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CAPÍTULO

49
Perspectivas futuras para las tecnologías
de enzimas en la industria alimentaria
Hita Rastogui⁎, Sugandha Bhatia⁎,†
⁎ Departamento de Biotecnología, Lovely Professional University, Jalandhar, India†Instituto
de Salud e Innovación Biomédica y Facultad de Ciencias Biomédicas,
Universidad Tecnológica de Queensland, Brisbane, Queensland, Australia

49.1 INTRODUCCIÓN

Las enzimas son catalizadores biológicos "verdes" que han alterado la forma en que procesamos nuestros
alimentos. Las enzimas se utilizan ampliamente en diversas industrias de alimentos y piensos, cubriendo
ampliamente la panadería, los jugos y las bebidas, la elaboración de cerveza, la carne, los productos lácteos, los
suplementos dietéticos, el procesamiento de vegetales, las grasas y los aceites.Robinson, 2015;Schäfer, 2007). Las
características deseadas, como la termoestabilidad, la capacidad de actuar en un amplio rango de pH y presión, la
dependencia de iones no metálicos, la velocidad de reacción rápida, la amplia utilización de sustratos y la capacidad
de actuar bajo la susceptibilidad de las moléculas inhibidoras típicas, se han desarrollado mediante el uso de
moléculas únicas o inhibidoras. enfoques integrados como el cribado, la tecnología de ADNr, la ingeniería de
proteínas, etc. (Figura 49.1). La inmovilización de enzimas también ha permitido que se empleen de manera más
económica para que puedan reutilizarse con pérdidas menores o sin ninguna pérdida en la actividad (Fernández,
2010). Con el avance de las técnicas de ingeniería genética, diferentes genes que codifican enzimas de interés
podrían transferirse y expresarse en los microbios hospedadores adecuados requeridos para la producción a gran
escala. Hoy en día, la implementación de la tecnología genética es de suma importancia para la producción de la
mayoría de las enzimas industriales mediante el descubrimiento de nuevas enzimas, así como la optimización de las
proteínas existentes. El uso de subsidios a las enzimas brinda muchos beneficios en las aplicaciones industriales de
alimentos, incluida la mejora de la consistencia y la calidad del producto, la reducción de la dependencia de las
materias primas para el procesamiento, la sustitución de los aditivos alimentarios químicos y la prevención de
subproductos potencialmente dañinos en los alimentos (Schäfer, 2007). Las tecnologías de enzimas novatas
también están abriendo nuevas vías para la utilización de enzimas para mejorar las propiedades aromáticas,
estructurales, de textura y umami de los productos alimenticios. El uso de la ingeniería genética aumenta la
extracción y la purificación de la enzima, así como su producción a gran escala con costos más económicos y una
menor utilización de energía de plantas y microbios para su uso en la fabricación y el procesamiento de alimentos.
Con el advenimiento de la bioinformática, el diseño in silico de nuevas enzimas y

Enzimas en Biotecnología de Alimentos https://doi.org/10.1016/ 845 © 2019 Elsevier Inc. Todos los derechos reservados.

B978-0-12-813280-7.00049-9
846 49. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA LAS TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

Genético Detección de mutagénesis

evolución dirigida Proteína
Ingenieria dirigida al sitio
Ingenieria
Diseño racional de proteínas

Bases de datos para la recuperación de información Covalente/ iónico/ enlace portador/

Herramientas computacionales inmovilización adsorción
Bioinformática
Diseño de enzimas tecnicas Agregados de enzimas reticulantes (CLEA)
Diseño de péptidos bioactivos Microencapsulación

HIGO. 49.1Visión consolidada de las técnicas empleadas en la tecnología de enzimas y otras dimensiones.

mejorar la eficiencia catalítica de las enzimas existentes también tiene un profundo impacto (Hilvert,
2013;Minkiewicz et al., 2016;Penning y Jez, 2001), que van desde industrias alimentarias hasta otros
sectores de contribución, como en intervenciones farmacológicas y biomédicas (Alderson et al., 2012;
Gurung et al., 2013).

49.2 HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR ENZIMAS

49.2.1 Tecnología de ADN recombinante

La utilización de tecnología de ADN recombinante o ingeniería genética ha complementado la
mejora de las cepas microbianas así como de las enzimas asociadas con las técnicas de procesamiento
y fermentación de alimentos. Desde la aparición de esta herramienta en la década de 1970, ha
revolucionado por completo la industria alimentaria. Las enzimas tanto nuevas como conocidas se
pueden adaptar específicamente usando esta tecnología para producir enzimas con la especificidad y
sensibilidad deseadas junto con la reducción del costo de producción de las enzimas. El éxito
considerable en el desarrollo de cepas microbianas mejoradas ha dado lugar a muchas aplicaciones
en la industria alimentaria, como la ingeniería de cepas huésped microbianas para mejorar los
rendimientos enzimáticos mediante la eliminación de genes nativos que codifican proteasas
extracelulares.Olempska-Beer et al., 2006). Las cepas modificadas genéticamente se pueden
implementar de manera efectiva para varias operaciones por lotes y continuas. Esto reduce el
requisito de extracción y purificación de enzimas y se puede cultivar fácilmente utilizando materias
primas más baratas. Las cepas mejoradas genéticamente en la producción de jarabe con alto
contenido de fructosa a partir de almidón también se adaptan a varios parámetros variables, como la
compatibilidad con la adición de sustratos altamente concentrados en los pasos intermedios de una
biotransformación de varios pasos, el paso de eliminación/adición de iones metálicos, las
temperaturas de procesamiento, y ajustes de pH. Por lo tanto, esta técnica ha aumentado la
productividad y reducido el costo relacionado con el procesamiento del producto aguas arriba (Liu y
Xu, 2008;Panesar, 2010). Otras enzimas (como las α-amilasas y las pululanasas) utilizadas en la
hidrólisis del almidón en realidad se producen utilizando
 49.2 HERRAMIENTAS BIOTECNOLÓGICAS PARA MEJORAR ENZIMAS 847
cepas mejoradas. Los cultivos microbianos genéticamente modificados (GM), junto con la producción
de enzimas, también se utilizan para la producción de glutamato monosódico (MSG), ácidos grasos
poliinsaturados y aminoácidos. Sin embargo, el uso de cepas genéticamente mejoradas también está
restringido en algunas tecnologías alimentarias, debido a la incongruencia con los procedimientos de
producción y purificación, la falta de certificación como seguras para el consumo en los Estados
Unidos y la Unión Europea, y la creciente conciencia pública sobre el no consumo. de OGM o
productos procesados con OGM (Agarwal y Sahu, 2014;Olempska-Beer et al., 2006; Spok, 2006).

La primera enzima recombinante comercial aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos de los
EE. UU. para su uso en el procesamiento de alimentos fue la quimosina bovina, involucrada en la fabricación
de queso (Flam, 1991). Otro ejemplo de enzimas manipuladas usando ingeniería genética (ampliamente
revisado enOlempska-Beer et al., 2006) y utilizado en el procesamiento de alimentos incluye alfa amilasas
diseñadas para una mayor estabilidad al calor para su uso en la producción de jarabes de maíz con alto
contenido de fructosa. El gen de la fosfolipasa A1 deFusarium venenatumse expresó en GMAspergillus
oryzaepara producir en exceso la enzima fosfolipasa A1. Se utiliza en la industria láctea para la fabricación de
queso para mejorar la eficiencia y el rendimiento del proceso.

49.2.2 Detección
Los métodos de detección tienen como objetivo el aislamiento de enzimas de una fuente
extremófila para que las enzimas que operan en un entorno hostil para aplicaciones industriales
permanezcan estables y muestren una alta actividad, especificidad y números de rotación (Asgeirsson
y Kristjansson, 2002;Gomes y Steiner, 2004;Synowiecki et al., 2006). Entre los extremófilos, varios
termófilos provenientes de temperaturas más altas, como un respiradero hidrotermal, se utilizan más
comúnmente para las industrias alimentarias. Estos incluyen alfa amilasa, amilopululanasas,
fructosiltransferasas, glucoamilasas, glucosa (xilosa) isomerasas, glucosidasas, inulinasas,
levansacarasas, pululanasas, β-galactosidasas y xilanasas en industrias que dependen de la hidrólisis
del almidón. Los ejemplos de estas enzimas a las que se hace referencia y otras varias obtenidas de
extremófilos se revisan exhaustivamente enFernández (2010)yGomes y Steiner (2004). El aislamiento
de bacterias de ambientes marinos también ha recibido gran atención para obtener otros genes de
interés, como la invertasa/inulinasa termoestable de Thermotoga napolitana DSM 4359, inulinasa de
Cryptococcus aureus(Dipasquale et al., 2009;Sheng et al., 2007), enzimas amilolíticas, glucosidasas y
proteasas de varios géneros (Mohapatra et al., 2003), esterasa deVibrio fischeri(Ranjitha et al., 2009) y
glicosil hidrolasas (Giordano et al., 2006;Tramice et al., 2007). Algunas industrias alimentarias, como la
láctea y la cárnica, necesitan que las enzimas funcionen a una temperatura más baja, por lo que la
detección de criófilos también ha identificado microbios potenciales que se utilizan en diferentes
aplicaciones, como el procesamiento de leche con lactasa para leche sin lactosa (Nakagawa et al., 2006
); maduración del queso y coagulación de la leche con proteasas (Wang et al., 2008); clarificación de
jugos de frutas con pectinasas para producir jugo claro (Nakagawa et al., 2004); o producción de
oligosacáridos (Mao et al., 2010). Sin embargo, los enfoques de selección tienen la advertencia de que
los microbios examinados e identificados son difíciles de cultivar en condiciones de laboratorio, por lo
que se aprovechan los métodos de ingeniería genética actuales para expresar los genes obtenidos de
los extremófilos en un microbio mesófilo. Esto es fácil de cultivar en un laboratorio, y la extracción y
purificación de proteínas se puede realizar con facilidad.
848 49. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA LAS TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

49.2.3 Ingeniería de proteínas

Con la gran cantidad de tecnología accesible a través de las últimas técnicas de PCR automatizadas para
la amplificación de genes y la inserción de mutantes utilizando un subconjunto de cebadores, una
generación de mutagénesis aleatoria y específica del sitio ha brindado estabilidad a diferentes reacciones
catalíticas con mejoras en la estabilidad de las enzimas y la tolerancia a temperaturas extremas. , pH y/o
disolventes orgánicos (Chiang, 2004). Se puede generar fácilmente una plétora de enzimas con diferentes
dominios/motivos funcionales usando herramientas recombinantes. Cristalografía de rayos X y RMN (Yee et
al., 2002) puede habilitar los sitios de unión/reconocimiento del sustrato de una enzima, los residuos
involucrados en un sitio activo y todo el panorama de la estructura terciaria de una enzima (Schneider et al.,
2009). Esta información facilita la mejora adicional de su tasa catalítica y la modificación de aminoácidos para
mejorar la especificidad del sustrato. Dos enfoques diferentes utilizados en la ingeniería de proteínas son el
diseño racional de proteínas (Tiwari et al., 2012) y evolución dirigida (Jackel et al., 2008); estos pueden usarse
exclusivamente o en conjunto entre sí. El enfoque de diseño racional requiere un conocimiento previo de la
estructura y función de una proteína para introducir los rasgos deseados mediante mutagénesis dirigida al
sitio (Singhania et al., 2010). El modelado de homología, el enhebrado de proteínas y los métodos de
alineación de secuencias múltiples se utilizan para predecir la estructura general y la función de la enzima.
Poluri y Gulati, 2016). En la evolución dirigida, la información previa sobre la proteína no es obligatoria y la
mutagénesis aleatoria se realiza mediante mediación química o utilizando métodos de PCR propensos a
errores. Se aplican múltiples rondas de mutación y selección, imitando la evolución natural para producir
variantes con las modificaciones deseadas (Jackel et al., 2008). El mayor impulso en la aplicación del enfoque
de diseño racional es que se requiere muy poco esfuerzo para detectar las propiedades mejoradas, ya que se
genera un número limitado de variantes de proteínas (Singhania et al., 2010). Por ejemplo, la glucosa
isomerasa mutante generada utilizando este enfoque deActinoplanes missouriensismuestra una actividad
enzimática similar pero con una estabilidad mejorada a diferentes pH, así como una estabilidad térmica
mejorada en comparación con su enzima original (Quax et al., 1991). Cuando la isomerasa doble mutante
(G138P, G247D) fue diseñada por elZhu et al. (1999)grupo, se mostró un aumento de 2,5 veces en la vida
media y un aumento del 45% en la actividad específica en comparación con su tipo salvaje. Lin y sus
colaboradores también utilizaron este enfoque para crear mutantes de amilasa a partir de Bacilosp.cepa
TS-23para mejorar la estabilidad térmica de la enzima (Lin et al., 2008). Xilanasa obtenida detrichodermasp.
también se utiliza a gran escala en la industria de piensos. Mediante mutagénesis diseñada, su estabilidad
térmica se ha mejorado unas 2000 veces a 70 °C, mientras que la vida media también se ha incrementado de
aproximadamente 60 s a 4 min a través de la estabilización de la región de hélice alfa y el extremo N-
terminal (Fenel et al., 2004). Por otro lado, la evolución dirigida usa métodos combinatorios para generar
cambios de una manera más aleatoria y producir multivariantes que necesitan métodos de alto rendimiento
para ser validados para su función. Se han diseñado varios biocatalizadores como proteinasas, celulasas, α-
amilasas, lipasas y glucoamilasas utilizando el enfoque de evolución dirigida.Singhania et al., 2010).

49.3 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

La inmovilización de enzimas tiene innumerables ventajas, como la estabilización térmica,

operativa y de almacenamiento de las enzimas que deben operar en condiciones ambientales
adversas y variables; actuar como regulador de la extensión de la reacción; y simplificando el
 49.3 INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS 849
aplicación aguas abajo de la purificación y separación del producto del biocatalizador. La inmovilización de
enzimas impide la desnaturalización de enzimas por autolisis o disolventes orgánicos y, por lo tanto, puede
cargarse en cantidades más altas. La operación en biorreactores con enzimas inmovilizadas se puede
automatizar y ejecutar como una operación continua o por lotes sobre la base de drenaje y llenado, según
los requisitos del usuario. Esto siempre que la inmovilización de la enzima haya encapsulado suficientemente
la enzima sin pérdida de su actividad. Los biocatalizadores inmovilizados se pueden recuperar y reutilizar
fácilmente, lo que mejora la productividad por unidad de enzima y minimiza la inhibición del sustrato (Mateo
et al., 2007;Sheldon, 2007;Swaisgood, 2003). Varias aplicaciones de los reactores de enzimas inmovilizadas
que se utilizan de forma rutinaria en aplicaciones industriales alimentarias son (1) biocatalizadores llenos de
isomerasa de glucosa inmovilizada para la producción de jarabe de maíz con alto contenido de fructosa; (2)
aminoacilasa para la producción de aminoácidos; (3) lactasa para hidrolizados de suero y para la producción
de tagatosa; (4) invertasa para la producción de jarabe de azúcar invertido; (5) lipasas para la
interesterificación de aceites comestibles, para la producción de aceites libres de trans, equivalentes de
manteca de cacao y para la modificación de triacilgliceroles; (6) β-fructofuranosidasa para la producción de
fructooligosacáridos; (7) isomaltulosa sintasa para la producción de isomaltulosa (Fernández, 2010;
Nakakuki, 2003;Swaisgood, 2003;Walsh, 2007).
Numerosos modos alternativos de inmovilización son atrapamiento/microencapsulación, unión a
un vehículo sólido a través de interacciones iónicas o covalentes, entrecruzamiento de agregados
enzimáticos y métodos de adsorción.Brady y Jordan, 2009). La adsorción (electrostática, bioespecífica,
hidrófoba) de enzimas a una matriz o soporte es más recomendable que la inmovilización química. La
matriz se puede separar fácilmente de la enzima, pero se puede recargar y reutilizar y los pasos son
menos complicados en comparación con el modo covalente de inmovilización (Swaisgood, 2003). Sin
embargo, la advertencia de este enfoque es la desorción de la enzima con el tiempo, lo que conduce a
una disminución de la actividad de la función. Diversas matrices con propiedades menos abrasivas
ampliamente utilizadas en técnicas de inmovilización son agarosa, Sephadex, Sepharose, nylon, vidrio,
sílice, celite, poliestireno, poliacrilamida, alcohol polivinílico, polietileno y derivados de glicol (Cao, 2006
;Datta et al., 2013). El entrecruzamiento del glutaraldehído con la enzima es un ejemplo de
inmovilización covalente, así como de CLEA (agregados de enzimas entrecruzadas). Sin embargo, la
adición de un espaciador ha mejorado la actividad de la enzima al garantizar la reacción de la enzima
con el sustrato al proporcionar la distancia adecuada (LI y WALSH, 2000;NAM y Walsh, 2005). El
método de atrapamiento emplea una red polimérica de un polímero orgánico o un sol-gel (alginato,
gelatina, k-carragenano, gelano), que puede servir como microcápsula o fibra hueca (Kailasapatía y
Lam, 2005). Alternativamente, las enzimas también se encapsulan dentro de los liposomas de acuerdo
con las especificaciones de la reacción (Rodríguez-Nogales y López, 2006). Varios modos y aplicaciones
de las enzimas inmovilizadas en la industria alimentaria también se revisan ampliamente enFernández
(2010).

Hay algunas desventajas intrínsecas identificadas con las técnicas de inmovilización de enzimas que
varían desde varias estrategias hasta varios tipos de catalizadores que se ejemplifican. Los procedimientos
de inmovilización pueden conducir a la pérdida de la actividad enzimática debido a la asociación química o al
impedimento estérico del sitio dinámico; limitaciones de transferencia de masa; una posibilidad de fuga de
enzimas durante la operación del biorreactor debido al deterioro del material moldeado en el que la enzima
está encapsulada o reticulada, o debido al estrés mecánico o químico durante la reacción. Sin embargo,
desde el punto de vista económico, la incorporación de enzimas costosas hace que el proceso general sea
menos costoso (Fernández, 2010).
850 49. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA LAS TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

49.4 INFORMÁTICA ENZIMÁTICA

49.4.1 Uso de herramientas bioinformáticas en ingeniería enzimática

Las enzimas son requisitos previos para realizar reacciones metabólicas que son críticas para
la supervivencia de los microorganismos a los seres vivos (Bairoch, 2000). El conocimiento y la
comprensión puros de la biología de sistemas y el metabolismo se basan en la comprensión
detallada de la función enzimática y la relación actividad-estructura.Li et al., 2010). El uso de la
herramienta bioinformática y la ventaja de ser de dominio público han ayudado a integrar y
comprender una gran cantidad de datos estructurales y de secuenciación provenientes de NGS
(secuenciación de próxima generación), espectrometría de masas, cristalografía de rayos X y
espectroscopia de RMN (nuclear). resonancia magnética) para la informática enzimática. La
bioinformática nos permite realizar análisis computacionales sofisticados de la información
presente en las bases de datos de enzimas en un tiempo mínimo, ya sea en línea o fuera de la
red (Alderson et al., 2012).

49.4.2 Recursos para la recuperación de información sobre enzimas

NCBI RefSeq y UniPort es un consorcio de un gran número de secuencias de péptidos y proteínas; PDB
contiene información estructural tridimensional (3D) de miles de proteínas (Jin et al., 2015;El Consorcio
UniProt, 2008). Pfam es una base de datos de familias de proteínas procedente de EMBL-EBI (Xu y Dunbrack,
2012); CATH proporciona información sobre la estructura, la evolución, la función y el sitio conservado de las
proteínas (Sillitoe et al., 2015). Muchas de las bases de datos de enzimas útiles están interconectadas para
que la información se pueda recuperar fácilmente. ExplorEnz es una base de datos dedicada exclusivamente
a las enzimas y, al mismo tiempo, proporciona recursos introductorios para otras bases de datos (McDonald
et al., 2009). BRENDA contiene una plétora de información sobre enzimas relacionada con fuentes biológicas,
especificidad de sustrato, cinética y química (Chang et al., 2015). Los mapas de redes presentes en KEGG
(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) brindan información útil sobre el papel de las enzimas en las
rutas metabólicas (Kanehisa et al., 2017, 2016). Otras bases de datos relevantes relacionadas con proteínas
son MEROPS, la base de datos de peptidasas del Centro Sanger (Rawlings y Barrett, 2000), CAZy, la base de
datos de enzimas activas de carbohidratos (Lombardo et al., 2014), y ESTHER, la base de datos de la
superfamilia de proteínas de plegado alfa/beta-hidrolasa (Lenfant et al., 2013). EzCat DB (http://
ezcatdb.cbrc.jp/EzCatDB/) interpreta el mecanismo catalítico de la enzima y contiene 878 datos de reacciones
enzimáticas (Nagano et al., 2015). Atlas del sitio catalítico (CSA) (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/
databases/CSA) cataloga los sitios activos de la enzima y los residuos catalíticos identificados en la estructura
3D de las enzimas. La plantilla 3D proporcionada en el CSA se utiliza para examinar una estructura de
proteína en busca de firmas espaciales de actividad enzimática (Furnham et al., 2014). La base de datos de
enlace de estructura-función (SFLD) proporciona una clasificación jerárquica de las enzimas relacionadas
evolutivamente y evolucionadas de forma divergente. También clasifican las secuencias "desconocidas" y las
anotan al mismo tiempo que asignan las funciones compartidas a los residuos del sitio activo conservados (
Akiva et al., 2014;Marrón y Babbitt, 2014). MACiE es otro conjunto de datos desarrollado a partir de CSA y
proporciona información detallada sobre el mecanismo y el centro reactivo de las reacciones enzimáticas, los
pasos que determinan la velocidad y la evidencia de reversibilidad (Holliday et al., 2007, 2012). La base de
datos del metaboloma humano (HMDB) es una base de datos ejemplar que contiene información que
respalda experimentos que involucran un enfoque metabolómico (Wishart et al., 2013, 2009).
 49.4 INFORMÁTICA ENZIMÁTICA 851
FooDB también es un recurso integral sobre biología, química y componentes presentes en los alimentos, incluidas
las enzimas. Las enzimas presentes en los alimentos se pueden evaluar en función de la espectrometría de masas o
los datos de resonancia magnética nuclear (Scalbert et al., 2011).

49.4.3 InterPro para predicción automatizada de funciones enzimáticas

Para el proceso de anotación automatizado, un conjunto de datos seleccionado manualmente es un

requisito previo. Pero la conservación manual de la información sobre enzimas en las bases de datos es
inevitablemente una tarea que requiere mucho tiempo (Baumgartner et al., 2007). Las herramientas
específicas basadas en el algoritmo de aprendizaje automático se basan en los atributos (características de
alias), que se obtienen a través de patrones conservados evolutivamente y firmas de secuencia que ya están
anotadas con su información completa. Se especifica una firma con las anotaciones para sus estructuras
vívidas, información mutante, verificación de funcionalidad in vitro o in vivo y literatura accesible para la
enzima o proteína designada (Alderson et al., 2012). InterPro es una base de datos que contiene una
boutique de firmas provenientes de otras bases de datos como: CATH-Gene3D, CDD, MobiDB, HAMAP,
PANTHER, Pfam, PIRSF, PRINTS, ProDom, PROSITE, SFLD, SMART, SUPERFAMILY y TIGRFAMs (Finn et al., 2017
), así como software en línea. InterProScan para hacer coincidir las firmas con las secuencias también se
presenta en sus archivos (Jones et al., 2014). Gene Ontology para su curación funcional también se basa en
IntroPro. El método InterPro2GO asigna términos de Gene Ontology que encuentran una coincidencia
consistente con las firmas de InterPro (Burge et al., 2012). La limitación de la predicción automatizada es su
dependencia de conjuntos de datos curados manualmente y la falta de validación a menos que se lleve a
cabo un enfoque experimental para la verificación cruzada (Furnham et al., 2009). EnzML también se basa en
las firmas de InterPro para predecir múltiples números de CE en alrededor de 300 000 proteínas Swiss-Prot,
utilizando un algoritmo multietiqueta de K-vecinos más cercanos (De Ferrari et al., 2012).

49.4.4 Diseño computacional de enzimas

Con la llegada de las herramientas in silico, las enzimas se pueden rediseñar para mejorar la
relación estructura-actividad. También se pueden deducir propiedades importantes a través de la
comparación con las proteínas y enzimas anotadas funcionalmente (Gro y Plaxco, 1997;Tao y
Cornualles, 2002). Las enzimas se pueden diseñar sobre la base de la actividad, la especificidad y la
estabilidad. Dos aplicaciones principales del enfoque de diseño de enzimas involucran el diseño de
novo, donde se pueden estructurar proteínas novedosas y su catálisis se puede interpretar utilizando
herramientas bioinformáticas.Huang et al., 2016); y rediseño (Penning y Jez, 2001), donde la proteína
natural se improvisa tanto por su poder catalítico como por la dinámica funcional en el ambiente bajo
el cual opera. ÉlROSETTAyORBITAson las suites de software más utilizadas para el diseño de enzimas
de novo. Otros que han aparecido recientemente incluyenSABIDURÍA, EVODISEÑO,y OPTIMIZADOR DE
BOLSILLO(ampliamente revisado enDamborsky y Brezovski, 2014). Las enzimas diseñadas pueden
catalizar reacciones no biológicas, incluida la transformación retroaldólica de varios pasos, la
cicloadición de Diels-Alder y la transferencia de protones.Hilvert, 2013;Kries et al., 2013). Estas enzimas
diseñadas aún no alcanzan la eficiencia de las enzimas naturales, pero se pueden improvisar
utilizando el enfoque de evolución dirigida. También se realizan otras simulaciones basadas en
modelos moleculares para mejorar la cinética de las enzimas existentes, como la herramienta de
softwareespeleólogo para analizar la dinámica de túneles y sitios activos enterrados;PRETERMUT
evaluar la energía libre de desdoblamiento; yPAREPROpara calcular la entropía evolutiva del sitio (
Chovancova et al., 2012;Damborsky y Brezovski, 2014;Tian et al., 2013).
852 49. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA LAS TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

49.4.5 Aplicación de la bioinformática en la detección de péptidos bioactivos

La fácil disponibilidad y utilización de materias primas proteicas de bajo costo derivadas de subproductos
de productos lácteos, carne, semillas oleaginosas, harinas de procesamiento de pescado y proteínas de
almacenamiento de semillas se pueden utilizar para producir péptidos bioactivos que tienen la capacidad de
mejorar varias condiciones de salud relacionadas con la hipertensión, hiperlipidemia, inflamación , diabetes,
cáncer, infecciones microbianas y trastornos inmunológicos. Los péptidos bioactivos se liberan durante el
procesamiento y el consumo de proteínas alimentarias por digestión gástrica, proteolisis endógena y
exógena y por la acción de la enzima microbiana en la fermentación.Agyei y Danquah, 2012;Beermann y
Hartung, 2013;Udenigwe y Aluko, 2012). Los péptidos bioactivos pueden formar una interacción
péptidoproteína para desviar el funcionamiento anormal de la proteína y tienen sus aplicaciones en el
mantenimiento de la homeostasis fisiológica y la mejora del metabolismo del colesterol hepático.Howard y
Udenigwe, 2013).
El enfoque de la bioinformática para detectar los péptidos bioactivos encriptados en las proteínas
de los alimentos puede hacer que el proceso sea menos desalentador en comparación con el método
de descubrimiento convencional. BIOPEP (http://www.uwm.edu.pl/biochemia) y PepBank (http://
pepbank.mgh.harvard.edu) son los reservorios de información de péptidos bioactivos y se utilizan
para identificar nuevos péptidos bioactivos de actividad farmacológica a partir de proteínas
alimentarias (Ahn et al., 2014;Él et al., 2013). Las herramientas de proteólisis in silico como PoPS,
BIOPEP y ExPASy PeptideCutter se pueden usar para determinar los péptidos bioactivos putativos o de
novo de las secuencias de proteínas (Udenigwe, 2014). Varios grupos han utilizado este enfoque para
estudiar la distribución de péptidos inhibidores de enzimas relacionados con enfermedades dentro de
la estructura primaria de las proteínas típicas de los alimentos.Gu et al., 2011;Lacroix y Li-Chan, 2012).
La presencia de péptidos que contienen Cys y Trp para intervenciones terapéuticas y antioxidantes
también se identificó después de la hidrólisis in silico de dioscorina (proteína de almacenamiento de
ñame) con pepsina. En los sistemas celulares, los péptidos mostraron mejores propiedades
antioxidantes y antiglicación en comparación con los péptidos fisiológicos, el glutatión y la carnosina.
Han et al., 2014, 2013). El servidor PeptideRanker de acceso abierto (http://bioware. ucd.ie/wcompass/
biowareweb) es una herramienta basada en la red neuronal N-to-1. Tiene la capacidad de clasificar
grandes conjuntos de péptidos y asignar puntajes de 0 a 1 según patrones estructurales que indican la
probabilidad de mostrar bioactividad, siendo los puntajes 0 y 1 los menos probables y los más
probables, respectivamente (Mooney et al., 2012). Este enfoque bioinformático integrado produjo
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, una enzima de la fotosíntesis vegetal, como un precursor
sostenible para la formación de péptidos bioactivos.Udenigwe et al., 2013).

49.5 APLICACIONES EXTENSIVAS DE ENZIMA

TECNOLOGÍAS PARA PRODUCIR, MEJORAR O MODIFICAR
EL SABOR DE LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS

49.5.1 Uso de vainilla y subproductos para moléculas de sabor de alto valor

vainilla (Vainilla planifoliaAndr.) es una especia muy popular utilizada en varios productos alimenticios.
Tiene una fragancia y un sabor muy agradable debido a la generación de un fruto fragante: la vaina de
vainilla. La vaina de vainilla en su estado verde no tiene el aroma que la caracteriza.
 49.5 APLICACIONES EXTENSAS DE TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS 853
El aroma de vainilla surge solo después del proceso de curado, que puede variar según el país y la
región de cultivo (Baqueiro-Peña y Guerrero-Beltrán, 2017). Los subproductos del extracto de vainilla
no se aprovechaban antes, pero en 2010 se reportó el tratamiento enzimático y la reutilización de las
vainas de vainilla agotadas. Las vainas de vainilla agotadas contienen solo pequeñas cantidades de
aroma y sabor, pero después de tratarlas con varias enzimas, el aroma y el sabor se pueden extraer y
potencialmente usarse como aditivos alimentarios (Patente, 2010, US 7803412 B1: Tratamiento
enzimático de vainas de vainilla gastadas, Estados Unidos). Los aromatizantes también se pueden
producir a partir del bagazo de vainilla utilizando varios microorganismos capaces de producir
enzimas que degradan la célula vegetal. Los microorganismos capaces de realizar esta
biotransformación fueronBacilosp.,Escherichia coli, Streptomycessp.,Termomicessp., Quetomiosp.,
poliporosp.,Pycnoporussp.,Trametessp.,Miceliofterasp.,rizomucorsp., cándidasp.,Aspergilosp.,
trichodermasp., yMucorsp. (Patente, 2011, US 2011/0318805 A1: Transformación microbiana de vainas
de vainilla usadas, Estados Unidos). Además, también se ha producido vainillina sintetizada
artificialmente a partir de varios subproductos industriales.Barbosa et al. (2008)preparó un sistema de
residuos de coco con cepas dePhanerochaete chrysosporium (moho). Como resultado de la
biotransformación obtuvieron 44,4 μg de vainillina por gramo de residuo en 24 h de fermentación.
Pero, con un pretratamiento previo del coco mediante secado al sol y prensado mecánico, el
rendimiento de vainillina aumentó a 52,5 μg de vainillina por gramo de residuo. Considerando el costo
de extracción y curado de la vainilla natural, el beneficio económico de este proceso es bastante
prometedor.

49.5.2 Utilización de enzimas para mejorar el sabor umami

Umami es reconocido como el quinto sabor básico después de dulce, amargo, agrio y salado y se
caracteriza por un sabor salado que está naturalmente presente en muchos alimentos de origen vegetal y
animal. Debido a su sabor salado, el umami tiene el potencial de reducir la ingesta de sodio en la dieta, lo
que hace que el alimento tenga un sabor más rico y reduce la ingesta de grasas y sal (Imada et al., 2014;
Miyaki et al., 2016). Se sabe que las setas son ricas en proteínas (Kalac, 2013) mientras que contiene
cantidades significativas de ácido glutámico y aspártico libre, que provocan el sabor umami (Zhang et al.,
2013). Para mejorar el contenido de aminoácidos libres que contribuyen al sabor, estas proteínas deben
hidrolizarse. Flavourzyme contiene ambosendo- yexo-Actividades de peptidasa que son adecuadas para
producir mayores cantidades de aminoácidos libres al mismo tiempo que producen aminoácidos activos en
el sabor y péptidos a partir de proteínas (Berends et al., 2014;Merz et al., 2015). En consecuencia, el
tratamiento de los hongos con la enzima β-glucanasa que degrada la pared celular y la proteasa
Flavourzyme mejoró significativamente el umami y otros aminoácidos libres que contribuyen al sabor.
Poojary et al., 2017). Durante mucho tiempo, los calamares se han utilizado en platos salados como
potenciadores del sabor. También se ha informado que la cabeza del calamar seco, obtenida como un
subproducto de la industria de bocadillos de calamar seco, contiene un rico contenido de proteínas y una
alta cantidad de aminoácido umami y ácido glutámico (7,45 mg/100 mg). La hidrólisis enzimática de la
cabeza de calamar seca también se logró al pH y la temperatura óptimos para producir un hidrolizado de
proteína funcional con sabor usando Flavourzyme (Sukkhown et al., 2017). La liofilización del hidrolizado
conserva aún más la propiedad antioxidante, así como los compuestos volátiles que enriquecen el sabor.
Además, la hidrólisis de algas (Gracilariasp.) mediante el uso de la enzima bromelina también se obtienen
péptidos con sabor a pescado (que tienen aminoácidos de arginina, lisina y leucina) (Laohakunjit et al., 2014).
854 49. PERSPECTIVAS FUTURAS PARA LAS TECNOLOGÍAS ENZIMÁTICAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA

49.5.3 Hidrolizados enzimáticos de proteínas de pescado como potenciadores del sabor

Amplios estudios han demostrado que los hidrolizados de proteína de pescado tienen buenas
propiedades nutricionales y, por lo tanto, pueden usarse ampliamente en la industria alimentaria para
diversos fines. Estos incluyen texturización, gelificación, formación de espuma, emulsificación, suplementos
proteicos, potenciadores del sabor, producción de surimi y estabilizadores de bebidas (Kristinson, 2007). La
hidrólisis enzimática es más conveniente y productiva en comparación con la hidrólisis química (Witono y
Kang, 2010). Los hidrolizados de bibisán de pescado producidos enzimáticamente también tienen una
excelente capacidad de retención de agua debido a la mayor concentración de grupos polares (carboxilo,
COOH y amida, grupos NH2) generados por la hidrólisis enzimática (Kristinsson y Rasco, 2000;Wasswa et al.,
2008). La fuente económica de enzimas proteasas extraídas de las plantas Biduri (Calotropis gigantea)
utilizado en Indonesia es una biomolécula prometedora para la hidrólisis enzimática. Se demostró su
aplicación como potenciador del sabor y se enriqueció en sustratos inferiores de pescado al hacer sinergia
con papaína y cisteína (Witono et al., 2011). Para mejorar las propiedades funcionales de las proteínas, se ha
empleado ampliamente la modificación enzimática en la hidrólisis del sustrato. La mayor actividad de la
papaína tiende a aumentar los grupos de amina primaria magnificando las proteínas de cadena corta. La
hidrólisis enzimática del bibisán de pescado mediante el uso de la enzima proteasa de la planta biduri y la
papaína también resultó en la formación de hidrolizados de proteínas con un bajo contenido de humedad (9
%–10 %), el menor contenido de lípidos (0,03 %) y un alto contenido de proteína (63%–75%) (Witono et al.,
2014). La hidrolización de la proteína de pescado por la proteasa biduri y la papaína en una proporción de
70:30 en presencia del activador sistein (0,6 %) demostró además una buena actividad antioxidante
(alrededor del 7 %). Esto se debió a la capacidad de eliminar los radicales lipídicos, disminuir el nivel de
ranciedad y la solubilidad de las proteínas y generar péptidos bioactivos (1,2 g/100 g) y el potenciador del
sabor glutamato (0,04 g/100 g) (Mananda et al., 2016).

49.5.4 Formación de aminoácidos activos en el sabor, derivados de aminoácidos y

péptidos en fermentaciones de alimentos

La mayoría de los alimentos fermentados se valoran por su rico y específico olor y sabor (Hutkins,
2008). Los aminoácidos con sabor activo, sus derivados y sus péptidos se generan durante la
fermentación de alimentos en pan, queso, salsa de soja y carnes fermentadas mediante proteólisis o
autólisis. Los péptidos imparten particularmente el sabor umami (p. ej., péptidos de α-glutamil) o
sabor amargo (p. ej., péptidos que contienen prolina hidrofóbica) (Zhao et al., 2016). Los ejemplos
comunes de derivados de péptidos con sabor activo incluyen péptidos de γ-glutamil, péptidos de piro-
glutamil y aminoácidos succinilo o lactoil. El ácido piroglutámico se puede liberar del extremo N de
proteínas y péptidos mediante la acción de una enzima específica, la l-piroglutamilpéptido hidrolasa (
Mucchetti et al., 2000). También se ha informado que los succinil aminoácidos como suc-Arg y suc-Glu,
obtenidos del catabolismo de la arginina o de la actividad fúngica de la succinil transferasa, imparten
el sabor umami.Frerot y Chen, 2013). En el caso de la fermentación de la carne y la masa madre, las
enzimas endógenas de la carne y los cereales determinan la proteólisis (Ganzle et al., 2008;Ordóñez et
al., 1999). Durante la producción de jamón y embutidos, las enzimas endógenas de la carne, como las
dipeptidil peptidasas (DPP) y la catepsina B, contribuyen principalmente al proceso de proteólisis (
Ordóñez et al., 1999;Sentandreu et al., 2003). Sin embargo, a medida que el jamón envejece y madura,
el contenido de aminoácidos o dipéptidos Met, Asn e Ile como Ile-Val, Leu-Gly, Ile-Asp y Pro-Leu
aumenta debido a la altaendo-actividad peptidasa e imparte amargor (Sentandreu et al., 2003;
 REFERENCIAS 855
Sforza et al., 2006). En los alimentos fermentados, el glutamato resulta de la proteólisis o actividad de
la glutaminasa, que imparte el sabor umami o salado, si la concentración de glutamato en los
productos alimenticios está por encima del umbral de sabor de aproximadamente 1 mM. Se ha
informado que la γ-glutamil transferasa (GGT) obtenida deBaciloyAspergiloconvierte la glutamina
presente en la salsa de soja en glutamato y proporciona así el sabor salado específico de la salsa de
soja (Ito et al., 2013; Lioe et al., 2010;Minami et al., 2003a,b). En el caso de la maduración del queso, se
evaluó el amargor del queso sobre el parámetro de niveles desequilibrados de proteolisis y
peptidolisis por enzimas proteinasas de bacterias ácido lácticas (LAB) (Fallico et al., 2005). Los factores
que contribuyen al sabor específico del queso son los aminoácidos (como el glutamato), los péptidos
pequeños y los derivados de aminoácidos como los aminoácidos piroglutamil y lactoil (Andersen et al.,
2010; Drake et al., 2007).

49.6 CONCLUSIÓN

La incorporación de biocatalizadores en las industrias de alimentos y piensos ha

fomentado varios enfoques y mejorado las diversas propiedades de los alimentos, así como
las técnicas para la fabricación y procesamiento de productos alimenticios. Hasta ahora, las
mejoras todavía están en progreso para el diseño adicional de enzimas nuevas y
mejoradas. Se han confirmado esfuerzos diversificados en la mejora de enzimas para
sostener su estructura-función-actividad en relación con factores ambientales agresivos y
variables (como temperatura, pH, solventes orgánicos, iones metálicos, agentes
inhibidores) de las condiciones del biorreactor. La utilización de enzimas purificadas sin
cultivo de microbios también es un avance en otros procedimientos posteriores; también
elimina el riesgo de contaminación microbiana en el procesamiento de alimentos. Con los
avances en las herramientas biotecnológicas como la ingeniería genética,

Las mejoras perpetuas en las técnicas de inmovilización de enzimas también han sido un factor de
apoyo clave para el uso eficiente de las enzimas; también pretenden hacer que el proceso sea más
económico. Los intentos convincentes en la implementación de metodologías de detección, alto
rendimiento y procedimientos automatizados también demuestran la caracterización oportuna y
eficiente de los biocatalizadores y una producción a gran escala más refinada de los productos. Por lo
tanto, se puede anticipar que los esfuerzos significativos realizados hacia las tecnologías de enzimas
han ampliado nuestro conocimiento y continúan expandiéndose aún más.

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