PROTOCOLOS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN EN EL GATO DOMÉSTICO

RESUMEN

En la actualidad los diferentes técnicas de criopreservación de semen en gatos su único

objetivo es para preservar la genética de estos gametos para uso futuro, especialmente
en razas valiosas de gatos domésticos y utilizar el conocimiento adquirido en la colección
de espermatozoide, congelación, dilución de espermatozoide, almacenamiento, método
de criopreservacion y descongelación para utilizar estas mismas técnicas de
conservación de esperma en felinos salvajes que se encuentran en los zoológicos que en
muchos casos se encuentran en peligro de extinción. Razón por la cual en este artículo se
describe los diferentes protocolos utilizados por diferentes investigadores en la
criopreservacion de semen de gato y los temas que presenta este articulo incluyen
técnicas de colección de semen, los principales diluyentes utilizados, métodos de dilución
de esperma, métodos de criopreservacion, temperatura de descongelación.
 1. INTRODUCCION

Entre 37 especies de felinos reportados hasta la actualidad , el gato doméstico

( Felis catus ) es la única especie que no está amenazada de peligro extinción
Baillie et al., 2010  . realizar el procedimiento de conservación de gametos en el
gato domestico no es complicado y este método se puede utilizar para estudiar
diferentes aspectos de otros félidos , incluida la crio preservación
de esperma . El desarrollo de protocolos válidos para la criopreservación de
esperma en gatos domésticos no solo es útil para la aplicación de técnicas de
criopreservación a felinos salvajes sino también para su uso en la cría de gatos
domésticos  Rijsselaere y Van Soom, 2010 .

2. COLECCIÓN DE SEMEN

Para colectar semen de gato doméstico se han utilizado diversas técnicas como
la vagina artificial, electroeyaculación, directamente de los epidídimos o
los testículos , y una técnica de nuevo desarrollo: el cateterismo uretral tras
sedación inducida farmacológicamente, Chatdarong et al., 2016.

Pero el volumen y la alcalinidad del semen obtenido al usar la electro

eyaculación es mayor en comparación con el semen recolectado con el uso de
vagina artificial, esta diferencia podría deberse al aumento de las secreciones
de las glándulas sexuales accesorias en respuesta a la estimulación
eléctrica encontraron que el número total y la motilidad de los espermatozoides
eran mayores ( P  < 0.05) para las muestras recolectadas con el uso de un
vagina artificial que las recolectadas con el uso de EE, Zambelli et al., 2008.

3. DILUYENTES
Los diluyentes preparados específicamente para la criopreservación de semen
de gato no han sido comercializados; por lo tanto, solo se utilizan medios
autopreparados o medios comercialmente formulados especialmente para otras
especies, como  el diluyente Tris a base de yema de huevo (TEY) se usa con
mayor frecuencia en la criopreservación de esperma de gato. Cuando se utilizó
este medio, se produjo una calidad del esperma de moderada a alta después de
la descongelación, como 20 % a 64,8 %, la motilidad 39,2   % a 67,2   % para la
integridad de la membrana plasmática , 33 % a 68 % para la integridad
del acrosoma y 88,8 ± 3,4 % a 91,4 ± 9,3 % para la integridad del ADN
Buranaamnuay, 2015 . 

La comparación de diluyentes de TEY y leche descremada-glucosa-taurina

(SMGT) indicó que el esperma de gato crioconservado con diluyente de TEY o
diluyente de SMGT que contenía yema de huevo no fue diferente ( P  >  0,05) y
las tasas de embarazo el día 19 después de la IIU fueron del 42,9 % para TEY y
del 33,3 % para SMGT ( P  >  0,05; Baran et al., 2011 ).

 Además, Tsutsui et al. (2000) demostraron que la motilidad media de los

espermatozoides después de la descongelación y la tasa de concepción después
de la IIU unilateral con semen de gato criopreservado preparado con citrato de
sodio de yema de huevo (EYC), que es un diluyente generalmente utilizado para
el semen de toro, fueron similares ( P  >  0.05) a los en las muestras preparadas
con TEY-fructosa. La motilidad de los espermatozoides fue del 30,0% y la tasa de
concepción fue del 57,1% cuando se utilizaron ambos diluyentes.

Vik et al. (2012) descubrieron que al reemplazar la yema de huevo

con lecitina de soja , mejoraban la motilidad, la longevidad y la integridad de la
membrana de los espermatozoides evaluadas mediante tinción
con clortetraciclina de esperma congelado-descongelado ( P  <  0,05).

Se evaluó la eficacia de un diluyente comercial no felino comercial (Triladyl;

diluyente para la criopreservación de semen de toro) y de un medio
autopreparado a base de yema de huevo Tris para la crioconservación de
esperma epididimario de gato. Los diluyentes preparados por uno mismo fueron
más efectivos ( P  <  0,05) que un diluyente comercial Triladyl para mantener la
calidad del esperma criopreservado (integridad del acrosoma, integridad de la
membrana funcional e integridad del ADN) , y sin diferencias ( P  > 0.05)
(Jimenez et al., 2013). También se ha evaluado la influencia de diferentes
diluyentes a base de sacarosa en la calidad del esperma de gato. La motilidad
progresiva y la morfología normal de los espermatozoides de gato del epidídimo
después de la criopreservación ultrarrápida con sacarosa como crioprotector no
permeable (CPA) fueron mayores ( P  <  0,01) en comparación con los
procesados con diluyentes sin sacarosa. Los resultados más deseables se
lograron cuando  se utilizó 0,4 M de sacarosa  Vizuete et al., 2014 .

Proceso de congelación

Al igual que en otros animales domésticos, el CPA permeable más utilizado para
la criopreservación de semen de gato doméstico es el glicerol, aunque esta
sustancia es dañina para las células, especialmente en altas concentraciones
( Villaverde et al., 2013 ). La concentración final de glicerol incluida en los
diluyentes no es la misma entre los diferentes estudios, oscilando entre el 1,25
% (v/v) ( Karja et al., 2002 ) y el 8 % (v/v) ( Bogliolo et al.,
2004 ). Independientemente del tipo de diluyente y método de congelación-
descongelación, sin embargo, una concentración final de glicerol de 4%
Chatdarong et al., 2009  es el más utilizado y se produce una motilidad
moderada (30 %–60 %) a muy aceptable (>60 %) de los espermatozoides
congelados y descongelados. Por lo tanto, se sugiere que 4% a 5% de glicerol es
óptimo para la crioconservación de esperma de gato. Esta sugerencia está
respaldada por un estudio anterior en el que se comparó la eficacia
crioprotectora de concentraciones finales de glicerol al 3 %, 5 % y 7 %, y el
efecto protector más deseable ( P  <  0,05) para el esperma de gato eyaculado
ocurrió con el grupo de glicerol al 5 % ( Villaverde et al., 2013 )

Además del glicerol CPA ampliamente utilizado, se ha utilizado sulfóxido de

dimetilo (DMSO), que es un CPA permeable, para la crioconservación de
esperma de gato ( Nelson et al., 1999 ). Se investigó si el uso de DMSO y glicerol
en las mismas concentraciones (4 % y 8 %) dio como resultado una motilidad del
esperma comparable ( P  > 0,05) después de la descongelación.  Las
comparaciones de concentraciones indicaron que el uso de una concentración
del 8 % de CPA dio como resultado una menor motilidad de los espermatozoides
( P  < 0,05) que con los grupos del 4 %  esto implica que una concentración final
de 8 % de glicerol/DMSO es excesiva y, por lo tanto, tóxica para el esperma de
gato.  ( Swain y Smith, 2010 ). 

Vizuete et al. (2014) informaron que el esperma de gato del epidídimo podría

criopreservarse en un extensor de congelación libre de CPA permeable
mediante el uso de un método de criopreservación ultrarrápido. El diluyente
utilizado en este estudio fue el diluyente basado en BSA al 1 % de solución salina
tamponada con fosfato de Dulbecco complementado con sacarosa que se
incorporó como un CPA no permeable. Después de la descongelación, las
muestras suplementadas con sacarosa (0.25, 0.4 y 0.6 M) tuvieron mayores
porcentajes ( P  < 0,01) de motilidad y morfología normal de los
espermatozoides que las  muestras sin sacarosa (0 M). Entre los grupos
suplementados con sacarosa, la  concentración de 0,4 M dio como resultado la
mayor calidad del esperma después de la descongelación.

MÉTODOS DE CRIOPRESERVACION

Las muestras de esperma de gato se pueden criopreservar utilizando uno de

estos tres métodos: hielo seco, vapor LN2, congelador  biológico programable,
en estudios más recientes, la crioconservación de esperma de gato se ha llevado
a cabo colocando el semen en vapor de LN 2 , que es más económico que usar
un congelador programable y más conveniente que usar hielo seco. Con este
método, los recipientes cargados de esperma se colocan horizontal o
verticalmente sobre la superficie de LN 2 durante un período de tiempo para
permitir que la temperatura de la muestra disminuya de 4 a 5  °C a
aproximadamente -40 , −100 , −110  , −120 o −130 °C, Siemieniuch and Dubiel,
2007.

CONCLUSION

El desarrollo de protocolos de crioconservación para el esperma de gatos

domésticos es necesario no solo para conservar el esperma de estos gatos, sino
que también es importante para aplicar el conocimiento obtenido de estos
estudios en el desarrollo de protocolos para la conservación del esperma de
felinos silvestres .
 Para adquirir una calidad prometedora de muestras congeladas y
descongeladas, cada proceso de crioconservación debe evaluarse
cuidadosamente. La presente contribución reúne publicaciones anteriores
mencionadas sobre la criopreservación de esperma de gato y resume los
protocolos de criopreservación de manera gradual, comenzando con la fuente
de esperma hasta la dilución posterior a la descongelación. En conclusión, los
espermatozoides se pueden recolectar de los gatos mediante el uso de AV , EE ,
cateterismo uretral y recolección de los epidídimos .mediante el uso de
compresión manual, lavado, corte/picado/rebanado y punción. Los
espermatozoides recolectados luego se someten al proceso de criopreservación
diluyéndolos con diluyentes que contienen CPA y otros componentes que
generalmente son autopreparados. El proceso de dilución de esperma se puede
completar en uno o dos pasos, a temperatura ambiente y entre 4 y 5 °C.
Independientemente del método de dilución, el esperma extendido debe
enfriarse (4 a 5 °C) durante un período de minutos a horas para que se equilibre
con los CPA antes de la crioconservación. Los espermatozoides procesados se
colocan en recipientes con una pajilla de plástico de 0,25 ml, que es el más
utilizado, y luego se crioconservan mediante el uso de hielo seco, vapor LN2o
una máquina de congelación programable. Con el método más utilizado,
LN2vapor, los vasos de esperma se colocan horizontal o verticalmente sobre la
superficie de LN 2 a distancias y tiempos variables antes de sumergirse en LN 2 .
La descongelación del esperma crioconservado se puede realizar colocando las
pajuelas de 0,25 ml en agua tibia, a 37–38 °C. Las muestras descongeladas se
utilizan posteriormente para la evaluación de la calidad posterior a la
descongelación o para la inseminación artificial con o sin medios de
descongelación.
La comprensión de todo el proceso de criopreservación de esperma de gato es
importante para comprender los protocolos que se han desarrollado
previamente y también mejora la comprensión sobre futuras oportunidades de
investigación en el área de la criopreservación de esperma de gato. Esta
recopilación de resultados previos sobre la criopreservación de esperma de gato
doméstico debería contribuir a mejorar la calidad in vitro del esperma de gato
congelado y descongelado. El objetivo final de esta revisión es potenciar el uso
exitoso de la inseminación artificial de gatos con esperma congelado-
descongelado y así aumentar el número de crías. La disminución de la población
de especies de felinos en peligro de extinción y el riesgo de extinción de
especies pueden moderarse si se abordan los problemas importantes para la
criopreservación de esperma en las especies felinas.

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