1.

REACTIVIDAD CRUZADA DE LAS PROTEÍNAS DE Mycobacterium smegmatis CON SUEROS

POSITIVOS A TUBERCULOSIS BOVINA
2. AUTORES
quevedo Rocha Gilberto1quevedo-10@live.com.mx, Gaxiola Camacho Soila Maribel2
soilagaxiola@uas.edu.mx, Enríquez Verdugo Idalia enver@uas.edu.mx, Castro Del Campo Nohemí2
2

ncastro@uas.edu.mx, Barraza Tizoc Claudia Leonor2 clavob@uas.edu.mx, Jesús Daniel Solís Carrasco2
daniel.solis@uas.edu.mx
1
Docente Investigador Centro de Bachillerato Tecnológico Agropecuario (CBTA) 261. 2PITC Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa. *Autor de correspondencia:
Gaxiola Camacho Soila Maribel. Blvd. San Ángel 3886, Mercado de Abastos, San Benito, 80260.
6677181650. Culiacán de Rosales, Sinaloa, México.

3. PALABRAS CLAVE
BCG, M tuberculosis, M smegmatis, M bovis, Reactividad Cruzada

4. INTRODUCCIÓN.
El éxito de Mycobacterium tuberculosis como patógeno deriva de su fácil adaptación al medio intracelular
de los macrófagos humanos (1) La patogénesis de Mycobacterium tuberculosis depende de la secreción
de factores clave de virulencia y de su capacidad de sobrevivir en los macrófagos. Al estar atrapadas en
el interior de las células del hospedero M. tuberculosis debe responder a las condiciones de carencia de
nutrientes, lo cual implica la inducción de determinadas proteínas, las cuales dependen del tipo de
nutriente limitado (2), en respuesta a esta sobrevivencia al agotamiento de nutrientes se incrementa la
patogenicidad (3), donde se demostró la síntesis del antígeno b de 38 kDa el cual se induce en restricción
de fosfato y está involucrada en el metabolismo del fosfato en M. tuberculosis (4); además de la
consecuente generación de antígenos, las funciones metabólicas sirven para la adaptación a las
condiciones cambiantes producen variación en la antigenicidad de las micobacterias patógenas (5).
Mientras que las micobacterias avirulentas como M. smegmatis, en un esfuerzo por sobrevivir a las
condiciones hostiles, pueden presentar una respuesta similar a M. tuberculosis en los hospederos sin
prosperar por largos periodos, pues las enzimas ortólogas no están adaptadas para responder a las
condiciones imperantes. La virulencia de M. tuberculosis le permite evadir el TNF-α de los macrófagos, la
cual tiene una relación inversamente proporcional en las micobacterias apatógenas como M. smegmatis,
M. tuberculosis H37Ra y M. bovis BCG (6). Sin embargo, la actividad metabólica de las micobacterias
como M. smegmatis es similar a las del complejo M. tuberculosis (7), existen diferencias muy marcadas
donde se han probado los cambios conformacionales dependientes del pH de MtbESAT-6 y MsESAT-6,
en condiciones de pH ácido, MtbESAT-6 experimenta un cambio conformacional significativo, que se
caracteriza por una mayor hidrofobicidad expuesta a disolvente, mientras que MsESAT-6 muestra poco
cambio conformacional en respuesta a la acidificación, demostrando que MtbESAT-6 posee una única
actividad de interacción de la membrana que no se encuentra en MsESAT-6 y estableció la utilidad de
rigurosos enfoques bioquímicos en la disección de la virulencia de M. tuberculosis (8), sin embargo en
condiciones de limitación de nutrientes específicamente el fosforo si expresa el gen esat-6 (9). Aunado a
todos estos acontecimientos se determinarán los grupos de proteínas expresadas en limitante de fósforo
de M. smegmatis las cuales presentan reactividad cruzada con sueros de bovino positivos a tuberculosis.

5. DESARROLLO
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Parasitología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Autónoma de Sinaloa.
Preparación de los medios de cultivo:
Medio sólido 7H9 Middlebrook Broth (Difco TM), y Agar Bacto complementado con Tween 80 al 0.05%
(v/v) y 0.2% de glicerol.
Hartman’s de Bont (HdB): La preparación se adicionó 2.0 g de (NH4)2SO4, por Litro-1 (la concentración
final de 15 mM); glicerol 27.4 mM (0.2%, vol/vol); K2HPO4 a 8.9 mM (1.55 g por Litro-1) y NaH2PO47.08
mM (0.85 g Litro-1) y (vol/vol) 0.05% de tween 80 y 10 ml de una fuente de elementos traza (en 965 mL
de H2O destilada: (EDTA [0.01 g], MgCl2•6H2O [0.1 g], CaCl2•2H2O [1 mg], NaMoO4•2H2O [0.2 mg],
CoCl2•6H2O [0.4 mg], MnCl2•2H2O [1 mg], ZnSO4•7H2O [2 mg], FeSO4•7H2O [5 mg], CuSO4•5H2O

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[0.2 mg]), pH 7.0, para el experimento limitado 100X menor en Pi (HDB<Pi) se adicionó K 2HPO4 a una
concentración final de 8.90 mM (15.5 mg L-1) y NaH2PO4 a una concentración de 7.08 mM (85 mg L-1.)
para reemplazar la pérdida de capacidad amortiguadora se agregó ácido propanolsulfonico 3-(N-
morfolino) (MOPS) 50 mM (10).
Crecimiento de la bacteria:
La cepa de M. smegmatis (de campo mc2 155), se cultivó en un medio sólido 7H9 Middlebrook Broth, las
placas se incubaron a 37ºC por 3 días en un agitador orbital a (250 rpm) en frascos en medio de cultivo
líquido por triplicado; el crecimiento se llevó a media fase logarítmica, con una densidad óptica de 0.6-0.8
(OD600) en (densitómetro Fisher Scientific). De este medio de cultivo se tomó una alícuota de 100 µl
donde las bacterias se transfirieron a 150 ml de medio de cultivo HdeB con y sin fósforo; se creció y se
incubó a 37ºC en agitación a 250 rpm por 96 h.
Obtención de proteínas:
Se obtuvo el paquete celular bacteriano por centrifugación a 4000 rpm/10 min, y el sobrenadante se
precipitó en alcohol absoluto 1:1, por 24 h a -70°C. Después se centrifugaron a 20000 rpm 90 min a 4°C
para extraer las proteínas del sobrenadante. El concentrado de proteínas, se suspendió en solución
amortiguadora de fosfatos (PBS) y EDTA. La concentración de proteínas se realizó con curva de
calibración y se determinó por el método de Bradford (1976).
Detección de proteínas de reacción cruzada (Inmuno dot: (dotblot)):
Para detectar la reacción cruzada de las proteínas antigénicas obtenidas de sobrenadante como
precipitado, se gotearon 15 µg a una membrana de nitrocelulosa, y se incubó en leche descremada al 5%
(Difco BD®) en 0.05% de PBS-Tween 20 (PBS-T), por 1 h a temperatura ambiente, la membrana se lavó
con PBS-T 3 veces por 10 min y se incubaron cada una con sueros de bovinos positivos a tuberculosis
(30) durante la noche a 4°C. Las membranas se lavaron 3 veces por 10 min en PBS-T. Posteriormente,
las membranas se incubaron con proteína A conjugada con peroxidasa por 2 h y se lavaron 3 veces, por
10 min, con PBS-T. La reacción antígeno-anticuerpo fue revelada con peróxido de hidrógeno.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las proteínas antigénicas expresadas por M. smegmatis crecidas con limitación de fósforo se observa en
la figura 1, donde el suero de animales positivos a tuberculosis bovina (30) reconocen fuertemente a
estas proteínas y cuando las proteínas se expresan con todos los nutrientes no se observa reacción
antigénica, esto sugiere las proteínas antigénicas expresadas en limitantes de fósforo incrementa la
patogenicidad de esta bacteria, de forma similar a lo descrito por Groat y colaboradores en 1986, donde
describen a M. tuberculosis responde a las condiciones de carencia de nutrientes, lo cual implica la
inducción de determinadas proteínas, las cuales dependen del tipo de nutriente limitado y en respuesta a
esta sobrevivencia al agotamiento de nutrientes la cual incrementa la patogenicidad; además, Andersen y
colaboradores en 1990, describen la síntesis del antígeno b de 38 kDa el cual se induce en restricción de
fosfato y está involucrada en el metabolismo del fosfato en M. tuberculosis. Además, las proteínas
antigénicas limitadas en fósforo se pueden utilizar en la aplicación para la detección de la tuberculosis
bovina.

FIG. 1.- Reacción de Proteínas de M. smegmatis con sueros de bovinos positivos a Tuberculosis. Parte
superior, reacción antígeno anticuerpo con proteínas en limitante de fósforo(Positivo). Parte inferior,
reacción antígeno anticuerpo con proteínas con todos los nutrientes (Negativo).

7. CONCLUSIÓN
Las proteínas de M. smegmatis expresadas con limitante de fósforo son antigénicas y produce una
reacción cruzada al reconocer a sueros de bovinos positivos a tuberculosis, indicando su aplicación en el
diagnóstico de esta enfermedad.

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 8. LITERATURA CITADA.
1. Mehrotra P, Jamwal SV, Saquib N Md, Sinha N, Siddiqui Z, Manivel V. 2014
Pathogenicity of Mycobacterium tuberculosis is expressed by regulating metabolic thresholds of
the host macrophage, PLoS Pathogens. 10.7 (July 2014).
2. Groat RG, Schultz JE, Zychlinsky E, Bockman A, Matin A. 1986 Starvation proteins in Escherichia
coli: kinetics of synthesis and role in starvation survival. Journal of bacteriology.;168(2):486-93.
3. Siegele DA, Kolter R. Life after log. Journal of bacteriology. 1992;174(2):345-8
4. Andersen AB, Ljungqvist L, Olsen M. Evidence that protein antigen b of Mycobacterium
tuberculosis is involved in phosphate metabolism. Journal of general microbiology.
1990;136(3):477-80. Epub 1990/03/01.
5. Brodinet P, Rosenkrands I, Andersen P, Cole ST, Brosch R. ESAT-6 proteins: protective antigens
and virulence factors? Trends in microbiology. 2004;12(11):500-8.
6. Falcone V, Collins F. Growth of recombinant Mycobacterium tuberculosis H37Ra in mouse
macrophages. Clinical and experimental immunology. 1997;109(1):80-3.
7. Reyrat JM, Kahn D. Mycobacterium smegmatis: an absurd model for tuberculosis? Trends in
microbiology. 2001;9(10):472-4. Epub 2001/10/13.
8. De Leon J, Jiang G, Ma Y, Rubin E, Fortune S, Sun J. 2012. Mycobacterium tuberculosis ESAT-6
exhibits a unique membrane-interacting activity that is not found in its ortholog from non-
pathogenic Mycobacterium smegmatis. The Journal of biological chemistry. 287(53):44184-91.
9. López-Pérez HM, Velarde-Félix S, Enriquez-Verdugo I, Xicotencatl-Palacios R, Gaxiola-Camacho
SM. Adaptation of Mycobacterium smegmatis to nutrient depletion and its effect on esat-6
expression. Revista Mexicana de Ciencias Pecuarias. 2016;7(1):127-39.
10. Smeulders Marjan J, Keer Jacquie, Speight Richard A †, And. Williams Huw D. 1999. Adaptation
of Mycobacterium smegmatis to Stationary Phase Journal Of Bacteriology, 0021-9193/99. P. 270–
283.

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