MATERIALES

Utilizaron:

- ShetA2 que lo obtuvieron sintetizado por Cayman Chemical Company, Inc.

- También usaron manteca de cacao
- Kolliphor HS15
- Solución salina estéril
- Isoflurano
- Acetonitrilo
- Metanol
- Ácido fosfórico
- Ácido clorhídrico
- Tinción de cristal violeta
- Sodio el trihidrato de acetato

EQUIPO

- En el proceso de extracción de medicamentos de los tejidos utilizaron el equipo de

filtración Captiva®
INSUMOS

- Kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de ciclina D1 de ratón

- Reactivo de extracción de proteínas tisulares (T-PER)
- Tabletas de cóctel de inhibidores de la proteasa

Fabricación de supositorios y control de calidad

Los supositorios de SHetA2 (15, 30 y 60 mg/kg de peso corporal) se fabricaron mediante el
método de moldeo por fusión. Brevemente, el fármaco se disolvió en Kolliphor HS15 derretido
y luego se combinó con la manteca de cacao. Luego, esta mezcla se vertió en moldes de
supositorios hechos a medida y se dejó solidificar. Se evaluó la uniformidad

- Contenido de todos los supositorios (85 %-115 %)

- Variación de peso (no más de 2 unidades con una [RSD] superior al 7,8 %)
- Tiempo de ablandamiento (menos de 30 min).

Animales
Usaron ratones hembra Friend Leukemia Virus B (FVB) de 7 semanas de edad, fueron alojados
en una habitación a temperatura constante a 22°C ± 1°C, ciclo de luz de 12h/ oscuridad de 12h y
acceso continuo a alimentos y agua ad libitum.
Sincronizaron a los ratones por medio de un ciclo estral modificado para que la absorción del
fármaco desde la cavidad vaginal no varie. El ciclo estral lo controlaron diariamente en todos
los ratones por medio de la observación de la composición de las células obtenidas en el lavado
vaginal, recogido el liquido se ubico en un portaobjetos, se los secaron al aire y se tiñeron con
cristal violeta, posterior fueron examinados en un microscopio Olympus FV donde
determinaron las morfologías de las células y las etapas del ciclo se determinaron por el tipo de
células observadas.
Estudio farmacocinético
Los ratones en la etapa de diestro de su ciclo estral se asignaron a un grupo de tratamiento para
recibir una dosis de 15, 30 o 60 mg/kg. Los ratones en los grupos de 15 y 30 mg/kg recibieron
un solo supositorio que contenía esa dosis, mientras que los ratones en la dosis de 60 mg/kg
recibieron dos supositorios de 30 mg/kg.
Para mayor facilidad de administración de los supositorios se sedaron ligeramente a los ratones
con isoflurano durante 3 min en posición horizontal puesto que era tiempo suficiente para la
absorción, luego fueron transferidos a una jaula limpia forrada con papel y observados 10 min
por que exista cualquier posible fuga del ovulo de color amarillo. Después de la dosificación,
los ratones (n = 5, por grupo y por punto de tiempo) fueron sacrificados a las 0,5, 1, 4, 8, 12, 24,
36, 48 y 72 h.
En el tratamiento oral, prepararon una suspensión de SHetA2 mediante la homogeneización de
una cantidad pesada del fármaco en una solución de Kolliphor al 30 %, teniendo una dosis de 60
mg/kg. Ratones (n = 5, por grupo y por punto de tiempo) fueron dosificados con la suspensión
por sonda oral y sacrificados a las 0,5, 1, 4 y 8 h después de la dosificación.
La sangre se recogió por punción cardíaca en tubos heparinizados y el plasma se separó por
centrifugación (12.000 rpm durante 10 min). Recogieron los tejidos ginecológicos (cuello
uterino, cuernos uterinos y ovarios) de todos los ratones que recibieron tratamientos vaginales y
orales y se limpiaron minuciosamente con solución salina para eliminar el fármaco amarillo no
absorbido. El plasma y los tejidos ginecológicos se congelaron a 80°C instantáneamente en
nitrógeno líquido para evitar la difusión adicional ex-vivo del fármaco a los tejidos adyacentes
hasta su análisis.
A ratones adicionales se les administró un supositorio de placebo para que sirvieran como
controles adicionales para el punto final de PD. Los supositorios vaginales placebo se
prepararon solo con manteca de cacao y Kolliphor, mientras que el placebo para el grupo que
recibió la dosis oral consistió en una solución de Kolliphor al 30 % en agua desionizada. Fueron
sacrificados a las 0,5 h (n = 3, por grupo) y a las 72 h (n = 3, por grupo) después de recibir la
dosis y se recolectó el tejido del cuello uterino, se lavó con solución salina y se mantuvo
congelada a 80°C hasta el análisis.
MATERIALES
Utilizaron:

- ShetA2 que lo obtuvieron sintetizado por Cayman Chemical Company, Inc.

- También usaron manteca de cacao
- Kolliphor HS15
- Solución salina estéril
- Isoflurano
- Acetonitrilo
- Metanol
- Ácido fosfórico
- Ácido clorhídrico
- Tinción de cristal violeta
- Sodio el trihidrato de acetato

Fabricación de supositorios y control de calidad

Los supositorios de SHetA2 (15, 30 y 60 mg/kg de peso corporal) se fabricaron mediante el
método de moldeo por fusión, donde el fármaco se disolvió en Kolliphor HS15 derretido y se
combinó con la manteca de cacao. Luego, esta mezcla se vertió en moldes de supositorios
hechos a medida y se dejó solidificar. Se evaluó la uniformidad

- Contenido de todos los supositorios (85 %-115 %)

- Variación de peso (no más de 2 unidades con una [RSD] superior al 7,8 %)
- Tiempo de ablandamiento (menos de 30 min).

Animales
Usaron ratones hembra Friend Leukemia Virus B (FVB) de 7 semanas de edad, fueron alojados
en una habitación a temperatura constante a 22°C ± 1°C, ciclo de luz de 12h/ oscuridad de 12h y
acceso continuo a alimentos y agua ad libitum.
Sincronizaron a los ratones por medio de un ciclo estral modificado para que la absorción del
fármaco desde la cavidad vaginal no varie. El ciclo estral lo controlaron diariamente en todos
los ratones por medio de la observación de la composición de las células obtenidas en el lavado
vaginal, recogido el liquido se ubico en un portaobjetos, se los secaron al aire y se tiñeron con
cristal violeta, posterior fueron examinados en un microscopio Olympus FV donde
determinaron las morfologías de las células y las etapas del ciclo se determinaron por el tipo de
células observadas.
Estudio farmacocinético
Los ratones en la etapa de diestro de su ciclo estral se asignaron a un grupo de tratamiento para
recibir una dosis de 15, 30 o 60 mg/kg. Los ratones en los grupos de 15 y 30 mg/kg recibieron
un solo supositorio que contenía esa dosis, mientras que los ratones en la dosis de 60 mg/kg
recibieron dos supositorios de 30 mg/kg.
Para mayor facilidad de administración de los supositorios se sedaron ligeramente a los ratones
con isoflurano durante 3 min en posición horizontal puesto que era tiempo suficiente para la
absorción, luego fueron transferidos a una jaula limpia forrada con papel y observados 10 min
por que exista cualquier posible fuga del ovulo de color amarillo. Después de la dosificación,
los ratones (n = 5, por grupo y por punto de tiempo) fueron sacrificados a las 0,5, 1, 4, 8, 12, 24,
36, 48 y 72 h.
En el tratamiento oral, prepararon una suspensión de SHetA2 mediante la homogeneización de
una cantidad pesada del fármaco en una solución de Kolliphor al 30 %, teniendo una dosis de 60
mg/kg. Ratones (n = 5, por grupo y por punto de tiempo) fueron dosificados con la suspensión
por sonda oral y sacrificados a las 0,5, 1, 4 y 8 h después de la dosificación.
La sangre se recogió por punción cardíaca en tubos heparinizados y el plasma se separó por
centrifugación (12.000 rpm durante 10 min). Recogieron los tejidos ginecológicos (cuello
uterino, cuernos uterinos y ovarios) de todos los ratones que recibieron tratamientos vaginales y
orales y se limpiaron minuciosamente con solución salina para eliminar el fármaco amarillo no
absorbido. El plasma y los tejidos ginecológicos se congelaron a 80°C instantáneamente en
nitrógeno líquido para evitar la difusión adicional ex-vivo del fármaco a los tejidos adyacentes
hasta su análisis.
A ratones adicionales se les administró un supositorio de placebo para que sirvieran como
controles adicionales para el punto final de PD. Los supositorios vaginales placebo se
prepararon solo con manteca de cacao y Kolliphor, mientras que el placebo para el grupo que
recibió la dosis oral consistió en una solución de Kolliphor al 30 % en agua desionizada. Fueron
sacrificados a las 0,5 h (n = 3, por grupo) y a las 72 h (n = 3, por grupo) después de recibir la
dosis y se recolectó el tejido del cuello uterino, se lavó con solución salina y se mantuvo
congelada a 80°C hasta el análisis.