Equipo #3

30/10/2018
Beltrán Rábago Luis Hernán
Guerrero Guzmán Adrian
Hernández Martínez Edher Daniel
López Vargas Julia Edith.
Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

I​ntroducción. 250 mL/ 1 varilla de vidrio/ 1 embudo/ 1

En ésta práctica se extrajo ADN del piseta de etanol 70%/ 10 mL de jabón.
plátano, utilizando un detergente en una
disolución salina. El detergente (en éste
caso el jabón líquido) degrada la Metodología.
membrana de las células, así liberando al “Extracción del ADN de plátano”
ADN y proteínas de la misma, y se
procede a hacer lavados con etanol
helado; el ADN es soluble en etanol, pero
al estar en una disolución de NaCl, los
iones Na​+ ​neutralizan la carga negativa de
los fosfatos, por lo que se insolubiliza y se
precipita en la disolución.
Para cuantificar el ADN obtenido,
se utilizó el espectrofotómetro, haciendo
una curva de calibración midiendo la
absorbancia a distintas longitudes de
onda, y utilizando la ley de Lambert-Beer
se puede obtener una ecuación que nos
indica la concentración de nuestra
muestra en relación con su absortividad.

Objetivo.
Se debe extraer ADN a partir de las
células de un plátano y cuantificar por
medio de un espectrofotómetro. Comparar
la concentración de ADN obtenido a partir
del plátano contra el ADN obtenido en la
parte A de la práctica.

Materiales.
1 micropipeta 20-200uL/ 2 puntas azules/
1 piseta de agua/ 2 celdas para
espectrofotómetro/ 1 espectrofotómetro/
ADN obtenido previamente.

1 bolsa ziploc “tamaño sándwich” / 1 “Cuantificación del ADN”

plátano/ 2 papel filtro de cafetera/ 1 Vaso
de precipitados de 50 mL/ 1 probeta de
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Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

A= absorbancia
l = Longitud de onda
c= concentración
ε = cte de proporcionalidad
A
por lo tanto c= εl
Resultados de muestra de ADN de
bacteria
c1B = 0.055 -4 ​
230 = 2.391x10​ (o 4181)
c2B = 0.036
260 = 1.384x10​
-4

0.006
c3B = 280 = 2.142x10​
-5

0.042
c1′B = 230 = 1.826x10​
-4

0.018
c2′B = 260 = 6.923x10​
-4

0.007
c3′B = 280 = 2.5x10​
-5

Resultados de muestra de ADN de

plátano
c1P = 0.004
230 = 1.739x10​
-5

c2P = 0.006
260 = 2.307x10​
-5

0.018
c3P = 280 = 6.428x10​
-5

0.004
c1′P = 230 = 1.739x10​
-5

0.004
c2′P = 260 = 1.538x10​
-5

Resultados. 0.002
c3′P = 280 = 7.142x10​
-6
Se eliminó la pared celular, dejando el
ADN expuesto.
Discusión.
Tabla #1
En esta práctica, se hizo la extraccion de
nm ADN Bacteria ADN plátano ADN de un plátano, en donde al momento
de macerar la pulpa, empezamos aislar y
230 0.055 0.042 0.004 0.004
purificar las moléculas de ADN y con ello
260 0.036 0.018 0.006 0.004 cambia las características fisicoquímicas;
y con ello, se afectan la acción de las
280 0.006 0.007 0.018 0.002 enzimas durante la reacción de PCR.
Blanco 3 ml de H2​ O
​
Donde cada tejido tiene sus
Para medir la absorbancia del ADN de consideraciones propias y siempre será
plátano se disolvieron 10 ul de ADN en necesario conocerlas para llevar a cabo
2990 ul de H2​ O.
​
una colecta y extracción correcta. Pero al
Para determinar la concentración de ADN momento de precipitar el ADN, lo único
en nuestra disoluciones, a partir de la que se está haciendo en ese momento es
absorbancia, utilizamos la Ley de que se eliminan los lípidos y las proteínas,
Lambert-Beer. para luego poder recuperar el ADN. Y al
A = εlc ; donde utilizar el Etanol, con sus altas
concentraciones de iones de sodio o
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Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

amonio se unen a los grupos fosfato, esta absorción de luz puede ser deducida a
mezcla y reduce las fuerzas repulsivas partir de la luz transmitida basada en el
entre las cadenas y permite que el ADN uso de espectrofotometría.
se pliega sobre sí mismo haciéndolo
insoluble. Y cuando se hace la Cuestionario.
centrifugación permite que el ADN
permanezca en el fondo del tubo mientras 1. ¿Cuál es el propósito de tratar
que el etanol es desechado. Los restos de las células con un detergente?
etanol se eliminan con un lavado con
etanol al 70% y el remanente se elimina R. Las interacciones
por evaporación. Aunado a ello, se hizo l (lípido-lípido, lípido-proteína y
análisis de la pureza del ADN proteína-proteína) entre las
(cuantificación), que dependiendo de cada moléculas que conforman la
caso, se debe usar una longitud de onda pared, la membrana celular y
específica, que en nuestro caso era 260
nuclear se modifican o
nm y para las proteínas 280 nm, donde
destruyen permitiendo que los
entre ellas, existía una relación de 1.8. En
ácidos nucleicos se liberen .
cuanto a lo que hicimos, no tuvimos un
problema al momento de analizar la (Sambrook et al. 1989)
muestra, el unico problema presente fue
2. ¿Qué características tiene la
el uso del espectrofotómetro, porque no
guanidina y cómo funciona?
medía bien la absorbancia, de lo obtenido.
R. La guanidina (CH​5​N​3​) es un
Conclusiones.
compuesto puro de color
En base en los resultados obtenidos en
blanco, cristalino y altamente
esta práctica, la extracción del DNA del
alcalino, con temperatura de
plátano a partir de un detergente y sus
posteriores lavados con etanol, fusión de 323,15 K (50 °C) y
precipitaron fibrillas de ADN de un color masa molecular de 59,07 g/mol.
blanco formando un mezcla heterogénea Se forma a partir de la
que se ocupó para comparar las oxidación de la guanina y la se
concentraciones con un ADN bacteriano. encontrar de manera natural en
Posteriormente se determinó, por medio la orina como un producto
de espectrofotometría, la concentración normal del metabolismo de las
de ADN bacteriano y ADN de un plátano
proteínas. (​Brewster, R., 1975​)
utilizando la ley de Lambert-Beer,
despejando de la ecuación original la
concentración y así poder obtener los
valores para la cuantificación del ADN de
las dos especies concluyendo que la
relación de la concentración y la
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Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”
”Híbrido de resonancia”
3. ¿Por qué precipita el ADN en
presencia de etanol?
R. Después de que son
eliminados los lípidos y las
proteínas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y
soluciones con altas
concentraciones de iones de
sodio o amonio que se unen a
los grupos fosfato, esta mezcla
reduce las fuerzas repulsivas
entre las cadenas y permite que
el ADN se pliegue sobre sí
mismo haciéndolo insoluble. Un
paso de centrifugación permite
que el ADN permanezca en el
fondo del tubo mientras que el
etanol es desechado. Los
restos de etanol se eliminan
con un lavado con etanol al
70% y el remanente se elimina
por evaporación. (​Crespo, A. y
col., 1999​)
4. Describa métodos alternativos
de purificación del ADN
R. ​Diferentes métodos de
extracción resultan en diferente
pureza y rendimiento de ADN.
Tecnología basada en sílica: El
ADN se adsorbe
específicamente a
membranas/esferas/partículas
de sílica en presencia de ciertas
sales y a un pH particular. Los
contaminantes celulares son
eliminados mediante diferentes
pasos de lavado.
Separación magnética: Método
basado en la unión reversible
del ADN a una
superficie/esferas/partículas
sólidas magnéticas, las cuales
han sido recubiertas con un
anticuerpo que une ADN o un
grupo funcional que interactúa
específicamente con el ADN.
Tecnología de intercambio
aniónico: Método basado en la
interacción específica entre los
fosfatos cargados
negativamente presentes en los
ácidos nucleicos y moléculas de
superficie cargadas
positivamente en el sustrato.
Otros métodos incluyen la
precipitación por sales (“salting
out”), gradientes de densidad
de cloruro de cesio y resina
chelex 100.
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Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

(Dhaliwa, A., 2013)

1. Dill, K. A. & Shortle, D., estado
5. Describa algún método de desnaturalización de
alternativo de cuantificación del proteínas. Annu. Rev.
ADN Bioquímica. 60, 795 (1991).
2. LEHNINGER, A., NELSON, D.,
R. Existen dos métodos para COX, M., Principios de
cuantificar ácidos nucleicos. 1) Bioquímica, 4º Edición, Ed.
Estimación a partir de la Omega, Barcelona, 2015, pp.
intensidad de fluorescencia 190,
emitida por bromuro de etidio, 3. Carrillo Wilman., (4 - DICIEMBRE
como se describió 4. 2013) Lisozima: Actividad
anteriormente. 2) Medición antibacteriana y alergenicidad.
Vol. 14. 318, 321-323.
espectrofotométrica de la
5. Santambrosio, E., Ortega, M. y
cantidad de irradiación
Garibaldi P. (2009) Tinción y
ultravioleta absorbida por las observación de
bases purínicasy pirimidinicas. microorganismos. Argentina.
(Sambrook et al. 1989) Recuperado de:
https://www.frro.utn.edu.ar/repo
6. ¿Cuáles son los objetivos de la
sitorio/catedras/quimica/5_anio/
electroforesis? biotecnologia/practico4.pdf
6. Lemus, Venezolana, M. J. y
R. Separar fragmentos de ADN
Cortez Suárez, L. A. (2015)
y ARN en función de su
Bioquímica general:
tamaño, visualizarlos mediante fundamentos y análisis de
una sencilla tinción, y de esta laboratorio. Machala, Ecuador :
forma determinar el contenido Universidad Técnica de
de ácidos nucleicos de una Machala.
muestra, teniendo una 7. Murray, R., Bender, D., Kennelly,
estimación de su concentración. P., & Rodwell, V. Harper
(​Cann J., 1989.​) Bioquímica Ilustrada. Editorial
McGraw- Hill Companies, inc.
7. Haga un esquema del enlace 29° edición. (2013). USA.
entre dos monómeros de la 8. Watson, J. D., Baker, T., Bell, S.,
agarosa. Gann, A., Levine, M. Biología
Molecular del Gen, 7° edición.,
Editorial médica panamericana
S.A de C.V.
9. Alberts B., Bray D., Lewis J.,
Bibliografía. Raff M., Roberts K., Watson J.D.
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Guerrero Guzmán Adrian
Hernández Martínez Edher Daniel
López Vargas Julia Edith.
Valdivia Vázquez Jovana Ameyalli
Práctica # 5 ​“Purificación y cuantificación de ADN”

Biología molecular de la célula

(1996) Omega.
10. Brewster, Ray Q. Mcewen,
Willian E. Química Orgánica/
Ray Q Brewster, Willian E
Mcewen Instituto Cubano del
Libro. La Habana. Edición
Revolucionaria. 1975

11. Cann J. R. 1989.

Phenomenological theory of
gel electrophoresis of
protein-nucleic acid
complexes. Journal of
Biological Chemistry 264:
17032-17040.

12. Crespo A., O. Blanco, O. F.

Cubero, M. C. Molina y P.
Cubas. 1999. Técnicas y
métodos para la iniciación en
el estudio de la evolución
molecular con aplicaciones
especiales para el análisis de
los hongos liquenizados.
Botanica Complutensis.

13. Dhaliwa, A. (2013-05-26)

Extracción y purificación de
ADN. Labome. ISSN :
2329-5139

14. Sambrook J., E. F. Fritsch y T.

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Laboratory Press, Cold
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