adicionada es
= 9,92 mg/L
, 6× .,
, ,,
Adición=
Se analizó cada una de las muestras antes y después de la adición y se obtuvieron los
resultados de la siguiente tabla
Página 101 de 142

RESULTADO RESULTADO
ADICIÓN RECUPERACIÓN
MUESTRA EXPERIMENTAL SESGO
(mg/L) (mg/L)
(mg/L) (mg/L)
1,70 9,92 11,37 9,67 -0,25
2,81 9,92 12,48 9,67 -0,25
1,07 9,92 11,23 10,16 0,24
3,40 9,92 12,74 9,34 -0,58
0,15 9,92 10,18 10,03 0,11
5,67 9,92 15,24 9,57 -0,35
3,95 9,92 14,21 10,26 0,34
1,81 9,92 10,40 8,59 -1,33
4,92 9,92 14,50 9,58 -0,34
4,89 9,92 14,36 9,47 -0,45
A. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE REPRODUCIBILIDAD (uRW)
Para el cálculo de esta componente se usan los valores de recuperación obtenidos en los
días seleccionados (9,67, 9,67, 10,16, 9,34, 10,03, 9,57, 10,26, 8,59, 9,58, 9,47) se
determina:
!̅ = 9,6 mg/L
∑ !5 − !̅ )6
912 = = 3 = 0,48
12
−1
912
912 %) = × 100 = 5,0%
!̅
B. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DEL SESGO usesgo
Se estima la incertidumbre del sesgo como:
9<v<wx = :| 6
<v<wx + 9>@
6
La incertidumbre del sesgo tiene como componentes:
1. La incertidumbre del sesgo de la recuperación | <v<wx
2. La incertidumbre de la adición realizada 9>@
Página 102 de 142

B.1 COMPONENTE INCERTIDUMBRE DE SESGO DE LA

RECUPERACIÓN (MCsesgo)
∑ 5)
6
| <v<wx =3
>@
Siendo:
>@ el número de muestras adicionadas analizadas
bi: Sesgo de las adiciones realizadas
| =: =0,53
J ,6½)~ Ç J ,6½)~ Ç ,6»)~ Ç J ,½¾)~ Ç ,,,)~ Ç J ,È½)~ Ç ,È»)~Ç J,,ÈÈ)~ Ç J ,È»)~ Ç J ,»½)~
<v<wx ,
| %) = /x?„ >@5„x?>@> !100 = ¼.¼6 !100 = 5,3%

Š/ÉPÉÊË .½È
<v<wx
B.2 COMPONENTE INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR DE LA ADICIÓN

REALIZADA (uad)
9>@ = :9zx{
6
+ 9„x?„
6
Para calcular esta componente, tener en cuenta:
1. La incertidumbre de la concentración adicionada 9„x?„

2. La incertidumbre del volumen añadido 9Nx{
ADICIONADA jˆquˆ
B.2.1 COMPONENTE INCERTIDUMBRE DE LA CONCENTRACIÓN
La solución patrón de sodio utilizada para la adición es de 1002 mg/L con una
incertidumbre expandida (U) de 4,1 mg/L y una k=2. La incertidumbre debida a
la concentración añadida se calcula como:
¹ 4,1
9„x?„ = = = 2,05
Á 2
9„x? 2,05
9„x?„ %) = !100 = !100 = 0,20%
® 1002
Página 103 de 142

Nota: En el ejemplo desarrollado no se realizan diluciones intermedias, en el caso de que

se trabaje con diluciones del patrón, se tendría que tener en cuenta el error máximo del
material de vidrio utilizado y la desviación estándar obtenida de su calibración.
B.2.2 COMPONENTE INCERTIDUMBRE DEL VOLUMEN jÌqÍ
9Nx{ = :9zx{
6
% + 9zx{ Avy
6
Para calcular esta componente se debe tener en cuenta:
1. La incertidumbre sistemática del volumen uVol,b

2. La incertidumbre aleatoria del volumen uVol,rep
B.2.2.1. COMPONENTE INCERTIDUMBRE SISTEMATICA

DEL VOLUMEN u Vol,b
El volumen adicionado es de 100 µL, usando una micropipeta cuyo error

máximo para ese volumen es del 2% (UNE-EN ISO 8655-2:2003)
0,02
9zx{ %, = = = 0,012
Ɛzx{ ¶>À
√3 √3
9zx{ %, %) = 1,2%
El volumen de muestra sobre el que se adiciona es de 10 mL, usando una

pipeta de doble aforo cuyo error máximo para ese volumen es del 0,5%
0,005
9zx{ %6 = = = 0,0029
Ɛzx{ ¶>À
√3 √3
9zx{ %6 %) = 0,3%
Página 104 de 142

B.2.2.2. COMPONENTE INCERTIDUMBRE ALEATORIA DEL

VOLUMEN uVol,rep
Se calcula pesando 10 dispensaciones de 100 µL realizadas con
micropipeta. Los resultados obtenidos son los siguientes:
NUMERO DE MEDIDAS masa (g)

1 0,10000
2 0,10004
3 0,10005
4 0,10010
5 0,10030
6 0,10043
7 0,10001
8 0,10036
9 0,10027
10 0,10030
Siendo:
&
D = 0,10019 (Valor promedio de las masas)
= 1.61509 × 10J »
0,000161509
9zx{ Avy = = = 0,00162
&
D 0,10019
9zx{ Avy %) = 0,16%
La componente aleatoria del volumen correspondiente a la pipeta

(uÎ\Ï EFÐ %) ), material utilizado para medir la muestra, se ha determinado
como la desviación estándar de la pesada de diversas dosificaciones de
10mL en condiciones de repetibilidad, siendo esta.
uÎ\Ï EFÐ %) = 0,17%
A partir de los valores obtenidos, la componente de la incertidumbre

debida al volumen añadido sería:
u Î\Ï %) = :u6Î\Ï W %) + uÎ\Ï

6
EFÐ %) =
u Î\Ï %) = ‡1,26 + 0,166 + 0,36 + 0,176 =1,3%
Página 105 de 142

Nota: La componente de incertidumbre estándar de la adición realizada (uad)

también puede calcularse aplicando Ley de propagación de varianzas. En el
Anexo VII, se da una comparación de la estimación de esta componente pos
ambos métodos.
La incertidumbre asociada a la adición seria:
9>@ %) = :9zx{
6
%) + 9„x?„
6
%) = ‡1,36 + 0,206 = 1,3%
ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE SESGO usesgo
9<v<wx %) = :| 6
<v<wx %) + 9>@
6
%) = ‡5.36 + 1,36 = 5,5%
C. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE COMBINADA

ESTÁNDAR
9„ %) = :912
6
%) + 9<v<wx
6 %) = ‡4,96 + 5,56 = 7,4%
D. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA
¹ %) = Á × 9„ %) = 2 × 7,4 = 15%
Página 106 de 142

CASO 2: El laboratorio realiza el control de calidad del método de sodio usando un

patrón de control de concentración de 35 mg/L preparada en agua sin matriz y
periódicamente determina muestras por duplicado. Los datos obtenidos en este tipo de
control pueden utilizarse para estimar la componente de reproducibilidad de la
incertidumbre. Para el cálculo de la componente del sesgo se podrían utilizar alguno de
los otros métodos anteriormente descritos en la guía.
Todas las componentes de la incertidumbre se han calculado en valor relativo (%)
912 = :91º
6
<=>?@ + 9A,A>?wx
6
RESULTADOS DE QC jlÑ nÒÓuÔ )

A. COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE LOS
Se toman 10 datos del control de calidad, en condiciones de reproducibilidad, de un QC

con un contenido en sodio de35 mg/L obteniéndose los resultados de la siguiente tabla.
Número medidas RESULTADO EXPERIMENTAL (xi)

n (mgNa/L)
1 35,06
2 33,99
3 34,42
4 33,38
5 33,94
6 34,84
7 34,73
8 34,65
9 34,99
10 34,37
!̅ = 34,4mg/L
Se determina:
91º <=>?@ = =:
∑ À} JÀ̅ )~
12 ?J,
=0,53
91º <=>?@ %) = × 100 = 1,5%

ÕÖ×
À̅
Página 107 de 142

GRÁFICO DE RECORRIDO jØ,ØÓupq )

B. COMPONENTE DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE DATOS DE
Datos de un gráfico de recorrido derivado de actividades de control interno, obtenido

con diferentes muestras de agua de consumo.
!̅5 ¬ ¯®yAx¶v@5x
|¬1 − ¬2|
Rango
R1 R2
11,41 11,35 0,06 11,38 0,53

18,56 18,44 0,12 18,50 0,65
14,60 14,51 0,09 14,56 0,62
13,16 13,18 0,02 13,17 0,15
29,24 29,94 0,70 29,59 2,37
41,46 41,35 0,11 41,41 0,27
15,46 15,62 0,16 15,54 1,03
13,42 13,49 0,07 13,46 0,52
48,70 48,77 0,07 48,74 0,14
16,50 16,46 0,04 16,48 0,24
25,67 25,64 0,03 25,66 0,12
30,20 30,02 0,18 30,11 0,60
17,06 16,80 0,26 16,93 1,54
18,93 19,03 0,10 18,98 0,53
40,76 40,70 0,06 40,73 0,15
42,60 42,63 0,03 42,62 0,07
Siendo:
R1, es el resultado del primer análisis de la muestra

R2, es el resultado del segundo análisis de la muestra
Rango, es la diferencia, en valor absoluto, entre el R1 y el R2
¬1 + ¬2)
Valor medio de los duplicados:
!DÙ =
2
¬ ¯® × 100
¬ ¯®yAx¶v@5x %) =
Rango promedio, es:
!DÙ
¬8 =
∑ 1>?wxÚOËÛP€}Ë %),}
? €ÜÚ
= 0,59
9A,A>?wx = @
18
~
Página 108 de 142

Siendo 6 un factor que depende del número de valores a partir del que se ha calculado
el rango. En este caso, el número de valores es 2, por lo que, 6 es 1,128.
0,59
9A,A>?wx %) = = 0,5%
1,128
912 = :91º
6
<=>?@ + 9A,A>?wx
6
912 = ‡1,56 + 0,56 = 1,6%
Página 109 de 142

ANEXO VII: COMPARACIÓN PARA EL CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE

ASOCIADA A LA ADICIÓN
COMPONENTE INCERTIDUMBRE COMPONENTE INCERTIDUMBRE ESTÁNDAR

ESTÁNDAR DE LA CONCENTRACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ADICIONADA (uad)
ADICIONADA (uad) propagación de Varianzas
°5 5 × °5
6 6 6
CONCENTRACIÓN ADICIONADA jˆquˆ 9>@ = 39„x?„ Ý Þ + 9N5
6
Ý Þ + 9N…
5 6
Ý Þ
COMPONENTE INCERTIDUMBRE DE LA
6
°… °… °…6
La solución patrón de sodio utilizada para la La solución patrón de sodio utilizada para la
adición es de 1002 mg/L con una adición es de 1002 mg/L con una incertidumbre
incertidumbre expandida de 4,1 mg/L y una expandida de 4,1 mg/L y una k=2. La
k=2. La incertidumbre debida a la incertidumbre debida a la concentración añadida
¹ 4,1
concentración añadida se calcula como: se calcula como:
9„x?„ = = = 2,05
Á 2 9/x?„ la incertidumbre del material de referencia
Siendo:
9„x? 2,05 ¹ 4,1

9„x?„ %) = !100 = !100 = 0,20% 9„x?„ = = = 2,05
® 1002 Á 2
En el ejemplo desarrollado no se realizan El volumen adicionado es de 100 µL, usando una

diluciones intermedias, en el caso de que se micropipeta cuyo error máximo para ese volumen
trabaje con diluciones del patrón, se tendría es del 2%.
que tener en cuenta el error máximo del El volumen de muestra sobre el que se adiciona
material de vidrio utilizado y la desviación es de 10 mL, usando una pipeta de doble aforo
estándar obtenida de su calibración. cuyo error máximo para ese volumen es del
A. COMPONENTE INCERTIDUMBRE 0,5%.
SISTEMATICA u Vol,b1 Por lo que:
°5 el volumen inicial (0,1 m L= 0.0001L)

°… el volumen de muestra (10,1mL=0.0101 L)
• El volumen adicionado es de 100 µL, usando
una micropipeta cuyo error máximo para ese
9N5 la incertidumbre de la micropipeta

volumen es del 2% (UNE-EN ISO 8655-
Ɛzx{ ¶>À 0,02

2:2003) •
9zx{ %, = = = 0,012
√3 √3
Usando una micropipeta cuyo error
9zx{ %, %) = 1,2%
máximo para ese volumen es del 2%
(Tolerancia 0.02)
9 N} = = =
• El volumen de muestra sobre el que se
N>{xA ?x¶5?>{ ×ßx{vA>?„5> . 6
√È √È
adiciona es de 10 mL, usando una pipeta de
1,2 × 10 Jà
doble aforo cuyo error máximo para ese
Ɛzx{ ¶>À 0,005 9N… la incertidumbre de la pipeta

volumen es del 0,5%
9zx{ %6 = = = 0,0028
•
√3 √3
9zx{ %6 %) = 0,3%
Usando una pipeta de doble aforo cuyo
error máximo para ese volumen es del
0,5% Tolerancia =0.05
° ®¥ ®& × á® ¥ %)
9 NQ =
A.2. COMPONENTE INCERTIDUMBRE
√3
ALEATORIA uVol,rep 1
0,00005
= = 2,88 × 10J½
En el caso de la micropipeta, se calcula
√3
pesando 10 dispensaciones de 100 µL
realizadas con micropipeta.
Los resultados obtenidos son al calibrar la
micropipeta 1
Siendo:
Página 110 de 142
&
D = 0,10019 (Valor promedio de las masas)
= 1.61509 × 10J »
0,000161509
9zx{ Avy = = = 0,00162
&
D 0,10019
9zx{ Avy %) = 0,16%
La componente aleatoria de la pipeta, material
utilizado para medir la muestra, se calcula
pesando 5 dispensaciones de 10 mL realizadas
con la pipeta de doble aforo. Los resultados
obtenidos son de la calibración de las pipetas
de 10 mL de doble aforo.
9zx{ Avy %) = 0,17%

Siendo:
VOLUMEN AÑADIDO jÌqÍ A partir de los

C COMPONENTE INCERTIDUMBRE DEL
valores obtenidos, la componente de la

incertidumbre debida al volumen añadido
sería:
9 zx{ %) = :9zx{
6
% %) + 9zx{
6
Avy %) =
‡1,26 + 0,166 + 0,36 + 0,176 =1,3%
LA INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA LA INCERTIDUMBRE ASOCIADA A LA

ADICIÓN ADICIÓN
9>@ =
jÓÔ = :jtâqÍ + jtˆquˆ , 6 6
: 2.05)6 æ ç + 1,2 × 10Jà )6 æ ç + 2,88
%) %) %) , , 6
= ‡ã, ät + å, tåt = ã, ä%
, , , , , ,
=0,13
å. ãä × ãåå
jÓÔ %) = = ã, ä%
è, èt
Página 111 de 142

ANEXO VIII: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE A PARTIR DE DATOS

DE EJERCICIOS DE INTERCOMPARACIÓN
Se estima la incertidumbre de la determinación de DQO por el método volumétrico con

dicromato potásico en agua residual, utilizando los resultados obtenidos en ejercicios de
interlaboratorio entre los años 2007 y 2013,
La sospecha de la existencia de diferentes incertidumbres dentro del rango de trabajo y

el hecho de que realizar el cálculo conjunto pueda penalizar en exceso los valores altos
de DQO, ha propiciado el estudio por separado de dos rangos.: 50 mg/L y 500 mg/L.
CASO 1: ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE PARA RANGO 1 (50 mg

O2/L)
Para el cálculo de esta componente se han tomado los resultados de DQO de 7 ejercicios
de interlaboratorio de agua residual, con valores de DQO comprendidos entre 40 y 100
mg O2/L.
bi,(%)
Valor b
Valor consenso sesgo SRW,i,rel ucref,i,rel
laboratorio sesgo np,i
mg O2/L (%) % %
mg O2/L mg O2/L
84,0 71,0 -13,0 -15,5 16,3 103 2,01
44,0 48,0 4,00 9,09 4,32 111 0,51
95,0 99,7 4,70 4,95 9,68 120 1,11
73,0 78,7 5,70 7,81 8,49 145 0,88
35,0 40,0 5,00 14,3 17,1 123 1,93
56,0 56,7 0,70 1,25 13,1 154 1,32
78,2 85,0 6,82 8,72 17,5 117 2,03
A. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE REPRODUCIBILIDAD (uR)
Para el cálculo de esta componente se usan los valores de recuperación obtenidos

(bi,(%)) se determina:
!̅ = 4,38%
Página 112 de 142

912 %) = =:
∑ À} JÀ̅ )~
12 ?J,
=9,6 %
B. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE SESGO (usesgo)
de interlaboratorio de agua residual, con valores de DQO comprendidos entre 40 y 100
mg O2/L
uZFZ[\ = :MCZFZ[\ + –98„Av… —

6
6
1. La incertidumbre del sesgo de la recuperación MCsesgo
2. La incertidumbre del valor asignado 98„Av…
B.1. COMPONENTE INCERTIDUMBRE DE SESGO DE LA
∑
%))6
| %) = 3
5
<v<wx
†5?=
Donde:
b` sesgo individual para cada uno de los ejercicios de intercomparación, es

decir, diferencia relativa entre el valor asignado y el obtenido por el laboratorio.
Nint el número de ejercicios interlaboratorio
−15,5)6 + 9,09)6 + 4,95)6 + 7,81)6 + 14,3)6 + 1,25)6 + 8,72)6

| %) = 3 ;
<v<wx
7
| <v<wx %) = 9,92%
Página 113 de 142

B.2. COMPONENTE INCERTIDUMBRE DEL VALOR CONSENSO

(ucref)
El organizador informa que el valor consenso se ha calculado mediante el uso de

la media robusta, en ese caso, la incertidumbre del valor consenso se calcula
%)
9„Av… 5 %) = 1,25 ×
1,5,
‡ y,5
Siendo y,5 el número de participantes de cada ejerciciointerlaboratorio.
La incertidumbre del valor consenso correspondiente a cada ejercicio

interlaboratorio (9„Av… 5 %) se indica en la tabla 1.
La media de los valores de la incertidumbre de los valores consenso vendrá dada

por la siguiente fórmula:
∑ 9„Av… 5 %)
98„Av… %) =
†5?=
98„Av… %) = = 1,40 %
6, ,Ç ,½,Ç,,,,Ç ,¾¾Ç,,¼ÈÇ,,È6Ç6, È
ê
9<v<wx %) = :MCZFZ[\
6
6 %) + æ98„Av… %)ç = ‡9.926 + 1,406 ;
9<v<wx %) = 10,0%
C. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE COMBINADA ESTÁNDAR
9„ %) = :912
6
%) + 9<v<wx
6 %) = ‡9,66 + 10,06 = 13,9%
D. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA PARA RANGO 1
¹ %) = Á × 9„ %) = 2 × 13,8 = 28 %
Página 114 de 142

CASO 2: ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE PARA RANGO 2 (500 mg

O2/L)
interlaboratorio de agua residual, con valores de DQO comprendidos entre 300 y 700
mg O2/L
bi,(%)
b
Valor consenso Valor laboratorio sesgo SRW,i,rel ucref,i,rel
sesgo np,i
mg O2/L mg O2/L (%) % %
mg O2/L
334 326 -8,00 -2,40 12,0 103 1,48

668 637 -31,0 -4,64 6,29 111 0,75
489 469 -20,0 -4,09 10,0 120 1,14
472 421 -51,0 -10,8 10,9 145 1,13
350 353 3,00 0,86 8,45 123 0,95
614 593 -21,0 -3,42 6,66 154 0,67
588 533 -55,0 -9,35 7,13 117 0,82
A. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE REPRODUCIBILIDAD (uRW)
Para el cálculo de esta componente se usan los valores de recuperación obtenidos

(bi,(%)) se determina :
!̅ = −4,83 %
912 %) = =:
∑ À} JÀ̅ )~
12 ?J,
= 4,0 %
B. ESTIMACIÓN DE LA COMPONENTE DE SESGO (usesgo)
uZFZ[\ = :MCZFZ[\ + –98„Av… —

6
6
1. La incertidumbre del sesgo de la recuperación MCsesgo

2. La incertidumbre del valor asignado ucref
Página 115 de 142

B.1. COMPONENTE INCERTIDUMBRE DE SESGO DE LA

∑ %))6
| %) = 3
5
<v<wx
†5?=
Donde:
b` sesgo individual para cada uno de los ejercicios de intercomparación, es

decir, diferencia relativa entre el valor asignado y el obtenido por el laboratorio.
Nint el número de ejercicios interlaboratorio
−2,40)6 + −4,64)6 + −4,09)6 + −10,8)6 + −0,86)6 + −3,42)6 + −9,35)6

| %) = 3
<v<wx
7
| <v<wx %) = 6,10%
B.2. COMPONENTE INCERTIDUMBRE DEL VALOR CONSENSO

(ucref)
El organizador informa que el valor consenso se ha calculado mediante el uso de

la media robusta, en ese caso, la incertidumbre del valor consenso se calcula
%)
9„Av… 5 %) = 1,25 ×
1,5,
‡ y,5
Siendo y,5 el número de participantes de cada ejercicio interlaboratorio.
La incertidumbre del valor consenso correspondiente a cada ejercicio

interlaboratorio (9„Av… 5 ) se indica en la tabla 2.
La media de los valores de la incertidumbre de los valores consenso vendrá dada

por la siguiente fórmula:
∑ 9„Av… 5 %)
98„Av… %) =
†5?=
Página 116 de 142

98„Av… %) = = 0,99 %
,,»¾Ç ,ê½Ç,,,»Ç,,,ÈÇ ,¼½Ç ,àêÇ ,¾6
ê
9<v<wx %) = :MCZFZ[\ %) + –98„Av… %)— = ‡6,106 + 0,996 = 6,2%

6
6
C. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE COMBINADA ESTÁNDAR
9„ %) = :912
6
%) + 9<v<wx
6 %) = ‡4,06 + 6,2 = 7,4%
D. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA PARA RANGO 2
¹ %) = Á × 9„ %) = 2 × 7,4 = 15%
Página 117 de 142

ANEXO IX: OBTENCIÓN DEL VALOR DE REFERENCIA EN MÉTODOS

MICROBIOLÓGICOS CUANTITATIVOS
Una titulación es la obtención del número de ufc que se encuentran en un volumen

determinado. Para ello, a partir de un volumen inicial inoculado se realizan diluciones
seriadas hasta llegar a una dilución en la que se pueda realizar un recuento.
Procedimiento
Se realiza una batería de diluciones seriadas (1/10) a partir de un tubo inoculado con la
cepa de interés:
Con la ayuda de un asa de siembra se recogen algunas colonias del crecimiento de la

cepa, crecida en placa o tubo inclinado, y se siembra en tubo con diluyente. A partir de
este tubo se realizan diluciones seriadas (1/10) (9mL diluyente +1mL inoculado), que
suelen hacerse llegar hasta 10-6/10-8ufc/mL.
NOTA: Si el laboratorio utiliza escala de Mc Farland para preparar banco

diluciones también puede utilizarse esta metodología para llegar a una dilución
en la que pueda realizarse el recuento.
Los diluyentes que se suelen utilizar son: Solución salina 0,85%, Solución Ringer ¼,
Agua de peptona Salina.
De los tubos más diluidos se siembra un inóculo de 0,1mL. Este volumen se siembra
sobre las placas con asa de Drigalsky. Los medios adecuados son medios no selectivos
(TSA, BHI, Agar nutritivo…) Se realiza una siembra por triplicado como mínimo. Se
incuban a la temperatura y tiempos adecuados a la cepa (y en anaerobiosis en el caso
de microrganismos anaerobios).
Se realizan los recuentos de las placas siguiendo las indicaciones de la Norma UNE-EN
ISO 8199.
Posibles cálculos y criterios aceptación de resultados.
1. COEFICIENTE VARIACIÓN VS 1,2 RSD POISSON

2. INDICE DE DISPERSIÓN DE POISSON
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1.COEFICIENTE VARIACIÓN
Los resultados obtenidos en el triplicado se considerarán válidos siempre que el CV (%)

sea inferior o igual a (1,20·RSD Poisson).
°= !100 ¬ = ! 100
Â€ ,
/̅ √/
Siendo:
CV Coeficiente de Variación
Sd Desviación estándar de los tres recuentos
̅ Media de los tres recuentos.
RSD Poisson
Si CV(%) < 1,20 x RSD Poisson, entonces la titulación final del tubo inoculado inicial se
obtendrá multiplicando el resultado obtenido en la dilución (donde se ha realizado el
recuento) por el factor de dilución.
Ejemplo:
De un tubo inicial contaminado se realizan diluciones 1/10 llegándose a la dilución 10-8.

Se siembran, por triplicado tres placas de BHI con 0,1mL de las tres últimas diluciones,
obteniéndose los siguientes resultados:
Dilución 10-8: 3ufc/0,1mL; 5ufc/0,1mL; 8ufc/0,1mL
Dilución 10-6: >200ufc/0,1mL; >200ufc/0,1mL; >200ufc/0,1mL
Calculo y aplicación criterio:
C8= 39
Sd= 5,57
CV = 14,28
RSD = 16,01
1,2 · RSD = 19,22
Los resultados del triplicado se aceptan ya que CV ≤ 1,20·RSD.
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Recuento:
3,9x102 ufc/mL en la dilución 10-7
El resultado de la titulación será 3,9x109 ufc/mL en el tubo inicial.
2.INDICE DE DISPERSIÓN DE POISSON
Se calcula el índice de dispersión de Poisson para n grados libertad y una probabilidad

de 0,05 y se contrasta el valor resultante frente al valor chi-cuadrado tabulado
¥∑ 6
− î 5 )6 ¥∑ 6
íAJ, = = −î
6 5 5
î 5 î 5
5
Siendo:
í6 valor Chi cuadrado observado
r número de grados de libertad (3 en caso de triplicado)
n es la observación iésima
Ejemplo:
De un tubo inicial contaminado se realizan diluciones 1/10 llegándose a la dilución 10-8.

Se siembran, por triplicado tres placas de BHI con 0,1mL de las tres últimas diluciones,
obteniéndose los siguientes resultados:
Dilución 10-6: >200ufc/0,1mL; >200ufc/0,1mL; >200ufc/0,1mL
Calculo y aplicación criterio:
888888
í2 = 1,59
¥−1
ï 0.05,3) = 5,99
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Donde ï 0.05,3) es =5,99 y que es el valor chi cuadrado tabulado, para una probabilidad
de 0,05 y (3-1) grados de libertad. Este valor puede encontrarse en las tablas
estadísticas de chi cuadrado.
Los resultados del triplicado se aceptan ya que íAJ,

6
≤ï 0.05,3) y significa que no hay
sobredispersión.
Recuento:
3,9x102 ufc/mL en la dilución 10-7
El resultado de la titulación será 3,9x109 ufc/mL en el tubo inicial.
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ANEXO X: CÁLCULO DE LA SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, TASA DE

FALSOS POSITIVOS, TASA DE FALSOS NEGATIVOS, SELECTIVIDAD Y
EFICIENCIA
Verificación del método UNE-EN ISO 9308-1. Recuento de Escherichia coli y de

bacterias coliformes. Parte 1: Método de filtración por membrana para aguas con
bajo contenido de microbiota.
Se preparan 5 muestras de agua de consumo contaminadas con agua continental

o agua residual. Se procesan según el método y se confirman las colonias
presuntivas mediante la prueba de la oxidasa, tal como indica la norma.
Se aíslan colonias típicas y no típicas de cada una de las muestras, un mínimo de

30 colonias en total.
Nota: Para estudiar la selectividad del método, se estudian TODAS las colonias
que se aíslan en una muestra o bien de forma aleatoria, pero manteniendo la
proporción entre el número de colonias típicas y no típicas obtenidas.
Sobre las colonias aisladas se realizan ensayos confirmativos adicionales, por

ejemplo, el estudio de las enzimas β-D-galactosidasa y de la β-D-glucuronidasa
mediante kits comerciales, etc. Se clasifican los resultados encontrados en alguno
de estos tipos:
Bacterias coliformes (colonias rosas y azules oxidasa negativa):
A: Número de colonias asignadas por el método como bacterias coliformes cuya

identidad es corroborada por el ensayo de identificación adicional. Verdaderos
positivos.
B: Número de colonias NO asignadas por el método como bacterias coliformes,

que si son asignadas como Bacterias coliformes por el ensayo de identificación
adicional. Falsos negativos.
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C: Número de colonias asignadas por el método como bacterias coliformes, cuya

identidad NO es corroborada por el ensayo de identificación adicional. Falsos
positivos.
D: Número de colonias NO asignadas por el método como bacterias coliformes,

cuya identidad NO es corroborada por el ensayo de identificación adicional.
Verdaderos negativos.
Ejemplo para cada una de las opciones:
Resultado UNE-EN ISO 9308-1 Resultado API Interpretación

Colonia rosa oxidasa negativa
Enterobacter cloacae A (verdadero positivo)
(bacteria coliforme)
Colonia blanca
Citrobacter B (falso negativo)
(flora acompañante)
Colonia rosa oxidasa negativa
Serratia marcences C (falso positivo)
(bacteria coliforme)
Colonia blanca
Serratia plymuthica D (verdadero negativo)
(flora acompañante)
Una vez estudiadas todas las colonias se obtienen:
Nº de
Interpretación
colonias
A (verdadero positivo) 16
B (falso negativo) 2
C (falso positivo) 1
D (verdadero negativo) 13
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Cálculos:
METODO
+ -
+ 16 1 A+B
REFERENCIA
- 1 13 C+D
A+C B+D N
Sensibilidad = A/(A+B)*100, es decir la fracción del total de las positivas

correctamente asignadas por el método.
Sensibilidad= 16/18 = 89%
Especificidad = D/(C+D)*100, es decir la fracción del total de las negativas

correctamente asignadas por el método.
Especificidad= 13/14 = 93%
Falsos positivos = C/(A+C)*100, es decir la fracción de positivas asignadas por

el método erróneamente.
Falsos positivos= 1/17 =6%
Falsos negativos = B/(B+D)*100, es decir la fracción de negativas asignadas por

el método erróneamente.
Falsos negativos = 1/14 = 7%
Eficiencia = (A+D)/N*100, es decir la fracción de resultados asignados

correctamente por el método.
Eficiencia = 29/31 = 94%
De la misma forma se harían los cálculos para E. coli (colonias azules)
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ANEXO XI: VERIFICACIÓN DE LA REPETIBILIDAD SEGÚN INDICE DE

DISPERSIÓN DE POISSON
Verificación del método UNE-EN ISO 7899-2. Detección y recuento de

enterococos intestinales. Parte 2: Método de filtración por membrana.
Se procesan 3 muestras de agua de consumo contaminada con agua continental,

de manera que posean diferentes niveles de contaminación, dentro del rango de
recuento válido de la placa. Cada una de ellas se repite 5 veces en las condiciones
de repetibilidad (misma analista, mismo lote de medio de cultivo, misma estufa,
etc.).
Los resultados obtenidos son los siguientes:
Rto 1 Rto 2 Rto 3 Rto 4 Rto 5 Media

Muestra
(ufc) (ufc) (ufc) (ufc) (ufc) aritmética
MC1 14 9 7 12 10 10
MC2 49 57 51 54 58 54
MC3 86 87 78 78 80 82
De las dos opciones posibles para la interpretación de resultados se decide utilizar

el Índice de Dispersión de Poisson, para comprobar que la variabilidad de los
datos es debida a la distribución intrínseca de los microrganismos, y que no hay
sobredispersión. Para cada serie se calcula el valor de X2r-1 según la fórmula:
¥∑ 6
− ∑ 5)
6
¥∑ 6
¤AJ, = = − ¦
6 5 5
∑ 5 ∑ 5
5
Muestra Valor observado de X2r-1
MC1 2,808
MC2 1,093
MC3 0,939
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Para la serie 1:
X2r-1 = (5*(142+92+72+122102)/14+9+7+12+10)-(14+9+7+12+10)=2,808
El valor crítico de probabilidad de 0,05 para (5-1) grados de libertad es: 9,477.
Siendo 5 el número de repeticiones de cada muestra.
En las tres series se comprueba que no hay sobredispersión, ya que el valor

obtenido es inferior al teórico, 2,808 < 9,477.
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ANEXO XII: CÁLCULO DE LA REPRODUCIBILIDAD SEGÚN LA UNE-EN ISO

19036
Reproducibilidad del método UNE-EN ISO 9308-1. Recuento de Escherichia coli y

de bacterias coliformes. Parte 1: Método de filtración por membrana para aguas
con bajo contenido de microbiota.
El laboratorio dispone de 3 analistas cualificados para realizar este ensayo

(analista A, B y C), dos estufas calibradas a la temperatura de uso (E1 y E2) y
tres rampas de filtración (R1, R2 y R3).
Se procesan 10 muestras de agua de consumo contaminadas con agua

continental o con agua residual, de forma que se cubra todo el rango de recuento
válido en placa (10-80 ufc). Se realiza en días distintos y cada día se hacen dos
repeticiones en distintas condiciones de medición, por ejemplo:
-Analista: cada día participan dos analistas distintos, tanto en la etapa de

procesamiento de la muestra como en la de realización de los recuentos.
-Equipos: cada día se utilizan las dos estufas disponibles y rampas de filtración
distintas. Dentro de la estufa se varía la posición en la que se colocan las placas
de medio de cultivo.
-Lote del medio de cultivo utilizado: cada día se utilizan dos lotes distintos del
medio de cultivo específico de este método, siempre que sea posible.
-Lote de los fungibles empleados: cada día se utilizan dos lotes distintos de la
membrana de filtración y embudo, siempre que sea posible.
-Tiempo de incubación: las placas se incubarán un número diferente de horas

dentro de la tolerancia del método (21 a 24 h).
Se puede elaborar un cuadro como este que recoge estos parámetros para cada
una de las 10 muestras:
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Analista Estufa, Lote Lote fungibles TIEMPO de

Fecha/muestra Muestra
FM/recuento rampa CCA membrana/embudo INCUBACIÓN
13/01/19 MC1-1 A/B E1, R1 CCA34 F8NA26E/F9DA99E 22 h
MC1
MC1-2 B/C E2, R2 CCA35 F7NA69S/F9HA88D 21 h
20/01/19 MC2-1 C/B E1, R3 CCA34 F8NA26E/F9DA99E 24 h
MC1
MC2-2 A/B E2, R1 CCA35 F7NA69S/F9HA88D 21 h
27/01/19 MC3-1 B/C E1, R2 CCA35 F7NA69S/F9DA99E 22 h
MC1
MC3-2 C/A E2, R3 CCA36 F8NA26E/F9HA88D 23 h
13/01/19 MC4-1 A/B E1, R3 CCA35 F7NA69S/F9DA99E 22,5 h
MC1
MC4-2 B/C E2, R2 CCA36 F8NA26E/F9HA88D 21 h
03/02/19 MC5-1 C/A E1, R2 CCA36 F7NA69S/F9DA99E 24 h
MC1
MC5-2 A/B E2, R1 CCA37 F8NA26E/F9HA88D 23,5 h
10/02/19 MC6-1 B/C E1, R3 CCA37 F7NA69S/F9DA99E 21 h
MC1
17/02/19 MC7-1 A/B E1, R1 CCA37 F8NA26E/F9DA99E 23,5 h
MC1
MC7-2 B/C E2, R2 CCA38 F7NA69S/F9HA88D 21,5 h
24/02/19 MC8-1 C/A E1, R3 CCA39 F7NA69S/F9DA99E 23 h
MC1
MC8-2 A/B E2, R1 CCA40 F8NA26E/F9HA88D 22 h
09/03/19 MC9-1 B/B E1, R2 CCA41 F7NA69S/F9DA99E 24 h
MC1
23/03/19 MC10-1 A/B E1, R3 CCA41 F8NA26E/F9DA99E 22 h
MC1
MC10-2 B/C E2, R2 CCA41 F7NA69S/F9HA88D 23 h
Se obtienen los siguientes resultados:
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Rdo 1 Rdo 2
Muestra
(ufc) (ufc)
MC1 38 49
MC2 53 49
MC3 46 57
MC4 31 23
MC5 43 35
MC6 76 80
MC7 54 45
MC8 33 43
MC9 64 62
MC10 45 53
• Cálculos según la norma ISO 19036:
yiA: es el dato en logaritmo de la réplica A.
yiB: es el dato en logaritmo de la réplica B.
i= número de muestras.
n= número de experimentos (≥10).
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Rdo 1 Rdo 2 (yiA-yiB)2

Muestra Rdo 1 (ufc) Rdo 2 (ufc)
(log) (log) 2
MC1 38 49 1,58 1,69 0,0061
MC2 53 49 1,72 1,69 0,0006
MC3 46 57 1,66 1,76 0,0043
MC4 31 23 1,49 1,36 0,0084
MC5 43 35 1,63 1,54 0,0040
MC6 76 80 1,88 1,90 0,0002
MC7 54 45 1,73 1,65 0,0031
MC8 33 43 1,52 1,63 0,0066
MC9 64 62 1,81 1,79 0,0001
MC10 45 53 1,65 1,72 0,0025
Se obtiene SRW = 0,06 (log). Teniendo en cuenta los datos recogidos en la guía,
apartado 4.4.2, donde se indica un valor de SRW inferior o igual a 0,20, se
considera correcto el resultado obtenido.
La variabilidad obtenida es similar a lo largo de todo el rango de trabajo. Si no

fuera así, se debería separar en función del recuento obtenido.
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ANEXO XIII: VERIFICACIÓN DE LA TASA DE RECUPERACIÓN RELATIVA

CUANDO LA NORMA INCLUYE CRITERIOS
Verificación del método UNE-EN ISO 9308-1. Recuento de Escherichia coli y de

bacterias coliformes. Parte 1: Método de filtración por membrana para aguas con
bajo contenido de microbiota.
Criterio a cumplir: Las características de funcionamiento están recogidas en el

Anexo C de la norma. Los estudios completos se encuentran publicados en
Performance validation of chromogenic coliform agar for the enumeration of
Escherichia coli and coliform bacteria (Letters in Applied Microbiology 57, 547-
553) y son los siguientes:
Recuperación: >80% para E. coli y >70% para bacterias coliformes.
En el estudio recogido en la norma, los datos de recuperación se han realizado

frente a medio no selectivo TSA y proceden de 10 ensayos realizados en
diferentes días y en cada ensayo han realizado 10 repeticiones en CCA y en TSA.
Para cada ensayo se calcula el porcentaje de recuperación como media de las 10
repeticiones. Ninguna de las medias obtenidas es inferior a esos porcentajes
indicados.
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Ensayos a realizar en el laboratorio:
Escherichia coli:
Material de referencia: Se utiliza E. coli WDCM 00013 ó WDCM 00012. Se

preparan inóculos a distintos niveles, siempre dentro del rango de recuento
válido.
Se realizan 3 experimentos en días diferentes. Cada día se realizan 3 repeticiones,

por el mismo analista, tanto por filtración por membrana en CCA como por
diseminación en superficie en medio no selectivo.
Se obtienen los siguientes resultados para Escherichia coli:
Recuento en Recuento en
Recuperación
Fecha Analista CCA TSA
relativa
(ufc) (ufc)
A 24 26
04/11/19 A 26 28
A 19 18
95,8%
B 40 38
11/11/19 B 47 42
B 53 43
108,5%
C 69 69
18/11/19 C 75 65
C 67 78
99,5%
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Los 3 resultados son > 80%, por lo que se considera APTO.
Se obtienen los siguientes resultados para bacterias coliformes:
Fecha Placa Recuento en Recuento en Recuperación

CCA TSA relativa
1 20 20
04/11/19 2 30 36
3 24 38
78,7%
1 39 58
11/11/19 2 47 60
3 49 58
73,3%
1 66 70
18/11/19 2 58 84
3 66 82
80,5%
Los 3 resultados son > 70%, por lo que se considera APTO. Los resultados sirven
para calcular los límites de control de calidad de recuperación, posteriormente se
pueden ajustar cuando se disponga de un mayor número de datos.
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ANEXO XIV: CÁLCULO DE LA TASA DE RECUPERACIÓN RELATIVA

CUANDO LA NORMA NO INCLUYE CRITERIOS
Verificación del método UNE-EN ISO 7899-2. Detección y recuento de

enterococos intestinales. Parte 2: Método de filtración por membrana.
Criterio a cumplir: se pueden considerar como valores guía, los indicados en la

norma ISO 11133.
Se realizan 10 experimentos en días diferentes. Cada día se inocula una muestra

de agua de consumo negativa, con un número conocido de ufc/100 ml y en
paralelo se siembran 5 placas (para poder quitar datos aberrantes) en TSA por
diseminación en superficie, para obtener el valor de referencia. Cada día hay que
verificar la homogeneidad de la suspensión empleada.
Se debe cubrir todo el rango de recuento en placa válido (10-80 ufc).
Una vez validado el valor de referencia, se estudia la recuperación obtenida en

cada experimento:
Recuento en Recuento en Log VR-logVM

Fecha Rec (%)
TSA (VR) SB (VM) (log)
01/03/20 20 18 -0,0458 90
15/03/20 37 41 0,0446 111
04/04/20 61 57 -0,0295 93
12/05/20 57 54 -0,0235 95
28/05/20 75 72 -0,0177 96
01/06/20 83 76 -0,0383 92
15/06/20 22 18 -0,0872 82
21/07/20 65 57 -0,0570 88
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28/07/20 65 58 -0,0495 89
31/07/20 48 49 0,0090 102
La recuperación media es 93% por lo que se considera APTO.
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ANEXO XV: EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE EN ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS
EJEMPLO 1:
Se utilizan los valores del ejemplo incluido en la UNE-EN ISO 13843 para calcular la incertidumbre según las otras dos normas.
En el ejemplo de la UNE-EN ISO 13843 se obtiene una incertidumbre de 27,8%, calculada según la ISO 29201 se obtiene 29,5% y según
la UNE-EN ISO 19036 el 29%. En este caso, si no se utiliza el concepto de “corrección” de la reproducibilidad según la variabilidad
intrínseca de Poisson de los experimentos de validación, la incertidumbre subiría a 35,2%, ya que son valores bastante bajos.
UNE-EN ISO 19036 SIN
VALORES UNE-EN ISO 19036 CON CORRECCIÓN ISO 29201 UNE-EN ISO 13843
CORRECCION
2
u 2 Media Varianza
u Poisson u Poisson u Poisson Variabilidad Variabilidad Varianza
nc1 nc2 lg nc1 lg nc2 Poisson SR2 i lg nc1 lg nc2 SR2 i u 2 método Aritmética operativa
nc1 nc2 nc2 operacional intrínseca (ufc)
nc1 (ufc) relativa
34 23 1,5315 1,3617 0,0745 0,0906 0,0055 0,0082 0,0144 1,5315 1,3617 0,0144 0,0144 0,0066 0,0078 28,5 60,5 0,0394
17 15 1,2304 1,1761 0,1053 0,1121 0,0111 0,0126 0,0015 1,2304 1,1761 0,0015 0,0015 0,0118 -0,0103 16 2 -0,0547
11 27 1,0414 1,4314 0,1309 0,0836 0,0171 0,0070 0,0760 1,0414 1,4314 0,0760 0,0760 0,0099 0,0661 19 128 0,3019
40 21 1,6021 1,3222 0,0687 0,0948 0,0047 0,0090 0,0392 1,6021 1,3222 0,0392 0,0392 0,0062 0,0330 30,5 180,5 0,1612
42 25 1,6232 1,3979 0,0670 0,0869 0,0045 0,0075 0,0254 1,6232 1,3979 0,0254 0,0254 0,0056 0,0198 33,5 144,5 0,0989
43 38 1,6335 1,5798 0,0662 0,0705 0,0044 0,0050 0,0014 1,6335 1,5798 0,0014 0,0014 0,0047 -0,0032 40,5 12,5 -0,0171
25 12 1,3979 1,0792 0,0869 0,1254 0,0075 0,0157 0,0508 1,3979 1,0792 0,0508 0,0508 0,0102 0,0406 18,5 84,5 0,1928
34 28 1,5315 1,4472 0,0745 0,0821 0,0055 0,0067 0,0036 1,5315 1,4472 0,0036 0,0036 0,0061 -0,0025 31 18 -0,0135
58 39 1,7634 1,5911 0,0570 0,0695 0,0033 0,0048 0,0149 1,7634 1,5911 0,0149 0,0149 0,0039 0,0110 48,5 180,5 0,0561
37 48 1,5682 1,6812 0,0714 0,0627 0,0051 0,0039 0,0064 1,5682 1,6812 0,0064 0,0064 0,0044 0,0020 42,5 60,5 0,0100
2
u Poisson media 0,0075
2
SR media 0,0234
2
SR media 0,0234 u2 mét media 0,0164
2
u media 0,0775
2
SR corregida 0,0159
SR corregida 0,1260 (log) SR 0,1528 (log) u mét 0,1281 (log) u media 0,278
29,03 (%) 35,2 (%) 29,5 (%) 27,8 (%)
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EJEMPLO 2
Se utilizan los valores del ejemplo incluido en la ISO 29201 para calcular la incertidumbre según las otras dos normas.
En el ejemplo de la ISO 29201 se obtiene una incertidumbre de 21,4%, calculada según la UNE-EN ISO 13843 se obtiene 20,3% y según
la UNE-EN ISO 19036 20,6%. En este caso, si no se utiliza el concepto de “corrección” de la reproducibilidad según la variabilidad
intrínseca de Poisson de los experimentos de validación, la incertidumbre subiría a 32,4%, ya que también son valores bastante bajos.

CORRECCION
2
u 2 Media Varianza
nc1 nc2 lg nc1 lg nc2 Poisson SR2 i lg nc1 lg nc2 SR2 i u2 método Aritmética operativa
nc1 (ufc) relativa
5 8 0,6990 0,9031 0,1942 0,1535 0,0377 0,0236 0,0208 0,6990 0,9031 0,0208 0,0208 0,0290 -0,0082 6,5 4,5 -0,0473
15 11 1,1761 1,0414 0,1121 0,1309 0,0126 0,0171 0,0091 1,1761 1,0414 0,0091 0,0091 0,0145 -0,0054 13 8 -0,0296
11 19 1,0414 1,2788 0,1309 0,0996 0,0171 0,0099 0,0282 1,0414 1,2788 0,0282 0,0282 0,0126 0,0156 15 32 0,0756
21 39 1,3222 1,5911 0,0948 0,0695 0,0090 0,0048 0,0361 1,3222 1,5911 0,0361 0,0361 0,0063 0,0299 30 162 0,1467
68 45 1,8325 1,6532 0,0527 0,0647 0,0028 0,0042 0,0161 1,8325 1,6532 0,0161 0,0161 0,0033 0,0127 56,5 264,5 0,0652
151 203 2,1790 2,3075 0,0353 0,0305 0,0012 0,0009 0,0083 2,1790 2,3075 0,0083 0,0083 0,0011 0,0072 177 1352 0,0375
2
2
SR media 0,0198
2
2
u media 0,0413
2
SR corregida 0,0080
20,60 (%) 32,4 (%) 21,4 (%) 20,3 (%)
Página 137 de 142

EJEMPLO 3
Se incluye este ejemplo con valores más altos que los anteriores para comparar los resultados obtenidos con las 3 normas.
Con la ISO 29201 se obtiene una incertidumbre de 18,7%, estimada según la UNE-EN ISO 13843 se obtiene 18,5% y según la UNE-EN
ISO 19036 18,7%. En este caso, apenas influye la variabilidad intrínseca de Poisson de los experimentos de validación.

CORRECCION
2
u 2 Media Varianza
nc1 (ufc) relativa
280 230 2,4472 2,3617 0,0260 0,0286 0,0007 0,0008 0,0036 2,4472 2,3617 0,0036 0,0036 0,0007 0,0029 255 1250 0,0153
170 150 2,2304 2,1761 0,0333 0,0355 0,0011 0,0013 0,0015 2,2304 2,1761 0,0015 0,0015 0,0012 0,0003 160 200 0,0016
120 180 2,0792 2,2553 0,0396 0,0324 0,0016 0,0010 0,0155 2,0792 2,2553 0,0155 0,0155 0,0013 0,0142 150 1800 0,0733
290 210 2,4624 2,3222 0,0255 0,0300 0,0007 0,0009 0,0098 2,4624 2,3222 0,0098 0,0098 0,0008 0,0091 250 3200 0,0472
240 290 2,3802 2,4624 0,0280 0,0255 0,0008 0,0007 0,0034 2,3802 2,4624 0,0034 0,0034 0,0007 0,0027 265 1250 0,0140
310 250 2,4914 2,3979 0,0247 0,0275 0,0006 0,0008 0,0044 2,4914 2,3979 0,0044 0,0044 0,0007 0,0037 280 1800 0,0194
250 180 2,3979 2,2553 0,0275 0,0324 0,0008 0,0010 0,0102 2,3979 2,2553 0,0102 0,0102 0,0009 0,0093 215 2450 0,0484
340 280 2,5315 2,4472 0,0236 0,0260 0,0006 0,0007 0,0036 2,5315 2,4472 0,0036 0,0036 0,0006 0,0029 310 1800 0,0155
220 280 2,3424 2,4472 0,0293 0,0260 0,0009 0,0007 0,0055 2,3424 2,4472 0,0055 0,0055 0,0008 0,0047 250 1800 0,0248
190 290 2,2788 2,4624 0,0315 0,0255 0,0010 0,0007 0,0169 2,2788 2,4624 0,0169 0,0169 0,0008 0,0161 240 5000 0,0826
2
2
SR media 0,0074
2
2
u media 0,0342
2
SR corregida 0,0066
18,68 (%) 19,8 (%) 18,7 (%) 18,5 (%)
Página 138 de 142

EJEMPLO 4
Ejemplo con valores cubriendo el rango de trabajo 10-80 ufc.

CORRECCION
Media Varianza
u Poisson u Poisson u2 Poisson 2
u Poisson Variabilidad Variabilidad Varianza
nc1 nc2 lg nc1 lg nc2 SR2 i lg nc1 lg nc2 SR2 i u2 método Aritmética operativa
nc1 nc2 nc1 nc2 operacional intrínseca (ufc)
(ufc) relativa
50 60 1,6990 1,7782 0,0614 0,0561 0,0038 0,0031 0,0031 1,6990 1,7782 0,0031 0,0031 0,0034 -0,0003 55 50 -0,0017
15 23 1,1761 1,3617 0,1121 0,0906 0,0126 0,0082 0,0172 1,1761 1,3617 0,0172 0,0172 0,0099 0,0073 19 32 0,0360
55 62 1,7404 1,7924 0,0586 0,0552 0,0034 0,0030 0,0014 1,7404 1,7924 0,0014 0,0014 0,0032 -0,0019 58,5 24,5 -0,0099
25 36 1,3979 1,5563 0,0869 0,0724 0,0075 0,0052 0,0125 1,3979 1,5563 0,0125 0,0125 0,0062 0,0064 30,5 60,5 0,0322
68 45 1,8325 1,6532 0,0527 0,0647 0,0028 0,0042 0,0161 1,8325 1,6532 0,0161 0,0161 0,0033 0,0127 56,5 264,5 0,0652
80 76 1,9031 1,8808 0,0486 0,0498 0,0024 0,0025 0,0002 1,9031 1,8808 0,0002 0,0002 0,0024 -0,0022 78 8 -0,0115
40 54 1,6021 1,7324 0,0687 0,0591 0,0047 0,0035 0,0085 1,6021 1,7324 0,0085 0,0085 0,0040 0,0045 47 98 0,0231
80 82 1,9031 1,9138 0,0486 0,0480 0,0024 0,0023 0,0001 1,9031 1,9138 0,0001 0,0001 0,0023 -0,0023 81 2 -0,0120
45 56 1,6532 1,7482 0,0647 0,0580 0,0042 0,0034 0,0045 1,6532 1,7482 0,0045 0,0045 0,0037 0,0008 50,5 60,5 0,0039
78 83 1,8921 1,9191 0,0492 0,0477 0,0024 0,0023 0,0004 1,8921 1,9191 0,0004 0,0004 0,0023 -0,0020 80,5 12,5 -0,0105
2
2
SR media 0,0064
2
2
u media 0,0115
2
SR corregida 0,0022
10,82 (%) 18,4 (%) 11,1 (%) 10,7 (%)
Página 139 de 142

EJEMPLO 5
Ejemplo con valores cubriendo el rango 10-80 ufc, con mayor variabilidad que el ejemplo 4.

CORRECCION
2
u 2 Media Varianza
nc1 (ufc) relativa
50 80 1,6990 1,9031 0,0614 0,0486 0,0038 0,0024 0,0208 1,6990 1,9031 0,0208 0,0208 0,0029 0,0179 65 450 0,0911
13 28 1,1139 1,4472 0,1205 0,0821 0,0145 0,0067 0,0555 1,1139 1,4472 0,0555 0,0555 0,0092 0,0463 20,5 112,5 0,2189
55 85 1,7404 1,9294 0,0586 0,0471 0,0034 0,0022 0,0179 1,7404 1,9294 0,0179 0,0179 0,0027 0,0152 70 450 0,0776
25 15 1,3979 1,1761 0,0869 0,1121 0,0075 0,0126 0,0246 1,3979 1,1761 0,0246 0,0246 0,0094 0,0152 20 50 0,0750
68 83 1,8325 1,9191 0,0527 0,0477 0,0028 0,0023 0,0037 1,8325 1,9191 0,0037 0,0037 0,0025 0,0012 75,5 112,5 0,0065
80 50 1,9031 1,6990 0,0486 0,0614 0,0024 0,0038 0,0208 1,9031 1,6990 0,0208 0,0208 0,0029 0,0179 65 450 0,0911
40 60 1,6021 1,7782 0,0687 0,0561 0,0047 0,0031 0,0155 1,6021 1,7782 0,0155 0,0155 0,0038 0,0117 50 200 0,0600
80 53 1,9031 1,7243 0,0486 0,0597 0,0024 0,0036 0,0160 1,9031 1,7243 0,0160 0,0160 0,0028 0,0132 66,5 364,5 0,0674
45 64 1,6532 1,8062 0,0647 0,0543 0,0042 0,0029 0,0117 1,6532 1,8062 0,0117 0,0117 0,0035 0,0082 54,5 180,5 0,0424
72 88 1,8573 1,9445 0,0512 0,0463 0,0026 0,0021 0,0038 1,8573 1,9445 0,0038 0,0038 0,0024 0,0014 80 128 0,0075
2
2
SR media 0,0190
2
2
u media 0,0738
2
SR corregida 0,0145
27,77 (%) 31,8 (%) 28,0 (%) 27,2 (%)
Página 140 de 142

ANEXO XVI: EXPRESION DE RESULTADOS
Se exponen a continuación una serie de ejemplos de expresión de resultados a partir de

valores de incertidumbre simulados.
Ejemplo 1: Aluminio en aguas de consumo
Valor Paramétrico (R.D. 140/2003) 200 µg/L
Para una incertidumbre del 12%, en unidades de medida y con dos cifras significativas
tendremos 24 µg/L. Por tanto, el valor reportado por el laboratorio será:
(200 ± 24) µg/L ó 200 µg/L ±12%
Ejemplo 2: Boro en aguas de consumo
Valor Paramétrico (R.D. 140/2003) 1,0 mg/L
tendremos 0,12 mg/L. Por tanto, el valor reportado por el laboratorio será:
(1,00 ± 0,12) mg/L ó 1,00 mg/L ± 12%
En este caso el requisito legal sobre el número de decimales indicado en el valor

paramétrico es menor que el que ofrece la incertidumbre del método. Entonces la
incertidumbre podría expresarse con una sola cifra significativa, con el fin de que el
resultado posea el mismo número de decimales que el Valor Paramétrico. De este modo,
el valor reportado por el laboratorio pasaría a ser:
(1,0 ± 0,1) mg/L ó 1,0 mg/L ± 12%
Nota: Considerando una cifra significativa, debería informarse como 1,1 mg/L cuando el
resultado de ensayo fuera mayor o igual que 1,05 mg/L, es decir, un 5% por encima del
Valor Paramétrico.
Considerando dos cifras significativas, debería informarse como 1,01 mg/L cuando el
resultado de ensayo fuera mayor o igual que 1,005 mg/L, es decir, sería necesario
superar el Valor Paramétrico en un 0,5% para emitir un resultado por encima del mismo.
Página 141 de 142

Ejemplo 3: Turbidez en agua regenerada
Nivel de Calidad Aceptable (R.D. 1620/2007) 2 UNT (calidad 1.1)
tendremos 0,24 UNT. Por tanto, el valor reportado por el laboratorio será:
(2,00 ± 0,24) UNT ó 2,00 UNT ± 12%
En este caso, el laboratorio no podría informar de acuerdo con el requerimiento legal,

ya que se obtendría un resultado incoherente de:
(2 ± 0) UNT
Página 142 de 142

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Guía para el Funcionamiento de los Laboratorios de Ensayo de Aguas.

Parte II: Criterios para la verificación y validación de los métodos

GUIA PARA EL FUNCIONAMIENTO

CRITERIOS PARA LA VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN

Fecha: 31 de octubre de 2022

CANAL DE ISABEL II, S.A. Pedro Pablo Morillas

AGUAS- AÑARBE Itziar Larumbe

CONSORCIO DE AGUAS DE TARRAGONA Josepa Fabregas

CONSORCI BÈSOS TORDERA Carles Carrión

CONSORCIO DE AGUAS DE BILBAO Estíbaliz Alda

EMASA Mª Carmen Assiego de Larriva

EMASESA Manuel Borrego

LAB. OLIVER - RODES Marta Pedemonte

LABAQUA Mª Pilar González

LABORATORIO LGA Olga Gutiérrez

LABs & TECHNOLOGICAL SERVICES AGQ SL Ramón Bouza

Expertos en ensayos microbiológicos:

AGUAS DE BARCELONA Belén Galofré

EMASESA Lucila Cuberos

EMATSA Pilar Caballero

IPROMA - EUROFINS Inmaculada Solís

LAB. OLIVER-RODES Miriam Monedero

Agradecemos su colaboración al resto de expertos del resto de empresas

En memoria de Lluís Vázquez (Aguas de Barcelona). Nuestro amigo y compañero.

SESGO (usesgo) ....................................................................................................... 32

B.1) A partir de datos de material de referencia matricial...................................... 32

A) PARÁMETROS FÍSICO – QUÍMICOS........................................................... 69

Este documento constituye la segunda parte de la Guía para el funcionamiento

Se publica la revisión 1 con el fin de atender e intentar dar respuesta a la nueva

La elaboración de la documentación y, en particular, el desarrollo de los métodos

En esta guía se proponen diversas pautas para la verificación y validación de los

Es necesario además establecer pautas para la expresión de los resultados

También debe asegurarse que tanto los cálculos realizados en la aplicación de

sujetos a verificación. Por ello, deben validarse las aplicaciones informáticas

En este documento se incluyen definiciones tomadas de referencias concretas

El Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social recomienda este documento

3. SELECCIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYO

Los documentos relacionados con los métodos de ensayo son procedimientos

Los documentos o procedimientos utilizados por el laboratorio deben contemplar

Los métodos normalizados se basan en normas internacionales, nacionales o

Cuando el método normalizado no contempla todas las especificaciones para que

necesarios para su realización. En ese caso se trata de métodos basados en

Finalmente, en algunos casos particulares podría no disponerse de un método

En caso de que el laboratorio disponga de más de un procedimiento de ensayo

En algún caso, como son los ensayos microbiológicos, el laboratorio tendrá la

En cuanto al contenido y estructura de los documentos donde se describen los

Cuando el laboratorio decide contar con un procedimiento interno para la

4. VERIFICACIÓN Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS (36, 37, 38, 39)

4.1. VERIFICACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS

Es esencial para los laboratorios que el proceso de selección de métodos permita:

De acuerdo con este último punto, el laboratorio debe ‘comprobar’ su capacidad

Así, si la norma incluye información relativa a interferencias para la matriz o

La verificación de un método por parte del laboratorio debería incluir una

El rendimiento del método debería demostrarse mediante el cumplimiento de las

• Muestras blanco o medios no inoculados (microbiología), para evaluar posible

También debe realizarse la verificación de modificaciones menores frente al

Los parámetros necesarios que considerar en el proceso de verificación

Para los análisis de trazas, el laboratorio debería confirmar los límites de

El laboratorio deberá validar un método cuando se realizan cambios significativos

4.2. VALIDACIÓN DE ENSAYOS FISICO-QUIMICOS

En general, la validación debe confirmar que el método del laboratorio se

Este proceso comprende un conjunto de pruebas sistemáticas y programadas

La amplitud del proceso de validación depende de varios factores, tales como la