2 Apuntes Cromatografia With Cover Page v2

Accelerat ing t he world's research.
Métodos Cromatográﬁcos
Yosvani Refeca
Related papers Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 
INST IT UT O POLIT ECNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E INDUST R…

Anderson Hinest roza
Int oxicación Con Rodent icidas Superwarfarínicos Desde El Laborat orio Toxicológico
Valent ina Olmos
Niveles de pest icidas organoclorados en Cyprinus carpio (Linnaeus, 1758) del lago de Tecocomulco, Hi…
Scot t Monks
Métodos Cromatográficos
Dr. Héctor Zumbado Fernández
Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. 2010

Indice
7 Introducción a los métodos cromatográficos 1
7.1 Generalidades 1
7.2 Clasificación de los métodos cromatográficos 3
7.3 Mecanismos de separación cromatográfica 5
7.3.1 Cromatografía de adsorción 5
7.3.2 Cromatografía de reparto 6
7.3.3 Cromatografía de intercambio iónico 8
7.3.4 Cromatografía de filtración sobre gel 12
8 Cromatografía en columna 16
8.1 Generalidades 16
8.2 Etapas de trabajo de la cromatografía líquida en columna convencional 17
8.3 Eficiencia de una columna cromatográfica 23
8.3.1 Teorías de la elución cromatográfica 25
8.3.2 Otros parámetros cromatográficos de interés 31
9 Cromatografía líquida de alta resolución 35
9.2 Descripción del proceso cromatográfico 35
9.3 Los componentes del sistema cromatográfico 37
9.3.1 La fase móvil 37
9.3.2 La bomba 40
9.3.3 Sistema de inyección o válvula de introducción de muestras 41
9.3.4 La precolumna 43
9.3.5 La columna cromatográfica 43
9.3.6 Los detectores 57
9.3.7 Sistema de registro y procesamiento de la información cromatográfica 66
9.4 Modos de operación en HPLC 68
9.4.1 Régimen isocrático 68
9.4.2 Programación de la composición de la fase móvil (gradiente de elución) 68
9.4.3 Programación de flujo o presión de la fase móvil 71
9.4.4 Programación de temperatura 71
9.5 Tratamiento de muestras para HPLC 72
9.5.1 Extracción en fase sólida 72
9.5.2 Microextracción en fase sólida 74
9.6 Aplicaciones analíticas de HPLC 75
9.6.1 Análisis cualitativo 76
9.6.2 Análisis cuantitativo 79
9.6.3 Límite de detección y límite de cuantificación 89
9.7 HPLC preparativa 90
10 Cromatografía de gases 95
10.2 Descripción del proceso cromatográfico 95
10.3 El cromatógrafo de gases 96
10.3.1 Los gases 96
10.3.2 Prefiltros 98
10.3.3 Control de flujo 99
10.3.4 La cámara de inyección 99
10.3.5 La columna cromatográfica 105
10.3.6 El horno 114
10.3.7 El detector 118
10.3.8 Amplificador 130
10.3.9 Registrador 130
10.4 Tratamiento de muestras en cromatografía de gases 131
10.4.1 Derivatización 132
10.4.2 Técnicas empleadas para la extracción de componentes volátiles 133
10.4.2.1. Microextracción en fase sólida 134
10.5 Aplicaciones analíticas de la cromatografía de gases 137
11 Cromatografía en capa delgada 142
11.2 Naturaleza del proceso cromatográfico 145
11.3 Placas cromatográficas 146
11.4 Aplicación de la muestra 148
11.5 Técnicas de desarrollo de los cromatogramas 150
11.6 Técnicas de revelado 156
11.7 Análisis cualitativo 158
11.8 Análisis cuantitativo 159
7 Introducción a los métodos cromatográficos
7 .1 . Ge n e r a lida de s
La separación de los com ponent es de m ezclas com plej as de com puest os nat urales o
sint ét icos con vist as a su ident ificación y cuant ificación, ha sido siem pre un problem a de
gran int erés para la quím ica analít ica. En est e sent ido el desarrollo se ha ido m oviendo
desde la aplicación de m ét odos quím icos clásicos hast a el em pleo de t écnicas inst rum ent ales
sofist icadas que avent aj an a las prim eras en cuant o a rapidez, exact it ud, precisión y
sensibilidad.
El origen de los m ét odos crom at ográficos se rem ont a a la segunda m it ad del siglo XI X. Los
prim eros t rabaj os cient íficos de separaciones físicas not ables fueron report ados por Runge
en 1855 y Schonbein en 1861. Est os invest igadores aplicaron una m ezcla com plej a de
colorant es en un punt o de una hoj a de papel de filt ro e hicieron llegar a est e un solvent e,
observando que la m ancha inicial se expandió radialm ent e separándose en sus
com ponent es. Aunque est os result ados fueron novedosos t ranscurrieron 80 años para que
resurgiera la crom at ografía de papel com o hoy se le conoce.
Alrededor de 1892, Redd logró separaciones de com puest os quím icos basados en principios
físicos. Para ello usó t ubos llenos de kaolin en los que separó dicrom at o de pot asio de
eosina, así com o iones férricos de iones cúpricos. Hoy se conoce est e procedim ient o com o
análisis front al en crom at ografía en colum na.
Pero el verdadero padre de la crom at ografía fue el bot ánico ruso Mij ail Tswet t , el cual
publicó en 1903 la separación exit osa de varios pigm ent os veget ales ext raídos de una plant a
con ét er de pet róleo, m ediant e la aplicación del ext ract o veget al en un t ubo de vidrio relleno
con carbonat o de calcio. Tswet t observó que una vez aplicado el ext ract o, al hacer pasar
ét er de pet róleo a t ravés de la colum na la banda coloreada inicial se m ovía a t ravés de est a
y com enzaba a separarse en varias bandas igualm ent e coloreadas. La figura 7.1 ilust ra est e
experim ent o.
Sin rest ar m érit o a sus predecesores, Tswet t no solo logró la separación de los pigm ent os
veget ales sino que por las bandas coloreadas obt enidas, fue el prim ero en acuñar el t érm ino
“ crom at ografía” ( del griego “ crom a at os” que significa color y “ graphos” que se refiere a
escrit ura) . Adem ás, con gran visión cient ífica, no excluyó la posibilidad de que el m ét odo
fuera aplicado t am bién en la separación de com puest os incoloros siem pre y cuando se
ut ilizara una t écnica de visualización de las zonas correspondient es a cada com puest o.
1
Análisis I nst rum ent al de Alim ent os
7. I nt roducción a los m ét odos crom at ográficos
Figu r a 7 .1 . Ex pe r im e n t o de M ij a il Tsw e t t
En la act ualidad se m ant iene el t érm ino de crom at ografía, aun cuando la m ayoría de las
separaciones que se realizan por est a t écnica, se aplican a com puest os incoloros.
Así, la crom at ografía puede definirse com o “ aquel m ét odo de separación de los
com ponent es de una m ezcla de solut os, basado en las diferent es velocidades con
que se m ueven cada uno de ellos a t ravés de un lecho est acionario de gran
desarrollo superficial ( fase est acionaria) m ient ras son arrast rados por un fluido en
m ovim ient o ( fase m óvil) ” .
En el experim ent o de Tswet t , la fase est acionaria es el carbonat o de calcio m ient ras que la
fase m óvil es el ét er de pet róleo. Los pigm ent os veget ales de la m uest ra t ienen diferencias
de afinidad por la fase est acionaria ( algunos son m ás afines que ot ros) , lo que conduce a
que se m uevan por ella a diferent e velocidad m ient ras son arrast rados por el ét er de
pet róleo ( las m ás afines con la fase est acionaria se m overán m ás lent am ent e m ient ras que
las m as solubles en la fase m óvil lo harán m ás rápido) ; precisam ent e esa diferencia de
velocidad es lo que posibilit a la separación de los com puest os.
En 1974 la Unión I nt ernacional de Quím ica Pura y Aplicada ( I UPAC, del inglés I nt ernacional
Union Pure Applied Chem ist ry) definió la crom at ografía del siguient e m odo:
“ La crom at ografía es un m ét odo físico usado principalm ent e para la separación de los
com ponent es de una m uest ra, en el cual est os se dist ribuyen ent re dos fases, una de ellas
est acionaria m ient ras que la ot ra se m ueve. La fase est acionaria ( FE) puede ser un sólido o
un gel y puede est ar em pacada en una colum na, esparcida en form a de capa o dist ribuida
com o una película. La fase m óvil ( FM) puede ser un líquido o un gas” .
Dr. Héctor Zumbado Fernández. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Cuba 2
7 .2 . Cla sifica ción de los m é t odos cr om a t ogr á ficos

Los m ét odos crom at ográficos pueden clasificarse en función de diferent es crit erios los cuales
se describen a cont inuación.
A. En fu n ción de l m e ca n ism o físico qu ím ico qu e r ige la se pa r a ción . En est e sent ido
los m ét odos crom at ográficos pueden se clasifican en crom at ografía de adsorción,
crom at ografía de repart o, crom at ografía de int ercam bio iónico y crom at ografía de
filt ración sobre gel. Más adelant e se explicarán con det alle est os cuat ro m ecanism os.
B. En fun ción de la disposición de la fa se e st a ciona r ia . Así, se define la
cr om a t ogr a fía e n colum na cuando la separación ocurre en un sist em a cerrado ( una
colum na) , y la cr om a t ogr a fía pla na cuando la separación ocurre en una superficie
plana y abiert a ( un papel o una capa delgada) .
C. En fun ción de l e st a do de a gr e ga ción de la fa se m óvil. En est e caso se habla de la
crom at ografía líquida, cuando la fase m óvil es un líquido y la crom at ografía de gases,
cuando la fase m óvil es un gas. Si se considera adem ás el est ado de agregación de la
fase est acionaria, el cual puede ser sólido o líquido, aparecen com binaciones en función
de la fase m óvil em pleada.
La crom at ografía líquida clásica ut iliza com o fase est acionaria un líquido adsorbido por un
sólido ( crom at ografía líquido – líquido, en la que pueden ocurrir los m ecanism os de
repart o y filt ración sobre gel) o un sólido propiam ent e ( crom at ografía líquido – sólido, en
la que t iene lugar los fenóm enos de adsorción o int ercam bio iónico) . En cualquiera de los
casos considerados, la fase est acionaria puede est ar cont enida en una colum na o
dispuest a sobre una placa.
La crom at ografía líquida en colum na evolucionó en su desarrollo hacia la crom at ografía
líquida de alt a resolución ( HPLC, del inglés High Perform ance Liquid Chrom at ography) ,
m ient ras que la crom at ografía plana encuent ra hoy un gran despliegue en la
crom at ografía en capa delgada de alt a resolución ( HPTLC, del inglés High Perform ance
Thin Layer Chrom at ography) .
En crom at ografia de gases, la fase m óvil es un gas que t ransport a al solut o, que debe
encont rarse en est ado gaseoso. La t écnica m ás ut ilizada es la crom at ografía de repart o
gas- líquido, que em plea com o fase est acionaria un líquido no volát il que recubre el
int erior de la colum na. En cam bio, la crom at ografía de adsorción gas- sólido ut iliza com o
fase est acionaria part ículas sólidas sobre las que el solut o puede adsorberse.
D . En fu n ción de los obj e t ivos que se pe r siga n . Cuando los m ét odos crom at ográficos se
aplican con fines cualit at ivos y/ o cuant it at ivos se habla de crom at ografía analít ica. En
cam bio cuando el obj et ivo es sim plem ent e aislar com puest os para post eriorm ent e
cont inuar invest igaciones con ellos, se habla de crom at ografía preparat iva.
Obviam ent e, en la práct ica est as clasificaciones se m ezclan. Así, la crom at ografía líquida en
colum na puede experim ent ar los cuat ro m ecanism os de separación ( adsorción, repart o,
int ercam bio iónico y filt ración sobre gel) y aplicarse con fines analít icos o preparat ivos; de
form a parecida sucede con la crom at ografía plana ( que es t am bién crom at ografía líquida) ,
en t ant o la crom at ografía de gases t iene lugar solo en colum na y se ponen de m anifiest o los
m ecanism os de repart o y adsorción.
Las figuras 7.2 y 7.3 resum en dos m aneras de int egrar los crit erios de clasificación de los
m ét odos crom at ográficos descrit os con ant erioridad.
Figu r a 7 .2 . Cla sifica ción de los m é t odos cr om a t ogr á ficos t om a n do com o e j e con du ct or e l
e st a do de a gr e ga ción de la fa se m óvil.
Figu r a 7 .3 . Cla sifica ción de los m é t odos cr om a t ogr á ficos t om a n do com o e j e con du ct or la
disposición de la fa se e st a cion a r ia
7 .3 . M e ca nism os de se pa r a ción cr om a t ogr á fica

7 .3 .1 . Cr om a t ogr a fía de a dsor ción
La t ot alidad de los prim eros t rabaj os realizados en crom at ografía correspondía al t ipo
denom inado de adsorción, en el cual la fase est acionaria ( FE) es la superficie de un sólido
finam ent e dividido. De ahí que la crom at ografía de adsorción se insert e en la clasificación del
t ipo de crom at ografía líquido- sólido o gas- sólido.
Cuando la m uest ra disuelt a en la fase m óvil ( FM) se pone en cont act o con las prim eras
capas de adsorbent e, est e ret iene parcialm ent e al sólido, est ableciéndose con rapidez un
equilibrio ent re la cant idad de m uest ra en la FM y la ret enida por el adsorbent e ( FE) . Est e
equilibrio es dinám ico y reversible.
La separación se realiza en virt ud de las diferencias de com port am ient o de las sust ancias
que desean separarse, at endiendo a su adsorción preferencial por la superficie de un sólido
( FE) m ient ras se m ueven por la acción de un disolvent e ( FM) que puede ser un líquido o un
gas ( aunque, com o ya se ha m encionado, en lo adelant e nos referirem os solam ent e a la
crom at ografía líquido- líquido pues la crom at ografía gas- líquido se est udiará en un t em a
independient e) .
La FE adsorbe los com ponent es de la m ezcla de sust ancias que desean separarse, m ient ras
que la FM será la encargada de desorberlos. En dependencia de la fort aleza con que los
com puest os se adsorban a la FE, la FM podrá desorberlos ( arrast rarlos) con m ayor o m enor
facilidad. Es est e fenóm eno el que posibilit a que los solut os puedan ser separados, dado
que, en función de su afinidad por la FE, los m ism os se m overán a diferent es velocidades.
Se plant ea que el solut o com pit e por los sit ios act ivos de la superficie del sólido ( FE) con el
disolvent e ut ilizado com o eluyent e ( FM) .
Es im port ant e señalar que la adsorción es un fenóm eno superficial, que no involucra la
form ación de enlaces quím icos ent re el solut o y la FE. La fuerza con la que los adsorbent es
ret ienen a los com ponent es de la m uest ra son de nat uraleza m uy diversa, dest acándose
ent re ellas las causadas por fuerzas elect rost át icas y de Vander Walls e int eracciones dipolo-
dipolo. La adsorción de los com ponent es de la m uest ra depende de la est ruct ura de las
sust ancias y de del desarrollo superficial del adsorbent e. Mient ras m ayor sea la superficie
específica de un sólido, m ayor será su poder de adsorción.
La elección del adsorbent e es im port ant e en el éxit o de la separación que se pret ende
realizar. En general, para com puest os m uy polares los m ej ores adsorbent e son poco polares
m ient ras que para com puest os poco polares se requiere adsorbent es polares.
La sílica gel o gel de sílice es sin duda el adsorbent e ( FE) m ás ut ilizado para la crom at ografía
de adsorción aunque t am bién se ut iliza m ucho el óxido de alum inio ( alúm ina) y en m enor
proporción ot ros com o el óxido de m agnesio act ivo, el carbón act ivo, el silicat o de m agnesio
act ivo y la celulosa.
La act ividad de un adsorbent e depende de su nat uraleza y del t rat am ient o previo al cual
est e haya sido som et ido. Est a act ividad es una m edida de la disponibilidad de los cent ros
act ivos ( de adsorción) de un adsorbent e. Por lo general los adsorbent es m uy act ivos t ienden
a capt ar agua del am bient e, dism inuyendo así gradualm ent e su capacidad adsort iva.
Para lograr el grado de act ividad requerido en un proceso analít ico dado, se precisa
deshidrat ar com plet am ent e el adsorbent e. En el caso del gel de sílice y el óxido de alum inio
( los cuales se com ercializan con ciert o cont enido de hum edad) , la act ivación se realiza
calent ando el adsorbent e a 350 º C durant e 1 – 2 horas.
La elección de la fase m óvil ( FM) es fundam ent al para el éxit o de la crom at ografía de
adsorción. Usualm ent e se ut ilizan solvent es orgánicos de diferent e capacidad de desorción.
El parám et ro que define la capacidad de un solvent e ( FM) para desorber una sust ancia es la
fuerza de elución, la cual est á relacionada con su polaridad y con su capacidad para
com pet ir con los solut os con los cent ros act ivos del adsorbent e. De form a general, a m ayor
polaridad del solvent e, m ayor fuerza de elución. La figura 7.4 m uest ra algunos solvent es de
uso frecuent e en crom at ografía de adsorción organizados en función de su polaridad y fuerza
de elución.
Figu r a 7 .4 . Solve n t e s de e m ple o fr e cu e n t e e n cr om a t ogr a fía de a dsor ción

Exist en diferencias en la t endencia de los com puest os a adsorberse. Por ej em plo puede
encont rarse una correlación posit iva ent re las propiedades de adsorción y el núm ero de
grupos hidroxilos de una m olécula; exist e una correlación sim ilar con los dobles enlaces y los
com puest os que cont ienen ciert os grupos funcionales t ienden a ser m ás fuert em ent e
ret enidos que ot ros. Así, la t endencia a ser adsorbido dism inuye en el siguient e orden:
ácido > alcohol > carbonilo > est er > hidrocarburos. Tam bién influye la nat uraleza del
adsorbent e ( FE) . Gran part e de los conocim ient os sobre est e cam po son em píricos y la
elección del adsorbent e ( FE) y del disolvent e ( FM) para una separación dada debe hacerse
con frecuencia en base a t ant eos.
7 .3 .2 . Cr om a t ogr a fía de r e pa r t o
La crom at ografía de part ición o repart o ( crom at ografía líquido- líquido o gas- líquido) se
originó en 1941 a part ir del t rabaj o de los ganadores del Prem io Nobel, Mart in y Synge.
Dicho procedim ient o se fundam ent a en el fenóm eno de repart o, es decir, en la dist ribución
de una m ezcla de solut os ( sust ancias que se desean separar) ent re 2 fases inm iscibles. El
repart o o dist ribución del solut o t iene lugar, at endiendo a su solubilidad preferencial ( lo cual
depende de su polaridad) , ent re la fase est acionaria ( FE) líquida unida a un soport e sólido
inert e, y la fase m óvil ( FM) que result a ser el disolvent e que fluye a t ravés de la FE y que
puede ser un líquido o un gas.
En lo adelant e nos referirem os solam ent e a la crom at ografía líquido- líquido, pues la
crom at ografía gas- líquido se est udiará en un capít ulo independient e.
Cuando la FE líquida es polar ( generalm ent e el agua) y la FM es un solvent e apolar, se habla
de crom at ografía de part ición clásica o crom at ografía de fase norm al y los solut os se
dist ribuirán según su solubilidad preferencial por alguna de las 2 fases. Así por ej em plo, si
se desean separar 2 solut os de diferent e polaridad em pleando com o FE el agua y com o FM el
et er de pet róleo, aquel de los solut os que sea m enos polar viaj ará por la FE a m ayor
velocidad puest o que será m ás fácilm ent e arrast rado por la FM en t ant o el ot ro se m overá
m ás lent am ent e dada su afinidad preferencial por la FE.
Ahora bien, cuando la FE líquida es apolar, se habla ent onces de crom at ografía de fase
reversa y en est e caso la FM ha de ser un solvent e polar o al m enos de m ayor polaridad que
la FE. La crom at ografía de fase reversa se inst rum ent o ordinariam ent e en sus inicios
em bebiendo el soport e sólido con una sust ancia apolar.
Dada la nat uraleza del proceso de part ición es necesario escoger adecuadam ent e los
solvent es a ut ilizar. En prim er lugar est os deben t ener una solubilidad con la FE lim it ada; en
caso ideal la FM y la FE deberían ser inm iscibles ent re si.
El proceso de part ición puede describirse a t ravés de la ley del repart o de Nernst según:
K=
C1
C2
donde K es el coeficient e de repart o, C1 y C2 represent an respect ivam ent e las
concent raciones en equilibrio del solut o en las fases est acionaria y m óvil.
eficiencia de un proceso crom at ográfico es el fact or de separación ( α) . Así para dos solut os A
Ot ro parám et ro im port ant e relacionado con la const ant e de repart o, que expresa la
y B, la m agnit ud α puede calcularse según:
α=
KA
KB
Siendo KA y KB las const ant es de repart o de los solut os A y B respect ivam ent e. Cuando α =
consecuent em ent e la separación ent re ellos será m ayor cuant o m as difiera α de la unidad.
1 no habrá separación pues am bos solut os t ienen idént ica afinidad por la FM y la FE, y
Los soport es ut ilizados para cont ener la FE líquida en crom at ografía de repart o requieren
poseer una buena capacidad de ret ención de líquidos m ient ras que por nat uraleza propia o a
consecuencia de la adsorción de la FE líquida, debe carecer de acción frent e a los solut os
que se pret enden crom at ografiar; quiere decir que que baj o las condiciones que se realice el
análisis no deben producirse fenóm enos de adsorción pues la com binación de fenóm enos de
repart o y adsorción en un m ism o procedim ient o crom at ográfico conduce a una m ala
separación y a pérdidas de solut os en el proceso.
Los soport e m ás com únm ent e usados en crom at ografía de repart o son la sílica gel, el polv o
de celulosa y el kieselguhr, ent onos los casos, em bebidos con la fase est acionaria.
Un t ipo de em paque cuyo uso se ha generalizado en la act ualidad es la llam ada
crom at ografía de fase ligada o crom at ografía de fase quím icam ent e unida, que consist e en
unir quím icanet e det erm inados grupos funcionales al soport e. Las superficies de fase ligada
ofrecen una considerable vent aj a con respect o a los líquidos sost enidos sobre sólidos ya que
el soport e no puede perder su líquido ( FE) por la acción de la fase m óvil. Sobre est e
part icular se profundizará con det alles en el capít ulo 8. A m odo de ej em plo, la t abla 7.1
ilust ra el com port am ient o de algunas fases ligadas com ercializadas indust rialm ent e.
Tabla 7.1. Crom at ografía de fase ligada con soport e de sílica gel.
N om br e Gr u po funciona l u n ido Tipo Aplica cione s

Tipo Diol Si- ( CH2 ) 3 - O- CH2 - CH( OH) - CH2 ( OH) Fase norm al Com puest os polares
Tipo Am ino Si- ( CH2 ) 3 - NH2 Fase norm al Com puest os polares
Tipo Ciano Si- ( CH2 ) 3 - CN Fase norm al o Com puest os
reversa según m oderadam ent e
FM usada polares y polares
Tipo Est er Si- OR Fase norm al Com puest os polares
Tipo Siloxano Si- O- SiR Fase norm al Com puest os polares
RP- 2 o C- 2 Si- ( CH3 ) 2 Fase reversa Com puest os polares y
m oderadam ent e
polares
RP- 8 o C- 8 Si- ( CH2 ) 7 - CH3 Fase reversa Com puest os polares y
m oderadam ent e
polares
RP- 18 o C- 18 Si- ( CH2 ) 17 - CH3 Fase reversa Com puest os polares y
m oderadam ent e
polares
La fuerza de elución de los solvent es em pleados en crom at ografía de part ición dependerá del
t ipo de la nat uraleza de la FE. Así, si est am os en presencia de una part ición en fase norm al
los solvent es m ás polares t endrán una m ayor fuerza de elución pues serán m ás afines con
los solut os que int eract úan con la FE, en cam bio si se t rat a de una crom at ografía de fase
reversa, los solvent es m enos polares serán los que con m ayor facilidad int eract uaran con los
solut os evidenciando una m ayor fuerza de elución.
7 .3 .3 . Cr om a t ogr a fía de in t e r ca m bio ión ico
La int eracción que t iene lugar en est e t ipo de crom at ografía es de nat uraleza iónica, es decir
los com ponent es de la m ezcla que se desean separar t ienen que est ar en form a de iones
cargados.
Los int ercam biadores de iones son com puest os orgánicos sint ét icos llam ados resinas, que
poseen cargas posit ivas o negat ivas y est án unidos a cont raiones lábiles de carga opuest a
que son desplazados con facilidad por los iones de la m uest ra, los cuales int eraccionan con
la resina y ocupan sus cent ros act ivos ( posit ivos o negat ivos) luego de int ercam biarse con
los cont raiones.
Dicho de ot ra form a, la separación se basa en el equilibrio que se est ablece por part e de los
iones del solut o ent re el disolvent e ( FM) y los grupos cargados posit iva o negat ivam ent e
cont enidos en la fase est acionaria sólida ( resina int ercam biadora) . Así, la crom at ografía de
int ercam bio iónico en función del est ado de agregación de la FM y la FE se clasifica com o
crom at ografía líquido – sólido.
Las resinas int ercam biadoras pueden ser cat iónicas o aniónicas, en dependencia de su carga
y de los solut os que int ercam bien.
Las resinas cat iónicas poseen grupos funcionales cargados negat ivam ent e y se em plean para
separar iones de carga posit iva ( de ahí su nom bre de cat iónicas) que son at raídos por la
resina y se int ercam bian con los cont raiones lábiles.
Las resinas aniónicas est án por el cont rario cargadas posit ivam ent e y se em plean para
separar iones de carga negat iva ( de ahí su nom bre de aniónicas) que se int ercam bian
igualm ent e con los cont raiones lábiles.
La figura 7.5. m uest ra un esquem a de la est ruct ura general de las resinas int ercam biadoras
unidas a sus cont raiones lábiles.
Figu r a 7 .5 . Re sin a s in t e r ca m bia dor a s.
El m ecanism o de int ercam bio iónico se describe a cont inuación t om ando com o ej em plo la
separación de una m ezcla de iones de carga negat iva, para lo cual es necesario em plear una
resina aniónica. Las et apas que t ienen lugar en el proceso de separación crom at ográfica son
las siguient es:
1 . Equ ilibr a r la r e sina
El prim er paso del proceso consist e en equilibrar la

resina de int ercam bio iónico, es decir hacer pasar a
t ravés de la colum na crom at ográfica que cont iene la
fase est acionaria una disolución que aport e los
cont raiones lábiles de carga opuest a ( negat iva en est e
caso pues se t rat a de una resina aniónica) que ocupe
los sit ios act ivos posit ivos de la resina. ( figura 7.6)
Figu r a 7 .6 . Equ ilibr io de la r e sin a
2 . Aplica ción de la m u e st r a
En est a segunda et apa se aplica la m uest ra form ada por los iones de carga negat iva que se
desean separar. Los com ponent es de la m ezcla son at raídos por la fase est acionaria ( resina
aniónica) y se int ercam bian con los cont raiones lábiles ocupando los sit ios act ivos de la
resina. La fuerza con la que est os aniones se fij en a la resina dependerá de su densidad de
carga; así, los iones de m ayor densidad de carga negat iva se fij arán con m ayor fuerza
m ient ras que los de m enor densidad de carga lo harán m as débilm ent e. De cualquier
m anera t odos los aniones desplazarán a los cont raiones y quedarán adheridos a la resina de
carga opuest a, ocurriendo así el prim ero de los int ercam bios ( figura 7.7)
Figu r a 7 .7 . Aplica ción de la m u e st r a
3 . Se pa r a ción de los com pon e nt e s
Para eluir los com ponent es fij ados a la resina se hace pasar ahora por la colum na
crom at ográfica un disolvent e que act úa com o fase m óvil y cont iene iones de carga negat iva
que efect úan un segundo int ercam bio iónico desplazando a los solut os de los cent ros act ivos
de la fase est acionaria.
La diferencia de velocidad de los iones de la m uest ra est ará en

dependencia de la fuerza con est én fij ados a la resina, es decir
dependerá de su fuerza iónica. Aquellos solut os m ás débilm ent e
unidos a la fase est acionaria serán los prim eros en ser
desplazados ( int ercam biados) por los iones de la fase m óvil y
por lo t ant o de m overán a m ayor velocidad, en t ant o aquellos
m ás fuert em ent e adsorbidos, por poseer una m ayor densidad
de carga negat iva serán m ás difíciles de desplazar por el
disolvent e iónico ( FM) y se m overán a m enor velocidad ( figura
7.8) , lo que garant iza su separación de los prim eros.
Figu r a 7 .8 . Se pa r a ción
de los solu t os
4 . Re ge ne r a ción de la r e sina
Una vez separados los solut os ( aniones en est e caso) , es necesario regenerar la resina para
recuperar sus condiciones iniciales, es decir, hacer pasar nuevam ent e la solución cont ent iva
de los cont raiones lábiles. Así, quedará list a la resina para realizar un nuevo proceso de
separación por int ercam bio iónico.
Result a esencial com prender que la fuerza con que es ret enido un ion por un int ercam biador
depende de la nat uraleza de am bos. Así, para una m ism a resina las diferencias con que son
ret enidas las dist int as especies iónicas de una solución dependerá de la nat uraleza de los
iones y del pH del m edio, pues est e últ im o influye en la ionización del com puest o.
Por ej em plo, un int ercam biador cat iónico a t ravés del cual se pasa una solución de cat iones
de diversa carga, ret iene preferent em ent e y con m ayor fuerza aquellos de m ayor carga y
con m enor fuerza a los de carga unit aria, est ableciéndose un orden de ret ención com o se
indica a cont inuación: M4+ > M3+ > M2+ > M+ .
Por ot ra part e, dent ro de un grupo de cat iones con la m ism a carga se est ablece t am bién un
orden de ret ención, siendo fij ados con m ayor fuerza aquellos cat iones con m enor diám et ro
efect ivo y aquellos m enos fuert em ent e ret enidos serán los m ás volum inosos.
Los grupos funcionales de las resinas cat iónicas son principalm ent e los grupos sulfónico o
carboxilo dispuest os sobre una m at riz orgánica de poliest ireno o poliacrílica. Las resinas
aniónicas por su part e, est án const it uidas por bases insolubles cuyos grupos funcionales son
am inas t erciarias o grupos am onio cuat ernario dispuest os igualm ent e sobre una soport e
orgánico de poliest ireno.
La figura 7.9 m uest ra la est ruct ura de dos resinas int ercam biadoras en soport e de celulosa,
m ient ras en las t ablas 7.2 y 7.3 se present an algunos int ercam biadores de m ayor em pleo en
crom at ografía.
Figu r a 7 .9 . Est r u ct u r a de dos r e sin a s in t e r ca m bia dor a s e n sopor t e de ce lu losa
Tabla 7.2. I nt ercam biadores com erciales usados en crom at ografía
Ra n go ú t il
Tipo N om br e com e r cia l For t a le za Gr u po funciona l
de pH
Am berlit e I R 120 Ácido fuert e 1- 14
Dowex 50 ( X1- X16) Ácido fuert e - SO3 H 1- 14
Wofat it KPS 200 Ácido fuert e - SO3 H 1- 12
Celulosa fosforilada Ácido fuert e - O- PO3 - H2
Cat iónico
Am berlit e I RC 50 Ácido débil - COOH 5- 14
Wofat it CF 300 Ácido débil - COOH
Zeocarb 226 Ácido débil - COOH
Carboxim et il celulosa Ácido débil - O- CH2 - COOH
Ra n go ú t il
Tipo N om br e com e r cia l For t a le za Gr u po funciona l
de pH
Am berlit e I RA 400 Base m uy fuert e - N ( CH3 ) 3 1- 14
Dowex 1 ( X1- X16) Base m uy fuert e - N ( CH3 ) 3 1- 14
Am berlit e I RA 410 Base fuert e - N ( alquil) 2 alquilol 1- 12
Aniónico Dowex 2 ( X1- X10) Base fuert e - N ( alquil) 2 alquilol 1- 14
DEAE Celulosa Base fuert e - C2 H4 - N( - C2 H5 ) 2
Am berlit e I R 45 Base débil - NR2 1- 9
Dowex 3 Base débil - NR2 1- 9
Tabla 7.3. Tipos de int ercam biadores y sus aplicaciones
Tipo de r e sin a Sopor t e + gr u po fu n ciona l Aplica cione s

Cam biadora de cat iones Poliest ireno sulfonado. Cat iones, vit am inas, pépt idos y
( fuert em ent e ácida) am inoácidos.
Cam biadora de cat iones Polim et acrilat o carboxilado. Cat iones, ant ibiót icos y bases
( débilm ent e ácida) orgánicas.
Cam biadora de aniones Poliest ireno con am ina Alcaloides, halógenos, aniones y
( fuert em ent e básica) cuat ernaria. ácidos grasos.
Cam biadora de aniones Poliest ireno con am ina I ones com plej os y aniones de
( débilm ent e básica) t erciaria o poliam ida diferent e valencia.
7 .3 .4 . Cr om a t ogr a fía de filt r a ción sobr e ge l
Est e t ipo de crom at ografía, conocido por las siglas GPC ( del inglés Gel Perm eat ion
Chrom at ography) , t am bién llam ada crom at ografía de exclusión m olecular, se usa en la
separación de m ezclas de com puest os en función de la m asa m olecular de est os ( m agnit ud
que est á relacionada direct am ent e con sus dim ensiones) . Así, est a crom at ografía es
aplicable a com puest os con m asas m oleculares superiores a 2000, los cuales pueden ser
solubles en agua o solubles en solvent es orgánicos.
La fase est acionaria se obt iene al m ezclar un m at erial polím ero inert e de elevado grado de
hidrat ación con agua o soluciones buffer. El result ado es un gel form ado por gránulos o
perlas con est ruct ura parecida a un t am iz que cont ienen poros de diferent e t am año ( figura
7.10)
Figu r a 7 .1 0 . Est r u ct u r a de l ge l pa r a cr om a t ogr a fía de e x clu sión m ole cu la r
El m ecanism o de separación consist e

en que la solución de la m uest ra se
hace pasar a t ravés del gel que posee
un t am año de poro det erm inado. Las
m oléculas de alt o peso m olecular con
t am año superior al de los poros de las
part ículas del gel no pueden penet rar
en los m ism os ( se dice que son
excluidas) y se m ueven librem ent e a
t ravés de la fase acuosa en el ext erior
de los gránulos, ent re los espacios
int erpart ícula, m ient ras que las de
t am año inferior al de los poros se
int roducen en est os y ven
obst aculizado su paso a t ravés del gel,
por lo que su avance a t ravés de la
colum na se ret rasa ( figura 7.11)
Figu r a 7 .1 1 . Pr oce so de e x clu sión m ole cu la r

vist o con a u m e n t o
La fase m óvil est á const it uida por m oléculas m uy pequeñas que pueden penet rar en t odos
los poros y son las últ im as en salir de la colum na. En general el orden de elución est á dado
por el t am año ( o la m asa m olecular) . Las m oléculas grandes eluyen prim ero y le siguen las
dem ás en orden decrecient e de sus m asas m oleculares. La figura 7.12 ilust ra est e
com port am ient o.
Cor t e lon git u din a l de Et a pa 1 Et a pa 2

u n a pa r t ícu la de Aplica ción de la m u e st r a Se pa r a ción de los com pon e n t e s
polím e r o por oso de l ge l
Figu r a 7 .1 2 . M e ca n ism o de e x clu sión m ole cu la r
En la crom at ografía de filt ración sobre gel la fase m óvil es generalm ent e agua o soluciones
buffer y la fase est acionaria es el líquido acuoso del gel que se encuent ra en el ext erior de
los gránulos en los espacios int erpart ículas, de m anera que en est e caso se t rat a de una
crom at ografía líquido – líquido.
Los polím eros em pleados para form ar el gel pueden obt enerse con diferent e t am año de
poro, lo que condiciona el int ervalo de m asas m oleculares que pueden ser separadas
eficient em ent e. En sus inicios, los polím eros m ás em pleados para GPC fueron, ent re ot ros, el
Sephadex y el Biogel. La t abla 7.4 m uest ra las caract eríst icas de los geles obt enidos con
est os polím eros.
Tabla 7.4. Algunos geles hidrófilos
Ra ngo a pr ox im a do de se pa r a ción
Tipo de ge l
Pr ot e ína s globu la r e s ( PM ) Polisa cá r idos ( PM )
Sephadex G- 25 1000 – 5000 100 – 5000
Sephadex G- 50 1500 – 30 000 500 – 10 000
Sephadex G- 100 4000 – 150 000 1000 – 100 000
Sephadex G- 150 5000 – 400 000 1000 – 150 000
Sephadex G- 200 5000 – 800 000 1000 – 200 000
Biogel p- 10 – 5000 – 17 000
Biogel p- 30 – 20 000 – 50 000
Biogel p- 100 – 40 000 – 100 000
Biogel p- 200 – 80 000 – 300 000
Biogel p- 300 – 100 000 – 400 000
Las aplicaciones fundam ent ales de la crom at ografía de exclusión m olecular est án dirigidas a
la separación de sust ancias de alt o peso m olecular com o prot eínas, polisacáridos, polím eros
de t riacilgricéridos, colorant es de alt o peso m olecular, virus, ribosom as, bact erias, et c.
Tam bién se em plea en la desalinización y separación de m oléculas de baj o peso m olecular

m ezcladas con m oléculas de alt o peso m olecular y en la det erm inación del peso m olecular
de m acrom oléculas.
Ant es de concluir est e capít ulo, debe señalarse que en el present e libro no se explicarán los
diferent es m ét odos crom at ográficos siguiendo la cronología hist órica de su aparición y
desarrollo sino que, por razones m et odológicas, seguirem os el esquem a propuest o en la
figura 7.3. Es decir, se abordarán prim ero los m ét odos de crom at ografía en colum na líquida
y gaseosa ( en ese orden, a pesar que en el desarrollo hist órico de los m ét odos
crom at ográficos la crom at ografía de gases fue la prim era en alcanzar avances significat ivos
en la separación de com puest os volát iles y m ost ró un claro predom inio a m ediados del
pasado siglo sobre el rest o de las t écnicas crom at ográficas) y finalm ent e los m ét odos de
crom at ografía plana.
Bibliogr a fía .
1. Dierksm eier, G. ( 2005) . Mét odos crom at ográficos. Edit orial Cient ífico Técnica. I m preso
por I m presol Ediciones Lt da. Bogot á, Colom bia.
2. I UPAC ( 1974) . Recom m endat ions of nom enclat ure for chrom at ography. I UPAC 37, 447-
462.
3. Shoenbein, C. F. ( 1861) . Verhandel. Nat urforsch. Ges. Basel 3 Seit e 249.
4. Skoog, D y West , D. ( 1988) . Análisis I nst rum ent al. 4t a Ed., Ediciones Label.
5. Tswet t , M. ( 1903) .Proc. Warsaw Soc. Nat . Sci. Biol. Sect .
8 Cromatografía en columna
8 .1 . Ge n e r a lida de s.
La crom at ografía en colum na ut iliza para su realización unos t ubos largos y est rechos dent ro
de los cuales est á cont enida la fase est acionaria. El proceso de separación crom at ográfica
que t iene lugar en el int erior de la colum na se describe a cont inuación:
Considérese una m uest ra de dos com ponent es, A y B, que se van a separar en una colum na
por crom at ografía, ut ilizando una fase est acionaria sólida o líquida ( según se describió en el
epígrafe 7.3 del capít ulo 7) y com o fase m óvil un líquido que act úa com o eluyent e. La figura
8.1 m uest ra las dist int as et apas de la separación.
Figu r a 8 .1 . Et a pa s de la se pa r a ción cr om a t ogr á fica
I nicialm ent e se int roduce la m uest ra con los com ponent es A y B, disuelt a en el eluyent e
( FM) , en la colum na ( t iem po t 0 ) , con lo que A y B se dist ribuirán ent re las dos fases. Al ir
añadiendo eluyent e a la colum na la m uest ra irá descendiendo, pero a la vez se producirá
una dist ribución de sus com ponent es ent re las fases m óvil y est acionaria at endiendo a las
diferencias de afinidad de los com ponent es por am bas fases en función del m ecanism o de
separación que t enga lugar ( adsorción, repart o, int ercam bio iónico o exclusión m olecular) .
16
8. Crom at ografía en colum na
Est as diferencias de afinidad irán produciendo la separación de A y B ( t iem pos t 1 y t 2 ) en la

m edida que t ransit an por la colum na. Finalm ent e, los com ponent es llegan a salir por el
ext rem o de la colum na donde pueden ser recogidos. El prim er com ponent e en salir ( eluir)
será el m enos ret enido por la fase est acionaria, en est e ej em plo, el A ( t iem po t 3 ) , y
post eriorm ent e eluirá aquel que haya sido m ás fuert em ent e ret enido, en est e caso el B
( t iem po t 4 ) .
En el ext rem o de la colum na se puede colocar un det ect or que perm it a m edir una m agnit ud
represent at iva de la concent ración de cada com ponent e. La señal ( m agnit ud m edida) se
represent a habit ualm ent e en función del t iem po y la gráfica obt enida se conoce com o
crom at ogram a. Al pie de la figura 8.1, se recoge el crom at ogram a que corresponde a la
separación efect uada. Las señales obt enidas de cada com ponent e se denom inan picos, que
quedan definidos por el t iem po de ret ención ( t iem po correspondient e a la aparición del pico
del solut o en el crom at ogram a respect o al m om ent o inicial de int roducción del com puest o en
la colum na) y por el área del pico ( represent at iva de la concent ración del com ponent e) . Así,
los t iem pos de ret ención pueden ut ilizarse para análisis cualit at ivo, y las áreas, en análisis
cuant it at ivo.
8 .2 . Et a pa s de t r a ba j o de la cr om a t ogr a fía líqu ida e n colum na conve n cion a l.
En los m arcos de est e libro, definim os la crom at ografía líquida en colum na convencional
com o aquella que se realiza por et apas y con un baj o o ningún grado de aut om at ización. En
la act ualidad est e procedim ient o se em plea m uy poco y ha dado paso a la crom at ografía
líquida de alt a resolución ( HPLC, del inglés High Perform ance Liquid Chrom at ography) , sin
em bargo los principios m ás generales siguen siendo los m ism os y la explicación de cada una
de las et apas de separación por crom at ografía convencional ayudará a com prender m ás
adelant e el funcionam ient o aut om at izado de la HPLC.
Las et apas generales de est e proceso son: selección y preparación de la fase m óvil y la fase
est acionaria, aplicación de la m uest ra, corrida crom at ográfica y elución, recogida de los
eluat os y det ección de los com ponent e separados.
8 .2 .1 . Se le cción y pr e pa r a ción de la fa se m óvil y la fa se e st a cion a r ia
La selección de la fase m óvil y la fase est acionaria dependerá de la est ruct ura y
caract eríst icas de los com puest os a separar, lo que condiciona el m ecanism o de separación
que t endrá lugar en la colum na crom at ográfica. Así, si se t rat a de com puest os en los que
predom inan sus caract eríst icas de polaridad puede elegirse la crom at ografía de repart o o la
crom at ografía de adsorción con sus correspondient es soport es y eluyent es ( ver epígrafe 7.3,
capit ulo 7) . Sin em bargo si los solut os a separar son ionizables, una opción im port ant e sería
la elección de resinas int ercam biadoras com o fase est acionaria, privilegiando el m ecanism o
de int ercam bio iónico. Finalm ent e, si se desean separar com puest os de m asas m oleculares
superiores a 2000, ent onces habría que acudir a la crom at ografía de filt ración sobre gel.
Una vez seleccionada la fase est acionaria, est a se

coloca dent ro de la colum na, la cual es
generalm ent e un t ubo de vidrio de longit ud
variable cuyas dim ensiones guardan la relación
30: 1 ( largo: diám et ro int erno) .
La colum na lleva colocada en su ext rem o inferior

una llave que act úa com o regulador del fluj o de la
fase m óvil, y m uy cerca de est e est rem o poseen
un m at erial filt rant e, que puede ser vidrio
aglom erado de diversas porosidades, para evit ar
que la fase est acionaria se salga. Así m ism o, una
colum na clásica puede poseer en su ext rem o
superior un ensancham ient o que sirve de
reservorio del solvent e, lo que perm it e m ant ener
durant e m ayor t iem po condiciones est ables de
fluj o de la fase m óvil en la colum na.
La figura 8.2 m uest ra un esquem a de una colum na

crom at ográfica para t rabaj os rut inarios.
Figu r a 8 .2 . Colu m n a cr om a t ogr á fica

con r e se r vor io de solve n t e
La cant idad de fase est acionaria que debe añadirse en la colum na dependerá del problem a
analít ico a resolver. En general est o est á definido en la t écnica analít ica que se realiza, o de
lo cont rario pueden realizarse ensayos previos y det erm inarse em píricam ent e.
El llenado de la colum na es una et apa de la que depende en buena part e la eficiencia del
m ét odo. Debe garant izarse un em paquet am ient o com pact o de la fase est acionaria dent ro de
la colum na, evit ando en t odo m om ent o la presencia de burbuj as de aire o de solvent e
volát il, así com o im pedir que est a se seque después que haya sido eluida con algún solvent e
y no se haya t erm inado el t rabaj o con ella. Si n se m ant ienen est os cuidados, se producen
griet as que const it uyen viñas preferenciales para los solvent es usados com o fase m óvil
dism inuyendo la eficiencia del proceso. En general se obt ienen buenos result ados cuando la
fase est acionaria se hace llegar a la colum na suspendida en un solvent e, que ha de ser el de
m enor polaridad de t odos los que se pret endan ut ilizar en la separación.
8 .2 .2 . Aplica ción de la m u e st r a .
La aplicación de la m uest ra en la colum na crom at ográfica t iene t am bién im port ancia sobre la
calidad del result ado final. La m uest ra debe incorporarse a la colum na disuelt a en una
pequeña cant idad de fase m óvil, cuando el solvent e con el que se cargó la colum na haya
penet rado t ot alm ent e en la fase est acionaria. La aplicación se realiza con pipet a em pleando
volúm enes relat ivam ent e grandes en el orden de los m ililit ros.
8 .2 .3 . Cor r ida cr om a t ogr á fica y e lu ción de los com pon e n t e s
La corrida crom at ográfica consist e en hacer pasar la fase m óvil a t ravés de la colum na
crom at ográfica. En est e m om ent o los com ponent es de la m uest ra aplicada com enzaran a
m overse a lo largo de la fase est acionaria arrast rados por el solvent e que act úa com o fase
m óvil. La diferencia de velocidad con la que se m ueven cada uno de ellos dependerá de su
diferencias de afinidad por la fase est acionaria y por la fase m óvil, lo que condiciona su
separación y el orden con el que saldrán por el ext rem o inferior de la colum na
crom at ográfica. Est e proceso se conoce con el nom bre de elución.
Exist en diferent es m odos de eluir los com ponent es de la m ezcla aplicada en función de la
com posición de la fase m óvil em pleada en la corrida crom at ográfica, ellos son: elución
isocrát ica, elución por et apas y elución en gradient e, los cuales se describen a cont inuación.
A. Elu ción isocr á t ica
La elución isocrát ica es aquella que se realiza cuando la com posición de la fase m óvil no
varía durant e el proceso crom at ográfico. Por ej em plo si en una separación crom at ográfica
se em plea com o fase m óvil m et anol o una m ezcla m et anol: agua ( 2: 1 V- V) desde el
com ienzo hast a el final de la corrida crom at ográfica, est am os en presencia de un sist em a
isocrát ico de elución.
B. Elu ción por e t a pa s
Ocurre con frecuencia que un solo solvent e o sist em a de solvent es no es capaz de lograr una
adecuada separación de los com ponent es de una m uest ra, debido a la exist encia de
im purezas o cont am inant es que pueden int erferir en las et apas de separación. En est os
casos es necesario eluir est as int erferencias con una det erm inada fase m óvil y
post eriorm ent e ut ilizar ot ros solvent es para eluir los com puest os de int erés analít ico.
Un ej em plo ilust rat ivo es la det erm inación de ácido cít rico en vinos em pleando com o fase
est acionaria una resina de int ercam bio aniónico. Una vez aplicados a la colum na 10 m L de
vino, la m ism a se lava 3 veces con 50 m L de agua dest ilada para eluir las sust ancias neut ras
y aquellas cargadas posit ivam ent e, est os eluat os se desechan y post eriorm ent e se hace
pasa a t ravés de la colum na 200 m L de una solución de ácido acét ico 2.5 N para que los
aniones acet at os se int ercam bien con los ácidos que est án int eract uando con la resina; la
fuerza iónica del ácido acét ico es suficient e para eluir un grupo de ácidos, ent re los que se
encuent ra el ácido cit rom álico que const it uye una int erferencia, pero est a fase m óvil no es
capaz de desplazar los aniones del ácido cít rico, los cuales est án m as fuert em ent e adheridos
a la resina; est e segundo eluat o t am bién se desecha y ent onces se usa un t ercer solvent e
( 100 m L de hidróxido de sodio 2 N) , cuya fuerza iónica es m ayor que la del ácido acét ico,
pudiendo ahora los aniones hidroxilos desplazar a los aniones cit rat o y eluir el ácido cít rico
de int erés en la det erm inación.
C. Elu ción con gr a die n t e o gr a die n t e de e lu ción
El gradient e de elución es una variant e m ucho m ás eficient e que la elución por et apas para
la separación de m ezclas com plej as pero el principio general es el m ism o, es decir el cam bio
de la com posición de la fase m óvil durant e el proceso de elución crom at ográfica.
En est a caso, a diferencia de la elución por et apas, la fase m óvil at raviesa la colum na
crom at ográfica com o un fluj o cont inuo, sin int errupciones, pero su com posición ( fuerza de
elución) se hace variar gradualm ent e desde el inicio hast a el final de la separación
crom at ográfica. Est o se logra m ezclando paulat inam ent e 2 solvent es en orden crecient e de
fuerza de elución ( polaridad o fuerza iónica según el m ecanism o de separación) fuera de la
colum na de m anera que el fluj o que at raviesa la m ism a va cam biando gradualm ent e su
com posición.
Así por ej em plo un gradient e de polaridad ascendent e para una colum na de repart o fase
norm al se m uest ra en la figura 8.3.
Tal gradient e se logra m ezclando

m et anol y agua de m odo que al inicio de
la corrida la fase m óvil est ará com puest a
por únicam ent e por m et anol y
gradualm ent e su polaridad irá
aum ent ando en la m edida en que se
m ezcle con agua. De est e m odo se logra
una m ayor select ividad de la fase m óvil
que arrast rará select ivam ent e a los
com ponent es de la m ezcla los cuales
eluirán en orden de polaridad
ascendent e, es decir, los m enos polares
se m overán con m ayor velocidad y
eluirán prim ero en t ant o los m ás polares
serán los últ im os. Figu r a 8 .3 . Gr a die n t e de pola r ida d a sce n de n t e
Con est e sencillo procedim ient o se pueden lograr gradient es lineales siem pre y cuando los
recipient es que cont ienen los solvent es 1 y 2 poseen el m ism o diám et ro y cont engan iguales
volúm enes. Usando recipient es de diferent e diám et ro de obt ienen m ezclas con un aum ent o
no lineal de 2 en 1.
8 .2 .4 . Re cogida de los e lua t os y de t e cción de los com pon e n t e s
En la crom at ografía en colum na convencional m ás ort odoxa los com ponent es separados se
recogen disuelt os en la fase m óvil a la salida de la colum na crom at ográfica. En est e sent ido
la recogida de los eluat os puede realizarse de dos form as diferent es en dependencia de los
obj et ivos que se persigan con la separación crom at ográfica.
Si el obj et ivo del m ét odo es separar un único com puest o de rest o de ot ros que se com port an
com o sust ancias int erferent es, usualm ent e se em plea un sist em a de elución por et apas en el
que en un prim er m om ent o, una vez aplicada la m uest ra, las int erferencias se eluyen con un
solvent e que no desplace al com puest o de int erés y est os eluat os se desechan.
Post eriorm ent e se hace pasar un segundo solvent e para eluir al analit o, el cual puede ser
recogido en un m at raz volum ét rico u ot ro recipient e quedando list o para su cuant ificación.
Puede suceder que, siguiendo est e m ism o obj et ivo, el com puest o de int erés no int eraccione
con la fase est acionaria y la aplicación de la m uest ra se realice para que las sust ancias
int erferent es queden adheridas a la fase est acionario m ient ras el analit o fluye librem ent e
con la fase m óvil y se recoge igualm ent e en un recipient e adecuado.
Ahora bien, si el obj et ivo que se persigue es la separación de varios com ponent es de una
m uest ra e int eresa obt enerlos a t odos de form a individual, ent onces los eluat os se recogen
con ayuda de un equipo llam ado colect or de fracciones.
El colect or de fracciones es un disposit ivo const it uido por un t am bor que cont iene un gran
núm ero de viales o pequeños t ubos de ensayo que recogen ciert o volum en de eluat os según
sea program ado por el analist a ( figura 8.4) .
Figu r a 8 .4 . Cole ct or de fr a ccion e s

En la m edida que com ienzan a eluir los com ponent es por el ext rem o de la colum na, los
eluat os cse recogen en el colect or de fracciones. El analist a est ablece que volum en debe ser
recogido en cada uno de los viales o t ubos de ensayo y una vez que se haya alcanzado est e
volum en en un t ubo, aut om át icam ent e el t am bor se desplaza y coloca ot ro t ubo vacío a la
salida del fluj o en la colum na. Est e proceso se repit e hast a culm inar la corrida
crom at ográfica cuya duración es t am bién est ablecida por el analist a.
Al finalizar la corrida crom at ográfica es necesario det ect ar los com ponent es eluidos, es decir
det erm inar cuant os com ponent es han sido separados. Para ello se lee una señal analít ica
( absorbancia, fluorescencia, índice de refrácción, et c) a cada uno de los eluat os recogidos en
cada uno de los t ubos de ensayo ( según el orden de elución) y se const ruye un
crom at ogram a, que es un gráfico de señal vs. volum en de elución.
Supongam os que en una separación crom at ográfica se ha recogido un volum en t ot al de 60
m L en un colect or de fracciones que ha sido regulado para recoger 1 m L en cada t ubo. Al
finalizar la corrida crom at ográfica se t endrán ent onces un t ot al de 60 t ubos de ensayo a los
que se les det erm ina individualm ent e una señal analít ica ( absorbancia por ej em plo, en un
espect rofot óm et ro) . Se obt endrán ent onces 60 pares de valores de absorbancia vs.
volum en de elución con los cuales se const ruye el crom at ogram a que aparece en la figura
8.5.
Figu r a 8 .5 . Cr om a t ogr a m a de se ñ a l vs. volu m e n de e lu ción
La línea base represent a los volúm enes de fase m óvil que no cont ienen solut o ( pues la señal
del det ect or es m ínim a) , m ient ras que cada uno de los picos que aparecen en el
crom at ogram a ( A, B y C) se corresponden con cada uno de los com ponent es d separados en
la colum na crom at ográfica. En est e caso, el com ponent e A est á cont enido en los t ubos del 8
al 18, el com ponent e B en el int ervalo del 29 al 40 y el com ponent e C en los t ubos del 48 al
57. Por ot ra part e los t ubos 13, 35 y 52 son aquellos en que es m ayor la concent ración de
los com ponent es A, B y C, respect ivam ent e.
Del análisis de est e gráfico queda claro adem ás que el com ponent e A es el de m enor
afinidad por la fase est acionaria y es el prim ero en eluir, m ient ras que el C result ó el m ás
fuert em ent e ret enido.
La figura 8.6 m uest ra un esquem a resum en del procedim ient o de recogida de los eluat os
según los obj et ivos que se persigan en la separación.
Figu r a 8 .6 . Re cogida de los e lu a t os e n fu n ción de los obj e t ivos a n a lít icos

8 .2 .5 . I de n t ifica ción y cu a n t ifica ción de los com pu e st os se pa r a dos
En la act ualidad las aplicaciones cualit at ivas y cuant it at ivas de la crom at ografía en colum na
clásica o convencional son m uy lim it adas debido al acelerado desarrollo de los m ét odos
aut om at izados de crom at ografía líquida de alt a resolución ( HPLC) y crom at ografía de gases,
los cuales const it uyen poderosas herram ient as para separación, ident ificación y
cuant ificación de m ezclas com plej as.
No obst ant e, exist en algunas det erm inaciones cuant it at ivas que se realizan por
crom at ografía en colum na clásica. En est e caso la cuant ificación se realiza en los eluat os
obt enidos em pleando generalm ent e m ét odos espect roscópicos con ayuda de una curva de
calibración.
Incluso existen técnicas reportadas de separaciones por cromatografía convencional en los que el
componente separado se cuantifica mediante métodos volumétricos. Tal es el caso de la determinación de
ácido cítrico en vinos, descrita en el epígrafe 8.2.3. En esta determinación el ácido cítrico eluido y
recogido en un matraz aforado es t ransform ado por oxidación cuidadosa en acet ona, la que se
separa por dest ilación y el et anal arrast rado se oxida a ácido acét ico y se valora sola la
acet ona por yodom et ría em pleando t iosulfat o de sodio com o pat rón valorant e.
8 .3 . Eficie n cia de u na colu m na cr om a t ogr á fica .
La eficiencia de una colum na crom at ográfica est á dada por su capacidad para lograr la
separación de dos o m ás solut os en un t iem po relat ivam ent e cort o, en dependencia de la
com plej idad de la m ezcla.
Para el est udio de la eficiencia de una colum na t om arem os com o punt o de part ida un
sist em a en que los eluat os no se recogen en un colect or de fracciones com o se explicó en el
epígrafe 8.4.2., sino que a la salida de la colum na est á colocado un det ect or que em it e una
señal analít ica correspondient e a los com ponent es que van eluyendo, la cual se regist ra
aut om át icam ent e en form a de un crom at ogram a, en est e caso de señal vs. t iem po de
ret ención ( figura 8.7) .
Figu r a 8 .7 . D e t e cción e n lín e a de los e lu a t os
La com prensión de las t eorías que explican los fenóm enos que afect an la eficiencia de una
colum na crom at ográfica requiere en prim er lugar del est udio de dos m agnit udes
crom at ográficas de enorm e im port ancia práct ica: el t iem po de ret ención ( t r) y la resolución
( R) , las cuales serán analizadas a cont inuación:
a . Tie m po de r e t e n ción ( t r )
El t iem po de ret ención ( t r) de un analit o dado m ide el lapso de t iem po que m edia ent re la
int roducción de la m uest ra y el inst ant e en que la respuest a del det ect or alcanza su valor
m áxim o ( figura 8.8) .
Figu r a 8 .8 . Tie m pos de r e t e n ción y ot r a s m a gn it u de s cr om a t ogr á fica s.
Si el t iem po de ret ención se m ide a part ir de la señal producida por un analit o no ret enido
por la fase est acionaria, ent onces est e se llam a t iem po de ret ención reducido ( t ’r) . A su vez
se llam a t iem po m uert o ( t m ) al t iem po que dem ora ese analit o no ret enido en recorrer la
colum na crom at ográfica y que coincide con el t iem po que requiere la fase m óvil para
recorrer la dist ancia desde que se int roduce la m uest ra hast a que est a llega al det ect or. En
consecuencia t m es aproxim adam ent e igual al t iem po necesario para que una m olécula de la
fase m óvil pase a lo largo de la colum na.
b. Re solu ción ( R)
La resolución es la m edida con que una colum na es capaz de separar a dos solut os con
t iem pos de ret ención m uy sem ej ant es.
Sean dos solut os 1 y 2 cuyos picos se present an m uy próxim os ( figura 8.9) . La resolución
puede calcularse por la expresión:
⎛ tr − tr1 ⎞
R12 = 2 ⎜⎜ 2 ⎟⎟
⎝ W2 + W1 ⎠
Donde t r 1 y t r 2 son los t iem pos de ret ención de am bos solut os, m ient ras que W 1 y W 2
represent an la anchura en la base de los picos 1 y 2 respect ivam ent e.
Figu r a 8 .9 . Pa r á m e t r os pa r a e l cá lcu lo de la Re solu ción e n t r e dos picos cr om a t ogr á ficos.
Si R calculado es m ayor de 1.5, los picos est án com plet am ent e separados ( 99.7% de
resolución) , aunque para los t rabaj os práct icos es suficient e que R sea igual o m ayor que 1
( resolución de 98% ) .
8 .3 .1 . Te or ía s de la e lu ción cr om a t ogr á fica
La figura 8.10 m uest ra las t rayect orias de m igración de los solut os A y B dent ro de una
colum na crom at ográfica en t res et apas: una et apa inicial, una et apa int erm edia y una et apa
cercana a la elución.
Figu r a 8 .1 0 . Pr oce so de m igr a ción de dos solu t os ( A y B)

de n t r o de u n a colu m n a cr om a t ogr á fica
La int eracción del solut o A con la fase est acionaria es m ayor que la de B, en consecuencia A
se ret rasa durant e el proceso de m igración dent ro de la colum na y sería el últ im o en eluir.
Es evident e que el m ovim ient o hacia abaj o en la colum na aum ent a la dist ancia ent re los dos
picos. Al m ism o t iem po sin em bargo t iene lugar un ensancham ient o de am bos picos
( llam ado t am bién ensancham ient o de banda o de zona) lo que dism inuye la eficiencia de la
colum na com o disposit ivo de separación.
El ensancham ient o de zona es inevit able; sin em bargo, afort unadam ent e est e proceso es
m ás lent o que la separación de los picos. De est a form a, es posible una separación net a de
am bas especies siem pre que la colum na posea una longit ud suficient e.
Result a evident e que las t eorías que int ent en sust ent ar el proceso de separación
crom at ográfico deben ser capaz de explicar dos fenóm enos: prim ero, la velocidad de
m igración de los solut os en la colum na crom at ográfica y segundo, la velocidad de
ensancham ient o de los picos durant e la m igración. En est e sent ido son válidas dos t eorías
que en la act ualidad se com plem ent an: la t eoría de los plat os t eóricos y la t eoría cinét ica.
8 .3 .1 .1 . Te or ía de los pla t os t e ór icos
La t eoría de los plat os t eóricos es la t eoría original de la crom at ografía y fue desarrollada por
Mart in y Synge en 1941. Est a t eoría considera que el em paque de una colum na
crom at ográfica est á com puest o por una serie de est rechas capas horizont ales llam adas
plat os t eóricos ( que no exist en com o una ent idad física en la colum na) . Se supone que en
cada plat o t iene lugar el equilibrio del solut o ent re la fase m óvil y la fase est acionaria. El
m ovim ient o del solut o y el disolvent e se considera ent onces com o una serie de
t ransferencias sucesivas de un plat o al siguient e.
La eficiencia de una colum na crom at ográfica será m ayor en la m edida que aum ent a el
núm ero de plat os t eóricos, pues aum ent ará t am bién el núm ero de equilibrios. Puest o que
cada solut o est ablecerá el equilibrio a diferent e velocidad, en función de su const ant e de
dist ribución ent re am bas fases ello condiciona que a m ayor núm ero de posibles equilibrios,
m ej or será la separación ent re los solut os que form an la m ezcla pues se m overán a
diferent e velocidad.
En consecuencia, el núm ero de plat os t eóricos ( N) se ut iliza com o una m edida de la
eficiencia de una colum na crom at ográfica. Un segundo t érm ino, la alt ura equivalent e de un
plat o t eórico ( H) t am bién sirve para est e fin. La relación ent re am bos parám et ros es la
siguient e:
N=
L
H
donde L es la longit ud del em paque de la colum na.
Obviam ent e N y H son inversam ent e proporcionales. Quiere est o decir que si desea
aum ent ar la eficiencia de una colum na o sea, aum ent ar el núm ero de plat os t eóricos ( N) ,
est o puede lograrse o bien aum ent ando la longit ud del em paque, o bien dism inuyendo la
alt ura equivalent e de un plat o t eórico.
El núm ero de plat os t eóricos de una colum na puede calcularse experim ent alm ent e con los
dat os de un pico crom at ográfico, según:
⎛ tr ⎞
N = 16 ⎜ ⎟
2
⎝W ⎠
donde t r es el t iem po de ret ención del solut o y W es la anchura del pico en la base.
La t eoría de los plat os t eóricos fue capaz de describir las velocidades de m igración de los
solut os de form a cuant it at iva; sin em bargo, su ut ilidad result a lim it ada porque no logró
describir los efect os de las variables responsables del fenóm eno de ensancham ient o de
banda. Com o consecuencia est a t eoría fue com plem ent ada y enriquecida por la t eoría
cinét ica que si pudo explicar el efect o de est as variables.
8 .3 .1 .2 . Te or ía cin é t ica
La observación de un pico crom at ográfico t ípico pone de m anifiest o su sem ej anza con las
curvas gaussianas o curvas de dist ribución norm al, que se obt ienen cuando se grafican
valores repet idos de una m edida en función de su frecuencia de aparición. En consecuencia
se obt iene una dist ribución sim ét rica de los dat os alrededor de un valor m edio.
La t eoría cinét ica part e del hecho de que no t odas las m oléculas del m ism o solut o se
m ueven a igual velocidad dent ro del em paque de la colum na crom at ográfica. Quiere est o
decir que, en algunos casos, el t iem po de residencia de las m oléculas de un solut o en una
fase dada puede ser m uy breve pero en ot ros puede ser m uy prolongado. Ciert as m oléculas
de un solut o viaj an m ás rápidam ent e que el prom edio en virt ud de su inclusión accident al en
la fase m óvil ( lo que se t raduce en que t ransit an al próxim o plat o t eórico sin haber
alcanzado el equilibrio) , m ient ras ot ras pueden ret ardarse debido a que perm anecen en la
fase est acionaria un t iem po m ayor que el prom edio. La consecuencia de est os procesos
individuales al azar, es una dist ribución sim ét rica de las velocidades de m igración alrededor
de un valor m edio que represent a el com port am ient o prom edio de las m oléculas del solut o.
Dicho de form a m ás sim ple, el fenóm eno de ensancham ient o de pico se debe a que no t odas
las m oléculas de un m ism o solut o t ransit an por la colum na a la m ism a velocidad sino que
unas se adelant an y ot ras se at rasan.
La figura 8.11 m uest ra el efect o perj udicial que t iene el ensancham ient o de banda en la
resolución ( separación) de los picos en un crom at ogram a y por ende en la eficiencia del
proceso.
Figu r a 8 .1 1 . Efe ct o de l e n sa n ch a m ie n t o de ba n da sobr e la

r e solu ción
En el crom at ogram a A el ensancham ient o de banda produce un
solapam ient o de los picos afect ando la resolución, m ient ras que en
el crom at ogr am a B se obt ienen picos est rechos y perfect am ent e
separados. Nót ese que los t iem pos de ret ención de los picos 1 y 2
en am bos crom at ogram as son idént icos por lo que afect ación de la
resolución es result ado del ensancham ient o de zona.
Ahora bien, ¿cuáles son las causas que provocan el ensancham ient o de un pico
crom at ográfico?
Los picos crom at ográficos se ensanchan, por lo general, debido a t res procesos baj o cont rol
cinét ico, ellos son: el efect o m ult ipaso, la difusión longit udinal y la t ransferencia de m asa
fuera del equilibrio. Las m agnit udes de est os efect os est án det erm inadas por variables
cont rolables experim ent alm ent e, t ales com o la velocidad de fluj o, el t am año de part ícula del
m at erial de em paque, las velocidades de difusión y el grosor de la fase est acionaria.
A cont inuación se explicará en que consist e cada uno de est os fenóm enos.
A. Efe ct o m u lt ipa so
El efect o m ult ipaso, t am bién llam ado efect o del cam ino m últ iple y difusión en rem olino, se
debe a la gran cant idad de t rayect orias que puede encont rar una m olécula en su cam ino a
t ravés del em paque de la colum na.
En la figura 8.12 se m uest ran las t rayect orias de dos m oléculas de un m ism o solut o,
observándose que las longit udes de est as t rayect orias no son iguales. En consecuencia los
t iem pos de residencia de am bas m oléculas de la m ism a especie en la colum na son t am bién
diferent es lo que conduce a que unas se adelant en y ot ras se at rasen.
Tal y com o se observa en la figura, el efect o m ult ipaso

puede relacionarse con el t am año y la geom et ría de las
part ículas del em paque así com o con el grado de
com pact ación del em paquet am ient o.
Por ej em plo, part e de las m oléculas de un solut o se ret rasan
en su avance cuando la fase m óvil ( líquida o gaseosa) t iene
que rodear part ículas grandes de relleno o cuando en un
punt o de la colum na hay obst rucción debido a part ículas
m uy pequeñas. En am bos casos los m ovim ient os axiales de
la fase m óvil conducen a un ensancham ient o de la banda
del solut o.
Así, el ensancham ient o de bandas debido al efect o

m ult ipaso puede dism inuirse al m ínim o si se em paquet a
cuidadosam ent e la colum na con pequeñas part ículas
esféricas cuyo t am año varíe dent ro de un
Figu r a 8 .1 2 . Efe ct o m u lt ipa so
int ervalo lim it ado, poniendo especial cuidado en evit ar la form ación de canales abiert os.
Una colum na em pacada de est a form a obligaría a las m oléculas de un m ism o solut o a
m overse por t rayect orias sim ilares a sim ilar velocidad, lo que m inim iza significat ivam ent e el
ensancham ient o del pico crom at ográfico.
Llam a la at ención el hecho de que el efect o m ult ipaso es independient e de la velocidad de
fluj o de la fase m óvil.
B. D ifusión lon git u dina l.
La difusión longit udinal se debe a la t endencia de las m oléculas de m igrar desde la porción
cent ral concent rada de una banda hacia regiones m ás diluidas de arriba y debaj o de la zona.
Dicho de ot ro m odo, es la t endencia de las m oléculas difundir desde zonas de m ayor
concent ración a zonas de m enor concent ración. Est e t ipo de difusión puede ocurrir t ant o en
la fase m óvil com o en la fase est acionaria y produce un ensancham ient o adicional del pico
crom at ográfico ( figura 8.13) .
Figu r a 8 .1 3 . D ifu sión lon git u din a l
La difusión longit udinal es m ás im port ant e cuando la fase m óvil es un gas debido a que la
velocidad de difusión en la fase gaseosa es varios órdenes m ayor que en los líquidos. El
grado de la m agnit ud de la difusión aum ent a con el t iem po, en consecuencia, el grado de
ensancham ient o será m ayor m ient ras m enor sea la velocidad de fluj o.
En virt ud de est e com port am ient o, el ensancham ient o de banda debido a la difusión
longit udinal puede dism inuirse aum ent ando la velocidad de fluj o de la fase m óvil.
C. Tr a n sfe r e n cia de m a sa fu e r a de l e qu ilibr io
La t ransferencia de m asa fuera del equilibrio, t am bién conocido com o resist encia a la
t ransferencia de m asa, es un fenóm eno en virt ud del cual las bandas crom at ográficas se
ensanchan debido a que el fluj o de la fase m óvil es por lo general t an rápido que los solut os
no pueden alcanzar un verdadero equilibrio ent re la fase m óvil y la fase est acionaria.
Dicho de ot ro m odo, puest o que el est ablecim ient o del equilibrio del solut o ent re las fases
t ranscurre con una velocidad finit a, se alcanzará com plet am ent e solo a velocidades m uy
baj as de fluj o de la fase m óvil. La t ransferencia incom plet a de m asa cont ribuye al
ensancham ient o de la banda.
Por ej em plo, al frent e de la zona en la cual se encuent ran el solut o, la fase m óvil encuent ra
fase est acionaria nueva lo que conduce a que ciert as m oléculas del solut o se t ransport en un
poco m ás abaj o de la colum na sin haber alcanzado el verdadero equilibrio ( t ransit an al
siguient e plat o t eórico sin haber alcanzado el equilibrio en el plat o precedent e) . De la m ism a
form a, det rás de esa zona los solut os de la fase est acionaria encuent ran fase m óvil nueva y
nuevam ent e la velocidad de t ransferencia de las m oléculas del solut o no es inst ant ánea;
ent onces la cola de la zona se est ira m ás de lo que ocurriría si el t iem po fuese suficient e
para lograr el equilibrio. El efect o net o es el ensancham ient o de la banda del solut o en
am bos ext rem os.
Los efect os de t ransferencia de m asa fuera del equilibrio pueden hacerse m enores si se
dism inuye la velocidad de fluj o de la fase m óvil debido a que hay m as t iem po disponible
para que se alcance el equilibrio. Adem ás, es de esperar una aproxim ación m ás est recha al
equilibrio si los canales a t ravés de los cuales fluye la fase m óvil son est rechos, de m odo que
las m oléculas del solut o no t engan que difundir a lo largo de una dist ancia grande para
alcanzar la fase est acionaria.
Por la m ism a razón, las capas de líquido inm ovilizado en la fase est acionaria ( en la
crom at ografía líquido- líquido y gas- líquido) , deben ser lo m ás delgadas posible.
Teóricam ent e la eficiencia sería m áxim a con un recubrim ient o en form a de capa
m onom olecular, pero en la práct ica est o t rae consecuencias adversas ya que por debaj o de
un ciert o espesor de fase líquida se ponen de m anifiest o efect os de adsorción del soport e, lo
que dificult a y/ o hace im posible el análisis.
Cuando la fase est acionaria es sólida ( crom at ografía líquido- sólido y gas- sólido) , la
t ransferencia de m asa fuera del equilibrio puede hacerse pequeña usando part ículas
pequeñas de m ucha superficie especifica pero sin grandes poros y griet as.
Finalm ent e, la aproxim ación al equilibrio es t am bién m ucho m ej or a t em prat uras elevadas
( para el caso de la crom at ografía de gases) y ut ilizando disolvent es de baj a viscosidad.
Se han obt enido varias ecuaciones que relacionan la eficiencia de una colum na
crom at ográfica con la m agnit ud de est os t res fenóm enos. La prim era y m ás sim ple de est as
ecuaciones se conoce com o ecuación de Van Deem t er y proporciona una relación
aproxim ada ent re la velocidad de fluj o ( u) y la alt ura equivalent e de un plat o t eórico ( H) .
est a ecuación es aplicable t ant o en crom at ografía líquida com o en crom at ografía de gases.
H=A+ + Cu
B
u
En est e caso la m agnit ud A se relaciona con el efect o m ult ipaso, B es la difusión longit udinal
y C es la t ransferencia de m asa fuera del equilibrio.
En form a m ás desarrollada, est a ecuación puede plant earse com o:
2 γ Dg
H = 2 λ dp + + ⋅ ⋅ f ⋅u
π (1 + K ) DL
d
2
8 K
u 2
en donde:
λ es el llam ado coeficient e de t ort uosidad y depende de la uniform idad del relleno y de la
form a en que se llenó la colum na.
d p es el diám et ro prom edio de las part ículas de relleno.
D g es el coeficient e de difusión del solut o en la fase líquida.
u es la velocidad lineal m edia de la fase m óvil.
γ es el fact or de laberint o de los canales o fact or de obst rucción.
K es el fact or de ret ención.
d f es el espesor prom edio de la película de fase líquida que recubre el soport e.
Con la excepción de u, los dem ás fact ores quedan fij ados cuando se selecciona: el t ipo de
soport e y fase líquida, el porcent aj e de ést a últ im a, la form a en que se llenó la colum na y el
t ipo de fase m óvil. De cualquier m odo, de las expresiones analizadas se desprende que la
eficiencia de la colum na crom at ográfica aum ent a a m edida que se hace m ínim o A, B y C, por
cuant o t am bién se m inim iza la alt ura equivalent e de un plat o t eórico lo que conduce al
increm ent o del núm ero de plat os t eóricos y con ello al est ablecim ient o de un m ayor núm ero
de equilibrios del solut o ent re am bas fases.
En la figura 8.14 se m uest ra la cont ribución de cada t érm ino de la ecuación sim plificada de
Van Deem t er en función de la velocidad de la fase m óvil, así com o su efect o net o.
Figu r a 8 .1 4 . Solu ción gr á fica de la e cu a ción de Va n D e e m t e r .

Del análisis de est e gráfico result a claro que es preciso llegar a un com prom iso ent re los
fact ores que afect an la eficiencia crom at ográfica, expresada por la ecuación de Van
Deem t er. Así hem os vist o que la alt ura del plat o t eórico H crece a baj as velocidades de la
fase m óvil debido a difusión, m ient ras que ocurre lo m ism o a elevadas velocidades por falt a
del est ablecim ient o del equilibrio. Ent re est os dos ext rem os hay un punt o que corresponde
al fluj o ópt im o. En la práct ica se t rabaj a dent ro de una zona bast ant e am plia por ciert o,
aunque es siem pre recom endable conocer cuales son los lím it es dent ro de los que es fact ible
sit uar la velocidad de la fase m óvil en el t rabaj o diario.
8 .3 .2 . Ot r os pa r á m e t r os cr om a t ogr á ficos de in t e r é s
a . Fa ct or de ca pa cida d ( k ’) .
El fact or de capacidad describe las velocidades de m igración de los analit os en la colum na y
est á relacionado con la const ant e de dist ribución ( Kc) de un solut o ent re 2 fases, es decir la
relación de la concent ración de un analit o A en la fase est acionaria, respect o al valor
correspondient e en la fase m óvil.
⎡A ⎤
K C = ⎢ FE ⎥
⎣ AFM ⎦
donde FE es la fase est acionaria y FM es la fase m óvil
Est a expresión se puede t ransform ar com o se indica:
wE
KC = E = E ⋅ M
V w V
w M w M VS
VM
donde:
w E = m asa del analit o en la fase est acionaria

VE = volum en de la fase est acionaria
w M = m asa del analit o en la fase m óvil
VM = volum en de la fase m óvil
Se llam a ent onces fact or de capacidad ( k’) a la relación de las m asas del analit o en la fase
est acionaria y la fase m óvil.
k' =
wE
wM
El fact or de capacidad puede expresarse t am bién en función de la relación del t iem po de
perm anencia del analit o en la fase est acionaria ( t ’r) respect o al valor correspondient e en la
fase m óvil ( t m ) , es decir:
k' =
tiempo que permanece el analito en la fase estacionaria
tiempo que permanece el analito en la fase móvil
o lo que es l m ism o:
k' =
t' r
tm
y se sabe que t ’r= t r – t m , ent onces k’ puede expresarse:
tr − tm
k' =
tm
En resum en el fact or de capacidad ( k’) expresa la int eracción del solut o con la fase
est acionaria. Obviam ent e a m ayor k’, m ayor será el t iem po de ret ención ( t r) del solut o.
En la crom at ografía de part ición, la cant idad de fase est acionaria es direct am ent e
proporcional a k’. En la crom at ografía de adsorción la proporcionalidad va ligada a la
superficie del adsorbent e, m ient ras que en int ercam bio iónico, la correspondencia es con el
núm ero especies ionizadas.
b. Se le ct ivida d ( α)
La select ividad expresa la ret ención relat iva ent re los m áxim os de dos picos adyacent es y
puede calcularse m ediant e la expresión:
α=
t' r2
t' r1
La det erm inación de los t iem pos que perm anecen dos com ponent es en la fase est acionaria,
evalúa las m agnit udes de sus int eracciones y se est ablece la relación de separación. La
select ividad es conocida com o eficiencia de la fase est acionaria y en la m edida que se alej e
select iva m ient ras m ayor es el valor de α.

m ás del valor 1 m ej or será la separación ent re los picos, es decir la fase est acionaria es m ás
Una vez conocidas est as dos nuevas m agnit udes se puede plant ear la ecuación m aest ra de
la resolución com o:
⎛ k' ⎞ ⎛ α − 1⎞
R= ⎜⎜ ⎟⎟ ⎜ ⎟
N
⎝1 + k ⎠⎝ α ⎠
'
4
y de la cual pueden ext raerse las siguient es conclusiones:
⎛ k' ⎞
• ⎜⎜ ⎟⎟ y
N
⎝1+ k ⎠
El t érm ino se relaciona direct am ent e con la eficiencia, m ient ras que '
4
⎛ α − 1⎞
⎜ ⎟ est án ligados a la ret ención y la select ividad, respect ivam ent e.
⎝ α ⎠
• Para t ener buenas separaciones, se necesit a que k’ sea m ayor de 2. Sin em bargo, un
valor m ayor de 6, sólo aum ent a el t iem po del análisis sin m ej orar la resolución.
• Al graficar R vs. α, se obt iene una gráfica asint ót ica por arriba de 6. Debido a que lo m ás
usual es t rabaj ar en la zona cercana a α= 1, la resolución m ej ora not ablem ent e cuando
se increm ent a de 1 a 6 el valor de α.
• Es necesario cam biar en varios ordenes de m agnit ud el valor de N para t ener una buena
resolución. Sólo se debe m ej orar N con sist em as que posean valores pequeños de H.
Únicam ent e en casos especiales, se debe t rabaj ar con colum nas m uy largas, que
producen análisis lent os.
En resum en puede plant earse que la eficiencia de una colum na crom at ográfica est a
condicionada por los siguient es fact ores:
1. Longit ud del em paque: A m ayor longit ud, m ayor núm ero de plat os t eóricos y m ayor
eficiencia, pero los análisis consum en m ayor t iem po
2. Tam año y geom et ría de las part ículas del em paque: A m enor t am año de part ícula y
m ayor hom ogeneidad y grado de com pact ación, m enor efect o m ult ipaso, y m ayor
eficiencia.
3. Diám et ro int erno del em paque: A m enor diám et ro, m enor espesor de la capa líquida que
rodea a fase est acionaria, m enor resist encia a la t ransferencia de m asa y m ayor
eficiencia.
4. Velocidad de fluj o: Exist e una velocidad de fluj o ópt im a, aunque no siem pre es necesario
t rabaj ar a est e valor ópt im o. En la práct ica la velocidad de fluj o se det erm ina
em píricam ent e.
5. Nat uraleza de la fase m óvil y la fase est acionaria: Am bas influyen en el fact or de
capacidad y en la select ividad, de ahí la im port ancia de su adecuada selección según los
obj et ivos analít icos que se persigan y las caract eríst icas de los solut os que se desean
separar así com o de la m at riz en que se encuent ren.
6. Régim en de elución: Se em plean regím enes isocrát icos o de gradient e en función de la
com plej idad de la m ezcla expresada t ant o el núm ero de com ponent es com o en sus
coeficient es de dist ribución.
La crom at ografía líquida en colum na convencional no pudo en su m om ent o sat isfacer t odas
est as exigencias. El t am año grande e irregular de las part ículas de la fase est acionaria, el
gran consum o de solvent es y m at rices, los largos t iem pos de análisis así com o la pobre
eficiencia en la separación de m ezclas com plej os, im pusieron a la crom at ografía
convencional un ret o que solo pudo vencerse con el desarrollo de la elect rónica y de nuevos
m at eriales. Así, la crom at ografía líquida en colum na convencional evolucionó al pot ent e
sist em a aut om at izado que hoy const it uye la crom at ografía líquida de alt a resolución, a la
cual dedicarem os el siguient e capít ulo.
Bibliogr a fía .
2. Mart in, A. y Synge, R. ( 1941) . Biochem . J., 35, 1358.
4. St ock, R. y Rice, C. ( 1966) . Chrom at ographic Met hods. Ed. Chapm an and Hall. LTD and
Sciense Paperbacks Second Edit ion Liverpool.
9 Cromatografía líquida de alta resolución
9 .1 . Ge n e r a lida de s
El éxito alcanzado por la cromatografía gaseosa y el desarrollo logrado en la construcción de
equipos, condujo necesariamente a la cromatografía líquida instrumental moderna, cuya
primera versión se remonta a comienzos de la década de 1960.
La cromatografía líquida de alta resolución, tal como la conocemos hoy y que
universalmente se abrevia con las siglas HPLC (del inglés High Perform ance Liquid
Chrom at ography), vino a llenar el vacío, no abarcado por la cromatografía gaseosa.
En efecto, esta nueva rama analítica se ocupa con preferencia, aunque no exclusivamente,
de aquellos compuestos con presión de vapor baja o termolábiles que, o no se pueden
cromatografiar directamente mediante la cromatografía gaseosa o requieren de un
tratamiento químico previo (derivatización), en ocasiones engorroso, consumidor de tiempo
o caro.
El éxito y la popularidad alcanzada por la cromatografía líquida desde su utilización
comercial a partir de la década de 1970 no tienen precedentes. En parte esto se debió a que
la cromatografía gaseosa ya había abierto el camino, se había alcanzado un nivel
considerable en la teoría cromatográfica y además, la construcción de equipos sofisticados
era cosa rutinaria en muchos países.
En menos de una década, la HPLC abarcó campos como el de los medicamentos, los
polímeros sintéticos y biológicos, los aminoácidos, azúcares y compuestos inorgánicos, por
solo mencionar aquellos de acceso difícil a la cromatografía gaseosa.
En la actualidad la cromatografía gaseosa y la HPLC abarcan una gran parte de la actividad
analítica que se realiza a nivel mundial. La primera, apoyada en el desarrollo de fases
estacionarias nuevas, puede contar en el presente con una fase estacionaria adecuada a
cada problema analítico particular. Además, el desarrollo de las columnas capilares y la
introducción de la sílice fundida en la construcción de éstas le han abierto un campo
extraordinario a la cromatografía gaseosa.
La HPLC, especialmente en su modalidad de fase reversa (RP del inglés Reverse Phase) que
es la que más se utiliza y se apoya en un reducido número de rellenos cromatográficos. La
gran aplicabilidad del método se basa en que la fase móvil interviene de forma decisiva en
el proceso de separación cromatográfica. Prácticamente se puede obtener una fase móvil
para cada problema analítico, variando cualitativamente (la composición) o
cuantitativamente (la proporción de los componentes) de ella.
9 .2 . D e scr ipción de l pr oce so cr om a t ogr á fico
De forma muy simplificada puede decirse que el proceso consiste en bombear a presión
elevada un solvente o sistema de solventes a través de una tubería capilar, por lo general de
acero inoxidable. Este líquido llega a una válvula que permite la introducción de la muestra
que se desea analizar.
La muestra, casi siempre una solución, se introduce mediante una jeringuilla en un
segmento de tubo capilar de volumen exacto y conocido. Accionando una válvula se logra
que la solución de la muestra se incorpore rápidamente al torrente de fase móvil. Entre la
35
Análisis I nst rum ent al de Alim ent os.
9. Crom at ografía líquida de alt a resolución
válvula de introducción de muestras y la columna cromatográfica, se sitúa generalmente una

precolumna. En los primeros cromatógrafos líquidos, esta precolumna tenía como función
garantizar que la fase móvil que salía de ella se encontrara completamente saturada
precisamente con la fase estacionaria usada en la columna cromatográfica. De este modo se
evitaba que la fase móvil, a su paso a través de la columna, arrastrara consigo la fase
cromatográficamente importante en el proceso.
Con la introducción de rellenos de fase enlazada y la reducción drástica en el tamaño de
partículas de estos, cambió la función de la precolumna, pero no su importancia. En efecto,
en la actualidad, al usarse rellenos de fase enlazada, no se requiere la precolumna
saturadora, pero la reducción del tamaño de partículas hace que las columnas estén más
expuestas al deterioro, a la obstrucción por la materia en suspensión que puede acompañar
a la muestra, a las moléculas de peso molecular elevado que como impurezas pueden
introducirse con la muestra e incluso a los solventes usados como fase móvil. La precolumna
es pues una barrera, un filtro protector adicional que alarga la vida útil de la columna.
A continuación de la precolumna se sitúa la columna cromatográfica, conectada a la primera
mediante una tubería capilar. En su modalidad clásica la columna cromatográfica es un tubo
de acero inoxidable (relleno con la fase estacionaria) de 1 m m a 4 m m de diámetro interno y
longitud variable, según la necesidad analítica pero por lo general inferior a 50 cm .
En la columna ocurre la separación cromatográfica de los componentes de la muestra. El
mecanismo de separación depende de la naturaleza de la fase móvil y de la fase estacionaria
y en esencia, la separación está determinada por las diferencias en afinidad de los analitos
por ambas fases.
A la salida de la columna se encuentra conectado el detector. En la actualidad se usa un
número reducido de detectores entre ellos: el refractométrico, el detector
espectrofotométrico, el detector electroquímico, el de fluorescencia y el de conductividad. Se
han desarrollado otros detectores pero no han sido tan utilizados comercialmente como los
mencionados.
La señal producida por el detector, previamente amplificada, se recibe en un registrador
potenciométrico donde se origina el cromatograma correspondiente. En la actualidad, la
señal puede procesarse mediante un software especializado con las ventajas inherentes que
brindan las Tecnologías de la Información y las Comunicaciones (TICs). Aunque no es una
parte esencial del sistema de cromatografía líquida, es posible también acoplar a la salida
del detector, un colector de fracciones, con el que se puede obtener separadamente las
eluciones correspondientes a un pico o un conjunto de picos según se requiera para un uso
posterior.
En la figura 9.1 se presenta un esquema correspondiente a un sistema cromatográfico
simple como el que se ha descrito en los párrafos precedentes.
Figu r a 9 .1 . Esqu e m a de u n sist e m a cr om a t ogr á fico H PLC

9 .3 . Los com pon e n t e s de l sist e m a cr om a t ogr á fico
En los párrafos siguientes se describe las partes constitutivas de un sistema de
cromatografía líquida de alta eficiencia. Siempre que sea posible se dará los parámetros
característicos o usados comercialmente.
9 .3 .1 . La fa se m óvil
La fase móvil está constituida por un solvente, una solución o un sistema de solventes,
acorde al tipo de cromatografía y a la muestra que se pretenda analizar.
La fase móvil ha de ser compatible con el detector que se requiera para llevar a cabo la
determinación.
Por lo general, la fase móvil se encuentra en recipientes de un 1 litro de capacidad, situados
por encima de los demás constituyentes del sistema cromatográfico. Mediante tubería
plástica resistente a solventes de 1 m m a 2 m m de diámetro interno, la fase móvil llega a la
bomba.
Por lo general en el extremo del tubo de toma de solventes se sitúa un filtro tubular que
impide la entrada de partículas a la bomba que sean superiores a 0,2 micrómetros.
Hay algunos requisitos que deben satisfacer los solventes usables en cromatografía líquida
de alta eficiencia, tanto en sus propiedades físicas como químicas.
Pr opie da de s física s
Las propiedades físicas más importantes de los solventes son: índice de refracción;
absorción en el ultravioleta; viscosidad y polaridad. (5)
• Í n dice de r e fr a cción . Solo es necesario tenerlo en cuenta cuando se trabaja con un
detector refractométrico. Es requisito en este caso que el solvente seleccionado tenga un
índice de refracción lo más diferente posible al de los solutos constitutivos de la muestra,
de los contrario, la sensibilidad de la determinación será baja.
• Absor ción e n e l u lt r a viole t a . Cuando se trabaja con un detector espectrofotométrico
en el rango UV, es imprescindible conocer la longitud de onda límite de uso de cada
solvente.
• Viscosida d. Esta propiedad es importantísima puesto que ella se opone al flujo del
solvente a través de la columna. Como se sabe, en HPLC la fase móvil se hace pasar a
presión elevada a través de una columna rellena con partículas muy pequeñas. Mientras
menor sea la viscosidad de un solvente a la temperatura de la columna, menor será la
presión necesaria para lograr la velocidad lineal (o el flujo) requerido para el análisis de
una muestra.
• Pola r ida d. Esta propiedad siempre es necesario conocerla tanto cuando se trabaja en
cromatografía de absorción como cuando se utiliza otros tipos de cromatografía.
En la tabla 9.1 se resume las propiedades físicas de interés de algunos solventes de uso
común en HPLC.
Tabla 9.1.
Propiedades físicas de int erés de algunos solvent es de gran uso en HPLC
Viscosida d λ lím it e Í ndice de Re fr a cción

Solve n t e
cp ( 2 0 º C) nm 2 0 º C 20º C
N - pentano 0,23 200 1,358
N - hexano 0,42 200 1,388
Ciclohexano 0,98 210 1,426
Éter etílico 0,23 220 1,353
Diclorometano 0,44 250 1,424
Acetato de etilo 0,45 260 1,37
Acetonitrilo 0,37 210 1,344
Isopropanol 2,39 205 1,375
Etanol 1,2 200 1,361
Metanol 0,6 200 1,329
Tetrahidrofurano 0,51 210 1,404
Agua 1,00 180 1,333
Es preciso señalar que las propiedades físicas de un sistema de solventes dependen de la

magnitud correspondiente de cada constituyente y de la proporción de estos en el sistema.
Por ejemplo, la viscosidad del sistema agua: metanol 1:1 es aproximadamente:
1,0 cp + 0,6 cp
= 0,8 cp
2
En donde 1,0 cp y 0,6cp son las viscosidades respectivas del agua y el metanol.
Pu r e za de los solve n t e s
La pureza de los solventes es un requisito elemental si se tiene en cuenta que la HPLC
alcanza límites de detección y de determinación en el rango de los nanogramos a los
picogramos. Desde el punto de vista químico, un solvente puro para análisis, destilado en
equipo de vidrio, está apto para usarlo en HPLC siempre que durante esta etapa purificadora
se excluya la incorporación de polvo. Sin embargo, a pesar de las medidas que se tomen en
este sentido, se recomienda siempre, antes de usar un solvente, pasarlo a través de un filtro
que retenga partículas en suspensión superiores a 0,2 micrómetros – 0,4 micrómetros. De
esta forma se obtiene un solvente adecuado para la mayoría de los trabajos en HPLC.
Una impureza sutil que acompaña a todos los solventes es la presencia en ellos de gases
disueltos, fundamentalmente oxigeno y nitrógeno. Esto origina burbujas gaseosas en la
bomba, en el dispositivo de mezclado y en el detector. Además, con el transcurso del
tiempo, el oxigeno afecta algunos constituyentes del sistema cromatográfico.
La formación de burbujas en la bomba puede producir cambios en el flujo de trabajo. Si las
burbujas se localizan en el dispositivo de mezclado, originan cambios notables en la
composición del sistema de solventes, tanto si se está trabajando con composición constante
(isocráticamente) o si se opera con un gradiente de concentración.
Pero donde más frecuentemente se forman las burbujas es en el detector, puesto que en él
la presión es baja (a la salida del detector la fase móvil está a presión atmosférica). El aire
que se mantiene disuelto en el solvente cuando este último está a presión, se libera
entonces al llegar al detector, originando las burbujas. Estas burbujas producen ruido y
deriva considerable y una inestabilidad tal que impiden trabajar cuando ellas se forman.
También se produce burbujas cuando se opera en el modo de operación llamado gradiente
de concentración con solventes en los cuales la solubilidad del aire en ellos es diferente.
Estas razones son suficientes para comprender la necesidad de desgasificar los solventes
que se usan en HPLC.
Hay diversos métodos para desgasificar solventes, algunos ya usados desde los comienzos
de la técnica de la cromatografía líquida moderna. Entre ellos se encuentran la
desgasificación por burbujeo de Helio; mediante aplicación de vacío; por reflujo o con la
utilización de un baño ultrasónico.
• D e sga sifica ción m e dia n t e cor r ie n t e de H e lio
Debido a que el He es mucho menos soluble en los solventes que el Nitrógeno y el
Oxigeno, se utiliza para desplazar a éstos. Para ellos se introduce una corriente de Helio
en la masa del solvente mediante un tubo provisto en su extremo de una placa de vidrio
aglomerado. De esta forma, la salida está constituida por burbujas pequeñas distribuidas
en el solvente. En la práctica es suficiente un flujo de 60 m l - 80 m l de He/min durante
10 minutos. Después el flujo de este gas se puede reducir a unos 20 m l/ m in para
mantener desgasificado el solvente mientras dura el trabajo. Esto es importante, pues la
redisolución del aire hasta alcanzar el nivel previo a la desgasificación se produce entre
30 minutos y 60 minutos, en dependencia del solvente y la temperatura de éste.
Para la mayoría de los solventes la eficiencia de la desgasificación con He es superior a

80 % . El agua es más difícil de desgasificar y nunca se alcanza la eficiencia señalada.
Aunque el método es satisfactorio, su costo elevado limita su uso.
• La u t iliza ción de l va cío
La desgasificación mediante vacío se utiliza cuando no se dispone de otros recursos.
Consiste simplemente en mantener a presión reducida al solvente durante unos 15
minutos. La eficiencia de la desgasificación es comparable a la del He. El agua es una
excepción, pues con el vacío apenas se alcanza una eficiencia de 30 % en el tiempo
señalado.
• El r e flu j o
Este es el método más efectivo en lo que respecta a rapidez y eficiencia. Entre 10
minutos y 15 minutos son necesarios para expulsar completamente todo el gas disuelto
en el solvente cuando este se refluja en un balón provisto de un condensador
convencional. Si se mantiene después el solvente a una temperatura cercana a su punto
de ebullición, la reincorporación del aire es despreciable. Sin embargo esto ocasiona una
atmósfera nociva y peligrosa en el área de trabajo. En nuestro Laboratorio se ha utilizado
con éxito por más de 15 años una combinación de vacío y temperatura que mantiene
desgasificada la fase móvil mientras se usa el cromatógrafo, sin los inconvenientes
mencionados.
• El ba ñ o u lt r a són ico
La introducción del frasco del solvente en un baño ultrasónico produce una
desgasificación moderada, con una eficiencia por lo general inferior a la de los demás
métodos descritos. El procedimiento es sin embargo cómodo, barato y no peligroso.
• D e sga sifica dor e s com e r cia le s
Actualmente se oferta en el mercado equipos desgasificadores que funcionan de forma
segura, eficiente y sin contaminar el área de trabajo. Esos equipos permiten la
desgasificación simultánea de varias fases móviles. La eficiencia de la desgasificación es
independiente del flujo de la fase móvil que se requiera y tampoco depende de la
composición de esta.
Finalmente es preciso señalar que la desgasificación es más difícil y menos eficiente en
aquellos solventes con polaridad grande (por ejemplo el agua).
9 .3 .2 . La bom ba
La bomba es una parte fundamental del sistema cromatográfico. Su función es la de extraer
el solvente o sistema de solventes (fase móvil) de su reservorio e impulsarlo a altas
presiones a través del sistema cromatográfico, garantizando la velocidad de flujo.
Puede decirse que el desarrollo alcanzado en la construcción de esta parte del cromatógrafo
líquido, ha sido decisiva en el avance de la HPLC. Esto resulta evidente si se analiza los
requisitos de una bomba usable en esta técnica. Cuando se trata de columnas analíticas
convencionales (diámetros internos entre 2 m m y 4 m m ) la bomba debe entregar un flujo de
solvente constante y exacto, en el rango de 0,5 m l/ m in a 10 m l/ m in. La presión de entrega
de la bomba ha de ser regulable entre 10 bar y 500 bar (146 psi y 7300 psi).
La bomba ha de trabajar de forma continua, sin interrupciones, por periodos prolongados
de tiempo. El material constitutivo de la bomba, especialmente las partes en contacto con el
solvente, deben ser capaces de resistir el ataque de las fases móviles agresivas (como las
usadas en separaciones iónicas).
En la actualidad, la mayoría de los fabricantes oferta bombas reciprocantes de dos pistones,

que entregan un flujo de fase móvil, prácticamente sin pulsaciones.
Las bombas utilizadas con columnas rellenas de diámetros internos menores o iguales a 1
m m deben entregar entre 5 m icrolit ros/ m in y 500 m icrolit ros/ m in en el mismo rango de
presiones señalado anteriormente.
Cuando se trabaja con columnas vacías, por ejemplo, de sílice fundida, el rango de trabajo
es aun menor, del orden de 0,1 m icrolit ros/ m in – 10 m icrolit ros/ m in. Las bombas usadas en
este rango son por lo general del tipo de jeringuilla (un émbolo que desplaza el volumen
requerido a la presión que garantice el flujo necesario.
En HPLC puede trabajarse con un sistema de elución isocrático (la composición de la fase
móvil no varía durante el proceso cromatografico) o con un sistema de gradiente de elución
(la composición de la fase móvil varía paulatinamente durante el proceso cromatográfico).
Cuando se aplica un sistema de gradiente, se utilizan como mínimo dos solventes. El
solvente A es débil mientras que el solvente B es fuerte. El porcentaje de este segundo
solvente se hace variar en función del tiempo, de modo de lograr la separación requerida.
En sus orígenes, para trabajar con gradiente de elución se requería dos bombas, una para el
solvente A y otra para el B.
La salida de ambas bombas se hacia llegar a un dispositivo mezclador desde donde se
conducía hacia la columna. La fase móvil iba cambiando en fortaleza acorde a lo requerido
para el análisis.
En la actualidad el principio es el mismo aunque se ha ampliado las posibilidades de
formación de gradiente a más de dos componentes, utilizando bombas muy complejas,
capaces de asumir por si solas la formación de la fase móvil requerida. Así, existen hoy en el
mercado bombas binarias, terciarias y cuaternarias, capaces de mezclar y controlar la
proporción de dos, tres y cuatro solventes, respectivamente.
El funcionamiento de las bombas usadas en HPLC está controlado por un microprocesador,
lo cual facilita el trabajo y amplía las posibilidades de uso de esta parte del sistema
cromatográfico. El microprocesador es especialmente útil cuando se trabaja con gradientes
de concentración o con programación de caudal.
En el epígrafe 9.4 se abordará con más detalle los aspectos relacionados con la utilización de
sistemas de elución isocrática y de gradiente así como otros modos de operación con HPLC.
9 .3 .3 . Sist e m a de inye cción o vá lvu la de in t r odu cción de m u e st r a s.
La válvula de introducción de muestras es un dispositivo que permite la dosificación exacta
de volúmenes conocidos de solución o muestra líquida, según el caso, de forma rápida, en el
torrente de fase móvil que se encuentra a presión elevada.
La válvula está situada entre la bomba y la precolumna, por lo general próxima a esta
última. En posición normal o de carga, la válvula permite el flujo de fase móvil, a la vez que
se puede introducir en un tubo calibrado, mediante una jeringuilla, un volumen de muestra
exacto y conocido. Estos tubos calibrados o “loops” tienen volúmenes de 1 microlitro a 100
microlitros para la determinación con columnas clásicas, y por debajo de un microlitro
cuando se trabaja con columnas de diámetros pequeños o capilares. Con un ligero
movimiento de la manecilla de la válvula hacia la posición de introducción, la fase móvil se
desvía y circula entonces a través del tubo calibrado, hasta desplazar totalmente el volumen
de muestra contenido en este. Después de algunos segundos se retorna la válvula hacia la
posición normal o de carga. (figura 9.2)
1 . Con e x ión de l la z o / 2 . Bom ba / 3 . Colu m n a /

4 . Pu n t o de in ye cción / 5 y 6 . Sa lida a l e x t e r ior
Figu r a 9 .2 . Vá lvu la de in ye cción : A) posición de ca r ga , B) in t r odu cción a la colu m n a

Por lo general para columnas cromatográficas de diámetros internos entre 4 m m y 5 m m , el
volumen de inyección no debe exceder de 25 microlitros. Así se evita la disminución en los
tiempos de retención y en el número de platos teóricos así como la perdida de resolución.
Un tópico de importancia en HPLC es el relacionado con la naturaleza del solvente que se
utiliza para disolver la muestra que se va a inyectar. Es una práctica generalizada disolver la
muestra en la fase móvil. Esto en cromatografía de fase normal no tiene inconvenientes,
pues casi todas las muestras son solubles en los solventes orgánicos que se utilizan como
fase móvil.
No es así en HPLC – fase reversa por la naturaleza acuosa en muchos casos de la fase móvil.
Pero técnicamente es admisible si se tiene en cuenta que en HPLC analítica las
concentraciones de trabajo son muy pequeñas por lo que, por muy baja que sea la
solubilidad de la muestra en la fase móvil, siempre se logra obtener una solución en ella.
Pero si fuera necesario disolver la muestra en otro solvente incluso muy poco soluble en la
fase móvil, los resultados de la inyección serían buenos.
En la actualidad existen también los llamados

automuestreadores automáticos que son equipos
que pueden realizar el proceso de inyección
automáticamente sin apenas atención del analista.
Estos dispositivos son programables en cuanto al
número de muestras a inyectar y los volúmenes
que se desean introducir. Así mismo puede
programarse el número de inyecciones por vial y el
intervalo de tiempo en que se debe realizar la
operación. Estos equipos son muy útiles cuando es
necesario procesar un gran número de muestras.
En la figura 9.3 se presenta la fotografía de un
modelo de automuestrador para HPLC.
Figu r a 9 .3 .
Au t om u e st r e a dor a u t om á t ico pa r a H PLC
9 .3 .4 . La pr e colum na
La precolumna va conectada entre la válvula de introducción de muestras y la columna
analítica, en ocasiones unida directamente a ésta. En todos los casos, las precolumnas,
además de servir de filtro para evitar la introducción de partículas a la columna, retienen los
componentes de la muestra que se adsorberían irreversiblemente en ella, contribuyendo así
a prolongar su vida útil.
Por lo general el relleno de las precolumnas es el mismo que el de la columna analítica, en
algunos casos con un tamaño de partícula superior. El diámetro de las precolumnas es de
unos 4 m m y su longitud varia de 5 m m hasta 30 m m o más. El relleno de las precolumnas
puede sustituirse tan pronto se observe saturación (perdida de eficiencia).
9 .3 .5 . La colum n a cr om a t ogr á fica
Es la parte del sistema donde se origina la separación de los componentes de la muestra y
de la que depende en gran medida la eficiencia del proceso cromatográfico. A continuación
se describe los aspectos fundamentales de las columnas cromatográficas.
9 .3 .5 .1 . Ca r a ct e r íst ica s ge n e r a le s
El material más empleado para la fabricación de las columnas de la HPLC, tanto analíticas
como preparativas, estan constituidas de acero inoxidable por razones de seguridad.
El acero sin embargo tiene limitaciones. En primer lugar es preciso pulir la pared interna de
la columna, pues con paredes rugosas, el empaquetamiento del relleno es deficiente (9).
Este tratamiento solo es posible para columnas con 2 m m o más de diámetro interno. En las
columnas de acero de diámetros menores o iguales a 2 m m ha resultado exitoso recubrirlas
interiormente con una capa fina de vidrio.
Otra de las limitaciones del acero es que a pesar de su calidad ocurre siempre la oxidación
de la pared interna y las fritas de ambos extremos. Este efecto es mayor si se usa fases
móviles pobremente desgasificadas especialmente metanol, acetonitrilo y agua o sus
mezclas. Es cierto que si se oxida una parte de la columna, la capa de oxido formada la
protege de ataque posteriores. Pero en ocasiones como se trabaja con medios agresivos, el
óxido se disuelve y el acero está expuesto siempre al ataque de la fase móvil, en mayor
grado si esta tiene reacción ácida, pero también el metanol y el acetonitrilo reducen la capa
de óxido.
No obstante, a pesar de los inconvenientes indicados, las columnas de acero, en especial las
de diámetro interno comprendidos entre 2 m m y 5 m m , son las que más se usan en la
actualidad.
Las columnas de vidrio, debidamente protegidas con una estructura o forro metálica
exterior, que facilita además su conexión, han encontrado también muchas aplicaciones,
debido a la inercia de este material ante un número elevado de fases móviles.
Más recientemente se ha comenzado a utilizar columnas capilares de sílice fundida sin
relleno, recubiertas exteriormente de poliimida. Estas columnas resisten presiones altas, en
ocasiones superiores a las requeridas para establecer el flujo necesario para las
determinaciones analíticas.
Las columnas analíticas en HPLC pueden ser de cuatro tipos, acorde a sus diámetros
internos.
• Colu m na s Clá sica s. Estas columnas tienen diámetros internos entre 2 m m y 5 m m .
Hasta el presente son las columnas más usadas. Para ellas fueron desarrollados los
elementos constitutivos del sistema cromatográfico (bomba, inyector, detectores). La
longitud de estas columnas, ofertadas comercialmente, se encuentra entre 5 cm y 50
cm , pero las de mayor uso son las de 25 cm .
• Colu m na s SBC. Estas columnas tienen diámetros internos entre 0,5 m m y 2 mm. Las
siglas SBC proceden del inglés (small bore column). El uso de estas columnas brinda
algunas ventajas tales como:
− El gasto de solvente es proporcional al cuadrado del radio, por lo que el ahorro es
sustancial.
− La eficiencia es la misma comparada con las columnas de diámetro mayor, siempre
que sea igual en ambas el valor de la velocidad lineal de la fase móvil (µ).
− En estas columnas se disipa rápida y fácilmente el calor que se genera por bombeo
de la fase móvil, especialmente si los flujos son altos.
− La cantidad mínima detectable en igualdad del analito, del detector y los demás
parámetros cromatográficos que influyen, es mucho más baja que en las columnas
clásicas, puesto que en HPLC hay proporcionalidad entre la masa detectable y el
cuadrado del radio de la columna cromatográfica.
No obstante estos beneficios, como desventajas de las columnas SBC se señala por lo
general las siguientes:
− Requieren un empaquetamiento muy bueno, no siempre alcanzable.
− Las bombas deben trabajar en el rango de 5 microlitros/minuto hasta 500
microlitros/minuto. Estas bombas por lo general son costosas.
• Colu m n a s M icr obor e . Estas columnas tienen diámetros internos en el rango de 0,1 m m
hasta 0,5 m m . Comúnmente el material constitutivo de estas columnas es la sílice
fundida. Estas columnas se empaquetan por secciones, se acoplan y después se enrollan.
En la actualidad el volumen muerto de estos acoplamientos es muy pequeño, por lo
general inferior a 70 nanolitros. Puesto que se determina la calidad y eficiencia de cada
segmento antes de acoplarlos para lograr la columna, se puede predeterminar el número

de estos para obtener una columna de la eficiencia requerida.
• Colu m na Ca pila r . El diámetro interno de estas columnas se encuentra entre 25
micrómetros y 100 micrómetros. Se fabrican casi exclusivamente de sílice fundida,
puesto que este material garantiza una buena resistencia mecánica asociada a una
flexibilidad aceptable. Resisten presiones del orden de 800 atmósferas (≈ 55 bar), tienen
una superficie interna muy lisa (carecen de efecto de pared) además como se sabe, son
muy inertes.
En estas columnas la fase estacionaria se une químicamente a la pared.
Con el uso de las columnas capilares en HPLC, el consumo de solventes es muy pequeño
(en ocasiones hasta 5000 veces menor que con las columnas clásicas). Tienen muy
buena resolución pero la capacidad de carga es pequeña.
Como el flujo de la fase móvil requerido por estas columnas es muy bajo (del orden de
los nanolitros/minuto), se pueden acoplar directamente a detectores de ionización por
llama o a espectrómetros de masa.
La forma de las columnas clásicas analíticas y preparativas es recta. Con ello se garantiza un
empaquetamiento uniforme del relleno. Dada la pequeña longitud de estas columnas
(inferior o igual a 500 mm) la forma recta no crea un problema de ubicación de éstas en el
sistema de cromatografía líquida. Incluso se puede colocar estas columnas verticalmente sin
ningún problema.
Las columnas rellenas de pequeños diámetros y las capilares sin relleno se pueden enrollar
como ya se explicó. Así, una columna de varios metros de longitud ocupa el mismo espacio
que una clásica.
La figura 9.4 muestra un esquema y una fotografía de columnas cromatográficas de relleno
para HPLC
Figu r a 9 .4 . Colu m n a s cr om a t ogr á fica s de r e lle n o, de a ce r o in ox ida ble pa r a H PLC
9 .3 .5 .2 . La fa se e st a ciona r ia
Si se exceptúa las columnas capilares en las cuales la fase estacionaria está unida
directamente a la pared interior de éstas, las demás columnas usadas en HPLC, tanto las
convencionales como las de diámetro interno pequeño, están rellenas de un material que es
en sí la fase estacionaria y el soporte de ésta.
El t a m a ñ o y la for m a de la s pa r t ícu la s de r e lle no

Las partículas usadas en las columnas analíticas tienen diámetros de 10 micrómetros o
inferiores. Las usadas en HPLC preparativa pueden tener hasta 60 micrómetros y en algunos
casos algo mayores.
Como ya se ha explicado con anterioridad, a medida que el tamaño de partículas disminuye,
la eficiencia del proceso en la HPLC es mayor, en igualdad de los demás parámetros que
influyen en ella.
Comercialmente se oferta columnas con tamaños de partículas de 3 micrómetros, 5
micrómetros, 7 micrómetros y 10 micrómetros. Por lo general, a medida que el tamaño es
menor, decrece la uniformidad del empaquetamiento. La forma de las partículas es también
muy importante. Las hay irregulares, producto de la reducción mecánica del tamaño de
partículas mayores. Se obtiene partículas esféricas con condiciones muy controladas. El
tamaño de ellas es muy uniforme y el empaquetamiento resultante es mucho más regular,
la columna es más permeable a la fase móvil.
La n a t u r a le za de l r e lle n o
La base fundamental de casi todos los rellenos en cromatografía líquida es el gel de sílice
completamente poroso. Este se utiliza directamente (en la cromatografía líquido – sólido) o
como soporte sobre el cual se une químicamente la fase estacionaria. Sin embargo, ha
comenzado a usarse rellenos poliméricos, que por sus características encontrarán seguro un
uso amplio en HPLC.
En la actualidad se usa tres tipos fundamentales de rellenos: los inorgánicos (representados
por el gel de sílice y la alúmina); los constituidos por el gel de sílice modificados
químicamente y finalmente aquellos a base de partículas poliméricas. Hay otros, pero sin la
importancia de los mencionados. A continuación se describe algunas de las características
importantes de estos rellenos.
A. Re lle nos in or gá n icos
Gel de Sílice. Este material se obtiene en la actualidad con un grado elevado de pureza. Se
de partículas. Los tamaños más frecuentemente usados de estas partículas son de 10 µm, 5
fabrica en forma de esferas muy uniformes, con una distribución muy estrecha de diámetros
µm y 3 µm. Cada una de ellas puede obtenerse con un diámetro de poro entre 7 nm y 100
nm . Estos poros le confieren a la sílice una superficie específica entre 450 m 2 / g y 50 m 2 / g
respectivamente.
La sílice tiene una resistencia mecánica elevada y resiste durante largo tiempo las presiones
usuales en HPLC. Sin embargo tiene tendencia a solubilizarse a pH por encima de 8. Aun a
este pH el relleno puede colapsar, con pérdida de eficiencia de la columna y asimetría en los
picos.
La sílice es ligeramente ácida, por lo que es buena para la separación de compuestos ácidos
y neutros, pero no es adecuada para compuestos básicos o con polaridad elevada.
La presencia de trazas metálicas en la sílice causa asimetría en algunos picos, especialmente
en muestras básicas y/o polares.
Óxido de Alum inio ( Alúm ina) . Este soporte se usa poco actualmente. Se comercializa en un
número reducido de diámetro de poros. Sus partículas son fuertes además de que resisten
fases móviles con pH hasta 12. Esto permite su uso en separaciones de compuestos básicos.
Carbón Grafit ado. Se oferta como esferas porosas, de varios tamaños y diámetros de poro.
Son usables a cualquier pH y temperatura, pero en líneas generales tienen menor eficiencia
que la sílice o la alúmina. Sus partículas son frágiles.
Requiere para su uso fases móviles muy puras, pues este relleno retiene impurezas que
eventualmente pueden dar cromatógramas con un ruido inaceptable.
Además de lo expuesto, estas columnas son muy caras.
B. Sílice m odifica da
La mayoría de los rellenos usados hoy en HPLC tienen como base la sílice porosa, con sus
grupos silanoles unidos químicamente a compuestos que le dan las características deseadas.
Los compuestos utilizados para obtener las fases enlazadas a base de sílice son los
monoclorosilanos y triclorosilanos. En menor grado se usa los diclorosilanos.
Estos tienen un ligando R que le confiere finalmente a la fase las propiedades requeridas.
La expresión general de la reacción con un monoclorosilano sería:
En función de la naturaleza del grupo R se han podido obtener varios tipos de relleno de gel
de sílice modificada.
• Si R es una cadena carbonada alifática no ramificada, normal de 2 átomos, 8 átomos
o 18 átomos de carbono, se obtiene las fases no polares denominadas RP-2, RP-8 y
RP-18 respectivamente. Estas fases, monoméricas y/o diméricas son las de mayor
uso en la actualidad, tanto en HPLC analítica como preparativa.
• Cuando el ligando R es una cadena carbonada alifática corta, terminada en el grupo
NH2 o el grupo CN, se obtiene soportes polares, usables en cromatografía de fase
normal, los cuales aventajan a los rellenos inorgánicos a base de gel de sílice o
alúmina.
• Las fases que se obtienen cuando el ligando R termina en el grupo sulfónico (-SO3-
H) o el amonio cuaternario (-NH4+) tienen mucha aplicación en HPLC de intercambio
iónico.
• Si el ligando termina en un diol vecino, resulta una fase estacionaria con aplicación
en la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Todas las fases orgánicas con soporte de gel de sílice son muy buenas, pues no se altera su
volumen por cambios de solventes de la fase móvil. Esto permite usarlas con condiciones
cromatográficas muy variadas, incluyendo trabajos con programación de gradiente.
C. Fa se s e st a cion a r ia s e n ba se a polím e r os por osos
La mayoría de este tipo de fase estacionaria tiene como base al estireno, reticulado con
divinilbenceno para lograr una dureza que le permita soportar las presiones usuales en
HPLC.
Se obtiene esferas del tamaño requerido para su uso en HPLC. El material es poroso, con un
rango amplio de diámetros de poro, lo que permite su uso en el análisis de moléculas de
peso molecular muy amplio.
Este relleno puede usarse en un rango muy grande de pH, pero a diferencia de los rellenos a
base de gel de sílice, sufre modificación de su volumen (se hincha) con algunos solventes de
uso común en HPLC. Esto limita su utilización en la mayoría de los casos a la cromatografía
isocrática.
Este polímero es hidrofóbico por lo que sin la introducción de grupos R, puede usarse en
cromatografía de fase reversa, aunque con menos eficiencia que sus análogos a base de gel
de sílice.
Se han empleado también con ligandos que le confieren propiedades de exclusión y de
intercambio iónico.
9 .3 .5 .3 . Los m e ca n ism os de se pa r a ción e n H PLC
En HPLC se pueden realizar separaciones analíticas mediante cualquiera de los cuatro
mecanismos de separación (adsorción, reparto, intercambio iónico y filtración sobre gel). A
continuación se expondrán los mas utilizados.
A. Cr om a t ogr a fía de fa se nor m a l
Este tipo de cromatografía fue la que primero se desarrolló y está caracterizada porque la
fase estacionaria es polar mientras que la fase móvil es un solvente orgánico o una mezcla
de solventes orgánicos de polaridad baja, no miscibles en agua.
La fase estacionaria usada originalmente en este tipo de cromatografía fue el gel de sílice
micro poroso. En la actualidad hay varias fases derivadas del gel de sílice con propiedades
diferentes, de modo que se amplia el rango de utilización de la cromatografía de fase
normal. En orden aproximado de utilización, las principales fases son:
ciano > gel de sílice > diol > am ino
A su vez, la fuerza de la interacción de la fase estacionaria con una muestra en igualdad de
fase móvil y otros parámetros es:
gel de sílice ( fuert e) > > am ino > diol > ciano
Esta fuerza de interacción con los analitos es de carácter adsortiva. Por lo general, la fase
móvil recubre el adsorbente con una monocapa. Un analito interactúa con la fase
estacionaria, por desplazamiento de una o varias moléculas de fase móvil.
En el caso de gel de sílice, como ya se ha explicado, la interacción se produce con los grupos
silanoles. Esta adsorción es muy fuerte por lo que algunos picos cuando se trabaja con gel
de sílice, presentan colas. Esta desventaja puede eliminarse con la adición de pequeños
volúmenes de agua o etanol a la fase móvil. Con estos compuestos, llamados moduladores,
se logra saturar los centros más activos del gel de sílice y los cromatógramas tienen más
calidad. El efecto de los moduladores es mayor en aquellas fases móviles en la que son muy
poco solubles. En el caso de la adición de alcohol a la fase móvil, la concentración máxima
debe estar entre 0,01 % y 0,5 % .
Concentraciones pequeñas de agua en la fase móvil, entre 1 m g/ L y 2 m g/ L originan efectos
grandes sobre la fuerza eluotrópica de estas. La poca reproducibilidad y repetibilidad de los
tr con las columnas de gel de sílice se debe casi siempre a la incorporación de vapor de agua
del ambiente.
Además, la regeneración de la columna después de un análisis, conlleva el paso de

volúmenes grandes de fase móvil. Cuando se trabaja con sílice modificada los
inconvenientes no se presentan. Los picos no tienen colas y por lo general no se requiere
una regeneración exhaustiva de la columna como en el caso del gel de sílice.
La fase móvil en la cromatografía de fase normal está constituida por lo general por dos
solventes: un solvente débil, no-polar, llamado A y otro fuerte, polar, llamado B.
Para obtener una fase móvil adecuada se mezcla B con A hasta obtener una polaridad tal
que origine valores de K para los componentes de la muestra en el rango 0,5 > K > 20.
la fase móvil es la selectividad. Si α para dos componentes de la muestra está próximo a la

Otro aspecto a tener en cuenta en la selección de los componentes y proporción de estos en
alcanzar el objetivo, esto es obtener un valor de α ≠ 1

unidad, es preciso variar el porcentaje de B, o cambiar B por otro solvente fuerte para
La retención de los compuestos en este tipo de cromatografía está relacionada con la

polaridad y solubilidad de estos en la fase móvil. Así los compuestos menos polares
(hidrofóbicos) eluyen primero, mientras que los más polares (hidrofílicos) son los últimos en
eluir.
De forma muy general, el orden de elución en cromatografía de fase normal para
compuestos R-X en donde X es un grupo funcional y R una cadena carbonada alifática,
depende fundamentalmente de X y se comporta del modo siguiente:
Alquilo < halógeno (F < Cl < Br < I) < éteres < compuestos nitro < nitrilos < aminas
terciarias < ésteres < cetonas < aldehídos < alcoholes < fenoles < aminas primarias <
amidas < ácidos carboxílicos < ácido sulfónico.
La elección de la fase estacionaria en la cromatografía de fase normal depende como es
natural del problema analítico a resolver.
valores adecuados de α variando casi siempre el porcentaje de B o la naturaleza de este.

El gel de sílice es excelente para separaciones complejas. Con esta fase estacionaria se logra
Para compuestos básicos, aminas, éteres, cetonas y esteres se requiere la fase amino,
mientras que los compuestos muy polares deben cromatografiarse con la fase ciano.
Finalmente, considerando las propiedades generales de las sílices modificadas y del gel de
sílice, se puede resumir que las primeras no requieren un control riguroso de la humedad en
la fase móvil, se equilibran fácilmente, son estables y pueden usarse en técnicas de
gradiente de elución. El gel de sílice por su parte es más duradero, más selectivo (es usado
en separaciones de isómeros) pero no es usable en cromatografía con gradiente de elución.
B. Cr om a t ogr a fía de fa se r e ve r sa
Este es sin duda el tipo de cromatografía líquida más usado y el que más campos ha
abarcado hasta el presente. Con fase reversa es posible analizar muestras muy variadas,
desde compuestos no polares hasta polares y aún iónicos, desde moléculas pequeñas hasta
polímeros de pesos moleculares altos (proteínas, DNA, plásticos). Es además el
procedimiento más robusto de los usados en HPLC.
En la cromatografía de fase reversa, la fase estacionaria es siempre menos polar que la fase
móvil. Esta última es casi siempre agua con un solvente orgánico polar, hidrofilico (llamado
modificador orgánico), mientras que la fase estacionaria es preferentemente sílice
modificada con radicales alquilo recubriendo su superficie.
El mecanismo de separación en la cromatografía de fase reversa es similar al de una

partición continua entre la fase móvil polar, acuosa, que se mueve a través de un lecho
hidrofóbico, apolar.
Los analitos se distribuyen acorde a su afinidad por ambas fases. Los compuestos hidrofilicos
se retendrán poco y tendrán tr pequeños mientras que los hidrofóbicos interactuarán más
con la fase estacionaria y tendrán tr mayores.
La fase móvil es esencialmente agua (A) con una cantidad de un solvente orgánico (B)
hidrosoluble.
El porcentaje de B en la composición de la fase móvil debe ser tal que para los componentes
de la muestra que se analiza, los valores de K han de encontrarse en el rango 0,5 < K < 20.
Aunque cuando se trabaja isocráticamente (con composición constante de la fase móvil) se
prefiere el rango 1 < K <10. (7)
En RP son pocos los solventes que pueden ser usados como modificador orgánico (B),
puesto que además de ser algo solubles en agua, deben tener una transparencia adecuada
en el rango UV. En la práctica solo el acetonitrilo y el metanol han encontrado un uso
generalizado en RP, pues son transparentes a longitudes de onda bajas (185 nm – 210 nm ),
aunque el tetrahidro furano, el etanol y el propanol han tenido eventualmente algún uso.
En igualdad del porcentaje del modificador, la fortaleza de la fase móvil está dada por la
secuencia:
agua < metanol < acetonitrilo < etanol < tetrahidro furano < propanol
En esta serie el agua es el solvente más débil y los tr resultantes son los mayores, mientras
que el propanol es el solvente más fuerte y con el los tr obtenibles son los menores.
Para cualquiera de los modificadores (B) los tr decrecen en la medida que la proporción de
este crece en la composición de la fase móvil.
En la práctica se puede trabajar en un rango amplio de la composición de la fase móvil
(respecto al componente B). Sin embargo esto no quiere decir que la composición elegida
sea la óptima.
La composición de la fase móvil próxima a la óptima se obtiene con relativa facilidad para un
analito dado, llevando a cabo una corrida con gradiente lineal de B (ver epígrafe 4). La
composición de la fase móvil a la cual eluye un analito bajo esas condiciones, está muy
próxima a la óptima para trabajar bajo condiciones isocráticas.
Un caso particular en la cromatografía de fase reversa está relacionado con las muestras
muy hidrofóbicas (compuestos que no eluyen aún con 100 % de Acetonitrilo como fase
móvil). En estos casos se elige como solvente A al Acetonitrilo mientras que el B puede ser
el tetrahidro furano, el diclorometano o la acetona.
Cr om a t ogr a fía de fa se r e ve r sa – pa r ión ico
La cromatografía de par iónico es un método ingenioso de analizar iones por un
procedimiento totalmente diferente al del intercambio iónico. En esencia consiste en añadir
un contraión (Ci) a la fase móvil, el cual se une químicamente al ión del analito (I)
originando un compuesto neutro que se analiza en fase reversa. El contraión es un
compuesto que es capaz de reaccionar rápida y reversiblemente con el ión (el analito) en la
muestra y tiene además un grupo hidrofóbico que interactúa con la fase estacionaria.
Hay dos teorías para explicar la forma en que se produce la separación en la cromatografía
de par iónico. En una de ellas el contraión y el ión se unen en la fase móvil y el producto
(ICi) interactúa con la fase estacionaria (fase reversa) acorde a la ecuación.
I+- acuoso + Ci+- acuoso ↔ ICi acuoso ↔ ICi en la fase estacionaria
La segunda teoría supone que el contraión interactúa con la fase estacionaria (se retiene en
ella, y después, desde esta, forma el compuesto con el ión (analito).
I+- acuoso + Ci+- en la fase estacionaria ↔ ICi en la fase estacionaria
En la práctica, los dos mecanismos se complementan y ambos explican, desde posiciones

extremas, lo que ocurre durante la separación.
La figura 9.5 ilustra esquemáticamente estos mecanismos
Figu r a 9 .5 . M e ca n ism o de fa se r e ve r sa – pa r ión ico

Las columnas usadas en la cromatografía de par iónico son las RP monoméricas, pues con
ellas se obtiene los mejores resultados. La fase móvil es casi siempre agua: metanol. La
proporción la determina el analista acorde al problema concreto a resolver. El rango de pH
es por lo general de 2 – 8, aunque siempre hay que tener presente la característica del
contraión que se vaya a usar.
Los contraiones usados frecuentemente para muestras catiónicas son:
• Aniones inorgánicos (acetato, Cl-, I- Br- PO43-)
• Alquilsulfonato con R de C1 a C16
• Toluensulfonato
• Naftalensulfonato
• Alquilsulfato con R de C1 a C12
• Citrato
• Tartrato
Para los compuestos aniónicos, se usa como contraión:

• Tetraalquil amonio (R4N+), con R de C1 a C7
• Trialquil amonio (R3NH+) con R de C1 a C8
Puede usarse los cationes Na+ K+ Cs+ Mg+2 y Ca+2.
El tiempo de retención en par iónico depende del tipo de contraión. El tr será mayor cuanto
mayor sea la tendencia del contraion a formar par iónico, así como cuanto mayor sea el peso
molecular del contraion y mientras más grande sea el carácter lipofílico del contraion.
La concentración del contraión por lo general es baja. El rango óptimo se encuentra entre
0,002 molar y 0,05 molar. La concentración del contraión también influye sobre el tr (crece
con ésta).
C. Cr om a t ogr a fía de in t e r ca m bio ión ico
La cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de fase reversa – par iónico,
tienen muchos aspectos en común. En especial el mecanismo de separación es muy similar.
Pero debido a las características favorables de la cromatografía de fase reversa, muchos de
los compuestos que en la década de los años 70 (poco después de la comercialización de los
primeros equipos para HPLC en 1968) se cromatografíaban mediante intercambio iónico, hoy
se analizan por par iónico. En especial los iones pequeños, pues con par iónico es mejor la
resolución y los resultados son más reproducibles.
El principio y el campo de aplicación de la cromatografía de intercambio iónico ya fue
expuesto en un capítulo precedente. Sin embargo, las características de la HPLC imponen
exigencias al intercambiador iónico que sirve de relleno a la columna. Este material ha de
resistir las presiones elevadas con que se trabaja en este tipo de cromatografía. Por su
naturaleza han sido dos los rellenos usados hasta el presente:
a) Gel de sílice modificada químicamente con grupos de amonio cuaternario o de ácido
sulfónico (intercambiadores aniónicos o catiónicos, respectivamente).
b) Resinas poliméricas altamente reticuladas que poseen los grupos funcionales antes
mencionados. La estabilidad ácido – base de estas resinas es superior a la de la sílice
modificada.
La fase móvil es por lo general un buffer acuoso diluido, aunque es posible utilizar sistemas
de solventes hidroorgánicos.
El incremento en la concentración del buffer resulta en una reducción de los tr de los
componentes de una muestra. A su vez, la naturaleza de los aniones o cationes
constituyentes del buffer o de la sal que se adiciona a la fase móvil, influyen selectivamente
sobre los tr. En general, la carga elevada tanto del anión como del catión conduce a un
aumento del tiempo de retención.
Para el intercambio aniónico, la fuerza desplazante está indicada para un grupo de aniones
de uso común:
F- (débil) < OH -
< acetato < CI - < SCN -
< Br - < CrO4- < NO3- < I -
< oxalato2- < citrato3-
(fuerte)
La fuerza desplazante en intercambio catiónico está dada en la serie:
Li+(débil) < H+ < Na+ < NH4+ < K+ < Rb+ < Cs+ < Ag+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ni2+ < Ca2+
< Pb2+ < Ba2+ (fuerte)
Para cambiar la selectividad en una separación por intercambio iónico, es preciso cambiar la
naturaleza de la sal.
Para la detección de iones por cromatografía líquida hay varios detectores, como el de
conductividad, el refractométrico, el espectrofotométrico (en el rango UV de 200 nm a 400
nm ) y especialmente el electroquímico.
D . Cr om a t ogr a fía de filt r a ción sobr e ge l
En HPLC pueden también emplearse columnas de filtración sobre gel (GPC, del inglés Gel
Perm eat ion Chrom at ography) o exclusión molecular para realizar separaciones de mezclas
de compuestos en función de la masa molecular. Esta cromatografía es aplicable a
compuestos con masas moleculares superiores a 2000 y el mecanismo de separación así
como sus características generales ya fueron explicadas en el epígrafe 7.3.4 del capítulo 4
de este texto.
Los rellenos de las columnas de GPC para HPLC puede ser de dos tipos:
• Gel de sílice o polímeros orgánicos semirígidos, que se ofertan con distintos diámetros de
poro que van desde 4 nm (para separar masas moleculares de 50 a 4000) hasta 400 nm
con el que se puede obtener separaciones de muestra con masas moleculares en el
rango de 104 Dalton a 107 Dalton.
• Polímeros orgánicos, los que tienen un rango amplio de diámetros de poros y permite
separar muestras con masas moleculares desde 200 Dalton hasta 107 Dalton o aún
mayores.
Cuando se trabaja con este último tipo de relleno, la presión no debe exceder de los 100 bar
para evitar daños en la estructura de este.
La fase móvil debe tener una viscosidad baja, preferentemente inferior a 0,7 cP. Entre los
solventes más utilizados en GPC se encuentran el tetrahidrofurano, diclorometano,
cloroformo, tolueno y dimetilformamida.
Es importante tener en cuenta las indicaciones del fabricante pues hay incompatibilidades de
algunos rellenos con determinados solventes.
La exclusión en fase acuosa utiliza como fase estacionaria partículas esféricas de gel de sílice
modificada con diversos tamaños de poros que permiten separaciones de muestra con
masas moleculares desde 200 Dalton hasta más de 107 Dalton. La fase móvil es agua o un
buffer acuoso.
Las tablas 9.2 y 9.3 muestran algunas fases estacionarias de amplio uso en la actualidad, así
como los criterios de selección del tipo de cromatografía en función de las características de
los componentes a separar.
Tabla 9.2.
Fases est acionarias em pleadas en HPLC
FASE ESTACI ON ARI A. FASE M OVI L. APLI CACI ON ES.

Ge l de sílice . Hexano, CHCl3 Adsor ción
Si- OH e isopropanol. Ésteres, éteres, porfirinas
micotoxinas y vitaminas liposolubles.
Alúm ina . Hexano, CHCl3 Adsor ción

Al 2 O 3 e isopropanol. Aminas.
Am in o. Hexano, CHCl3 Fa se N or m a l
Si- ( CH 2 ) 3 - N H 2 e isopropanol. Azúcares, esteroides y
nitroderivados.
Cia no. Hexano, CHCl3 Fa se N or m a l

Si- ( CH 2 ) 3 - CN e isopropanol. Aminoácidos y nitroderivados.
D iol. Na2HPO4 0.1 M Fa se N or m a l

Si- ( CH 2 ) 3 - O- CH 2 - [ CH ( OH ) ] 2 y agua. Proteínas, péptidos y tensoactivos
acuosos.
Oct a de cilsila no ( C- 1 8 ) Agua, metanol, THF Fa se Re ve r sa

Si- ( CH 2 ) 1 7 - CH 3 y acetonitrilo. Analgésicos, aromáticos,
polinucleares y ftalatos.
Oct ilsila n o ( C- 8 ) Agua, metanol, THF Fa se Re ve r sa

Si- ( CH 2 ) 7 - CH 3 y acetonitrilo. Catecolaminas, esteroides aceites
esenciales.
D im e t ilsila n o ( C- 2 ) Agua, metanol Fa se Re ve r sa

Si- ( CH 3 ) 2 y acetonitrilo. Aminas, fenoles y vitaminas
hidrosolubles.
D ivin ilbe nce n o su lfon a do. Agua. GPC

Proteínas, péptidos y azúcares.
D ivin ilbe nce n o. CHCl3, THF. GPC
Polímeros y gomas.
Vidr io por oso. THF, alcoholes, agua. GPC
Compuestos biológicos.
Se ph a de x Agua, buffer GPC
Compuestos biológicos, proteínas,
carbohidratos.
Re sina fu e r t e m e n t e á cida Na2HPO4 0.01-0.1 M I n t e r ca m bio ión ico
– SO 3 - Vitaminas hidrosolubles, purinas,
aminoácidos y nucleósidos.
Re sina fu e r t e m e n t e bá sica Na2HPO4 0.01-0.1 M I n t e r ca m bio ión ico
– NH4+ Nucleótidos.
Tabla 9.3.
Crit erios de selección del t ipo de crom at ografía según las caract eríst icas de los com puest os a
separar con m asas m oleculares m enores de 2000.
Soluble s Ca r á ct e r pola r Tipo de Fa se
Fa se m óvil
en y/ o ión ico cr om a t ogr a fía e st a ciona r ia
RP RP-2 a RP-18 CH3-CN: H2O;
Met OH: H2O
Adsorción Gel de Sílice cloroformo,
No polar, no (Si-40 a Si-100) diclorometano
iónico Partición Gel de Sílice diclorometano,
modificada metanol
(Si-NH2, Si-CN,
Solvente Si-diol)
orgánicos RP con control de RP-2 a RP-18 CH3-CN:buffer acuoso
pH Met OH: buffer acuoso
RP- par iónico RP-2 a RP-18 CH3-CN: buffer acuoso
+ contraión
Polar, ionizable
Partición Gel de Sílice THF, Met OH
modificada H2O,solución buffer
(Si-NH2, Si-CN,
Si-diol)
RP RP-2 a RP-18 CH3-CN: H2O,
Met OH:H2O
Partición Gel de Sílice Met OH, CH3-CN, H2O
Polar, no iónico
modificada
(Si-NH2, Si-CN,
Agua Si-diol)
RP– par iónico RP-2 a RP-18 CH3-CN: buffer acuoso
+ contraión
Iónico Intercambio Intercambiador buffer acuoso
iónico aniónico o
catiónico
9 .3 .5 .4 . Espe cifica cion e s de la s colu m n a s cr om a t ogr á fica s

Teniendo en cuenta la diversidad de proveedores de columnas cromatográficas, con
frecuencia no basta con seleccionar un relleno, un tamaño de partículas y unas dimensiones
concretas. Para estos mismos parámetros, los resultados cromatográficos de dos columnas
pueden ser muy diferentes, si estas son de distintos fabricantes.
Por esta razón, en ocasiones se requiere información adicional concerniente a
especificaciones y eficiencia de la columna que se pretende adquirir, especialmente si por
razones de aseguramiento de la calidad es preciso repetir condiciones analíticas.
Los parámetros más estrechamente vinculados con la eficiencia de la columna
cromatográfica y que por lo general se requiere conocer antes de usarla de forma rutinaria
son:
• Números de platos teóricos para un analito dado y un valor concreto de K.
• Factor de asimetría de un pico.
• Selectividad determinada para dos compuestos similares.

• Reproducibilidad del tiempo de retención.
• Caída de presión para una fase móvil y temperatura requerida.
• Estabilidad de la columna.
En caso de columnas de sílice modificada, con frecuencia es preciso conocer además de lo
expuesto: la concentración de la fase enlazada (porcentaje de carbono orgánico por
ejemplo), así como si la fase es monomérica o polimérica.
Algunos de los parámetros indicados pueden obtenerse del fabricante. Hay columnas que se
suministran con cromatogramas tipos. Otros parámetros se precisa determinarlos en el
laboratorio y sirven al analista para la toma de decisiones en adquisiciones futuras.
9 .3 .5 .5 . Pr oble m a s de la colum n a cr om a t ogr á fica
Durante el uso de la columna cromatográfica surgen problemas, algunos normales, debidos
al número de muestras inyectadas y a las condiciones de operación. Otros dependen del
cuidado al que son sometidas por el analista.
Los problemas se pueden agrupar en tres tipos: variabilidad en tiempos de retención y
resolución, formación de colas y vida útil muy corta
• Va r ia bilida d e n los t ie m pos de r e t e n ción y e n la r e solu ción
la selectividad ( α ). Estas variaciones son aceptables si no exceden 3 % respecto al valor

Debido al uso prolongado de la columna comienza a producirse variaciones en los t r y en
óptimo de la columna.
Las causas de este comportamiento son varias: pérdida de fase estacionaria; disolución
parcial de la sílice (aun en el caso de rellenos de fase enlazada) y acumulación de
impurezas que no eluyen con las condiciones normales de trabajo.
Otros factores que influyen y que no dependen directamente de la columna son: cambios
en la composición de la fase móvil; cambios de flujo; variaciones de temperatura; falta
de equilibrio entre análisis sucesivos y la inyección de tamaños de muestra excesivos.
• For m a ción de cola s
La formación de colas debe evitarse o reducirse al mínimo por el efecto adverso que
tiene sobre la resolución y la exactitud de las determinaciones. Una cola puede invadir la
zona de elución de un componente próximo, con lo que se reduce la exactitud de la
determinación cuantitativa de ambos.
El cálculo del número de platos teóricos y la resolución pueden sobreestimarse cuando
los picos involucrados tienen cola.
Las causas para la formación de cola son varias. Algunas dependen de la columna, del
uso al cual está destinada y otras de las condiciones de operación.
Las causas principales son: columna de calidad baja (no llenada adecuadamente); fritas
obstruidas; acumulación de impurezas fundamentalmente a la entrada de la columna;
sobresaturación (muestras muy grandes); efectos extracolumna; retención secundaria
(debida a silanoles libres en el caso de rellenos de fase enlazada); buffer no apropiado o
falta de buffer.
• Vida ú t il m u y cor t a
El trabajo estable y la vida útil de una columna cromatográfica de calidad buena
dependen en gran medida de la aplicación que se le dé y del trato que reciba. Aun con
condiciones inobjetables (muestras limpias, no agresivas) y buen manejo, las columnas
tienen una vida limitada. Pero esta vida útil varia de laboratorio a laboratorio y dentro de
un mismo laboratorio acorde al trabajo específico al cual se dedica la columna.
reducido a la mitad, mientras que el valor de α descendió a 75 % de su valor óptimo.

Como orientación, una columna debe desecharse cuando el valor de n inicial se haya
este es ≈ 2 la columna debe desecharse. Sin embargo columnas con estas características
Otro elemento para desechar la columna es el incremento en el factor de asimetría. Si
pueden ser usadas en trabajos menos exigentes.

La vida útil debe expresarse por el número de muestras analizadas. Una columna normal
permite el análisis de 1000 – 1500 muestras limpias, no agresivas, mientras que este
número se reduce a 50 – 250 en el caso de muestras complejas (extractos de tejidos y
fluidos biológicos, muestras vegetales, suelos y sedimentos con un contenido alto de
materia orgánica) sometidas a purificaciones simples.
Si se tiene el registro del trabajo que se realiza con una columna, esta debe cambiarse
cuando se haya analizado el número de muestras indicado en cada caso.
Por el costo de las columnas cromatográficas hay laboratorios que prolongan la vida útil
de estas, tal como se indicó en párrafos anteriores.
En igualdad de condiciones las columnas que más duran son las usadas en HPLC – fase
normal. En ese orden le siguen las columnas poliméricas, mientras que las columnas
usadas en fase reversa, y sobre todo cuando se utiliza en la modalidad RP – par iónico,
son las que tienen una vida más corta. Esto se debe a que las fases acuosas son más
agresivas que los solventes orgánicos usados en la modalidad de fase normal.
9 .3 .6 . Los de t e ct or e s
Han sido desarrollados numerosos detectores para ser usados en los sistemas de
cromatografía líquida. Además se ha intentado adaptar a esta técnica algunos detectores de
gran uso en cromatografía gaseosa, pero esto no es aun una realidad en muchos casos. Lo
cierto es que en el momento en que nos encontramos, el número de detectores adquiribles
en HPLC es relativamente reducido. En los párrafos siguientes se describirá brevemente las
características y la aplicación de la mayoría de los detectores actualmente en uso en esta
rama analítica.
Se describirá además algunos detectores que aunque aun no se comercializan ampliamente,
son ejemplos notables del desarrollo alcanzado por la HPLC en este aspecto.
9 .3 .6 .1 . D e t e ct or e s e spe ct r ofot om é t r icos UV- Vis
Este tipo de detector se puede usar en el rango ultravioleta (desde 190 nm hasta 360 nm ),
en el visible (más de 360 nm hasta 800 nm ) o en ambos, dependiendo del fabricante. Hay
tres tipos fundamentales de detectores: el detector de longitud de onda fija, el de longitud
de onda variable y el detector de arreglo de diodos, también llamado multiespectral. En
todos ellos una fuente luminosa procedente de una lámpara apropiada pasa a través de una
celda de flujo que está conectada a la salida de la columna, y llega a un fototubo o a un
diodo donde se mide la intensidad de luz I (figura 9.6). Usualmente la luz de la lámpara se
dirige hacia el fototubo (o diodo) de referencia donde se mide la intensidad original de luz I0.
Mediante un dispositivo electrónico el detector transforma estas dos señales en absorbancia
(A)
Figu r a 9 .6 . Esqu e m a de u n de t e ct or UV pa r a H PLC

El detector de longitud de onda fija, utiliza una fuente luminosa que emite una radiación I0
muy fuerte. Por tal razón la sensibilidad de este detector es muy buena. Sin embargo, no
tienen mucha aplicabilidad.
El detector de longitud de onda variable es algo menos sensible pero es aplicable a un
número mayor de muestras diferentes.
La sensibilidad en líneas generales se encuentra en el rango de los ng a los µg, pero
depende fuertemente de la naturaleza del analito.
El volumen de la celda de medición de ambos detectores es inferior a 10 microlitros y el
paso óptico es del orden de 10 m m . Son detectores estables, con un nivel de ruido muy
bajo.
Estos detectores son los más usados en HPLC y solo requiere que el solvente sea
transparente a la longitud de onda de trabajo en UV. Su utilización depende de la naturaleza
del analito (que absorba en UV o que tenga color)
La aplicación de la microelectrónica y la computación en la fabricación de instrumentos
científicos, unido al desarrollo de softwares especializados, ha permitido el surgimiento y
utilización a gran escala, de uno de los detectores más importantes y sensibles de los que se
ofertan hoy para HPLC: el detector multiespectral o de arreglo de diodos.
Los primeros detectores de arreglo de diodos trabajaban en el rango de 190 nm hasta 400
nm , mientras que los que se ofertan hoy abarcan también el rango visible.
El sistema electrónico de estos detectores permite de forma continua y mientras dura el
análisis, captar varios espectros de absorción en una fracción de segundo (en el rango de
longitud de onda de interés). Esta información se guarda en la memoria de la PC y al final de
la corrida se integra para dar un cromatograma tridimensional absorción – longitud de onda
– tiempo de retención.
Las posibilidades que brinda el detector de arreglo de diodos y su software específico son
muchas. Entre ellas, poder determinar y mantener en la memoria del equipo el
cromatograma tridimensional del blanco de reactivos (eventualmente el blanco de la matriz
que acompaña a un compuesto de interés). Estos cromatogramas se pueden sustraer del
obtenido de la muestra, resultando solamente uno más limpio, más fácil de interpretar, el
cual sirve para identificar trazas o componentes minoritarios de la muestra con mucha
sensibilidad y un grado elevado de exactitud.
Pero además permite hacer comparaciones y búsqueda de cromatogramas similares
almacenados en un archivo (con fines de identificación), entre otras opciones de interés
analítico y del aseguramiento de la calidad correspondiente.
9 .3 .6 .2 . D e t e ct or r e fr a ct om é t r ico
Es un detector de uso general, utilizado en la determinación de aquellos compuestos para
los que sea posible usar una fase móvil que como característica sobresaliente, tenga un
índice de refracción diferente al de estos. Es el detector de menos sensibilidad de los usados
en HPLC. Por lo general no detecta por debajo del microgramo de compuesto. Se opera de
forma diferencial, usando dos celdas, una de medición y otra de referencia, por la que pasa
exclusivamente la fase móvil. Tiene uso en la determinación de azúcares y oligómeros
sintéticos. No puede usarse cuando se trabaja con gradiente. Es además muy sensible a los
cambios de temperatura por lo que requiere una climatización estable del local de trabajo.
9 .3 .6 .3 . D e t e ct or de flu or e sce n cia
Este detector es uno de los más sensibles actualmente en uso. Es ideal para la
determinación de trazas, especialmente en matrices complejas, basado fundamentalmente
en su selectividad elevada. Es tres órdenes de magnitud más sensible que el detector UV o
el de ordenamiento de diodos. Tiene también un rango lineal amplio (103 - 104).
El detector es selectivo ya que no todos los solutos son capaces de fluorescer, además los
que se excitan, lo hacen generalmente a longitudes de onda incidentes diferentes. Esto
quiere decir que si se selecciona adecuadamente la longitud de onda, se puede lograr la
respuesta de un analito en presencia de otros compuestos, sin que se produzcan
interferencias.
Este detector como se señaló, es muy sensible. Responde satisfactoriamente en trabajos de
rutina ante cantidades del orden de los picogramos en el volumen de la muestra inyectado.
Es importante señalar que la señal fluorescente y la longitud de onda óptima de la radiación
excitadora dependen de la temperatura, la polaridad y la viscosidad de la fase móvil y del
pH. Está en manos del analista lograr un compromiso satisfactorio entre una buena
separación cromatográfica y una buena detección.
La gran sensibilidad de la detección fluorométrica ha hecho posible que se extienda el campo
de aplicación del detector de fluorescencia aún a compuestos que no son fluorescentes. En
estos casos se requiere del acoplamiento químico de la muestra con un compuesto
fluoróforo. Esta reacción química puede llevarse a cabo pre o post columna. Algunos de
estos fluoróforos se usan extensamente y son clásicos en la literatura científica. Entre ellos
por solo citar unos ejemplos se encuentran el 4 bromometil, 7 etoxicoumarina (BrMMC)
usado en el análisis de ácidos grasos; la dansilhidrazina (DNS–hidrazina), utilizada
fundamentalmente en la determinación de aldehídos, cetonas y azúcares; el cloruro de
dansilo (DNS-CL), para aminas y aminoácidos y la 4 cloro 7 nitrobenzofurazano (NBD–CL)
que tiene campos de aplicación en aminas primarias y secundarias. El más conocido de
estos agentes fluoróforos es sin duda el OPA (anhídrido orto ftálico). Este compuesto se usa
ampliamente en el análisis de aminoácidos, péptidos y aminas.
9 .3 .6 .4 D e t e ct or e le ct r oqu ím ico
Es un detector muy sensible y selectivo. Se utiliza en la detección de solutos que puedan
oxidarse o reducirse.
En esencia, el detector está constituido por una microcelda a través de la cual fluye la fase
móvil. En ella hay situados dos electrodos, uno llamado de trabajo y el otro denominado
electrodo auxiliar.
La respuesta del detector se origina cuando las moléculas del analito sufren una reacción
redox en el electrodo de trabajo. Paralelamente ocurren reacciones electroquímicas en el
electrodo auxiliar, restableciéndose el equilibrio eléctrico mediante el flujo hacia ambos
electrodos de los iones presentes en la fase móvil (como componentes de esta). En ausencia
de muestra, está pasando fase móvil solamente por la celda y entre ambos electrodos se
mantiene una corriente iónica portada por el electrolito. La oxidación o reducción de un
analito sobre el electrodo de trabajo provoca un cambio en esta corriente, que previamente
amplificada y registrada en función del tiempo origina el cromatógrama (el pico) del analito
en cuestión.
La reacción sobre el electrodo de trabajo es muy rápida. La concentración del analito se
reduce allí casi a cero, por lo que la respuesta del detector está limitada por la difusión de la
muestra hacia la superficie del electrodo de trabajo.
La fase móvil es por lo general una solución acuosa diluida de un electrolito, una solución
buffer diluida o un solvente hidrofílico que contiene un electrolito.
La selectividad del detector electroquímico se basa en que no todos los analitos sufren
oxidación (o reducción). En el caso de los compuestos que sufren reacciones redox, la
selectividad, se logra mediante el ajuste a un valor determinado del voltaje entre el
electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar. La gran sensibilidad (del orden de los
picogramos) se debe al pequeño volumen de celda y a la rapidez con que ocurren las
reacciones electroquímicas. Comercialmente se oferta detectores con volúmenes de dos
microlitros y aun menores. Experimentalmente se ha fabricado algunos detectores
electroquímicos con celdas muy pequeñas, tan solo de unos pocos nanolitros.
Las variaciones de la temperatura afectan la respuesta del detector. Aunque es posible
operar un detector electroquímico a temperatura ambiente, la máxima estabilidad se alcanza
cuando el equipo se encuentra en un área de temperatura constante.
La adsorción de algunos productos de las reacciones que tienen lugar sobre los electrodos,
cambia la respuesta del detector. Esto requiere una calibración frecuente y una limpieza de
los electrodos o cambio de estos, especialmente el de trabajo, cosa que en los equipos
modernos se realiza con facilidad.
La sal requerida para mantener la conductividad de la solución limita considerablemente el
número de fases móviles utilizables con este detector. En caso de que la separación
cromatográfica no permita la adición de un electrolito, este puede introducirse a la salida de
la columna.
La principal utilización del detector electroquímico se encuentra en los campos de la
bioquímica y los fármacos. Compuestos como las catecolaminas, algunas vitaminas,
hormonas estrogénicas, analgésicos y narcóticos, se determinan con una sensibilidad buena.
9 .3 .6 .5 . D e t e ct or de con du ct ivida d
Es un detector útil en la determinación de compuestos iónicos o ionizables. El detector está
constituido por dos celdas, una de medición y otra de referencia. La fase móvil es una
solución acuosa muy diluida de sales, ácidos o bases. Por lo general las celdas de este
detector son pequeñas (del orden de los microlitros). Los electrodos son de platino.
Hay detectores de conductividad que resisten presiones elevadas. Esto es importante ya

que no es necesario trabajar con dos bombas. Basta intercalar la celda de referencia entre la
bomba y el inyector (o válvula de introducción de muestras). La sensibilidad es moderada.
9 .3 .6 .6 . Ot r os de t e ct or e s u sa dos e n H PLC
En la actualidad han comenzado a desarrollarse otros detectores para los que se prevee una
aplicación extensa a corto plazo. El desarrollo de esos detectores ha estado vinculado con la
introducción de las columnas de diámetro pequeño y en especial de las columnas capilares.
De forma muy breve se describen las principales características de estos detectores:
• D e t e cción e n la Colum na
Las ventajas de la radiación láser sobre las del arco de mercurio, ha hecho posible el
desarrollo de un modo de detección fluorescente que utiliza una parte de la columna
como celda de flujo.
En efecto, con el uso del láser como fuente excitadora se obtiene una ventaja sobre la
excitación clásica. La radiación láser es muy compacta, coherente, planar, con una
dispersión mínima fácilmente eliminable (la luz del arco de mercurio por el contrario es
omnidimensional)
Si se elimina la poliimida en un segmento pequeño de una columna cromatográfica
capilar y se enfoca la radiación láser hacia ese lugar, se logra detectar compuestos
fluorescentes, en concentraciones extraordinariamente bajas, por lo menos tres ordenes
de magnitud por debajo de lo obtenible con un detector convencional. El volumen
iluminado es del orden de los picolitros.
La emisión fluorescente se mide en una dirección tal que la radiación láser excitadora no
influya en esa magnitud.
La resolución cuando se usa este detector, está dada por la longitud del segmento de
columna iluminado por el láser.
• D e t e ct or de le n t e t é r m ico
Se ha desarrollado un detector que utiliza la radiación láser y el principio de la detección
en columna ya explicado, pero aplicable a compuestos que se excitan pero que no
emiten radiación fluorescente al retornar al estado base. En esencia, consiste en hacer
llegar la radiación láser a un segmento corto de la columna capilar. Las moléculas del
analito al pasar por esa sección de la columna se excitan. Al volver al estado base
generan calor. Esta pequeña perturbación térmica local cambia el índice de refracción de
esa zona en una magnitud tal que es posible detectarlo.
Este detector es de uso general y tiene una sensibilidad muy buena, en el rango de los
ng a los pg.
• D e t e ct or de dispe r sión de luz
El detector de dispersión de luz es otro que ha sido desarrollado después que se
introdujeron las columnas capilares en HPLC. Este detector responde por igual ante
muestras de naturaleza química muy diferente. Es pues un detector universal. Tiene
como requisito que la fase móvil sea fácilmente volatizable y ha encontrado mayor
aplicación desde la introducción de las columnas de diámetro pequeño.
El principio del detector es simple. El eluato de la columna se hace llegar a una cámara
donde se nebuliza para facilitar la evaporización de la fase móvil. Las partículas del
analito se conducen hacia la celda de dispersión de luz. A través de esa celda pasa
continuamente un haz de luz de longitud de onda apropiada. Parte de esa luz es

dispersada por las micropartículas de la muestra. La intensidad de la luz dispersada se
capta y amplifica mediante un tubo fotomultiplicador.
La magnitud de la luz dispersada es proporcional a la concentración de la muestra. El
tubo fotomultiplicador debe situarse de modo tal que su respuesta no esté afectada por
la luz no dispersada (procedente de la fuente)..
9 .3 .6 .7 . Acople de la H PLC con e spe ct r om e t r ía de m a sa s.
El valor de la espectroscopia de masas (MS) como técnica eficaz en la identificación de la
estructura de compuestos químicos fue reconocido hace varias décadas. El espectro de
masas da una información concerniente al ordenamiento estructural de los átomos en una
molécula. La interpretación de los espectros de masas brinda una información cualitativa
inequívoca acerca de la identidad de un compuesto. En sus inicios, esta interpretación era
difícil y requería de una cierta especialización de los analistas. No obstante estas
dificultades, el reconocimiento de su potencial identificador situaba a la MS en un lugar
cimero.
Un uso amplio y creciente ha tenido el acoplamiento de la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) con espectrometría de masa (MS del inglés “ m ass spect rom et ry” ). Por la
importancia de esta técnica, se describen a continuación los aspectos fundamentales.
El e spe ct r óm e t r o de m a sa s
Todo espectrómetro de masas está constituido por tres elementos o partes esenciales: la
fu e nt e de ion iza ción , e l a na liza dor de m a sa s y e l de t e ct or .
De modo muy general el proceso que ocurre es el siguiente:
Las moléculas eluidas de la columna son ionizadas y fragmentadas en la fuente de
ionización, pues el espectrómetro de masas solo es capaz de detectar especies iónicas.
Los iones formados en la fuente (la molécula cargada o ión molecular) así como los
fragmentos de esta son separados y enfocados hacia el detector mediante el analizador de
masas. Los haces de iones de igual relación masa/carga (m / z) impactan en el detector, el
cual determina su intensidad.
El analizador del MS es análogo al prisma o monocromador de un espectrofotómetro, pero
en este caso, los iones son separados acorde a sus valores de m / z, en lugar de la separación
de los fotones.
El detector del MS es también análogo al del espectrofotómetro, pero en el primer caso se
utiliza un multiplicador electrónico en lugar de un fotomultiplicador como en el segundo.
Un esquema conceptual del funcionamiento de un espectrómetro de masas se muestra en la
figura 9.7.
Figu r a 9 .7 . Esqu e m a con ce pt u a l de l fu n cion a m ie n t o de u n e spe ct r óm e t r o de m a sa s

La fu e n t e ión ica . Una vez que las moléculas de la muestra salen de la interfase y entran en
la cámara de ionización se ionizan, eventualmente también se fragmentan, originando iones
de distinta relación m / z. El esquema general de ionización y fragmentación es el siguiente:
I ON I ZACI ÓN ABCD + fue n t e → ABCD + . ( ión m ole cu la r )
ABCD + . → AB . + CD +
ABCD + . → AB + + CD .
FRAGM EN TACI ÓN
ABCD + . → ACD + + B . … e t c
Son varios los métodos usables para provocar la ionización y fragmentación de las moléculas
que llegan a la cámara de ionización.
El método más simple, el que primero se usó y aún continúa vigente en muchas
aplicaciones, es el del impacto electrónico (EI), también conocido por ionización electrónica.
Por lo general este método además de originar el ión molecular ABCD + . (la molécula no
fragmentada, cargada por captación o perdida de un electrón) produce una fragmentación
significativa de la molécula. En general la ionización es máxima cuando el voltaje de
aceleración de los electrones está en orden de los 50v-70v.
El método de EI no debe usarse para compuestos que se fragmentan muy fácilmente. En
estos casos es difícil determinar las masas moleculares. Tampoco es bueno el método
cuando se requiera analizar isómeros.
La ionización química (CI) por el contrario es un método de ionización menos fuerte, con el
cual se favorece la formación preferencial (aunque no exclusiva) del ión molecular (ABCD + . ).
Para lograr esto se introduce constantemente en la cámara de ionización una sustancia
química la cual se ioniza con facilidad mediante impacto electrónico originando un gas
reactivo. Este actúa sobre las moléculas de la muestra provocando transferencias de carga
pero con poca transferencia de energía por lo que la fragmentación es poco probable aunque
en algunos casos puede ocurrir.
Entre las ventajas de la ionización química sobre el impacto electrónico se señalan:
• Puede determinarse la masa molecular de la muestra.
• Es más sensible y selectivo en el caso de muestras complejas, pues puede buscarse

condiciones de ionización adecuadas a un compuesto dado.
• Permite distinguir entre isómeros y estereoisómeros.
• La fragmentación es poca por lo que los espectros son más fáciles de interpretar.
• Es muy bueno cuando se usa el método de cuantificación SIM (selective ion monitoring).
Ana liza dor de m a sa s. Los iones formados en la cámara de ionización entran de inmediato
en el analizador de masas. La función de esta parte del espectrógrafo de masas es filtrar o
“enfocar” los iones de igual relación m / z hacia el detector.
Para ello y como las especies a separar son iones en movimiento, se hace uso de la
interacción simultánea de campos eléctricos y magnéticos sobre los primeros, acorde a las
leyes de la electroestática y la electrodinámica. Esto da origen al analizador de masas de
doble enfoque (eléctrico y magnético).
El objetivo, como se expresó es guiar todos los iones formados hacia un punto (el detector)
y como estos tienen masas y/o cargas diferentes (ión molecular, fragmentos iónicos) es
preciso incrementar progresivamente la intensidad del campo magnético y la corriente
directa, que crea un campo electrostático también creciente.
Las posibilidades que brinda la electrónica, los materiales novedosos, la mecánica de alta
precisión, así como el uso de PC y softwares especializados han permitido el desarrollo y
puesta en práctica de varios tipos de analizadores de masa tales como el cuadrupolo y el Ion
Trap Analyzer con características variadas de trabajo en especial el rango de relación m / z
máximo y mínimo que abarcan, así también como la resolución.
No obstante es importante señalar que aunque los analizadores de masas mencionados son
los más usados hasta hoy en la mayoría de los equipos comerciales, se ha desarrollado y
comenzado aplicar en los últimos años un tipo de analizador de masas, que basa la
separación de las especies iónicas en un principio totalmente diferente. Este es conocido por
sus siglas en inglés como “TOF mass analyzer” (Time Of Flight), el cual fue el primero en
usarse en el acoplamiento CG– MS aunque sin éxito por entonces.
En este tipo de analizador las especies iónicas se conducen a un tubo llamado de deriva y
son aceleradas hacia el detector mediante un potencial eléctrico adecuado a tal fin. Puesto
que las especies iónicas que se originan en la cámara de ionización tienen distintas
relaciones m / z, cada ión llegará al detector en un momento diferente. Los primeros en llegar
serán los de menor masa y los últimos los de mayor.
La resolución en este tipo de analizador estará dada por la diferencia del tiempo de
migración de cada ión, que como es lógico dependerá de su relación m / z. La resolución
depende también de la longitud del tubo de deriva y del potencial (constante) aplicado, los
cuales son aspectos tenidos en cuenta por el fabricante y optimizados por el.
En la actualidad la resolución de los analizadores de masa comerciales y las del tipo TOF son
similares, obteniéndose rutinariamente valores del orden de 0,1 a 1 Da.
La de t e cción . Cada especie iónica llega al amplificador electrónico y da una señal cuya
intensidad dependerá de su abundancia relativa. La corriente generada por el flujo de iones
proveniente del analizador de masas es muy débil del orden de 10-14 A. No obstante, a
través de un amplificador electrónico alcanza valores aptos para ser medidos con exactitud.
Hay varios tipos de detectores comerciales en uso desde el punto de vista analítico la
información eléctrica puede ser adquirida de dos modos distintos. En uno de ellos se
monitorea todas las masas producidas en la cámara de ionización (ión molecular,
fragmentos y productos de reacción). Se obtiene un gráfico tridimensional donde un eje

corresponde al tiempo de retención, otro a la abundancia iónica relativa y el tercero a la
masa de cada fragmento. Este modo es usado en la identificación de compuestos con la
ayuda de los ficheros de espectros de masas.
En el otro modo se selecciona previamente las masas o fragmentos que se desean medir.
Este procedimiento es conocido por SIM. Es mucho más sensible y selectivo y los espectros
son más fáciles de interpretar.
Como resultado del análisis por espectrometría de masas se obtiene un espectro de masas,
que es un gráfico compuesto de muchas líneas, cada una de las cuales se corresponde con
los diferentes fragmentos obtenidos y detectados, en función de su relación masa/carga
(m / z). En el eje de las ordenadas (y) aparece el % de abundancia de cada uno de estos
fragmentos.
La figura 9.8 muestra un espectro de masas de la Vitamina D3
Figu r a 9 .8 . Espe ct r o de m a sa obt e n ido pa r a la Vit a m in a D 3 ( cole ca lcife r ol)

Obviamente el espectro de masas de una especie brinda importante información cualitativa
sobre esta, pues el número de fragmentos obtenido así como los valores de la relación m/z
de los mismos está íntimamente relacionado con la estructura de la sustancia.
Con fines analíticos, en un sistema HPLC-MS se registra un cromatograma de corriente
iónica total (TIC) contra el tiempo de retención. Puede también registrarse la corriente de un
ión característico de cada componente de la muestra, contra el tiempo: este método se
denomina SIM por sus siglas anglosajonas (selective ion monitoring).
Los análisis mediante el acople HPLC-MS son muy precisos. Por lo general se logra una
precisión entre 1% y 10% de la desviación estándar relativa para concentraciones de
decenas de pg a decenas de ng. Otra característica buena del acoplamiento HPLC – MS es su
rango lineal grande, que como mínimo es de 104.
El acoplamiento HPLC – MS se aplica en la determinación de cualquier compuesto, si se
dispone de este de una columna adecuada y condiciones tales, que permitan
cromatografiarlo en un tiempo práctico. Así como es lógico, es necesario que la masa
molecular de la muestra sea compatible con el analizador de masas del sistema que se
disponga.
En la tabla 9.4 se resumen las características fundamentales de algunos detectores usados
en HPLC.
Tabla 9.4
Caract eríst icas y uso de algunos det ect ores
D e t e ct or Uso LD Lin e a lida d Obse r va cion e s

Refractométrico Universal µg/mL 10 3
UV Selectivo ng/mL 10 4 Uso frecuente
(λ fija)
(UV–visible) Selectivo ng/mL 10 3 Espectro de aplicación amplio
(λ variable)
Fluorescencia Selectivo pg/mL 10 3 − 10 4 -
Electroquímico Selectivo pg/mL - -

Conductividad Selectivo µg/mL- 10 5 Para la detección de sustancias
de iones mg/mL conductivas e iones
µg/mL 10 3 − 10 4
columnas de di ≅ 25 µm
Dispersión de luz Universal Detección “on – column” para
columnas de di ≅ 25 µm
Detector de Selectivo fg/mL 10 3 Detección “on – column” para
fluorescencia en
columna
Acople HPLC -MASA Selectivo ng/mL 10 4 Para flujos de 1 mL/min o
menores
9 .3 .7 . Sist e m a de r e gist r o y pr oce sa m ie nt o de la in for m a ción cr om a t ogr á fica

Por lo general, la salida de la información producida por el detector ante el paso de la
muestra a través de la celda de flujo, puede registrarse directamente valiéndose de un
registrador convencional. Pero esto es ya algo que se está utilizando cada vez menos. La
introducción de las PC y de los softwares especializados permite la captación de la
información cromatográfica, su almacenamiento y procesamiento en el momento que se
requiera. Los softwares especializados en cromatografía líquida le proporcionan al analista
un número de herramientas que hacen más fácil, seguro y exacto su trabajo.
La posibilidad de comparar los cromatógramas de la muestra, de los patrones analíticos y los
de los blancos correspondientes al análisis que se realiza es hoy tarea rutinaria en el análisis
por HPLC.
El cálculo cuantitativo se facilita pues además de los tr, el sistema software – computadora
almacena el área y la altura de cada pico significativo.
9 .3 .8 . El cole ct or de fr a ccione s
Para trabajos preparativos en los que se requiere colectar las fracciones eluidas de la
columna puede emplearse de modo opcional un colector de fracciones. El colector de
fracciones se coloca después que la señal del detector ha sido registrada y de forma análoga
a los automuestreadores, estos dispositivos son programables en cuanto al volumen y
número de muestras a colectar en función del tiempo de análisis.
En la actualidad muchos equipos de HPLC se comercializan con un diseño modular muy

atractivo que posee la ventaja adicional de brindar una mayor protección a cada uno de sus
componentes (figura 9.9).
Figu r a 9 .9 . D ise ñ o m odu la r de u n cr om a t ógr a fo líqu ido de a lt a r e solu ción ( H PLC) de la se r ie

1 2 0 0 , com e r cia liza do por la fir m a a le m a n a Agile n t Te ch n ologie s
Por otra parte el desarrollo alcanzado por las microelectrónica ha conducido a la aparición de
potentes aditamentos de pequeño tamaño capaces de monitorear todo el proceso
cromatográfico (figura 9.10), en tanto el auge de las Tecnologías de la Información y las
Comunicaciones (TICs) facilita el acceso a enormes bases de datos en línea que permiten la
obtención de información cromatográfica de todo tipo.
Figu r a 9 .1 0 . Con t r ola dor I n st a n t Pilot Agile n t . Se r ie 1 2 0 0 qu e pr opor cion a ple n o con t r ol
in st r u m e n t a l y visu a liz a ción de la se ñ a l e n lín e a
9 .4 . M odos de ope r a ción e n H PLC

En líneas generales, los distintos tipos de cromatografía usados en HPLC pueden llevarse a
cabo de modos muy diferentes.
9 .4 .1 . Ré gim e n isocr á t ico
La forma más simple de realizar una determinación en HPLC es cuando todos los parámetros
que influyen en la separación cromatográfica, permanecen constantes. Entre ellos tiene
relevancia la composición de la fase móvil. En este caso el modo de operación se llama
isocrático (de igual fuerza, en este caso, de elución).
Hay razones muy fuertes para usar, siempre que sea posible, el modo de operación
isocrático:
• El equipamiento es más simple, menos costoso.
• El procedimiento es sencillo y relativamente rápido.
• El tiempo de la estabilización de la columna después de cada análisis es muy corto,
en ocasiones no se requiere esta etapa.
• Los resultados son muy reproducibles y el procedimiento está poco influenciado por
algunas impurezas en los solventes que originan problemas en otros modos de
operación.
Sin embargo la operación isocrática tiene inconvenientes y limitaciones. Así por ejemplo:
• No puede usarse, cuando no es posible lograr que los componentes de una muestra
tengan valores de K en el rango 0,5 < K < 20.
• Es muy difícil obtener resultados adecuados (reproducibles), si la masa molecular de
los componentes de la muestra es superior a 1000 Da. En estos casos, variaciones
muy pequeñas en el porcentaje del modificador orgánico (% B), ocasionan grandes
cambios en los tiempos de retención.
• Si las muestras que se analizan tienen impurezas con K » 20, además de dañarse la
columna, provocan dificultades en la interpretación y calidad de análisis sucesivos
(eluyen en zonas evaluables de los cromatógramas siguientes).
• En ocasiones es muy difícil eliminar con medios isocráticos las colas de algunos
componentes de las muestras.
Para dar solución a los problemas cromatográficos expuestos, se ha desarrollado algunos
modos de operación en HPLC. En los epígrafes siguientes se describirá los tipos principales
de programación en HPLC y se hará énfasis en la programación de gradiente (composición
variable de la fase móvil), debido a la importancia que tiene esta variante tanto en HPLC
analítica como en procesos preparativos a cualquier escala.
9 .4 .2 . Pr ogr a m a ción de la com posición de la fa se m óvil ( gr a die n t e de e lu ción)
Este es el tipo de programación más usado en HPLC a pesar de que tiene algunas
desventajas (equipamiento costoso, en especial la bomba, además requiere tiempo para
reequilibrar la columna después de cada análisis, lo que implica un consumo mayor de fase
móvil).
Además de las circunstancias que fueron señaladas en el epígrafe 5.5 que indican como
opción la vía de programación en HPLC, en el caso concreto del gradiente de elución hay que
añadir que se mejora sustancialmente la sensibilidad (los picos son la mitad del ancho y el
doble de altos que en la separación correspondiente de forma isocrática).
Como ya se ha mencionado con anterioridad, en la cromatografía de gradiente de elución se

utiliza como mínimo dos solventes. El solvente A es débil mientras que el solvente B es
fuerte. El porcentaje de este segundo solvente se hace variar en función del tiempo, de
modo de lograr la separación requerida.
Cuando se usa gradiente de elución es útil trabajar con el parámetro tiempo de gradiente
(tG), el cual mide el tiempo en que la fase móvil cambia desde A puro (100 % ) hasta B puro
(100 % ) en forma lineal (figura 9.11).
Figu r a 9 .1 1 . I n cr e m e n t o lin e a l de l solve n t e B. Tie m po de gr a die n t e ( t G)

Por razones prácticas este cambio se expresa siempre en % V/ V.
9 .4 .2 .1 . La Ele cción de los Solve n t e s A y B
Si el solvente A es más fuerte que el B, la utilización de gradiente de elución tiene un efecto
adverso al deseado pues empeora el cromatograma. Si por el contrario A es muy débil
mientras que B es demasiado fuerte, por lo general los componentes de la muestra se
reúnen muy unidos, con poca resolución, en un punto del cromatograma. En este caso es
aconsejable variar A (seleccionar otro A) hasta lograr que los picos con t r pequeño no se
superpongan.
Si aún con el solvente A más débil los picos tienden a agruparse poco tiempo después de la
inyección, entonces se requiere trabajar con una columna con un número de platos teóricos
mayor (más larga) o cambiar el tipo de fase estacionaria hasta lograr el objetivo requerido.
La elección del Solvente B reviste una particular importancia en los sistemas de gradiente. El
parámetro tG es muy útil en su selección pues si cuando se alcanza el tiempo tG, no han
eluido aun todos los componentes de la muestra, ello es indicativo de que es preciso
incrementar la fortaleza de B.
9 .4 .2 .2 . Tipos de gr a die n t e
Hay varias formas de realizar el gradiente de elución de acuerdo a la forma en que se varíe
la concentración de B en función del tiempo. En este sentido los gradientes pueden ser
lineales, logarítmicos y exponenciales. Los cromatogramas obtenidos al aplicar cada una de
estas variantes poseen características diferen
El gradiente lineal es aquel en el cual el porcentaje de B varia linealmente en función del

tiempo lo que produce de forma general un cromatograma cuyos picos son equidistantes y
tienen anchos en las semialturas muy similares (figura 9.12).
Figu r a 9 .1 2 . Gr a die n t e lin e a l: ( A) r e pr e se n t a ción gr á fica , ( B) cr om a t ogr a m a ca r a ct e r íst ico.

Cuando se hace crecer B de forma logarítmica en función del tiempo el cromatograma
resultante se caracteriza por el hecho de que los picos con t r pequeños son más estrechos
que los de t r mayor y se produce además un incremento entre las distancias entre picos a
medida que aumenta el t r (figura 9.13)
Figu r a 9 .1 3 . Gr a die n t e loga r ít m ico: ( A) r e pr e se n t a ción gr á fica ,

( B) cr om a t ogr a m a ca r a ct e r íst ico.
Finalmente, si la concentración de B se hace crecer exponencialmente en función del tiempo,
el cromatograma resultante presenta picos que van siendo mayores, más estrechos y con
menores distancias entre dos consecutivos tal como se muestra en la figura 9.14.
Figu r a 9 .1 4 . Gr a die n t e e x pon e n cia l: ( A) r e pr e se n t a ción gr á fica ,

( B) cr om a t ogr a m a ca r a ct e r íst ico.
Cada una de las tres formas de realizar el gradiente de elución tiene sus ventajas y su
campo de aplicación.
La programación lineal se usa para casos normales, Sus resultados son muy buenos,
especialmente la calidad de sus cromatogramas. En ellos hay casi la misma resolución para
los picos con tr pequeños que para los que tienen tr grandes.
En el caso del gradiente logarítmico mejora la resolución para los picos con tr grande, pero
hay pérdida de sensibilidad. Mientras que con el gradiente exponencial ocurre todo lo
contrario: los compuestos de mayor tr salen más finos, con menos resolución, pero se gana
en sensibilidad.
Un aspecto que es general para cualquier forma de realizar el gradiente de elución está
relacionado con la capacidad de carga de la columna. Si se trabaja isocráticamente la
sobrecarga de la columna (un tamaño excesivo de muestra) se manifiesta por una
disminución de los tr así como del número de platos teóricos. La sobrecarga es mayor, en
igualdad de condiciones, para los componentes de la muestra con mayores valores de K.
Esto se pone de manifiesto cuando se analiza una mezcla de varios analitos, todos con la
misma concentración. Si esa concentración es tal que se satura la columna para el
componente con menor tr, esa misma concentración sobresatura los demás componentes
(con tr mayores).
Esto no se presenta cuando se trabaja con gradiente de elución. En este caso, como que K
decrece con el gradiente, la columna no se sobrecarga. Tampoco es frecuente ver picos con
colas cuando se trabaja con gradiente, puesto que la zona posterior de este está en
contacto siempre con una fase móvil más fuerte que la de su frente.
Por las razones expuestas, es frecuente que los trabajos preparativos en HPLC (a cualquier
escala) se realicen con gradiente de elución.
9 .4 .3 . Pr ogr a m a ción de flu j o o pr e sión de la fa se m óvil
Este es un tipo de programación sencillo. Puesto que los tr de los componentes de una
muestra son inversamente proporcionales al incremento de la presión (o del flujo
correspondiente) si se programa éste, acorde a una cierta ley (incremento lineal,
exponencial), se logrará un cromatograma más corto, con las ventajas que esto conlleva.
En la actualidad y con el uso de softwares especializados, es factible hacer una
programación de presión acorde a una necesidad analítica concreta.
Aunque el método no requiere una estabilización del sistema posterior al análisis, se usa
poco pues tiende a compactar el relleno de la columna si se usa repetidamente.
9 .4 .4 . Pr ogr a m a ción de t e m pe r a t u r a
Este tipo de programación requiere como es natural disponer de un horno con regulación de
la temperatura. El efecto del incremento de la temperatura sobre la separación
cromatográfica tiene que ver con la modificación de las constantes de distribución de los
solutos.
Pero además de la disminución de los tr que esto lleva aparejado, y debido al efecto que
tiene la fase móvil en la HPLC:
• Se mejora la capacidad de muestra (la columna admite una muestra de mayor tamaño
sin saturarse)
• Disminuye progresivamente la viscosidad de la fase móvil, aumenta la permeabilidad del

relleno y en consecuencia la presión necesaria para mantener un flujo preestablecido es
cada vez menor.
Desde el punto de vista práctico, es necesario programar también la temperatura de la fase
móvil que entra a la columna. Para ello basta con introducir en el horno de 0,5 m – 1 m del
tubo conductor de la fase móvil.
9 .5 . Tr a t a m ie n t o de m u e st r a s pa r a H PLC
La etapa de la preparación de la muestra es una etapa crítica en cualquier método analítico
y de ella depende en gran medida el éxito de la determinación.
A pesar de que el objetivo de la cromatografía es precisamente la separación de los
componentes de una mezcla y de la formidable fortaleza de HPLC para la separación de
mezclas de altísima complejidad, está técnica no está exenta de necesitar un cuidadoso
tratamiento de las muestras debido a que la impurezas y contaminantes presentes en la
matriz original pueden entorpecer la eficiencia de la separación y lo que es peor dañar la
columna cromatográfica.
De cualquier modo el objetivo de la etapa de preparación de la muestra es el mismo que
para cualquier método analítico, es decir, extraer el grupo de compuestos a cromatografiar
del modo más eficiente posible, en ausencia de sustancias interferentes.
Para ello pueden emplearse métodos de extracción convencionales tales como extracciones
sucesivas con disolventes (en función de la polaridad de los compuestos de interés) y
posterior concentración del extracto, procedimientos de destilación, reflujo, clarificación,
digestión, e incluso la aplicación de la cromatografía en columna convencional como un paso
previo a la inyección en HPLC; pero estos procedimientos tienen la desventaja de consumir
grandes cantidades de solventes y matrices así como largos tiempos de análisis, con vistas a
garantizar porcentajes de recuperación adecuados.
En los últimos años han surgido otras técnicas que permiten un tratamiento de las muestras
menos laborioso y más eficiente. A continuación se expondrán brevemente dos de las más
empleadas en la actualidad: la extracción en fase sólida y la microextracción en fase sólida.
9 .5 .1 . Ex t r a cción e n fa se sólida
La extracción en fase sólida (SPE, del inglés Solid Phase Ext ract ion) es una excelente opción
en la preparación de muestras para análisis por cromatografía de una enorme gama de
componentes presentes en los alimentos (grasas, proteínas, aminoácidos, azúcares,
vitaminas, etc.), con la ventaja de que requiere de pequeñas cantidades de muestras y
solventes orgánicos, así como cortos tiempos de análisis en comparación con otras técnicas
clásicas de tratamiento de muestras.
El método consiste en hacer pasar la muestra a través de unas pequeñas columnas
cromatográficas, llamadas también cartuchos de SPE, rellenas de un soporte que contiene la
fase estacionaria con la cual interactúan los componentes de la muestra (figura 9.15).
El objetivo de este procedimiento es la separación del grupo de compuestos (que
posteriormente serán analizados por HPLC o cromatografía de gases), de otros sustancias
contaminantes o interferentes presentes en la muestra, que pudieran dificultar la posterior
separación o incluso dañar la columna cromatográfica. Para ello debe existir una diferencia
apreciable de afinidad por la fase estacionaria entre los compuestos de interés y las
interferencias; así, la purificación y/o extracción de estos componentes en SPE puede ocurrir
de dos formas diferentes:
1. Las sustancias contaminantes interactúan con la fase estacionaria y los componentes que
se desean extraer eluyen rápidamente sin interaccionar con ésta y se recogen para su
posterior separación cromatográfica.
2. Los componentes que se desean extraer quedan en la fase estacionaria mientras que las
sustancias interferentes eluyen. En este caso habría que hacer pasar con posterioridad a
través del cartucho SPE un solvente adecuado para eluir los compuestos de interés y
recogerlos para su análisis.
Figu r a 9 .1 5 . Ca r t u ch o de e x t r a cción e n fa se sólida

En la actualidad se comercializan cartuchos SPE desechables de vidrio o material polimérico
que se usan para remover contaminantes o para realizar fraccionamientos previos. Esta
técnica es altamente selectiva y versátil debido al gran número de fases estacionarias
introducidas en los últimos 15 años; además de la conocida sílica gel, se emplean cartuchos
SPE de fase ligada (amino, diol, ciano), fase ligada reversa (C-8 y C-18) y fase ligada de
grupos siloxano y amino cuaternario para intercambio iónico.
Las tablas 9.5 y 9.6 muestran dos procedimientos de SPE para la preparación de muestras
lipídicas.
Tabla 9.5
Ext racción de la fracción de est eroles en aceit es
ETAPA ACCI ÓN
A Saponificación de la muestra
(0.25-0.50 g aceite + 5 ml 0.5 mM KOH alcoholico, 20 min a reflujo, 80ºC)
B Adición de betulina como estándar interno
(1 mL de betulina en 5 mL de cloroformo
C Ajustar pH y filtrar
(HCl 5 M, filtro de membrana de nylon 0.45 mm)
D Pasar a través de cartucho C18
Tabla 9.6
Elución combinada de colesterol oxidado usando columnas SPE de sílica y NH2
ETAPA ACCI ÓN
A Columna SPE de sílica (300mg/3ml); acondicionada con 3 ml hexano
B Aplicación de la muestra
C Elución con 10 ml n-hexano/eter etílico (95:5,v/v); 25 ml n-hexano/eter etílico
(90:10),15ml n-hexano/eter etílico (80:20, v/v), vacío 29 kPa, flujo 0.6 ml/min
v/v]
D Elución de colesterol oxidado con 5 mL de acetona
E Concentración del eluato a 1ml de n-hexano/eter etílico (90:10), v/v
F Aplicación en columna SPE NH2
G Elución con 15 ml n-hexano/eter etílico (90:10), v/v
H Elución de colesterol oxidado purificado con 10 mL de acetona
9 .5 .2 . M icr oe x t r a cción e n fa se sólida

La microextracción en fase sólida (SPME, del inglés Solid Phase Micro Ext ract ion) es una
técnica de preparación de la muestra en la que se emplea muy poca cantidad de disolventes.
El principio de funcionamiento es muy similar a la extracción en fase sólida (SPE), pero aquí
la fase estacionaria está contenida en un finísimo capilar (de diámetro interno en el orden de
los micrómetros), que sustituye a la aguja de una jeringa especial. La figura 9.16 muestra
un esquema de la jeringa con el capilar que contiene la fase estacionaria
Figu r a 9 .1 6 . Je r in ga con e l ca pila r con t e n t ivo de la fa se e st a cion a r ia

El procedimiento general consiste introducir un volumen de muestra en la jeringa y ejercer
una presión controlada sobre el émbolo con ayuda de una bomba. La muestra se adsorbe en
fase estacionaria y los eluatos se desechan. Posteriormente se repite el procedimiento con
una solución de lavado para terminar de eluir las interferencias que no interactuaron con el
adsorbente y nuevamente los eluatos son desechados. Finalmente se hace pasar un
disolvente que actúa como fase móvil y eluye el o los compuestos de interés, los cuales
quedan listos para el análisis por HPLC.
En la figura 9.17 se muestra un esquema de un procedimiento SMPE aplicable a muestras de

mieles, leche y huevos, para la posterior determinación de cloranfenicol por HPLC. En este
caso se empleó un capilar cuyas dimensiones fueron 2 cm x 530 nm, contentivo de un
polímero monolítico como fase estacionaria.
Figu r a 9 .1 7 . Ex t r a cción de clor a n fe n icol e l m ie le s, le ch e y h u e vos u t iliza n do m icr oe x t r a cción

con polím e r os m on olít icos ( á cido m e t a cr ílico- dim e t ilcr ila t o de e t ile n glicol)
9 .6 . Aplica cion e s a na lít ica s de H PLC
El objetivo del análisis por HPLC es el mismo que el de cualquier otro tipo de análisis
cromatográfico, esto es, lograr la separación lo más completamente posible de los
constituyentes de una mezcla, para luego identificarlos y cuantificarlos por algún medio
apropiado. En este aspecto HPLC es muy buena pues las separaciones que se logra con ella
son excelentes. En los demás métodos de análisis conocidos, se precisa separar los
constituyentes de una mezcla (incluidos como tales también las impurezas), para con
posterioridad identificarlos y/o cuantificarlos. En cuanto a la rapidez del método no es
necesario insistir mucho. Así por ejemplo a principios del pasado siglo uno de los grandes
químicos de la época, Emil Fischer, desarrolló un método para analizar hidrolizados de
proteína, el cual requería por lo menos una semana de trabajo para su terminación.
Actualmente el análisis de un hidrolizado de proteína por HPLC es tarea de unas pocas
horas.
Es premisa en todo análisis obtener un grado satisfactorio de aislamiento de los
componentes de la mezcla a analizar. El trabajo se facilita mucho cuando se supone o
conoce el origen de la muestra o la posible presencia de algunos constituyentes particulares.
Para llevar a cabo una separación por HPLC es preciso tener en cuenta dos factores
importantes: la naturaleza físico-química de la columna y las condiciones de operación del
equipo.
De importancia en cualquier separación cromatográfica es la naturaleza de la FE. De la
elección acertada de ésta depende en gran medida el éxito del análisis. Cuando no se
dispone de datos sobre la naturaleza de la muestra a analizar, es preciso hacer análisis de
tanteo con fases estacionarias de naturaleza químico-físicas diferentes, con vistas a elegir
entre ellas la que presente las mejores características.
Una vez elegida la FE es preciso tener presente todos los parámetros que afectan la
eficiencia de una columna, los cuales han sido discutidos en detalle al tratar sobre la
ecuación de Van Deemter y que como es lógico, no es necesario repetir aquí. Solo es preciso
señalar que aún eligiendo los parámetros óptimos para una separación, los resultados
pueden ser pobres o insatisfactorios, si no se ha procedido correctamente al impregnar el
soporte con la FE; si con posterioridad no se empaquetó correctamente el relleno en la
columna; si el acondicionamiento de ésta fue inadecuado, etc. En resumen, los mejores
resultados se obtienen solamente cuando todos los pasos requeridos para la preparación y
puesta en operación de una columna cromatográfica han sido realizados teniendo en cuenta
los principios e indicaciones dados en párrafos anteriores..
Condicione s de ope r a ción
Los parámetros de operación fundamentales son la composición de la fase móvil, el sistema
de elución empleado y la velocidad de flujo.
En HPLC, la composición de la fase móvil y el sistema de elución empleado (isocrático o de
gradiente) juegan un papel esencial en el proceso por cuanto determinan la fuerza con que
la misma va a arrastrar a los solutos durante el proceso de separación y por tanto su
capacidad de solubilizarlos con mayor o menor facilidad influye grandemente en la eficiencia
de la separación.
En relación a la velocidad de flujo se sabe que existe un flujo óptimo para cada
constituyente, pero la mezcla se cromatografía a un flujo de compromiso. En cada caso
particular habrá que variar el flujo y observar el efecto que esta variación produce sobre la
resolución.
Finalmente es preciso considerar la concentración de la muestra y el volumen de esta a
inyectar. La cantidad de cada componente inyectado debe encontrarse dentro del rango
lineal de respuesta del detector. De no ser así debe realizarse diluciones hasta satisfacer
este requisito. Además, el volumen a inyectar debe ser el menor posible.
9 .6 .1 . An á lisis cu a lit a t ivo
Para identificar los componentes de una mezcla separados por HPLC se utilizan diversos
métodos, los cuales pueden ser cromatográficos y no cromatográficos. Los métodos de
identificación basados en las propiedades cromatográficas son relativamente rápidos y
sencillos en sus principios. Tienen sin embargo sus limitaciones. Así por ejemplo, si se mide
el tr y el ancho de la altura media de un compuesto desconocido y no coinciden con los
valores respectivos de un patrón X cromatografíado bajo idénticas condiciones, se puede
afirmar categóricamente que el producto desconocido no es X. Pero si al realizar las
mediciones de tr y ancho en la altura media se encuentra una buena concordancia entre los
valores respectivos del patrón X y del compuesto desconocido, (teniendo en cuenta el error
normal de medición), no se puede afirmar que sean la misma especie química. Hay sin
embargo una buena probabilidad de que sean el mismo compuesto; la probabilidad
aumentará a medida que se use otros métodos de identificación (cromatográficos o de otro
tipo).
Es claro que el conocer el origen de la muestra facilita el trabajo. Si se sabe que un cultivo
se trata con insecticidas fosforados y al analizar una muestra de tomate se presenta un pico
con igual tr, ancho en altura media, etc, que el malathion debemos darnos por satisfechos y
aceptar que la sustancia desconocida corresponde al referido insecticida.
En una identificación de rutina, en la que se use un detector selectivo, es suficiente la
coincidencia de dos o tres parámetros cromatográficos para dejar sentada la identidad de un
compuesto, si se dispone además de datos sobre el origen de la muestra.
Una identificación más rigurosa se requiere cuando se tiene poca información sobre la matriz
y sobre su composición. En este caso es necesario, como es lógico, más trabajo sobre la
muestra. En primer lugar hay que hacer selectiva la identificación desde las etapas
preliminares del análisis, esto es desde la extracción y limpieza. De ser posible habrá de
usarse métodos que permitan separar los analitos en grupos. La información derivada de los
métodos de partición y elución selectiva en columna es muy valiosa para ayudar a
interpretar los resultados cromatográficos. Además de éstos métodos, ha de usarse
identificaciones por capa delgada, de ser posible con revelados selectivos. Se completa el
trabajo recogiendo el compuesto separado cromatográficamente en una trampa adecuada y
sometiéndolo a identificación adicional por UV, IR u otra técnica adecuada.
De cualquier modo en el análisis de los alimentos el análisis cualitativo se realiza de forma
general con fines corroborativos pues la inmensa mayoría de los componentes presentes en
los alimentos se conocen, así como también se sabe a priori la procedencia de las muestras
y se cuenta con un gran número de patrones de referencia de estos compuestos.
A continuación se describen los métodos más empleados para el análisis cualitativo en el
caso de matrices alimentarias.
9 .6 .1 .1 . Com pa r a ción de los t ie m pos de r e t e n ción
Es un método muy sencillo que consiste en comparar los tiempos de retención obtenidos
para un pico cromatográfico de una muestra cromatografiaza con el tiempo de retención
obtenido para un patrón de referencia de la sustancia que se sospecha esté presente en la
muestra.
Es útil cuando se dispone de patrones analíticos y se conoce la procedencia de la muestra.
Se analiza ésta y aquellos bajo iguales condiciones, preferentemente alternando la inyección
de la muestra con la de los patrones y, con las limitantes ya conocidas, la igualdad de
tiempos de retención entre muestra y patrón es un buen indicio de identidad.
Los tiempos de retención publicados en la literatura no deben usarse como criterio de
identificación. Esto se debe a que el tr depende de numerosos factores (naturaleza y
porcentaje de FE, longitud y diámetro interno de la columna, velocidad de flujo, entre otros)
y no es posible reproducir las mismas condiciones en otro laboratorio, máxime cuando el
porcentaje de FE es variable en función del tiempo, ya que ésta varía paulatinamente.
9 .6 .1 .2 . Anch u r a e n la a lt u r a m e dia
La anchura del pico de un analito medido en la mitad de la altura es una característica
distintiva de este. Así, cuando un compuesto desconocido presenta el mismo tiempo de
retención que un patrón analítico y además sus anchuras respectivas en la semialtura son
iguales, se puede afirmar con mucha probabilidad de no equivocarse, que ambos son la
misma sustancia. Si para tiempos de retención iguales de muestra y patrón las anchuras
respectivas son diferentes, se puede descartar definitivamente la igualdad. Debe recordarse
que el proceso de ensanchamiento de una banda cromatográfica es muy complejo y está
determinado por numerosos factores, la mayoría de los cuales depende de la naturaleza
físico-química del soluto que se cromatografía. Es lógico que si dos compuestos tienen
naturalezas físico-químicas distintas, sus ensanchamientos respectivos sean diferentes.
9 .6 .1 .3 . Enr iqu e cim ie n t o de pico
Es una variante de la comparación de los tiempos de retención. En este caso una vez
cromatografiaza la muestra, se añade a esta una cierta cantidad de patrón de referencia del
compuesto que se sospecha esté presente. La muestra con el patrón adicionado se vuelve a
cromatografiar y si uno de sus picos aumenta su área es indicativo que se corresponde con
el patrón adicionado. Si por el contrario aparece un nuevo pico en el cromatograma puede
afirmarse que el patrón de referencia no se corresponde con ninguno de los componentes

presentes en la muestra.
9 .6 .1 .4 . Ut iliza ción de u n de t e ct or con a r r e glo de diodos
El empleo de un detector espectrométrico UV-Vis con arreglo de diodos brinda enormes
posibilidades para la identificación de compuestos por cuanto, además de ofrecer
información sobre los tiempos de retención de los componentes y por tanto ser sensible a la
aplicación de los métodos de identificación anteriormente mencionados (comparación de los
tiempos de retención, anchura en la altura media y enriquecimiento de pico), este detector
es capaz de realizar un barrido en un amplio rango de longitudes de onda a cada uno de los
componentes eluidos obteniendo el espectro de absorción de cada uno.
El uso de computadoras y software especializados permiten en la actualidad almacenar una
enorme cantidad de espectros en bibliotecas digitales llamadas espectrotecas y realizar
comparaciones con los espectros obtenidos por el detector de cada uno de los componentes
cromatografiados lo que permite realizar el análisis cualitativo basado no solo en las
propiedades cromatográficas de los eluatos sino también, en sus características
espectroscópicas.
La figura 9.18 muestra un gráfico en tercera dimensión donde se relacionan los tiempos de
retención y los espectros de absorción de una mezcla compleja.
Figu r a 9 .1 8 . Gr á fico t r idim e n sion a l de u n a m e zcla com ple j a obt e n ida con u n de t e ct or de
a r r e glo de diodos.
9 .6 .1 .5 . Acopla m ie n t o e n lín e a de H PLC con t é cn ica s e spe ct r oscópica s
En la actualidad están tomando mucho auge un grupo de equipos analíticos que constan de
un cromatógrafo acoplado a un espectrómetro de masas (MS) o a un equipo de resonancia
magnético nuclear (RMN). Estos equipos son muy costosos aunque las ventajas que brindan
son innegables por cuanto aprovechan al máximo las inigualables potencialidades de estos
métodos espectroscópicos en la identificación de prácticamente todo tipo de compuestos.
En la actualidad es posible disponer comercialmente de cromatógrafos líquidos de alta
eficiencia acoplados a espectrómetros de masas (HPLC–MS), como equipos compactos, en
los cuales el espectrómetro de masas se ha convertido en un detector muy valioso en la
identificación y cuantificación. De forma análoga al detector con arreglo de diodos el uso de
computadoras y software especializados permiten en la actualidad almacenar una enorme
cantidad de espectros de masas en espectrotecas y realizar comparaciones con los espectros
obtenidos por el detector de cada uno de los componentes cromatografiados, sin que el
analista tenga que ser un especialista en espectrometría de masas para arribar a
conclusiones sobre la composición cualitativa de los compuestos cromatografiados.
9 .6 .1 .6 . Cole cción de a na lit os e lu ídos e ide n t ifica ción por t é cn ica s
e spe ct r oscópica s, de m icr oa ná lisis y por cr om a t ogr a fía de ca pa de lga da
La colección de los componentes separados por HPLC de una mezcla compleja puede
realizarse automáticamente colocando un colector de fracciones al final del sistema
cromatográfico. Una vez colectada la cantidad requerida del analito o analitos de interés, los
mismos se analizan mediante métodos espectroscópicos tales como la espectrometría de
masas (MS), la espectroscopia infrarroja (IR) o la espectroscopia de resonancia magnético
nuclear (RMN) aprovechando las potencialidades de los mismos como métodos de
identificación.
Las técnicas de microanálisis generalmente están muy bien establecidas y pueden aplicarse
con éxito para la identificación de los solutos separados y aislados por los procedimientos
descritos. La especificidad de estos métodos de identificación es muy grande, razón por la
cual se han desarrollado mucho en los últimos años.
Finalmente el uso de la cromatografía de capa delgada en la identificación cualitativa puede
tener lugar tanto en el extracto que se inyecta en el cromatógrafo como en los compuestos
eluídos y aislados por los métodos descritos. La cromatografía de capa delgada tiene un gran
poder de separación, por lo que en la mayoría de los casos puede prescindirse de la
separación por HPLC y se identifica el extracto directamente por este procedimiento.
9 .6 .2 . An á lisis cu a n t it a t ivo
La aplicación de HPLC al análisis cuantitativo tiene sus premisas, sin las cuales los resultados
son poco valiosos o erróneos. Sin que el orden siguiente implique la importancia, las
premisas fundamentales de todo análisis cuantitativo por cromatografía líquida de alta
resolución son:
• Los picos a evaluar han de corresponder a una sola especie química. Es por tanto
importante que la separación haya sido eficiente. Picos con colas o frentes difusos
amplios o con costados ligeramente deformados pueden enmascarar el resultado
cuantitativo. Es importante que la simetría del pico de una muestra dada sea igual al del
patrón correspondiente, cosa esta a veces difícil de lograr, especialmente cuando se
analiza extractos vegetales, material biológico, etc., en los cuales pueden existir
interferencias menores que afecten la simetría.
• La segunda premisa del análisis cuantitativo tiene que ver con la respuesta del detector.
Esta tiene que ser lineal dentro del rango de concentraciones. Este rango se determina
previamente para cada compuesto o componente de una mezcla con el detector que se
vaya a usar en el análisis, utilizando patrones puros. Si al analizar la muestra ésta se
encuentra por encima del rango lineal de respuesta, es preciso diluirla hasta que una
nueva inyección caiga dentro del rango. Como ya se señaló al tratar los detectores, es
conveniente determinar el rango lineal midiendo las áreas de los picos.
• Las condiciones de operación han de ser constantes. Esto quiere decir que durante la
realización del análisis debe permanecer invariable la velocidad de flujo, la naturaleza de
la fase móvil y el sistema de elución empleado, el tipo de columna y los parámetros
operacionales del detector.
• La repetibilidad en la inyección de la muestra ha de ser buena. La introducción de la
muestra ha de ser rápida, siempre igual y tener muy presente inyectar los mismos
volúmenes de muestra y patrón. La razón es sencilla. El ancho del pico cromatografiado
depende de la duración de la inyección, de la temperatura y de la cantidad de muestra

inyectada. Es también imprescindible usar el mismo solvente para diluir la muestra y los
patrones.
En esencia, la cuantificación por HPLC se basa en la correspondencia lineal que hay entre la
concentración o la cantidad de soluto presente en la muestra inyectada (y que pasa por el
detector en un momento dado) y el área o la altura del pico correspondiente.
Así, la cuantificación de un pico cromatográfico puede realizarse según los criterios
siguientes:
• Usando la señal máxima (altura máxima de pico) como una medida de la cantidad o
concentración.
• Utilizando la señal integrada del detector (área del pico) como una medida de la cantidad
o concentración.
En realidad siempre que se pueda, la señal a elegir debe ser el área del pico por cuanto su
proporcionalidad con la concentración no se ve afectada por el fenómeno de ensanchamiento
de pico, lo que si ocurre con la altura. Sin embargo cuando los picos son estrechos, la
evaluación es más exacta y sencilla si se miden solamente sus alturas. El error que se
introduce al medir la anchura (en la base o en la semialtura) de un pico estrecho es siempre
considerable.
En la actualidad el procesamiento de la información cromatográfica se realiza mediante
computadoras y softwares cromatográficos especializados, los cuales captan y almacenan la
información que brinda constantemente el detector.
Esta información comprende las áreas, alturas y tiempos de retención de todos los picos de
un cromatograma correspondiente a una muestra dada, el cromatograma completo y otros
datos de interés. Esos softwares permiten además realizar operaciones tales como:
comparación de cromatogramas (muy útil para el trabajo cualitativo) y determinaciones de
concentraciones. El analista puede en cualquier momento y con una rapidez extraordinaria,
disponer de esa información tabulada y/o graficada.
Los métodos de cuantificación de muestras dependen fundamentalmente del objetivo que se
persiga y del tipo y característica de la muestra particular. A continuación se describirán los
procedimientos de mayor empleo.
9 .6 .2 .1 . M é t odo de la cu r va de ca libr a ción
Es posiblemente el método de cuantificación más empleado en HPLC. Consiste en preparar
varias soluciones de un patrón de referencia del analito (PR) a concentraciones crecientes y
exactamente conocidas e inyectarlas individualmente bajo las mismas condiciones
cromatográficas que se emplearon para obtener el cromatograma de la muestra.
Los cromatogramas obtenidos de los PR contendrán un solo pico de igual tiempo de
retención (pues se trata del mismo componente bajo las mismas condiciones
cromatográficas) pero los valores de área irán aumentando en la medida que aumente su
concentración.
En la figura 9.19 Se muestra un esquema simplificado de este procedimiento, así como los
cromatogramas obtenidos.
Figu r a 9 .1 9 . Esqu e m a de l pr oce dim ie n t o de cu r va de ca libr a ción

El equipo integra las áreas obtenidas en cada cromatograma y con estos resultados se
obtiene una data de área (o altura) de los picos de los PR vs. concentración (o masa) de los
PR. Esta data se procesa por regresión lineal y se obtiene una ecuación del tipo:
y= m x + a
donde:
m es la pendiente
a es el intercepto
x es la concentración (o la masa) del analito en la muestra inyectada
y es el área (o la altura) del pico del analito en el cromatograma de la muestra
Se obtiene además el valor del coeficiente de determinación (R2), que debe ser muy cercano
a 1 (≅ 0.99) y es una medida de la linealidad y por lo tanto de la proporcionalidad entre el
área (o la altura) y la concentración (o la masa), brindando información sobre la calidad del
trabajo realizado.
Veamos un ejemplo:
rango de 2.0 µg/µl a 10,0 µg/µl. Se preparan entonces soluciones conteniendo patrón de
Se requiere cuantificar con exactitud el contenido de Riboflavina en un extracto vegetal en el
referencia (PR) de Riboflavina en las concentraciones 2,0 µg/µl; 4,0 µg/µl; 6,0 µg/µl 8.0
µg/µl y 10,0 µg/µl. Se inyectan volúmenes iguales de estas soluciones obteniéndose los
resultados que se muestran en la tabla 9.6.
Tabla 9.6.
Valores num éricos del gráfico de calibración
Ribofla vina ( µg/ µl)

Con ce n t r a ción de PR de Ár e a de PR de
Ribofla vina ( m m 2 )
2.0 187
4.0 399
6.0 601
8.0 814
10.0 995
Los resultados obtenidos se procesaron por regresión lineal obteniéndose la siguiente

ecuación:
y = 1 0 1 .5 5 x - 1 0 .1
R 2 = 0 .9 9 9 3
Para el análisis de la muestra se inyecta el mismo volumen utilizado en las determinaciones
del gráfico de calibración, obteniéndose un área de 862 m m 2 para el pico correspondiente a
obtiene una concentración de 8.59 µ/µl para la Riboflavina en la muestra, según:

la Riboflavina en la muestra. Este valor se lleva a la ecuación de regresión y despejando se
862 + 10.1
x= = 8.59 µg / µl
101.55
9 .6 .2 .2 . M é t odo de l pa t r ón e x t e r n o
Es un método muy usado, especialmente en determinaciones rutinarias donde no se
requiera mucha exactitud. No requiere del uso de una curva de calibración pero hay que
disponer de todos los patrones analíticos de los constituyentes presentes en la muestra. Con
esta premisa, se inyecta el patrón de referencia del analito (PR) a una concentración
exactamente conocida y con los datos de las áreas (o alturas) de los picos correspondiente
al patrón de referencia y al componente objeto de cuantificación se plantea la siguiente regla
matemática:
Área del patrón de referencia (APR) → m (PR)

Área del pico de interés en la muestra (AM) → m (M)
entonces:
m (M ) =
AM . m ( PR )
APR
El método se ilustra con el ejemplo siguiente.
Se extrae 50 g de muestra vegetal para determinar el plaguicida methyl parathion. Después
éste 2 µl en el cromatógrafo, equipado con un detector adecuado, originándose un pico

de terminado el procesamiento de la muestra, se diluye el extracto a 3.0 ml y se inyecta de
estrecho de 6 cm de altura. Posteriormente se inyecta 2 microlitros ( µl ) de un patrón de
methyl parathion de 2 ng/ µl que originan un pico de 8 cm. Se desea saber los ng/kg de
methyl Parathión en la muestra.
Primeramente calculamos número de ng de patrón inyectado según :
2µl ⋅ = 4ng
2ng
µl
Se establece entonces la relación matemática:
Altura del pico del patrón de referencia = 8 cm → 4 ng de PR

Altura del pico de interés en la muestra = 6 cm → m (M)
m (M ) = = 3 ng
6 cm . 4 ng )
8 cm
µl del extracto final. Por tanto su concentración es 3/2
ng/ µl = 1.5 ng/ µl .
Esos 3 ng fueron tomados en 2
Si se multiplica la concentración hallada del extracto por su volumen, habremos determinado

la cantidad de methyl Parathión en los 3 ml del extracto, esto es:
1.5 ng . 3000 µl = 4500 ng = 4.5 µg
Finalmente la concentración se puede expresar en ppm según:
4,5 µg
µg / g = mg / kg = ppm = = 0,09 ppm .
50 g
El cálculo en base a áreas se realiza de modo análogo.
Finalmente es importante señalar que para la aplicación de este procedimiento se debe tener
la garantía de que la concentración del patrón de referencia inyectado se encuentre dentro
de un rango de linealidad con los valores de área o altura de los picos cromatogradiados.
9 .6 .2 .3 . M é t odo de l pa t r ón in t e r n o
Es un método muy exacto, de obligatorio uso cuando los resultados analíticos requieran de
una gran confiabilidad. Este método posee la ventaja de compensar las pérdidas de analito
que pueden producirse durante la inyección de la muestra o durante el proceso de
separación antes de llegar al detector.
Supongamos que necesitamos cuantificar un analito M presente en una mezcla. Se dispone
del patrón de referencia (PR) correspondiente a M (si no se tiene el patrón correspondiente a
un componente de la mezcla éste no se puede determinar) y además se posee otro patrón,
que llamaremos patrón interno (PI) de propiedades físico-químicas semejantes a la de la
muestra M, pero que tenga un tiempo de retención diferente, aunque próximo a ésta, y que
por supuesto no esté presente en la muestra.
De acuerdo al rango de respuesta lineal del detector, tanto para M como para PI (que debe
conocerse previamente) se preparan soluciones en las cuales están presentes PR y PI. El
patrón de referencia (PR) en concentraciones crecientes y exactamente conocidad, mientras
que el patrón interno (PI) tiene que tener la misma concentración en todas las soluciones
(idéntica además a la adicionada a la muestra). Para 4 puntos de la curva, las
concentraciones (en las unidades propias del problema particular) pudieran ser por ejemplo:
Pu n t o PR PI
1 2,0 2,0
2 4,0 2,0
3 6,0 2,0
4 8,0 2,0
Estas soluciones se preparan a partir de los patrones puros de PR y PI, enrasándose al

mismo volumen. Se inyectan entonces, individualmente y por separado, volúmenes iguales
de las soluciones, bajo las mismas condiciones cromatográficas que se emplearon para
obtener el cromatograma de la muestra.
Los cromatogramas obtenidos de los PR+PI contendrán 2 picos de diferentes tiempos de
retención (pues se trata de dos compuestos). Los valores de área de los picos
correspondientes al patrón de referencia (PR) irán aumentando en la medida que aumente
su concentración, mientras que el área de los picos correspondientes al patrón interno (PR)
se mantendrá constante puesto que su concentración en todas las soluciones inyectadas es
la misma.
La figura 9.20 ilustra este proceso para el caso del ejemplo considerado.
Figu r a 9 .2 0 . Esqu e m a de l pr oce dim ie n t o de cu r va de a dición de pa t r ón
El equipo integra las áreas obtenidas en cada cromatograma y con estos resultados se
calcula para cada punto, el cociente de las áreas PR/PI. Así, se obtiene ahora una data de
concentraciones de los patrones de referencia (PR) vs. las relaciones de áreas (APR/API)
obtenidas experimentalmente. Esta data se procesa por regresión lineal y se obtiene una
ecuación del tipo:
y= m x + a
donde:
m es la pendiente
a es el intercepto
x es la concentración (o la masa) del analito en la muestra inyectada
y es la relación de área (APICO DE INTERËS /API) en el cromatograma de la muestra
Cuando se va a analizar la muestra se añade a ésta la misma cantidad de patrón interno (PI)
que fue usada para obtener los distintos puntos del gráfico de calibración y se enrasa al
mismo volumen. Se inyecta de la muestra el mismo volumen que se usó para obtener los
cromatógramas de calibración obteniéndose un cromatograma en que aparece un pico
adicional, correspondiente al patrón interno (PI). La figura 9.21 ilustra este proceso.
Figu r a 9 .2 1 .
Cr om a t ogr a m a s de u n a m e zcla de vit a m in a s. A la iz qu ie r da , e l cr om a t ogr a m a de la m u e st r a
sin a dición de pa t r ón in t e r n o ( PI ) ; a la de r e ch a , e l cr om a t ogr a m a con a dición de PI a la
m u e st r a . N ót e se la a pa r ición de u n n u e vo pico e n t r e los picos 5 y 6 .
Una vez obtenido el cromatógrama de la muestra que contiene PI, se integran los picos de
los componentes de interés y del PI de la misma forma usada en el caso del gráfico se
calcula el cociente (Área del pico de interés en muestra/Área de PI). Este valor se sustituye
en la variable “ y” de la ecuación de regresión y despejando “ x” se obtiene el valor de la
concentración de la muestra, en la misma unidad de concentración con la que se prepararon
las soluciones de calibración.
y = mx + a
−a
A
y −a
PICO DEL ANALITO
x= o sea c ( analito ) =
A PI
m m
Si la muestra tiene varios picos que se desea cuantificar, habrá que establecer para cada
uno de ellos un gráfico de calibración del modo descrito.
Resulta práctico en algunos casos, especialmente en muestras de varios componentes,
calcular un factor f (conocido como factor de respuesta del detector) para cada uno de
ellos. Estos factores sirven para determinar la cantidad de cada componente en la muestra.
El proceso es el siguiente. Supongamos que la muestra tiene n componentes bien resueltos.
Se prepara entonces una solución con masas exactamente conocidas de un patrón de
referencia (PR) de cada uno de los componentes de la muestra PR1, PR2… PRn y se añade
entonces un masa conocida de patrón interno (PR). Se cromatografía la mezcla y luego de
evaluadas las áreas de todos los picos se obtiene n factores:
f1 = ⋅ , f2 = PR 2 ⋅ PI .....fn = ⋅
mPR 1 API m A mPR n API
APR 1 mPI APR 2 mPI APRn mPI
donde: m PI y A PI es la masa del patrón interno y su área correspondiente; m PR1 , m PR2 , …
m PRn y A PR1 , A PR2 , … A PRn son las masas y áreas respectivas de los patrones de referencia
de cada componente.
Si se quiere determinar la cantidad de cada componente en una muestra cuya masa es Pm ,
se añade a ésta el mismo patrón interno utilizado para el cálculo de los factores de
respuesta, en una cantidad igual a la mitad de la masa de la muestra. Se cromatografía esta
mezcla y se integran las áreas de los picos correspondientes a los componentes de la
muestra (A M ) y al patrón interno (A PI ). La cantidad de cada componente se calcula según:
Para el pico 1
Área del PI (A PI ) → m de PR (m PI )
Área del pico 1 en la muestra (A M 1 ) → m del componente 1 (m M1 )
así quedaría:
mM 1 =
AM 1 . mPI
y se multiplica por el factor calculado para el componente correspondiente
API
al pico 1, según mM 1 =
AM 1 . mPI
. f1
API
Este mismo procedimiento se emplea para determinar la masa de cada uno de los
componentes de la mezcla usando en cada caso el factor de respuesta calculado para cada
componente.
El método del patrón interno, tal como se ha descrito, presenta muchas ventajas. Las
principales son:
• Solo se necesita un análisis de la muestra, obteniéndose con él una gran exactitud.
• Debido a que la determinación es relativa, no es necesario reproducir exactamente las
condiciones analíticas. Esto no quiere decir por ejemplo, que al obtener el gráfico de
calibración se pueda trabajar a una temperatura e inyectar un volumen, diferentes

ambos a los usados al analizar la muestra. Hay que tener presente que, aunque la
muestra y el patrón interno tienen que ser semejantes estructuralmente, esto no implica
que se comporten igual desde el punto de vista cromatográfico. De ahí que no respondan
igual ante variaciones operacionales (temperatura, flujo) ni tampoco ante diferencias
grandes en los volúmenes de inyección. Lo que si es cierto es que con este método se
elimina el error de inyección, dependiendo la exactitud de la determinación del cuidado y
exactitud con que se haya preparado el gráfico de calibración y la solución de la
muestra, así como que pequeñas fluctuaciones en los parámetros de operación carecen
de efecto medible sobre los resultados.
El método es tanto más exacto cuanto más se ajuste el compuesto elegido como patrón
interno a los siguientes requisitos:
• Debe estar relacionado estructuralmente con la muestra que se vaya a determinar.
• El pico del patrón interno debe encontrarse próximo al del compuesto que se vaya a
analizar. Si la muestra tiene más de un compuesto, el Pi debe eluir aproximadamente
hacia la mitad del cromatógrama.
• La concentración del PI debe ser semejante a la de la muestra. En caso de una mezcla,
este requisito no es fácil de satisfacer, pero al menos muestra y patrón han de poder
determinarse con la misma atenuación del electrómetro.
• El PI no debe interactuar químicamente con los componentes de la muestra.
Veamos a continuación un ejemplo numérico:
Se requiere cuantificar con exactitud un compuesto M en el rango de 2,5 µ/µl a 10,0 µ/µl.
Se conoce para este compuesto un patrón que llena los requerimientos de un patrón interno
concentraciones 2,5 µ/µl; 5,0 µ/µl; 7,5 µ/µl y 10,0 µ/µl, mientras que en todas ellas PI tiene
(PI). Se prepara entonces soluciones conteniendo patrón de referencia de M (PRM) en las
una concentración de 5,0 µ/µl. Se inyecta volúmenes iguales de estas soluciones

obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla 9.7.
Tabla 9.7.
Valores num éricos del gráfico de adición de pat rón
Ár e a ( m m 2 )
µg/ µl µg/ µl
Con c. de PR M Con c. de PI Re la ción
PR M PI Ár e a PR M / Ár e a PI
2,5 5,0 340 590 0,576

5,0 5,0 653 565 1,156
7,5 5,0 958 552 1,735
10,0 5,0 1251 543 2,304
Los resultados obtenidos de µ/µl de PRM vs. Área PRM/Área PI se procesaron por regresión
lineal obteniéndose la siguiente ecuación:
y = 0 .2 3 0 5 + 0 .0 0 2
R2 = 1
concentración de éste sea exactamente de 5,0 µg/µl. Se inyecta el mismo volumen utilizado
Para el análisis de la muestra se añade PI y cantidad suficiente de solvente de modo que la
en las determinaciones del gráfico de calibración, obteniéndose un área de PRM igual a 538
m m 2 mientras que esta vez el patrón arrojó un valor de 572 m m 2 .
= 0.94 se lleva a la ecuación de regresión, obteniéndose una concentración

538
La relación
572
de 4.06 µg/µl para la muestra. Se recomienda que el lector analice con detenimiento las
relaciones concentración de muestra-área; concentración PI –área y finalmente la relación
área PRM – área PI.
9 .6 .2 .4 . M é t odo de nor m a liza ción in t e r na
Este procedimiento, también denominado método del área total, se aplica exclusivamente
cuando cada uno de los componentes de una muestra compleja está representado por un
pico en el cromatograma. Esto quiere decir que si la muestra consta de n componentes, su
cromatograma deberá tener n picos resueltos. El porcentaje de cada componente en la
mezcla se determina mediante la expresión:
% componente y = ⋅ 100
Ay
∑ Ay
y =n
y =1
∑A
y =n
En donde Ay es el área de cualquiera de los n picos y y es la suma de las áreas de
y =1
todos los picos. Si el detector usado respondiera igual ante todos los componentes de la
muestra, el resultado del análisis de la mezcla sería satisfactorio. Pero en la práctica los
detectores no responden igual ante compuestos diferentes. Para eliminar ésta dificultad se
ha introducido factores de corrección, los cuales se calculan para cada componente según la
expresión:
fy =
Py
A' y
Py es la masa del constituyente y de la mezcla y A’y el área del pico de éste.
Si se usa los factores de corrección, la expresión para el cálculo sería:

f ⋅ Ay
% componente y = ⋅ 100
∑f
y
y =n
y ⋅ Ay
y =1
El método descrito es muy usado cuando se requiere determinar la composición relativa de

una mezcla.
Ejemplo. Se desea conocer la composición de una mezcla que tiene cuatro constituyentes. Al
analizar por HPLC están presentes en el cromatógrama cuatro picos de áreas: a= 225m m 2 ;
b= 375 m m 2 ; c= 250 m m 2 ; d= 150 m m 2 .
∑
La composición de la mezcla es la siguiente:
Áreas a + b + c + d = 225 + 375 + 250 + 150 = 1000 mm 2
a:
225
= 0.225 (22,5%)
1000
b:
375
= 0,375 (37,5%)
1000
c:
250
= 0,25 (25,0%)
1000
d:
150
= 0,15 (15,0%)
1000
Esta sería la composición de la mezcla en caso de que el detector responda igual ante los
que cada componente tiene un valor de λmax diferente), habría que preparar una muestra
cuatro componentes. Si el detector no fuera ideal (por ejemplo un espectrómetro UV, en el
sintética con cantidades conocidas de cada uno de los componentes y luego de analizadas
por cromatografía gaseosa, se determinarían con ella los factores f y con lo que se aplicaría
entonces la expresión correspondiente.
9 .6 .3 . Lím it e de de t e cción y lím it e de cu a n t ifica ción
El lím it e de de t e cción ( LD ) , es la concentración más pequeña, que puede ser detectada
por el método analítico con un grado aceptable de confiabilidad.
El LD está relacionado con la señal del compuesto y con el ruido en el momento, y con las
condiciones cromatográficas con que se trabaja y por lo general es definido como el pico
cuya relación señal/ruido es al menos de 3:1.
La forma más adecuada de disminuir el LD es mediante la reducción del ruido. En ocasiones
el ruido depende de factores intrínsecos del detector y del sistema electrónico asociado. Este
por lo general es un parámetro propio del equipo y depende de su calidad, asumiendo que
no es debido a desperfectos.
Pero los factores que más inciden en la presencia del ruido en el cromatograma son las
sangramiento de la fase estacionaria. Un análisis de trazas a niveles del orden de los µ/kg o
impurezas de los solventes, la contribución de la matriz de la muestra y en ocasiones el
inferior requiere de cuidados extremos: un local protegido de contaminación, incluso

proveniente del aire (ambiente); cristalería limpia y un control rutinario de la contribución al
ruido de los factores mencionados. Excepto la contribución de la matriz de la muestra, los
demás pueden ser objeto de reducción y mantenimiento al mínimo práctico.
El lím it e de cu a n t ifica ción ( LC) es por su parte la concentración menor que puede
cuantificarse de forma confiable con un nivel aceptable de exactitud y precisión.
El LC está igualmente relacionado con el ruido, de tal modo que se plantea que para poder
cuantificar un pico de modo confiable, se requiere que la relación señal/ruido sea al menos
10. Para valores de concentración pequeños es importante conocer el LC y este carece de
significación si la concentración de la muestra es grande.
En la figura 9.22 Se esquematizan los criterios para la determinación del ñímite de detección
y cuantificación en función del ruido.
Figu r a 9 .2 2 . Cr it e r ios pa r a la de t e r m in a ción de l LD ( a ) y e l LC
9 .7 . H PLC pr e pa r a t iva
El objetivo de este tipo de cromatografía líquida es el de obtener cantidades pequeñas de
compuestos puros (ng – m g), utilizando el equipamiento analítico convencional, aunque no
se excluye la posibilidad de uso de bombas, inyectores y columnas especiales.
Si es posible establecer unas condiciones cromatográficas tales que el compuesto de interés
esta bien separado de otros compuestos y/o impurezas, entonces puede aplicarse una
sobrecarga a la columna y obtener así cantidades mayores del producto deseado.
Cuando la inyección de la muestra contiene 25 µg o menos (para una columna de 4,6 m m de
diámetro interno), el ancho de la banda y el tiempo de retención no dependen del tamaño
de la muestra. Si la inyección es mayor que el valor indicado, el pico se ancha, se
distorsiona. El tamaño puede aumentarse gradualmente hasta que la banda de interés se
aproxime (sin solaparse) con la banda del compuesto que la precede.
Por lo general es preciso disponer de las condiciones cromatográficas analíticas antes de
intentar una separación preparativa. Además, se necesita conocer aspectos de la HPLC
preparativa que ayudan a elegir adecuadamente el procedimiento a seguir. En los párrafos
siguientes se expondrá estos aspectos, sin que el orden indique la importancia. Todos son
sin duda importantes.
9 .7 .1 . La fa se m óvil
Para obtener un producto puro es necesario eliminar la fase móvil de la fracción colectada
donde se encuentra el compuesto de interés. Por ello es preferible siempre trabajar con la
modalidad HPLC – fase normal, pues es mucho más fácil evaporar los solventes orgánicos
que le son típicos, comparado con las fases móviles acuosas usadas en la cromatografía de
fase reversa.
Además, si el objetivo es trabajar a una escala mayor, es importante también tener en
cuenta que el gel de sílice no modificado es la fase estacionaria menos costosa, comparado
incluso con los derivados ciano, diol y amino. Si se exceptúa la solubilidad ligera en las fases
móviles básicas, el gel de sílice no tiene otro inconveniente.
De ser posible hay que evitar el uso de aditivos a la fase móvil que puedan hacer difícil el
aislamiento puro del compuesto de interés (como tampones, sales de los buffer). Si esto no
fuera posible debe usarse aquellos aditivos que tengan mayor volatilidad (ácido acético,
ácido fórmico, carbonato de amonio), los cuales son más fáciles de eliminar.
9 .7 .2 . Solubilida d de la m u e st r a e n la fa se m óvil
Hay que tener en cuenta también la solubilidad de la muestra en la fase móvil. En HPLC
analítica esto no es importante y se recordará que se recomienda en algunos casos inyectar
la muestra en un solvente poco miscible en la fase móvil. Pero en HPLC preparativa se
requiere una masa grande de muestra en el volumen menor posible de fase móvil. Esta es
otra razón para elegir HPLC- fase normal, pues las fases móviles en cromatografía reversa
no disuelven adecuadamente la mayoría de los compuestos orgánicos.
9 .7 .3 . I m por t a n cia r e la t iva de l n ú m e r o de pla t os t e ór icos y e l fa ct or de se le ct ivida d
En HPLC preparativa el número de platos teóricos (n) y la selectividad (α) tienen una
importancia relativa. Así cuando el tamaño de muestra que se inyecta es cada vez mayor, el
número de platos teóricos se convierte cada vez más en una función de este y es más
independiente de la longitud de la columna, del flujo de fase móvil y del tamaño de
grandes y con flujos elevados. Si con estas condiciones α es también grande para el
partículas del relleno. Eso permite trabajar HPLC preparativa con partículas de relleno
compuesto de interés y su impureza más próxima, entonces se puede inyectar muestras

mayores.
9 .7 .4 . La m a sa de la m u e st r a a in ye ct a r
En la práctica, la masa máxima de la muestra para la obtención de fracciones puras en
condiciones limites de resolución (próximas a la superposición de las bandas contiguas), se
logra experimentalmente. Más adelante se verá que también puede hacerse un estimado
teórico. Este tamaño máximo va a depender mucho de la naturaleza de la muestra y de las
condiciones cromatográficas.
Así, si se logra aumentar α eligiendo adecuadamente los parámetros cromatográficos,
entonces la masa máxima de muestra a inyectar puede ser grande. Acorde a la teoría, si α
de muestra debe ser ≤ 30µm. Pero si se logra modificar las condiciones de modo que se
para una columna analítica de 250 m m x 4.6 m m es por ejemplo 1,05, la cantidad máxima
obtenga un valor de α= 3, entonces la cantidad de muestra máxima es 6 m g (2000 veces

mayor) para la misma columna.
Un incremento de α por selección adecuada de las condiciones en HPLC, además de
permitir un tamaño mayor de muestra como se indicó, hace posible trabajar con n pequeño
(esto significa entre otras cosas, partículas de relleno de diámetros mayores y
consecuentemente flujos de fase móvil más altos). Se reduce así el tiempo para cada
corrida, o lo que es igual, se aumenta la productividad.
Esta es otra de las razones, además de las expuestas con anterioridad, de seleccionar el gel
de α con cambios pequeños en las condiciones cromatográficas.

de sílice como relleno en la HPLC preparativa. Con el es posible lograr variaciones grandes
9 .7 .5 . Re ndim ie n t o
Como el objetivo de la HPLC preparativa es obtener producto puro, se define la velocidad de
producción Pi como la cantidad Qi separada en el tiempo t ri . Esto es:
Pi =
Qi
t ri
A su vez Pi puede expresarse en función de parámetros cromatográficos y las dimensiones

de la columna:
⎛1 h ⎞
Pi = A ⋅ B ⋅ u ⋅ C ⋅ D ⎜ − o ⎟
1
2
⎝N L ⎠
donde:
A = sección transversal de la columna
B = porosidad del relleno
u = velocidad lineal de la fase móvil
C= concentración de la muestra
D = relación entre el volumen inyectado Vi y σ0, a su vez σ0 mide la dispersión del volumen
de muestra inyectado a la entrada de la columna. En la práctica se trata de lograr que σ0
sea lo más pequeño posible
N = número de platos teóricos
h 0 = valor que toma h (altura del plato teórico) cuando Vi tiende a cero
L = longitud de la columna
Esta expresión, además del resultado cuantitativo, permite hacer un análisis cualitativo del
efecto de cada uno de los factores que influyen sobre la velocidad de producción.
9 .7 .6 . Alca n ce y r e que r im ie n t os m a t e r ia le s de la H PLC pr e pa r a t iva
La HPLC preparativa puede ser de tres tipos acorde al objetivo que se persiga y los
requerimientos materiales necesarios para llevarla a cabo.
A escala de laboratorio puede ser de dos tipos: HPLC preparativa con fines analíticos y/o con
fines de obtener compuestos puros a pequeña escala para investigación o uso en el
laboratorio. Cuando el objetivo es separar cantidades grandes se tiene la HPLC a escala
productiva o comercial.
• La HPLC preparativa con fines analíticos se utiliza para separar componentes de una
mezcla para ser usados en su identificación por vías no cromatográficas. En la
actualidad, y con la introducción de las técnicas acopladas esta modalidad continúa
usándose debido al costo elevado de esos equipos. Para lograr una separación con la
diámetro de las partículas de relleno usable debe estar entre 3 µm y 10 µm. Por lo
finalidad indicada no se requiere equipo adicional (solo el analítico convencional). El
general se trabaja con presiones inferiores a 300 bar, mientras que los flujos no
exceden de 10 m l/ m in. Las bombas analíticas en uso hoy alcanzan esa entrega. Las
columnas pueden tener hasta 10 m m de diámetro interno y de 250 m m a 500 m m de
longitud.
• La HPLC preparativa a escala de laboratorio persigue obtener cantidades del orden de
los gramos de compuestos puros para realizar ensayos toxicológicos, determinación
El diámetro de las partículas (casi siempre de gel de sílice) se encuentra entre 5 µm y

de estructura o simplemente para obtener patrones con un grado elevado de pureza.
10 µm. Se trabaja con flujos desde 1 m l/ m in hasta 100 m l/ m in. Esto requiere
bombas especiales, aunque la presión no excede los 100 bar. Las columnas usadas
son de vidrio, con diámetros en el rango de 2,5 cm a 7,5 cm , y longitudes de 50 cm
como máximo. Son columnas especiales para la finalidad indicada.
• A escala productiva, la HPLC preparativa usa columnas de vidrio y/o acero inoxidable,
con diámetros internos desde 2,5 cm hasta 100 cm y longitudes entre 50 cm y 250
cm . Los rellenos usados casi exclusivamente son el gel de sílice, la alúmina y la
celulosa. El tamaño de partículas es del orden de los 100 micrómetros. Las presiones
de trabajo son en consecuencia, bajas. Por razones económicas y en dependencia de
la separación que se lleva a cabo, con frecuencia se desecha el relleno después de
usado, debido al costo elevado de los volúmenes de solventes requeridos para la
regeneración de las columnas.
Bibliogr a fía .
1. Aparicio, R., Aparicio-Ruíz, R. (2000). Authentication of vegetable oils by
chromatographic techniques. J. Chromatogr. A 881, 93-104.
2. Barceló D., G. Durand, R. J. Vreeken (1991). Evaluation of eluants in thermospray liquid
chromatography – mass spectrometry for identification and determination of pesticides
in environmental samples. J. Chromatog. 553, 311-328.
3. Catalogo. Knaver. Productos para Cromatografía Líquida (HPLC) (1999)
4. Cert, A., Moreda, W., Pérez, C. (2000). Chromatographic analysis of minor constituents
in vegetable oils. J. Chromatogr. A 881, 131-148.
5. Chiron S., S. Dupas, P. Scribe and D. Barceló (1994). Application of on – line solid –
phase extraction followed by liquid chromatography – thermospray mass spectrometry
to the determination of pesticides in environmental waters. J. Chromatog. A 665, 295-
305.
6. Cole L. A. and J. G. Dorsey (1990). Anal. Chem. 62, 16.
7. Dierksmeier, G. (2005). Métodos cromatográficos. Editorial Científico Técnica. Impreso
por Impresol Ediciones Ltda. Bogotá, Colombia.
8. Flaherty B. O. (1993). “A practical guide to HPLC detection “.p 111. C. Parito ed.
Academia Press. San Diego. CA.
9. Haddad P. R. and P. E. Jackson (1990). Ion Chromatography. Elsevier Ámsterdam.
10. Hennion, M.C. (1999). Solid-phase extraction: method development, sorbents, and
coupling with liquid chromatography. J. Chromatogr. A 856, 3-54.
11. Huang, J-F, Zhang, H-J and Feng, Y-Q. (2006). Chloramphenicol Extraction from Honey,
Milk, and Eggs Using Polymer Monolith Microextraction Followed by Liquid
Chromatography-Mass Spectrometry Determination. J. Agric. Food Chem. 54, 9279-
9286.
12. Kirkland J. J., C. H. Dilks and J. J. De Stefano (1993). J. Chromatography A 635, 19.
13. Kirkland K. M., D. A. Mc Combs and J. J. Kirkland (1994). J. Chromatography A. 660
pag 327.
14. Konikrom® V. 1.4. Referente Guide and User’s Guide. Review (2002). Barcelona Spain.
15. Lercker, G., Rodriguez-Estrada, M.T. (2000). Chromatographic analysis of

unsaponifiable compounds of olive oils and fat-containing foods. J. Chromatogr. A 881,
105-129.
16. Lewis J. A. D. C. Lommen, W. D. Raddatz, J. J. Dolan and R. L. Zinder (1992). J.
chromatog. 592, 183.
17. Li G., E. Szule, D. H. Fisher and I. S. Krull (1997). “Electrochemical detection in liquid
chromatography and capillary electrophoresis”. P. T. Kissinger editor. Chromatog
Science Series Marcel Dekker New York.
18. Liu H. and F. F. Cantwell (1991). Ion Pair High Perfomance Liquid Chromatography.
Anal. Chem. 63, 993.
19. Lubke M., J. L. le Quere and D. Barron (1995). “Normal Phase Liquid Chromatography
Principles”. J. Chromatog. A 690, 41.
20. MALDI-TOFMS System. Technical Literatura. HP G2025A; Hewlett Packard, Burlington
MA and San Jose, Ca.
21. Mc Donald P. D. and B. Bidlingmeyer. Chromatography ed. Elsevier Amsterdam p1
(1995)
22. Niessen M. A. and J. Van der Greef (1992). Liquid chromatography- mass spectrometry.
Chromatographic Science. Series 58. Marcel Dekker. New York.
23. Panagiotopoulou. P. M. and Tsimidou M. (2002). Solid Phase Extraction: Applications to
the Chromatographic Analysis of Vegetable Oils and Fats. Grasas y Aceites. Vol. 53.
Fasc. 1, 84-95.
24. Parriot C. (1993). “A practical guide to HPLC detection”. Page 2 256. C. Parriot editor.
Academic Press. San Diego. CA.
25. Parriot C. (1993). “On column Light scattering detection in a practical guide to HPLC
detection. C. Parriot. ed. Academic Press. San Diego.
26. Parriot C. (1993). UV detection in a practical guide to HPLC detection. Page 67. C.
Parriot editor. Academic Press. San Diego. CA.
27. Ruiz-Gutiérrez, V., Pérez-Camino, M. C. (2000). Update on solid phase extraction for
the analysis of lipid classes and related compounds. J. Chromatogr. A 885, 321-341.
28. Shoenmakers P. J. and R. Tijssen (1993). J. Chromatograpgy A 656, 577.
29. Snyder L. R. (1992). Chromatography 5th Edition. Elsevier. Ámsterdam.
30. Snyder L.R, J. J Kirkland and J.L Glajch (1997) “Practical HPLC Method Development” ,
Second Edition, John Wiley and Son INC – New York., Chichester, Weinheim, Brisbane,
Singapore, Toronto.
31. Volmer D. (1994). Thermospray HPLC-MS analyse von pestiziden in wässrigen
Unweltproben GIT Fachzeitschrift für das Laboratorium 38 Jahrg Janvar 1/94. 16-24.
32. Volmer D. A. Preiss, K. Levsen und G. Wünsch (1993). Thermospray mass spectral
studies of pesticides. Temperature and salt concentration effects on the ion abundance
in thermospray mass spectra. J. Chromatog. 647, 235 – 259.
33. Znyder L. R, J. J. Kirkland and J. L. Glajch (1997) “Practical HPLC Method Development”
John. Whiley and Sons. NY. Chichester, Weinheim. Brisbane, Singapore, Toronto.
10 Cromatografía de gases
1 0 .1 . Ge n e r a lida de s
Las prim eras separaciones por crom at ografía de gases fueron realizadas por Hesse y
colaboradores en 1941, los cuales hicieron pasar una m ezcla de com puest os orgánicos
volat ilizados a t ravés de una colum na em pacada con gel de sílice. Surgía así la
crom at ografía gas- sólido, que fuera m ás t arde desarrollada por Crem er en 1951 y t uvo su
im pulso decisivo un año m ás t arde cuando Mart in y Jam es lograron separaciones en fase
gaseosa ut ilizando el m ecanism o de repart o; surgía asñi la crom at ografía gas- líquido,
am pliando ext raordinariam ent e el cam po de aplicación de la crom at ografía de gases.
El im pact o de est a t écnica crom at ográfica fue t an grande que ya en 1954 aparecieron los
prim eros crom at ógrafos de gases en el m ercado y en 1980 se est im aban en m ás de 200 000
el núm ero de equipos en el m undo y en m ás de 30 000 las publicaciones del t em a. En la
act ualidad la crom at ografía de gases es la m ej or opción para la separación de com puest os
volát iles o volat ilizables.
La crom at ografía gaseosa es un m ét odo de separación físico aplicable a com puest os que
puedan volat ilizarse direct am ent e o m ediant e la form ación de un derivado adecuado. La
difusión am plia y aplicación del m ét odo se basa en que perm it e una ident ificación y
cuant ificación rápida, sim ple y sensible de un grupo num eroso de com puest os de int erés
cient ífico, económ ico o am bient al, a un cost o m oderado.
Todo t ipo de crom at ografía hace uso de dos fases, una de las cuales es est acionaria y la ot ra
m óvil. El solut o, llevado por la fase m óvil a t ravés de la fase est acionaria, int eract úa con
ést a y com o result ado de esa acción recíproca será ret ardado en su avance, result ando la
separación crom at ográfica, ya que en general solut os diferent es no avanzarán con la m ism a
velocidad. En el caso específico de la crom at ografía gaseosa, la fase m óvil es un gas y la
est acionaria puede ser un sólido o un líquido que recubre a un sólido “ inert e” de gran
superficie. La prim era posibilidad da origen a la crom at ografía gas – sólido y la segunda a la
crom at ografía gas – líquido. Por su im port ancia y grado de aplicación se dedicará los
siguient es epígrafes a la crom at ografía gas – líquido ( GLC, del inglés Gas Liquid
Chrom at ography) . Sin em bargo, gran part e de los concept os y principios que se expondrán
son aplicables a la crom at ografía gas – sólido.
1 0 .2 . D e scr ipción de l pr oce so cr om a t ogr á fico
De form a m uy sim plificada puede decirse que el proceso consist e en im pulsar, a una
velocidad de fluj o cont rolada, el gas port ador a t ravés de una t ubería capilar hast a una
cám ara de inyección a alt as t em perat uras donde se int roduce la m uest ra que se desea
analizar.
La m uest ra se int roduce en ést a cám ara por inyección a t ravés de una m em brana
perforable, valiéndose de una m icroj eringuilla. La t em perat ura de la cám ara y la capacidad
calorífica de est a perm it en un rápido paso a la fase de vapor, t ant o del solvent e usado en
disolver la m uest ra com o de los com ponent es sólidos de est a. Una vez en est ado de vapor,
la m uest ra es arrast rada por el gas port ador, int roduciéndola y llevándola a t ravés de la
colum na crom at ográfica, la cual se encuent ra sit uada en un horno aislado t érm icam ent e a
t em perat ura ent re 50º C y 350º C.
95
10. Crom at ogr afía de gases
En la colum na crom at ográfica ocurre la separación de los com ponent es de la m uest ra en

función de las diferencias en afinidad de los analit os por la fase est acionaria m ient ras son
arrast rados por el gas port ador.
A la salida de la colum na se encuent ra conect ado el det ect or, el cual es un disposit ivo capaz
de responder a las pequeñas variaciones en las propiedades físicas del gas port ador cuando
se encuent ra acom pañado por el analit o. En general cada det ect or est á diseñado para
responder ant e una variación específica del gas port ador, por ej em plo conduct ividad
t érm ica, ionización, absorción elect rónica, et c. Est as variaciones darán origen a ot ros t ant os
t ipos de det ect ores.
La señal producida por el det ect or de nat uraleza eléct rica o t ransform able en ella, es
am plificada m ediant e un accesorio adecuado llam ado elect róm et ro, que perm it e variar
dent ro de am plios m árgenes la señal que envía al regist rador donde se origina el
crom at ogram a correspondient e de señal cont ra t iem po de ret ención. De form a análoga a la
HPLC, la señal puede procesarse m ediant e un soft ware especializado con las vent aj as
inherent es que brindan las Tecnologías de la I nform ación y las Com unicaciones ( TI Cs) .
En la figura 10.1 se present a un esquem a correspondient e a un sist em a de crom at ografía de
gases com o el que se ha descrit o en los párrafos precedent es.
Figu r a 1 0 .1 . Esqu e m a de u n sist e m a de cr om a t ogr a fía de ga se s
1 0 .3 . El cr om a t ógr a fo de ga se s
1 0 .3 .1 . Los ga se s.
Los gases usados en la crom at ografía a la cual han dado su nom bre, est án cont enidos
norm alm ent e en recipient es o balones de acero con capacidad real de 20 lit ros - 50 lit ros. La
presión a la que pueden est ar som et idos los gases en los balones m encionados no debe
sobrepasar de 200 kg/ cm 2 . Cada balón requiere de un m anoreduct or cuya función es la de
ent regar una presión const ant e y que en la m ayoría de los casos no es superior a los 5
kg/ cm 2 . A t ravés de t ubos adecuados, los gases llegan a los punt os de ent rada del
crom at ógrafo, pasando por filt ros especiales ant es de llegar a las válvulas que regulan con
exact it ud la presión de est os. En t odos los crom at ógrafos hay dispuest os m anóm et ros, con
ayuda de los cuales es posible fij ar con exact it ud la presión de t rabaj o de los dist int os
gases. En algunos equipos hay rot ám et ros que perm it en leer direct am ent e el fluj o de gas
que est á ent rando al crom at ógrafo.

En la act ualidad, con excepción de los gases nobles, los dem ás pueden generarse en el
Laborat orio, usando equipos que dan una ent rega adecuada para el t rabaj o, t ant o de fluj o
com o de presión. Adem ás, la calidad es por lo general excelent e.
Los gases crom at ográficos son de dos t ipos fundam ent ales: port adores y auxiliares.
A. Ga se s por t a dor e s
Los gases port adores com únm ent e usados son los siguient es: Nit rógenos, Argón, Helio,
Hidrógeno y CO2 .
La elección del gas port ador que debe usarse en un t rabaj o det erm inado depende del t ipo
de det ect or que se vaya a usar. Así por lo general, para t rabaj ar con un det ect or de
conduct ividad t érm ica se requieren gases con valor alt o de est a caract eríst ica y la elección
recaerá sobre el H2 o He; para capt ura elect rónica se usan Nit rógeno o Argón im purificado y
con los det ect ores de ionización por llam a se puede ut ilizar cualquiera de los gases arriba
m encionados.
Just am ent e el problem a m ás difícil que se puede present ar t iene lugar cuando para un
det ect or dado sea posible usar m ás de un gas port ador. En est e caso la elección del gas
habrá que hacerla t om ando com o base requerim ient os t écnico- económ icos.
Si bien es ciert o que hay una pérdida de eficiencia cuando se usa He en lugar de Nit rógeno
o Argón, es t am bién ciert o que la velocidad ópt im a del gas port ador es m ayor en el prim ero
respect o a los ot ros dos gases. Est o quiere decir que un análisis se realiza en m enos t iem po
cuando se usa He com o port ador que cuando se usa Nit rógeno o Argón, aunque con una
pequeña pérdida de eficiencia.
En la práct ica se t rabaj a dent ro de un rango bast ant e am plio de velocidades sin que est o
m enoscabe apreciablem ent e la eficiencia crom at ográfica. La razón para ello es que el punt o
m ínim o de la ecuación de Van Deem t er se encuent ra en una región bast ant e llana, de m odo
que variaciones apreciables de u apenas influyen sobre h , siendo est o t ant o m ás acent uado
cuant o m ayor sea la densidad del gas port ador.
En lo referent e a las razones económ icas, el precio de los dist int os gases es m uy variable y
no se indicará cifras. Sólo es preciso señalar que el precio del He es elevado respect o a los
dem ás gases, con el agravant e de que se consum e m ucho m ás que de los ot ros. Es solo
aconsej able su uso en conduct ividad t érm ica por razones de seguridad, o en casos
especiales de separación, cuando se requiera un port ador poco denso.
B. Ga se s a u x ilia r e s
Los gases auxiliares en crom at ografía se usan para los sist em as de det ección por ionización
y en el det ect or fot om ét rico de llam a. Para am bos casos se requiere Hidrógeno y aire. Est os
gases, cont enidos en recipient es com o los descrit os para los port adores, se conducen hast a
el sist em a de det ección, luego de reducir su presión adecuadam ent e con los m anoreduct ores
apropiados. La presión de ent rada al det ect or ( y en algunos equipos el fluj o) se indica en
m anóm et ros y/ o rot ám et ros sit uados en el crom at ógrafo.
Con relación al uso del Hidrógeno es preciso hacer algún com ent ario. En prim er lugar él o los
balones de hidrógeno no se deben sit uar dent ro de un área de t rabaj o cerrada. De ser
posible deben colocarse en lugares abiert os prot egidos del sol y la lluvia. Si la ubicación del
balón de Hidrógeno no puede ser la indicada, est ando dent ro del área del crom at ógrafo,
norm alm ent e clim at izada, es preciso ent onces com probar diariam ent e la fuga posible,
valiéndose de una solución j abonosa. La herm et icidad del sist em a neum át ico del
crom at ógrafo ( desde la fuent e hast a la salida del det ect or) se com prueba desm ont ando est e
últ im o y sellando la salida al ext erior con un eyect or ciego. Se fij a una presión de ent rada al
crom at ógrafo de 2 kg/ cm 2 , cerrando de inm ediat o la válvula de acceso del gas que se va a
com probar. En est as condiciones debe m ant enerse la lect ura de la presión en el indicador
correspondient e por lo m enos durant e 5 m inut os. Ot ra m edida a observar es vent ilar
com plet am ent e el área de t rabaj o al com enzar un nuevo día, ant es de encender cualquier
conm ut ador eléct rico ( incluso el de la luz) . Con est as m edidas se evit an riesgos de
explosiones.
1 0 .3 .1 .1 . Espe cifica cion e s de los ga se s cr om a t ogr á ficos ( 3 - 7 )
Aunque para m uchos fines analít icos y t ecnológicos los gases m encionados, producidos
indust rialm ent e, poseen un grado de pureza suficient e, en el caso de la crom at ografía se
requiere que ellos sat isfagan det erm inadas especificaciones, que de no cum plirlas los harían
inservibles. En la t abla 10.1 se resum en las caract eríst icas de los gases para uso
crom at ográfico.
Tabla 10.1.
Gases usados en crom at ografía
Ga s D e nom in a ción I m pur e za s m á x im a s Usos

H2 Purísim o O2 < 300 ppm I onización por llam a
H2 O < 80 ppm
H2 Especial purificado < 5 ppm de O2 Conduct ividad t érm ica
< 5 ppm de CO2
Helio 99.995 Trazas de CO2 , H2 , CH4 y Ar Uso general com o gas
port ador
Argón 99.95 < 100 ppm de O2 Uso com o port ador
t razas de N2
Nit rógeno seco cert ificado < 2000 ppm de Ar Uso general com o gas
< 10 ppm de H2 O Port ador
< 5 ppm de O2
Aire seco I onización por llam a
1 0 .3 .2 . Pr e filt r os.
Las im purezas que norm alm ent e acom pañan a los gases port adores, las cuales no pueden
ser elim inadas en los procesos de obt ención, afect an en m ayor o m enor grado los result ados
crom at ográficos. En la m ayoría de los casos, la presencia de im purezas se reflej a en
inest abilidad de la línea de base y sobre t odo ruido de fondo. En el caso de det ect ores
sensibles com o el de capt ura elect rónica, t ant o el agua com o el oxigeno dism inuyen
gradualm ent e su sensibilidad hast a reducirla a cero.
Cuando se t rabaj a a t em perat ura program ada con isot erm a inicial baj a, la colum na capt a
im purezas, que luego se eluyen cuando se eleva la t em perat ura. Los crom at ógram as
result ant es son difíciles de int erpret ar.
Hay sin em bargo un efect o de las im purezas que no se observa a cort o plazo, a no ser que
est én en concent raciones m uy grandes. Ese efect o es el det erioro gradual de la fase
est acionaria, en especial cuando la im pureza es oxigeno y se t rabaj a a t em perat uras alt as.
Para evit ar el efect o adverso de las im purezas, la m ayoría de los equipos est án dot ados de
filt ros purificadores de gases. Est os filt ros, sit uados inm ediat am ent e a la ent rada del
crom at ógrafo, est án cargados COn t am ices m oleculares, los cuales ret ienen agua, grasa, et c.
Est os t am ices m oleculares deben react ivarse periódicam ent e, de ser posible cada vez que se
cam bia un balón.
Los filt ros purificadores son de t res t ipos:
• De gel de sílice. Para elim inar la hum edad. Por lo general t ienen indicador que perm it e
saber cuando es necesario cam biarlos.
• De t am ices m oleculares. Est os ret ienen im purezas orgánicas incluidos hidrocarburos
provenient es de los com presores usados en la obt ención de los gases port adores.
• Tram pas de oxigeno. Por lo general regenerables, que elim inan t razas de est e gas. Est e
t ipo de filt ro es indispensable cuando se t rabaj a con det ect ores de capt ura elect rónica.
1 0 .3 .3 . Con t r ol de flu j o. M a n or e du ct or
Es preciso reducir la presión elevada del gas cont enido en el balón ant es de que llegue al
crom at ógrafo. Para ello se hace uso de un m anoreduct or el cual garant iza que la presión que
ent ra al crom at ógrafo no sea superior a 5 kg/ cm ² . Est o es im port ant e ya que dent ro del
equipo se encuent ran sit uados reguladores de caudal e indicadores de presión que no
soport an grandes presiones. En la m ayoría de los equipos los indicadores de presión a la
ent rada de la colum na no sobrepasan los 3 kg/ cm ² . En ot ros, apart e de los indicadores de
presión t ienen m edidores de fluj o ( rot ám et ros) a la ent rada de la colum na. Los m edidores
de fluj o pueden t am bién est ar sit uados a la salida de la colum na. Cuando se usa
generadores de Hidrógeno o Nit rógeno est os equipos ent regan esos gases con presiones en
los rangos requeridos para el t rabaj o crom at ográfico.
1 0 .3 .4 . La cá m a r a de in ye cción
I nm ediat am ent e a cont inuación del indicador de presión ( o caudal) del gas port ador, se
encuent ra sit uada la part e del crom at ógrafo conocida com o cám ara de inyección. Est e es el
lugar por donde se int roduce las m uest ras. La figura 10.2 m uest ra un esquem a de una
cám ara de inyección t ípica.
Figu r a 1 0 .2 . Cá m a r a de in ye cción clá sica
El gas port ador, calent ado ant es de ent rar a la cám ara, arrast ra consigo los vapores de la
m uest ra, la cual se int roduce a t ravés de la m em brana perforable de gom a de silicona,
haciéndolos ent rar y avanzar a t ravés de la colum na crom at ográfica.
El diseño de la cám ara de inyección perm it e que las m uest ras que se int roducen en ella, a
t ravés de la m em brana o sept um , se vaporicen rápida y t ot alm ent e. La t em perat ura y
capacidad calorífica de la cám ara, facilit an el paso al est ado de vapor.
El m at erial, la form a y el t am año del port am em branas garant izan una radiación considerable
de calor, evit ando el det erioro de la m em brana perforable.
De la cám ara de inyección depende en gran m edida el result ado de análisis crom at ográfico e
incluso si est e se puede realizar o no.
Se recordará que solo se puede analizar por crom at ografía gaseosa aquellos com puest os que
de por sí o m ediant e algún procedim ient o físico, quím ico o físico- quím ico, pasan al est ado
de vapor o adquieren una presión de vapor t al baj o las condiciones de operación, que le
perm it a avanzar a t ravés de la colum na. El fenóm eno que t iene lugar en la cám ara de
inyección es precisam ent e de nat uraleza física ( vaporización) . Los ot ros procedim ient os
( quím icos, quím ico- físicos) son realizados por el analist a sobre una m uest ra dada para
aum ent ar su volat ilidad. Se describirán m as adelant e.
La im port ancia de la cám ara de inyección es enorm e. Si la m uest ra que se int roduce en ella
no se volat iliza de inm ediat o o lo hace incom plet am ent e, la m asa de vapor llega a la
colum na en form a de una banda ancha con una densidad baj a de vapor. Si la t em perat ura
es dem asiado alt a, la m uest ra pasa m uy rápidam ent e al est ado de vapor, ent rando a la
colum na en form a de banda est recha y concent rada. Sin em bargo, se corre el riesgo que
part e de la m uest ra se pirrolice.
La m uest ra que se inyect a a una t em perat ura insuficient e present a una banda de vapor
ancha, la cual, al ent rar en la colum na abarca m ás de un plat o t eórico. En casos ext rem os
no hay respuest a del det ect or o se present a una ondulación sim ple de la línea de base en la
región correspondient e al t iem po de ret ención del analit o.
Cuando la t em perat ura es adecuada, la banda de vapor ocupa la alt ura equivalent e a un
plat o t eórico.
En resum en cabe dest acar lo siguient e:
• En el análisis por crom at ografía de gases son crít icos los pasos de: inyección con una
m icroj eringa, evaporación inst ant ánea de las m uest ras líquidas en la cám ara del
inyect or, y el t ransport e a la colum na
• La t em perat ura del inyect or debe ser m ayor que la de la colum na, para producir la
volat ilización inm ediat a de la m uest ra, después de su inyección. Hay que cuidar que no
sea excesiva para evit ar la descom posición o la isom erización de sus const it uyent es.
• Aunque la m icroj eringa usada perm it a m edir volúm enes m enores, si la m uest ra se
int roduce a un inyect or calient e, es im posible inyect ar algún volum en m enor que el de
capacidad int erna de la aguj a.
• En la m ayoría de las m uest ras, el fact or det erm inant e del proceso de evaporación es el
solvent e ( no el solut o) . Por ser el com ponent e m ayorit ario y en especial si posee
capacidad calorífica grande, puede consum ir el 99 % de de la energía t érm ica.
Hay una diferencia not able ent re la cám ara de inyección y la form a en que se int roduce la
m uest ra en el sist em a crom at ográfico cuando se usan colum nas em pacadas, respect o al
inyect or y el procedim ient o en el caso de las colum nas capilares.
A cont inuación se expondrán las principales caract eríst icas de est as cám aras en función del
t ipo de colum na em pleada.
1 0 .3 .4 .1 . La cá m a r a de inye cción pa r a colu m na s e m pa ca da s
Com o regla general la t em perat ura de la cám ara de inyección debe sit uarse ent re 10 º C y 20
º C por encim a de la t em perat ura a la cual se opere la colum na crom at ográfica. En el caso de
crom at ografiarse m ezclas, debe siem pre aj ust arse dicha t em perat ura por lo m enos al valor
correspondient e al punt o de ebullición del com ponent e m enos volát il.
Ocurre en la práct ica que m ej ora el aspect o de un pico cuando en lugar de crom at ografiarlo
a la t em perat ura de cám ara indicada, se hace a una superior. Est o puede ser un fenóm eno
t ransit orio ya que, con m ucha frecuencia, una t em perat ura superior a la recom endada
produce pirólisis y carbonización en la cám ara, lo cual provoca m ás t arde dest rucción de las
sust ancias inyect adas o adsorción.
Ot ro requerim ient o im port ant e de est a part e del crom at ógrafo es que sus dim ensiones y
form as sean t ales que garant icen una buena m ezcla vapor – gas port ador, con un t iem po
m ínim o de t ransport e hast a las prim eras capas del relleno de la colum na, reduciendo con
ello la difusión en la fase gaseosa. En realidad el t iem po de t ransport e depende del volum en
de la cám ara de inyección ( llam ado volum en m uert o del inyect or) y ya viene reducido a un
m ínim o por el fabricant e del equipo. Sin em bargo se puede favorecer el t ransport e rápido
hacia la colum na elevando ligeram ent e la t em perat ura del inyect or.
I n ye cción e n la colum na
Un m ét odo m uy difundido act ualm ent e es la inyección en la colum na. En el la m uest ra se
int roduce m ediant e una m icroj eringuilla a unos pocos m m de dist ancia del relleno de la
colum na. Práct icam ent e la volat ilización, t ant o del solut o com o del solvent e, ocurre en las
prim eras capas del relleno. Con ello se m inim iza el volum en m uert o. Con frecuencia se sit úa
un t aponcit o de lana de vidrio desact ivada a la ent rada de la colum na, sobre el relleno. Est e
t iene la doble función de favorecer la evaporación y el m ezclado de la m uest ra con el gas
port ador.
En el m ét odo de inyección en la colum na se int roduce la m uest ra con una m icroj eringuilla de
aguj a larga de m odo que est a llegue al relleno o m ás frecuent em ent e, se sube el nivel de
est e en la colum na ( Ver Fig. 3.25) lo cual present a desvent aj a. Al est ar la fase líquida del
relleno en la zona del cuerpo del inyect or expuest a a una t em perat ura superior a la de la
colum na, est a se volat iliza y se condensa m ás adelant e, si no es que llega al det ect or
provocando ruido de fondo. Con el t ranscurso del t iem po, el relleno de la ent rada de la
colum na se queda sin fase líquida y present a fenóm enos de adsorción de solut os. En la
práct ica est o t iene una solución sencilla. Se desconect a la colum na del crom at ógrafo y se
ext rae el relleno de su ent rada en una longit ud de unos 10 cm – 15 cm , sust it uyéndose por
relleno nuevo de la m ism a com posición.
Volu m e n de m ue st r a a inye ct a r
Para cada equipo y t ipo de m uest ra ( gaseosa o en solución) hay un volum en de inyección
que no debe sobrepasarse ya que est o produciría aum ent o en los t' r así com o
ensancham ient o de las bandas de los solut os.
Com o regla general, en colum nas de relleno se puede inyect ar ent re 0,5 – 10 µL de
m uest ras en solución y de 1– 10 m L cuando las m uest ras son gaseosas, m ient ras que las
sobrepasar de 1 µL.
colum nas capilares adm it en volúm enes m uchos m enores. Para líquidos no se debe
Er r or e s de la inye cción
Com o en t oda operación analít ica, la inyección en crom at ografía gaseosa est á afect ada por
dos t ipos principales de errores: error de m ét odo y error de m anipulación. El error de
m anipulación est á asociado a la falt a de repet ibilidad, fundam ent alm ent e del t iem po en que
se realiza la inyección de la m uest ra. El t iem po de inyección de la m uest ra influye sobre la
alt ura del pico y su t iem po de ret ención. Cuando los picos t ienen un t r grande, las
variaciones en el t iem po de inyección carecen de im port ancia pero hay que ser m uy
cuidadoso en el caso de picos con t r pequeños, especialm ent e en análisis cualit at ivo, ya que
las variaciones ent re una inyección y ot ra pueden en m uchos casos producir dudas respect o
a la ident idad de un com puest o.
El error de m ét odo est á asociado al volum en de la m uest ra a inyect ar. En est e sent ido, el
m uest ra hast a 5 µL. Sin em bargo, cuando la eficiencia de la colum na no sea lim it ant e, es
error dism inuye exponencialm ent e en la m edida que se inyect an volúm enes m ayores de
fact ible inyect ar volúm enes m ayores.

M é t odos de inye cción
Muest ras líquidas: El error result ant e en la inyección de m uest ras líquidas depende en part e
del m ét odo que se siga. En t rabaj os donde no se requiera una exact it ud grande, puede
acept arse com o el volum en inyect ado el valor de enrase de la m icroj eringuilla. Los
volúm enes ent regados son en realidad m ucho m ayores a los nom inales. Est o se debe a que
part e del líquido cont enido en la aguj a es expulsado por efect o del calor de la cám ara. Con
est a form a de proceder, el error relat ivo dism inuye con el volum en de la m uest ra inyect ada.
Muest ras gaseosas: Para int roducir m uest ras gaseosas se usan j eringuillas hipodérm icas
convencionales o un t ipo especial de j eringuilla fabricado con la finalidad crom at ográfica.
Est as últ im as son m uchos m ej ores, ya que las fugas de m uest ra son m ínim as, a pesar de
que com o sabem os, la presión que se genera en la cám ara de inyección es grande.
Muest ras sólidas: La int roducción de m uest ras sólidas es m ucho m ás com plej a que las
líquidas o gaseosas. Se requiere norm alm ent e cám aras con adit am ent os especiales que
perm it an la int roducción de cápsulas pequeñas de vidrio o I ndium , las cuales cont ienen la
m uest ra sólida. Las cápsulas de vidrio se fragm ent an m ecánicam ent e, m ient ras que las de
I ndium se funden ( a 156 º C) , liberando la m uest ra en am bos casos.
1 0 .3 .4 .2 . El in ye ct or y los m é t odos de inye cción pa r a colu m na s ca pila r e s
Dada las caract eríst icas de las colum nas capilares y sem icapilares ( wide bore) que serán
explicadas en epígrafes próxim os, t ant o el inyect or com o los m ét odos de inyección varían
sust ancialm ent e con respect o a la part e del crom at ógrafo ya explicada.
En efect o, las colum nas capilares t ienen un diám et ro int erno m uy pequeño, lo que lim it a al
volum en de inyección a 1µL o m enos. Adem ás, la cant idad de fase est acionaria en la
colum na y m ás im port ant e, el espesor de la película, es m uy pequeño. Est o necesariam ent e
lim it a el t am año de m uest ra a inyect ar y el volum en en que est a se disuelve. Es por eso que
la inyección en crom at ografía capilar, es lo que m ás influye en la precisión de los result ados
analít icos obt enidos con esa t écnica.
Se ha desarrollado varios m odos de inyección con vist as a m inim izar o evit ar los errores que
se int roducen durant e esa operación crom at ográfica. Ent re ellos, los m ás usados son: a) el
m ét odo Split , b) el m ét odo Split t less, c) la inyección en colum na fría y d) la inyección
m ediant e el disposit ivo PTV ( vaporizador con t em perat ura program ada) , ent re ot ros.
a ) I nye cción Split
En el m odo de inyección split solo una fracción del volum en inyect ado se int roduce en la
colum na crom at ográfica, el rest o se desvía hacia el ext erior. El analist a predet erm ina que
volum en desea que se int roduzca en la colum na ( acorde a sus condiciones crom at ográficas
especialm ent e las caract eríst icas de la colum na)
En los equipos m odernos est o se cont rola aut om át icam ent e, a t ravés del m ando elect rónico
del crom at ógrafo, haciendo uso de un inyect or m odificado conocido com o split t er, cuya
función es precisam ent e facilit ar la división del caudal inyect ado.
Un esquem a sim plificado de un split t er se m uest ra en la figura 10.3.
Figu r a 1 0 .3 . Esqu e m a sim plifica do de u n in ye ct or Split
Un volum en “ norm al” de m uest ras de V µL se int roduce en el inyect or split . Dada la relación
previam ent e est ablecida por el analist a ( relación split ) , se logra la ent rada a la colum na del
volum en deseado de m uest ra. Así, sí la relación split es por ej em plo 10/ 1, solam ent e el 10
% de la inyección ent ra a la colum na m ient ras que el 90 % se elim ina o va al ext erior.
Est e m ét odo de inyección es m uy usado en la act ualidad y posee sin dudas vent aj as, ent re
ellas:
• Es sim ple de operar.
• Se inyect a con m icroj eringuilla convencional.
• Por lo general puede usarse cualquier solvent e para disolver la m uest ra.
• Hay poca pert urbación por ensancham ient o de las bandas crom at ográficas, debido a
t ransferencia lent a del inyect or a la colum na.
Se le señala sin em bargo dos desvent aj as fundam ent ales:
1. Poca repet ibilidad de las inyecciones: La falt a de repet ibilidad ( error de inyección) se
pone de m anifiest o sobre t odo cuando se t rabaj a con program ación de t em perat ura y la
isot erm a inicial est á por debaj o de la t em perat ura de ebullición del solvent e usado para
disolver la m uest ra. Se debe a que la relación split prefij ada ( relación del fluj o de gas
port ador que llega al inyect or respect o al que ent ra a la colum na) no siem pre es igual a
la relación split verdadera ( fracción de la m uest ra que llega a la colum na) .
De hecho, en la práct ica la relación split prefij ada es m enor que el valor split verdadero,
debido a que ent ra m as m uest ra que la correspondient e. Por eso no es posible calcular la
cant idad de m uest ra inyect ada basado sim plem ent e en la relación split . Tam poco se
reproduce adecuadam ent e la inyección. Debe señalarse que est a deficiencia puede
resolverse usando un pat rón int erno.
Para garant izar una exact it ud adicional en las det erm inaciones cuant it at ivas, es preciso
m ant ener const ant e la relación split y la t em perat ura de la colum na, así com o disolver la
m uest ra y el pat rón ( en caso de usar pat rón ext erno) , en el m ism o solvent e
2. Efect o discrim inant e de solut os: Los solut os de pesos m oleculares diferent es t ienen por
lo general volat ilidades dist int as, por lo que no se com port an del m ism o m odo cuando se
inyect an j unt os m ediant e el m ét odo split . En general, en est e disposit ivo hay zonas m ás
calient es que ot ras. En las zonas m enos calient es, incluida la punt a de la j eringuilla, se
produce una condensación parcial de los analit os m enos volát iles de una m ezcla dada.
Adem ás y puest o que el t ránsit o hacia la ent rada de la colum na es m uy rápido, no se
alcanza una dist ribución hom ogénea de est os en el vapor que se produce en el inyect or.
Por ello la proporción que ent ra a la colum na es m enor que la de los analit os m ás
volát iles, produciéndose el fenóm eno llam ado discrim inación
b) M é t odo de inye cción Split le ss
En est e procedim ient o de inyección la t ot alidad de la m uest ra que se int roduce en el inyect or
m uy pequeño. Por lo general nunca excede a un 1 µL y aún con volúm enes inferiores al
accede a la colum na. Por est a razón el volum en m áxim o de m uest ra a inyect ar debe ser
indicado, se origina zonas de vapor condensado en los prim eros 20 cm - 60 cm a la ent rada
de la colum na, cuando se t rabaj a con isot erm as iniciales relat ivam ent e baj as ( del orden del
punt o de ebullición del solvent e o por debaj o de est e)
con m icroj eringuillas de 1 µL, las cuales t ienen t endencia a t upirse con facilidad.
Adem ás de est e inconvenient e y para garant izar una exact it ud sat isfact oria, debe inyect arse
c) I n ye cción e n colu m n a fr ía
Est a es una variant e del m ét odo de inyección split less, pero con la caract eríst ica que no
ut iliza un cuerpo de inyect or sofist icado. Adem ás, en est e caso, la punt a de la
m icroj eringuilla se int roduce direct am ent e en la colum na crom at ográfica, para lo cual se
requiere expansionar est a ligeram ent e.
La t em perat ura de la colum na debe encont rarse en el rango de 40 º C a 50 º C. Después
que se int roduce la m uest ra, se ret ira la m icroj eringuilla y se program a de inm ediat o la
t em perat ura del horno ( ent re 30 º C/ m in a 40 º C/ m in) , hast a alcanzar la t em perat ura de
operación.
Con est e m ét odo se puede inyect ar de 1 µL a 1,5 µL de m uest ra, con result ados
sat isfact orios en lo que respect a a exact it ud y ausencia de discrim inación.
El m ét odo sin em bargo t iene algunas caract eríst icas que es preciso t ener en cuent a a la hora
de seleccionarlo:
• Se requiere expansionar la punt a de la colum na.
• Es preciso usar m icroj eringuillas con aguj as m uy finas. Est o t iene el inconvenient e que se
inut ilizan fácilm ent e ( se t upen, se doblan)
• Con est e m ét odo no es posible aut om at izar la inyección.
• Residuos no volát iles de la inyección t ienden a acum ularse en el ext rem o de la colum na
por donde se int roduce la aguj a, con efect os nocivos ( cat alít icos, de absorción) a largo
plazo.
Se señala adem ás que la reproducibilidad de los prim eros picos no es buena, debido a
que la inyección en la colum na fría produce una zona inundada con la solución de la
m uest ra inyect ada, que puede llegar hast a 60 cm de longit ud ( en dependencia del
volum en inyect ado) . Est a m asa liquida se m ueve rápidam ent e im pulsada por el gas
port ador, se expande dent ro de la colum na hast a alcanzar una m onocapa, com enzando a
pasar a la fase de vapor. En resum en, la m uest ra ent ra a la colum na crom at ográfica para
iniciar la separación com o una banda ancha, por lo que los picos result ant es serán
t am bién anchos.
Est e fenóm eno es m ayor en colum nas de m enos de 25 m . En colum nas m ayores el efect o
es m enor pero se present a siem pre, especialm ent e cuando la m uest ra se inyect a en
solvent e polar.
d) I nye cción con pr ogr a m a ción de t e m pe r a t u r a de l va por iza dor
Est e m odo de inyección ut iliza un inyect or clásico m odificado ingeniosam ent e. La m uest ra se
int roduce m anual o aut om át icam ent e en una cám ara, que se encuent ra a t em perat ura
am bient al. Al inyect ar la m uest ra en frío, no hay perdidas ni discrim inación. Después que se
saca la aguj a se program a la vaporización hast a el valor m áxim o preest ablecido, a part ir del
cual com ienza el program a de calent am ient o del horno, la apert ura de la válvula del inyect or
hacia la colum na y el enfriam ient o post erior de la cám ara de inyección.
Con adapt adores apropiados, est e inyect or adm it e colum nas desde 0,22 m m hast a 1,2 m m
de diám et ro ext erno.
1 0 .3 .5 . La colu m n a cr om a t ogr á fica
La colum na se encuent ra acoplada a la salida de la cám ara de vaporización por un ext rem o y
por el ot ro a la ent rada del cuerpo del det ect or. El acoplam ient o de la colum na depende del
t ipo de ést a y del fabricant e del equipo.
Las colum nas de vidrio se acoplan m ediant e t uercas. La herm et icidad del acoplam ient o lo
garant izan sellos de t eflón, vit ón u ot ro elast óm ero t erm oresist ent e. En caso de operación a
t em perat ura elevada, el sello usado es de grafit o ( lim it e de operación hast a 500 º C) .
De la colum na crom at ográfica depende el éxit o del análisis. Es la part e m ás im port ant e del
crom at ógrafo, de cuya eficiencia y caract eríst icas result a si una m ezcla se puede separar o
no, si un com puest o puede o no crom at ografiarse. Se expondrá en det alle a cont inuación los
elem ent os que ent ran a form ar part e del t érm ino colum na crom at ográfica.
Las colum nas crom at ográficas para crom at ografía de gases son t ubos de longit ud y
diám et ros apropiados de vidrio, acero inoxidable, aleaciones m et álicas, cobre, plást ico, et c.
El m at erial de const rucción se selecciona de acuerdo a las caract eríst icas de los problem as a
resolver. Sin em bargo, debido a sus escasas propiedades cat alít icas, el vidrio es el m at erial
que m ás se ha usado en la const rucción de colum nas, desde las sim ples en form a de U hast a
las capilares, las cuales alcanzan en algunos casos m ás de 1000 m de largo. Con el avance
de la t ecnología, se fabrican hoy colum nas de sílice que com pit en favorablem ent e con las de
vidrio.
At endiendo a su función, las colum nas pueden clasificarse en analít icas y preparat ivas. La
finalidad de las prim eras es la separación de un com puest o de ot ros para ident ificarlo y
cuant ificarlo, m ient ras que las colum nas preparat ivas se ut ilizan en la obt ención de
fracciones puras.
Ahora bien, si la clasificación se basa en la form a en que est á dispuest a la fase est acionaria
en las colum nas, ést as pueden ser: colum nas de relleno o em pacadas, si la fase est acionaria
recubre a un soport e inert e, m ás o m enos regular, el cual llena t ot alm ent e el int erior de la
colum na y colum nas capilares, cuando las paredes int eriores de un t ubo m uy fino sirven de
soport e a la fase est acionaria ( figura 10.4) .
Figu r a 1 0 .4 . Colu m n a s pa r a cr om a t ogr a fía de ga se s
1 0 .3 .5 .1 . Colum n a s e m pa ca da s
Las colum nas de relleno o em pacadas son aquellas en las que la fase est acionaria recubre a
un soport e inert e, m ás o m enos regular, el cual llena t ot alm ent e el int erior de la colum na
Las dim ensiones de una colum na em pacada se escogen de acuerdo a las caract eríst icas del
problem a analít ico a resolver. Por lo general cuant o m ayor es la longit ud de una colum na,
m ej or será su poder separat ivo. El lím it e práct ico de longit ud est á det erm inado por la caída
de presión del gas port ador dent ro de la colum na. El diám et ro int erno es t am bién
im port ant e pues un aum ent o del diám et ro int erno se t raduce en picos anchos. Las colum nas
de pequeño diám et ro int erno adem ás de su eficiencia, son m uy buenas en t rabaj os de
program ación de t em perat ura, puest o que se est ablece m uy rápidam ent e el equilibrio
t érm ico ent re el horno y el relleno crom at ográfico.
Las colum nas de relleno t ienen por lo general una longit ud ent re 0.3 y 10 m et ros y
diám et ros int ernos ent re 2 y 6 m m . Debido a la gran longit ud de algunas colum nas es
preciso enrollarlas.
1 0 .3 .5 .1 .1 . El sopor t e de r e lle no de la colum na
Las colum nas se rellenan con un sólido o soport e granular m ás o m enos inert e, recubiert o
de una fase est acionaria líquida a la t em perat ura de operación del crom at ógrafo. La fase
est acionaria es la que le confiere a la colum na sus caract eríst icas separat ivas.
Sirve com o soport e cualquier m at erial granular inert e, con una superficie especifica m enor
de 10 m 2 / g, de m odo que la película liquida que lo recubra ofrezca un buen cont act o con el
analit o ( o sea, un rápido int ercam bio líquido- gas) . Debe ser adem ás duro y t erm oest able,
con una porosidad t al que favorezca el paso del gas port ador. En realidad son pocos los
m at eriales, por no decir ninguno, que sat isfacen est os requisit os. Se fabrican sin em bargo
product os cuyas caract eríst icas perm it en su uso com o soport e.
Los soport es de gran uso en crom at ografía gaseosa pueden ser clasificados en dos grandes
grupos; Diat om áceos y No Diat om áceos. Los Soport es Diat om áceos usan para su fabricación
la diat om it a, t am bién llam ada t ierra de infusorios o Kieselguhr. Est e m at erial est á form ado
por los esquelet os fósiles de algas unicelulares, las diat om eas, las cuales se han acum ulado
en grandes cant idades en los m ares y lagos de algunas regiones del m undo. La
caract eríst ica sobresalient e de est as algas fósiles es la de t ener un esquelet o poroso. El
diám et ro m edio de los poros es del orden de 1 m icróm et ro poco m ás o m enos.
Los soport es no diat om áceos han encont rado algún uso por sus caract eríst icas part iculares y
est án llam ados a ocupar un lugar dest acado dent ro de la crom at ografía gaseosa. Ent re ellos
se encuent ra: el t eflón, las bolas de vidrio y los polím eros orgánicos. El Teflón es un soport e
m uy inert e, especial para crom at ografiar agua, alcoholes, am inas, am oniaco, SH2 y SO2 . La
eficiencia de las colum nas rellenas con t eflón es baj a por la poca uniform idad del
recubrim ient o de est e soport e. Por encim a de 290 º C no puede usarse ya que em it e vapores
t óxicos.
Las m icro bolas de vidrio son m uy uniform es en t am año ( ideales) pero present an
desvent aj as grandes. En prim er lugar su superficie es m uy pequeña y por t ant o ret ienen
poco la fase est acionaria; son sólidos no porosos y adem ás la fase liquida se acum ula en los
espacios libres dej ados ent re las bolas, con espesores m ucho m ayores a los de la película
que recubre a ést as.
Las m icrobolas polim éricas present an buenas caract eríst icas. El t am año es m uy uniform e,
son porosas y algunas no requieren fase líquida.
En la t abla 10.2 se present a algunos de los soport es de gran uso crom at ográfico.
Tabla 10.2.
Soport es de uso crom at ográfico
Sopor t e s D ia t om á ce os Sopor t e s no D ia t om á ce os
Ca r a ct e r íst ica
M icr o bola s M icr o bola s
Bla n co Rosa do Te flón
de vidr io or gá n ica s
Act ividad
Alt a Despreciable Despreciable Despreciable
superficial
Uniform idad de
No No No Buena Buena
part ículas
3- 10
Ancho de poro 1 m icróm et ro - No -
m icróm et ros
Superficie
1 m 2/ g 4 m 2/ g - - -
específica
Reacción Básica Ácida No No -

Chrom osorb W
Porapak
Ej em plo de Chrom osorb G
Chrom osorb P Kel- F - Chrom osorb
soport e Gas Chrom Q
102
Celit e 545
1 0 .3 .5 .1 .2 . La fa se e st a cion a r ia e n la s colum na s e m pa ca da s
La fase est acionarla, líquida a la t em perat ura a la que se realiza el análisis crom at ográfico,
t iene una im port ancia ext raordinaria. Ella recubre un soport e m ás o m enos inert e, en form a
de película fina y const it uye la part e act iva del relleno. Ent re ella y el gas port ador se realiza
el proceso de part ición, base de la crom at ografía gas- líquido.
La im port ancia que ha adquirido recient e la crom at ografía gaseosa se debe a que se ha
podido disponer de una fase est acionaria adecuada para cada problem a analít ico part icular.
Act ualm ent e son adquiribles com ercialm ent e fases est acionarias cuyas propiedades físico-
quím icas varían dent ro de un rango m uy am plio: ut ilizables desde t em perat ura am bient e o
por debaj o de ést a, hast a fases est acionarias cuyo m áxim o de operación supera los 500 º C;
desde escasa o nula polaridad hast a polaridades elevadas, disponiéndose en algunos casos
de fases est acionarias quím ico- específicas para resolver problem as analít icos part iculares.
La fase est acionaria requiere t ener una serie de caract eríst icas. Las fundam ent ales son las
siguient es:
• Debe ser select iva a los com ponent es de la m ezcla que se desea separar. Est o quiere
decir que sea capaz de disolver bien el ( los) analit o ( s) para dar lugar a la separación de
bandas crom at ográficas. Si la solubilidad de los analit os en la fase est acionaria es
pequeña, habrá m ala resolución, except o si los analit os a separar difieren
considerablem ent e en sus punt os de ebullición.
• La fase est acionaria debe ser líquida a la t em perat ura de operación, con viscosidad baj a
y una t ensión de vapor pequeña. Las pérdidas de fase est acionaria por evaporación y
arrast re deben ser m oderadas, no debiendo causar su presencia en el det ect or ruido de
fondo que alt ere la sensibilidad del m ét odo.
• Debe ser est able a la t em perat ura de operación y no reaccionar con los analit os a
separar.
• Debe m oj ar bien el soport e, form ando una película uniform e, lo cual no depende
solam ent e de la fase líquida, sino t am bién del soport e em pleado.La falt a de uniform idad
de la película de FE se present a en soport es de m icrobolas de vidrio y t am bién en
soport es con superficie rugosa. En los soport es diat om áceos la fase est acionaria t iene un
espesor m ayor en sus poros y canales.
El éxit o de una separación por crom at ografía gaseosa en colum nas de relleno depende de
varios fact ores, ent re los que pueden cit arse com o m ás im port ant es: A. la t em perat ura de
uso de la fase est acionaria, B. la polaridad de la fase est acionaria, C. la int eracción fase
est acionaria – solut o, D. la presión de vapor de los analit os y E. la relación fase est acionaria
– soport e.
A. Te m pe r a t u r a de uso de la fa se e st a cion a r ia
Aunque en principio no se usa la fase est acionaria a una t em perat ura por debaj o de su
punt o de fusión, en la práct ica, el sim ple hecho de que ést a sea líquida a una t em perat ura
dada no im plica necesariam ent e que se pueda usar. Es preciso considerar la viscosidad de la
fase líquida, especialm ent e cuando el espesor de la película sea grande, ya que puede
afect arse considerablem ent e la eficiencia de la colum na. En la práct ica es posible t rabaj ar
una fase est acionaria a una t em perat ura para la cual su viscosidad sea de 1 poise o algo
m enor. En caso de películas delgadas de fase líquida se adm it en viscosidades m ayores y
para películas gruesas t odo lo cont rario.
En relación con la t em perat ura m áxim a a la cual se t rabaj a una FE, est a debe est ar lo
suficient em ent e alej ada de su punt o de ebullición de m odo que su t ensión de vapor no
influya en la respuest a del det ect or. El lím it e práct ico m áxim o de operación se encuent ra
ent re 200 º C y 250 º C por debaj o del punt o de ebullición de la FE.
En la práct ica el analist a se sient e t ent ado de t rabaj ar a t em perat uras alt as ya que con ello
se aum ent a las solubilidades de los analit os en la FE, los picos t ienden a ser m ás est rechos
puest o que la viscosidad es m enor, los t r t am bién son m enores ( siem pre que se m ant enga
const ant e el fluj o de gas port ador) . Pero cont rarrest ando esas vent aj as hay desvent aj as a
largo y a cort o plazo.
Una desvent aj a a largo plazo la t enem os en la duración de la colum na. Est a, debido a la
volat ilización y arrast re de la FE, durará t ant o m enos cuant o m ás se use cerca del lím it e
m áxim o de t em perat ura de operación.
La principal desvent aj a a cort o plazo, de operar a t em perat ura elevada la t enem os en la
presencia pert urbadora de los vapores de FE en el det ect or y en m uchos casos el ruido
dism inuye la calidad y sensibilidad de det ección.
B. Pola r ida d de la fa se e st a ciona r ia
El conocim ient o de la polaridad de las fases est acionarias disponibles com ercialm ent e es de
m ucha ut ilidad práct ica. El analist a puede hacer una elección correct a de una FE ant e un
problem a concret o a resolver, o sacar conclusiones acert adas acerca de la polaridad de los
com ponent es de una m uest ra, si conoce las caract eríst icas de la m uest ra con que t rabaj a.
En ocasiones es suficient e, para hacerle frent e a los problem as que se present an a diario,
disponer de una escala cualit at iva de polaridades de las fases est acionarias. Por lo general
esa escala t om a valores de 0 a 5. A las fases no polares se les asigna el valor 0 m ient ras
que a las de m áxim a polaridad le corresponde el 5.
C. I n t e r a cción fa se e st a cion a r ia - solu t o.
La int eracción FE - analit o depende de la nat uraleza de am bos. Est a int eracción será m ayor
cuant o m ás sim ilares sean las propiedades del analit o y de la FE Así por ej em plo, si un
analit o A difiere not ablem ent e en propiedades físico- quím icas de una FE dada, su solubilidad
en ést a será escasa. Est e analit o perm anecerá poco t iem po en la fase est acionaria ( por la
falt a de afinidad hacia ella) por lo que el vapor se eluirá rápidam ent e. Su t r será pequeño.
Por el cont rario, si ot ro analit o B t iene propiedades en com ún con la FE, ent onces su
solubilidad en est a será considerable, su perm anencia en la colum na será grande ( ya que el
analit o solo avanza a t ravés de la colum na cuando se encuent ra en la fase gaseosa) y por
t ant o su t r será m ucho m ayor que el del analit o A.
Se sabe que los analit os polares se crom at ografiarán bien en FE polares, m ient ras que los
analit os apolares lo hacen bien en FE apolares.
Debido a la poca afinidad ent re un analit o polar y una FE apolar, su t iem po de ret ención en
ést a será m enor que el de un analit o apolar de igual punt o de ebullición. De m odo análogo,
un analit o apolar t endrá un t r m enor en una FE polar que el de un analit o polar de igual
punt o de ebullición.
Así m ism o, los t r de dist int os analit os polares de iguales punt os de ebullición serán
proporcionales a sus polaridades respect ivas, est o es, m ient ras m ayor sea la polaridad de un
analit o, m ayor será su t r en igualdad del rest o de las condiciones. Finalm ent e, el orden de
elución de los analit os apolares en FE apolar, est á regido por sus punt os de ebullición; los
m ás volát iles t ienen m enores t r que los m enos volát iles.
Est as reglas cualit at ivas nos sirven para elegir una FE si se conoce la polaridad de los
com ponent es de una m uest ra. I nversam ent e, conocida la polaridad relat iva de una FE, es
posible sacar conclusiones cualit at ivas acerca de la nat uraleza de los com ponent es de una
m ezcla separada por crom at ografía gaseosa, det erm inados sus t r respect ivos.
D . Pr e sión de va por de los a na lit os.
Considerem os ahora la influencia de la presión de vapor sobre el t r . Para dos analit os A y B
en equilibrio con una FE a una t em perat ura T de operación del análisis ( en la cual la FE es
líquida y los analit os A y B est arán disuelt os en ella) , para una m ism a fracción m olar el
com puest o que exhiba una presión de vapor m ayor t endrá una proporción m ayor de sus
m oléculas en la fase gaseosa y consecuent em ent e su t r será m enor que el correspondient e
al com puest o que t enga una m enor presión de vapor..
E. Re la ción fa se e st a ciona r ia - sopor t e
La influencia sobre el t r, el t am año de la m uest ra, la eficiencia y la vida út il de la colum na
est án det erm inadas por la proporción de FE que recubre el soport e.
Después de la nat uraleza de la FE, es la proporción de ést a en el relleno la que decide la
eficiencia y durabilidad de una colum na. A m edida que va siendo m ayor la cant idad de FE
que recubre un ciert o soport e, será m ayor el espesor de la película que recubra las
part ículas de ést e. El aum ent o del espesor de la película va acom pañado de un aum ent o del
t iem po de ret ención de los analit os, en igualdad del rest o de los parám et ros, lo que puede
conducir a una dism inución de la eficiencia de la colum na ( crece h) .
1 0 .3 .5 .1 .3 . Vida ú t il de la colum n a . Enve j e cim ie n t o
La vida út il de una colum na es m uy variable, desde algunos días hast a un año o m ás. Una
colum na durará m ás m ient ras se t rabaj e a una t em perat ura lo m ás alej ada posible del
m áxim o señalado para la FE en cuest ión. De est a form a t ant o la volat ilización com o la
descom posición de la FE serán m ínim as, obt eniéndose result ados sat isfact orios durant e un
periodo largo de t iem po. Todo lo cont rario ocurre cuando se t rabaj a m uy cerca o por encim a
del valor m áxim o de la t em perat ura de operación de la FE.
Ot ros fact ores que t am bién influyen en la vida de la colum na son:
• Calent ar la colum na sin ant es haber desaloj ado el aire del sist em a m ediant e el gas
port ador ( sobre t odo cuando se cam bia o inst ala colum nas nuevas) .
• Trabaj ar con gases port adores puros. Si los gases port adores cont ienen im purezas ( por
ej em plo oxígeno) por encim a de las indicadas la vida de la colum na se reduce
considerablem ent e. En algunos casos pierde su efect ividad en unas pocas horas.
El proceso de pérdida gradual de la eficiencia de una colum na crom at ográfica se conoce
com o envej ecim ient o. En condiciones norm ales es causado por la volat ilización de la FE y
por fenóm enos de crist alización de est a ent re los períodos de ut ilización y alm acenaj e.
1 0 .3 .5 .2 . Colum n a s ca pila r e s
El uso am plio que han t enido las colum nas capilares desde su int roducción en la
crom at ografía gaseosa hast a nuest ros días y las perspect ivas que se vislum bran, se debe sin
duda a los result ados sobresalient es alcanzables con ést as, especialm ent e en resolución y
reproducibilidad. Est o se ha puest o aun m ás de m anifiest o con el uso de la sílice fundida
com o m at erial de part ida para la fabricación de colum nas, aprovechando de form a acert ada
la t ecnología de fabricación de las fibras ópt icas. Est o ha perm it ido a la crom at ografía
gaseosa capilar, conocida t am bién por sus siglas HRGC ( Crom at ografía Gaseosa de Alt a
Resolución) , est ar vigent e hast a nuest ros días a pesar del auge y la puj anza de la HPLC.
1 0 .3 .5 .2 .1 . Aspe ct os ge n e r a le s de la s colum na s ca pila r e s
Las colum nas capilares son aquellas form adas por un capilar de diám et ro int erno m uy
pequeño, en cuyas paredes int eriores est á dispuest a la fase est acionaria
El m at erial const it ut ivo de las colum nas capilares fue en sus com ienzos el vidrio, t ant o el
llam ado vidrio soda ( blando) com o el vidrio duro Tipo Pyrex ó Durán. En la act ualidad sin
em bargo, la m ayoría de las colum nas se fabrican indust rialm ent e usando sílice purísim a
com o m at erial de part ida. No obst ant e debido a las caract eríst icas del m at erial de part ida y
del product o final, las colum nas de vidrio encuent ran aún uso analít ico. Así, com o se t rat ará
m ás adelant e, las colum nas de vidrio requieren un t rat am ient o físico y quím ico m uy
com plej o de su pared int erior. Ello perm it e usar un núm ero m uy grande de fases
est acionarias para su recubrim ient o y en dependencia de su nat uraleza, es posible t rabaj ar
con ellas a t em perat uras por encim a de los 400 º C, lo cual est á vedado para las colum nas
de sílice fundida, que t ienen com o t em perat ura lím it e 300 º C ( debido a que el recubrim ient o
ext erior de poliim ida, usado para aum ent ar su flexibilidad, se descom pone alrededor de esa
t em perat ura) . A diferencia de las colum nas de vidrio, las de sílice fundida requieren poco
t rat am ient o de su pared int erior, adem ás de que el núm ero de fases est acionarias usables
con ellas es lim it ado.
Las colum nas capilares pueden t ener una longit ud hast a 10 veces m ayor que las colum nas
em pacadas ( 10 – 100 m ) y un diám et ro int erno m ucho m enor ( 0.1 – 0.75 m m ) , lo que
unido a la ausencia de relleno, las hace m ucho m ás eficient es. Las figuras 10.5. y 10.6.
Muest ran el efect o de la longit ud y el diám et ro de la colum na sobre la resolución del
crom at ogram a.
Figu r a 1 0 .5 . Efe ct o de la lon git u d de la colu m n a sobr e la r e solu ción .
Figu r a 1 0 .6 . Efe ct o de l diá m e t r o in t e r n o de la colu m n a sobr e la r e solu ción .

El espesor de la pared de las colum nas de sílice es diez veces m enor al de las colum nas de
vidrio, y es del orden de 25 m icróm et ros. Por est o y por la dureza de la sílice, es que est as
colum nas son t an frágiles y requieren del recubrim ient o prot ect or de la poliim ida.
prepara en el rango de 0,02 a 8 µm .

El espesor de fase est acionaria t ant o de las colum nas de vidrio com o las de sílice fundida se
Acorde a la nat uraleza de la superficie int erna del capilar, las colum nas pueden ser act ivas y
no act ivas ( inert es) . Las prim eras son select ivas, resist en la cont am inación y t ienen una vida
út il larga, pero son operables solo por debaj o de 250 º C. Las colum nas inert es no son
select ivas, son m uy sensibles a la cont am inación ( m ient ras m ás inert es, m ás fácil se
cont am inan) , pero son operables a t em perat uras alt as ( hast a 400 º C) . Su vida út il es cort a y
depende de la pureza de los ext ract os que se inyect an.
Las im purezas de peso m olecular alt o, generalm ent e poco volát iles, se ret ienen t ant o en las
colum nas act ivas com o en las inert es. En las prim eras, est as im purezas se neut ralizan y
prevalecen las caract eríst icas de la fase est acionaria, m ient ras que en las colum nas inert es
van cam biando paulat inam ent e la nat uraleza del recubrim ient o, especialm ent e cuando est e
es apolar.
1 0 .3 .5 .2 .2 . La fa se e st a cion a r ia e n la s colum na s ca pila r e s

En función de la m anera en que est é dispuest a la fase est acionaria en la pared int erior de la
colum na, est as se clasifican en t res t ipos:
• Colum na ca pila r con sopor t e r e cu bie r t o ( SCOT, del inglés Support Cover Open
Tubular) . La fase est acionaria est á unida a un soport e y est e últ im o se encuent ra
recubriendo la pared int erior de la colum na.
• Colum na ca pila r de pa r e d r e cu bie r t a ( WCOT, del inglés Wall Cover Open Tubular) . La
fase est acionaria est á direct am ent e adherida a la pared int erior de la colum na
crom at ográfica.
• Colum na ca pila r de sílice fun dida ( FSOT, del inglés Fusion Silice Open Tubular) . En
est e caso la fase est acionaria est á inm ovilizada o quím icam ent e enlazada a la pared
int erior del capilar.
En los dos prim eros casos de colum nas capilares, la fase est acionaria est á deposit ada
físicam ent e com o una película fina en el int erior del capilar, por lo que est as est an som et idas
a las m ism as deficiencias que las colum nas em pacadas: sangram ient o, redist ribución de la
fase est acionaria y en ocasiones hast a obst rucción del capilar.
En las colum nas capilares de sílice fundida la inm ovilización consist e en unir quím icam ent e
ent re sí algunas m oléculas de la fase est acionaria o ést as con la pared de la colum na. En
ocasiones t iene lugar los dos t ipos de enlace.
Las vent aj as de la inm ovilización son varias:
• La fase est acionaria no se desplaza de su posición, aun en zonas cerca del inyect or
donde est á som et ida a solvent es o vapores concent rados de ést os, por lo que la
uniform idad del recubrim ient o perm anece const ant e durant e m ucho t iem po.
• La colum na puede ser lavada con solvent es, lo cual cont ribuye a que est a recobre su
eficiencia después de un período prolongado de t rabaj o.
•
película > 2 µm .
La inm ovilización es im prescindible en caso de recubrim ient os con un espesor de la
En la t abla 10.3 se relacionan las fases est acionarias m ás em pleadas en colum nas capilares
de sílice fundida.
Tabla 10.3. Fases est acionarias para colum nas de sílice fundida
Com posición Pola r ida d Lím it e ( e n °C) Aplica cione s
100 % gom a de No polar - 60 a 325 Fenoles, hidrocarburos, am inas,

dim et ilpolisiloxano pest icidas, PCBs, com puest os de
azufre.
100 % fluido de No polar 0 a 280 Derivados de am inoácidos, aceit es

dim et ilpolisiloxano esenciales.
5 % fenil y 95 % No polar - 60 a 325 Ácidos grasos, alcaloides, ést eres

dim et ilpolisiloxano m et ílicos, drogas, com puest os
halogenados.
14 % cianopropil y I nt erm edia - 20 a 280 Drogas, est eroides, pest icidas.

fenilpolisiloxano
Com posición Pola r ida d Lím it e ( e n °C) Aplica cione s
50 % fenil y 50 % I nt erm edia 60 a 240 Drogas, est eroides, pest icidas,

m et ilpolisiloxano glicoles.
50 % cianopropil m et il I nt erm edia 60 a 240 Ácidos grasos, ést eres m et ílicos,

y 50 % fenil acet at os de adit oles.
m et ilpolisiloxano
50 % t rifluoropropil I nt erm edia 45 a 240 Arom át icos, com puest os

polisiloxano halogenados.
Poliet ilenglicol Polar 60 a 240 Ácidos, alcoholes, aldehídos,

m odificado con TPA acrilat os, cet onas, nit rilos.
Poliet ilenglicol Polar 60 a 220 Ácidos, alcoholes, ét eres, aceit es

esenciales, glicoles, solvent es
En la t abla 10.4 aparece una com paración de las principales caract eríst icas de las colum nas
capilares y em pacadas para crom at ografía gaseosa.
Tabla 10.4.
Propiedades y caract eríst icas de las colum nas analít icas para crom at ografía de gases
FSOT W COT SCOT Em pa ca da

Longit ud, m . 10- 100 10- 100 10- 100 1- 6
Diám et ro int erno, m m . 0.1- 0.53 0.25- 0.75 0.5 2- 6
Eficiencia, plat os/ m . 2000- 4000 1000- 4000 600- 1200 500- 1000
Cant idad de m uest ra, ng. 10- 75 10- 1000 10- 1000 10- 10 6
Presión relat iva. Baj a Baj a Baj a Alt a
Velocidad relat iva. Rápida Rápida Rápida Lent a
I nact ividad quím ica. Excelent e Muy buena Buena Mala
Flexible. Si No No No
FSOT: Colum na capilar de sílice fundida, W COT: Colum na capilar de pared recubiert a,
SCOT: Colum na capilar con soport e recubiert o
1 0 .3 .6 . El h or no
La colum na crom at ográfica se encuent ra sit uada en un horno aislado t érm icam ent e. En la
m ayoría de los equipos la t em perat ura del horno puede fij arse en cualquier valor ent re 50º C
y 350º C. Equipos especiales poseen “ hornos” operables por debaj o de 0º C y hast a 500º C.
Un accesorio, llam ado program ador, perm it e variar la t em perat ura del horno en función del
t iem po dent ro de los lím it es perm isibles del equipo. La form a y velocidad con que la
t em perat ura del horno varía en función del t iem po son prefij adas de ant em ano por el
operador de acuerdo al problem a analít ico a resolver.
Cuando el análisis crom at ográfico se realiza con el horno sit uado a una t em perat ura fij a, se
dice que la operación es isot érm ica. Si por el cont rario la t em perat ura varia siguiendo una
ciert a ley ( m ediant e el program ador) se dice ent onces que el análisis se realiza con
program ación de t em perat ura.
La t em perat ura que m ás afect a la separación crom at ográfica es la del horno. Considerem os
que t ant o la t em perat ura de la cám ara de inyección com o la del det ect or son adecuadas
para resolver un problem a y analicem os solam ent e la del horno. Cada com puest o t iene una
t em perat ura con la cual se opt im iza su paso a t ravés de la colum na. Com o es lógico, en una
m uest ra con varios const it uyent es diferent es, habrá que elegir una t em perat ura con la cual
se crom at ografien bien t odos ellos. Esa t em perat ura se encuent ra experim ent alm ent e. Si se
est á t rabaj ando isot érm icam ent e a una t em perat ura dada y la resolución de algunos picos es
insuficient e, da m uy buenos result ados dism inuir est a. Con ello se logra que se haga m ás
m arcadas las pequeñas diferencias de solubilidad hacia la fase líquida que pudieran t ener los
const it uyent es que eluyen m uy próxim os, diferenciándose sus valores de K. Est o es
suficient e para m ej orar la resolución.
La figura 10.7 m uest ra el efect o de la t em perat ura sobre la separación crom at ográfica.
Figu r a 1 0 .7 . Efe ct o de la t e m pe r a t u r a sobr e la se pa r a ción cr om a t ogr á fica . N ót e se qu e a l

a u m e n t a r la t e m pe r a t u r a dism in u ye n los t ie m pos de r e t e n ción ( t r ) de los com pu e st os
se pa r a dos a sí com o t a m bié n e l e n sa n ch a m ie n t o de ba n da . En e l e j e m plo con side r a do e s
be n e ficioso in cr e m e n t a r la t e m pe r a t u r a por cu a n t o se pr e t e n de dism in u ir los t r , sin
e m ba r go, e n e l ca so qu e se obt e nga n cr om a t ogr a m a s con picos sola pa dos a ba j os t ie m pos
de r e t e n ción , con ve n dr ía dism in u ir la t e m pe r a t u r a pa r a m e j or a r la r e solu ción .
Sin em bargo, la crom at ografía isot erm a no perm it e de form a general una adecuada
separación, cuando los com ponent es t ienen punt os de ebullición ( p.e.) m uy dist int os. A
baj as t em perat uras se separan bien las sust ancias de p.e. baj o, pero no las de p.e. alt o, que
perm anecen en la fase est acionaria. Por el cont rario, a t em perat uras elevadas los
especím enes de m ayor p.e. em ergen separados, pero las fracciones m ás volát iles pasan con
dem asiada rapidez, sin ser diferenciados. Por ot ra part e, la ebullición hace que los
com ponent es est én la m ayor part e del t iem po en fase de vapor y a t em perat uras m uy baj as
las m uest ras se difunden, dism inuyendo el núm ero de plat os t eóricos ( N) .
1 0 .3 .6 .1 . Cr om a t ogr a fía a t e m pe r a t u r a pr ogr a m a da

Est e es el m ét odo m ás difundido a causa de las vent aj as que ofrece, adem ás de ser
fácilm ent e pract icable por lo sencillo del equipam ient o. A diferencia del m ét odo isot érm ico,
en est e caso ocurre un aum ent o gradual de la t em perat ura de t odo el horno. El aum ent o de
la t em perat ura del horno en función del t iem po est á prefij ado por el operador del equipo de
acuerdo a experiencias previas sobre el com port am ient o de la m ezcla com plej a a resolver.
Por est o a est e m ét odo se le llam a crom at ografía a t em perat ura program ada.
Si por ej em plo al crom at ografiar una m ezcla con un rango am plio de punt os de ebullición se
usa el m ét odo isot érm ico, se obt endría un crom at ogram a com o el que m uest ra la figura
10.8 En est e por sim plicidad sólo se ha represent ado dos com ponent es de baj os, y dos de
alt os punt os de ebullición.
Figu r a 1 0 .8 . Cr om a t ogr a m a isot é r m ico de u n a m e z cla con dife r e n cia s gr a n de s e n los pu n t os

de e bu llición de los com pon e n t e s se pa r a dos.
La m ism a m ezcla puede crom at ografiarse a la t em perat ura T hast a que haya eluido el
com ponent e b y luego subir rápidam ent e la t em perat ura hast a un nuevo valor de
t em perat ura ( Tf) m ant eniéndola en est e hast a la t erm inación del análisis. El efect o
producido por la sim ple m odificación de la t em perat ura original se m uest ra en la figura 10.9
en donde, com o en la figura 5 se ha incluido el gráfico de T en función del t iem po.
Figu r a 1 0 .9 . Ca m bio e n e l va lor de la t e m pe r a t u r a de ope r a ción . S= se ñ a l de l solve n t e
Un segundo m odo de crom at ografiar la m ezcla es variando linealm ent e la t em perat ura en
función del t iem po com o se represent a en la figura 10.10.
Figu r a 1 0 .1 0 . Pr ogr a m a ción lin e a l de t e m pe r a t u r a .
Est e t ipo de program ación t iene m ucha im port ancia en análisis cualit at ivo debido a que por
ej em plo en una serie hom óloga los t r de sus com ponent es son función lineal del núm ero de
át om os de carbono de cada com puest o. Hay t am bién una relación cuant it at iva ent re los
t iem pos de ret ención y el núm ero de át om os de carbono de los com ponent es de una serie
hom óloga cuando est a se crom at ografía isot érm icam ent e, pero en est e caso la dependencia
es logarít m ica.
En los ej em plos ilust rados en las figuras 10.5 y 10.6 no se ha t enido en cuent a la alt eración
de la línea de base que siem pre t iene lugar cuando se m odifica la t em perat ura de operación.
Así, debido al aum ent o de la t em perat ura hay una volat ilización sust ancial de la fase
est acionaria, siendo arrast radas sus m oléculas hast a el det ect or, la respuest a del cual
provoca una desviación de la línea de base conocida com o deriva. La deriva es de
consideración cuando se t rabaj a a una t em perat ura superior al lím it e m áxim o recom endado
para cada fase est acionaria.
La program ación escalonada de la t em perat ura se usa cuando los com puest os est án
form ando dos o m ás grupos, bast ant e separados ent re si. La program ación lineal se em plea
cuando hay una dist ribución de los com puest os m ás o m enos regular en t odo el
crom at ógram a.
Debe señalarse que los program adores m odernos perm it en realizar program as escalonados
de ram pas de t em perat ura con alt a com plej idad, siendo fact ible una com binación de am bos
t ipos de program ación. En la figura 10.11 se m uest ra un program a com plej o de ram pas de
t em perat ura.
Figu r a 1 0 .1 1 . Pr ogr a m a com ple j o de ciclo de pr ogr a m a ción o r a m pa s de t e m pe r a t u r a s. I 1

r e pr e se n t a u n a ope r a ción isot é r m ica in icia l. L1 m u e st r a u n a sce n so lin e a l de la t e m pe r a t u r a ,
E r e pr e se n t a la e t a pa de e n fr ia m ie n t o. En la m a yor ía de los e qu ipos pu e de pr e fij a r se la s
t e m pe r a t u r a s y du r a cion e s de I 1 , I 2 , I 3 , e t c. Así com o la s ve locida de s de a sce n so de la
t e m pe r a t u r a e n la s e t a pa s L 1 , L2 , e t c., de n t r o de r a n gos ba st a n t e s a m plios.
La t em perat ura program ada se em plea cuando los com ponent es t ienen una diferencia
apreciable de los punt os de ebullición ( > 100 grados) y present a vent aj as apreciables debido
a que reduce el t iem po de análisis, produce picos m ás delgados y present a m ej or
reproducibilidad cuant it at iva, especialm ent e en los últ im os com ponent es que eluyen.
1 0 .3 .7 . El de t e ct or
Gracias al desarrollo de det ect ores cada vez m ás sensibles y select ivos ha sido posible a la
crom at ografía gaseosa abarcar cam pos m uy diversos del análisis quím ico orgánico. Han sido
num erosos los t ipos dist int os de det ect ores que se ha ideado para “ det ect ar” y m edir las
bandas de vapor que eluyen de la colum na, basados en algunas propiedades del gas
port ador que se alt era por la presencia en él de los vapores de la m uest ra.
Los det ect ores crom at ográficos son los disposit ivos encargados de señalar la presencia y
m edir la concent ración ( o cant idad) de los solut os que eluyen de la colum na crom at ográfica.
Ellos pueden ser de dos t ipos fundam ent ales: int egrales y diferenciales.
Los det ect ores int egrales m iden la cant idad de un com ponent e eluido y la sum an a la
t ot alidad de los valores previam ent e obt enidos de ot ros com ponent es de una m ezcla
analizada.
Los det ect ores diferenciales m iden la variación inst ant ánea de alguna propiedad física del
gas port ador que se alt era por la presencia de un analit o en él. Est os det ect ores son los m ás
usados en la act ualidad.
Tant o los det ect ores diferenciales com o los int egrales pueden ser dest ruct ivos o no
dest ruct ivos. En los prim eros la m uest ra se dest ruye ( generalm ent e se quem a) en el
m om ent o de la m edición, m ient ras que en los segundos ést a abandona int act a el det ect or.
1 0 .3 .7 .1 . Ca r a ct e r íst ica s fu n da m e n t a le s de los de t e ct or e s.
Un det ect or ideal debe responder igualm ent e ant e cualquier analit o baj o cualquier condición
de t em perat ura, fluj o y presión. Algunos det ect ores poseen una propiedad cont raria a ést a,
es decir, responden ant e com puest os definidos baj o condiciones cont roladas.
Los crit erios de calidad generales que deben considerarse para t odo det ect or son: A.
Est abilidad, B. Sensibilidad y lím it e de det ección, C. Respuest a lineal, D. Tiem po de
respuest a y E. Volum en int erno
A. Est a bilida d
Teóricam ent e la respuest a del det ect or en ausencia de m uest ra, es decir, cuando a t ravés de
él est á pasando solam ent e el gas port ador provenient e de la colum na, debe ser una línea
rect a horizont al. Debido a la presencia en dicho gas port ador de im purezas y t razas de fase
est acionaria, así com o a causa de desequilibrio t érm ico, la línea de base puede present ar
desviaciones inst ant áneas ( ruido) , adem ás de desviaciones de la horizont alidad ( deriva) , que
ocurren a m ediano y largo plazo.
Tant o el ruido com o la deriva son fact ores que dificult an la buena operación de un det ect or.
La deriva se corrige en la m ayoría de los casos dándole un t iem po suficient e de
calent am ient o al sist em a de det ección ( incluido am plificador y regist ro) . Por m anipulación
del am plificador puede corregirse la deriva cuant as veces sea necesario. Mayor im port ancia
analít ica t iene el ruido de fondo, ya que est e lim it a la cant idad m ínim a det ect able de un
analit o.
Aunque producen deriva de la línea de base no se consideran com o fact ores de inest abilidad
las variaciones de t em perat ura, presión y/ o caudal no previst as. Est os se consideran com o
defect os del equipo.
B. Se n sibilida d y lím it e de de t e cción
La sensibilidad es la caract eríst ica que t iene un det ect or de responder ant e pequeñas
cant idades de solut o. Si R es la respuest a ant e una cant idad Q, se define la sensibilidad S
com o:
∆R
S=
∆Q
En la cual ∆R est á expresada en m V y ∆Q en ng ( pueden usarse ot ras unidades) . La
cant idad m ínim a det ect able est á relacionada con el ruido y la sensibilidad. Considerem os el
gráfico de la figura 10.12. La línea de t razos horizont ales es la línea de base t eórica. El t razo
cont inuo represent a la línea de base real ( con deriva) . Se considera ruido a la dist ancia
m áxim a ent re los desplazam ient os inst ant áneos del regist ro por encim a y por debaj o de la
línea de base.
Figu r a 1 0 .1 2 . Ru ido y de r iva

Si se conoce la sensibilidad ( S) , ent onces la cant idad m ínim a det ect able es:
Q min =
2R
S
o expresado de ot ra m anera Qmin es la m enor cant idad de un solut o que produce una señal
dist inguible del ruido de fondo.
C. Re spu e st a lin e a l
De t odas las propiedades del det ect or est a es una de las m ás im port ant es ya que est á
relacionada con la cuant ificación de los solut os. Hay un rango de concent raciones por encim a
y por debaj o del cual la respuest a del det ect or no es proporcional a la cant idad ( o
concent ración) de la m uest ra inyect ada.
Las causas de la no linealidad pueden ser de dos t ipos: debidas a sobrecarga de la colum na
y a la sat uración del det ect or.
Cuando se sobrepasa la capacidad de carga de una colum na, est o es, cuando la cant idad de
m uest ra es dem asiado grande, se aprecia est o en el crom at ógram a, ya que dej a de ser
lineal la relación t am año de m uest ra- alt ura de pico, adem ás, el t iem po de ret ención se
acort a respect o al valor del t r del m ism o com puest o, pero en el caso que no sat ura la
colum na; en est e caso el pico t iene un frent e casi vert ical, con una cola prolongada. Si por el
cont rario la colum na adm it e perfect am ent e la m uest ra inyect ada pero est a cant idad es
dem asiado grande para que el det ect or de una respuest a lineal, ent onces est o se reflej a en
el área del pico, la cual dej a de ser proporcional con el t am año de la m uest ra inyect ada.
Aunque el dat o del rango lineal es im port ant ísim o en análisis cuant it at ivo, los valores
report ados en la lit erat ura son solo indicat ivos ya que no dependen solam ent e del det ect or.
Pero m ás im port ant e aún, dependen adem ás del t ipo de det ect or, de sus caract eríst icas y
est ado de funcionam ient o.
Por t ales razones es im prescindible det erm inar el rango lineal de respuest a para el det ect or
en las condiciones en que se vaya a realizar el análisis. Para ello se inyect an iguales
volúm enes de soluciones del pat rón analít ico de la m uest ra que se vaya a analizar, de
concent raciones crecient es. Se grafica la concent ración ( o cant idad) de m uest ra inyect ada
cont ra la alt ura y el área de pico, det erm inándose a part ir de que valor de inyección dej a de
ser lineal la respuest a. En la práct ica se t rabaj a en la m it ad del rango para t ener un buen
m argen de seguridad que incluye la event ual suciedad del det ect or.
D . El t ie m po de r e spue st a
El t iem po de respuest a se define generalm ent e com o el lapso de t iem po que requiere un
det ect or para reaccionar ant e el 60 % del cam bio brusco de la concent ración del analit o en
el gas port ador.
En realidad el t iem po de respuest a no depende solo del det ect or sino del conj unt o llam ado
sist em a de det ección y regist ro ( det ect or, am plificador y regist rador) . El t iem po de
respuest a es m uy im port ant e en t rabaj os com plicados de separación en donde es
im prescindible que el sist em a de det ección sea capaz de det ect ar y regist rar los solut os
eluídos m uy próxim os ent re si. En los buenos det ect ores est e t iem po de respuest a es de 1
segundo o m enos. Cuando se describa en part icular los det ect ores, se hará referencia a est o
de nuevo.
E. Volu m e n in t e r no de l de t e ct or
Es una caract eríst ica del det ect or que depende de su diseño y const rucción. El volum en
int erno del det ect or ha de ser el m enor posible, ya que ést e afect a el t iem po de respuest a,
la sensibilidad, la resolución, la form a del pico y hast a el t iem po de ret ención.
1 0 .3 .7 .2 . D e scr ipción de l pr incipio y a plica cion e s de a lgu nos de t e ct or e s de gr a n
u so
En lo que sigue se describirá los det ect ores m ás ut ilizados en la act ualidad. Algunos de est os
t ienen ut ilidad am plia y diversificada en analít ica. Ot ros com o el t erm oiónico, debido a su
alt a select ividad, t ienen cont ados cam pos de aplicación, pero de ext raordinaria im port ancia,
com o son los m edicam ent os y los plaguicidas.
1 0 .3 .7 .2 .1 . D e t e ct or e s de con duct ivida d t é r m ica
Est os det ect ores, llam ados t am bién cát arom et ros o det ect ores de hilo calient e ( TCD, del
inglés Therm ical Conduct ivit y Det ect or) han sido usados ext ensam ent e hast a el surgim ient o
del det ect or de ionización por llam a, el cual le ha rest ado popularidad y aplicación. No
obst ant e, aquel cont inúa en uso, especialm ent e cuando no se requiere una sensibilidad
grande y si una buena est abilidad. Est os det ect ores son sim ples en su funcionam ient o,
est ables y versát iles.
El principio en que se basa el det ect or de conduct ividad t érm ica es el siguient e: el gas
port ador en est ado puro t iene una conduct ividad t érm ica a una t em perat ura det erm inada.
Cuando con el gas port ador llega vapor de un analit o al det ect or, la conduct ividad t érm ica
de est a m ezcla gaseosa es m enor que la del port ador puro. Un filam ent o que se encuent re a
una t em perat ura de equilibrio cuando pasa gas port ador solam ent e, se calent ará al pasar la
m ezcla port ador- m uest ra, ya que com o se señaló, su conduct ividad es m enor. Est e aum ent o
de la t em perat ura del filam ent o se t raduce en un increm ent o de su resist encia el cual es
proporcional a la concent ración del vapor de la m uest ra.
Hay ot ros det ect ores de conduct ividad que no ut ilizan filam ent os sino t erm ist ores. Est os son
sem iconduct ores que operan a la inversa del filam ent o, ya que al calent arse dism inuyen su
resist encia. Tam bién en est e caso la dism inución de la resist encia es proporcional al t am año
de la m uest ra inyect ada.
En la práct ica es poco preciso y difícil m edir la variación de la resist encia de un solo
filam ent o, razón por la cual en los det ect ores de est e t ipo se hace uso de dos colum nas
crom at ográficas iguales. Por una de est as pasa solam ent e gas port ador. Es la colum na
llam ada de referencia. Por la ot ra circula el gas port ador con la m uest ra que event ualm ent e
se inyect a. Am bas colum nas se conect an al m ism o det ect or cuyos elem ent os sensibles est án
dispuest os en form a de puent e Wheat st one, com o el represent ado en la figura 10.13, donde
se incluye el esquem a de un det ect or de conduct ividad t érm ica. Mediant e la resist encia
variable Rv se fij a la t em perat ura de los filam ent os ( de m edición y referencia) no debiendo
est ar ést a por encim a de 250 º C. Operando el bot ón AZ que no es m ás que ot ra resist encia
variable, se equilibra el circuit o. Con ello la aguj a del regist rador cae en escala. Cuando
j unt o con el gas port ador ent ra un solut o en la ram a de m edición, la conduct ividad de est a
m ezcla es m enor com o ya se indicó. El filam ent o ( o el t erm ist or) se calient a y su resist encia
sube ( o baj a) produciéndose un desbalance en el puent e, el cual se regist ra com o un pico.
Figu r a 1 0 .1 3 . D e t e ct or de con du ct ivida d t é r m ica ( TCD )

La conduct ividad t érm ica de los gases port adores y los com puest os orgánicos en general se
m uest ran en la t abla 10.5.
Tabla 10.5. Conduct ividad t érm ica de los gases port adores y de los com puest os orgánicos.
Ga s por t a dor Ca l/ cm .se g.gr a do x 1 0 5 a 1 0 0 º C

Argón 5,2
CO2 5,3
N2 7,5
He 41,6
H2 53,4
Com p. Orgánicos < 7 ( generalm ent e)
Los valores de conduct ividad t érm ica para la m ayoría de los com puest os orgánicos decrecen
con el aum ent o del peso m olecular de cada com puest o.
El t iem po de respuest a en est os det ect ores est á relacionado con las caract eríst icas
const ruct ivas, pudiendo variar desde 0,02 segundos hast a 10 segundos. En los det ect ores
de filam ent o, el t iem po de respuest a depende fundam ent alm ent e de la colocación de est os
dent ro del det ect or. Algunos filam ent os est án sit uados direct am ent e en la corrient e del gas
port ador y ent onces el t iem po de respuest a es m ínim o, pero se present a fenóm enos de
ruido ya que est án expuest os a las variaciones de presión y de fluj o. En ot ros casos los
filam ent os est án sit uados en una ram ificación de la colum na, en est e caso el t iem po de
respuest a es m ayor pero la est abilidad del det ect or es m uy buena.
En el caso especial de los det ect ores que ut ilizan t erm ist ores, el t iem po de respuest a es
adem ás inversam ent e proporcional al diám et ro del elem ent o sensible.
Por encim a de 100 º C se ut ilizan los det ect ores de hilo calient e, los cuales aum ent an la
sensibilidad con la t em perat ura. Por debaj o de 100 º C son m ás sensibles los det ect ores de
t erm ist ores.
Los det ect ores de conduct ividad t érm ica t ienen aplicación en la det erm inación de cualquier
t ipo de com puest os cuando no se requiera una sensibilidad alt a. No ha podido ser sust it uido
por el det ect or de ionización por llam a en la det erm inación de gases perm anent es.
El lím it e de det ección es del orden del m icrogram o ( µg) y el rango de respuest a lineal es
m uy am plio ( 10 4 - 10 5 ) .
1 0 .3 .7 .2 .2 . D e t e ct or de ion iza ción por lla m a
Est e t ipo de det ect or FI D ( del inglés Flam e I onizat ion Det ect or) se desarrolló a part ir de
1958 alcanzando act ualm ent e un am plio uso. Es m ucho m ás sensible que el de
conduct ividad t érm ica, m uy est able y versát il, aunque a diferencia del ant erior m encionado,
su influencia est á influida por la est ruct ura quím ica de los com puest os analizados.
El principio en que se basa est e det ect or es m uy sim ple. Una llam a de Hidrógeno produce
una ionización de las m oléculas gaseosas que la rodean. Si est a llam a se encuent ra en un
cam po eléct rico fuert e, los iones m igran de acuerdo a sus cargas respect ivas hacia los
elect rodos de carga opuest a, est ableciéndose una corrient e, la cual es débil. Sin em bargo,
cuando un com puest o carbonado se quem a en est a llam a, la form ación de iones es grande,
la corrient e producida es perfect am ent e m edible y dent ro de ciert os lím it es, proporcional a la
cant idad de com puest o que ha pasado por el det ect or.
Es int eresant e señalar que la respuest a de est e det ect or es nula en ausencia de oxígeno. Se
ha podido est ablecer que la energía de ionización proviene de la oxidación del carbono. Así
por ej em plo, un com puest o en el cual el carbono se encuent re parcial o t ot alm ent e oxidado,
no será det ect ado por el det ect or de ionización por llam a. La det ección se basa pues en un
fenóm eno físico- quím ico, específicam ent e t erm oquím ico. Por t al razón es lógico pensar que
la respuest a de est e det ect or est ará en part e condicionada por la est ruct ura quím ica de los
com puest os a analizar. De hecho así ocurre. Digam os por ej em plo que en dos m oléculas con
igual núm ero de át om os de carbono, la respuest a será m ayor en la m ás insat urada de
am bas. En series hom ólogas dist int as, en igualdad de m oles inyect ados, la respuest a del
det ect or será proporcional al núm ero de át om os de carbono de cada com puest o no unido
direct am ent e a oxígeno. La respuest a t am bién es m enor en la m edida en que hay
sust it uidos en la m olécula carbonos por het eroát om os.
El efect o de la est ruct ura quím ica sobre la sensibilidad del det ect or de ionización por llam a
es relat ivam ent e pequeño. Mayor im port ancia t iene la t em perat ura de la llam a y el volt aj e
aplicado. La t em perat ura de la llam a condiciona la form ación de iones, siem pre que la
cant idad de oxígeno present e no sea lim it ant e. Pero en realidad est o solo no produce un
aum ent o de sensibilidad. Se requiere un volt aj e adecuado, de m odo que la m ayoría de los
iones form ados lleguen a los elect rodos colect ores sin que ocurran fenóm enos de
recom binación iónica. En la m ayoría de los diseños de det ect ores de ionización por llam a la
colección de los iones form ados es m áxim a para un volt aj e aplicado de 250–300 V. Est e
volt aj e aplicado es un parám et ro const ruct ivo del det ect or que no puede variarse, de m odo
que si el analist a necesit a variar la sensibilidad de su det ect or, t endrá que variar los fluj os
de los gases, especialm ent e el del Hidrógeno o recurrir al am plificador elect rom ét rico. La
10.14 m uest ra el esquem a de un det ect or de ionización por llam a. El hidrógeno se m ezcla
con el gas port ador poco ant es de la ent rada al det ect or. El aire se hace llegar direct am ent e
al det ect or adquiriendo un fluj o lam inar después de pasar a t ravés de un difusor. De est a
form a se evit a que la llam a oscile, produciendo ruido de fondo.
Figu r a 1 0 .1 4 . D e t e ct or de ion iz a ción por lla m a ( FI D )

Est e det ect or t iene un t iem po de respuest a m uy pequeño, práct icam ent e responde de
inm ediat o ant e los com puest os que se quem an, razón por la cual es aplicable aún en caso de
separaciones difíciles. El ruido en condiciones norm ales de operación es baj ísim o. Su rango
lineal es m uy grande del orden de 10 5 . Su ut ilización no requiere de gases port adores m uy
puros. Adem ás se puede usar t odos los gases port adores, incluso el Hidrógeno. Las
m uest ras pueden inyect arse en cualquier solvent e que se quem e, pero preferent em ent e en
alcoholes, cet onas y est eres de baj a m asa m olecular. En algunos casos se ha usado agua
com o solvent e para inyect ar la m uest ra, sin det erioro y/ o m erm a de la calidad de la
respuest a.
Com o se ha m encionado, su uso es general, aunque su respuest a es pobre para com puest os
carbonados con het eroát om os en su est ruct ura, principalm ent e el cloro. No responde ant e
com puest os t ales com o los gases nobles, CO2 , O2 , CS2 , COS, SO2 , NO, N2 O, NO2 , NH3 , et c.
El lím it e de det ección de est e det ect or es de 10 - 8 g pero en el t rabaj o cot idiano, donde
verdaderam ent e rinde frut os, es en la det erm inación de cant idades m ayores, del orden de
los m icrogram os.
1 0 .3 .7 .2 .3 . D e t e ct or de ca pt u r a e le ct r ón ica
El det ect or de capt ura elect rónica ( ECD, del inglés Elect rón Capt ure Det ect or) ) Es un
det ect or de ionización alt am ent e sensible aunque su select ividad es baj a. Por t al razón ha
sido usado en cam pos m uy diversos del análisis y de la quím ica en general. Es un arm a m uy
út il en la det erm inación de t razas de com puest os con afinidad elect rónica, especialm ent e los
organoclorados.
El principio de operación de est e det ect or es inverso al de los det ect ores de ionización
descrit os. Una fuent e “ F” radiact iva ( Ni 63 , Sr 90 ó Trit io, ( figura 10.15) em it e elect rones los
cuales ionizan las m oléculas del gas port ador que at raviesa la cám ara. Las m oléculas de gas
port ador se conviert en en em isores secundarios, produciéndose una corrient e de elect rones
que es capt ada en el ánodo, el cual est á a un pot encial posit ivo respect o a las paredes
em isoras. Est a corrient e elect rónica es llam ada corrient e de fondo y es del orden de 10 - 9
Am peres para la m ayoría de los det ect ores, aunque es un parám et ro de diseño.
Figu r a 1 0 .1 5 . D e t e ct or de ca pt u r a e le ct r ón ica ( ECD )

Debido a su poca m asa, los elect rones son rápidam ent e colect ados por el ánodo, m ient ras
que se form a una zona de iones posit ivos de gas port ador e im purezas ionizadas, los cuales
m igran lent am ent e hacia las paredes radiact ivas de la fuent e F. Baj o condiciones de
equilibrio operacional, en el det ect or se form an dos zonas com o las represent adas en la
cit ada figura 11. Cuando un com puest o con afinidad elect rónica ent ra en la cám ara de
ionización, capt a elect rones y ent onces dism inuye el valor de la corrient e de fondo. Baj o
ciert as condiciones el valor de est a dism inución es proporcional a la cant idad de solut o que
pasa por la cám ara y a su afinidad elect rónica.
Los iones negat ivos del com puest o t am bién pueden colect arse en el ánodo pero en realidad
est o ocurre poco ya que los elect rones se m ueven m ucho m ás rápidam ent e. Adem ás hay
posibilidad de neut ralización de las cargas en la zona posit iva. De hecho el det ect or de
capt ura elect rónica hace uso de est a recom binación iónica de m odo que el fenóm eno de la
det ección sea lo m ás posible de capt ura elect rónica pura.
Una vez que ocurrió la recom binación iónica y que las m oléculas de analit o abandonaron el
det ect or, se rest ablece el equilibrio eléct rico, volviendo a t om ar la corrient e de fondo su
valor norm al.
La t abla 10.6 m uest ra las afinidades elect rónicas para un grupo de com puest os, así com o
los valores esperados en caso que una m olécula posea en su est ruct ura un núm ero
det erm inado de át om os de halógenos, grupos nit ro, et c.
Tabla 10.6.
Com puest os o grupos con afinidad elect rónica
Com pue st o Coe ficie n t e de a dsor cion e le ct r ón ica

• Hidrocarburos alifát icos
• Hidrocarburos arom át icos
• Alcoholes < 0,1
• Aldehídos
• Cet onas
• Com puest os m onoclorados
•
0,1 – 10
Com puest os t rifluorados
• Com puest os diclorados
•
10 – 100
Com puest os m onobrom ados
• Com puest os t riclorados
• Com puest os dibrom ados
• Com puest os m onoyodados 100 – 1000
• Com puest os m ononit ros
• Com puest os alquil- m et ales
• Com puest os t et raclorados
• Com puest os t ribrom ados
•
1000 - 10000
Com puest os diyodados
• Com puest os dinit ros
Los valores de la t abla son un índice de la respuest a relat iva de los com puest os relacionados
en ella. Sin em bargo hay que t ener m uy en consideración, por ej em plo, que un com puest o
t et raclorado no necesariam ent e posee una sensibilidad m ayor que uno t riclorado o diclorado.
Est o es ciert o solo en el caso que lleguen al det ect or cant idades equivalent es de est os
com puest os ( suponiendo que no se descom pongan, adsorban o ret engan de m odo diferent e
en su paso a t ravés de la colum na) .
De inm ediat o se puede recom endar com o solvent es para capt ura elect rónica t odos aquellos
com prendidos en el prim er grupo ( con coeficient e de adsorción< 0,1) . Es requisit o que el
solvent e que se ut ilice est é lo m ás seco posible ya que el agua produce una respuest a del
det ect or que afect a la det erm inación que se realiza.
El rango lineal de est e det ect or es m uy pequeño del orden de 10 2 - 10 3 . Depende com o es
nat ural del com puest o específico.
La sensibilidad es grande. El lím it e de det ección es del orden de los picogram os. Sin
em bargo, en los t rabaj os ordinarios, el lím it e de det ección est á det erm inado por el grado de
purificación de los ext ract os a analizar, encont rándose ent re las décim as y las cent ésim as de
nanogram o para los organoclorados.
1 0 .3 .7 .2 .4 . D e t e ct or t e r m oión ico
Est e det ect or es una m odificación del de ionización por llam a. Fue int roducido en 1964.
Sufrió m odificaciones y perfeccionam ient os sucesivos hast a la fecha. Su aplicación est á
lim it ada a un grupo de com puest os ya que est e es alt am ent e select ivo. Debido a su elevada
sensibilidad, ha sido ut ilizado en la det erm inación de t razas de est eres fosfóricos y
com puest os nit rogenados, de t ant a im port ancia en biom edicina, bioquím ica y quím ica de
plaguicidas.
Las m odificaciones y perfeccionam ient os t ecnológicos en el desarrollo del det ect or
t erm oiónico se adelant aron algo a los conocim ient os t eóricos que explican su principio. No
obst ant e se sabe que cuando se quem a un com puest o orgánico que t iene en su est ruct ura
át om os de P, N, S o halógeno, en presencia de vapores de una sal de sodio, de pot asio,
rubidio o cesio se produce una corrient e iónica m uy grande si se com para con la ionización
que debía esperarse en caso de un det ect or de llam a norm al.
La respuest a del det ect or t erm oiónico depende del het eroát om o present e y de su cant idad.
En igualdad del núm ero de het eroát om os, la respuest a del DTI ( det ect or t erm oiónico)
respect o a un com puest o orgánico carbonaceo puro equim olar es 10 veces superior para
com puest os con cloro o azufre; de 100 – 150 veces cuando el het eroát om o es nit rógeno y
ent re 1000 y 10000 veces m ayor cuando el com puest o t iene fósforo en su est ruct ura.
Expresando lo m ism o de ot ra form a. Supongam os que un ést er fosfórico cont iene solo P
com o het eroát om o y el rest o de su est ruct ura son át om os de carbono. Cuando est e
com puest o se analiza con un DTI produce, por ej em plo, una alt ura de pico de 5 cm para 1
ng de m uest ra. Un com puest o análogo, pero con N en lugar de P requiere de 7 ng – 10 ng
para dar una respuest a equivalent e; si el het eroát om o fuera Cl o S, ent onces se requerirían
unos 100 ng; unos 1000 ng de com puest o puro serían necesarios com o m ínim o para dar un
pico análogo al del com puest o fosforado.
La figura 10.16 m uest ra un esquem a del diseño de un det ect or t erm oionico.
Figu r a 1 0 .1 6 . D e t e ct or t e r m oión ico

Respect o a la select ividad de la respuest a del DTI y el t ipo de sal usado, los result ados
obt enidos han sido cont radict orios. Se plant ea por algunos aut ores que la sensibilidad hacia
com puest os nit rogenados aum ent a cuando se usa sales de rubidio, pero ot ros señalan las
sales de Cesio com o las m ej ores para los órganofosforados.
Los det ect ores t erm oiónicos responden específicam ent e ant e cada com puest o de acuerdo a
su com posición quím ica part icular. I nfluye sobre t odo el núm ero de át om os de P, N, S, Cl,
et c, pero t am bién la est ruct ura del com puest o, aunque est a en m enor grado. Por est as
razones, al cuant ificar una señal obt enida con un DTI se requiere disponer del pat rón
analít ico o del dat o de respuest a relat iva del com puest o respect o a un pat rón conocido.
Debido a la sensibilidad alt a y select ividad de respuest a, los ext ract os para analizar por DTI
no requieren una purificación rigurosa. En la m ayoría de los casos se pueden analizar
direct am ent e sin previa purificación.
1 0 .3 .7 .2 .5 . D e t e ct or fot om é t r ico de lla m a
El det ect or fot om ét rico de llam a ( DFLL) puede ser usado en la det erm inación de com puest os
orgánicos de fósforo y la única vía práct ica cuando se requiere det erm inar com puest os
órganoazufrados. En efect o, el det ect or fot om ét rico, en su m odalidad de det ección de
fósforo ( DFLL–P) es uno de los det ect ores de crom at ografía de gases m ás select ivos. Sin
em bargo, en su m odalidad de azufre ( DFLL–S), es m enos select ivo pues, cant idades grandes
de com puest os organofosforados pueden int erferir en la det erm inación. Tam bién en est a
m odalidad la respuest a es lineal solam ent e en escala sem ilogarit m ica. No obst ant e, est e
det ect or es m uy út il en el análisis cualit at ivo por su select ividad elevada, especialm ent e
cuando se requiere confirm ar la ident idad de un analit o en base a la relación de las
respuest as P/ S.
La m uest ra llega al det ect or y se quem a en una llam a de Hidrógeno, en una at m ósfera rica
en oxigeno. Cuando la m uest ra es un com puest o órgano fosforado u órganoazufrado genera
una em isión ópt ica t ípica, al descom ponerse en la llam a de Hidrógeno.
Esa radiación se filt ra a t ravés de un filt ro de int erferencia de banda est recha. Si el filt ro
seleccionado t iene una t ransm it ancia m áxim a a 526 nm , correspondient e a la longit ud de
onda de em isión del product o HPO, perm it e la det ección de com puest os organofosforados, si
el filt ro perm it e el paso de radiación a 394 nm , perm it e la det ección de com puest os
orgánicos de azufre. La luz filt rada a t ravés de cualquiera de los filt ros de int erferencia llega
a un t ubo fot om ult iplicador, el cual la conviert e en una respuest a eléct rica.
La figura 10.17 m uest ra un esquem a sim plificado de un det ect or fot om ét rico de llam a.
Figu r a 1 0 .1 7 . D e t e ct or fot om é t r ico de lla m a

En algunos equipos, el filt ro de int erferencia es int ercam biable. El analist a puede sust it uir el
de fósforo por el de azufre con facilidad. Hay det ect ores que t ienen inst alados los dos filt ros.
Cualquiera de ellos, acorde a la m uest ra que se analiza, puede sit uarse, m ediant e una
m anipulación sim ple, en la posición para hacer la m edición.
La respuest a del det ect or fot om ét rico de llam a en su m odalidad de fósforo es de 10 4 a 10 5
veces m ayor respect o a la respuest a al carbono. La select ividad de la det erm inación de
organofosforados en presencia de int erferencias organoazufradas es m enor y depende
considerablem ent e de la concent ración del cont am inant e, por lo que debe det erm inarse con
pat rones analít icos.
La select ividad, S/ C varía considerablem ent e con la concent ración del órganoazufrado. Para
valores alt os de est os com puest os, la relación de respuest as S/ C es grande ( 10 5 – 10 6 ) ,
m ient ras que si la concent ración de la m uest ra es baj a, est a relación es solo 10 4 .
Algo análogo ocurre con la respuest a a com puest os de azufre en presencia de
organofosforados. En est e caso la select ividad S/ P est á en el rango 10 1 – 10 4 , dependiendo
de la concent ración del organofosforado. En est e caso t am bién es preciso det erm inar la
concent ración int erferent e y su influencia sobre la respuest a requerida del det ect or.
La sensibilidad de est e det ect or en los dos m odos ( P, S) es m uy buena, aunque el lím it e de
det ección para organofosforados es 3 o 4 veces m ás baj o que para com puest os de azufre.
Debido a la est abilidad alt a y al ruido baj o de est e det ect or, se alcanza lím it es de det ección
m uy baj os, del orden de 0,01 ng para organofosforados y 0,04 ng – 0,05 ng para
com puest os orgánicos de azufre.
El rango lineal de respuest a en la m odalidad de fósforo es de 10 4 . El rango correspondient e
para órganoazufrados es m enor. La respuest a en la m odalidad S no es lineal pero est o no es
un inconvenient e. Los equipos m odernos linearizan aut om át icam ent e la señal expresandola
com o la raíz cuadrada. Algunos analist as prefieren t rabaj ar con la señal no m odificada y
graficarla direct am ent e en papel sem ilog cont ra la m asa de m uest ra inyect ada, lo cual es
m ás exact o.
1 0 .3 .7 .2 .6 . Acopla m ie n t o Cr om a t ogr a fía Ga se osa – Espe ct r oscopia de M a sa s ( GC-
M S) .
El prim er int ent o report ado de acople direct o CG – MS fue llevado a cabo por Gohlke en
1959 pero es preciso recordar que por ent onces t odavía no se habían desarrollado las
colum nas capilares, por lo que los fluj os de gas port ador eran grandes, y era preciso adem ás
usar split t ers para int roducir fracciones que fueran com pat ibles con el MS. Ya en 1968,
Scalan describió la ut ilidad del acople CG Capilar – MS. La elevadísim a resolución de la
crom at ografía gaseosa capilar perm it ía la int roducción de com puest os m uy puros ( m uy
resuelt os) , en volúm enes gaseosos pequeños, com pat ibles con los sist em as de vacío de los
MS en uso por ent onces. Est e desarrollo fue asist ido t am bién desde épocas t em pranas, por
el uso de las com put adoras, que aunque no t enían las posibilidades de las de hoy fueron
decisivas para prom over el desarrollo alcanzado en el present e.
En la act ualidad el desarrollo alcanzado en la elect rónica, las com put adoras y la m ecánica
fina ha perm it ido la fabricación de crom at ógrafos gaseosos acoplados a espect rógrafos de
m asas m uy com pact os, pequeños y fáciles de operar.
En el epígrafe 9.3.6.7 del capít ulo 9, se t rat ó acerca de la im port ancia analít ica del
acoplam ient o HPLC–MS) , y se dio una explicación del principio de funcionam ient o de un
espect róm et ro de m asas.
En el acoplam ient o GC- MS j uega un papel im port ant e la int erfase que perm it e el acople de
la m asa gaseosa a la salida de la colum na capilar con la fuent e iónica del espect róm et ro de
m asas.
Durant e el paso a t ravés de la int erfase, el efluent e de la colum na crom at ográfica pierde
presión ( desde la at m osférica a la salida de la colum na, hast a el valor de vacío requerido por
la fuent e de ionización del MS) . En est e proceso se elim inan fundam ent alm ent e las
m oléculas del gas port ador ( t ienen una difusión m ayor debido a su m asa m olecular baj a) y
llegan a la fuent e de ionización casi exclusivam ent e las m oléculas que corresponden a un
t iem po de ret ención dado. Por est o t iene m ucha im port ancia la nat uraleza del gas port ador
que se use. Teóricam ent e con hidrógeno se obt iene los m ej ores result ados pues su difusión
es m uy grande. Pero su uso siem pre est á asociado al riesgo de explosión en am bient es
cerrados. Por est a razón, el uso del Helio es la opción m ás razonable ya que t iene una
difusión m ucho m ayor que la del Nit rógeno.
Han sido desarrollados dist int os t ipos de int erfase que cum plen m ás o m enos con los
requisit os expuest os pero que no cont inúan en uso por el desarrollo de ot ras m ás eficient es.
Ent re las prim eras m erecen m encionarse el separador de vidrio poroso y el diafragm a de
gom a de silicona.
Hast a el present e se ha ut ilizado el principio de la diferencia en difusión ent re el gas
port ador y la m uest ra. En est e sent ido, el efluent e de la colum na se hace pasar por un
orificio m uy pequeño sit uado en una lám ina m et álica fina. Separado de est a se encuent ra
una lám ina igual con un orificio idént ico al prim ero y alineado con est e. En el t rayect o ent re
am bos orificios, las m oléculas del gas port ador difunden lat eralm ent e. La difusión lat eral es
m ínim a en las m oléculas de la m uest ra y la m ayoría de ellas cont inúan en línea rect a y
at raviesan el segundo orificio. De est a form a se logra un enriquecim ient o grande baj o
condiciones apropiadas de operación ( indicadas por el fabricant e) . Est e m ism o principio se
aplica m ucho act ualm ent e en la int erfase conocida com o “ j et separat ors” const ruidos de
vidrio.
I ngeniosa t am bién es la int erfase const it uida por un t ubo capilar de pared fina y porosa, de
Teflón el cual est á rodeado por un “ j acket ” o cám ara conect ada a una bom ba de vacío. Las
m oléculas de gas port ador son forzadas por el vacío a at ravesar las paredes del t ubo capilar
de Teflón m ient ras que las de la m uest ra cont inúan su viaj e hacia la fuent e de ionización,
pues sus diám et ros m oleculares, son m uy superiores a los poros del Teflón. Ent re las
vent aj as del m ét odo se señalan su alt o rendim ient o y robust ez pero t iene la desvent aj a de
dist orsionar las bandas crom at ográficas y t ener una t em perat ura de operación crít ica. Con el
m ism o principio se ha usado el acero y la plat a m icroporosas.
De m odo análogo al acoplam ient o HPLC- MS, en un sist em a GC- MS se regist ra un
crom at ogram a de corrient e iónica t ot al ( TI C) cont ra el t iem po de ret ención. Puede t am bién
regist rarse la corrient e de un ión caract eríst ico de cada com ponent e de la m uest ra, cont ra el
t iem po: est e m ét odo se denom ina SI M por sus siglas anglosaj onas ( select ive ion m onit oring)
El rango lineal de respuest a del sist em a CG – MS es grande, superior a 10 4 , m ient ras que el
lím it e de det ección depende del sist em a que se use para capt ar la inform ación ( TI C, SI M) .
Pero aun con la m odalidad m enos sensible, est e acoplam ient o perm it e una det ección en el
orden de las decenas de pg para una variedad grande de com puest os.
1 0 .3 .8 . Am plifica dor
La señal producida por el det ect or de nat uraleza eléct rica o t ransform able en ella, es
am plificada m ediant e un accesorio adecuado llam ado elect róm et ro, que perm it e variar
dent ro de am plios m árgenes la señal que envía al regist rador.
1 0 .3 .9 . Re gist r a dor
Es un accesorio elect rom ecánico que t ransform a el im pulso eléct rico enviado por el
elect róm et ro y lo conviert e en im pulso m ecánico. Ést e im pulso m ecánico se regist ra
gráficam ent e originando el crom at ógram a. Com o un com plem ent o m ás cost oso puede
usarse un int egrador. Ést e equipo, elect rónico o elect rom ecánico, perm it e una cuant ificación
de la señal generada por el det ect or, ahorrando el t rabaj o que el analist a debe realizar y que
m ás t arde se explicará. En la act ualidad, soft wares especializados en com put adoras de gran
capacidad y rapidez perm it en la capt ación, alm acenam ient o y procesam ient o de t oda la
inform ación que se origina en el det ect or. De est a form a el analist a puede realizar
aut om át icam ent e t odas las operaciones que se hacían m anualm ent e ( la det erm inación de
los t iem pos de ret ención, el cálculo de las alt uras y áreas de t odos los picos del
crom at ógram a) , pero adem ás hacer superponer crom at ógram as correspondient e a análisis
realizados en m om ent os y con m uest ras diferent es, rest ar la cont ribución del blanco de
react ivos y blanco de m uest ras si fuera necesario ent re ot ras operaciones.
La figura 10.18 m uest ra un crom at ógrafo del año 2004 com ercializado por la firm a alem ana
Agilent Technologies.
Figu r a 1 0 .1 8 . Cr om a t ógr a fo ga se oso de la fir m a Agile n t Te ch n ologie s, 2 0 0 4

1 0 .4 . Tr a t a m ie n t o de m ue st r a s e n cr om a t ogr a fía de ga se s
Com o ya se ha plant eado la crom at ografía de gases se aplica en la separación de
com puest os volát iles o volat ilizables, es decir se pueden separar y analizar sust ancias
gaseosas o en fase de vapor. Si las m uest ras se vaporizan dent ro del inst rum ent o, es m ás
apropiado hablar de crom at ografía en fase de vapor.
De form a general, a m ayor peso m olecular m ayor punt o de ebullición. Solo el 20 % de los
com puest os orgánicos poseen presiones de vapor elevadas y pesos m oleculares m enores de
500 lo que los hace volát iles a las t em perat uras de operación del crom at ógrafo de gases y
perm it e su análisis. Por ot ra part e, debe señalarse que m uchas sust ancias que en su form a
m onom érica t ienen pesos m oleculares baj os, pueden a t ravés de puent es de hidrógeno
int erm oleculares, form ar conglom erados de varias unidades, ya sea ent re m oléculas de la
m uest ra, o ent re ellas y el solvent e, convirt iéndose en especies no volát iles y difíciles de
analizar por crom at ografía de gases.
Es por ello que en el análisis por crom at ografía de gases es com ún som et er la m uest ra a
reacciones quím icas previas con vist a a obt ener derivados con m ej ores propiedades
crom at ográficas. Las caract eríst icas generales del proceso de derivat ización serán abordadas
a cont inuación.
1 0 .4 .1 . D e r iva t iza ción
El obj et ivo general de la derivat ización es, com o ya se m encionó, m ej orar las propiedades
crom at ográficas de los com puest os a separar por crom at ografía de gases. Las razones para
acom et er est e proceso pueden resum irse en los siguient es aspect os:
• En prim er lugar la derivat ización se realiza con vist as dism inuir el punt o de ebullición de
los com puest os a separar m ediant e la disociación de los puent es de hidrógeno, es decir
obt ener derivados m ás volát iles que los com puest os nat ivos u obt ener derivados volát iles
a part ir de com puest os que en su est ado nat ivo no lo son.
• Dism inuir la ret ención de los com ponent es de alt a polaridad en la colum na, previniendo
así el coleo. Est o puede lograrse dism inuyendo la polaridad de los analit os a separar o
derivat izando los grupos silanol que se form an en la superficie de la sílice de la colum na,
con hexam et ildisilazano y/ o clorot rim et ilsilano.
• Mej orar la separación los com ponent es de la m uest ra, o propiciar la resolución de
m ezclas de enant ióm eros.
• En el proceso de derivat ización los analit os adquieren nuevas propiedades físicas y
quím icas, lo cual puede m ej orar las propiedades de det ección, ya sea con la producción
de la señal o con el increm ent o de la sensibilidad de un det ect or det erm inado.
• Finalm ent e en la m ayoría de las m uest ras los com puest os volát iles est án present es en
concent raciones m uy baj as y form ando part e de una m ezcla com plej a. Todos aquellos
com puest os que t am bién est án present es en la m at riz, en una concent ración sim ilar o
m ayor, pueden de una u ot ra form a int erferir en la det erm inación. La conversión en
sust ancias derivadas con diferent e est ruct ura quím ica perm it e su diferenciación del rest o
de los com ponent es de la m at riz.
Las reacciones de derivat ización m ás usadas en crom at ografía de gases son las de
est erificación, alquilación, acilación, silanización y acet ilación.
Al valorar la fact ibilidad de derivat izar m uest ras para crom at ografía gaseosa debe
considerarse que:
• El t iem po para concluir una reacción depende de la presión, la react ividad de los agent es
em pleados, la nat uraleza de los disolvent es, y la est ruct ura de los analit os que se
quieren derivat izar.
• Es necesario conocer la pureza de los react ivos y disolvent es, así com o la est abilidad y
volat ilidad de los derivados.
• Es m uy im port ant e ext rem ar precauciones durant e los t rat am ient os t érm icos, para
dism inuir o evit ar pérdidas, especialm ent e si ya se obt uvo el derivado volát il.
• Mient ras m ayor sea la m anipulación de la m uest ra, m enor exact it ud y precisión se t endrá
en el análisis.
• Las sust ancias de elevada polaridad, que t ienen pares elect rónicos no com part idos, y
poseen hidrógenos act ivos de O- H, N- H o S- H, form an puent es de hidrógeno lo que
dificult a no solo su vaporización sino t am bién su separación en la colum na
crom at ográfica. En est e caso, la opción para suprim ir est as asociaciones, es sust it uir los
hidrógenos act ivos por grupos alquilo, acilo o silano. Con el fin de increm ent ar la rapidez
y el rendim ient o de las reacciones es frecuent e el uso de react ivos clorados, o m ej or
aún, fluorados
• La derivat ización de com puest os que poseen m ás de un t ipo de hidrógeno act ivo, com o
es el caso de los am inoácidos, puede im plicar: la alquilación del carboxilo y la acet ilación
del grupo am ino.
• Debe t enerse present e que las posiciones bencílicas y alílicas pueden experim ent ar
rupt uras t érm icas. Si est o sucede, los picos del crom at ogram a son art efact os que se
deben a la pirólisis. Aunque es poco probable, si hay presencia de oxígeno se puede
producir com bust ión.
• Diversos com puest os com o los fenoles, barbit úricos y est eroles, que en el pasado se
t enían que derivat izar para analizarlos usando colum nas em pacadas, act ualm ent e se
det erm inan sin derivar em pleando colum nas capilares
• En el análisis de sust ancias no volát iles, pero sí solubles, es m ej or em plear m ét odos de
HPLC
Un resum en de los agent es derivat izadores m ás em pleados en crom at ografía gaseosa se
m uest ra en la t abla 10.7
Tabla 10.7.
Algunos react ivos derivat izadores y sus aplicaciones en crom at ografía de gases.
Am in oá cidos
Est e r oide s
Vit a m ina s
Alcohole s
Azú ca r e s
Fe nole s
Am in a s
Ácidos
Re a ct ivos de r iva t iza dor e s
Anhídrido hept afluorobut írico X X X X X X

Anhídrido t rifluoroacét ico X X X X
Bis( t rim et ilsilil) acet am ida X X X X X X X X
Bis( t rim et ilsilil) t rifluoroacet am ida X X X X X X X X
Trifluoruro de boro m et anol X X
Clorot rim et ilsilano X X X X X X X
Hexam et ildisilazano X X X X X X X
Triclorom et ilsilano X X
N- t rim et ilsililacet am ida X X X X X X X X
1 0 .4 .2 . Té cn ica s e m ple a da s pa r a la e x t r a cción de com pone nt e s volá t ile s.

Las sust ancias volát iles responsables del arom a y sabor de los alim ent os generalm ent e
est án present es en concent raciones t razas y en m at rices com plej as com o son los propios
alim ent os. Por t ant o, la preparación de la m uest ra y la preconcent ración de los analit os se
hacen necesarias para su post erior análisis.
Muchas son las t écnicas de aislam ient o ut ilizadas para la ext racción de com ponent es
volát iles en diferent es m at rices, ent re ellas pueden m encionarse: la ext racción direct a con
disolvent e, dest ilación- ext racción con disolvent e sim ult áneas, análisis del espacio de cabeza
dinám ico y la m icroext racción en fase sólida ( SPME, del inglés Solid Phase Micro Ext ract ion) .
La t écnica de ext racción direct a con disolvent e, com o su nom bre lo indica consist e en
ext raer los analit os de int erés con un disolvent e adecuado y post erior concent ración de los
m ism os para su inyección en el crom at ógrafo.
La t écnica de dest ilación- ext racción sim ult áneas ( DES) se fundam ent a en el aislam ient o de
los com puest os m ediant e una dest ilación con vapor com binada con una ext racción
sim ult ánea en un aparat o apropiado.
La t écnica de análisis del espacio de cabeza dinám ico no ut iliza disolvent es y consist e en el
arrast re con un gas inert e de purga y ret ención en una t ram pa con adsorbent e desde la cual
se int roduce el el crom at ógrafo de gases.
Las t écnicas que requieren el uso de disolvent es, com o la ext racción líquido- líquido y la
dest ilación- ext racción sim ult áneas son en ocasiones com plicadas, consum idoras de
disolvent es de alt a pureza y de t iem po. El em pleo de la t écnica del análisis del espacio de
cabeza dinám ico puede elim inar el uso de disolvent es; sin em bargo, requiere para la
desorción t érm ica de los volát iles ret enidos en la fase sólida que los inyect ores de los
crom at ógrafos de gases sufran m odificaciones ext ensas o la adición de cost osos m ódulos de
desorción.
De ahí que en la act ualidad est é t om ando m ucho auge la t écnica de m icroext racción en fase
sólida, cuyas generalidades se describen a cont inuación.
1 0 .4 .2 .1 . M icr oe x t r a cción e n fa se sólida
La m icroext racción en fase sólida ( SPME) para crom at ografía de gases, desarrollada por
Pawlizyn en 1990, es una t écnica de preparación de la m uest ra, que present a algunas
diferencias respect o al procedim ient o explicado en el epígrafe 9.5.2. para el caso de HPLC.
En prim er lugar SPME para el análisis de com puest os volát iles se realiza sin el em pleo de
solvent es, ut ilizando una fibra de cuarzo, colocada en la aguj a de una j eringa especial y en
est e caso cubiert a con una fase est acionaria apropiada, ( lo que represent a una segunda
diferencia con respect o a HPLC, en el que la fase est acionaria est á cont enida en el int erior de
un capilar) . El analit o ( o analit os) en la m uest ra es direct am ent e ext raído y concent rado en
el recubrim ient o de la fibra para su post erior inyección en el crom at ógrafo. La figura 10.19
m uest ra un esquem a de la j eringa con la fibra de vidrio recubiert a de fase est acionaria.
Figu r a 1 0 .1 9 . Je r in ga con la fibr a de vidr io r e cu bie r t a de fa se e st a cion a r ia
En la SPME para com puest os volát iles, pueden em plearse dos t écnicas para la ext racción de
los analit os:
1. Técnica de inm ersión direct a ( DI - SPME) , en la que la fibra es direct am ent e sum ergida en
la m uest ra líquida haciendo cont act o con el disolvent e.
2. Técnica de espacio de cabeza ( HS- SPME) , en la que la fibra es expuest a a la fase vapor
sobre la m uest ra sin hacer cont act o con el disolvent e. Est o se logra colocando la fibra en
el espacio de cabeza del recipient e que cont iene la m uest ra. La m uest ra se calient a y los
com puest o volát iles se adsorben o absorben a la fibra. Est a t écnica prolonga la vida út il
de la fibra porque la m ism a no est á en cont act o direct o con la m uest ra.
La eficiencia de la ext racción con cada t écnica depende de las propiedades de los analit os y
la m at riz a analizar. En general, la DI - SPME es m ás sensit iva que la HS- SPME para analit os
predom inant em ent e present es en un líquido. Sin em bargo, la HS- SPME es adecuada para la
ext racción de analit os m ás volát iles en la m ayoría de las m uest ras gaseosas, líquidas y
sólidas.
La figura 10.20 ilust ra de form a sim plificada el proceso de ext racción de volát iles m ediant e
el análisis del espacio de cabeza por m icroext racción en fase sólida ( HS- SPME) y post erior
desorción en un crom at ógrafo de gases.
Figu r a 1 0 .2 0 . Pr oce so de e x t r a cción de volá t ile s m e dia n t e H S- SPM E

y post e r ior de sor ción t é r m ica
Est e m ét odo t rae consigo un ahorro de t iem po de preparación y cost os por no uso de
disolvent es, así com o m ej ora los lím it es de det ección. Est a t écnica ha sido ut ilizada en
com binación con la crom at ografía de gases ( GC) y la crom at ografía de gases- espect rom et ría
de m asas ( GC- MS) y exit osam ent e aplicada a una am plia variedad de com puest os,
part icularm ent e para la ext racción de com puest os orgánicos volát iles y sem ivolát iles del
m edio am bient e, biológicos y de los alim ent os. La efect ividad en la preconcent ración del
analit o depende de varios parám et ros ent re ellos t ipo de fibra, m odo de ext racción ( DI -
HPME o HS- HPME) y desorción de los analit os en la fibra, t iem po y t em perat ura de
ext racción, presencia de sales, los cuales es necesario est ablecer previam ent e.
A. Tipo de fibr a
De m anera general se puede decir que dist int os t ipos de fases est acionarias son em pleadas
para la ext racción de los analit os. La afinidad de la fibra por un analit o depende del principio
“ lo sím il disuelve a lo sím il” . En general, los com puest os volát iles requieren una capa de
polím ero gruesa y los sem ivolát iles una capa m ás fina. Adem ás las fibras recubiert as con
capas gruesas requieren un m ayor t iem po part a lograr el equilibrio de ext racción, pero
aport an m ayor sensibilidad debido a la m ayor m asa del analit o que puede ser ext raído.
La fibra apolar de polidim et ilsiloxano ( PDMS) es preferida para la ext racción de sust ancias
no polares com o lo son m uchos com puest os volát iles del arom a; sin em bargo, puede
t am bién usarse para com puest os m ás polares, part icularm ent e después de opt im izar las
condiciones de operación.
La fibra m ás polar, poliacrilat o ( PA) , es preferida para la ext racción de analit os m uy polares,
part icularm ent e fenoles y alcoholes. Fibras con m ezclas de fases cont eniendo copolím eros de
divinilbenceno ( DVB) o soport e de carbón act ivado ( CAR: Carboxen) increm ent an la
capacidad de ret ención debido al efect o pot encial de adsorción y dist ribución de la fase
est acionaria. Las fibras de PDMS- DVB, CAR- DVB y Carbowax ( CW: poliet ilenglicol) - DVB
pueden ser ut ilizadas para la ext racción de analit os polares y de baj o peso m olecular. La
t abla 10.8 relaciona los dist int os t ipos de fibras, así com o sus principales caract eríst icas.
Tabla 10.8.
Caract eríst icas de las fibras de SPME disponibles ( Supelco, 1999)
Gr osor Te m pe r a t ur a
Fa se e st a ciona r ia Pola r ida d
( µm ) m á x im a ( º C)
100 280
Polidim et ilsiloxano ( PDMS) Apolar 30 280
70 340
Polidim et ilsiloxano/ divinilbenceno 65 270
Sem ipolar
( PDMS/ DVB) 60 270
Poliacrilat o ( PA) Polar 85 320
75 320
Carboxen/ polidim et ilsiloxano ( CAR/ PDMS) Sem ipolar
85 320
65 265
Carbowax/ divinilbenceno ( CW/ DVB) Polar
70 265
B. Te m pe r a t u r a y t ie m po de e x t r a cción
El t iem po de ext racción es principalm ent e det erm inado por la velocidad de agit ación y el
coeficient e de part ición del analit o ent re la fase de la fibra y la m uest ra. La agit ación
m agnét ica acelera la t ransferencia de los analit os de la m uest ra al recubrim ient o de la fibra.
Aunque la SPME t iene una sensibilidad m áxim a en el punt o de equilibrio, no es necesario
alcanzar el equilibrio para m ediciones exact as y precisas debido a la relación lineal exist ent e
ent re la cant idad de analit o adsorbida ( o absorbida) por el recubrim ient o de la fibra y la
concent ración inicial en la m uest ra en condiciones de no- equilibrio. Es por ello que por lo
general se acost um bra a fij ar un t iem po de pre- ext racción ( en ocasiones m al llam ado de
equilibrio) para garant izar ciert a est abilización de la concent ración de los analit os en la fase
vapor, así com o de la t em perat ura del sist em a.
Con el obj et ivo de increm ent ar la concent ración de los analit os en la fase gaseosa durant e la
HS- SPME, la m uest ra es generalm ent e calent ada. Un increm ent o de la t em perat ura de
ext racción causa un aum ent o de la velocidad de ext racción y sim ult áneam ent e una
dism inución de la const ant e de dist ribución. Por t ant o, debe ser ut ilizada una t em perat ura
que conduzca a una sensibilidad y velocidad de ext racción sat isfact orias.
El t iem po de exposición es m uy significat ivo. Un m ayor t iem po favorece la ocupación de

m ayor cant idad de sit ios en la fibra por las m oléculas del analit o, pero un t iem po prolongado
cuando t odos los sit ios est án cubiert os no afect a la eficiencia de la preconcent ración y en
ocasiones puede causar la desorción.
El t iem po y la t em perat ura de ext racción son parám et ros est recham ent e relacionados el uno
con el ot ro y un increm ent o en la t em perat ura proporciona un cort o t iem po de exposición, lo
cual cont ribuye a dism inuir el t iem po de det erm inación.
C. Efe ct o de la a dición de sa l
La eficiencia de la ext racción es t am bién m ej orada m ediant e la adición de alguna sal soluble
en la m uest ra. El cloruro de sodio, bicarbonat o de sodio, carbonat o de sodio y sulfat o de
am onio son las sales m ás usadas para est e propósit o. En principio la sobresat uración de la
m uest ra con sales es m ás efect iva para la ext racción e los analit os por la fibra debido al
efect o salt ing- out . Se debe t ener en cuent a que est e efect o depende de cada analit o en
part icular y de la concent ración de la sal en la m uest ra.
D . D e sor ción de los a n a lit os
La desorción t érm ica eficient e de los analit os en el inyect or del crom at ógrafo es dependient e
de la volat ilidad del analit o, grosor del recubrim ient o de la fibra, profundidad del inyect or,
t em perat ura del inyect or y el t iem po de exposición. Generalm ent e la t em perat ura de
desorción ópt im a es aproxim adam ent e igual al punt o de ebullición del analit o m enos volát il.
El t iem po de desorción depende de la t em perat ura del inyect or y del fluj o alrededor de la
fibra. El cont rol de est e t iem po es im port ant e si se quieren lograr result ados con alt os
recobrados y reproducibles.
1 0 .5 . Aplica cion e s a na lít ica s de la cr om a t ogr a fía de ga se s
Los procedim ient os para realizar el análisis cualit at ivo y cuant it at ivo en crom at ografía de
gases son análogos a los em pleados en HPLC y que fueron explicados con det alle en el
capít ulo correspondient e. La t abla 10.9 m uest ra un resum en de los m ism os.
Tabla 10.9.
Mét odos de ident ificación y cuant ificación em pleados en HPLC y GC
M é t odos de ide nt ifica ción M é t odos de cu a n t ifica ción

1. Com paración de los t iem pos de ret ención 1. Pat rón ext erno
2. Enriquecim ient o de pico 2. Curva de calibración
3. Acoplam ient o con espect rom et ría de m asas 3. Pat rón int erno
4. Norm alización int erna
Sin em bargo en el caso de la crom at ografía gaseosa se em plean con ciert a frecuencia ot ros
procedim ient os de ident ificación los cuales se describen brevem ent e a cont inuación.
1 0 .5 .1 . Uso de colum n a s de dife r e n t e pola r ida d

Cuando un problem a de ident ificación se hace difícil por los m ét odos indicados da buenos
result ados usar colum nas de polaridades diferent es. Al variar la nat uraleza quím ico- física de
la colum na es lógico esperar una int eracción pat rón FE diferent e a la int eracción m uest ra FE.
Ut ilizando por lo m enos dos colum nas de diferent e polaridad, los result ados que se obt ienen
son seguros. Son m uy pocos los com puest os que se com port an igual baj o est as condiciones.
El ensayo se hace m ás riguroso aún si adem ás se incluye el fact or t em perat ura. Est o es, si
se t rabaj a con dos o m ás colum nas a dos o m ás t em perat uras diferent es.
1 0 .5 .2 . Ut iliza ción de va r ios de t e ct or e s
El uso de det ect ores select ivos facilit a m ucho la labor ident ificat iva. Así por ej em plo, si un
com puest o se det ect a sat isfact oriam ent e usando un det ect or de capt ura elect rónica o uno
t erm iónico, la ident ificación se facilit a m ucho ya que la relación de las respuest as para la
m uest ra en los dos det ect ores t iene que ser la m ism a que la relación correspondient e del
pat rón. Si est o es así, se puede afirm ar con una buena probabilidad de cert idum bre que la
m uest ra y pat rón son el m ism o com puest o.
Veam os un ej em plo: Un com puest o X se det ect a por capt ura elect rónica dando un pico de 4
cm de alt ura. Se analiza a cont inuación con un det ect or t erm oiónico, originando un pico de
10 cm de alt ura. El t r y el ancho del pico de la m uest ra en la sem ialt ura coinciden bast ant e
bien con el del m et hyl parat hion, t ant o en el det ect or de capt ura elect rónica com o en el
t erm oiónico, obt eniéndose alt uras de picos de 3 y 7.5 cm respect ivam ent e. La relación de
las alt uras de la m uest ra en los dos det ect ores es 10/ 4= 2.5 y la del pat rón 7.5/ 3= 2.5. Con
est os result ados la ident ificación queda concluida. El m ét odo descrit o aunque sencillo y
rápido t iene sus requisit os para poderlo aplicar. En efect o, se requiere que t ant o el pat rón
com o la m uest ra est én en el rango lineal de respuest a de am bos det ect ores, cosa que se
puede det erm inar con facilidad haciendo algunas diluciones e inyecciones de am bos en los
dos det ect ores. El segundo requisit o es t am bién elem ent al, ha de inyect arse volúm enes
iguales de m uest ra y pat rón en am bos det ect ores. Tam bién la m uest ra y el pat rón han de
disolverse en el m ism o solvent e.
Ot ra posibilidad de usar dos det ect ores select ivos la t enem os cuando se present a un
com puest o organofosforado con un grupo P= S, cuyas propiedades son m uy sem ej ant es a las
de un pat rón organofosforado pero con grupo P= O. Si en est e caso se usa un det ect or
fot om ét rico de llam a con filt ro de fósforo, se obt iene respuest as para la m uest ra y el
pat rón, pero si el filt ro usado es el de azufre, se obt endrá una sola respuest a ( la m uest ra)
excluyendo de inm ediat o la supuest a ident idad.
1 0 .5 .3 . Pa r t ición se gu ida de cr om a t ogr a fía ga se osa
Est e m ét odo es m uy út il y sim ple. Una cant idad de m uest ra y una cant idad sem ej ant e de
pat rón analít ico se part iciona por separado en dos solvent es A y B poco m iscibles ent re sí.
Se inyect a por separado volúm enes iguales del ext ract o de A, de la m uest ra y del pat rón. Se
hace lo m ism o con el ext ract o B. Finalm ent e se calcula las const ant es de repart o de la
m uest ra y del pat rón. La igualdad de est a const ant e en el ensayo descrit o confirm a la
ident idad de la m uest ra. Es requisit o realizar el m ét odo expuest o de m odo igual para la
m uest ra y el pat rón respect o a volúm enes de A y B, t iem po de agit ación ( ext racción) y
t em perat ura.
1 0 .5 .4 . Tr a n se st e r ifica cion
Es un m ét odo m uy usado cuando los com puest os se crom at ografían en form a de ést eres.
Por lo general la est erificación en la m ayoría de los m ét odos analít icos ut iliza com o agent e el
diazom et ano ( o un precursor de est e) o el sulfat o de dim et ilo. En am bos casos se origina el
ést er m et ílico del com puest o invest igado, En est e caso la confirm ación se realiza
t ransest erificando el ést er, por ej em plo usando alcohol but ílico. El procedim ient o det allado
es el siguient e. Teniendo en cuent a la sensibilidad de det ección del m ét odo, se t ransfiere
una cant idad suficient e de m uest ra a un t ubo de ensayo de 25 m l. Se evapora el solvent e y
se añade 0,5 m l de n- but anol, se agit a y a cont inuación se añade 0,5 m l de ácido sulfúrico
concent rado, se t apa y calient a sobre baño de vapor durant e 5 m inut os agit ando
ocasionalm ent e, se enfría y quit a la t apa y se añade 15 m l de agua agit ando
reposar varios m inut os. Se inyect a 5 µL del sobrenadant e. El m ét odo se realiza t am bién con
vigorosam ent e. Se añade 0,5 m l – 1,0 m l de isooct ano ( ó n- Hexano) . Se agit a y dej a
los pat rones. El t r del nuevo ést er debe ser m ayor e igual para m uest ra y pat rón.
1 0 .5 .5 . D e spla za m ie n t o de u n pico por m odifica ción qu ím ica
Se ha desarrollado m ét odos específicos de confirm ación de com puest os por crom at ografía
gaseosa que im plican una m odificación quím ica de est os, los que ocasionan desaparición de
un pico en algunos casos, m ient ras que en ot ros hay m odificación de los t r, debido a
alt eraciones quím icas de los analit os.
Son pocos los com puest os para los cuales hay procedim ient os de est e t ipo, sin em bargo
debido a su elevada especificidad se le ha concedido cada vez m ayor im port ancia.
Considerem os el ej em plo siguient e, el cual ayudará a apreciar la im port ancia del m ét odo. Al
con los de los isóm eros α y β endosulfan. Con vist as a confirm ar la presencia del referido
analizar una m uest ra present ó dos picos cuyos t r y anchura en la sem ialt ura coincidieron
insect icida se t ransfiere a un balón de 100 m l; 600 ng de α y 560 ng de β endosulfan. Se

evapora el solvent e y se añade 10 m l de solución et anólica de KOH al 2 % . La m ezcla se
refluj a 12 m inut os. Al cabo de ese t iem po, se dej a enfriar y se diluye con 100 m l de agua,
ext rayéndose con 20 m l de n- Hexano. El n- Hexano se seca por sulfat o de sodio ( cant idad
est a solución se inyect a 5 µL. En el nuevo crom at ogram a ha desaparecido el α y el β

m ínim a) y se concent ra a sequedad diluyéndose a 1 m l con n- Hexano o acet at o de et ilo. De
endosulfan, pero se present a un pico con un t r que es aproxim adam ent e la sem isum a de los
desaparición de los picos sospechosos de ser α y el β endosulfan y la aparición de un solo

t r de los dos isóm eros. El ensayo se realiza con la m uest ra en idént icas condiciones. La
pico con t r int erm edio ent re los ant eriores, confirm an la presencia en el ext ract o del
endosulfan.
Bibliogr a fía .
1. Ahuj a S. ( 1992) Trace and Ult rat race Analysis by HPLC, Chem ical Analysis. Vol. 115.
Wiley. New york.
2. Alissandrakis, E.; Daferera, D.; Tarant ilis, P. A; Polissiou, M. y Harizanis, P. ( 2003) .
C. Ult rasound- assist ed ext ract ion of volat ile com pounds from cit rus flower and cit rus
honey. Food Chem ., 82, 575- 582.
3. Bouset a, A.; Collin, S. y Doufour, J- P. ( 1992) . Charact erist ic arom a profiles of unifloral
honeys obt ained wit h a dynam ic headspace GC- MS syst em . J. Apic. Res., 31, 96- 109.
4. Carasek, E. y Pawliszyn, J. ( 2006) . Screening of t ropical fruit volat ile com pounds using
solid- phase m icroext ract ion ( SPME) fibers and int ernally cooled SPME fiber. J. Agric.
Food Chem ., 54, 8688- 8696.
5. Ceballos, L. Desarrollo de un m ét odo de m icroext racción en fase sólida para la
det erm inación de com puest os volát iles en m iel de abej as. ( 2007) . Tesis en opción del
t ít ulo de Mast er en Ciencia y Tecnología de los Alim ent os. I nst it ut o de Farm acia y
Alim ent os. Universidad de La Habana. Cuba.
6. Crem er, F. y Prior, F. ( 1951) . Z. Elect rochem ., 55, 66.

8. Fit zgerald, G.; Jam es, K.J.; Macnam ara, K. y St ack, M.A. ( 2000) . Charact erizat ion of
whiskeys using solid- phase m icroext ract ion wit h gas chrom at ography- m ass
spect rom et ry. J. Chrom at ogr. A, 896, 351–359.
9. Gasco, L. ( 1969) . Teoría y práct ica de la crom at ografía en fase gaseosa. Publicaciones
Cient íficas de la Junt a de Energía Nuclear. Madrid.
10. Harold M. Mc Nair H. M and J. M. Miller ( 1997) Basic Gas Chrom at ography Wiley, New
York.
11. Harold M. Mc Nair, H. M and J. M. Miller ( 1997) . Basic Gas Chrom at ography. Wiley. New
York.
12. Hesse, G y col. ( 1941) . Liebigs Ann. Chem ., 546, 251.
13. Kat aoka, H.; Lord, H. L. y Pawliszyn, J. ( 2000) . Applicat ions of solid- phase
m icroext ract ion in food analysis. J. Chrom at ogr. A, 880, 35–62.
14. MALDI – TOF Syst em Technical. Lit erat ure. HPG 2025 ( 1994) . Hewlet t Packard,
Burlingt on. M. A. and San José. Ca.
15. Mart in, A. y Jam es, A. ( 1952) . Biochem . J. 50, 679.
16. Mest res, M.; Mart i, M. P.; Bust o, O. y Guasch, J. ( 2000) . Analysis of low- volat ilit y
organic sulphur com pounds m icroext ract ion and gas chrom at ography. J. Chrom at ogr. A,
881, 583–590.
17. Niessen M. A. and J. Van der Greef ( 1992) . Líquid chrom at ography m ass spect rom et ry.
Chrom at ographic Science Series 58 Marcel Dekker. New York.
18. Pawliszyn, J. ( 1997) . Solid Phase Microext ract ion: Theory and Pract ice. Wiley- VCH, New
York.
19. Pawliszyn, J. ( 1999) . Applicat ions of Solid- Phase Microext ract ion. Royal Societ y of
Chem ist ry, Cam bridge, 3- 21.
20. Pawliszyn, J. y Art hur, C. L. ( 1990) . Solid phase m icroext ract ion wit h t erm al desorpt ion
used fused silica opt ical fibers. Anal. Chem ., 62, 2145- 246.
21. Pest icide Analyt ical Manual Vol. I – I V. Food and Drug Adm inist rat ion ( FDA) 3 er
Edit ion ( 1994)
22. Pino, J. ( 2007) . Charact erizat ion of rum using solid- phase m icroext ract ion wit h gas
chrom at ography- m ass spect om et ry. Food Chem ., 104, 421- 428.
23. Pino, J.; Mart í, M. P.; Mest res, M.; Pérez, J.; Bust o, O. y Guasch, J. ( 2002) . Headspace
solid- phase m icroext ract ion of higher fat t y acid et hyl est ers in whit e rum . J.
Chrom at ogr. A, 954, 51- 57.
24. Radovic, B. S.; Careri, M.; Mangia, A.; Musci, M.; Gerboles, M. y Anklam , E. ( 2001) .
Cont ribut ion of dynam ic headspace GC- MS analysis of arom a com pounds t o aut hent icit y
t est ing of honey. Food Chem ., 72, 511- 520.
25. Sides, A.; Robards, K. y Helliwell, S. ( 2000) . Developm ent s in ext ract ion t echniques and
t heir applicat ion t o analysis of volat iles in foods. Trends in Analyt ical Chem ist ry, 19,
322- 330.
26. Snow, N. H. y Slack, G. C. ( 2002) . Head space analysis in m odern chrom at ography.
Trends in Analyt ical Chem ist ry, 21, 608- 617.
27. Snyder L. R., J. J. Kirkland and J. L. Glaj ch ( 1997) . Pract ical HPLC Met hod Developm ent .
Second Edit ion. John Wiley and Sons I NC. New York, Chichest er, Weinheim , Brisbane,
Singapore, Toront o.
28. Sobdeva E. ( 2000) . Basic Theory and use of GC- MS. FAO/ I AEA Training and Reference
Cent re for Food and Pest icide Cont rol. Publicado por I nt ernat ional At om ic Energy
Agency. Vienna, Aust ria.
29. Spanier, A. H.; Shahidi, F.; Parlim ant , T. H.; Mussinan, C.; Ho, C.- T. y Trat ras, E.
( 2002) . Food flavors and chem ist ry: advances of t he new m illennium . Food Res. I nt .,
35, 898- 899.
30. Supelco. Solid- phase m icroext ract ion fiber assem blies, 1999. [ En línea] . Disponible en:
www.sigm aaldrich.com . Fecha de consult a: Diciem bre, 2008.
31. Wardencki, W.; Michulec, M. y Cury, J. ( 2004) . A review of t heoret ical and pract ical
aspect s of solid- phase m icroext ract ion in food analysis. I nt . J. Food Sci. Technol., 39,
703–717.
11 Cromatografía en capa delgada
La Crom at ografía en Capa Delgada ( CCD o TLC, del inglés Thin Layer Chrom at ography) ,
conj unt am ent e con la crom at ografía en colum na abiert a, fue una de las prim eras t écnicas
crom at ográficas em pleadas en el laborat orio, no solo por su sim plicidad sino t am bién por su
baj o cost o y posibilidades de aplicación ilim it adas en la m ayoría de los cam pos de la quím ica
analít ica m oderna.
Sin em bargo, hast a la década de los ‘90 el desarrollo de la inst rum ent ación para la
aplicación de la crom at ografía en capa delgada, se vio considerablem ent e em pobrecido, no
correspondiendo su im port ancia con el diseño de nuevos y m ás m odernos inst rum ent os que
fueran perfeccionando est a t écnica y le perm it iera increm ent ar su especificidad y
especialm ent e su exact it ud desde el punt o de vist a cuant it at ivo, siendo considerada por la
m ayoría de los analist as com o un m ét odo puram ent e cualit at ivo, sin grandes pret enciones
en cuant o a la cuant ificación de los analit os a det erm inar.
Un fact or que vino a cont ribuir grandem ent e a ello fue la aparición de los m ét odos de
crom at ografía gas- líquido ( GLC, del inglés Gas Liquid Chrom at ography) y post eriorm ent e la
rápida evolución de la crom at ografía líquida de alt a resolución ( HPLC, del inglés High
Perform ance Liquid Chrom at ography) a part ir de las experiencias y el desarrollo de la t eoría
de la crom at ografía en colum na, a la que rápidam ent e la m ayoría de los analist as se
aficionaron debido a la gran pot encialidad que represent aban, no solo desde el punt o de
vist a cualit at ivo y cuant it at ivo sino t am bién por las posibilidades de aut om at ización y rapidez
que poseían est as t écnicas con respect o a la CCD.
Ot ra cuest ión que t am bién influenció fue el desarrollo de las t écnicas acopladas GLC- EM y
GLC- I R para la crom at ografía gaseosa y la aparición de los det ect ores UV con arreglo de
diodos para HPLC, lo que aum ent ó ext raordinariam ent e la capacidad de ident ificación de los
eluat os, ya nosolam ent e por sus caract eríst icas de elución ( Tr) , sino t am bién por sus
caract eríst icas espect roscópicas.
Mient ras est o sucedía la CCD quedaba rezagada y aunque las t écnicas densit om ét ricas ya se
habían ut ilizado, las experiencias no eran m uy alent adoras, especialm ent e cuando para la
visualización del analit o era necesario em plear reacciones coloreadas, debido a que el fondo
de la placa int erfería considerablem ent e en est e t ipo de det erm inaciones, haciéndolas
im precisas, razón por la cual est a t écnica decayó considerablem ent e y solo se usaba en los
casos donde se usaba la det erm inación en la zona ult raviolet a. Aun en est e caso, la calidad
de las placas crom at ográficas em pleadas t raían problem as, ya que al no ser com plet am ent e
plana la superficie de sílicagel, la línea base del Crom at ogram a era irregular y no se
obt enían cuant ificaciones adecuadas.
Es por eso que en com paración con los ot ros m ét odos ya m encionados, la CCD se convirt ió
en una especie de “ cenicient a” y se ut ilizaba en m uchos casos solo com o un m ét odo auxiliar
de com probación de ot ros m ét odos analít icos.
Sin em bargo, a part ir de la década de los 80 y en especial a com ienzos de los 90, la CCD
resurgió de nuevo con una gran fuerza, y act ualm ent e est á com pit iendo con las t écnicas de
crom at ografía m ás avanzadas debido al gran desarrollo que ha experim ent ado el diseño y
com ercialización de t oda una gam a de equipos especializados que perm it en realizar t oda una
serie de operaciones no concebibles con ant erioridad, incluidas las t écnicas de cuant ificación
142
11. Crom at ogr afía en capa delgada
y de acoplam ient o com o result ado del gran desarrollo alcanzado por la densit om et ría de
scanning, la cual al ser acoplada a las t écnicas act uales de com put ación, ha devenido en un
poderoso inst rum ent o para los propósit os ant eriorm ent e m encionados. Hoy en día la CCD
puede rivalizar con HPLC y GLC, en m uchos casos aun hast a en aut om at ización.
Todo ello es t am bién el result ado del desarrollo inst rum ent al alcanzado en cada una de las
et apas involucradas en el proceso crom at ográfico que caract erizan la CCD. Así, la
espect acular evolución de la CCD ha est ado condicionada por el desarrollo t ecnológico
int roducido en las placas crom at ográficas los sist em as de aplicación de m uest ras, los
t anques de desarrollo de las placas, los sist em as de revelado de las m uest ras y hast a los
sist em as de docum ent ación los que en algunos casos pueden com pet ir con vent aj as con
HPLC y GLC.
1 1 .1 . Ge n e r a lida de s
Com o en el caso de cualquier t ipo de crom at ografía la separación de un com puest o por
crom at ografía en capa delgada t iene lugar ent re dos fases, una de las cuales es m óvil y la
ot ra est acionaria. A diferencia de la crom at ografía en colum na en CCD la fase est acionaria
est á dispuest a en form a de una película fina sobre una superficie plana, m ient ras que la fase
m óvil asciende o desciende según el caso a t ravés de la capa m at erial que const it uye la fase
est acionaria.
En CCD la fase m óvil es siem pre líquida y la fase est acionaria puede ser un sólido con una
alt a superficie específica o un líquido ret enido en la est ruct ura de un sólido m ás o m enos
inert e. Así, la CCD puede ser líquido- sólido o líquido- líquido.
De form a general el procedim ient o de t rabaj o en CCD at raviesa las siguient es et apas:
A. Pr e pa r a ción de la pla ca cr om a t ogr á fica : El adsorbent e se ext iende sobre una lám ina
plana ( de vidrio o alum inio generalm ent e) en form a de película fina form ando ant es una
suspensión en agua u ot ro líquido apropiado. En general se usa un aglut inant e para
favorecer la adhesión del adsorbent e a la placa soport e garant izando que la capa result ant e
t enga un espesor uniform e ( figura 11.1) . Una vez ext endida la suspensión se dej a evaporar
el exceso de agua para lo cual puede usarse un secado en est ufa a t em perat uras superiores
a 100 º C.
Figu r a 1 1 .1 . D isposición de la fa se e st a cion a r ia e n la pla ca
B. Aplica ción de la m u e st r a : La m uest ra o m uest ras a crom at ografiar se aplican a 1.5 cm

de uno de los bordes de la placa, conj unt am ent e con soluciones de pat rones conocidos con
vist a su post erior ident ificación. La aplicación de las soluciones de la m uest ra y los pat rones
se realiza ut ilizando m icropipet as, m icroj eringuillas o m icrocapilares, en la línea de origen, a
la dist ancia del borde ya señalado. Cada aplicación debe est ar separada lat eralm ent e a una
dist ancia suficient e de las aplicaciones cont iguas para evit ar que los com ponent es de la
m uest ra y los pat rones se superpongan ( figura 11.2) .
Figu r a 1 1 .2 .Aplica ción de la m u e st r a y los pa t r on e s
Una vez aplicada la m uest ra y los pat rones debe dej arse evaporar el solvent e de los punt os
de aplicación lo cual puede realizarse con aire frío o con aire calient e en dependencia de la
labilidad de los com ponent es.
C. D e sa r r ollo de l cr om a t ogr a m a : Consist e en hacer pasar la fase m óvil ( solvent e de
corrida) a t ravés de la fase est acionaria. Para ello se coloca la placa en una cám ara cerrada
que cont iene el solvent e ( o sist em a de solvent es) que se usará en el desarrollo del
crom at ogram a. La profundidad del solvent e no debe ser superior a 1 cm de m anera que
nunca los punt os de aplicación se sum erj an en la fase m óvil para evit ar su disolución en ella.
Una vez colocada la placa dent ro de la cám ara crom at ográfica, el solvent e asciende por
capilaridad arrast rando a los solut os que com enzarán a separarse en función de las
diferencias de afinidad por la fase m óvil y la fase est acionaria. Aquellos m ás afines a la fase
m óvil se m overán con m ayor velocidad y recorrerán una m ayor dist ancia. La figura 11.3.
m uest ra un esquem a de una vist a lat eral de un desarrollo ascendent e com o el que se ha
explicado.
Figu r a 1 1 .3 . D e sa r r ollo a sce n de n t e
La corrida crom at ográfica se int errum pe cuando el frent e del solvent e haya alcanzado una
dist ancia de 10 a 15 cm desde la línea de aplicación. En est e inst ant e se saca la placa de la
cám ara y se perm it e que el solvent e se evapore, pudiendo usarse una corrient e de aire
calient e para acelerar el secado.
D . Re ve la do: La det ección de los com puest os separados se realiza m ediant e m ét odos
físicos o quím icos que perm it an visualizar la posición de los m ism os en la superficie de la
capa. Los com ponent es separados aparecen inm ovilizados en la placa com o m anchas, t al y
com o se m uest ra en la figura 11.4.
La ident ificación se realiza de m odo sencillo com parando las dist ancias de recorrido de los
com ponent e de la m uest ra con las dist ancias de recorrido de los diferent es pat rones
aplicados. Es requisit o de ident idad ent re un com ponent e de la m uest ra y un pat rón dado
que am bos t engan iguales dist ancias de recorrido en la placa.
Figu r a 1 1 .4 . Cr om a t ogr a m a r e ve la do de un a m u e st r a de 5 com pon e n t e s. N ót e se qu e 4 de

e llos h a n podido se r ide n t ifica dos, cor r e spon dié n dose con los pa t r on e s P2 , P3 , P4 y P5 .
Vé a se a de m á s qu e e l com pon e n t e de la m u e st r a de m a yor a fin ida d con la fa se e st a cion a r ia
( qu e m ost r ó e l m e n or r e cor r ido) n o pu do se r ide n t ifica do e n e st a cor r ida pu e st o qu e su
dist a n cia de r e cor r ido no coin cide con la de n in gu n o de los pa t r on e s a plica dos. Así m ism o e l
pa t r ón P1 n o e st á pr e se n t e e n la m u e st r a .
A cont inuación se abordará con m ás det alle las caract eríst icas fundam ent ales de cada una
de las et apas del proceso de separación por CCD.
1 1 .2 . N a t ur a le za de l pr oce so cr om a t ogr á fico
En crom at ografía en capa delgada se pueden poner de m anifiest o los m ecanism os de
separación por adsorción, repart o e int ercam bio iónico, en función de la nat uraleza de la
fase est acionaria em pleada. Los fundam ent os de est os m ecanism os ya fueron explicados en
el epígrafe 7.7 del capít ulo 7, por lo que no se abordarán nuevam ent e.
El proceso de separación en una placa crom at ográfica, con independencia de la fase
est acionaria ut ilizada, ocurre de la siguient e m anera:
Una vez que la placa se int roduce en la cám ara crom at ográfica ( t om em os com o ej em plo un
desarrollo ascendent e) , el solvent e o sist em a de solvent es t ransit a por la m ism a a causa de
fuerzas capilares. Cuando est a fase m óvil llega al lugar de aplicación, los com puest os allí
deposit ados son arrast rados con el solvent e hacia arriba; sin em bargo, t an pront o com o est o
ocurre los analit os desplazados se ponen en cont act o con la fase est acionaria en ot ro punt o
de la placa sit uado m ás arriba est ableciéndose un equilibrio del solut o ent re am bas fases
est e proceso se repit e de form a infinit a en cada punt o del recorrido de un com puest o a
t ravés de la capa y aquí ent ran en acción las diferencias de las propiedades físicas de los
diferent es analit os, que a fin de cuent as dependen de su est ruct ura. Los que t ienen m ayor
afinidad por la fase est acionaria serán ret enidos por est a, quedándose rezagados respect o a
aquellos que t ienen m enor afinidad. Así, com o consecuencia de la int eracción solut o- FE y
solut o- FM cada solut o recorrerá una dist ancia definida en la capa. Com o en general las
propiedades físico- quím icas de los dist int os com ponent es de una m ezcla no son las m ism as,
cada uno ocupará una posición diferent e en su recorrido a t ravés de la capa. El result ado es
la resolución o separación de los com ponent es de la m ezcla, cada uno de los cuales aparece
en la placa com o una m ancha m ás o m enos redonda, sim ét rica, casi siem pre difusa hacia los
bordes. Hay ocasiones en que est as m anchas son alargadas en form a de elipse, horizont al o
vert icalm ent e y en casos ext rem os pueden present arse prolongaciones, denom inadas colas,
las cuales son causadas fundam ent alm ent e por sobrecarga del com puest o aplicado.
1 1 .3 . Pla ca s cr om a t ogr á fica s
Los soport es m ás em pleados en los que se encuent ra ext endida la capa delgada con la fase
est acionaria son el vidrio y el alum inio, aunque t am bién se han em pleado lám inas plást icas.
Las dim ensiones de est as placas son variables aunque las m ás com unes son de 20 x 20 cm ,
20 x 10 cm y 20 x 5 cm . Se em plean una u ot ras en dependencia del núm ero de
aplicaciones que se deseen realizar.
Las fases est acionarias de m ayor em pleo son el gel de sílice o sílica gel ( act ivada) , el óxido
de alum inio, el polvo de celulosa y el Kieselguhr para separaciones por adsorción, cuidando
en t odos los casos un baj o cont enido de hum edad para que no ocurra el fenóm eno de
repart o. En el caso de la crom at ografía de part ición, el gel de sílice no act ivado y la celulosa
son las m ás em pleadas, en t ant o para int ercam bio iónico se em plean resinas
int ercam biadoras ( aniónicas y cat iónicas) sim ilares a las ut ilizadas en crom at ografía en
colum na.
Aunque la placa de silicagel sigue siendo el caballo de bat alla en la m ayoría de los
laborat orios que aplican la CCD, ha habido una revolución en est e sent ido que ha perm it ido
no solo aum ent ar la resolución del Crom at ogram a sino que t am bién ha facilit ado la
aplicación de las m uest ras y ha aum ent ado la velocidad del análisis, cuest ión est a que era
obj et o de crít ica por part e de m uchos especialist as en crom at ografía.
Convencionalm ent e la disposición de la fase est acionaria sobre el soport e de vidrio o
alum inio se realizaba art esanalm ent e en el laborat orio em pleando unos disposit ivos
llam ados t iradores y aunque est a t écnica se em pleó durant e m ucho t iem po ( y aun se
em plea en algunos casos) , el grosor y la dist ribución del adsorbent e no era t odo lo uniform e
que se hubiera deseado, por lo que en m uchos casos los crom at ogram as obt enidos adolecían
de poca reproducibilidad y adem ás de una pobre resolución.
El advenim ient o de las placas precubiert as o las lám inas de alum inio cubiert as con el
adsorbent e, ha perm it ido no solo m ej orar la resolución del crom at ogram a sino que t am bién
ha influido en la reproducibilidad de los result ados obt enidos.
Las placas precubiert as son placas de vidrio o alum inio producidas indust rialm ent e con un
alt o grado de uniform idad de la fase est acionaria, t ant o en lo referent e al grosor de la capa
com o al t am año de part ícula del m at erial de la m ism a y son desechables, es decir se ut ilizan
solo una vez para una ciert a separación crom at ográfica.
Con la aparición de la t ecnología de la placa precubiert a se hizo posible adem ás la
com ercialización de t oda una serie de variedades que incluyen no solo los t ipos de
crom at ografía m ás convencionales com o son las de repart o, adsorción e int ercam bio iónico,
sino t am bién la m odalidad de fase ligada. Hoy en día es posible em plear placas de fase
ligada ( norm al o reversa) em pleando sist em as C- 8, C- 18, ciano, diol, am ino, et c, al igual
que en HPLC.
Gracias al desarrollo alcanzado en la com ercialización de placas crom at ográficas, m uchas
veces se prefiere elegir la CCD sobre la HPLC debido a la sim plicidad en la preparación de las
m uest ras.
Cuando los com puest os de int erés se present an incluidos en m at rices m uy com plej as com o
sangre, orina, saliva y ot ros fluidos biológicos y se decide aplicar HPLC o GLC es necesario
realizar una previa purificación de la m uest ra a fin de evit ar que la colum na crom at ográfica
se eche a perder rápidam ent e, lo que no es nada at ract ivo t eniendo en cuent a el cost o de
las m ism as.
En CCD est a et apa de purificación no es t an im port ant e y se puede proceder a la aplicación
de la m uest ra direct am ent e si se quiere, debido a que siem pre se ut ilizará una capa nueva
en cada corrida crom at ográfica, por lo que se part irá de un sist em a crom at ográfico
com plet am ent e fresco, con lo que no es de t em er la pérdida de resolución com o sucede con
las colum nas de GLC o HPLC.
Ot ro elem ent o de vit al int erés es la aplicación

de la m uest ra en la placa crom at ográfica ( figura
11.5) la cual result a especialm ent e im port ant e
cuando se realiza de form a m anual, siendo el
obj et ivo a lograr, el obt ener en la zona de
aplicación un punt o o una banda lo m ás
est recha y concent rada posible, a fin de obt ener
una m ayor resolución al final de la corrida, por
una m enor difusión de la m ancha. Para ello es
necesario ser ext rem adam ent e cuidadoso y
pacient e y aun así no siem pre se obt enían
buenos result ados.
Figu r a 1 1 .5 . Aplica ción m a n u a l e n for m a
de pu n t o
Para resolver est a dificult ad fueron creadas las placas con zonas de concent ración en las
cuales se ha definido una zona de aplicación y ot ra zona analít ica. Con est e t ipo de placa, la
aplicación de la m uest ra dej a de ser t an exigent e debido a que aunque no se logre un punt o
de aplicación lo suficient em ent e pequeño y concent rado, el efect o que se logra en la zona de
aplicación es precisam ent e el de concent rar el punt o o banda de aplicación de m uest ra, la
cual llega a la zona analít ica en condiciones ópt im as para desarrollar el crom at ogram a. Est e
t ipo de placa puede ser especialm ent e adecuada para aquellos laborat orios donde los
recursos no perm it a la adquisición de inst rum ent os m ás adecuados que resuelvan est a
problem át ica y se necesit e realizar la separación de m ezclas com plej as.
El resurgim ient o del int erés en la crom at ografía plana ha venido en gran m edida aparej ado
con el desarrollo de las placas crom at ográficas, lo que ha dado lugar a la crom at ografía en
capa delgada de alt a resolución ( HPTLC, del inglés High Perform ance Thin Layer
Chrom at ography) , t am bién conocida com o nanocrom at ografía. Est e t ipo de placa present a
diferencias considerables con la placa crom at ográfica norm alm ent e em pleada, en una serie
de caract eríst icas t ales com o el t am año de part ícula del adsorbent e y la porosidad del
m ism o.
El adsorbent e para HPTLC es producido de la m anera m ás uniform e en cuant o al t am año de
part ícula, t eniendo una granulom et ría en cot as m ucho m ás cerradas que el adsorbent e
t am bién considerablem ent e m enor encont rándose en el orden de los 100 µm , m ient ras que
norm al, y un t am año de poro m ucho m ás pequeño. El grosor de est e t ipo de placa es
en la placa convencional es de alrededor de 250 µm para el t ipo analít ico.

Com o result ado del m enor t am año de part ícula, est e t ipo de placa es m ucho m ás eficient e y
perm it e obt ener separaciones adecuadas con dist ancias de corrida de solo 3 a 5 cm ,
com parado con los 10- 15 cm que norm alm ent e se necesit an para el t ipo convencional. Com o
consecuencia de lo ant erior, los t iem pos de corrida se reducen considerablem ent e
lográndose reducciones de hast a 40% del t iem po em pleado con las placas convencionales.
Ahora bien, debido al m enor grosor de la placa, la capacidad de carga de la placa es m enor
lo que obliga a aplicar volúm enes de m uest ra considerablem ent e m enores a fin de
concent rar la m uest ra lo m ás posible en el punto de aplicación. Así, para obt ener una ópt im a
resolución, el t am año de la m ancha en el punt o de aplicación no debe ser m ayor a 2- 3 m m
a 0.2 µL. Lograr est os result ados con aplicaciones m anuales result a práct icam ent e
de diám et ro lo que im plica que los volúm enes de aplicación han de est ar en el rango de 0.1
im posible, por lo que se han t enido que diseñar t oda una serie de aplicadores de m uest ra,
de los cuales hablarem os m ás adelant e.
El pequeño t am año del punt o de aplicación en HPTLC perm it e aplicar un gran núm ero de
m uest ras por placa ( de 20 a 30 m uest ras por placa) . Si se considera lo ant erior y t om ando
com o t iem po de corrida un t ot al de 20 m inut os puede decirse que la velocidad de análisis es
de 1 m uest ra por m inut o, con lo que se ej em plifica la capacidad que t iene est a t écnica de
com pet ir con HPLC en t érm inos de velocidad de análisis.
1 1 .4 . Aplica ción de la m u e st r a
Ot ro cam po que ha experim ent ado un gran desarrollo es el de la aplicación de la m uest ra,
punt o neurálgico en el desarrollo exit oso de la crom at ografía en capa delgada.
10 a 1000 µL, las

En sus inicios la aplicación se realizaba ut ilizando m icropipet as, m icroj eringuillas y
m icroj eringuillas t ienen una capacidad m enor ( 5- 50 µL) en t ant o los m icrocapilares se
m icrocapilares. Las prim eras perm it en cargar volúm enes de
fabrican generalm ent e de 1, 2, 3, 5 y 10 µL.

Los volúm enes de aplicación de la solución de m uest ra y pat rones dependen de varios
fact ores. En prim er lugar el volum en depende de la finalidad que se persigue, es decir si el
t rabaj o es analít ico o preparat ivo ( en el segundo caso es obvio que se requiere aplicar
m ayores volúm enes) y por ot ra part e es im port ant e considerar la concent ración del analit o.
Así por ej em plo, si se pret ende analizar un com ponent e que se encuent ra en m uy baj a
concent ración en la m uest ra, cercana al lím it e de det ección del m ét odo, es aconsej able
aum ent ar el volum en de aplicación con vistas a garant izar su post erior det ección.
ent re 1 y 20 µL, obt eniéndose una m ayor repet ibilidad cuando se aplican volúm enes
De form a general los volúm enes de aplicación con obj et ivos analít icos est án com prendidos
pequeños por cuant o se evit a la difusión radial de los solut os en el punt o de aplicación.
espesor) , hast a 500 µL de solución. En est os casos la aplicación no se realiza en form a de

Con fines preparat ivos se puede aplicar ( sobre una placa de 20 x 20 cm y 0.5 m m de
punt os sino de bandas, t al y com o se m uest ra en la figura 11.6.
Figu r a 1 1 .6 . Aplica ción e n for m a de pu n t o y de ba n da
En el área de la aplicación de m uest ras se ha t ransit ado desde los inyect ores m anuales
( figura 11.7) em pleando j eringuillas convencionales t ipo HPLC, m ont adas en un sist em a
m icrom ét rico, hast a los inyect ores aut om át icos acoplados a sist em as de com put ación,
capaces de inform ar los est at us de operación y perm it ir aplicar cant idades ext rem adam ent e
pequeñas de la m uest ra.
Figu r a 1 1 .7 . D ife r e n t e s t ipos de a plica dor e s m a n u a le s

Una versión int erm edia es el inyect or sem iaut om át ico, el cual solo necesit a que sea cargada
la j eringuilla con el pat rón o con la m uest ra problem a.
Est e pequeño inst rum ent o de cost o m oderado, es capaz de calcular, según el t am año de la
placa, el núm ero de pist as posibles de aplicación de la m uest ra, cuest ión que es a veces un
verdadero rom pecabezas para el analist a a la hora de opt im izar el núm ero de m uest ras por
placa.
Program ado adecuadam ent e, perm it e aplicar con una pequeñísim a at ención del analist a, la
m uest ra problem a y los pat rones de m anera práct icam ent e insuperable, aun por m anos
expert as, ya que la aplicación se realiza m ediant e un spray que evit a el cont act o direct o del
disposit ivo con la placa. Adem ás, brinda la posibilidad de realizar el secado con aire o con
nit rógeno, y siem pre en frío, cuest iones im port ant es a la hora de m anej ar m uest ras
fácilm ent e oxidables, siendo posible incluso adicionar un disposit ivo que perm it e crear una
cám ara de gas inert e alrededor de la placa durant e el proceso de aplicación.
Com o caract eríst ica adicional se puede agregar que la aplicación de la m uest ra puede
realizarse en form a de punt os o en form a de bandas, lográndose una m ej or resolución con
est a últ im a m odalidad, pero que en num erosas oport unidades es despreciada debido a la
dificult ad que represent a realizarla de form a m anual con una pipet a.
El t am año de la banda así com o el t iem po de secado es seleccionado por el analist a de
acuerdo a sus necesidades, t eniendo en cuent a el caráct er del solvent e em pleado para la
disolución del analit o. Finalm ent e se debe punt ualizar que los aplicadores aut om át icos,
liberan al analist a del t edioso t rabaj o de realizar est a operación y le perm it e por t ant o
realizar ot ras t areas con lo que se consigue una m ayor product ividad.
Ot ros sist em as que han sido desarrollados son los relacionados con la nanocrom at ografía
( HPTLC) , donde se han diseñado equipos de aplicación especiales para las pequeñas
cant idades ant eriorm ent e discut idas y que realizan est a operación de form a sem im anual
em pleando pequeños capilares de plat ino/ iridio ( figura 11.8) .
Figu r a 1 1 .8 . Aplica dor se m ia u t om á t ico Lin om a t 5 de la fir m a su iz a CAM AG
Los sist em as de aplicación aut om át icos cubren las gam as de aplicaciones que van desde la
aplicación ent re los 10 nL y los 50 µL, en placas de hast a 20x20 cm .

crom at ografía convencional hast a la nanocrom at ografía con un rango de volúm enes de
Debido a que est os aplicadores est án acoplados a sist em as de com put ación, perm it en la
operación de form a com plet am ent e aut om át ica y sin at ención del operario una vez realizada
la program ación. Est o perm it e adem ás alm acenar en m em oria la program ación ej ecut ada y
repet irla de form a com plet am ent e reproducible t ant as veces com o sea necesario.
1 1 .5 . Té cnica s de de sa r r ollo de los cr om a t ogr a m a s
Com o ya se explicó el desarrollo del crom at ogram a es la et apa en la que se hace pasar la
fase m óvil a t ravés de la fase est acionaria para lograr la separación de los solut os que
com ponen la m uest ra. En est e sent ido exist en varias t écnicas de desarrollo; las m ás
ut ilizadas se exponen a cont inuación:
A. D e sa r r ollo a sce nde n t e .
Es el m odo de operación m ás ut ilizado en el desarrollo del crom at ogram a, por la sencillez del
equipo que requiere. Se coloca la placa dent ro de una cám ara o cubet a de cierre herm ét ico,
en cuyo fondo se ha colocado previam ent e la fase m óvil la cual debe t ener una profundidad
m áxim a de 1 cm . La fase m óvil asciende ent onces por capilaridad a t ravés de la placa y
com ienza el proceso de separación de los solut os de int erés.
Es im port ant e que la cubet a est é previam ent e sat urada con los vapores del solvent e, lo que
se logra m ant eniendo el solvent e dent ro de la cám ara alrededor de 12 horas ant es de
int roducir la placa crom at ográfica. En est e sent ido debe señalarse que m ient ras m enor
volum en de solvent e haya en la cám ara, m ás rápido se alcanza el equilibrio líquido- vapor y
m ás rápido es el proceso de sat uración, consecuent em ent e la corrida crom at ográfica ocurre
en m enor t iem po se evit a que el solvent e no se evapore en su ascenso al encont rarse con
una at m ósfera insat urada.
La figura 11.3, incluida en el epígrafe 11.1, m uest ra un esquem a de est a t écnic de
desarrollo.
B. D e sa r r ollo de sce nde n t e
Est a m odalidad requiere de una cubet a especial provist a e un recipient e sit uado en su part e
superior ( figura 11.9) . La placa se recuest a o fij a, según el caso, al recipient e m encionado y
m ediant e una banda de papel de filt ro que abarque el ancho de la placa se est ablece un
puent e líquido ent re la fase m óvil y la placa. El solvent e asciende por capilaridad a t ravés
del papel y llega al borde superior de la placa, a part ir del cual com ienza a descender a lo
largo de la m ism a m ovido por dos fuerzas: la capilar y la gravit at oria.
Figu r a 1 1 .9 . D e sa r r ollo de sce n de n t e
El desarrollo descendent e es usualm ent e m ás rápido que el ascendent e y se em plea

usualm ent e cuando los com puest os a separar t ienen m uy poca dist ancia de recorrido desde
el punt o de aplicación. La corrida puede det enerse a una dist ancia m ayor de 15 cm , cuando
el frent e del solvent e est á m uy próxim o al borde inferior de la placa.
C. D e sa r r ollo hor izont a l
En su form a m ás sencilla, en est a t écnica de desarrollo se coloca la placa horizont alm ent e
dent ro de una cám ara y se hace llegar la fase m óvil a uno de sus bordes m ediant e un
puent e de papel de filt ro sim ilar al explicado para el desarrollo descendent e el cual asciende
por capilaridad a t ravés del papel y luego t ransit a horizont alm ent e a lo largo de la fase
est acionaria ( figura 11.10)
Figu r a 1 1 .1 0 . D e sa r r ollo h or izon t a l con ve n cion a l
El desarrollo horizont al convencional, t al com o se ha explicado n logró m ej orar en sus inicios

la separación frent e a las t écnicas ascendent e y descendent e. Sin em bargo, en la act ualidad
ha t om ado un enorm e auge, aspect o est e del que se com ent ará m ás adelant e.
La clasificación de las t écnicas de desarrollo arriba explicadas se fundam ent a en la
disposición de la placa crom at ográfica y el la dirección que t om a la fase m óvil m ient ras fluye
a t ravés de la fase est acionaria.
Sin em bargo exist en ot ros procedim ient os adicionales que buscan m ej orar la resolución del
crom at ogram a. Dos de los m ás em pleados son el desarrollo m últ iple y el desarrollo
bidim ensional.
D . D e sa r r ollo m ú lt iple
La t écnica de desarrollo m últ iple consist e en realizar dos corridas crom at ográficas sobre una
m ism a placa. Así por ej em plo, se realiza un prim er desarrollo en un sist em a de solvent es
hast a una alt ura det erm inada. La placa se seca y se int roduce en ot ra cám ara con ot ro
solvent e o sist em a de solvent es de polaridad diferent e al prim ero, para realizar un segundo
desarrollo, ahora hast a 15- 20 cm del punt o de aplicación. La elección del solvent e para
ut ilizar prim ero o después depende de cada problem a específico y se det erm ina por lo
general em píricam ent e.
E. D e sa r r ollo bidim e n siona l
Est a t écnica se aplica en los casos de separaciones difíciles, cuando no se logra una
resolución adecuada de la m ezcla aplicada. En est e caso la m ezcla se aplica en un solo
punt o en uno de los ext rem os de la placa; se realiza ent onces un prim er desarrollo en una
dirección con un sist em a de solvent es hast a la alt ura convencional ( 10- 15 cm ) .
Post eriorm ent e la placa se seca y se int roduce en ot ro sist em a de solvent es con la
part icularidad que se ha girado 90º . Ahora los deficient em ent e separados con el prim er
sist em a de solvent es se m overán en dirección perpendicular al prim er desarrollo, lográndose
en m uchas ocasiones buenas separaciones finales. La figura 11.11 esquem at iza est e
procedim ient o.
Figu r a 1 1 .1 1 . D e sa r r ollo bidim e n sion a l
En lo referent e a las t écnicas de desarrollo, t am bién se han producido avances

espect aculares y exist en hoy en día desde las cám aras usualm ent e em pleadas que cubren
desde los t anques crom at ográficos convencionales hast a el t ipo sándwich, hast a las cám aras
com plet am ent e aut om at izadas.
Una cám ara crom at ográfica que aunque se puede considerar dent ro del t ipo de las
convencionales se em plea hoy con ciert a frecuencia es la conocida com o Twin Through
Cham ber ( figura 11.12) , ya que una división de vidrio int erm edia da la posibilidad de no solo
em plear una m enor cant idad de solvent e sino que t am bién, perm it e sit uar en la ot ra m it ad
un solvent e dist int o a fin de acondicionar la cám ara con valores enriquecidos con un
com ponent e que puede est ar present e o no en la fase m óvil, com o por ej em plo am oníaco.
Figu r a 1 1 .1 2 .Tw in Th r ou gh Ch a m be r
Ot ro t ipo de cám ara a considerar es aquella en la cual se puede en una sola corrida analít ica
probar hast a 5 t ipos dist int os de solvent e en una sola placa, con lo que se aligera bast ant e
t oda la serie de experim ent os que m uchas veces es necesario realizar ant es de encont rar
una com posición adecuada de fase m óvil. Al m ism o t iem po ot ros parám et ros t ales com o la
hum edad relat iva y la influencia de react ivos volát iles pueden ser est udiados. Es evident e
adem ás el ahorro de placas que se obt iene.
Para el desarrollo de la HPTLC se em plean hoy

en día las llam adas cám aras horizont ales
( Figura 11.13.) en las cuales el solvent e corre
de form a horizont al com o su nom bre lo indica.
Para ello se aplica una t ira de papel que conect a
la placa con el t anque de solvent e. Con ello es
posible por t ant o com o dij im os ant eriorm ent e
aplicar m uest ras por am bos sent idos.
Com o ej em plo puede decirse que aplicando las

m uest ras con una separación de 5 m m ent re
ellas y dej ando 15 m m libres a cada lado de la
placa, es posible aplicar hast a 30 m uest ras en
una placa de 10x10 cm .
Figu r a 1 1 .1 3 . Cá m a r a s de de sa r r ollo
h or izon t a l pa r a H PTLC
Hoy en día ya es posible el desarrollo del

crom at ogram a de form a com plet am ent e aut om át ica.
Exist en en el m ercado, cám aras de desarrollo capaces
de preacondicionar la placa, realizar la corrida en
form a de t anque o sándwich, cont rolar la dist ancia de
m igración y lo que es m ás, hast a secar la placa, con
lo que el const ant e m onit oreo de la m ism a dej a de
ser una preocupación del analist a. Una vez que la
corrida se ha t erm inado según las condiciones de
program ación dadas por el analist a, la m ism a es
secada con aire frío o calient e y perm anece allí hast a
que es ext raída para su observación o el análisis
cuant it at ivo ( Figura 11.14.) .
Figu r a 1 1 .1 4 . Au t om a t ic D e ve lopin g
Ch a m be r ( AD C)
Quizás la variant e m ás poderosa de separación es el conocido sist em a AMD ( Aut om at ic

Mult iple Developm ent ) de est a m ism a firm a, capaz de com pet ir con la HPLC en cuant o a
separación por gradient e se refiere ( figura 11.15) .
Ent re sus caract eríst icas pueden nom brarse que

debido a que t iene un efect o focusing en la
banda crom at ográfica perm it e obt ener núm ero
de separación superior a 50, ofrece un m ét odo
reproducible de elución de gradient e, con lo que
com ponent es dent ro de una am plia gam a de
polaridades pueden ser separados y perm it e que
las dist ancias de m igración de los com ponent es
individuales sean independient es de las m at rices
donde se encuent ran cont enidos. Com o ej em plos
de aplicación pueden cit arse la separación de
pest icidas en agua pot able, la separación de
m ezclas de fosfolípidos, sust ancias anabólicas en
hum anos o alim ent os, et c. Es por t ant o posible
realizar ahora t écnicas de separación en capa
delgada que no eran posibles de hacer hast a
hace poco.
Figu r a 1 1 .1 5 . Sist e m a AM D
En la t abla 11.1 se present an las principales vent aj as del sist em a HPTLC frent e a la CCD
convencional.
Tabla 11.1. Com paración ent re CCD y HPTLC
Pa r á m e t r o CCD H PTLC
Tam año m edio de part ícula 10 - 12 µm 5 - 6 µm
Dist ribución del t am año de part ícula 5 – 20 µm 4 – 8 µm
Espesor de la capa 250 µm 50, 100, 200 µm
Alt ura de la placa 30 µm 12 µm
Volum en de m uest ra a aplicar 1 – 5 µL 0.1 – 0.5 µL
Diám et ro del punt o de aplicación 3 - 6 mm 1 - 1,5 m m
Diám et ro de la m ancha después del desarrollo 6 - 15 m m 2 - 5 mm
Dist ancia ent re m uest ras 15 m m 5 mm
Núm ero de m uest ras por placa m ax. 12 m ax. 72
Dist ancia de m igración 10 - 15 cm 3 - 5 cm
Tiem po de m igración 20 - 200 m in 3 - 20 m in
Requerim ient os de solvent e 50 m L 4 - 8 mL
Lím it e de det ección
• Absorbancia 1 – 5 ng 100 – 500 pg
• Fluorescencia 50 – 100 pg 5 – 10 pg
Lím it e de det erm inación
• Absorbancia 100 - 1000 ng 10 - 100 ng
• Fluorescencia 1 - 100 ng 100 pg - 10 ng
1 1 .6 . Té cnica s de r e ve la do
En la m ayoría de los casos los com puest os separados por CCD no non coloreados por lo que
al culm inar la corrida crom at ográfica y el secado de la placa, es necesario visualizar la
posición de los m ism os en la placa crom at ográfica. Para ello se em plean los llam ados
m ét odos de revelado que básicam ent e pueden ser de dos t ipos: revelado quím ico y revelado
físico.
1 1 .6 .1 . Re ve la do físico
El revelado físico aprovecha alguna propiedad de los com puest os m ediant e la cual, a t ravés
de la int eracción agent e físico – analit o, est e últ im o se hace visible.
El revelador físico m ás em pleado es la radiación ult raviolet a ( UV) y la propiedad de los
com puest os que se aprovecha es la fluorescencia. Una vez desarrollado el crom at ogram a y
secado la placa, est a se expone a la radiación ult raviolet a ut ilizando una lám para UV
adecuada y los com puest os separados fluourecen al int eract uar con la radiación UV
haciéndose visibles en form a de m anchas sobre la placa. Obviam ent e est e m ét odo posee la
desvent aj a de ser aplicable, en un principio, solo a aquellas sust ancias que son capaces de
fluorescer.
Est a dificult ad se resolvió con la aparición y com ercialización de las placas fluorescent es, las
cuales poseen un adit ivo que fluoresce, generalm ent e a 254 y 336 nm . Al exponer la placa
a la radiación UV, est a fluoresce con un color am arillo verdoso y en los lugares donde se
encuent ran los analit os no fluorescent es no se produce el fenóm eno, visualizándose com o
m anchas oscuras. Sin lugar a dudas el advenim ient o de est e t ipo de placas am plió
ext raordinariam ent e las posibilidades de aplicación de est e m ét odo físico de revelado.
1 1 .6 .2 . Re ve la do qu ím ico
Se considera un revelador quím ico a cualquier react ivo que al reaccionar con el analit o lo
t ransform e en un derivado coloreado. Así, el revelado quím ico es sim plem ent e un proceso
de derivat ización que se realiza “ in sit u” sobre la placa crom at ográfica para visualizar los
com ponent es separados que aparecen el gorm a de m anchas.
Las soluciones de los reveladores o react ivos crom ogénicos se dist ribuyen sobre la capa
m ediant e dos procedim ient os:
• Por inm ersión de la placa en el agent e revelador, que const it uye un m ét odo de poco
em pleo.
• Por pulverización neum át ica o at om ización de la solución reveladora sobre la placa.
Es im port ant e llam ar la at ención sobre la form a de aplicar la solución reveladora. La
pulverización t iene que ser uniform e ut ilizando un pulverizador que ent regue got as m uy
finas. La dist ancia de colocación del pulverizador frent e a la placa debe ser t al que la fuerza
con que lleguen la got it as no dist orsione el crom at ogram a. En cada t écnica part icular se
indica com o dispersar el agent e crom ogénico y por lo general debe est arse aplicando
solución reveladora hast a que la placa se t orne t raslúcida; se requiere adem ás una et apa de
t ant eo en la cual se varía la cant idad de agent e revelador, la dist ancia y la fuerza de la
aspersión, ant es de que se obt engan los m ej ores result ados. La figura 11.16 m uest ra un
pulverizador t ípico, ut ilizado para la at om ización de la solución reveladora.
Figu r a 1 1 .1 6 . Cá m a r a de pu lve r iz a ción y pu lve r iz a dor pa r a a t om iz a ción
Debe señalarse que en algunas ocasiones se com bina el revelado físico con el quím ico,
debido a que exist en reveladores quím icos que requieren para su acción de agent es físicos
com o la radiación UV y el calor.
La t abla 11.2 m uest ra algunos reveladores quím icos y sus condiciones de em pleo.
Tabla 11.2. Algunos sist em as de revelado
Ana lit o Re ve la dor Tr a t a m ie nt o

Plaguicidas Solución de AgNO3 + 2- Exposición de la placa a radiación
organoclorados fenoxiet anol + peróxido de UV 254 nm después de haber
hidrógeno. evaporado el solvent e.
Am inoácidos Ninhidrina Calent ar la placa a 100º C
después de haber at om izado el
revelador.
Est eroles y ácidos 2,7- diclorofluoresceína Exposición de la placa a radiación
grasos UV 254 nm después de haber
evaporado el solvent e
Acido sorbico, Solución hidroalcohólica de Exposición de la placa a radiación
benzoico, dicrom at o de pot asio 0.15 % + UV 360 nm después de haber
p- clorobenzoico, Solución sat urada de ácido evaporado el solvent e
salicilico, t iobarbit úrico 0,1% en Et anol
p- hidroxibenzoico 96%
1 1 .7 . Aná lisis cu a lit a t ivo
La ident ificación de las m anchas en el crom at ogram a es el paso previo a su est im ación
cuant it at iva. Sin em bargo, est a et apa t iene gran im port ancia debido a que en m uchos casos
con la ident ificación del com puest o t erm ina el análisis. En efect o, la CCD es una t écnica m uy
fuert e de confirm ación analít ica y con t al finalidad se ut iliza frecuent em ent e.
Cuando se poseen pat rones de referencia de los com puest os que pueden present arse en la
m uest ra, la ident ificación result a relat ivam ent e fácil. Sobre una m ism a placa se aplican
m uest ras y los pat rones de referencia de los analit os que se sospecha est án present es en la
m uest ra. Luego de desarrollado y revelado el crom at ogram a se com paran las dist ancias de
m igración de los com puest os separados de la m uest ra con las dist ancias de m igración de los
pat rones y en aquellos casos coincident es hay razones para pensar que la ident idad del
com puest o se corresponde con la del pat rón ( ver figura 11.4 en el epígrafe 11.1) .
Ahora bien, la com paración de est as dist ancias no se realiza solo visualm ent e sino que se
calcula un parám et ro conocido com o fact or de ret ardo ( Rf) , definido com o la relación ent re
la dist ancia recorrida por un com puest o ent re la dist ancia recorrida por el solvent e de
corrida ( fase m óvil) .
Tom em os por ej em plo el caso de una separación crom at ográfica de una m uest ra const it uida
por 2 com ponent es A y B, la cual se ha crom at ografiado con 2 pat rones P1 y P2 ( figura
11.17) .
Para el caso del com ponent e B de la m uest ra el Rf

se calcula:
RfB =
dis tan cia recorrida por B
dis tan cia recorrida por el solvente
RfB =
dB
dS
Y para el pat rón de referencia P1 sería:
Rf P 1 =
dP 1
dS
Figur a 1 1 .1 7 . Cá lcu lo de l Rf
Es obvio que iguales valores de Rf para un pat rón y ciert o com ponent e de la m uest ra indican
la ident idad del analit o. Est á claro t am bién que el Rf t om a valores ent re 0 y 1.
Pudiera pensarse que ot ra vía de ident ificación pudiera ser la com paración del Rf obt enido
para el com puest o de int erés con valores report ados en la lit erat ura, sin em bargo est e
procedim ient o es poco confiable debido a que los valores de Rf dependen de un grupo de
fact ores, ent re los que pueden cit arse:
• El est ado de sat uración de la cám ara crom at ográfica.
• La nat uraleza la fase est acionaria, pues aun de un m ism o fabricant e hay diferencias de
un lot e a ot ro a causa de las condiciones de fabricación.
• La t em perat ura a la cual se lleva a cabo el desarrollo.
• La act ividad de la capa.
• La variación de la com posición de la fase líquida, sobre t odo cuando hay m ucha
diferencia ent re los punt os de ebullición para el caso de m ezclas de solvent es.
• La t écnica de aplicación ( si est a se realizó m anual o aut om át icam ent e, si se aplicó solo
una vez o el punt eo se realizó secando ent re aplicaciones sucesivas) .
Por las razones expuest as, result a casi im posible reproducir exact am ent e las condiciones
crom at ográficas em pleadas para la obt ención de los valores de Rf report ados y por ot ra
part e m uchas veces t odas las condiciones de separación no se conocen. Es por ello que se
prefiere siem pre aplicar pat rones conj unt am ent e con la m uest ra, exact am ent e baj o las
m ism as condiciones con vist a a elim inar los fact ores de variabilidad relacionados. Solo en los
casos en que no se posean los pat rones de referencia, se acude a la com paración con
report es de la lit erat ura con la incert idum bre de que los result ados no serían del t odo
concluyent es.
1 1 .8 . Aná lisis cu a nt it a t ivo
Una razón por la cual la crom at ografía plana fue relegada durant e m ucho t iem po por
m uchos analist as fue las dificult ades inherent es a la cuant ificación de los eluat os de int erés
con exact it ud.
Sin em bargo, es posible afirm ar que hoy en día esas im precisiones son cosas del pasado y la
inst rum ent ación desarrollada por la CCD en est e m om ent o es capaz de vencer est as
dificult ades de m anera convincent e.
Exist en dos m ét odos fundam ent ales para realizar la cuant ificación: la elución de los
com ponent es de la placa y los m ét odos densit om ét ricos.
1 1 .8 .1 . M é t odo de e lu ción de los com pon e n t e s
Uno de los m ét odos em pleados para realizar est e t rabaj o consist ía en desarrollar el
crom at ogram a y post erior a la visualización de las zonas de int erés, raspar la zona de sílica
correspondient e al com ponent e que se deseaba cuant ificar y t rasvasarla a un recipient e
donde hacía la m edición direct am ent e por t écnicas espect roscópicas ( o bien se en la zona
ult raviolet a del espect ro si el com ponent e era capaz de absorber o se realiza una reacción de
derivat ización para obt ener un com puest o coloreado que perm it ía realizar la det erm inación
en la zona visible del espect ro) .
Est o t raía t oda una serie de inconvenient e que iban desde la pérdida de m uest ra con el
consiguient e baj o recobrado, hast a problem as de int erferencias por el m ism o adsorbent e o
por los react ivos usados en la reacción de color, por lo que era práct ica obligat oria em plear
un ensayo en blanco con la zona de la sílica a fin de obviar est a dificult ad.
Era t am bién im port ant e realizar un est udio del sist em a de ext racción del eluat o de la sílica a
fin de garant izar un porcent aj e de recuperación adecuado. No obst ant e, se necesit aba de
pericia y una buena m anipulación a fin de obt ener result ados reproducibles y precisos, lo
que no siem pre se lograba.
Com o una variant e a est a m odalidad es posible encont rar hoy en día inst rum ent os que
perm it en realizar est a operación de form a sem iaut om át ica sin t ener que realizar la operación
de raspado.
Est os disposit ivos realizan la ext racción del com ponent e de int erés m ediant e la elución en
las zonas de separación de la fracción que se quiere de form a com plet am ent e aut om át ica sin
t ener que realizar el raspado de la placa, perm it iendo la ext racción de varias m uest ras al
m ism o t iem po.
Para ello se usa una pequeña boquilla de elución que se coloca exact am ent e en la zona
donde se pret ende realizar la operación después de la creación de una pequeña zona circular
donde la sílica ha sido raspada m ediant e ot ro pequeño adit am ent o diseñado para est e
propósit o. Ello perm it e que el solvent e seleccionado para realizar est a operación ent re de
m anera sim ilar a com o lo hace la fase m óvil en la et apa de desarrollo del crom at ogram a y
eluya así cuant it at ivam ent e el com ponent e, siendo recogido est e solvent e ( cont eniendo el
com ponent e) a un t ubo o cont enedor de ot ro t ipo con el cual se puede realizar
post eriorm ent e las operaciones de m edición o de derivat ización necesarias.
Est e inst rum ent o puede ser conj ugado para la separación cuant it at iva o inclusive
preparat iva de t odo t ipo de com puest os suscept ibles de ser separados m ediant e CCD y
perm it e inclusive su obt ención para su post erior int roducción en un sist em a de GLC o HPLC,
en caso de que la separación no haya podido ser com plet ada en la placa.
1 1 .8 .2 . M é t odos de n sit om é t r icos
La solución m ás im port ant e para el análisis cuant it at ivo por CCD, ha sido el desarrollo
im pet uoso que ha t enido la const rucción de densit óm et ros cada vez m ás eficient es y
poderosos.
Un densit óm et ro es un equipo capaz de m edir una señal analít ica de los com ponent es
separados y los pat rones direct am ent e “ in sit u” sobre la placa crom at ográfica. El result ado
de est a m edición es un crom at ogram a de señal vs. dist ancia de m igración de cada uno de
los com ponent e de la m uest ra, en el cual, de form a análoga a la HPLC y a GLC, el área baj o
la curva de cada pico es proporcional a la concent ración ( figura 11.18) .
Figu r a 1 1 .1 8 . Pla ca cr om a t ogr á fica de u n a m u e st r a de cin co com pon e n t e s ( A, B, C, D y E) y

cr om a t ogr a m a obt e n ido por ba r r ido de n sit om é t r ico.
La cuant ificación de cualquiera de los com ponent es de la m uest ra se realiza con ayuda de
una curva de calibración. Para ello se aplican en una capa nueva soluciones de un pat rón de
m asas crecient es y exact am ent e conocidas ( por ej em plo 2, 4, 6 y 8 µg) . Se realiza ent onces
referencia correspondient e al com ponent e que se desea cuant ificar a concent raciones o
la corrida crom at ográfica baj o condiciones idént icas a las ut ilizadas para la m uest ra y la
placa se coloca en el densit óm et ro para la lect ura de la señal analít ica de los pat rones.
Se obt ienen ent onces un núm ero de picos equivalent es al núm ero de soluciones pat rones
aplicadas en la placa ( cuat ro en el ej em plo considerado) cuyas áreas baj o la curva aum ent an
en la m edida en que aum ent a la concent ración de los pat rones. El equipo es capaz de
int egrar est as áreas y com o result ado se obt iene un j uego de dat os de concent ración ( o
m asa) de los pat rones vs. área baj o la curva. Est a dat a se procesa por regresión lineal y se
obt iene una ecuación del t ipo
y = mx + a
donde “m ” es la pendient e, “a ” es el int ercept o, “y” es el área baj o la curva del pico del
com ponent e de int erés en el crom at ogram a de la m uest ra y “x ” es la concent ración o m asa
del com ponent e de int erés
La figura 11.19. m uest ra un esquem a del proceso descrit o.
Figu r a 1 1 .1 9 . Cu r va de ca libr a ción y

de t e cción de n sit om é t r ica .
Nót ese que los valores de Rf de los diferent es
pat rones ( P1, P2, P3 y P4) en la placa
crom at ográfica son iguales debido a que se t rat a
del m ism o com ponent e. Véase adem as com o en
la m edida en que aum ent a la concent ración de
los pat rones aum ent a t am bién el ár ea baj o la
curva de los picos obt enidos con el análisis
densit om ét rico.
Los densit óm et ros act uales son capaces de leer con una gran precisión y exact it ud no solo
una placa de hast a 20x20 cm sino que t am bién pueden leer t iras elect roforét icas. Poseen un
rango espect ral út il desde 190 hast a 800 nm con lo cual superan en algunos casos los
det ect ores UV/ VI S de HPLC, y efect úan el barrido de la placa en form a de absorbancia,
fluorescencia y reflect ancia, lo cual puede ser seleccionado por el analist a. Para ello usan 3
t ipos de lám paras: las de Deut erio, en el rango espect ral de 190 a 400 nm , las de
Tungst eno- Halógeno en el rango de 400 a 800 nm y una lám para de alt a presión de
m ercurio en el rango de 254 a 578 nm .
Los fenóm enos de absorbancia y fluorescencia ya fueron explicados en capít ulos
precedent es. En el caso de la reflect ancia la señal obt enida es result ado de la m edición de la
pot encia de radiación reflej ada por los analit os la cual es proporcional a su concent ración. La
m edición de la fluorescencia t iene el inconvenient e de est ar rest ringida para aquellos
com ponent es capaces de fluorescer, ya sea en su est ado nat ivo o con ayuda de reacciones
de derivat ización, pero a su vez posee la vent aj a del increm ent o considerable de la
sensibilidad en la det ección.
Ent re ot ras caract eríst icas que han sido m ej oradas se encuent ran la const rucción de
m onocrom adores capaces de obt ener hast a 1200 líneas/ m m . Con est e t ipo de sist em a, la
cuant ificación puede realizarse de form a confiable y exact a ya que la m edición se realiza “ in
sit u” y no es necesario realizar ninguna m anipulación de la m uest ra.
Debe señalarse adem ás que al igual que ot ras t écnicas crom at ográficas que cuent an hoy en
día con sist em as que perm it en obt ener inform ación est ruct ural de las sust ancias separadas
( com o son los det ect ores de espect rom et ría de m asa para GLC y HPLC, así com o arreglo de
diodos para HPLC) , los densit óm et ros act uales, al ser acoplados a sist em as de com put ación
con soft ware alt am ent e sofist icados, hacen posible la ej ecución de est as m ism as
operaciones, haciendo alt am ent e eficient e el procedim ient o de ident ificación sobre la base
no solo de los valores de Rf sino t am bién con la obt ención de inform ación espect ral “ in sit u”
de los com ponent es crom at ografiados. Así, los densit óm et ros act uales perm it en t am bién
m onit orear el crom at ogram a a diferent es longit udes de onda con una sola corrida de form a
sim ilar a com o lo hacen los det ect ores con arreglo de diodos en HPLC.
La figura 11.20 m uest ra un densit óm et ro acoplado a un sist em a com put arizado.
Figu r a 1 1 .2 0 . D e n sit óm e t r o a copla do a u n sist e m a de com pu t a ción

Finalm ent e querem os discut ir ot ro problem a que est uvo direct am ent e relacionado con el uso
de los densit óm et ros , especialm ent e en el caso de det ecciones donde se em pleaba el
revelado quím ico. Es conocido que el revelado quím ico en form a de spray con react ivos
form adores de com plej os coloreados, t raía com o consecuencia la dist ribución no uniform e
del m ism o, con su consiguient e acum ulación en diferent es punt os de la placa, de form a
het erogénea. Est o conducía a que al aplicar las t écnicas densit om ét ricas se produj eran
considerables desviaciones de la línea de base del crom at ogram a t rayendo com o result ado
una apreciación errónea del área baj o la curva de los picos crom at ográficos. Para resolver
est e problem a, se ha desarrollado un sist em a que perm it e esparcir de form a com plet am ent e
hom ogénea y cont inua el react ivo revelador, por sum ersión de la placa en el sist em a
crom ogénico, por lo que la línea de base del crom at ogram a se present a en condiciones
ópt im as.
Fot odocum e n t a ción
Una vent aj a adicional con la que no cuent a el rest o de las
t écnicas crom at ográficas est udiadas ( GLC y HPLC) es el sist em a
de fot odocum ent ación del crom at ogram a obt enido.
Act ualm ent e exist en adit am ent os que perm it en regist rar
fot ográficam ent e la separación efect uada en la placa ( Figura
11.21.) , en excelent es fot ografías a color, lo m ism o a la luz
ult raviolet a que para aquellas det ecciones con reveladores
quím icos, lo que perm it e crear un archivo de no solo el
crom at ogram a vist o por un densit óm et ro, sino t am bién de la
separación efect uada en la placa crom at ográfica.
Figu r a 1 1 .2 1 . Sist e m a de fot odocu - m e n t a ción
Es innegable que la CCD, gracias al desarrollo innovat ivo de una poderosa inst rum ent ación,
est á resurgiendo nuevam ent e en el cam po del análisis crom at ográfico com o una t écnica
analít ica sum am ent e poderosa que cont ribuye y cont ribuirá en los años próxim os a ganar
cada vez m ás adept os y a reconquist ar a los que en algún m om ent o la abandonaron por
m ét odos inst rum ent ales m ás m odernos.
Bibliogr a fía .
1. Analít icos en Alim ent aria. Mét odos Oficiales de Análisis. Aceit es y grasas. Ed. Panreac
Quím ica SA, 1999.
2. Analít icos en Alim ent aria. Mét odos Oficiales de Análisis. Product os derivados de la uva,
aguardient es y sidra. Ed. Panreac Quím ica SA, 1999.
4. McLeod, J. A. ( 1973) . I nst rum ent al Met hods of Food Analysis. Elek Science. London.

2 Apuntes Cromatografia With Cover Page v2

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

2 Apuntes Cromatografia With Cover Page v2

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Accelerat ing t he world's research.

Related papers Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

INST IT UT O POLIT ECNICO NACIONAL ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E INDUST R…

Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. 2010

7 .2 . Cla sifica ción de los m é t odos cr om a t ogr á ficos

7 .3 . M e ca nism os de se pa r a ción cr om a t ogr á fica

Figu r a 7 .4 . Solve n t e s de e m ple o fr e cu e n t e e n cr om a t ogr a fía de a dsor ción

y B, la m agnit ud α puede calcularse según:

N om br e Gr u po funciona l u n ido Tipo Aplica cione s

Figu r a 7 .5 . Re sin a s in t e r ca m bia dor a s.

1 . Equ ilibr a r la r e sina

El prim er paso del proceso consist e en equilibrar la

Figu r a 7 .6 . Equ ilibr io de la r e sin a

Figu r a 7 .7 . Aplica ción de la m u e st r a

3 . Se pa r a ción de los com pon e nt e s

La diferencia de velocidad de los iones de la m uest ra est ará en

Figu r a 7 .9 . Est r u ct u r a de dos r e sin a s in t e r ca m bia dor a s e n sopor t e de ce lu losa

Tabla 7.2. I nt ercam biadores com erciales usados en crom at ografía

Tabla 7.3. Tipos de int ercam biadores y sus aplicaciones

Tipo de r e sin a Sopor t e + gr u po fu n ciona l Aplica cione s

7 .3 .4 . Cr om a t ogr a fía de filt r a ción sobr e ge l

Figu r a 7 .1 0 . Est r u ct u r a de l ge l pa r a cr om a t ogr a fía de e x clu sión m ole cu la r

El m ecanism o de separación consist e

Figu r a 7 .1 1 . Pr oce so de e x clu sión m ole cu la r

Cor t e lon git u din a l de Et a pa 1 Et a pa 2

Figu r a 7 .1 2 . M e ca n ism o de e x clu sión m ole cu la r

Tabla 7.4. Algunos geles hidrófilos

Tam bién se em plea en la desalinización y separación de m oléculas de baj o peso m olecular

3. Shoenbein, C. F. ( 1861) . Verhandel. Nat urforsch. Ges. Basel 3 Seit e 249.

5. Tswet t , M. ( 1903) .Proc. Warsaw Soc. Nat . Sci. Biol. Sect .

Figu r a 8 .1 . Et a pa s de la se pa r a ción cr om a t ogr á fica

Est as diferencias de afinidad irán produciendo la separación de A y B ( t iem pos t 1 y t 2 ) en la

8 .2 . Et a pa s de t r a ba j o de la cr om a t ogr a fía líqu ida e n colum na conve n cion a l.

8 .2 .1 . Se le cción y pr e pa r a ción de la fa se m óvil y la fa se e st a cion a r ia

Una vez seleccionada la fase est acionaria, est a se

La colum na lleva colocada en su ext rem o inferior

La figura 8.2 m uest ra un esquem a de una colum na

Figu r a 8 .2 . Colu m n a cr om a t ogr á fica

Tal gradient e se logra m ezclando

8 .2 .4 . Re cogida de los e lua t os y de t e cción de los com pon e n t e s

Figu r a 8 .4 . Cole ct or de fr a ccion e s

Figu r a 8 .5 . Cr om a t ogr a m a de se ñ a l vs. volu m e n de e lu ción

Figu r a 8 .6 . Re cogida de los e lu a t os e n fu n ción de los obj e t ivos a n a lít icos

Figu r a 8 .7 . D e t e cción e n lín e a de los e lu a t os

Figu r a 8 .8 . Tie m pos de r e t e n ción y ot r a s m a gn it u de s cr om a t ogr á fica s.

Figu r a 8 .9 . Pa r á m e t r os pa r a e l cá lcu lo de la Re solu ción e n t r e dos picos cr om a t ogr á ficos.

8 .3 .1 . Te or ía s de la e lu ción cr om a t ogr á fica

Figu r a 8 .1 0 . Pr oce so de m igr a ción de dos solu t os ( A y B)

Figu r a 8 .1 1 . Efe ct o de l e n sa n ch a m ie n t o de ba n da sobr e la

Tal y com o se observa en la figura, el efect o m ult ipaso

Así, el ensancham ient o de bandas debido al efect o

Figu r a 8 .1 3 . D ifu sión lon git u din a l

Figu r a 8 .1 4 . Solu ción gr á fica de la e cu a ción de Va n D e e m t e r .

w E = m asa del analit o en la fase est acionaria

select iva m ient ras m ayor es el valor de α.

válvula de introducción de muestras y la columna cromatográfica, se sitúa generalmente una

Figu r a 9 .1 . Esqu e m a de u n sist e m a cr om a t ogr á fico H PLC

Viscosida d λ lím it e Í ndice de Re fr a cción

Es preciso señalar que las propiedades físicas de un sistema de solventes dependen de la

Para la mayoría de los solventes la eficiencia de la desgasificación con He es superior a

En la actualidad, la mayoría de los fabricantes oferta bombas reciprocantes de dos pistones,

1 . Con e x ión de l la z o / 2 . Bom ba / 3 . Colu m n a /

Figu r a 9 .2 . Vá lvu la de in ye cción : A) posición de ca r ga , B) in t r odu cción a la colu m n a

En la actualidad existen también los llamados