Instituto Politécnico Nacional

Centro de Investigación en
Biotecnología Aplicada

MAESTRIA EN BIOTECNOLOGIA APLICADA

TESIS

ACOMPLEJAMIENTO Y MICROENCAPSULADO
DE BIXINA PARA EL DESARROLLO DE
COLORANTES HIDROSOLUBLES ESTABLES
DE GRADO ALIMENTICIO

PRESENTA

Rosita Flores Juárez

Tepetitla de Lardizábal, Tlaxcala, Junio 2018

1
 TESIS DIRIGIDA

Dra. María Myrna Solís Oba

Dr. Erik Ocaranza Sánchez

Comité Tutoral

M. en C. Lilia Tapia López

Dr. Marlón Rojas López
Dr. Víctor Eric López Y López

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3
4
5
AGRADECIMIENTOS

Doy gracias a Dios y a la vida por haberme permitido terminar.

A mis papas Juan y Carmen por todo su apoyo incondicional, son mi

mayor ejemplo de amor, perseverancia y trabajo.

Gracias mis hermanas y hermanos por su cariño, compañía y sus

palabras de aliento, los quiero mucho.

Gracias a mi compañero de vida Isaí, que siempre ha sido mi cómplice

y me ha apoyado incondicionalmente en cada momento, gracias amor,
gracias a mi pequeña hija Valentina, que desde que llego a mi vida me
ha enseñado a no darme por vencida sin antes luchar.

Agradezco el apoyo y compañía de Juanita y Rita, compañeras y

amigas de la maestría, hicierón que la estancia fuera más agradable.

Agradezco todo el apoyo brindado por el Dr. Erik Ocaranza, que con
su apoyo, su experiencia y su amistad he logrado terminar el posgrado
y me ha ayudado a crecer profesionalmente. También agradezco al
grupo de trabajo Colorantes, por su compañía, amistad y apoyo,
gracias a todos.

Le agradezco a CONACYT por la beca otorgada durante el posgrado,

agradezco a CIBA- IPN por haberme permitido ser parte de la familia
politécnica.

¡Muchas gracias a todos!

6
 ÍNDICE
RESUMEN ..............................................................................................................................................13
ABSTRACT..............................................................................................................................................15
I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................16
II. MARCO TEÓRICO ...........................................................................................................................18
2.1. Pigmento o Colorante............................................................................................................18
2.2. Colorantes naturales alimenticios .........................................................................................18
2.3. Clasificación de los colorantes ...............................................................................................18
2.4. Carotenoides .........................................................................................................................19
2.5. Bixina .....................................................................................................................................19
2.6. Estructura química de bixina .................................................................................................20
2.7. Biosíntesis de bixina ..............................................................................................................20
2.8. Usos y aplicaciones de bixina ................................................................................................21
2.9. Ventajas y desventajas de bixina ...........................................................................................22
2.10. Factores que afectan la estabilidad de los carotenoides ...................................................23
Temperatura ................................................................................................................................24
2.10.1. Mecanismos de estabilización de carotenoides .........................................................25
Microencapsulación .....................................................................................................................25
Complejo con metales..................................................................................................................27
III. ANTECEDENTES .........................................................................................................................28
3.1. Antecedentes directos ...........................................................................................................28
IV. JUSTIFICACIÓN...........................................................................................................................30
V. HIPÓTESIS ......................................................................................................................................30
VI. OBJETIVOS .................................................................................................................................31
6.1. Objetivo General ...................................................................................................................31
6.2. Objetivos Específicos .............................................................................................................31
VII. METODOLOGÍA..........................................................................................................................32
7.1. Manejo de las semillas de annatto ........................................................................................32
7.2. Análisis fisicoquímicos de las semillas ...................................................................................32
7.2.1. Determinación de humedad ........................................................................................32
7.2.2. Determinación de cenizas ...........................................................................................32
7.2.3. Determinación de proteína .........................................................................................33
7.2.4. Determinación de lípidos ............................................................................................33

7
 7.3. Raspelling de semillas ............................................................................................................34
7.4. Método de extracción ...........................................................................................................34
7.4.1. Método de extracción por Soxhlet ..............................................................................34
7.4.2. Método de extracción por maceración .......................................................................34
7.5. Cuantificación de bixina por espectrofotometría ..................................................................35
7.6. Evaluación de la actividad antioxidante ................................................................................35
7.7. Identificación de bixina, por Cromatografía en capa fina ......................................................37
7.8. Análisis por HPLC ...................................................................................................................37
7.9. Acomplejamiento metálico ...................................................................................................37
7.10. Análisis mediante espectroscopia infraroja por transformada de Fourier (FTIR) ..............39
7.11. Microencapsulación, secado por aspersión ......................................................................39
7.12. Análisis de los microencapsulados.....................................................................................40
7.13. Evaluación del colorante bixina-metal microencápsulado en una bebida no alcohólica ...41
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................42
8.1. Objetivo 1: Establecer un método de extracción de bixina a partir de semillas de Bixa
orellana l. ..........................................................................................................................................42
8.1.1. Análisis proximal .........................................................................................................42
8.1.2. Raspelling: Obtención del polvo a partir de semillas enteras ..................................43
8.1.3. Extracción por maceración ..........................................................................................43
8.1.4. Extracción por soxhlet .................................................................................................44
8.1.5. Cuantificación de bixina por espectrofotometría.......................................................44
8.2. Evaluación de la actividad antioxidante ................................................................................45
8.3. Cromatografía en capa fina del polvo comercial, los extractos etanólico y aceite ................48
8.4. Análisis por HPLC ...................................................................................................................50
8.5. Objetivo 2: Establecer una metodología y evaluar la estabilización del cromóforo de bixina
mediante reacciones de acomplejamiento con sales metálicas de grado alimenticio como son
sulfato de cobre, sulfato de hierro y sulfato de zinc..........................................................................51
8.5.1. Complejo con Cu2+ Estabilidad a luz solar .....................................................................52
8.5.2. Complejo con Cu2+- Estabilidad al tratamiento térmico ............................................54
8.6. Cromatografía en capa fina TLC, de muestras con cobre ......................................................56
8.7. Espectros por FTIR .................................................................................................................57
8.8. Objetivo 3: Desarrollar la metodología de encapsulamiento del complejo seleccionado para
la generación de microemulsiones estables. .....................................................................................60
8.8.1. Microencapsulados ......................................................................................................60

8
 8.8.2. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados ......................................................61
8.8.3. Estabilidad a tratamiento térmico ..............................................................................63
8.9. Objetivo 4: Evaluar el color de una bebida formulada con el microencapsulado ..................64
IX. Resumen de resultados .............................................................................................................66
X. Conclusiones .................................................................................................................................68
XI. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................69
XII. Anexos .......................................................................................................................................74
12.1. Anexo 1. Curva patrón de Quercetina ...............................................................................74
12.2. Anexo 2. Curva patrón de Trolox .......................................................................................75
12.3. Anexo 3. Curva para determinar el IC50 del extracto etanólico ........................................76
12.4. Anexo 4. Curva para determinar el IC50 del estándar de bixina ........................................77
12.5. Anexo 5. Curva para determinar lC50 del polvo comercial ................................................78
12.6. Anexo 6. HPLC, curva patrón de bixina ..............................................................................79
12.7. Anexo 7. HPLC, curva patrón de norbixina ........................................................................80
12.8. Anexo 8. Espectros de HPLC ..............................................................................................81
12.8.1. Estandar de bixina, 3.5 mg ml-1 ...................................................................................81
12.8.2. Estandar de norbixina 0.8 mg ml-1 ..............................................................................81
12.8.3. Polvo comercial ............................................................................................................82
12.8.4. Polvo extracto por maceración ......................................................................................83
12.8.5. Polvo extracto por soxhlet ..............................................................................................83
12.9. Anexo 9. Acomplejamiento con Cu2+, Rx1, Rx2 y Rx3. .......................................................84
12.9.1. Cuantificación de bixina ..............................................................................................87
12.9.2. Estabilidad a luz solar ..................................................................................................88
12.10. Anexo 10. Acomplejamiento con Fe+3................................................................................91
12.10.1. Cuantificación de bixina...........................................................................................94
12.10.2. Estabilidad a luz solar ..............................................................................................95
12.10.3. Evaluación a tratamiento térmico ...........................................................................98
12.11. Anexo 11. Acomplejamiento con Zn2+ ...............................................................................99
12.11.1. Cuantificación de bixina.........................................................................................100
12.11.2. Estabilidad a luz solar ............................................................................................101
12.11.3. Estabilidad a tratamiento térmico ........................................................................103

9
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de bixina, R=COOCH₃…………………………………………..……………………….

18
Figura 2. Ruta de biosíntesis de bixina………………………………………………………………………. 19

Figura 3. Factores que afectan la estabilidad de los carotenoides ….…………………………..

21

Figura 4. Mecanismo de degradación térmica A= bixina B= m-xileno, C= C-17 ……………

22

Figura 5. Extracción de bixina con aceite de soya ………………………………………………………..

41
Figura 6. Estructura de hipolaetina, compuesto fenólico presente en semillas y
extractos de Bixa orellana…………………………………………………………………………………………… 45
Figura 7. Placas cromatográficas en capa fina, A: extracto etanólico, B: polvo
comercial, C: extracto por maceración…………………………………………………………………………. 47
Figura 8. TLC estándar de bixina (1), estándar de norbixina (2), polvo comercial (3),
extracto etanólico (4) y extracto en maceración (5) ……………………………………………………. 48

Figura 9. Espectro Uv- vis después de la reacción Rx4 con cobre ..………………………………..
50

Figura 10. Estabilidad a luz solar después de la reacción Rx4 con cobre . …………………….
51

Figura 11. Estabilidad a luz solar Rx4 cobre, proporción (1:2) ………………………………………
52

Figura 12. Retención de color después del tratamiento térmico, Rx3 y Rx4 …..……………..
53
Figura 13. TLC del estándar de bixina (1), polvo comercial (2), extractos etanólicos
de bixina (3 y 4), muestras del tratamiento Rx4, (1:2)= (5), (3:1)= (6), (1:1)= (7),
control= (8 ) …..…………………………………………………………………………………………………………… 54
Figura 14. Espectro FTIR: Estándar de bixina (ES), Polvo comercial (PC), Extracto
etanólico (EXL)…………………………………………………………………………………………………………..… 55
Figura 15. Espectro FTIR: Comparación de la muestra (1:2) vs Estándar de bixina
(ES), Polvo comercial (PC) y el control (CO) de la reacción Rx4……………………………………
57

Figura 16. Espectro FTIR: Zoom en la zona de 1600 a 1800 cm -1……………………………….

57

Figura 17. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados………………………………………..

59

Figura 18. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados………………………………………..

60

10
Figura 19. Retención de color después del tratamiento térmico de los
microencapsulados…………………………….……………………………………………………………………….. 61

Figura 20. Muestras encapsuladas antes y después del tratamiento térmico…………..….

61
Figura 21. Comparación de color de bebidas formuladas con el
microencapsulado…………………………………………………………………………………. 63

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Ventajas y desventajas del uso de la bixina ....………………………………………………

20
Tabla 2. Condiciones y proporciones utilizadas para acomplejamiento metálico……….. 36

Tabla 3. Relación bixina- encapsulante utilizadas………………………………………………………

37
Tabla 4. Determinación proximal de semillas de annatto y comparación con
literatura…………………………………………………………………………………………………………………….. 40

Tabla 5. Características de los extractos etanólico y por maceración…………………………..

43

Tabla 6. Comparación de IC50, estándares y muestras de bixina…………………………………

44

Tabla 7. Concentraciones de bixina y norbixina……………………………………………………………

49

Tabla 8. ANOVA de las muestras de la Rx4 con cobre………………………………………………….

51
Tabla 9. Microencapsulado, humedad, cuantificación de bixina y eficiencia de
encapsulación……………………………………………………………………………………………………………… 58

Tabla 10. Coordenadas del colorímetro, bebidas con microencapsulados……………………

62

11
 ÍNDICE DE FIGURAS ANEXOS

Figura 1.Curva patrón de quercetina…………………………………………………………………………….. 72

Figura 2. Curva patrón de trolox……………………………………………………………………………………. 73
Figura 3. Porcentaje de inhibición antioxidante del extracto etanólico………………………….. 74
Figura 4. Porcentaje de inhibición antioxidante del estándar de bixina…………………………. 75
Figura 5. Porcentaje de inhibición antioxidante del polvo comercial……………………………… 76
Figura 6. Curva patrón de bixina, HPLC…………………………………………………………………………. 77
Figura 7. Curva patrón, norbixina………………………………………………………………………………….. 78
Figura 8. Espectro de HPLC del estándar de Bixina………………………………………………………… 79
Figura 9. Espectro de HPLC del estándar de norbixina…………………………………………………… 80
Figura 10. Espectro de HPLC del estándar de polvo comercial (PC)………………………………… 80
Figura 11. Espectro de HPLC del estándar de polvo extracto por maceración………………… 81
Figura 12. Espectro de HPLC del extracto por soxhlet……………………………………………………. 81
Figura 13a. Espectro UV-vis Rx1…………………………………………………………………………………… 82
Figura 13b. Espectro UV-vis Rx2…………………………………………………………………………………… 83
Figura 13c. Espectro UV-vis Rx3…………………………………………………………………………………… 83
Figura 13d. Espectro UV-vis Rx3…………………………………………………………………………………… 84
Figura 14. Concentraciones después del tratamiento con CuSO₄…………………………………… 85
Figura 15. Concentraciones después de Rx1 con cobre………………………………………………….. 86
Figura 16. Estabilidad a luz solar Rx1 cobre…………………………………………………………………… 87
Figura 17. Estabilidad a luz solar después de Rx2 con cobre…………………………………………. 87
Figura 18. Estabilidad a luz solar Rx1 cobre…………………………………………………………………… 81
Figura 19. Estabilidad a luz solar después de Rx3 con cobre…………….…………………………… 88
Figura 20. Estabilidad a luz solar Rx3 cobre…………………………………………………………………… 89
Figura 21 a. Espectro UV-vis de la Rx1 con Fe3+.…………………………………………………………… 90
Figura 21b. Espectro UV-vis de la Rx2 con Fe3+.…………………………………………………………… 90
3+
Figura 21c. Espectro UV-vis de la Rx3 con Fe .…………………………………………………………… 91
Figura 21d. Espectro UV-vis de la Rx4 con Fe3+ .…………………………………………………………… 91
Figura 22. Concentración de bixina antes y después de la reacción de estabilización con
FeSO₄.…………………………………………………………….……………………………………………………… 93

Figura 23. Resistencia a luz solar de la reacción Rx1, con Fe 3+.……………………………………..

94
3+
Figura 24. Resistencia a luz solar de la reacción Rx2, con Fe .…………………………………….. 95
Figura 25. Resistencia a luz solar de la reacción Rx4, con Fe 3+ .…………………………………….. 95
Figura 26. Porcentaje de retención de color después del tratamiento térmico. 96
Figura 27a. Espectro UV- vis de Rx3 con Zn3+.……………………………………...……………………….. 97
Figura 27b. Espectro UV- vis de Rx4 con Zn3+.……………………………………...……………………….. 98

12
Figura 28. Concentración de bixina antes y después de la reacción de estabilización con
Zn3+.……………………………………...………………………...……………………………………...…………………….. 99
3+
Figura 29. Estabilidad a luz solar de la reacción, Rx3 muestras con Zn ………………………… 100
Figura 30. Estabilidad a luz solar de la reacción Rx4, muestras con Zn 3+………………………… 100
Figura 31. Porcentaje de retención de color después del tratamiento térmico. ………………. 102

ÍNDICE TABLAS ANEXOS

Tabla 1. Porcentaje de inhibición de quercetina. ……………………………………...…………………… 72

Tabla 2. Porcentaje de inhibición antioxidante de trolox. ……………………………………...……… 73
Tabla 3. Porcentaje de inhibición antioxidante del extracto etanólico. ………………………….. 74
Tabla 4. Porcentaje de inhibición del estándar de bixina. ……………………………………...……… 75
Tabla 5. Porcentaje de inhibición del polvo comercial. ……………………………………...………….. 76
Tabla 6. Curva de bixina, HPLC……………………………………...………………………………………………. 77
Tabla 7. Curva de norbixina, HPLC ……………………………………...………………………………………… 78
Tabla 8. Valores de F y Ft del ANOVA, gráficos de resistencia a luz solar………………………… 94
Tabla 9. Valores de F y Ft del ANOVA, gráficos de resistencia a luz solar………………………… 101

13
 RESUMEN

El estudio del acomplejamiento y microencapsulado de bixina para la generación de

colorantes de origen natural, estables y de grado alimenticio es de relevancia en la industria
de alimentos, porque en la actualidad se demandan productos que contengan ingredientes
naturales y que aporten algún beneficio a la salud. Debido a que en diversos estudios se ha
encontrado que los colorantes artificiales tienen efectos perjudiciales a la salud, y por
consecuencia algunos han sido prohibidos en diversos países, por lo que se han buscado
diversas fuentes para la obtención de colorantes naturales como: raíces, semillas, frutos,
microorganismos y animales; sin embargo dada la naturaleza de estos, su aplicación es
restringida debido a su susceptibilidad oxidativa . En el presente trabajo se ha evaluado
procedimientos de acomplejamiento metálico con cobre- bixina, por medio de la formación
de un enlace covalente coordinado, analizando el posible enlace formado por Uv- vis,
pruebas de estabilidad oxidativa a luz solar, a tratamiento térmico y análisis por FTIR. Los
resultados de este trabajo indican que el uso de la sal metálica sulfato de cobre, tiene la
capacidad de formar un enlace covalente coordinado con el colorante de bixina, el complejo
generado fue más estable a luz solar por una hora más que el control y a un tratamiento
térmico, dicho enlace de coordinación se ha corroborado por FTIR. A partir del
acomplejamiento y microencapsulado (obtenido secado por aspersión) de los colorantes
generados se comparó el color contra el color de una bebida comercial, en donde los
resultados muestran que los colores que se pueden obtener van desde el amarillo al
anaranjado bajo condiciones de reacción específicas y usando goma arábiga (GA),
maltodextrina (MD) como agentes encapsulantes. Con los resultados obtenidos se puede
pensar en dirigir los colorantes generados, a una amplia gama de alimentos.

14
 ABSTRACT

The study of the complexation and microencapsulation of bixin for the generation of natural,
stable and food-grade dyes is of relevance in the food industry, because products containing
natural ingredients that provide some benefit to health are currently demanded. . Because in
various studies it has been found that artificial colors have detrimental effects to health, and
consequently some have been banned in various countries, which is why various sources
have been sought for obtaining natural dyes such as roots, seeds , fruits, microorganisms and
animals; however given the nature of these, its application is restricted due to its oxidative
susceptibility. In the present work, copper-bixin metallic complexation procedures have been
evaluated, through the formation of a coordinated covalent bond, analyzing the possible
bond formed by Uv-vis, oxidative stability tests to sunlight, thermal treatment and analysis.
by FTIR. The results of this work indicate that the use of copper sulfate metal salt, has the
ability to form a coordinated covalent bond with the bixin dye, the complex generated was
more stable to sunlight for one hour more than the control and a thermal treatment, said
coordination link has been corroborated by FTIR. From the complexing and
microencapsulation (obtained by spray drying) of the dyes generated, the color was
compared against the color of a commercial drink, where the results show that the colors
that can be obtained range from yellow to orange under reaction conditions specific and
using gum arabic (GA), maltodextrin (MD) as encapsulating agents. With the results obtained,
it is possible to think about directing the dyes generated, to a wide range of food

15
 I. INTRODUCCIÓN

Desde los tiempos prehistóricos el uso de colorantes naturales ha sido de gran importancia,
utilizados principalmente por sus colores como aditivo en alimentos tradicionales, para la
coloración de vasijas y el teñido de tela. Actualmente los colorantes naturales se emplean
principalmente en la industria alimentaria, debido a la creciente demanda de productos
naturales que ofrezcan al consumidor beneficios nutricionales y principalmente seguridad
alimentaria. La importancia de los colorantes naturales ha resurgido como alternativa al uso
de colorantes sintéticos, los colorantes sintéticos como la tartrazina, carmoisina, rojo allura y
el amarillo ocaso, han sido muy utilizados en una gama amplia de alimentos, pero han sido
catalogados como peligrosos a la salud. Por lo anterior, se amplían las oportunidades para el
uso de colorantes naturales, los cuales tienen aplicaciones diferentes en distintas áreas,
como por ejemplo la industria textil, pintura, la industria cosmética y en la industria
alimentaria. Algunos de ellos han sido aceptados por la Organización Mundial de la Salud
(OMS) por que no representan peligro a la salud del ser humano.
Las características que actualmente se demandan para los colorantes aplicables en
alimentos son: que sean naturales, seguros y que tengan estabilidad química suficiente para
resistir los tratamientos físicos a los que se somete un alimento. Un grupo de dichos
colorantes naturales son los carotenoides, importantes en el área de alimentos,
medicamentos y cosméticos, debido a su poder colorante y su aporte de vitamina A; entre
los carotenoides más conocidos y usados esta la bixina, un pigmento rojo-anaranjado
proveniente de las semillas de Bixa orellana l. Los principales inconvenientes en el uso de los
colorantes naturales para su aplicación en alimentos, es su alta inestabilidad a la oxidación,
que conlleva a la pérdida de color. Bixina presenta estabilidad en condiciones de
almacenamiento en obscuridad y bajas temperaturas; debido a su naturaleza liposoluble es
usado en alimentos como quesos, margarinas y mantequillas, lo que imposibilita su
aplicación en alimentos de naturaleza hidrosoluble. Para ampliar sus aplicaciones se requiere
de procesos de estabilización para aumentar la resistencia del color a factores de
degradación como luz, oxigeno, temperatura y también un proceso de estabilización en el
que bixina pueda ser un colorante con características hidrosolubles que permita utilizarlo en
bebidas no alcohólicas.

16
Dentro de los procesos de estabilización más usados para colorantes, se encuentra la
microencapsulación que ha sido ampliamente usada para el recubrimiento de distintos
compuestos de interés y para cambiar algunas propiedades físicas como la solubilidad.
En este trabajo se estudió el comportamiento de bixina, proveniente de la extracción de Bixa
Orellana l. Se analizó un sistema de acomplejamiento para el desarrollo de colorantes
hidrosolubles estables que puedan ser usados en bebidas.
Para la realización de este trabajo se utilizó técnicas biotecnológicas que permitieron
preparar un complejo metálico con Cu- bixina, que es estable a cambios de luz y
temperatura, con ayuda de un proceso de microencapsulación se consiguió mayor
estabilidad a reacciones de oxidación por luz y temperatura.

17
 II. MARCO TEÓRICO

2.1. Pigmento o Colorante

Son compuestos químicos que absorben luz en el rango de longitud de onda de la región
visible. El color producido se debe a una estructura específica de la molécula llamada
(cromóforo); esta estructura captura la energía y se produce la excitación de un electrón
desde un orbital externo a un orbital más alto; la energía no absorbida se refleja y / o
refracta para ser capturada por el ojo y los impulsos neuronales generados se transmiten al
cerebro donde podrían interpretarse como un color. (Hari et al., 2009).

Por su origen se clasifican en naturales, sintéticos o inorgánicos. Los pigmentos naturales son
producidos por organismos vivos como plantas, animales, hongos y microorganismos. Los
pigmentos sintéticos se obtienen de los laboratorios. Los pigmentos inorgánicos se pueden
encontrar en la naturaleza o reproducirse mediante síntesis (Baldi et al., 2005).

2.2. Colorantes naturales alimenticios

Se considera colorante natural alimentario a las sustancias coloreadas extraídas de plantas
superiores, algas, hongos y líquenes, algunos insectos y organismos invertebrados (Ugaz,
1997).

2.3. Clasificación de los colorantes

La clasificación de los colorantes naturales depende de su naturaleza química, se dividen en:

a) Tetrapirroles, se pueden encontrar lineales y cíclicos como son ficobilinas y clorofila,

dan colores de azul- verde, amarillo rojo y absorben de 540- 650 nm.
b) Carotenos y carotenoides, terpenos, se encuentran en color amarillo-anaranjado-rojo
y absorben de 400-500 nm.
c) Flavonoides, en este grupo se encuentran flavonas, flavonoles, chalconas, auronas y
antocianinas, tienen colores rojo-azul, amarillo, blanco-crema, absorben de 310- 550
nm.
d) Xantonas, suelen ser de color amarillo y absorben de 340-400.
e) Quinonas, en este grupo se encuentran las naftoquinonas y antraquinonas, tienen
color rojo-azul-verde, rojo púrpura y absorben de 420-460 nm.

18
 f) Índoles, en este grupo se encuentran el índigo y las betalaínas, tienen color azul-
rosado, amarillo-rojo, absorben de 470-554 nm (Ugaz, 1997).

En el presente trabajo se abordara al grupo de los carotenoides, como a continuación se

describe:

2.4. Carotenoides
Los carotenoides son colorantes poliénicos rojos y amarillos, en su molécula posee un grupo
cromóforo, sistema de dobles enlaces conjugados en una cadena alifática ramificada (grupos
metilos), se pueden encontrar en forma lineal o con uno o dos ciclos. (Primo, 1995). Su
función es actuar como pigmentos complementarios en la fotosíntesis y protegen a los
tejidos fotosintéticos de la foto-oxidación.
Los terpenos al ser metabolitos secundarios ayudan a la planta a sus funciones ecológicas,
produciendo sustancias que las protegen de herbívoros, a la infección por agentes
microbianos patógenos, sirven como atrayentes de polinizadores y dispersores de semillas
(Taiz & Zeiger, 2002).
En las semillas de Bixa orellana l. se encuentran presentes dos colorantes: bixina y norbixina,
son considerados apocarotenoides y ambos están en el pericarpio de la semilla . Norbixina
es ácido dicarboxílico y es el compuesto hidrosoluble, tiene un color rojo obscuro y se
encuentra en menor cantidad que bixina (FAO/WHO 2006).

El presente trabajo se enfocó en el uso de bixina, a continuación se describe:

2.5. Bixina
Es un carotenoide de naturaleza lipófila, se encuentra naturalmente en la parte del
pericarpio de las semillas provenientes de la planta Bixa orellana, es el componente
mayoritario de todos los carotenoides presentes en la semilla, se caracteriza por tener un
color anaranjado-rojizo dependiendo del solvente y método de extracción (FAO/WHO, 2006).

Presenta gran estabilidad a condiciones normales pero tiende a degradarse en presencia de

luz y alta temperatura. Es resistente a ácidos, álcalis y a la acción microbiana (Turrialba,
1983). La bixina se presenta en la capa externa del achiote, un carotenoide rojizo. Es un
pigmento ampliamente utilizado en la industria alimentaria (Scotter et al., 1998).

19
2.6. Estructura química de bixina
Es una molécula isoprenoide con 25 carbonos, tiene un sistema de dobles enlaces
conjugados, con un grupo carboxílico libre y otro esterificado, considerado como un
colorante ácido orgánico (ver figura 1).

La esterificación le confiere la característica de solubilidad en disolventes de poca polaridad

como éter de petróleo, acetona, hexano, diclrometano, etanol, etc. Su Formula química es
C₂₄H₃₀O₄, tiene un peso molecular de 394.51 g/mol, su punto de ebullición es de 198°C
(FAO/WHO, 2006). Se describe como un polvo, suspensión o solución de color marrón rojizo
(Santos, 2008).

Figura 1. Estructura de bixina, R=COOCH₃

Fuente: Taham, Cabral y Barrozo (2015)

2.7. Biosíntesis de bixina

Los terpenos se forman a partir de unidades de cinco átomos de carbono. El compuesto de
partida es el pirofosfato de isopentenilo (IPP) y dimetil alil pirofosfato (DMAPP), se obtienen
a partir de la ruta del ácido mevalónico (MVA) (Claramunt et al., 2013). El sitio específico de
biosíntesis es en la membrana de los tilacoides, en forma específica, en los cromoplastos. La
condensación de DMAPP e IPP generan una molécula de geranil pirofosfato (GPP) y la unión
de dos moléculas de GPP forma un diterpeno (C20), al unirse dos diterpenos da lugar a la
formación de un tetraterpeno (C40). El precursor de la síntesis de Bixina es el Licopeno. Se
han encontrado tres enzimas que catalizan la conversión secuencial de licopeno en bixina:
1. Dioxigenasa escisión licopeno (LCD), 2. Bixina aldehído deshidrogenasa (ADH), y 3.
Norbixina carboxilo metiltransferasa (CMT) (Camara & Bouvier, 2004).

20
Los pasos iniciales de la síntesis de bixina son catalizadas por una dioxigenasa escisión
licopeno 5, 6 (5´,6´) el dialdehído resultante es bixina, secuencialmente convertida en
norbixina, por un bixina aldehído deshidrogenasa y una norbixina metiltransferasa, utiliza S-
adenosil-L metionina que le transfiere un grupo metilo, resultando en bixina, según se indica
en la figura 2.

Figura 2. Ruta de biosíntesis de bixina

Fuente: Camara & Bouvier (2004)

2.8. Usos y aplicaciones de bixina

Es un importante colorante en la industria de alimentos y puede sustituir el uso de tartrazina,
el cual es un colorante sintético y prohibido un varios países; porque el consumo de
alimentos con colorantes artificiales ha sido relacionado con el trastorno de déficit de
atención e hiperactividad en niños menores de 12 años, también tienen importancia en otras
industrias como la farmacéutica y la cosmética (Taham et al., 2015).
Es el colorante más usado en la industria alimentaria, por su naturaleza lipófila su uso es
principalmente en alimentos de base lipídica, como quesos, aceites y helados entre otros.
Tiene propiedades antioxidantes y antimicrobianas, su consumo es considerado seguro para
el ser humano. Es considerado GRAS porque no es alérgico, es biodegradable, no toxico y no
carcinogénico (Yolmeh et al., 2014).
Dentro de los principales usos de bixina en la industria alimentaria es como colorante,
antioxidante y antimicrobiano, en una aplicación de extractos de Bixa orellana l.
21
En empanadas de cerdo, Cuong y Chin, (2016) encontraron que la bixina otorga mejor
capacidad antioxidante que el ácido ascórbico, microbiológicamente fueron muy similares sin
haber diferencia significativa, además de proporcionarle un color atractivo y natural a las
empanadas.
Rocha García et al., (2012) prueban extractos Bixa orellana l. (Bixina y norbixina) como
agentes antioxidantes en productos cárnicos, mencionan que el uso de estos compuestos es
seguro y que además de poder aplicarlos como colorantes, pueden ser usados como
antioxidantes naturales, los cuales son capaces de reemplazar o minimizar el uso de aditivos
sintéticos in productos cárnicos.
Laganá et al., (2012) usaron extracto de bixina para enriquecer la dieta de gallinas de
postura, y encontraron que esto contribuye a un aumento de coloración en la yema del
huevo, el color se mantiene estable hasta los 21 días de almacenamiento.
Como se observa el uso de extractos de Bixa orellana l. no se limita en la industria de
alimentos, cosméticos, textiles, también en el ramo avícola.

2.9. Ventajas y desventajas de bixina

La tabla 1 describe las ventajas y desventajas del uso de la bixina en productos alimenticios.

Tabla 1. Ventajas y desventajas del uso de la bixina

Ventajas Desventajas
 Representa el 80 % de todos los  Sensible a la oxidación debido a su
carotenoides presentes en la estructura insaturada.
semilla de Bixa orellana.  La oxidación implica una disminución
 Es liposoluble directa del color.
 Colorante con propiedades  La oxidación es acelerada por factores
medicinales: Antiinflamatorio, como luz, temperatura y agentes
antioxidante, diurético, laxativo. oxidantes.
 Considerado GRAS
 Toxicidad nula
 Aprobado por la FAO

Fuente: Pérez de la Clourido et al., (2010), Benítez etal., (2010)

22
2.10. Factores que afectan la estabilidad de los carotenoides
La cadena poliénica conjugada que es característica de los carotenoides también hace que
estos compuestos sean susceptibles a la degradación de una serie de agentes. Se han
identificado varios agentes oxidantes de carotenoides. Las vías de degradación de los
carotenoides están muy influenciadas por el agente involucrado en el inicio de la
degradación. Una vez que la oxidación ha sido iniciada por un agente oxidante, los
carotenoides pueden reaccionar con ellos mismos u otras especies químicas en el medio
ambiente para formar una gran cantidad de productos. Los factores de degradación de los
carotenoides son: autoxidación, degradación térmica, fotodegradación, oxigeno singlete,
ácidos, transferencia de electrones, radicales libres, formación de aductos, abstracción de
hidrogeno. En la figura 3 se muestran los mecanismos de oxidación. (Boom et al., 2010)

Figura 3. Factores que afectan la estabilidad de los carotenoides

Fuente: Boom et al., (2010)

23
Para bixina son dos los factores que mayormente afectan su estabilidad oxidativa, la
fotooxidación y la degradación térmica. A continuación se describen.

Luz
La reacción inducida por la luz predomina sobre la destrucción directa por oxígeno (Najar et
al., 1988).
Mortensen y Skibsted, (1996) mencionan que la exposición a la luz degrada los carotenoides
y se han propuesto varios mecanismos de acción:
- La fotooxidación produce especies que se cree que son cationes radicales.
- Las moléculas del carotenoide en el estado excitado pueden volver al estado
fundamental, donde pueden ser atacadas por subproductos radicales creados
durante la reacción anterior y experimentar un proceso de degradación más lento
que posiblemente resulten en cationes radicales.

Temperatura

Scotter, (1995) elucida el mecanismo principal para la degradación térmica a 126°C de

bixina, lo describe como un proceso electrocíclico, que por hidrólisis se elimina m-xileno y
forma una especie de 17 carbonos, que puede degradarse aún más por un mecanismo
similar, como se observa en la figura 4.

A B C

Figura 4. Mecanismo de degradación térmica A= bixina B= m-xileno, C= C-17

Fuente: Scotter (1995)

24
Sin embrago se han reportado otros productos de degradación por temperatura, como son:
tolueno, ácido toluico y dimetildihidronaftaleno.

McKeown, (1963) en un análisis de los productos de degradación de bixina por efectos de

temperatura, encuentra que los grupos terminales de bixina (carboxilo y metíl-bixina) se
encuentran intactos, por lo que la degradación implica la una ruptura inicial dentro de la
cadena del polieno de bixina. También han demostrado que las reacciones en cadena
ocurren sin cambios de hidrógeno y por lo tanto, solo implican ruptura de dobles enlaces.

2.10.1. Mecanismos de estabilización de carotenoides

Hay varios mecanismos que pueden aumentar la estabilidad de los carotenoides, a

continuación se describen los más importantes:

Microencapsulación

Es una alternativa para incrementar la estabilidad de carotenoides y permitir su

incorporación en ambientes hidrófilicos, como lo describen Larroza y Zerlotti, (2007). La
microencapsulación es una tecnología de empaquetamiento de materiales sólidos, líquidos, o
gaseosos.
Consiste en macropartículas conformadas por una membrana polimérica porosa
contenedora de una sustancia activa, con el objetivo de proteger el producto encapsulado de
la luz y el oxígeno. Los materiales que se utilizan para el encapsulamiento pueden ser
pectina, goma arábiga, alignato de calcio, almidón, ciclodextrina, maltodextrina, ceras,
caseinato de sodio, proteína de lactosuero o proteína de soya Huertas, (2010).

La técnica de Microencapsulación ha permitido solucionar algunos problemas limitando las

aplicaciones de ingredientes y aditivos alimenticios, puesto que puede controlar la
eliminación de saborizantes, así como reducir volatilidad, higroscopicidad y reactividad
incrementando la estabilidad de productos bajo condiciones ambientales adversas Favaro et
al., (2010).

25
Se ha reportado la microencapsulación de algunos carotenoides, con el fin de aumentar su
vida de anaquel, retrasar o detener el proceso de oxidación por diversos factores como luz y
oxígeno Barbosa et al., (2005).

Los carotenos son utilizados como colorantes en alimentos, bebidas, cosméticos. Durante el
proceso y almacén, los carotenos fácilmente pueden cambiar de forma en diferentes
isómeros geométricos y oxidarse, como consecuencia hay perdida del colorante y sus
propiedades biológicas. Las alternativas principales para incrementar la estabilidad de
carotenoides y así permitir su incorporación en ambientes hidrófilicos, es la técnica de
Microencapsulación a través del método de secado por aspersión Larroza y Zerlotti, (2007).

Ventajas de la Microencapsulación

- Proteger el material activo de la degradación producida por el medio ambiente (calor,

aire, luz, humedad), etc.
- El compuesto encapsulado se libera gradualmente del compuesto que lo ha
englobado o atrapado en un punto determinado.
- Las características físicas del material original pueden ser modificadas y hacer más
fácil su manejo, la higroscopia puede ser reducida, la densidad se modifica y el
material contenido puede ser distribuido más uniformemente e una muestra.
- El sabor y olor del material puede ser enmascarado.
- Puede ser empleado para separar componentes, con el fin de que estos no
reaccionen.
- Estabilización de principios activos inestables.
- Transformación de líquidos en sólidos Astray, (2009).

26
Complejo con metales

Los complejos metálicos consisten en formar un enlace de coordinación, se forma de un

átomo metálico unido a un ligando por medio de un enlace covalente coordinado.
Zhao et al., (2010) formaron complejos de cúrcumina- Al y cúrcumina-Cu, obtuvieron un
colorante más resistente a reacciones de oxidación.

Alfred Werner a finales del siglo XIX explica las propiedades y la estructura de un complejo,
básicamente un complejo está constituido por un ion central M, al que se le unen moléculas
neutras o iones negativos L, llamados ligandos, generando una esfera de coordinación. El ion
y el ligando se unen mediante un enlace covalente coordinado.

Una característica importante de los ligandos es que deben de tener disponibles pares
electrónicos no enlazantes y el ion deberá tener orbitales vacantes. La unión entre el ion
central y los ligandos se hace mediante un enlace covalente coordinado; de ahí que para que
se formen compuestos de este tipo los ligandos deban disponer de pares electrónicos
disponibles Carrion, (2016).

27
 III. ANTECEDENTES

3.1. Antecedentes directos

Zaho et al., (2010) en su trabajo “Interacción of curcumin with Zn(II) and Cu(II) ions based on
experiment and theoretical calculation” evaluaron la interacción de cúrcumina con iones de
Zn+2 y Cu+2, encontraron desplazamientos en las bandas de absorción en el análisis por UV-
vis, para cada interacción Zn- cúrcumina y Cu- cúrcumina, teniendo cúrcumina cuatro
longitudes máximas de absorción 382, 413, 434 y 456 nm, el desplazamiento fue de 1 a 4 nm.
Ellos determinan que los cambios de absorción dependen de las relaciones molares usadas
entre Zn- cúrcumina y Cu- cúrcumina. Determinaron por espectroscopia infraroja FTIR, la
zona en donde detectaron el enlace Cu- cúrcumina fue entre 400 y 420 cm-1, así como la
banda característica del carbono carbonilo C=O de cúrcumina a 1603, Zn- cúrcumina 1596 y
Cu- cúrcumina 1590.

Hettiarachychy et al., (1986) en su trabajo “Un proceso para estabilizar un pigmento”,

determinan algunas condiciones para estabilizar extractos de annatto, ellos utilizan iones
metálicos de diversas fuentes (carbonatos, nitratos, sulfatos) y un polisacárido para formar
compuestos protegidos y unidos por puentes de hidrogeno; determinan que el lugar en
donde se da la unión es en el ácido carboxílico de la molécula de bixina y que este a su vez
forma puentes de hidrogeno con el polisacárido. Sin embargo no muestran análisis
espectrofotométricos que demuestren dichos enlaces.

Diversos autores han reportado el uso de agentes encapsulantes, que ayudan a mantener la
vida de anaquel por un periodo mayor, además de otorgar nuevas características físicas,
como la solubilidad en sistemas hidrófilicos. La combinación entre bixina y diferentes
agentes encapsulantes ha sido reportada por Shu et al., (2006) quienes reportarón el uso de

goma arábiga, maltodextrina y grenetina, (Nunes et al., (2007) ᵦ-ciclodextrina, goma arábiga,

De Marco et al., (2013) usaron goma arábiga y maltodextrina. Todos ellos mencionan que se
logró prolongar la vida de anaquel y la solubilidad fue mejor en agua.

28
Se ha reportado el encapsulado de bixina para evaluar su estabilidad oxidativa, antes factores
de luz, oxigeno, obscuridad (Rios, Borsarelli, & Mercadante, 2005), también se han reportado
aplicaciones de extractos de semillas de Bixa orellana l. en alimentos como yogurt quesos y
productos cárnicos Cuong y Chin, (2016), Rocha García et al., (2012), sin embrago no se ha
reportado alguna evaluación en alimentos de microencapsulados de bixina.

29
 IV. JUSTIFICACIÓN

Se sabe de los efectos tóxicos de algunos colorantes químicos como la tartrazina y rojo 40,
por ello ha incrementado la demanda de colorantes naturales; sin embargo la aplicación de
estos colorantes está restringida debido a su susceptibilidad oxidativa ante los factores de luz
solar y alta temperatura, lo cual ocasionan pérdida de color.

Por lo anterior es necesario establecer procesos de acomplejamiento metálico y

microencapsulación que aseguren la estabilidad a reacciones de oxidación de los colorantes
naturales y se cuente con colorantes estables que puedan ser utilizados en diversos tipos de
alimentos, principalmente en bebidas.

Para este trabajo se implementó un proceso de acomplejamiento metálico, el cual brindó

mayor estabilidad al colorante de bixina y la técnica de microencapsulado de secado por
aspersión, porque es una técnica que permite altos rendimientos y bajo costo de fabricación.

Se ha reportado la estabilización del colorante de bixina por medio de microencapsulación;

sin embargo no hay reportes del uso de metales para la formación de complejos con bixina, y
el uso de la técnica de FTIR para la validación de la formación de un enlace bixina- metal. De
igual forma no se ha reportado el uso del raspelling como parte de la extracción de bixina y la
evaluación de la estabilidad a luz solar y tratamiento térmico del colorante estabilizado
aplicado en una bebida no alcohólica.

V. HIPÓTESIS

El acomplejamiento metálico y microencapsulamiento de bixina brindará un colorante

natural aplicable en bebidas, incrementando la resistencia del color a cambios de luz y
temperatura.

30
 VI. OBJETIVOS

6.1. Objetivo General

Evaluar procedimientos de acomplejamiento con Cu 2⁺, Fe3+ Zn2+ y microencapsulado de

bixina para incrementar su estabilidad oxidativa y obtener un colorante hidrosoluble para la
formulación de una bebida coloreada.

6.2. Objetivos Específicos

 Establecer un método de extracción a partir de semillas de Bixa orellana l.

 Establecer una metodología y evaluar la estabilización del cromóforo de bixina
mediante reacciones de acomplejamiento con sales metálicas de grado alimenticio
como son sulfato de cobre, sulfato de hierro y sulfato de zinc.
 Desarrollar la metodología de encapsulamiento del complejo metálico seleccionado
para la generación de microemulsiones más estables.
 Evaluar la estabilidad del color de una bebida formulada con el microencapsulado.

31
 VII. METODOLOGÍA

7.1. Manejo de las semillas de annatto

Las semillas fueron obtenidas por donación de la empresa ALTECSA S.A de C.V El
almacenamiento se llevó a cabo en bolsas herméticas y en condiciones de obscuridad, a una
temperatura de refrigeración de 4 °C, para reducir el riesgo de degradación.

7.2. Análisis fisicoquímicos de las semillas

Se siguieron los métodos establecidos por la AOAC (2000) se analizó humedad, cenizas,
proteína y lípidos.

7.2.1. Determinación de humedad

Se pusieron las cápsulas de porcelana a peso constante. En las cápsulas previamente secas y
taradas poner 3 g de muestra y distribuirla uniformemente. Secar en estufa a 105°C por tres
horas; posteriormente pasar al desecador por media hora hasta peso constante. El
porcentaje de humedad se calcula con la siguiente fórmula.

Humedad %= (W1-W2)/W1 *100

W1= Peso (g) de la muestra antes de secar

W2= peso (g) de la muestra después de secar

7.2.2. Determinación de cenizas

Se ponen los crisoles a peso constante, pesar 5 g de muestra e incinerar hasta que ya no se
produzcan humos, colocar el crisol en la mufla a 550°C durante una noche. Posteriormente
pasar el crisol al desecador por 30 minutos, pesar hasta obtener peso constante. El
porcentaje de cenizas se determina por la siguiente fórmula.

Cenizas %= Peso de las cenizas/ Peso de la muestra *100

32
7.2.3. Determinación de proteína

Poner muestras de 0.5-1 g en un matraz de digestión, adicionar 5 g de mezcla del catalizador

Kjedahl y 200 ml de ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente calentar hasta la formación
de espuma, hervir vigorosamente hasta que la solución se aclare. Dejar enfriar y añadir 60 ml
de agua destilada. Conectar inmediatamente el matraz de digestión y al condensador con la
punta del condensador sumergida en HCl 0.2 N, poner de 5 a 7 gotas de indicador, calentar
hasta destilar el NH₃ y titular con solución de NaOH 1M. El porcentaje de proteína se calcula
con, la siguiente fórmula.

Proteína %= [(A-B) x N x 1.4007 x 6.25]/W

A= volumen en ml de HCL 0.2 N usado en la valoración de la muestra

B= volumen en ml de HCL 0.2 N usado en la valoración de la muestra “blanco”
N= normalidad de HCL
W= peso de la muestra (g)
14.007= peso atómico del Nitrógeno
6.25= el factor de conversión de nitrógeno en proteínas de pescado y sus
derivados

7.2.4. Determinación de lípidos

Poner a peso constante el matraz Soxhlet, la muestra (semillas de annatto), un cartucho de

papel. Posteriormente pesar el cartucho y el matraz Soxhlet. Poner de 3 a 5 gramos de
muestra seca en el cartucho. Montar el equipo y poner aproximadamente 250 ml de éter de
petróleo en el matraz, la duración de la extracción será hasta que el éter del sifón no tenga
color. Posteriormente se enfría, y se pone a peso constante el cartucho y el matraz. Calcular
el porciento de lípidos con la siguiente formula.

Lípidos %= (peso de la grasa/peso de la muestra) * 100

33
7.3. Raspelling de semillas
Las semillas de Bixa orellana se pusieron en un molino de acero inoxidable con una chaqueta
para el enfriamiento y una adaptación para un taladro como fuente de movimiento, se raspó
la parte exterior, para tener la parte del pericarpio y obtener un polvo fino que
posteriormente se usó para realizar las extracciones de bixina.

7.4. Método de extracción

La extracción se realizó con dos métodos: soxhlet y por maceración de acuerdo con Rueda et
al., (2004) y Mehta et al., (2015) respectivamente, utilizando etanol y aceite vegetal como
disolvente. A continuación se describe el proceso para cada extracción.

7.4.1. Método de extracción por Soxhlet

Se hizo un proceso de desengrasado con hexano en una relación 1:6 m/v polvo: hexano, por
tres horas en agitación constante y temperatura ambiente, posteriormente se dejó precipitar
y se recuperó el polvo, para retirar completamente el hexano se centrifugo a 4500 rpm por
30 minutos a 15°C y después se evaporó el remanente en la campana de extracción en
condiciones de obscuridad por todo una noche. El polvo desengrasado se puso en un
cartucho de celulosa seco y tarado, se montó en el equipo soxhlet y se usó etanol como
disolvente, se dejaron 10 reflujos de una hora cada uno, a ebullición del disolvente, finalizada
la extracción el extracto se concentró en rotavapor, finalmente el extracto recuperado fue
almacenado a -20°C en frasco ámbar.

7.4.2. Método de extracción por maceración

Se incorporaron 10 g de polvo con 50 ml de aceite vegetal de canola, se llevó a 120°C en
agitación constante durante una hora. Posteriormente se enfrió a temperatura ambiente y se
filtró con papel filtro de poro mediano, el extracto obtenido se centrifuga a 4500 rpm por 30
minutos a 15°C, la pastilla obtenida se lavó con hexano 1:6 extracto: hexano, por tres horas
en agitación y temperatura ambiente. Posteriormente se precipitó, se recuperó el polvo, para
retirar completamente el hexano se centrifugó a 4500 rpm por 30 minutos a 15°C y después

34
se evaporó el remanente en condiciones de obscuridad por una noche, la pastilla obtenida se
almacenó a -20°C en frasco ámbar.

7.5. Cuantificación de bixina por espectrofotometría

Se cuantifico el contenido de bixina siguiendo la metodología descrita en FAO/WHO (2006),
procedimiento 2: contenido de materia colorante soluble en disolventes orgánicos, se usó el
coeficiente de absortividad molar de 3090 y la ecuación de Lambert-Beer FAO/WHO (2006).
Se pesó 0.08 g de muestra en un matraz volumétrico de 100 ml, se adicionaron 20 ml de
cloroformo para disolver la muestra, aforar con ciclohexano = (V1), tomar 5ml del matraz V1
y pasar a otro matraz volumétrico de 100 ml, aforar con ciclohexano= (V2), tomar 5 ml del
matraz V2 y pasar a otro matraz volumétrico de 100 ml y aforar con ciclohexano= (V3). Medir
en el espectrofotómetro a la longitud de 457 nm. El % de materia colorante se calcula con la
siguiente formula.

Bixina %= A*V1*…Vn/ (E*M muestra *V´1*…*V´n)

A= la media de la absorbancia de la muestra diluida

V1=volumen de dilución (1=1,2…n)
E= 3090
M= masa de la muestra en g.
V´1= volumen de la alícuota para la dilución (1´=1,2…n)

7.6. Evaluación de la actividad antioxidante

La actividad antioxidante se determinó por el método DPPH (2, 2-Difenil-2- picrilhidrazilo), se
usó quercetina y trolox como estándares, siguiendo el siguiente proceso:
Preparar una solución stock de DPPH 1 mM, la solución stock se lleva a una solución de 133.3
µM, preparar en obscuridad y almacenar en refrigeración hasta su uso. Para Quercetina
preparar una solución stock de 100 ppm, se partió de esta, para preprar la serie de diluciones
para la curva de calibración.

Se ajustan las concentraciones de Quercetina a 16.8, 29, 40 y 71 ppm, usando etanol frío
como disolvente, se midió en un espectrofotómetro de placas EPOCH y placas de fondo

35
plano, se pusieron 50µl de cada concentración de Quercetina y se ajustó a 200 µl con la
solución de DPPH 133.3 µM, incubar 30 minutos en obscuridad y agitación a 37°C, medir a
517 nm.

Para el estándar de Trolox preparar una solución stock de 1 mM, se ajustó a concentraciones
de 40, 53, 71, 95, 126.5 y 169 µM, se usó etanol frio como disolvente se midió en un
espectrofotómetro de placas EPOCH y placas de fondo plano, se pusieron 50µl de cada
concentración de Trolox y se ajustó con 200µl de la solución de DPPH 133.3µM, incubar 30
minutos en obscuridad y agitación a 37°C, medir a 517 nm. La IC50 se obtuvo a partir de la
ecuación de la recta que ajusto a la curva de calibración.

El porcentaje de inhibición se obtuvo con la siguiente formula:

%Inhibición= [(abs etanol + DPPH) – [(abs Muestra + DPPH) – (abs Etanol + Muestra)]] / (abs
Etanol + DPPH)

Para la evaluación de la actividad antioxidante de los extractos etanólico y aceite, se

preparan soluciones stock a 500 ppm, se ajustan concentraciones de 95, 126.5, 169, 224.5,
296.5 y 400 ppm, usando etanol frío como disolvente, se pusieron 50 µl de cada
concentración de extracto y se ajustó a 200µl con la solución de DPPH 133.3 µM, incubar 30
minutos en obscuridad y agitación a 37°C, medir a 517 nm. El IC50 se obtuvo a partir de la
ecuación de la recta.
Se preparó una solución stock a 5000 ppm del estándar de Bixina y del polvo comercial, se
ajustaron a concentraciones de 71.32, 94.856, 126.492, 168.68, 224.936, 296.524, 400,
533.4, 711.31 ppm para el polvo comercial y las siguientes concentraciones para el estándar
de bixina, 296.524, 400, 533.4, 711.31, 948.548, 1100, 1264.912, 1686.788, 2249.364 ppm;
se pusieron 50µl de cada concentración y se ajustó a 200µl con la solución de DPPH 133.3
µM, incubar 30 minutos en obscuridad y agitación a 37°C, medir a 517 nm. La IC50 se obtuvo
a partir de la ecuación de la recta sacando la regresión lineal.

36
7.7. Identificación de bixina, por Cromatografía en capa fina
Se usaron placas de sílice como fase estacionaria, se probarón 6 mezclas de fases móviles, a
continuación se indican:

1. Cloroformo: metanol (9.7:0.3) (Pech, 2015)

2. Hexano: acetona (2:1) (Rahmalia et al., 2015)
3. Metanol: diclrometano (1:1) (Ibrahim, 2007)
4. Acetato de etilo: éter de petróleo (3:2) (Ibrahim, 2007)
5. Agua: tetrahidrofurano: acetonitrilo (2:1:1) (Ibrahim, 2007)
6. N-butanol: metíl etilcetona: amoniaco acuoso 10% (3:2:2) (Smith y D., 2006)

7.8. Análisis por HPLC

Se usó un equipo Agilent HPLC 1100 DAD QUAT PUMP, una columna C-18 fase reversa, fase
móvil isocrática de acetonitrilo: agua: ácido acético 70:28:2, se midió a la longitud de 452
nm, se utilizaron estándares de bixina y norbixina para la identificación y cuantificación. El
estándar de norbixina se usó para saber en qué cantidad está presente en los extractos.

Las concentraciones que se usaron para la curva de bixina van de 1 a 3.5 mg ml -1, y para
norbixina de 0.008 a 0.1 mg ml-1.

Las muestras fueron preparadas en etanol absoluto para medir bixina y en NaOH 0.1 M más
metanol HPLC para norbixina, las muestras fueron filtradas por filtros de 0.02 µm, todos los
disolventes fueron grado HPLC, filtrados y des gasificados.

7.9. Acomplejamiento metálico

Para realizar el acomplejamiento metálico de bixina se utilizó un polvo comercial de bixina,
cationes metálicos de grado alimenticio en forma de sus sales de sulfato de, Fe 3+, Zn2+ y Cu2+.
La tabla 2 muestra las condiciones y estequiometrias para realizar el acomplejamiento.

37
 Tabla 2. Condiciones y proporciones utilizadas para acomplejamiento metálico
Ion pH Temperatura bixina: metal Tiempo
3+
Fe
Rx1 Zn2+ (1:1), (3:1),
Cu2+ 9.5 50°C (1:2) 25 min
3+
Fe
Rx2 Zn2+ (1:1), (3:1),
2+
Cu 12 50° C (1:2) 25 min
3+
Fe
Rx3 Zn2+ (1:1), (3:1),
2+
Cu 9.5° 75°C (1:2) 25 min
3+
Fe
Rx4 Zn2+ (1:1), (3:1),
2+
Cu 12 75°C (1:2) 25 min

Se preparó una solución de NaOH 0,06M, una solución de acido clorhidrico 0.1M, 0.6 g del
pigmento en polvo comercial, se disuelve en un matraz aforado de 250 ml con etanol
absoluto, se mide la concentración de bixina por espectrofotometría usando el coeficiente de
absortividad molar 3090 M-1 cm-1, se realizan los cálculos para saber la masa en mg de sal de
Cu, Fe o Zn, las proporciones bixina:metal son las indicadas en la tabla 2, la fuente del catión
es solubilizada en 0.3 ml de agua. En frascos ambar de 50 ml se ponen 20 ml del pigmento
disuelto en etanol, 8 ml de NaOH 0.06 M, y 0.3 ml del catión solubilizado, esta mezcla se
ajustó a un pH de 9.5 o 12 según el tratamiento, posteriormente se puso en sonicación a
50°C o 70°C según la reacción, se enfrió a temperatura ambiente, se ajustó el pH a 3.5 con
ácido clorhidrico 0.1 M y se cuantificó la concentración de bixina por espectrofotometría a
457 nm.
Las variables a controlar en este experimento fueron: temperatura de reacción, proporción
bixina metal y tiempo de reacción (Hettiarachchy et al., 1986).

38
7.10. Análisis mediante espectroscopia infraroja por transformada de Fourier
(FTIR)
El análisis por FTIR se realizó en muestras estabilizadas con cobre y sin estabilizar, para
identificar la formación de enlaces entre bixina y el metal. La región espectral de análisis fue
el infrarrojo mediano que va de 400 a 4000 cm¯¹.

7.11. Microencapsulación, secado por aspersión

Para realizar la microencapsulación, los encapsulantes que se probaron fueron: goma
arábiga (GA), maltodextrina (MD) como se muestra en la tabla 3.
Los encapsulantes se solubilizaron en 180 ml de agua a 60°C por 30 minutos en agitación
hasta bajar la temperatura a 30°C, el pigmento se solubilizó en 20 ml de etanol, ambas
mezclas se homogenizan en agitación a 1200 rpm por 30 minutos a temperatura ambiente, a
cada muestra se midió los grados Brix con refractómetro digital, posteriormente se hace el
secado por aspersión a las siguientes condiciones: de acuerdo con Barbosa et al., (2005), el
flujo de aire de 30 ml/min, presión de 5 Kgf/cm², temperatura de 180°C y 130°C entrada y
salida respectivamente. Las microcápsulas fueron almacenas en frasco ámbar. En la tabla 3 se
muestran las relaciones bixina- encapsulante usadas para el secado por aspersión.

Tabla 3. Relación bixina- encapsulante utilizadas.

Encapsulantes Encapsulantes %

1. Goma arábiga 100

2. Maltodextrina 100

3. Goma arábiga +
50:50
maltodextrina

39
7.12. Análisis de los microencapsulados
Los polvos obtenidos del microencapsulamiento se les determinaron, humedad, solubilidad
en agua, concentración de bixina en agua y etanol, eficiencia de microencapsulado.
La humedad fue determinada por termo balanza OHAUS, la solubilidad en agua se determinó
siguiendo la metodología de Marco et al., (2013), se preparó una solución al 1% w/v
microencapsulado/ agua, se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos, el sobrenadante fue
puesto en capsulas a peso constante a 110° C por 24 h, la solubilidad fue calculada por
diferencia de peso.

La concentración de bixina fue determinada en etanol y en agua, como se describe a

continuación. Se pesaron 0.5 g de polvo microencapsulado, se les agregaron 10 ml de etanol
o agua destilada, se agitó en vortex hasta su solubilización, posteriormente se sónico por 15
minutos con el fin de romper las microcápsulas, se centrifugó a 4000 rpm por 10 minutos, se
cuantificó bixina por espectrofotometría, usando el coeficiente de absortividad molar de
3090 M-1 cm-1, a 457 nm, y usando la ecuación de Lambert Beer.

A= E * C* L

A= absorbancia

C= concentración

L= longitud de la celda

La eficiencia de microencapsulado se determinó de acuerdo con Tonon et al (2012), a 2 g de

polvo microencapsulado se añadió 15 ml de hexano, se agitó por 2 minutos, posteriormente
se filtró, el filtrado se enjuagó con 20 ml de hexano, el residuo generado se evaporó hasta
peso constante. La eficiencia de encapsulación fue determinada por la siguiente fórmula:

EE= ((T0 – SO)/ T0)*100

T0=es el contenido total de bixina en g. (bixina inicial)

SO= (peso matraz c/ bixina no encapsulada) – (peso constante de matraz)

40
7.13. Evaluación del colorante bixina-metal microencápsulado en una bebida no
alcohólica
Se hizo una comparación de estabilidad de color entre las muestras microencapsuladas, los
colorantes obtenidos del microencapsulado se expusieron a condiciones de luz solar y
tratamiento térmico (esterilización a 110°C por 15 minutos).
El colorante microencapsulado se puso en una base de agua comercial a 2.4 de absorbancia
medidos a 457 nm, se expuso a la luz solar en un promedio de entre 2 a 3 horas, 457 nm es la
longitud de onda a la que absorbe bixina en el espectrofotómetro.
Para el tratamiento térmico las muestras se prepararon de la misma forma, después de la
prueba se obtuvo el porcentaje de retención de color.
Se midió el color de las bebidas formuladas con los microencapsulados, se usó un
colorímetro Konica- Minolta.

41
 VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1. Objetivo 1: Establecer un método de extracción de bixina a partir de semillas

de Bixa orellana l.

8.1.1. Análisis proximal

Se realizó la determinación proximal de las semillas de annatto por medio de métodos

estandarizados por la AOAC (2000), a continuación en la tabla 4 se resumen los resultados.

Tabla 4. Determinación proximal de semillas de annatto y comparación con literatura.

Obtenidos Thiago et Jasen &
Cordova et Nogueira et
en este India, (2010) al., Cardon,
al., (1989) al., (2010)
trabajo (2015) (2005)

Humedad % 2.09 8 a 13 7.70 a 5.76 11.5 __ 9.6 - 13.3

Cenizas % 5.09 4.5 a 7.97 __ 3.82 __ 5.4 - 6.9

Lípidos % 2.96 __ 3.32 a 5.46 4.99 5 2 - 4.8

9.81 a
Proteína % 4.7 13 a 14.24 10.34 13 12.1 - 17
11.80

Carbohidratos
86.54 __ __ __ __ 65.7 - 70
totales %

Los valores obtenidos en humedad, cenizas, lípidos y carbohidratos son similares a los
reportados en literatura (Cordova et al., 1989; India, 2010; Thiago et al., 2015; Jasen y
Cardon, 2005; Nogueira Carvalho et al., 2010). El porcentaje en proteína que se obtuvo, fue
menor al porcentaje reportado, debido a que la semilla ha estado almacenada por un largo
periodo de tiempo, Alburquerque y Meireles, (2012) reportan que los niveles de humedad y
proteína decrementan durante el almacenamiento.

42
8.1.2. Raspelling: Obtención del polvo a partir de semillas enteras

De 2848.44 g de semilla entera se obtuvieron 82.59 g de polvo tamizado con un tamiz de

malla 40, obteniendo un rendimiento del 2.90%, cabe señalar que no hay referencias para la
obtención de polvo de las semillas de Bixa orellana.

8.1.3. Extracción por maceración

Partiendo del polvo del raspelling se obtuvo un rendimiento del 4.4% de pasta, superando el
rendimiento obtenido por Metha et al., (2015), ellos obtuvieron un rendimiento del 0.99% y
usaron semillas enteras para la extracción. Las condiciones a las trabajaron fueron: dejar las
semillas por 16 h sumergidas en aceite, posteriormente a 120°C por una hora.

Cabe señalar que en las condiciones de extracción que se usaron en este trabajo, se omitió el
paso de remojo de las semillas por 16 horas, porque el proceso de extracción no se hizo con
semillas enteras, sino de un polvo, del cual se obtuvo mayor rendimiento.

El extracto tiene apariencia pastosa de consistencia dura, de color y olor característico (a

achiote).

Figura 5. Extracción de bixina con aceite de soya

Fuente: propia (2016)

43
8.1.4. Extracción por soxhlet

Se obtuvo 12.7% de rendimiento de pasta, el extracto tiene apariencia pastosa color y olor
característico.

Los análisis realizados a los extractos son: cuantificación de bixina por espectrofotometría,
evaluación de la capacidad antioxidante, cromatografía de capa fina y por HPLC, se muestran
los resultados obtenidos.

8.1.5. Cuantificación de bixina por espectrofotometría

Se cuantificó por el método descrito por FAO/WHO (2006). Para el extracto por maceración
se obtuvo un porcentaje expresado como bixina del 26.1%, el extracto etanólico tuvo un
porcentaje expresado como bixina del 5.35%.
Se observa que el rendimiento de extracción reportado en las secciones 8.1.3 y 8.1.4, el
extracto etanólico fue mayor, sin embargo el porcentaje de bixina extraída fue mayor en el
extracto por maceración. Debido a las propiedades químicas y la estructura de bixina, el
aceite facilitó la extracción. Los grupos terminales en la estructura de bixina son un ácido
carboxílico y un metilo lo que le otorga propiedades liposolubles.
Por otra parte el etanol se encuentra dentro de los disolventes de mediana polaridad, por lo
que el grupo metilo contribuye a su extracción, pero el bajo rendimiento de bixina en el
extracto etanólico se debe a que se extrajeron otros compuestos como antioxidantes o
productos de degradación. Esto se corrobora mediante la cromatografía de capa fina (TLC)
(ver figura 7).

Las características físicas de ambos extractos se resumen en la tabla 5.

44
 Tabla 5. Características de los extractos etanólico y por maceración

Característica Extracto Etanólico Extracto por maceración

Color Rojo intenso- color vino Rojo pálido

Textura Viscosa Dura

Olor Característico Tenuemente a aceite

% de bixina 5.35 26.1

El extracto etanólico presentó un color más intenso que el extracto obtenido por maceración
sin embargo contiene una concentración menor de bixina. Ambos extractos tienen diferente
textura, el extracto etanólico es una pasta viscosa y el obtenido por maceración son
pequeños trozos duros y pastosos; la manipulación es mejor con el extracto que se obtuvo
por maceración.

8.2. Evaluación de la actividad antioxidante

Como parte de la evaluación de los extractos etanólico y por maceración se determinó la
actividad antioxidante para conocer si tenían algún efecto biológico aparte de ser una fuente
natural de provitamina A. Se muestran las curvas de los estándares utilizados para medir la
actividad antioxidante en los anexos 1 y 2, y su IC50 de inhibición antioxidante.

Quercetina obtuvo un IC50 de 0.01041 mg/ml o 10.41 µg/ml, el resultado es similar a lo

reportado por Pourmorad et al., (2006) que obtuvieron 0.01 mg/ml y Nimmi y George. (2012)
que reportaron un IC50 de 0.01025 mg/ml.

Para Trolox se obtuvo un IC50 de 0.26 µg/ml, el resultado es similar a lo reportado por Nimmi
y George. (2012) quienes obtuvieron 0.25 µg/ml.

En la evaluación del estándar de bixina se obtuvo un IC50 de 321.5 µg/ml, y con el polvo
comercial se obtuvo un IC50 de 131.3 µg/ml

45
Se realizó un screening de inhibición antioxidante del extracto etanólico para encontrar el
intervalo que diera porcentajes de inhibición antioxidante entre 20% y 70%, se probaron
concentraciones de extracto etanólico de 50, 100, 150 y 500 ppm, Ver anexo 3.

El extracto etanólico obtuvo un IC50 de 73.7 ppm o 73.7 µg/ml, el resultado es semejante a
lo obtenido por Ganju y Ganju (2014), ellos obtuvieron un IC50 en extracto metanólico de 75
µg/ml, también obtuvieron un IC50 para extracto etanólico de 35 µg/ml, sin embargo la
técnica de extracción usada por Ganju y Ganju (2014), varía en proporciones de disolventes,
(metanol-etanol y agua).

Se evaluó de la misma forma el extracto por maceración, debido al disolvente utilizado en la

extracción, no se pudo determinar el IC50, los valores de medición fuerón negativos, lo cual
sugiere que el extracto en aceite actúa como pro-antioxidante, en este proceso ocurre una
oxidación de los lípidos presentes, ocurriendo reacciones de oxidación en cadena, formando
compuestos radicales (Nieto et al., 2012).

En la tabla 6 se muestran los resultados del IC50 de cada muestra. Se observa que los
estándares de referencia trolox y quercetina tienen la mayor actividad antioxidante con 0.26
y 10.41 µg ml-1 y el extracto etanólico tuvo mayor actividad que el polvo comercial y el
estándar de bixina, lo que sugiere, que el extracto etanólico se puede usar de forma directa
en algunos alimentos, como colorante y a su vez como antioxidante.

Tabla 6. Comparación de IC50, estándares y muestras de bixina.

Muestra IC50 µg ml-1

Trolox 0.26

Quercetina 10.41

Ex. etanólico 73.7

Polvo comercial 131.3

Estándar bixina 321.5

Ext. aceite _____

46
Se observó en el apartado 8.1.5 que el extracto etanólico tuvo menor porcentaje de bixina,
con el resultado de actividad antioxidante se demuestra que en el extracto etanólico están
presentes otros compuestos, como los antioxidantes y algunos productos de degradación,
(ver TLC figura 6) sin embargo la presencia de los compuestos antioxidantes le da actividad
biológica al extracto etanólico y puede usarse directamente en alimentos de base lipídica,
como quesos, cremas, yogurt etc.

Debido al tiempo de almacenamiento del extracto probado en este trabajo, es probable que
los compuestos flavonoides responsables de la actividad antioxidante como la hipolaetina y
derivados del ácido cafeico Chiste et al., (2011), se encuentren en menor cantidad debido a
degradación.

Por literatura se encuentra reportado que la hipolaetina se encuentra presente en los

extractos de semilla de Bixa orellana l. En la figura 5 se observa la estructura de la
hipolaetina, compuesto antioxidante presente en el extracto etanólico. Es una flavona que se
encuentran dentro del grupo de compuestos flavonoides, que son conocidos por tener
actividad antioxidante y generalmente tiene una estructura de carbono C6-C3-C6 o bien
llamado un esqueleto fenilbenzo-pireno (Kumar Verma & Patrap, 2010).

Figura 6. Estructura de hipolaetina, compuesto fenólico presente en semillas y extractos de

Bixa orellana Fuente: (Chiste et al., 2011).

47
8.3. Cromatografía en capa fina del polvo comercial, los extractos etanólico y
aceite
Se probaron 6 fases móviles para la separación de los compuestos, la fase móvil que mejor
separo bixina, norbixina y metilbixina fue la reportada por Smith et al., (2006), consiste en N-
butanol: metíl etilcetona: amoniaco acuoso 10% (3:2:2). En la figura 6 se muestran las placas
cromatográficas.

Los factores de retención coinciden con lo reportado por James (2006) y Abayomi et al.,
(2014), se encontraron dos compuestos principales presentes en los extractos, bixina y
norbixina. Los factores de retención fueron de 0.4 para norbixina y 0.51 para bixina.

En la figura 6, en la placa 1 y 2, B corresponde al polvo comercial, A corresponde al extracto

etanólico y C corresponde al extracto por maceración. Se observa que hay dos bandas con
mayor intensidad en donde la inferior corresponde a norbixina y la superior a bixina, la
intensidad de la banda de norbixina es mayor en el polvo comercial, debido al método de
extracción: extracción alcalina y precipitación ácida FAO/ WHO (2006), que contribuye a que
haya una mayor cantidad de norbixina que bixina; Norbixina es un compuesto hidrosoluble y
soluble en soluciones alcalinas acuosas, y bixina es un compuesto liposoluble y soluble en
aceites y disolventes con baja polaridad. Para los extractos etanólico y en maceración las
bandas de norbixina son menos perceptibles, esto se debe al método de extracción y el
disolvente usado. Para verificar que los compuestos observados son los reportados, se midió
el factor de retención Rf.

48
 Figura 7. Placas cromatográficas en capa fina, A: extracto etanólico, B: polvo comercial,
C: extracto por maceración Fuente: propia

En la figura 7 se comparó el estándar de bixina (1), el estándar de norbixina (2), el polvo

comercial (3), los extractos etanólico (4) y en maceración (5), las bandas que corresponden a
bixina tienen el mismo corrimiento; se encontró norbixina en el estándar (1), el estándar de
norbixina tiene mayor pureza carril (2), se detectaron bandas tenues de norbixina en los
extractos, bandas (4) y (5). Las estructuras de cada marca según lo reportado por PubChem,
(2017) y Ríos et al., (2005) se incluyen en la figura 7.

Se identificó bixina con menos impurezas en el extracto por maceración que en el extracto
etanólico, esto se puede atribuir al disolvente usado para la extracción, el aceite facilito la
extracción de bixina gracias a la solubilidad que tiene esta en medios lipófilos.

49
 Figura 8. TLC estándar de bixina (1), estándar de norbixina (2), polvo comercial (3), extracto
etanólico (4), y extracto en maceración (5).

Fuente: propia

8.4. Análisis por HPLC

Se realizó la identificación y cuantificación de bixina y norbixina por Cromatografía líquida de
alto rendimiento, las muestras que se analizaron fueron: polvo comercial, extracto etanólico,
extracto en maceración. Para la cuantificación de bixina y norbixina se hicieron curvas patrón
a partir de los estándares, bixina al 90% y norbixina al 95% de pureza.
Se usaron concentraciones de 1 a 3.5 mg mL¯¹ para bixina y 0.008 a 0.1 mg mL¯¹ para
norbixina, se obtuvieron coeficientes de correlación de 0.986 y 0.98 respetivamente. En el
anexo 8 y 9 se muestra la curva de bixina y norbixina.

En la tabla 7 se observa que la muestra extracto en maceración tuvo 36.8 mg mL¯¹ de bixina
más que la muestra extracto etanólico, esto se debe al disolvente de extracción usado, el
aceite vegetal favorece la extracción de bixina, debido a que es de origen liposoluble.

50
Se identificó norbixina solo en el extracto etanólico con 0.81 mg mL¯¹, la presencia de
norbixina en esta muestra se debe al tipo de extracción y a las condiciones usadas ver
apartado 6.7.1. Sin embargo la presencia de norbixina no afecta al extracto etanólico, porque
no son productos de degradación.

Tabla 7. Concentraciones de bixina y norbixina.

Bixina Norbixina
Muestras mg mL¯¹ mg mL¯¹
Extracto en
maceración 160.97 __
Extracto
etanólico 124.16 0.81
Polvo comercial 34.17 __

8.5. Objetivo 2: Establecer una metodología y evaluar la estabilización del

cromóforo de bixina mediante reacciones de acomplejamiento con sales
metálicas de grado alimenticio como son sulfato de cobre, sulfato de hierro y
sulfato de zinc.

Se probarón tres iones metálicos Cu 2+, Fe3+, Zn2+ para evaluar la capacidad de formación de
complejo. Los resultados con Cu 2+ en las reacciones Rx1, Rx2, Rx3, Fe 3+ y Zn2+ se encuentran
en los anexos 6, 7 y 8.

Los complejos generados con Fe3+ no otorgaron resistencia a luz solar y tratamiento térmico
al colorante de bixina, por los resultados de los análisis por Uv- visible, el colorante sufrió
suficiente degradación de tal forma que el espectro cambio considerablemente respecto al
control en las reacciones RX 1 y Rx2. Mientras que para las reacciones RX3 y Rx4 el espectro
Uv-visible mantuvo la estructura, pero en los resultados de estabilidad a luz solar y
tratamiento térmico no hubo diferencia significativa respecto al control.

51
Los complejos generados con Zn2+ en el espectro del análisis por Uv- visible la estructura se
mantuvo, sin embargo no otorgaron resistencia a luz solar y tratamiento térmico, las
muestras tratadas con zinc no fuerón estadísticamente diferentes a la muestra control.

A continuación se muestran los resultados para Cu 2+ en la reacción Rx4 (Ver tabla 2).

En esta sección se le llama control (CO) a la muestra sin cobre, tratada bajo las mismas
condiciones de reacción que las muestras (1:1), (3:1) y (1:2). (Ver condiciones de reacción en
la tabla 2).

8.5.1. Complejo con Cu2+ Estabilidad a luz solar

En la figura 8 se observa el espectro por Uv- vis de las muestras de la Rx4, la forma del
espectro de la muestra control no es diferente al espectro de las muestras con cobre, por lo
que se sugiere que el cobre puede estar formando un enlace coordinado con bixina, el cual le
está otorgando resistencia a las condiciones de reacción de Rx4.

Rx4 Cu
0.3
0.25
0.2
control
0.15
abs

(1:1)
0.1
(3:1)
0.05
(1:2)
0
400 420 440 460 480 500 520 540
-0.05
nm

Figura 9. Espectro Uv- vis después de la reacción Rx4 con cobre

Fuente: propia. Cada punto es el promedio de tres replicas.

Se observa en la figura 9 que la tendencia de degradación de las muestras (1:1), (3:1) y (1:2)
es menor respecto a la muestra control, en análisis de varianza confirma que hubo diferencia

52
significativa, en la degradación de las muestras acomplejadas con cobre respecto a la
muestra control. Lo cual indica que el acomplejamiento con Cu, ayuda a estabilizar la bixina
reteniendo por más tiempo su coloración.

Rx4 Estabilidad a luz solar

2

1.5
Control
abs

1 (1:1)
(3:1)
0.5 (1:2)

0
30 min 60 min 90 min 120 min 150 min

Figura 10. Estabilidad a luz solar después de la reacción Rx4 con cobre

Fuente: propia. Cada punto es el promedio de tres replicas.

Se aplicó un análisis de varianza ANOVA entre los resultados de las absorbancias de las
cinéticas de la Rx4, para determinar qué proporción fue la mejor; sin embargo no se
encontró diferencia significativa, en la tabla 8 se muestran los resultados del ANOVA.

Tabla 8. ANOVA de las muestras de la Rx4 con cobre.

Proporción F Ft

(1:1) 0.266503 4.9646

(3:1) 0.483991 4.9646

(1:2) 0.446509 4.9646

53
Se determinó que la proporción (1:2) fue mejor de acuerdo al color que tuvo al final de la
prueba a estabilidad a luz, por lo que esta proporción se trabajó para el proceso de
microencapsulado.

En la figura 10 se comparan las muestras (1:2) y el control, la muestra (1:2) fue más estable
en un 55% respecto al control.

Figura 11. Estabilidad a luz solar Rx4 cobre, estequiometría (1:2)

Fuente: propia.

Es importante mencionar que los resultados es esta sección fueron generados con
metodologías propuestas en el equipo de trabajo, no se encontró reporte de metodología
para las pruebas de estabilidad a luz solar y tratamiento térmico de bixina.

8.5.2. Complejo con Cu2+- Estabilidad al tratamiento térmico

Se evaluó la estabilidad de color de las muestras con Cu, la estabilidad se cuantificó como
porcentaje de retención de color después de un tratamiento térmico.

Se tomaron las condiciones de esterilización a 110° por 15 minutos. En la figura 20 se observa

el porcentaje de retención de color de las muestras de las Rx3 y Rx4 (ver tabla 2). Las
muestras de las reacciones Rx1 y Rx2 (ver tabla 2), no fue posible medirlas porque

54
presentaron mayor degradación después de añadir el cobre, esto se debió a las condición de
temperatura.

La retención de color después del tratamiento térmico para las muestras de la Rx3 con cobre,
es menor a la de la muestra control 84.1±0.006 > (1:1)=44.6±0.0001, (3:1)= 50±0.0006, (1:2)=
31.9±0.0008, aquí las condiciones de reacción favorecen para que la muestra control retenga
más color, pero al añadir el cobre, las muestras disminuyen su capacidad de retención,
posiblemente a pH 9.5 el cobre se está uniendo al grupo OH.

Para las muestras de la Rx4, la muestra control tiene un porcentaje de retención más bajo
que las muestras con cobre, 51.8±0.0004 < (1:1)= 70.9±0.0007, (3:1)= 76.1±0.0009, (1:2)=
69.7±0.002, el cobre está ayudando a mantener la mayor retención de color en la muestra
(1:2), a pH 12 hay una mayor solubilización del pigmento y disposición electrónica para que el
cobre se una a bixina y no al grupo OH; estos resultados son similares a los obtenidos en el
análisis de UV- vis y la prueba de estabilidad a luz solar.

% Retención de color después del T. térmico - Cu

90 84.1 Control Rx3
76.1
80 70.9 69.7 Control Rx4
70
(1:1) Rx3
60
% Retención

51.8 50
50 44.6 (1:1) Rx4
40 31.9 (3:1) Rx3
30
(3:1) Rx4
20
10 (1:2) Rx3
0 (1:2) Rx4
Después del T. térmico

Figura 12. Retención de color después del tratamiento térmico, Rx3 y Rx4.

Fuente: propia

55
8.6. Cromatografía en capa fina TLC, de muestras con cobre
Se realizó cromatografía en capa fina, se comparó las muestras de la Rx4 con cobre, contra el
estándar de bixina (ES), un polvo comercial (PC) y extractos etanólicos de bixina. En la figura
12 se observa que el estándar de bixina (1), se encuentran otros compuestos, estos se
pudieron generar por las condiciones de almacenamiento antes de ser adquirido; a diferencia
del polvo comercial (2), se distingue mejor bixina; también está presente norbixina, esto se
puede deber a la forma de extracción, a nivel industrial la bixina se obtiene por extracción
con solventes y precipitación ácida. Los extractos etanólicos (3 y 4) se ven con mayor
intensidad en la banda de bixina ya que la presencia de norbixina es menor, sin embargo
debido a las condiciones de extracción se pudieron arrastrar otros compuestos más polares
como metíl bixina (PubChem, 2017), o productos de degradación con cadena más corta,
identificado por Scotter, (1995) como un compuesto de 17 carbonos.

En las muestras (5, 6, y 8) se observa que hay bixina esto se puede deber a que no toda la
bixina reacciono, además que por las condiciones utilizadas en la reacción Rx4, la bixina pudo
haber isomerizado a norbixina (FAO/WHO, 2006).

Figura 13. TLC del estándar de bixina (1), polvo comercial (2), extractos etanólicos de bixina (3
y 4), muestras del tratamiento Rx4, (1:2)= (5), (3:1)= (6), (1:1)= (7), control= (8)

Fuente: propia

56
8.7. Espectros por FTIR
Se analizó por FTIR el estándar de bixina (ES), el polvo comercial (PC) y el extracto etanólico
de bixina EXL, en la figura 13, se muestra el espectro. Se observa que las señales de absorción
FTIR de las muestras (PC) y (EXL) son muy similares, sin embargo son diferentes al espectro
FTIR de (ES) esto se puede deber a la pureza, por lo que la vibración del enlace C=O es mayor.

En la zona de 1600 a 1800 cm -1 sobresale una banda que pertenece a la vibración del grupo
carbonilo C=O (Rahmalia et al., 2015), para el estándar (ES) la intensidad aumenta mientras
que para (PC) y (EXL) la intensidad no es muy evidente porque se traslapa con bandas de
absorción de otros compuestos, por ejemplo norbixina.

ES
PC
0.4 EXL
Intensidad

0.2

0.0

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000
-1
cm

Figura 14. Espectro FTIR: Estándar de bixina (ES), Polvo comercial (PC), Extracto etanólico
(EXL).

Fuente: propia

57
En la figura 14 se muestra el espectro de las muestras: estándar (ES), polvo comercial (PC),
control (CO) y muestra con cobre (1:2), se observa que los espectros tienen una estructura
similar, en la zona de 1600 a 1800 cm -1 que corresponde a la vibración del grupo carbonilo
C=O, la vibración del estándar de bixina (ES), es de 1717 cm -1, el polvo comercial 1669 cm-1, el
control y la muestra (1:2) lo tienen en 1653 cm -1, lo cual se sugiere que el desplazamiento en
la vibración, es por el grado de oxidación.

En el espectro en color azul (1:2) hay una mayor intensidad de absorción a 1653 cm -1 la cual
se sugiere que se relaciona con el enlace de coordinación entre la bixina y el cobre. De 3000 a
3500 cm-1 se encontró la vibración del enlace O-H, el cual también sobresale y se sugiere que
el cobre se está enlazando de forma covalente coordinada a un oxigeno de ese grupo (Zhao
et al., 2010); más de una molécula de bixina se estaría enlazando de esta forma con el cobre.

Hettiarachchy et al., (1986) describe la estructura generada por un complejo entre un ion
polivalente (Mg, Mn, Ca) y moléculas de colorante natural, con al menos un grupo hidroxilo
en su estructura, menciona que un ion metálico se unirá de manera óptima a un grupo
carboxilo de la molécula de pigmento y es probable que algunos de los iones se unan a dos
moléculas de pigmento.

La señal de 400 a 800 cm-1 podría también ser un indicador de que el complejo se está
formando, Zhao et al., (2010) encontraron una nueva señal de 400 a 500 cm -1 que indica la
formación del complejo cúrcumina-Cobre.

58
 PC
0.45 (1:2)
CO
ES

Intensidad 0.30

0.15

0.00

400 800 1200 1600 2000 2400 2800 3200 3600 4000 4400
-1
cm
Figura 23.
Figura 15. Espectro FTIR: Comparación de la muestra (1:2) vs Estándar de bixina (ES), Polvo
comercial (PC) y el control (CO) de la reacción Rx4.

El corrimiento de la banda correspondiente al grupo carbonilo C=O, de las muestras CO y

(1:2) se muestran de manera ampliada en la figura 15.

PC
(1:2)
CO
0.06
ES

0.04
Intensidad

0.02

0.00

1600 1800 2000

-1
cm

Figura 16. Espectro FTIR: Zoom en la zona de 1600 a 1800 cm -1

59
8.8. Objetivo 3: Desarrollar la metodología de encapsulamiento del complejo
seleccionado para la generación de microemulsiones estables.

8.8.1. Microencapsulados

Se llevó acabo el microencapsulamiento del colorante complejo bixina-cobre, se usó goma

arábiga (GA), maltodextrina (MD) y una combinación de ambas para la microencapsulación,
fueron secados por aspersión. A los polvos obtenidos se les midió porcentaje de humedad,
solubilidad, concentración de bixina en agua y etanol, porcentaje de eficiencia de
microencapsulado (EM), se midió la estabilidad a luz solar y tratamiento térmico, en la tabla
9 se muestra los resultados.

Tabla 9. Microencapsulado, humedad, cuantificación de bixina y eficiencia de encapsulación.

Concentración
µg bixina ml¯¹
Solubilidad
% en agua
Humedad mg ml-1 Agua Etanol % EM
1. GA 7.05±0.7 133.3±0.004 0.34 ___ 98.6±0.1
2. MD 3.82±0.1 142.8±0.002 0.23 0.14 97.9±0.8
3. GA- MD 3.89±0.6 154.9±0.006 0.92±0.0005 0.66 98.59±0.2
Resultados del promedio de tres replicas.

El contenido de humedad varió entre 3.82 y 7.05% y mostró una diferencia significativa
cuando se usaron diferentes tipos de materiales para encapsular. Los polvos producidos con
goma arábiga mostraron el mayor contenido de humedad, probablemente debido a su alta
higroscopicidad, ya que tiene muchas ramificaciones hidrófilas que promueven una mayor
adsorción de agua del medio ambiente según lo explican Tonon et al., (2012).

60
Se cuantificó las concentraciones de bixina en agua y etanol, en agua fueron mayores que las
concentraciones medidas en etanol, esto se pudiera deber a que la solubilidad de las gomas
es mayor en agua que en etanol. Barbosa et al, (2005) obtuvieron una concentración de
bixina encapsulada en MD de 0.538 µg ml¯¹, la concentración obtenida en este trabajo es
menor, debido a que la eficiencia de microencapsulado afecta la concentración del colorante,
con MD tuvo menor porcentaje de eficiencia de microencapsulado.

Como se describió previamente, la eficiencia de microencapsulación varió de 97.9 a 98.6% y

se vio influenciada por el tipo de goma y por la concentración de bixina. No hubo diferencia
significativa en al ANOVA.

Con MD tuvo la menor eficiencia de microencapsulado, Barbosa et al., (2005) mencionan que
se puede atribuir a la falta de propiedades emulsionantes y a la baja capacidad de formación
de barrera de la maltodextrina.

8.8.2. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados

Las muestras obtenidas del secado por aspersión se analizaron en una prueba de estabilidad
a luz solar, las muestras fueron puestas a un mismo valor de absorbancia en el UV-vis, se usó
una base de agua comercial sin color para simular una bebida no alcohólica y se midió en el
UV-vis a 457 nm. En la figura 17 se muestran las gráficas de la estabilidad a luz solar.

Estabilidad a luz solar de los microencapsulados

3
2.5
2 GA
abs

1.5 MD
1 GA- MD
0.5 CO
0
0 min 30 min 60 min

Figura 17. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados.

61
Las muestras con (GA-MD) tuvieron mayor estabilidad a la luz solar, le prueba de ANOVA
confirma que estas muestras son más estables. En la figura 26 se muestran las muestras
antes y después de la exposición a luz solar.

Los polvos obtenidos con GA, MD y GA- MD presentaron diferente color, esto puede ser
debido a la cantidad de goma usada, o a las condiciones de secado, sin embargo la resistencia
a luz solar se ve mayormente afectada visualmente en las muestras GA y MD, Tonon et al.,
(2012) mencionan que la GA tienen mayor higroscopicidad y esta afecta el porcentaje de
humedad y la estabilidad del microencapsulado, Barbosa et al., (2005) mencionan que la MD
carece de propiedades emulsionantes y tiene baja capacidad de formación de barrera, lo que
puede indicar que debido a esto las muestras GA y MD tienen baja estabilidad a luz solar, sin
embargo las muestras GA-MD en combinación disminuyeron el porcentaje de humedad y
aumentaron la estabilidad a luz solar, esta estabilidad se mantuvo por una hora.

Figura 18. Estabilidad a luz solar de los microencapsulados.

62
8.8.3. Estabilidad a tratamiento térmico

Se midió la estabilidad a tratamiento térmico de las muestras encapsuladas, en la figura 27 se

muestra el porcentaje de color después del tratamiento térmico. La muestra GA- MD tuvo la
mayor retención de color con 93.2%. El polvo microencapsulado con goma arábiga y
maltodextrina es una opción para reemplazar el uso de colorantes artificiales anaranjados y
rojos en la industria de bebidas no alcohólicas, y fue capaz de mantener el color estable, bajo
condiciones de esterilización. En la figura 19 corresponde a las muestras antes y después del
tratamiento térmico.

% Retención de color después del T. Térmico

100 93.2
80.6
% Retención de color

80
62.1
60
40
20
0
GA MD GA- MD

Figura 19. Retención de color después del tratamiento térmico de los microencapsulados.

Figura 20. Muestras encapsuladas antes y después del tratamiento térmico

63
8.9. Objetivo 4: Evaluar el color de una bebida formulada con el
microencapsulado

En la tabla 10 se muestran los valores de luminosidad L* y las coordenadas cromáticas a* y

b*de las muestras: polvo comercial (PC), muestras con goma arábiga (GA), muestras con
maltodextrina (MD) y muestras con goma arábiga- maltodextrina (GA-MD)

Se observa que la muestra (PC) tiene coordenadas que ubican el color en los anaranjados,
para las muestras con goma arábiga se obtuvieron coordenadas para un color amarillo, de
igual forma para las muestras con maltodextrina; las muestras con (GA- MD) se ubicaron en
el color de los anaranjados, con esto concluimos que con el proceso de microencapsulado se
obtienen colores que van desde los amarillos hasta los anaranjados, acercándose a los rojos,
lo cual es una oportunidad para que este colorante generado pueda implementarse en
alimentos procesados y de esta forma reemplazar el uso de colorantes artificiales como el
amarillo tartrazina y el rojo 40.

Tabla 10. Coordenadas del colorímetro, bebidas con microencapsulados.

Muestra L* a* b* Color

PC 29.4 17.0 10.2 Naranja

GA 37.7 7.5 19.7 Amarillo
MD 41.3 4.8 23.9 Amarillo
GA- MD 36.6 23.6 20.7 Naranja

En la figura 20, se muestra la comparación de las bebidas formulas con el colorante

microencapsulado.

64
 Figura 21. Comparación de color de bebidas formuladas con el microencapsulado

Fuente: propia

Las variaciones de color obtenidas son importantes porque están en el intervalo de colores
que demanda la industria de alimentos, además que con este proceso de estabilización,
aumentará la importancia del colorante de bixina en la industria alimentaria, ya que el uso de
colorantes artificiales se ha ido restringiendo debido a sus efectos indeseados a la salud.

Por otro lado el tiempo de estabilidad a luz solar de los colorantes generados no es el
suficiente para competir con los colorantes artificiales aplicados en bebidas, pero se sugiere
implementarlos en otros alimentos como quesos, yogurt, panes y pastas.

Se requiere de mayor investigación para alargar la estabilidad a luz solar de los

microencapsulados.

65
IX. Resumen de resultados

- Los valores obtenidos en el análisis proximal son similares a los encontrados en la

literatura.
- Se obtuvo un rendimiento del 2.9% en el raspelling de semillas enteras, es una técnica
que no está reportada para la obtención de polvo de Bixa orellana.
- Se obtuvo un rendimiento en la extracción por maceración del 4.4%, se partió del
polvo del raspelling, fue mayor a lo obtenido por Metha et al., (2015).
- Para la extracción por soxhlet se obtuvo un rendimiento del 12.7%, se usó polvo
obtenido por raspelling.
- El extracto por maceración tiene 26.1% de bixina y el extracto etanólico tiene 5.35%,
se cuantificó por espectrofotometría UV- vis.
- El análisis por HPLC, indica que hay mayor contenido de bixina en los extractos etanol
y en aceite, usando polvo del raspelling y la concentración de norbixina en el extracto
etanólico es despreciable comparado con la concentración de bixina 124.16 Vs 0.81
mg ml-1.
- En la evaluación antioxidante de los extractos por maceración, etanólico, polvo
comercial y estándar de bixina, el extracto etanólico obtuvo un IC50= 73.7 µg/ml
menor que el estándar de bixina IC50= 321 µg/ml y que el polvo comercial IC50=
131.3 µg/ml, sin embargo es mayor al IC50 de estándares como Trolox IC50= 0.26
µg/ml y Quercetina IC50= 10.41 µg/ml
- El extracto etanólico puede ser utilizado en alimentos como colorante y como
antioxidante.
- Las reacciones de acomplejamiento con CuSO₄ en los tratamientos Rx1, Rx2 y Rx3 el
cobre no formó enlace bixina- metal y no hubo resistencia a luz solar,
estadísticamente no hay diferencia entre la muestra control y las muestras con metal.
- Las muestras con metal del Rx4 obtuvieron una mejor resistencia a luz solar,
estadísticamente hubo diferencia significativa, la relación molar bixina: metal (1:2)
es la mejor para la formación del complejo bixina- cobre.

66
- FTIR de ES, PC y EXL: los espectros son similares, en la zona de 1600 a 1800 cm -1 hay
una banda que los distingue, en el estándar está presente con más intensidad esto
puede ser atribuido a que es un compuesto puro, mientras que para el PC y EXL la
intensidad de esa banda disminuye, esto puede ser debido a que hay otros
compuestos como norbixina, visto en el TLC como dos marcas.
- FTIR de ES, PC, CO, en proporción (1:2): los espectros son similares, hay una banda
que los diferencia, entre 1600 y 1800 cm-1 el (ES) presenta un corrimiento de esa
cm-1
banda 1717 debida a que es un compuesto puro, su enlace C=O es más rígido,
para el (CO) y (1:2), la vibración está entre 1653 cm -1 que corresponde a la vibración
del enlace C=O, sin embargo en la muestra (1:2) se presenta con mayor intensidad, se
sugiere que se podría estar formando un nuevo enlace entre bixina- cobre, el (PC) no
presenta esa intensidad de banda.
- La muestra microencapsulado (GA- MD) fue la mejor en contenido de bixina, fue más
estable a luz solar y al tratamiento térmico.
- La muestra (GA- MD) retiene el color en un 93%.
- El análisis de color de las bebidas con el microencapsulado, dan colores que van
desde los rojos, amarillos y anaranjados, esto es importante porque estos colorantes
generados a partir de bixina pueden ser utilizados en alimentos y pueden reemplazar
a los colorantes artificiales como la tartrazina y el rojo 40.

67
X. Conclusiones

Derivado de las actividades realizadas en el presente proyecto de tesis se establecieron las

siguientes conclusiones:

1. Los colorantes generados a partir del acomplejamiento de bixina y sales de cubre de

grado alimenticio, son una opción innovadora que presentan termoestabilidad y
fotoestabilidad, para su aplicación en la industria de alimentos, capaces de
reemplazar el uso de colorantes artificiales en aplicaciones de exposición solar
limitada.
2. En relación a la etapa de extracción de bixina a partir de semillas de Bixa orellana
l., el raspelling de las semillas incrementa los rendimientos de extracción de bixina ya
que el proceso de extracción por soxhlet se aplica a un material con mayor contenido
de bixina permitiendo a la vez, un uso alternativo de la semilla residual.
3. En relación a la etapa de estabilización química o acomplejamiento químico, el
acomplejamiento con cobre presenta los niveles más altos en termoestabilidad y
fotoestabilidad permitiendo un color más resistente, en comparación con el pigmento
original.
4. El microencapsulado de los complejos de bixina y cobre incrementan la estabilidad
del colorante generado en bebidas formuladas con los microencapsulados. Sin
embargo estos pigmentos acomplejados no alcanzan estabilidad equiparable a los
colorantes sintéticos por lo que requieren una presentación que reduzca su
exposición directa a luz solar.

68
 XI. BIBLIOGRAFIA

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Zn(II) and Cu(II) ions based on experiment and theoretical calculation. Journal of Molecular
Structure, 316-325.

73
 XII. Anexos

12.1. Anexo 1. Curva patrón de Quercetina

En la evaluación de Quercetina como estándar 1, se usaron concentraciones que se

establecieron por medio de un screening, donde el porcentaje de inhibición antioxidante
estuviera entre el 20% y el 70%, en la tabla siguiente se muestra las concentraciones
utilizadas para la curva estándar.

Tabla 1. Porcentaje de inhibición de quercetina.

Quercetina
% Inhibición
ppm antioxidante
16.868 18.98772087
29 34.68104223
40 45.01347709
71.132 88.88140162

Curva estándar de Quercetina

100
Inhibición (%)

80 y = 1.2859x - 3.5793
60 R² = 0.996
40
20
0
0 20 40 60 80
Concentración (ppm)

Figura 1.Curva patrón de quercetina

Fuente: propia (2017)

74
12.2. Anexo 2. Curva patrón de Trolox

Para Trolox como estándar 2, se usaron concentraciones que se establecieron por medio de
un screening, donde el porcentaje de inhibición antioxidante estuviera entre el 20% y el 80%,
en la tabla siguiente se muestra las concentraciones utilizadas la curva estándar.

Tabla 2. Porcentaje de inhibición antioxidante de trolox.

Trolox
%Inhibición
µM
antioxidante
40 21.6914265
53.34 28.9025644
71.132 37.0256039
94.856 48.1107073
126.492 65.0552644
168.68 87.4194928

Curva estándar de Trolox

100
80
% Reducción

60
40
y = 0.5078x + 1.1061
20 R² = 0.99918
0
0 50 100 150 200
µM

Figura 2. Curva patrón de trolox

Fuente: propia (2017)

75
12.3. Anexo 3. Curva para determinar el IC50 del extracto etanólico

En la siguiente tabla se muestran las concentraciones usadas para determinar el porcentaje

de inhibición de actividad antioxidante y el IC50.

Tabla 3. Porcentaje de inhibición antioxidante del extracto etanólico.

Extracto etanólico
ppm % Inhibición
94.856 23.0821731
126.492 27.7641278
168.68 33.974884
224.936 41.3322413
296.524 51.1739012
400 62.8310128

%Inhibición antioxidante de
80
Ext. etanólico
% Inhibición

60

40 y = 0.1308x + 11.436
R² = 0.9975
20

0
0 100 200 300 400 500
Concentración (ppm)

Figura 3. Porcentaje de inhibición antioxidante del extracto etanólico

Fuente: propia (2017)

76
12.4. Anexo 4. Curva para determinar el IC50 del estándar de bixina

En la siguiente tabla se muestran las concentraciones usadas para determinar el porcentaje

de inhibición de actividad antioxidante y la IC50.

Tabla 4. Porcentaje de inhibición del estándar de bixina.

ppm % Inhibición
296.524 21.6005352
400 24.1499951
533.4 32.2486826
711.31 32.4062074
948.548 41.7468405
1100 47.0714761
1264.912 49.8918271
1686.788 61.8521984
2249.364 74.3916066

% de Inhibición de actividad antioxidante del

estándar de bixina
90
80
70
% Inhibición

60
50
40
30 y = 0.0272x + 15.02
20 R² = 0.9892
10
0
0 500 1000 1500 2000 2500
Concentración ppm

Figura 4. Porcentaje de inhibición antioxidante del estándar de bixina

Fuente: propia (2017)

77
12.5. Anexo 5. Curva para determinar lC50 del polvo comercial

En la siguiente tabla se muestran las concentraciones usadas para determinar el porcentaje

de inhibición de actividad antioxidante y la IC50.

Tabla 5. Porcentaje de inhibición del polvo comercial.

ppm % Inhibición
71.132 10.4689154
94.856 11.642006
126.492 16.5747803
168.68 17.4998493
224.936 24.0231906
296.524 27.6979539
400 34.1014752
533.4 49.5804166
711.31 70.0517909

% de Inhibición de actividad antioxidante del

polvo comercial
80
% Inhibición

60
40 y = 0.0895x + 2.9492
R² = 0.9852
20
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Concentración ppm

Figura 5. Porcentaje de inhibición antioxidante del polvo comercial

Fuente: propia (2017)

78
12.6. Anexo 6. HPLC, curva patrón de bixina

Tabla 6. Curva de bixina, HPLC

mg ml-1 mAU
3.5 54.91
3 42.795
2.5 38.89
2 29.02
1.5 23.575
1 15.55

Curva Bixina
60
50
40
mAU

30
y = 15.105x + 0.138
20 R² = 0.986
10
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
mg ml¯¹

Figura 6. Curva patrón de bixina, HPLC.

Fuente: propia (2018)

79
12.7. Anexo 7. HPLC, curva patrón de norbixina

Tabla 7. Curva de norbixina, HPLC

mg ml-1 mAU
0.08 34.665
0.05 24
0.03 17.075
0.01 6
0.008 2.965

Curva Norbixina
40
35
30
25
mAU

20
15
10
y = 428.34x + 1.6921
5
R² = 0.9801
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
mg ml¯¹

Figura 7. Curva patrón, norbixina.

Fuente: propia (2018)

80
12.8. Anexo 8. Espectros de HPLC

A continuación se muestran los espectros del análisis por HPLC.

12.8.1. Estandar de bixina, 3.5 mg ml-1

Como se muestra en la figura 8, cis- bixna fue identificada a 452 nm, en un tiempo de
retención de 24.4 minutos, como se observa del minuto 2 al 4 hay unas bandas no
caracteristicas de bixina, lo que se significa que el compuesto no esta puro, el estandar fue
adquirido con 90% de puereza, lo que se ve reflejado en el espectro es que hay productos de
degradación, como pueden ser compuestos de cadena más corta que bixina; estos
compuestos fueron identificados a 280 nm. Sin embargo al comparar este espectro con el de
la muestra del polvo comercial, se concluyó que el estandar de bixina no llegó con la pureza
del 90%, y por factores de almacenamiento su pureza se vio perjudicada.

Figura 8. Espectro de HPLC del estándar de Bixina.

Fuente: propia (2018)

12.8.2. Estandar de norbixina 0.8 mg ml-1

Norbixina es un apocarotenoide también presente en las semillas de Bixa orellana l. En la

figura, se muestra el espectro de identificación por HPLC del estándar de trans- norbixina, fue
identificado a 452 nm y a un tiempo de 8.5 minutos, se adquirió con un 98% de pureza. La
concentración corresponde a 0.8 mg ml-1

81
 Figura 9. Espectro de HPLC del estándar de norbixina.
Fuente: propia (2018)

12.8.3. Polvo comercial

Se muestra el espectro obtenido por HPLC del polvo comercial, fue adquirido con el 80% de
pureza, esta muestra que fue usada para hacer el proceso de acomplejamiento con cobre, el
compuesto de cis- bixina fue identificada en un tiempo de 23.1 minutos, no se detecto
precencia de norbixina.

Se observa que con el 80% de pureza no se detectan compuestos de degradación como en el

espectro del estandar de bixina y concluimos que el estandar de bixina se ha degradado, por
factores de almacenamiento.

Figura 10. Espectro de HPLC del estándar de polvo comercial (PC).

Fuente: propia (2018)

82
12.8.4. Polvo extracto por maceración

En la figura 11 se muestra el espectro por HPLC del extracto por maceración a partir de polvo
obtenido del raspelling, se identificó cis- bixina en el minuto 24.5 y no se detectó trans-
norbixina, esto se le puede atribuir al disolvente utilizado, bixina es soluble en sistemas
lipófilos, por lo que el aceite fue un buen medio para la extracción.

Figura 11. Espectro de HPLC del estándar de polvo extracto por maceración.
Fuente: propia (2018)

12.8.5. Polvo extracto por soxhlet

En la figura se observa el espectro que corresponde a la muestra del extracto etanólico, a

partir de polvo del raspelling. Cis- bixina se identificó al minuto 24.5 y trans- norbixina en el
minuto 8.6, también fueron identificados dos picos, que corresponden a cis- norbixina y
trans-bixina. (Gondi et al., (2011) identificaron trans- norbixina en el minuto 7.3, cis-
norbixina al minuto 10.8, trans- bixina en el minuto 21.2 y cis- bixina en el minuto 27.8.

Figura 12. Espectro de HPLC del extracto por soxhlet. Fuente: propia (2018)

83
12.9. Anexo 9. Acomplejamiento con Cu2+, Rx1, Rx2 y Rx3.

En la figura 13a se muestra el espectro UV-vis de la Rx1 (pH 9.5 a 50°C), 13b la Rx2 (pH 12 a
50°C), 13c la Rx3 (pH 9.5 a 75°C) y 13d la Rx4 (pH 12 a 75°C).

En las figuras 13a y 13b, se observan los espectros Uv-vis de las muestras control, (1:1), (3:1)
y (2:1), la forma del espectro de (1:1), (3:1) y (2:1) cambia respecto al control, la capacidad
absortiva de las muestras con Cu 2+ se ve disminuida; las condiciones de reacción de Rx1 y Rx2
cambia la capacidad de absorción y los productos de degradación que se podrían haber
generado.

Rx1 Cu2+
0.25
0.2
0.15 Control
abs

0.1 (1:1)
0.05 (3:1)
0 (1:2)
400 430 460 490 520 550
nm
Figura
13a. Espectro UV-vis Rx1

Fuente: propia (2017)

84
 Rx2 Cu2+
0.35
0.3
0.25
abs 0.2 Control
0.15 (1:1)
0.1
(3:1)
0.05
0 (2:1)
400 430 460 490 520 550
nm

Figura 13b. Espectro UV-vis Rx2

Fuente: propia (2017)

En la figura 13c, se observa aumento de absorbancia entre 280 y 350 nm, a 457 nm la
absorbancia se ve mayormente afectada respecto a la absorbancia de la muestra control, en
la Rx3 el Cu2+ disminuye casi totalmente la absorbancia de las muestras (1:1), (3:1) y (2:1).

Rx3 Cu2+
0.35
0.3
0.25
0.2 Control
abs

0.15 (1:1)
0.1
(3:1)
0.05
0 (1:2)
400 430 460 490 520 550
nm

Figura 13c. Espectro UV-vis Rx3,

Fuente: propia (2017)

85
En la figura 13d se observa el espectro UV-vis de la muestras de la Rx4, Bixina tiene máximos
de absorción en el UV-vis a 425, 457 y 487 nm usando acetona como solvente, bixina en
etanol sus máximos de absorción son 436, 457 y 487 nm, después de la Rx4 los máximos de
absorción se recorren: para la muestra control sus máximos fueron 430, 457 y 487 nm, para
la muestra (1:1), 435, 459 y 487 nm, para la muestra (3:1), 436, 457, 487 nm, para la muestra
(1:2), 434, 459 y 485 nm.

En la muestra control el máximo de absorción de 436 se desplaza hipsocromicamente a 430

nm, la muestra (1:1) tienen un recorrimiento batocrómico en los máximos de 435 y 459, para
la muestra (3:1) solo el primer máximo de absorción 436 se desplaza batocromicamente y
para la muestra (1:2) hay modificación en los tres máximos de absorción, para el primero de
430 a 435nm, de 457 a 459 y de 487 a 485, estos datos son similares a los reportados por
(Zhao et al., 2010), ellos reportan recorrimientos en los máximos de absorción en los
complejos cúrcumina-Cu y cúrcumina-Zn, estos recorrimientos de banda de absorción
dependen de las relaciones molares de Zn y Cu.

Rx4 Cu
0.3
0.25
0.2
control
abs

0.15
(1:1)
0.1
0.05 (3:1)
0 (1:2)
400 430 460 490 520 550
nm

Figura 13d. Espectro UV-vis Rx3

Fuente: propia (2017)

86
12.9.1. Cuantificación de bixina

Se cuantificó la concentración después de la reacción con cobre. En la figura 14 se observa

que las concentraciones de las Rx4 son mayores respecto a Rx1, Rx2 y Rx3. Dentro del grupo
de muestras de Rx4, la muestra que obtuvo mayor concentración de bixina fue (1:2). Estos
resultados se relacionan directamente con los resultados de UV-vis de Rx4, en donde se ve
claramente en la figura 13d, que la capacidad de absorción fue mayor y mejor.

Concentracion de bixina depués de la Rx con Cu

20

17.55 Ctrl Rx1

18 17.24 17.48 17.16
Ctrl Rx2
16 Ctrl Rx3
Ctrl Rx4
14 (1:1) Rx1
(1:1) Rx2
12
(1:1) Rx3
mg/L

(1:1) Rx4
10
(3:1) Rx1
8 (3:1) Rx2
(3:1) Rx3
6 (3:1) Rx4
(1:2) Rx1
4
(1:2) Rx2
2 (1:2) Rx3
(1:2) Rx4
0
Muestras con cobre

Figura 14. Concentraciones después del tratamiento con CuSO₄

Fuente: propia (2017)

87
12.9.2. Estabilidad a luz solar

Las muestras obtenidas después de las reacciones Rx1, Rx2, Rx3 y Rx4 con cobre, se
analizaron en una prueba de estabilidad a luz solar, las muestras fueron puestas a un mismo
valor de absorbancia en el UV-vis, se usó una base de agua comercial sin color para simular
una bebida no alcohólica y se midió en el UV-vis a 457 nm. En la figura 15 se muestran la
gráfica de la resistencia a luz solar.

Rx1 Estabilidad a luz solar

2.5
2
1.5 control
abs

1 (1:1)
0.5 (3:1)
0 (1:2)
0 min 30 min 60 min 90 min
Tiempo

Figura 15. Concentraciones después de Rx1 con cobre

Fuente: propia (2017). Cada punto es el promedio de tres replicas.

Se observa en la figura 16 la tendencia de degradación aumenta, los valores de absorbancia

disminuyen respecto al tiempo, al realizar un ANOVA con un alfa de 0.05, se observa que no
hay diferencia significativa entre la estabilidad de las muestras.

La figura 15 es similar a la tendencia de la figura 16, la constante degradación resulta en una

pérdida total de color.

88
 Figura 16. Estabilidad a luz solar Rx1 cobre

Fuente: propia (2017)

Rx2 Estabilidad a luz solar

3
2.5
2
control
abs

1.5 (1:1)
1 (3:1)
(1:2)
0.5
0
0 min 30 min 60 min 90min

Figura 17. Estabilidad a luz solar después de Rx2 con cobre

Fuente: propia (2017). Cada punto es el promedio de tres replicas.

Se observa en la figura 17 la tendencia de degradación aumenta, los valores de absorbancia

disminuyen respecto al tiempo, al realizar un ANOVA con un alfa de 0.05, se observa que no
hay diferencia significativa entre la estabilidad de las muestras.

89
La constante degradación resulta en una pérdida total de color.

Figura 18. Estabilidad a luz solar Rx1 cobre

Fuente: propia (2017)

Se observa en la figura 19 que la tendencia de degradación aumenta, los valores de

absorbancia disminuyen respecto al tiempo, al realizar un ANOVA con un alfa de 0.05, se
observa que no hay diferencia significativa entre la estabilidad de las muestras.

Rx3 Estabilidad a luz solar

1

0.8
control
0.6
abs

(1:1)
0.4
(3:1)
0.2 (1:2)

0
0 min 30 min 60 min 90 min 120 min

Figura 19. Estabilidad a luz solar después de Rx3 con cobre

Fuente: propia (2017). Cada punto es el promedio de tres replicas.

En la figura 20 se observa que al final de la cinética, el color no se pierde totalmente, sin

embargo no hay diferencia significativa.

90
 Figura 20. Estabilidad a luz solar Rx3 cobre

Fuente: propia (2017)

12.10. Anexo 10. Acomplejamiento con Fe+3

En la figura 21a se muestra el espectro UV-vis de la Rx1 (pH 9.5 a 50°C), 21b la Rx2 (pH 12 a
50°C), 21c la Rx3 (pH 9.5 a 75°C) y 21d la Rx4 (pH 12 a 75°C).

En las figuras 13a y 13b, se observan los espectros Uv-vis de las muestras control, (1:1), (3:1)
y (2:1), la forma del espectro de (1:1), (3:1) y (2:1) cambia respecto al control, la capacidad
absortiva de las muestras con Fe3+ se ve disminuida; las condiciones de reacción de Rx1 y Rx2
cambia la capacidad de absorción y productos de degradación se podrían haber generado.

91
 RX1 Feᶟ⁺
0.4
0.35
0.3
0.25 CONTROL -
abs

0.2
(1:1)
0.15
0.1 (3:1)
0.05 (1:2)
0
400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
nm

Figura 21 a. Espectro UV-vis de la Rx1 con Fe3+

Fuente: propia (2017)

RX2 Feᶟ⁺
2

1.5 (1:1)
(3:1)
abs

1
(1:2)

0.5 control + rx

0
400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
nm

Figura 21b. Espectro UV-vis de la Rx2 con Fe3+

Fuente: propia (2017)

En la figura 21c, se observa que la forma de los espectros no cambia como en la figura 21 a y
b, los valores de absorción son los mismo para las muestras con hierro, sin embargo se ve
una ligera absorción mayor en la muestra control, lo que sugiere que el metal no daña al
colorante pero tampoco lo está ayudando a mantener su estabilidad, por eso el espectro de
UV- vis se ve con cambios menores que los de la reacción RX1 y RX2.

92
 RX3 Feᶟ⁺
1

0.8

0.6 control +rx

abs

0.4 (1:1)
(3:1)
0.2
(1:2)
0
400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500
nm

Figura 21c. Espectro UV-vis de la Rx3 con Fe3+

Fuente: propia (2017)

Rx4 Fe3+
0.35
0.3
0.25
0.2 CONROL
abs

0.15 (1:1)
0.1 (3:1)
0.05 (1:2)
0
-0.05 400 420 440 460 480 500 520 540
nm

Figura 21d. Espectro UV-vis de la Rx4 con Fe3+

Fuente: propia (2017)

En la figura 21d se observa que la estructura de los espectros no cambia como en la figura 21
a y b. La muestra control tiene una mayor absorbancia respecto a las muestras (1:1), (3:1) y
(1:2), sin embargo el hierro no afecta la capacidad de absorción, para verificar si el hierro
está otorgando estabilidad oxidativa a bixina, se espera que en la prueba de estabilidad a luz
solar, las muestras con cobre tengan mayor estabilidad que la muestra control.

93
12.10.1. Cuantificación de bixina

Al inicio del proceso de reacción de acomplejamiento metálico, se cuantificó la concentración

de bixina en una solución stock, de la cual se partió para las diferentes reacciones, al final de
la reacción de acomplejamiento se cuantifico la concentración de bixina. A continuación se
muestra el gráfico de concentraciones de bixina por cada reacción.

Nota: el orden va desde el RX1 a RX4, cada color significa que es la misma proporción o
muestra (control, (1:1), (3:1), (1:2)) pero en diferente reacción.

Se puede observar una mayor concentración de bixina en las muestras de la Rx4, si

comparamos la concentración de la muestra Control Rx4 vs las muestras (1:1), (3:1), (1:2) de
la reacción Rx4, el control tiene una mayor concentración, esto nos sugiere que el metal está
mermando la capacidad absortiva de las muestras con metal.

94
 Concentracion de bixina depués de la Rx con
Fe3+
60

51.51
Control Rx1
50
Control Rx2
43.15 43.15 Control Rx3
41.75
Control Rx4
40
(1:1) Rx1
(1:1) Rx2
(1:1) Rx3
mg/L

30 (1:1) Rx4
(3:1) Rx1
(3:1) Rx2
(3:1) Rx3
20
(3:1) Rx4
(1:2) Rx1
(1:2) Rx2
10 (1:2) Rx3
(1:2) Rx4

0
Muestras despues del tratamiento con el Fe

Figura 22. Concentración de bixina antes y después de la reacción de estabilización con FeSO₄

Fuente: propia (2017)

12.10.2. Estabilidad a luz solar

Las muestras obtenidas después del tratamiento con Fe 3+, se analizó en una prueba de
resistencia a luz solar, las muestras fueron puestas a un mismo valor de absorbancia, fueron
diluidas en una base de agua comercial sin color, se midió en el UV-vis a la longitud de onda
de absorción de bixina 457 nm. En la siguiente figura se muestran las gráficas de la
resistencia a luz solar por cada tratamiento.

95
Se observa en las figuras la tendencia de degradación aumenta, los valores de absorbancia
disminuyen respecto al tiempo, se realizó un análisis de varianza ANOVA con un alfa de 0.05
para cada gráfico, se muestran los resultados a continuación.

Tabla 8. Valores de F y Ft del ANOVA, gráficos de resistencia a luz solar

Reacción F Ft
Rx1 0.013814 3.49029 No hay diferencia significativa
Rx2 0.01404 3.49029 No hay diferencia significativa
Rx4 0.07077 3.49029 No hay diferencia significativa

No se encontró una diferencia significativa entre las muestras control y las muestras tratadas
con Fe3+.

Rx1 Estabilidad a luz solar

3
2.5
2
Control
abs

1.5
(1:1)
1
(3:1)
0.5
(1:2)
0
0 min 30 min 60 min 90 min
Tiempo

Figura 23. Resistencia a luz solar de la reacción Rx1, con Fe 3+ Fuente: propia (2017)

Se observa en la figura 23 la tendencia de degradación aumenta, igual mete para la figura 24

la tendencia es similar, la constante degradación resulta en una pérdida total de color.

96
 Rx2 Estabilidad a luz solar
3
2.5
abs 2 Control
1.5
1 (1:1)
0.5 (3:1)
0 (1:2)
0 min 30 min 60 min 90 miin
Tiempo

Figura 24. Resistencia a luz solar de la reacción Rx2, con Fe 3+

Fuente: propia (2017)

En la figura 24, se observó que el control fue más estable que las muestras con metal, por lo
que se concluye que el hierro no está formando enlace con bixina y está mermando la
concentración de bixina y la estabilidad a luz solar.

Rx4 Estabilidad a luz solar

3
2.5
2 Control
abs

1.5 (1:1)
1 (3:1)
0.5
(1:2)
0
0 min 30 min 60 min 90 min
Tiempo

Figura 25. Resistencia a luz solar de la reacción Rx4, con Fe 3+

Fuente: propia (2017)

97
12.10.3. Evaluación a tratamiento térmico

Se evaluó la resistencia de las muestras obtenidas después de la reacción con el metal Fe3+, a
un tratamiento térmico: 110°C por 15 minutos, en la figura 26 se observa el porcentaje de
retención de color después de aplicar el tratamiento térmico.

Las muestras del tratamiento Rx2 obtuvieron una mayor porcentaje de retención de color,
por lo que se sugiere que se debe a un efecto del metal porque en la figura 22, la Rx2 no fue
la mejor, se concluyó que la reacción Rx2 tuvo mejor resistencia al tratamiento térmico pero
en estabilidad a luz solar no fue el mejor.

% Retención de color después del T. Térmico. Fe3+

Control Rx1
100.0
Control Rx2
90.0 81.7 Control Rx4
80.0 (1:1) Rx1
% Retención de color

70.0 (1:1) Rx2

60.0 (1:1) Rx4
(3:1) Rx1
50.0
(3:1) Rx2
40.0 32.7
28.9 30.5 (3:1) Rx4
30.0 (1:2) Rx1
20.0 (1:2) Rx2
10.0 (1:2) Rx4
0.0
Muestras después del tratamiento térmico

Figura 26. Porcentaje de retención de color después del tratamiento térmico.

Fuente: propia (2017)

98
12.11. Anexo 11. Acomplejamiento con Zn2+

En la figura 27a se muestra el espectro UV-vis de la Rx3 (pH 9.5 a 75°C) y 27b la Rx4 (pH 12 a
75°C).

En las figuras 27a y 27b, se observan los espectros Uv-vis de las muestras control, (1:1), (3:1)
y (2:1), la forma del espectro de (1:1), (3:1) y (2:1) no cambia respecto al control, la capacidad
absortiva de las muestras con Zn 3+ se ve aumentada para las muestras (1:1) y (3:1), este
resultado podría ser un indicio de que se está generando la formación de un enlace entre
bixina y el zinc.

Rx3 con Zn3+

0.25

0.2
Control
0.15
(1:1)
abs

0.1 (3:1)

0.05 (2:1)

0
400 450 500 550
nm

Figura 27a. Espectro UV- vis de Rx3 con Zn3+

Fuente: propia (2017)

En la figura 27b se observa el espectro de Uv- vis de la reacción Rx4, es una gráfico con mayor
similitud al control, puede ser por efecto de la temperatura ya que es importante en la
isomerización de bixina, en la Rx4 se observa que las muestras (3:1), (1:2) y el control tienen
mayor absorción que la muestra (1:1), por lo que suponemos que el metal Zn está formando
algún tipo de enlace.

99
 Rx4 con Zn3+
0.3
0.25
0.2 control
0.15 (1:1)
abs

0.1 (3:1)
0.05
(1:2)
0
-0.05 400 450 500 550
nm

Figura 27b. Espectro UV- vis de Rx4 con Zn3+

Fuente: propia (2017)

12.11.1. Cuantificación de bixina

Durante el proceso de reacción de estabilización, se cuantificó la concentración de bixina en

una solución stock de la cual se partió para los diferentes tratamientos, al final de la reacción
de estabilización también se cuantifico la concentración de bixina, a continuación se muestra
el gráfico de concentraciones de bixina por cada tratamiento.

Nota: el orden va desde la Rx3 a la Rx4, cada color significa que es la misma proporción o
muestra (control, (1:1), (3:1), (1:2)) pero en diferente tratamiento.

En la figura 28 se puede observar una mayor concentración de bixina en las muestras o

proporciones de la reacción Rx4, excepto la muestra (1:1) donde la Rx3 fue mejor; si
comparamos la concentración de la muestra Control Rx4 vs la muestra (1:2) Rx4, se observa
solo una diferencia del 0.15 mg/L, lo que sugiere es que el tratamiento con ZnSO₄ le está
otorgando resistencia.

100
 Concentración de bixina después de la Rx con Zn 3+
18.00 16.70
15.84 16.55
15.90
16.00

14.00 Control T3
Control T4
12.00
(1:1) T3
10.00
mg/L

(1:1) T4
8.00
(3:1) T3
6.00 (3:1) T4
4.00 (1:2) T3

2.00 (1:2) T4

0.00
Muestras después del tratamiento con Zn

Figura 28. Concentración de bixina antes y después de la reacción de estabilización con Zn 3+

Fuente: propia (2017)

12.11.2. Estabilidad a luz solar

Las muestras obtenidas después del tratamiento con Zn 3+, se analizaron en una prueba de
resistencia a luz solar, las muestras fueron puestas a un mismo valor de absorbancia, fueron
diluidas en una base de agua comercial sin color, se midió en el UV-vis a la longitud de onda
de absorción de bixina 457 nm. En la siguiente figura se muestran las gráficas de la
resistencia a luz solar por cada tratamiento.

Se observa en la figura 29 la estabilidad aluz solar de muestras de la Rx3, las muestras con
metal tienen una mayor absorbancia que la muestra control, sin embargo estadisticamente
no hay diferencia significativa, por lo que la perdida de color para todas las muestras es igual.
El zinc esta protegiendo al colorante pero la estabilidad no es la suficiente.

101
 Rx3 Estabilidad a luz solar
3
2.5
abs 2 Control
1.5
(1:1)
1
0.5 (3:1)
0 (1:2)
0 min 30 min 60 min 90 miin
Tiempo

Figura 29. Estabilidad a luz solar de la reacción, Rx3 muestras con Zn3+

Fuente: propia (2017)

En la figura 30 se muestra la estabilidad a luz solar de la muestras de Rx4, la perdida de color

fue igual en todas las muestras, el zinc merma la capacidad de absorción en el Uv- vis y
contribuye a la perdida de color por oxidación.

Rx4 Estabilidad a luz solar

3
2.5
2 Control
abs

1.5
(1:1)
1
0.5 (3:1)
0 (1:2)
0 min 30 min 60 min 90 min
Tiempo

Figura 30. Estabilidad a luz solar de la reacción Rx4, muestras con Zn 3+

Fuente: propia (2017)

A continuación se muestra en la tabla 9 los valores para F y Ft del ANOVA de las absorbancias
entre la Rx3 y la Rx4.

102
 Tabla 9. Valores de F y Ft del ANOVA, gráficos de resistencia a luz solar

Tratamiento F Ft
T3 0.2378 3.2388 No hay diferencia significativa
T4 0.0744 3.4902 No hay diferencia significativa

12.11.3. Estabilidad a tratamiento térmico

Se evaluó la resistencia de las muestras obtenidas después de la reacción con Zn 3+, a un

tratamiento térmico: 110°C por 15 minutos, en la siguiente gráfica se observa el porcentaje
de retención de color después de aplicar el tratamiento térmico.

Se observa que el porcentaje de retención de color en las muestras de la Rx3 (3:1) y Rx4
(1:2), es mayor que la muestra Control, por lo que suponemos que el metal le está otorgando
una mejor resistencia al tratamiento térmico.

Las condiciones de reacción y la proporción de metal influyen directamente en la estabilidad

a tratamiento térmico.

103
 % Retención de color después del T. térmico. ZnSO₄
100.00
89.98 90.25
90.00 85.62
81.01 82.97
79.6
80.00 Control T3
67.99
% Retención de color

70.00 64.08 Control T4

60.00 (1:1) T3
50.00 (1:1) T4

40.00 (3:1) T3

30.00 (3:1) T4

20.00 (1:2) T3
(1:2) T4
10.00
0.00
Muestras después del tratamiento térmico

Figura 31. Porcentaje de retención de color después del tratamiento térmico.

Fuente: propia (2017)

104