Manual de Microbiología de Alimentos

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INSTITUTO TECNOLÓGICO AÑO MES DÍA
SUPERIOR DE TEZIUTLÁN 2017 06 01
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS PUNTO(S) DE LA NORMA

(M-MDA-01) QUE APLICA: 7.5.1
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
ELABORÓ: REVISÓ: AUTORIZÓ:
PUESTO DOCENTE SUBDIRECCIÓN ACADÉMICA DIRECCIÓN ACADÉMICA
FECHA 01 DE JUNIO DEL 2017 01 DE JUNIO DEL 2017 01 DE JUNIO DEL 2017
NOMBRE Y ING. MARLÉN HERNÁNDEZ MTRA. MYRIAM SÁNCHEZ
M.C. JOSÉ LUÍS SESEÑA OSORIO
FIRMA HERNÁNDEZ PÉREZ
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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR AÑO MES DÍA
DE TEZIUTLAN 2017 06 01
PUNTO(S) DE LA NORMA
QUE APLICA: 7.5.1
(M–MDA–01)
PRESENTACIÓN
Con el fin de lograr la enseñanza - aprendizaje en la materia de Microbiología de

Alimentos de la carrera de Ingeniería en Industrias Alimentarias, el División de
Ingeniería en Industrias Alimentarias pone a disposición de profesores y alumnos un
manual de prácticas, el cual contiene seis prácticas que están diseñadas de acuerdo al
plan de estudios IIAL – 2010 - 219.
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ÍNDICE
Introducción…..................................................................................... 4
Reglamento…...................................................................................... 6
Medidas de seguridad en el laboratorio………..………………….....……………. 7
Competencias específicas a desarrollar………………………………………………. 12
Practica no. 1 “Determinación de closdtridios sulfito reductores en agua” 17
Practica no. 2 “Recuento de bacterias mesófitas aerobias en agua para

23
consumo humano”……...……………………………………………………………………
Practica no. 3 “Coliformes totales y fecales en agua de consumo
29
humano”………………………………………………………………………………………….
Practica no. 4 “Evaluación microbiológica de hongos, levaduras y
46
coliformes para diferentes tratamientos de carne de res”……………………..
Practica no. 5 “Análisis microbiológico de materias primas, superficies,
48
productos terminados”………………………................................................
Practica no. 6 “Detección de salmonella en alimentos”............................ 50
Bibliografía………………………………………………………………..…………………….. 52
Anexos………………….…………………………………………………………………………. 53
Formato de reporte de prácticas………………………………………………………… 54
Rúbrica de evaluación de competencias específicas del laboratorio de

59
química……………………………………………………………………………………………
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INTRODUCCIÓN
En el Instituto Superior de Teziutlán se imparte la carrera de Ingeniería en Industrias
Alimentarias, misma que en su retícula incluye la materia de Microbiología de
Alimentos, la cual tiene un valor de 6 créditos que son obtenidos de 4 horas clases
más 2 horas prácticas, las horas prácticas son llevadas a cabo en el Laboratorio de
Microbiología, por lo que la División de Ingeniería en Industrias Alimentarias de este
Instituto pone a disposición el presente Manual de Microbiología de Alimentos que
incluye seis prácticas, realizadas de acuerdo al contenido temático.
Cabe mencionar que las prácticas aquí descritas ya se han realizado en ciclos de clases
anteriores en el laboratorio de este Instituto, por lo que la metodología empleada es
segura y confiable.
La planeación de cada práctica responde a un análisis de los contenidos temáticos del

programa de la asignatura Microbiología de Alimentos, ALM-1016.
Con el desarrollo de las prácticas que integran este manual el alumno se familiarizará
con el uso del microscopio, preparación de extensiones y su tinción, preparación,
esterilización y distribución de medios de cultivo, algunos métodos de control de los
microorganismos, diferentes técnicas de aislamiento de microorganismos aerobios y
anaerobios y su identificación, así como también con la determinación de diversos
indicadores de contaminación fecal del agua y otras técnicas de laboratorio que
permitirán conocer el grado de contaminación microbiológica en los alimentos el aire,
agua y superficies.
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Microorganismos en los alimentos
Desde el punto de vista sanitario, los alimentos pueden ser vehículos de infecciones
(ingestión de microorganismos patógenos) o de intoxicaciones graves (ingestión de
toxinas producidas por microorganismos). En este sentido se han desarrollado las
técnicas de control microbiológico de alimentos. Muchas veces la causa de la
contaminación del alimento se debe a medidas higiénicas inadecuadas en la
producción, preparación y conservación; lo que facilita la presencia y el desarrollo de
microorganismos que producto de su actividad y haciendo uso de las sustancias
nutritivas presentes en éste, lo transforman volviéndolo inaceptable para la salud
humana. Por esta razón, es que una de las principales actividades en la conservación y
elaboración de alimentos a partir de productos vegetales y animales es la reducción de
la contaminación de los mismos, sea biótica o abiótica. Para poder llevar a cabo esta
actividad es necesario lo siguiente:
✓ Identificar los agentes contaminantes y las fuentes de contaminación.

✓ Caracterizar el potencial tóxico de los agentes y de las sustancias
contaminantes individualmente.
✓ Valorar en términos reales el impacto sobre la salud del consumidor.
✓ Controlar los niveles de los contaminantes en los alimentos.
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REGLAMENTO DE LABORATORIO
PROHIBIDO
✓ El ingreso de personas ajenas al grupo y la salida de alumnos mientras se están

llevando a cabo las practicas
✓ Ingresar alimentos o bebidas
✓ Cambiar por iniciativa propia el procedimiento al realizar un experimento.
✓ cambiar de posición los reactivos o materiales de uso general.
RESPONSABILIDADES DEL USUARIO
✓ Usar bata del laboratorio y lentes de protección.

✓ Solicitar los reactivos y el material a utilizar al instructor, a través de un
responsable de equipo y por medio de un vale.
✓ Permanecer en el lugar asignado al equipo.
✓ Informar inmediatamente al instructor si ocurre un accidente.
✓ Leer la etiqueta para identificar el contenido de un frasco, tomar la cantidad
exacta para no regresar excedentes al frasco original.
✓ No mezclar cucharas o pipetas utilizadas al tomar diferentes reactivos.
✓ Entregar limpio y seco el material usado en la práctica.
✓ Reponer en especie el material usado en la práctica.
✓ Acomodar los bancos y dejar limpia la mesa de trabajo.
El usuario que no respete el reglamento será suspendido
Para cualquier duda o sugerencia, favor de dirigirse con el responsable en turno.
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1.- Para evitar quemaduras se deberán colocar los objetos calientes sobre tela de
asbesto.
2.- Al calentar sustancias contenidas en un tubo de ensaye, no se debe apuntar la

boca del tubo al compañero o a sí mismo, ya que pueden presentarse proyecciones de
líquido caliente.
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3.- Para llevar acabo diluciones de ácidos concentrados se deben llevar a cabo los
siguientes pasos:
➢ Utilizar recipientes de pared delgada

➢ Añadir lentamente el ácido al agua resbalándolo por las paredes del recipiente,
al mismo tiempo que se agita suavemente (jamás debe agregarse agua al
acido), ya que puede formarse vapor con violencia explosiva.
➢ En caso de que el recipiente en donde se está llevando a cabo la dilución se
caliente será necesario interrumpir de inmediato y se continuara el proceso en
baño de agua fría.
4.- En caso de ingestión accidental de algún reactivo deberá notificarse se deberá

avisar inmediatamente al instructor.
5.- Para oler una sustancia debe evitarse hacerlo directamente por lo que deberemos
atraer sus vapores con las manos hacia la nariz.
6.- Al final de cada practica se deberá preguntar al instructor sobre productos que
pueden ser arrojados al desagüe, de esta manera evitaremos la contaminación de ríos
y lagunas.
7.- cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen la operación

deberá hacerse bajo una campaña de extracción.
8.- Los frascos que contengan los reactivos a emplear en la práctica deberán
mantenerse tapados mientras no se usen, además de no llevárselos a la mesa de
trabajo salvo autorización previa.
9.- No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo.
10.- Se deberá mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el laboratorio

y estar atentos a las instrucciones del docente.
SUSTANCIAS QUE DEBEN USARSE CON PRECAUCIÓN

Todas las sustancias utilizadas en las prácticas en el laboratorio son potencialmente
peligrosas por lo que deberá trabajarse con cautela y normar el comportamiento en el
laboratorio por las exigencias de la seguridad personal y del grupo que se encuentre
realizando una práctica.
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Existen sustancias orgánicas e inorgánicas que son corrosivas o que son absorbidas
fácilmente por la piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de
evitar su contacto directo; en caso de que ocurriera se deberá lavar inmediatamente la
parte afectada con abundante agua.
A continuación se muestran algunas sustancias que se deben usar con mayor

precaución.
Ácido Fluorhídrico (HF)
Causa quemaduras de acción retardada en la piel, en contacto con las uñas causa
fuertes dolores, y sólo si se atiende a tiempo se puede evitar la destrucción de los
tejidos incluso el óseo. (Nunca se deben pipetear directamente con la boca).
Ácido Nítrico (HNO3)
En unos cuantos segundos daña permanentemente los ojos y es sumamente corrosivo

en contacto con la piel, produce quemaduras, mancha las manos de amarillo por
acción sobre las proteínas. (Nunca se deben pipetear directamente con la boca).
Ácido Sulfúrico (H2SO4), Fosfórico (H3PO4) y Clorhídrico (HCl)
Lesionan rápidamente la piel y los tejidos internos. Sus quemaduras tardan en sanar y
pueden dejar cicatrices (Nunca se deben pipetear directamente con la boca).
PASOS A SEGUIR EN CASO DE UN ACCIDENTE

En caso de ocurrir un accidente en el laboratorio, deberá comunicarlo inmediatamente
al auxiliar del laboratorio.
➢ Salpicaduras por ácidos y álcalis.- Lavarse inmediatamente y con

abundante agua la parte afectada. Si la quemadura fuera en los ojos o muy
extensa lavar abundantemente y acudir inmediatamente al servicio médico.
➢ Quemaduras por objetos, líquidos o vapores calientes.- Aplicar pomada
para quemadura. En caso necesario, proteger la piel con gasa y acudir al
servicio médico.
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INCENDIO DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Agentes de extinción
Las principales causas de incendios en los laboratorios suelen ser la manipulación con
cierta ligereza de los productos, mecheros, etc. Y el emplazamiento de las sustancias
inflamables cerca de fuentes de calor como estufas, hornillos, etc.
En caso de iniciarse el fuego hay que tener en cuenta que no siempre el agua es el
agente de extinción idóneo. Para cada grupo de productos inflamables debe emplearse
un agente de extinción apropiado:
1. Agua, polvo seco o anhídrido carbónico.

2. Polvo seco o anhídrido carbónico
3. Arena seca o polvo seco.
I. Símbolos de peligro
Existen símbolos (íconos) que se utilizan en las etiquetas de los envases que contienen
los reactivos, para indicar el grado de peligrosidad de los mismos y que están regidos
por el Sistema Globalmente Armonizado de Clasificación y Etiquetado de Productos
Químicos, así como en la Norma Oficial Mexicana NOM-018-STPS-2015, Sistema
armonizado para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por sustancias
químicas peligrosas en los centros de trabajo:
IMAGEN PELIGROSIDAD DESCRIPCION
Sustancias y preparados que

pueden explosionar bajo el efecto
[E] de una llama o que son más
EXPLOSIVOS sensibles a los choques o a la
fricción que el dinitrobenceno.
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Sustancias y preparados que en

contacto con otros particularmente
[O] COMBURENTES
con los inflamables originan una
reacción fuertemente exotérmica
(Gran desprendimiento de energía).
Sustancias y preparados líquidos

[ F+ ] cuyo punto de destello sea inferior
EXTREMADAMENTE a 0º -1º centígrados y su punto de
INFLAMABLES ebullición inferior o igual a 35º
centígrados.
[F] Sustancias y preparados cuyo punto

FÁCILMENTE de destello sea inferior a 21º
INFLAMABLES centígrados.
Son sustancias y preparados que

por inhalación, ingestión o
penetración cutánea pueden
[ T+ ] MUY TÓXICOS
entrañar riesgos extremadamente
graves, agudos o crónicos e incluso
la muerte.

por inhalación, ingestión o
[ T ] TÓXICOS penetración cutánea pueden
entrañar riesgos extremadamente
graves, agudos o crónicos e incluso
la muerte.
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Son sustancias y preparados que en

[ C ] CORROSIVOS contacto con los tejidos vivos
puedan ejercer sobre ellos una
acción destructiva.

por inhalación ingestión o
[ Xn] NOCIVOS penetración cutánea puedan
entrañar riesgos de gravedad
limitada.
Sustancias y preparados no
corrosivos que por contacto
[ Xi ] IRRITANTES prolongado o repetido con la piel o
mucosas puedan provocar una
reacción inflamatoria.
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Competencias específicas a desarrollar

I. Realizar procedimientos microbiológicos de laboratorio.
II. Aplicar principios de Microbiología de Alimentos
Tabla 1. Descripción de la competencia específica: “Realizar procedimientos

microbiológicos de laboratorio”.
Objetivo Norma
Enunciado de la competencia Contexto de realización

i. A partir de materias primas, reactivos y
soluciones afines a las prácticas
correspondientes al programa de
Microbiología de Alimentos de la carrera de
Ingeniería en Industrias Alimentarias.
I. Realizar procedimientos
microbiológicos de
ii. Por medio de equipos e instrumentos de
laboratorio.
laboratorio.
iii. Con ayuda de manuales de referencia y

normas técnicas.
Elementos de competencia Criterios de rendimiento

1.1 Manipulación adecuada de los reactivos y
1) Manipular reactivos y material de laboratorio afines a los
material de laboratorio
procedimientos.
afines a los
procedimientos 1.2 Respeto de las fases de trabajo.
2.1 Manipulación de los reactivos y material de

laboratorio afines a los procedimientos.
2.2 Diseño y montaje adecuados de los aparatos
2) Aplicar procedimientos necesarios para los procedimientos.
sencillos de laboratorio
2.3 Ejecución eficaz del procedimiento.
2.4 Respeto de las normas de seguridad e
higiene.
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3.1 Selección correcta del procedimiento según

las características de la práctica.
3.2 Conocimiento del material del laboratorio y
3) Preparar disoluciones y del procedimiento de forma cuidadosa y
cultivos de composición y eficaz.
concentración conocida
3.3 Realización correcta de los cálculos
pertinentes.
3.4 Medición correcta de las magnitudes.
4.1 Identificación correcta del equipo apropiado.

4.2 Determinación de las características estáticas
de la escala del instrumento o equipo.
4) Aplicar métodos de 4.3 Ejecución adecuada de la medición y
medición de magnitudes
manipulación correcta del equipo con respeto
a las normas de funcionamiento del mismo.
4.4 Trabajo organizado
5.1 Conocimiento del fundamento teórico del

procedimiento.
5.2 Diseño y montaje correcto del aparato y
manipulación de los útiles.
5) Sintetizar sustancias 5.3 Ejecución correcta del procedimiento.
5.4 Ejecución precisa del cálculo de rendimiento.
5.5 Respeto de las normas de seguridad e
higiene.
6.1 Realiza preparaciones fijas y las elaboradas.
6) Utiliza el microscopio 6.2 Identifica la morfología celular de los
adecuadamente diferentes tipos de microorganismos
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Tabla 2. Descripción de la competencia específica: “Aplicar principios de

Microbiología de Alimentos”.
Objetivo Norma
Enunciado de la competencia Contexto de realización
i. A partir de materias primas, reactivos,
equipo e instrumentos del Laboratorio de
II. Aplicar principios de Microbiología.
Microbiología de ii. Con la ayuda de libros, manuales de
alimentos referencia, TIC’s, SGC, SGA y Sistema de
Protección Civil
iii. En el Laboratorio de Microbiología del
Instituto Tecnológico Superior de Teziutlán
Elementos de competencia Criterios de rendimiento
1) Determinación de 1.1 Realiza el análisis microbiológico de diferentes

closdtridios sulfito alimentos y en agua.
reductores en agua. 1.2 Consultar y aplicar las especificaciones
microbiológicas para los alimentos según la
normatividad nacional e internacional vigente.
2) Recuento de bacterias 2.1 Identificar los factores que intervienen en el

mesófitas aerobias en crecimiento microbiano.
agua para consumo 2.2 Comprender y describir los factores
relacionados con la alteración de los
humano
alimentos.
2.3 Identificación correcta de los procedimientos
de siembra de microorganismos.
2.4 Identificación correcta de la morfología de los
microorganismos.
3) Coliformes totales y 3.1 Identificación adecuada de técnicas de

fecales en agua de siembra de acuerdo al microorganismo a
consumo humano. identificar.
3.2 Realiza siembras microbiológicas que le

permite ejercitar e integrar los conocimientos,
habilidades y actitudes adquiridas durante
clases anteriores.
3.3 Desarrolla el pensamiento crítico y maneja la
información obtenida (analiza, compara,
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infiere) en diferentes tareas.

3.4 Plantea la solución a un problema específico
dentro del área de los alimentos con base en
la evidencia de pruebas microbiológicas en
agua para el consumo humano.
4) Evaluación microbiológica 4.1 Habilidad en el cultivo, de microorganismos y

de hongos, levaduras y en las metodologías
coliformes para diferentes 4.2 Ejecución adecuada de las medidas de
tratamientos de carne de seguridad e higiene.
res. 4.3 Manipulación correcta del equipo con respeto a
las normas de funcionamiento del mismo.
5) Análisis microbiológico de 5.1 Conocimientos de las metodologías de cultivo

materias primas, de microorganismos en materias primas,
superficies, productos terminados.
superficies, productos
terminados 5.2 Ejecución adecuada de las medidas de
seguridad e higiene.
6) Detección de salmonela 6.1 Capacidad para evaluar la actividad de los

en alimentos. microorganismos en ambientes naturales.
6.2 Ejecución adecuada de las medidas de
seguridad e higiene.
RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE COMPETENCIAS ESPECÍFICAS DEL LABORATORIO

DE MICROBIOLOGÍA.
En el Anexo I se adjunta la rúbrica de evaluación de competencias en Laboratorio.
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(M - MDA - 01) QUE APLICA: 7.5.1
Prácticas
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PRÁCTICA No.1
DETERMINACIÓN DE CLOSDTRIDIOS SULFITO REDUCTORES EN AGUA
OBJETIVO: Determinar la presencia de Closdtridios sulfitos reductores en agua

por el método de recuento en tubo.
ANTECEDENTES:
Los procedimientos bacteriológicos de rutina en el análisis de agua incluyen la
determinación de Closdtridios sulfito reductores.
Se consideran Closdtridios sulfito reductores aquellas bacterias de morfología bacilar,
Gram positivas, anaerobias estrictas, capaces de formar esporas y con actividad sulfito
reductora.
La determinación de éstos se basa en el recuento del número de colonias de esporas
con capacidad sulfito-reductora, desarrolladas en un medio específico, incubadas en
condiciones anaeróbicas durante un tiempo y a una temperatura determinada.
Material Sustancias
✓ 4 Tubos de 18 x 159 mm ✓ 1 Muestra de agua (100 mL), ya

estériles. sea de consumo “clorada”,
✓ Baño de agua con temperatura "natural limpia" o "residual", por
constante a 50 °C. cada equipo.
✓ Baño de agua con temperatura ✓ 4 Tubos de 20 x 200 mm
constante a 80 °C conteniendo cada uno 15 mL de
✓ 3 Pipetas de 10 mL estériles. agar sulfitopolimixina- sulfadiazina
✓ Gradillas para tubos de 18 x (SPS) aun fundido,
150 mm y de 20 x 200 mm. manteniéndolos en un baño de
✓ Mechero. agua a 50 °C con el objeto de que
✓ Cerillos o encendedor. permanezcan a esa temperatura y
✓ Parafina o vaselina estéril. al mismo tiempo para eliminar el
aire.
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Desarrollo de la práctica
Tiempo estimado: 3 horas
a. Agitar vigorosamente la muestra para homogeneizar.

b. A partir de la muestra previamente homogeneizada tomar alícuotas de 10 ml
con una pipeta estéril y depositarlas en cada uno de los tubos estériles.
c. Una vez que estos tubos contienen los 10 ml de agua, mantenerlos en un
baño de agua a 80 °C durante 5 minutos a efecto de que se destruyan las
formas vegetativas y permanezcan solamente las formas esporuladas. Fig. 1.
d. Tomar los tubos con SPS agar a 50 °C y proceder a su inoculación profunda,
de la siguiente manera:
i. Con una pipeta estéril tomar 5 ml de dicha agua e introducirla hasta el
fondo del tubo que contiene el agar.
ii. Con mucho cuidado se va depositando el agua a lo largo de todo el tubo
desplazando la pipeta al exterior procurando que el total de la muestra
quede en el agar y no se airee.
iii. Rápidamente pasar el tubo a la llave del agua para enfriarlo.
iv. Después añadir una capa de vaselina o parafina estéril de unos 3 mm de
espesor para conseguir condiciones de anaerobiosis.
v. Este procedimiento se repite con los 3 tubos restantes.
vi. Es aconsejable rotular cada tubo convenientemente.
Nota:
Si se sospecha que el agua está muy contaminada, se puede inocular 5 ml

de muestra en un tubo y 5 ml de las diluciones 10-1, 10-2.
e. Una vez inoculados todos los tubos, incubar a 37°C (±1°C) durante 24 hr.
(±2 hr.).
f. Transcurrido el período de incubación, contar las colonias de color negro que
aparezcan en la totalidad de los cuatro tubos inoculados. Fig. 2.
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Cálculos y presentación de resultados:
Efectuado el recuento en los tubos correspondientes, el resultado obtenido se

calculará de la siguiente manera:
✓ Si se han sembrado 20 ml de muestra, el resultado es directo.

✓ En caso de haber realizado diluciones, se aplica la siguiente fórmula:
Número de esporas de closdtridios sulfito-reductores/20 ml =
(Número de colonias/volumen real de la muestra inoculada en ml) x 20
Los resultados se expresaran así:
Número de esporas de closdtridios sulfito-reductores: ____/20 ml.
Ejemplos:
a. Los resultados obtenidos en la determinación, en agua, de esporas de

closdtridios sulfito-reductores son los que se especifican a continuación:
Volumen de muestra Tubo Numero de colonias

inoculada (mL)
5 1 5
5 2 5
5 3 2
5 4 4
Número total de colonias: 5 + 3 +2 + 4 = 14

Volumen total de muestras inoculada = 20 ml
El resultado es directo y, por tanto, se expresará
Numero de esporas de closdtridios sulfito-reductores: 14/20 ml
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b. En el análisis de una muestra de agua fue necesario efectuar diluciones para

la determinación de esporas de closdtridios sulfito-reductores, obteniendo
los siguientes resultados:
c.
Volumen de muestra Tubo Numero de colonias

inoculada (ml)
5 1 Incontables
0.5 2 13
0.05 3 7
0.005 4 0
Los tubos en los cuales se ha realizado el recuento de colonias son los números 2
y 3, por tanto:
• Número total de colonias: 13 + 7 = 20

• Suma de los volúmenes de muestra inoculados: 0.5 + 0.05 = 0.55
• Se aplica la fórmula general: (20 colonias/0.55 ml) x 20 = 727
• El resultado se expresará:
Número de esporas de Closdtridios sulfito-reductores: 727/20 ml.
Cuestionario
1. ¿Por qué las colonias de closdtridios sulfito reductores son de color negro en
el agar SPS?
2. ¿A qué se debe la posible presencia de Closdtridios sulfito reductores en
agua?
3. ¿En qué otro medio se pueden encontrar difundidos los Closdtridios?
4. ¿A qué se atribuye la patogenicidad de los Closdtridios?
5. Mencionar 5 especies de Closdtridios.
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Fig. 1 Determinación de Closdtridios Sulfito-reductores por el método de recuento

en tubo.
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Fig. 2 Serie de diluciones donde se observa colonias de closdtridios Sulfito

Reductores bien aisladas en los tubos de la Izquierda
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PRÁCTICA No. 2
RECUENTO DE BACTERIAS MESÓFITAS AEROBIAS EN AGUA PARA
CONSUMO HUMANO
OBJETIVO: Determinar la presencia de bacterias Mesófilas Aerobias en una

muestra de agua potable por la técnica de placa vertida.
ANTECEDENTES:
De todos los tipos de contaminación ambiental, puede destacarse la contaminación
del agua.
Muchas veces el agua puede ser completamente transparente, incolora e inodora,

pero estar aún contaminada, por lo que, es importante determinar su calidad sanitaria.
La potabilidad del agua sólo se puede determinar mediante análisis químicos y

bacteriológicos.
Los procedimientos bacteriológicos de rutina son: Recuento de Bacterias Mesófilas

Aerobias, Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Estreptococos Fecales y
Closdtridios Sulfito Reductores.
Los recuentos de Mesófilos Aeróbicos en placa son útiles para determinar la

potabilidad de un agua, así como también la eficiencia de las operaciones para
eliminar microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración. Las cuentas
se deben hacer antes y después del tratamiento específico. Los resultados indicarán
la medida en que ha sido reducida la población microbiana. Lo usual es que el agua
de buena calidad, para consumo humano, tenga cuentas bajas: < 100 UFC (Unidades
formadoras de colonias) por mililitro.
La determinación del conteo de bacterias mesófilas aerobias en una muestra de agua

se realiza, normalmente, por siembra en una placa, de un volumen determinado de
agua, por incubación a una temperatura concreta y en un tiempo determinado, y por
recuento posterior de las colonias desarrolladas y con la aceptación implícita de que
cada colonia es originada por una bacteria de la muestra inicial, por lo tanto, el
número de colonias equivaldrá al número de bacterias en el volumen sembrado.
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Materiales Sustancias
✓ Gradilla. ✓ Muestras de agua potable de

✓ Pipetas estériles de 1 ml diferente origen (Grifo,
graduadas en décimas. purificada y embotellada u
✓ 9 cajas Petri estériles. otro), de un volumen mínimo
✓ Mechero Bunsen. de 100 ml obtenida en
✓ Cerillos o encendedor. recipiente estéril y con
✓ Incubadora. Tiosulfato de Sodio al 10%.
✓ Contador de Colonias Quebec. ✓ 3 tubos de ensayo conteniendo
c/u 9 ml de agua de dilución
estéril. (Apéndice C)
✓ 9 tubos de 20 x 160 mm, con
tapón conteniendo c/u de 15-
20 ml de agar cuenta estándar
estéril, manteniéndolo a 45-47
°C en baño de temperatura
constante.
Desarrollo
En condiciones asépticas:
1. Agitar vigorosamente la muestra de agua, para homogeneizar.

2. Pipetear 1 ml de muestra y verterlo en el primer tubo con 9 ml de agua de
dilución estéril, quedando entonces una dilución de 10-1. Fig.3
3. Agitar para homogeneizar y tomar 1 ml de esta dilución (10-1) y verterlo
en el segundo tubo, quedando una dilución de 10-2.
4. Agitar para homogeneizar y tomar 1 ml de esta dilución (10-2) y verterlo
en el tercer tubo, quedando una dilución de 10-3.
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5. Utilizando pipeta estéril, tomar 1 ml de la dilución 10-1 y verterlo en la caja

Petri estéril marcada con 10-1, distribuyéndolo bien en el fondo de la caja
Petri vacía.
Efectuar esta misma operación por triplicado.
6. De la misma manera, tomar 1 ml de la dilución 10-2 y verterlo en la caja
Petri marcada con 10-2. Efectuar esta misma operación por triplicado.
7. Hacer lo mismo con el tubo de la dilución 10-3 y la caja marcada con 10-3.
Efectuar la misma operación por triplicado.
Es recomendable usar una pipeta estéril para cada dilución.
8. Antes de que pasen 10 minutos, agregar a cada caja Petri el medio de
cultivo contenido en un tubo, a una temperatura máxima de 47 °C
(todavía líquido).
Nota: Si la temperatura del agar es superior a 47°C al vaciarlo a las cajas,

puede producirse la destrucción total o parcial de las bacterias sembradas.
9. Antes de que el medio de cultivo solidifique homogeneizar cada caja

mediante movimientos de translación y rotación en una superficie plana
aproximadamente durante 1 minuto evitando que se mojen la tapa y los
costados de la caja, de esta manera el agua y el agar son mezclados
íntimamente.
10. Dejar reposar las cajas el tiempo necesario para que solidifique el agar.
11. Una vez solidificado el agar en las cajas, incubar en posición invertida con
objeto de que el agua de condensación del agar no caiga sobre la
superficie del cultivo. Las condiciones de incubación son: 37 °C (±1 °C)
durante 24 horas (± 3 h). Ahora bien, si se desea conocer la flora
bacteriana total de la muestra las condiciones serán: 22 °C (±2 °C),
durante 72 horas (±4h).
12. Transcurrido el tiempo de incubación contar las colonias que se han
desarrollado en cada una de las placas, usando un cuenta colonias para
efecto de facilitar la lectura.
Si la investigación de mesófilos se practica a otro tipo de muestra de agua que no

sea potable, se procede a realizar los grados de dilución necesarios, dependiendo
del origen de la misma, pero solo se trabajará con las últimas tres diluciones,
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procediendo de la misma forma descrita anteriormente pero incubando durante 48

horas a 37 °C (±1 °C).
Al hacer el recuento, tener en cuenta las siguientes consideraciones:
✓ Seleccionar las cajas que contengan entre 25 y 250 colonias y descartar las
otras.
✓ Si son varias las que entran en este intervalo, contar todas y seleccionar las
del grado de dilución por triplicado que represente menor margen de error
en el recuento y como resultado, tomar el promedio de las tres cajas y
referirlo al volumen real de muestra sembrado para efectos del cálculo
correspondiente.
✓ Si no hay ninguna caja con un recuento dentro del intervalo mencionado, se
hará de aquella que tenga el valor más próximo a cualquiera de los dos
extremos. En estos casos los resultados se tomarán como aproximados,
excepto en los casos de siembra de muestra directa donde se efectuará,
también el recuento en cajas con menos de 25 colonias.
✓ Si el recuento no se hace en el mismo momento de sacarlas de la
incubadora, se pueden conservar las cajas dentro del refrigerador entre 5 y
10 °C, durante un período máximo de 24 horas.
Cálculo y presentación de resultados
Una vez efectuado el recuento de las cajas correspondientes, los resultados

obtenidos se elaboran de la siguiente manera:
✓ Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 1 ml la expresión del resultado

es directa.
✓ Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 0.1 ml, el número de colonias
contadas habrá de dividirse por el volumen de muestra sembrada, es decir,
por 0.1, para obtener el número de colonias por mililitro.
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En general se tiene:
Bacterias Mesófilas aerobias/ml = Número de colonias en volumen real de muestra

sembrada, en ml.
Los resultados se expresarán así:
Número de bacterias mesófilas aerobias: ____ UFC/ml.
Nota:
Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el resultado no será

de 0 (cero) UFC/ml, sino que será referido al menor grado de dilución sembrado.
En el presente experimento éste es de 10-1, por lo tanto el resultado sería: <10
UFC/ml.
Cuestionario
i. Consultar el significado de Cuenta Viable.

ii. ¿Cuáles son las bacterias mesófilas aerobias?
iii. ¿En qué otro tipo de muestras, además de agua, se puede investigar la
presencia de mesófilas aerobias? Dar ejemplos.
iv. De acuerdo a la normatividad mexicana vigente, ¿Cuál es el límite máximo
permisible para bacterias mesófilas aerobias en agua purificada y
embotellada? Dar el número de norma.
v. Explicar con un ejemplo la investigación de otro tipo de microorganismos
utilizando esta misma técnica.
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Fig. 3 Preparación de diluciones decimales y procedimiento para el recuento

de Bacterias Mesófilas Aerobias
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PRÁCTICA No. 3
COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN
AGUA DE CONSUMO HUMANO
OBJETIVO: Investigar la presencia de bacterias del grupo Coliforme en agua de

consumo humano mediante la técnica del Número Más Probable (NMP), usando
tubos de fermentación múltiple.
ANTECEDENTES
La potabilidad del agua es de gran importancia en cuanto a Salud Pública, ya que

ésta puede servir como vehículo de microorganismos patógenos, es decir,
productores de enfermedades llamadas comúnmente "de origen hídrico" tales
como Salmonelosis (Tifoidea y Paratifoidea), Shigelosis, Cólera, Hepatitis, etc.
Estos microorganismos son todos de origen entérico.
Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua,
proceden de las descargas intestinales de hombres y animales. Además, ciertas
especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos
similares, denominados coliformes, Estreptococos fecales (como Streptococcus
faecalis) y Clostridium perfringens, son habitantes normales del intestino grueso de
hombres y animales y en consecuencia siempre están en las materias fecales. Así
pues, la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de
contaminación fecal y el camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran
en las materias fecales.
La evaluación rutinaria del agua en busca de microorganismos patógenos, como

Salmonella spp. y Shigella spp., puede ser difícil de realizar ya que el número de
estas bacterias es relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas
bacteriológicas del agua potable que demuestren la presencia de microorganismos
indicadores que siempre estén presentes en materia fecal, fácil de demostrar y que
sirva de guía para conocer el grado de contaminación fecal.
Surge así el concepto de "Indicador de contaminación fecal", el cual será utilizado

para la valoración de la potabilidad bacteriológica de las aguas. De acuerdo con lo
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anterior, se ha adoptado con carácter general, el "Grupo Coliforme" como

indicador más digno de confianza. La OMS incluye dentro del grupo coliforme
todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos Gram negativos, no
esporulados, que producen ácido y gas al fermentar la lactosa, a 35 – 37 °C. Las
especies clásicas de este grupo son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes.
El microorganismo indicador más comúnmente utilizado es Escherichia coli,

considerando la OMS preferible emplear la expresión "Coliforme fecal" que
comprende un número ligeramente mayor de variedades, todas ellas de claro
origen fecal e indicadores de contaminación fecal reciente.
Para los efectos del análisis sanitario del agua, se define el Coliforme fecal como
un bacilo aerobio o anaerobio facultativo, Gram negativo, no esporulado, que
fermenta la lactosa con producción de ácido y gas a 44 °C (± 0.5 °C) en menos de
24 horas.
El método se basa en la inoculación de alícuotas de la muestra sin diluir que

pueden ser volúmenes de 50, 10 y 1 ml, o de 10, 1 y 0.1 ml, o diluida en caso
necesario, en una serie de tubos por triplicado o quintuplicado con un medio que
contiene lactosa (caldo lactosado o caldo lauril triptosa). La valoración del
contenido microbiano de una muestra de agua por el método del NMP supone la
utilización de tablas numéricas que tienen en cuenta los volúmenes de agua y las
cantidades de tubos sembrados en una ó más series. Realmente consiste en tratar
estadísticamente el número de tubos de cada serie sembrada que resulten
positivos después de su incubación. En cuanto a la investigación de patógenos en
agua, no existe un método único que permita aislar e identificar todos estos
microorganismos.
En general, los métodos con los que se obtienen mejores resultados comprenden
una fase de concentración, seguida de técnicas de enriquecimiento y aislamiento
específicas para cada microorganismo.
El procedimiento para la recolección de las muestras de agua para el análisis

bacteriológico, depende del tipo de agua que se desee muestrear. Este se hará de
acuerdo a la normatividad mexicana vigente. Las muestras para el análisis
bacteriológico, se deben tomar en frascos muestreadores que se hayan lavado con
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extremo cuidado y esterilizado. En su interior añadir, previo a la esterilización, 0.1

ml de solución de Na 2S 2O 3 (tiosulfato de sodio) al 10%, por cada 120 ml de
muestra con el propósito de neutralizar la acción del cloro que pudiera contener la
muestra, cubriendo además el tapón del frasco hasta el cuello con papel aluminio.
El análisis bacteriológico de la muestra debe practicarse inmediatamente después

de su recolección. Es por ello que se recomienda que de no efectuarse así el
análisis, se inicie dentro de las dos horas próximas a la recolección de la muestra y
en ningún caso, este lapso debe de exceder de 24 horas para agua potable y de 6
horas para otros tipos de agua para que sea válido el resultado del análisis.
Durante el período que transcurre del muestreo al análisis, se debe conservar la
muestra a 4 °C, con objeto de inhibir la actividad bacteriana para no obtener
resultados falsos o dudosos.
Material Sustancias
✓ 1 Pipeta de 10 mL graduada en ✓ Muestras de agua potable de

décimas, estéril. diferente origen (Grifo, purificada y
✓ 2 Pipetas de 1 mL graduadas en embotellada, tinaco, cisterna u
décimas, estériles. otro), de un volumen mínimo de
✓ Mechero Bunsen. 100 ml.
✓ Cerillos o encendedor. ✓ 5 Tubos de 20 x 180 mm con
✓ Asa bacteriológica. campana Durham en su interior,
✓ Gradillas para tubos de 18 x 150 conteniendo 20 mL de caldo
y de 20 x 200. lactosado o lauril triptosa estéril de
✓ Agitador de tubos Vortex. doble concentración.
✓ Incubadora a 35 °C. ✓ 10 Tubos de 18 x 150 mm campana
✓ Baño Incubador para C. Fecales a Durham en su interior, conteniendo
temperatura constante de 44 °C 10 ml de caldo lactosado estéril de
(±0.5 °C). simple concentración.
✓ 10 Tubos de 18 x 150 mm con
campana Durham en su interior,
conteniendo 10 ml de caldo Lactosa
bilis verde brillante (LBVB) estéril de
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concentración sencilla.
✓ 10 Tubos de 18 x 150 mm con
campana Durham en su interior,
conteniendo 10 ml de caldo E.C.
(Escherichia coli) estéril de
concentración sencilla.
Desarrollo
Descripción de la metodología de análisis:
La técnica del NMP comprende siempre una prueba presuntiva y otra confirmativa.
Esto es así porque una positividad en un tubo de la prueba presuntiva no indica
necesariamente la presencia del grupo bacteriano a determinar (Coliformes
Totales, Coliformes Fecales o Estreptococos Fecales), sino tan solo es una
presunción, que habrá de confirmarse posteriormente.
Sin embargo, una negatividad en la prueba presuntiva permite dictaminar la

ausencia de dicho grupo bacteriano en el agua examinada.
La denominada prueba presuntiva consiste en una metodología de tipo general

para cualquier grupo de bacterias, mientras que la prueba confirmativa es
específica.
PARTE EXPERIMENTAL
Prueba presuntiva:
Todas las operaciones deberán efectuarse en absolutas condiciones de asepsia.
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i. Preparar tres series sucesivas de 5 tubos con caldo lactosado, una de

doble concentración y las otras dos de concentración sencilla.
ii. Etiquetar las series con 10, 1 y 0.1 ml.
iii. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces antes de tomar
el volumen que se va a inocular, a efecto de homogeneizar.
iv. Antes y después de realizar las inoculaciones, la boca del frasco de la
muestra deberá ser flameada con objeto de evitar contaminación.
v. Inocular con una pipeta de 10 ml este volumen de muestra en la serie de
tubos con caldo de doble concentración, con otra pipeta de 1 ml para 1
ml de muestra en la segunda serie de tubos con concentración sencilla.
vi. Con una pipeta de 1 ml inocular este volumen de muestra en la segunda
serie de tubos con concentración sencilla (Fig. 4)
vii. Igualmente con la misma pipeta podrá inocularse la tercera serie de
tubos con 0.1 ml de muestra.
Normalmente, siempre que no se sospecha que el agua contenga elevada

carga bacteriana, solo se inoculan estas tres primeras series de tubos.
En caso contrario, será necesario inocular otras series y por lo tanto,

realizar diluciones de la muestra original.
viii. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 °C durante 24-48

horas.
ix. Después de 24 horas de incubación efectuar una primera lectura para
observar si hay tubos positivos, es decir, con producción de ácido, si el
medio contiene un indicador de pH, turbidez y producción de gas en la
campana Durham. Al hacer esta verificación es importante asegurarse
que la producción de gas sea resultado de la fermentación de la lactosa
en cuyo caso se observará turbidez en el medio de cultivo y no confundir
con burbujas de aire. Para evitar este tipo de confusiones es
recomendable revisar las campanas Durham antes de proceder a la
inoculación y desechar aquellos que contengan burbujas de aire ó de
alguna manera eliminar éstas y así poder utilizarlos.
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x. De los tubos que en esta primera lectura den positivos, ya se pueden

hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes
fecales.
xi. En caso de no apreciarse alguno o todos los cambios mencionados en el
resto de los tubos, continuarán en incubación 24 horas más.
xii. Después de 48 horas (±2h) a partir de la inoculación, se hace la lectura
final.
xiii. Si pasadas estas 48 h tampoco se aprecia turbidez ni producción de gas,
los tubos se toman como negativos.
Interpretación:
✓ Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado,

reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la
muestra analizada.
✓ Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se
anotarán convenientemente y se procederá a realizar la PRUEBA
CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.
Prueba confirmatoria para coliformes totales:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la

prueba presuntiva, agitándolos previamente para homogeneizar, inocular
con tres asadas tubos conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante
(LBVB). Fig. 5
2. Incubar durante 48 ± 3 h a 35 ± 0.5 °C.
3. Después de la incubación observar la presencia de turbidez y de gas.
Interpretación:
✓ Si se observa turbidez y producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos

positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP. Tabla 1
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✓ Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se

observe turbidez:
Se consideran negativos, estableciéndose el Código 0,0,0 para efecto del

cálculo del NMP.
Prueba confirmatoria para coliformes fecales:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la

prueba presuntiva, agitándolos para homogeneizar, inocular con tres
asadas tubos conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44 °C (±0.5 °C), observar presencia de
turbidez y gas.
Interpretación:
✓ Si se observa turbidez y producción de gas:
La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el número de tubos

positivos para posteriormente hacer el cálculo del NMP.
✓ Si no se observa producción de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se reporta la AUSENCIA DE COLIFORMES FECALES.
Cálculos.
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes

Totales y Fecales:
Establecer los códigos correspondientes para calcular por referencia en la tabla

estadística correspondiente a la Tablas 1-4 el NMP de Coliformes Totales y Fecales
en 100 ml de agua.
En caso de no encontrar en las tablas la combinación de tubos adecuada, emplear

para los cálculos la siguiente ecuación:
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𝑁𝑀𝑃 𝑙𝑒í𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

𝑁𝑀𝑃 ⁄𝐶 =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎
𝑒𝑛 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑒𝑟𝑖𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑙 (𝑚𝑙)
Elaboración y presentación de resultados.
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:
✓ Si únicamente se inoculan tres series de cinco tubos cada una con 10, 1 y
0.1 ml de muestra, la lectura de los resultados nos permite tener dos
códigos de valores uno para coliformes totales y otro para coliformes
fecales los cuales leídos en la tabla del NMP nos dará el valor de bacterias
correspondientes en 100 ml de muestra, de manera directa.
✓ Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor
cero.
✓ A continuación se establece el triplete de valores correspondiente a las
tres series anteriores a la del valor cero que podrá ser leída en la tabla
del NMP.
✓ Para efectos de expresar el valor obtenido basándose en 100 ml de
muestra habrá de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de
muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
escogido.
✓ Se tendrá un triplete de valores para cada tipo de determinación.
En general se tiene:
𝑁𝑀𝑃 𝑙𝑒í𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑎

𝑁𝑀𝑃 ⁄𝐶 =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑠 𝑖𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑎𝑑𝑎
𝑒𝑛 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑢𝑏𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑒𝑟𝑖𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑙 (𝑚𝑙)
Los resultados obtenidos se expresarán de la siguiente manera:
NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 ml
NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 ml
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Ejemplos:
1) La lectura de los resultados obtenidos en el análisis del agua de un grifo

es la siguiente:
Volumen de Denominación de Tubos positivos en Tubos positivos Tubos positivos en

muestra la serie de 5 tubos la prueba en la prueba la prueba
inoculada (ml) confirmativa para confirmativa para confirmativa para
coliformes totales coliformes totales coliformes fecales.
y fecales
10 1 – CT. CF 5 4 2
1 2 – CT. CF 3 2 1
0.1 3 – CT. CF 2 1 0
Con estos datos consultando la tabla del NMP correspondiente tenemos:
✓ Para coliformes totales los resultados obtenidos finalmente en la prueba

confirmativa son: 4,2,1 que en la tabla nos indica un valor de 26 es decir
el resultado será:
NMP de coliformes totales: 26/100 ml.
✓ Para coliformes fecales el triplete de valores obtenido es: 2,1,0 y

consultando la tabla del NMP se tiene el valor de 7.
El resultado se expresará:
NMP de coliformes fecales: 7/100 ml
2) La lectura de los resultados obtenidos en el análisis de un agua de la que

fue necesario hacer diluciones, es la siguiente:
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Volumen de Denominación de Tubos positivos Tubos positivos Tubos positivos

muestra series de 5 tubos en la prueba en la prueba en la prueba
inoculada confirmativa confirmativa para confirmativa
para coliformes coliformes para coliformes
totales y fecales totales fecales
0.1 3 - CT. CF 4 3 2
0.01 4 - CT. CF 2 1 1
0.001 5 -CT. CF 1 1 0
✓ Para coliformes totales se establece el código del triplete: 3,1,1 y

consultando la tabla del NMP se observa un valor de 14, por lo tanto se
tiene:
14 / 0.01 = 14 x 100 = 1400.
NMP de coliformes totales: 1400/100 ml
✓ Para coliformes fecales con el mismo razonamiento se establece el

código:
2,1,0 que en las tablas del NMP correspondientes se observa un valor de

7, por lo tanto se tiene:
7 / 0.01 = 7 x 100 = 700
NMP de coliformes fecales: 700/100 ml
Confiabilidad
El procedimiento de fermentación en tubos múltiples es el método más usado por

su facilidad y economía.
El resultado de esta prueba se expresa por “el número más probable” (NMP), pero
debe entenderse que este método no es exacto ya que sólo nos da la probable
densidad de bacterias coliformes totales o fecales de una muestra determinada.
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La confiabilidad está dada por los niveles superiores o inferiores del límite de
confianza al 95% establecidos en las tablas para cada NMP/100 ml, no obstante,
es una indicación importante para evaluar la calidad sanitaria del agua.
CUESTIONARIO
1. Mostrar los cálculos realizados para obtener el NMP de Coliformes Totales

y Fecales en el agua analizada.
2. ¿Cuáles son las características que debe reunir un Microorganismo
Indicador?
3. ¿Por qué el número de Coliformes Totales es siempre mayor que el de
Coliformes Fecales?
4. De acuerdo a la normatividad mexicana vigente ¿Cuáles son los límites
permisibles en cuanto a Coliformes Totales y Coliformes Fecales en el
agua para consumo humano? Dar los números de las Normas Oficiales
Mexicanas correspondientes.
5. ¿Por qué aun cuando los microorganismos patógenos se encuentran en
poca concentración en un agua éstos pueden causar enfermedad?
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Tabla. 1 Índice del NMP y limite confiable de 95 % para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos se usan: 5 tubos con porciones de 10 cm3 en cada uno, 5 con porciones de 1
cm3 y 5 con porciones de 1 cm3y 5 con porciones de 0.1 cm3
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Tabla. 2 Índice del límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 1 tubo con porciones de 50 cm 3, 5 tubos con
porciones de 10 cm3 y 5 tubos con porciones de 10 cm3
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Tabla. 3 Índice del NMP y limite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos se usan: 5 tubos con porciones de 50 cm3, 5 con porciones de 10 cm3 y 5 con
porciones de 10 cm3y 5 tubos con porciones de 1 cm3
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Tabla. 4 Índice del NMP y límite confiable de 95% para varias combinaciones de resultados
positivos y negativos cuando se usan: 3 tubos con porciones de 10 cm3, 3 con porciones de
1 cm3 y 3 con porciones de .1 cm3.
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Figura. 4. Prueba presuntiva en la determinación del NMP de CT y Cf
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Figura. 6 Pruebas confirmativas para coliformes fecales
Figura. 7 Evaluación de las pruebas presuntivas y confirmativas en la determinación del

NMP de coliformes totales y fecales
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PRÁCTICA No. 4
EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE HONGOS, LEVADURAS Y
COLIFORMES PARA DIFERENTES TRATAMIENTOS DE CARNE DE RES
OBJETIVO: Comparar 3 estados microbiológicos de un producto cárnico.
ANTECEDENTES:
Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres
grupos importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos
filamentosos que están ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales
en pan viejo, queso o frutas. Presentan una gran variedad de formas y tamaños.
Cada filamento crece fundamentalmente en el ápice, por extensión de la célula
terminal.
Las levaduras son hongos unicelulares y la mayoría son Ascomicetos. Normalmente

tienen forma oval o cilíndrica y su principal forma de reproducción es la gemación,
se desarrollan bien en hábitats con abundante azúcar tales como frutas, flores, e
incluso la corteza de los árboles.
Material 1 Jeringa
1 Espátula
1 Probeta de 100 ml Pinzas de crisol
2 Matraces Erlenmeyer de 250 ml Báscula analítica
20 tubos de ensayo con tapón Algodón
2 vasos de precipitados de 250 ml Papel de estraza
1 Tripie
1 Tela de asbesto Sustancias
1 Mechero
3 Pipetas de 1 ml Agua destilada
2 Pipetas de 5 ml Agar bilis rojo violeta (VRBA)
2 Pipetas de 10 ml Muestra de bistec con sal
1 Mortero con pistilo Bistec con alcohol
1 Bisturí Bistec sin ningún tratamiento
Medios de cultivo para hongos
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Desarrollo
i. Preparar medios de cultivo según las indicaciones del cultivo para hongos y
levaduras, disolver el medio sintético en agua destila y se pone a fuego en el
mechero (Flama azul) durante un minuto, se retira del fuego y se tapa con
algodón y gasas.
ii. Esterilizar el material para disoluciones y siembra
iii. Verter el medio de cultivo en los tubos de ensayo, (generar un ambiente de
esterilidad).
iv. Los tubos se colocaran de forma inclinada hasta gelificar
v. Preparar las muestras de alimentos para su análisis y dilución de 10-1 según la
NOM-110-SSA1-1994.
vi. Sembrar hongos y levaduras por medio de la técnica de siembra de estría
cruzada con 3 asas esterilizadas dejando un tubo como testigo y realizar la
siembra por triplicado, al finalizar etiquetar y colocar en incubadora.
vii. Preparar medio de cultivo para coliformes según las indicaciones del envase.
viii. Posteriormente realizar la siembra de coliformes, tomar 0.1 ml de la dilución
previamente preparada (10-1) para verter en el tubo de ensayo y
posteriormente verter el medio de cultivo, tapar, homogenizar e incubar,
realizar cada tratamiento por triplicado.
CUESTIONARIO
a. ¿Podrían los niveles de experiencia de los trabajadores de laboratorio

impactar en la confiabilidad de la calidad de las pruebas de control?
Explica
b. ¿Cuáles son algunas de las nuevas tecnologías que podrían acortar o
eliminar este largo proceso? En el proceso, ¿Dónde podrían éstas ser
implementadas?
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PRÁCTICA No. 5
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MATERIAS PRIMAS, SUPERFICIES,
PRODUCTOS TERMINADOS
OBJETIVO: Analizar microbiológicamente materias primas, superficies y productos

terminados por el método de Petri film.
ANTECEDENTES:
Los Films secos o Petrifilm: son películas deshidratadas de medios de cultivos

generales o selectivos en la que se depositan 1 ml de muestra que rehidrata el
medio. Tras la incubación se hace el recuento.
6 Tubos de ensayo con tapa rosca 150 ml de Agua destilada
10 Hisopos 200 ml de Alcohol
1 bolsa de Algodón
5 Frascos estériles
8 pipetas de 1ml
8 pipetas de 10 ml
Bolsas Ziploc
Mecheros de alcohol
3 Placas Petri film para recuento de
coliformes
3 Placas Petrifilm para levaduras y
mohos
3 Placas Petri film para E. coli
3 Placas Petri film para
Enterobacterias
Procedimiento
Tiempo estimado: 1.5 horas
i. Recolectar la muestra
ii. Preparar las muestras para su análisis y dilución de 10-3 según la NOM-110-
SSA1-1994
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iii. Seleccionar por lo menos 3 diluciones de la muestra

iv. Colocar la placa Petri film en una superficie plana.
v. Levantar el film superior
vi. Con una pipeta perpendicular a la placa Petri film colocar 1 ml de muestra en
el centro del film interior.
vii. Bajar el film superior con cuidado evitando introducir burbujas de aire, no
dejarlo caer
viii. Con la cara lisa hacia abajo, colocar el aplicador en el film superior sobre el
inoculo
ix. Con cuidado ejercer una presión sobre el aplicador para repartir el inoculo
sobre el área circular. No girar ni deslizar el aplicador.
x. Levantar el aplicador. Esperar un minuto a que se solidifique el gel
xi. Repetir el proceso con las diferentes diluciones
xii. Incubar las placas Petri film cara arriba en pilas hasta 20 placas
xiii. Leer las placas Petri film en un contador de colonias. Rango 15-150 UFC/ml
xiv. Interpretar los resultados
CUESTIONARIO
I. Describe la forma correcta de recolectar una muestra en superficies

II. ¿Cuál es la ventaja de utilizar polacas petrifilm en la industria de los
alimentos?
III. ¿Cómo afectan la calidad microbiológica, la sanidad y la higiene en la
aceptación de un producto por parte del consumidor?
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PRÁCTICA No. 6
DETECCIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
OBJETIVO: Familiarizarse con la identificación de Salmonella spp. en alimentos.
ANTECEDENTES:
Salmonella es un miembro de la familia Enterobacteriaceae y siempre se

considera un patógeno cuando se aísla a partir de productos alimenticios o de los
seres humanos. La enfermedad causada por Salmonella genéricamente se llama
salmonelosis y puede variar desde diarrea bacteriana a la septicemia; diarrea
infección bacteriana salmonelosis es generalmente transmitidas por los alimentos
por lo general llega a los humanos a través de los huevos contaminados de
productos avícolas inadecuadamente cocidos.
Aves albergan muchas especies de salmonella en sus tractos gastrointestinales

que pueden resultar en la contaminación si no se maneja adecuadamente. s. typhi,
la causa de la fiebre tifoidea difiere de la mayoría Salmonella spp en que su
reservorio es humano en lugar de animal. El organismo se transmite de persona a
persona a través de la vía oral-fecal.
✓ 5 Pipetas de 1ml ✓ Medios de cultivo:

estériles. ✓ Muestra de alimento solida
✓ 4 Asas de cultivo. ✓ Medio de pre enriquecimiento: Caldo
✓ Placas Petri estériles. nutritivo.
✓ 4 Pipetas de 10 ml ✓ Medio de enriquecimiento: Caldo
estériles. selenito-cistina.
✓ Medio para detección: Agar Hektoen.
✓ Reactivo para la prueba citocromo-
oxidasa.
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Procedimiento:
i. Toma de muestras y homogeneización: Tomar 25 g de alimento, mezclar

con 225ml de caldo nutritivo y homogeneizar (si el alimento es ácido debe
ajustarse el pH a 6-7).
ii. Pre enriquecimiento: Incubar el homogeneizado 16-20h a 37ºC.
iii. Enriquecimiento: Inocular 1ml del cultivo de pre enriquecimiento en un tubo
con 10 ml de caldo selenito-cistina. Incubar durante 24-48h.
iv. Detección: A partir del tubo de enriquecimiento inocular placas con agar
Hektoen (técnica de aislamiento). Incubar las placas 48 h a 37ºC.
v. Las colonias de Salmonella en agar Hektoen aparecen verde azuladas con o
sin centro negro.
vi. Análisis confirmativo (opcional): Se realizará una u otra prueba habría que
tomar colonias sospechosas e inocularlas en sistema API 20.
vii. Tomar colonias y realizar la prueba de Kligler.
viii. Resultados
ix. Se expresan como presencia o ausencia en 25 g de alimento.
CUESTIONARIO
I. ¿Qué es salmonellosis?
II. ¿Cuáles son los síntomas de salmonellosis?
III. ¿Cómo las personas se enferman con salmonellosis?
IV. ¿Los alimentos etiquetados como “Kosher”, “sin – restricción” (“free-
range”), “orgánico” (“organic”) o “natural” tienen menos cantidad de
bacterias Salmonella?
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BIBLIOGRAFÍA.
1. APHA, AWWA, WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and
Wastewater, Washington, D. C., U.S.A. 18th Edition, 1992.
2. Atlas, R.M., “Microbiología Fundamentos y Aplicaciones”, CECSA, México,

1990.
3. Castañeda Briones María Teresa, 2002 Microbiología Aplicada Manual de

Practicas de laboratorio, Editorial: Universidad Autónoma Metropolitana.
4. Mc Landsborough, 2015, Food microbiology laboratory, Editorial: CRC

Press, University of Massachusetts, Amherts.
5. NOM-AA-102-1987. Calidad del Agua. Detección y Enumeración de

organismos coliformes, organismos coliformes termotolerantes y Escherichia
coli Presuntiva – Método de Filtración en membrana, DGN.
6. NOM-092-SSA1-1994, Bienes y Servicios, Método para la cuenta de

bacterias aerobias en placa.
7. Velasco C.O., Carmen, G.B., Manual de Técnicas de Laboratorio, Volumen

II, Segunda Parte, Diagnóstico Parasitológico, Instituto Nacional de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, Secretaria de Salud, México, D.F
1994
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Anexos
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FORMATO DE REPORTE
Ing. en Industrias Alimentarias
MICROBIOLOGÍA DE
ALIMENTOS
Clave de materia
REPORTE DE LA PRÁCTICA No.
Nombre de la práctica
DOCENTE:
ALUMNO:
Semestre:
Semestre:
Teziutlán, Pue., 3 de Agosto de 2016
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ÍNDICE
Introducción……………………………………………(Pág.)
Objetivo ………………………………………………..( )
Desarrollo de la Práctica …………………………….( )
Conclusión…….……………………………………….( )
Bibliografía…………………………………………….( )
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Introducción.
Objetivo.
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Desarrollo de la Práctica.
Nota. Incluya en esta sección sus dibujos o esquemas.
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Conclusión.
Bibliografía.
Nota. Enlistar por orden alfabético.
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RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE COMPETENCIAS ESPECÍFICAS DEL LABORATORIO
Categorías Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3 Nivel 4 Calificación
Muestra falta de conocimiento de Muestra algo de conocimiento de la Muestra un conocimiento Muestra un sólido conocimiento
la práctica. práctica. considerable sobre la práctica. considerable sobre la práctica.
Actividades previas Esquema poco claro con poca Esquema claro del procedimiento Esquema claro y conciso de gran Esquema claro y conciso de todo
información del procedimiento experimental parte del procedimiento el procedimiento experimental
experimental experimental
No prepara ni organiza el material Prepara y organiza el material con Prepara y organiza el material Prepara y organiza el material
Puesta a punto de la
dificultad adecuadamente requiriendo muy adecuadamente.
práctica
ayuda puntualmente
Falta conocimiento del material de Demuestra un conocimiento general Demuestra un buen Demuestra un muy buen
laboratorio y del procedimiento del material del laboratorio y del conocimiento del material del conocimiento del material del
Desarrollo del
procedimiento laboratorio y del procedimiento laboratorio y del procedimiento
procedimiento
que forma cuidadosa y eficaz.
Las medidas son incompletas, Las medidas son inexactas e Medidas exactas y precisas. Medidas exactas y precisas.
imprecisas e inexactas. imprecisas. Observaciones adecuadas. Observaciones adecuadas y bien
Carece de observaciones. Las observaciones son confusas. Trabajo organizado. razonadas.
Adquisición de datos No hay unidades. Hay errores en las unidades. Algún error puntual en las Reconocen errores en la
unidades. adquisición de datos.
Trabajo organizado.
Ningún error en las unidades.
Actúa de manera imprudente No toma ninguna medida de Generalmente toma las medidas Toma las medidas de seguridad
Seguridad en el
seguridad de seguridad necesarias necesarias y actúa de manera
laboratorio
consciente.
Raramente limpia el material Necesita que se le recuerde que hay Generalmente lava y ordena el Siempre lava y ordena el
Limpieza y orden Deja el material sucio y que lavar el material material. material.
desordenado Deja el material desordenado.
Datos desorganizados, resultados Datos organizados, imprecisos Datos bien organizados, precisos, Datos bien organizados, precisos,
Reporte de la práctica imprecisos, inexactos y expresados inexactos y expresados con algún inexactos y expresados con algún exactos y expresados
incorrectamente. error. error. correctamente.
Calificación de Competencias específicas de Laboratorio
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MANUAL DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS PUNTO(S) DE LA NORMA

MANUAL DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

ELABORÓ: REVISÓ: AUTORIZÓ:

PUESTO DOCENTE SUBDIRECCIÓN ACADÉMICA DIRECCIÓN ACADÉMICA

Con el fin de lograr la enseñanza - aprendizaje en la materia de Microbiología de

Medidas de seguridad en el laboratorio………..………………….....……………. 7

Competencias específicas a desarrollar………………………………………………. 12

Practica no. 1 “Determinación de closdtridios sulfito reductores en agua” 17

Practica no. 2 “Recuento de bacterias mesófitas aerobias en agua para

Formato de reporte de prácticas………………………………………………………… 54

Rúbrica de evaluación de competencias específicas del laboratorio de

La planeación de cada práctica responde a un análisis de los contenidos temáticos del

Microorganismos en los alimentos

✓ Identificar los agentes contaminantes y las fuentes de contaminación.

✓ El ingreso de personas ajenas al grupo y la salida de alumnos mientras se están

RESPONSABILIDADES DEL USUARIO

✓ Usar bata del laboratorio y lentes de protección.

El usuario que no respete el reglamento será suspendido

Para cualquier duda o sugerencia, favor de dirigirse con el responsable en turno.

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

2.- Al calentar sustancias contenidas en un tubo de ensaye, no se debe apuntar la

➢ Utilizar recipientes de pared delgada

4.- En caso de ingestión accidental de algún reactivo deberá notificarse se deberá

7.- cuando en una reacción se desprendan gases tóxicos o se evaporen la operación

9.- No trasladar varios objetos de vidrio al mismo tiempo.

10.- Se deberá mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el laboratorio

SUSTANCIAS QUE DEBEN USARSE CON PRECAUCIÓN

A continuación se muestran algunas sustancias que se deben usar con mayor

Ácido Fluorhídrico (HF)

Ácido Nítrico (HNO3)

En unos cuantos segundos daña permanentemente los ojos y es sumamente corrosivo

Ácido Sulfúrico (H2SO4), Fosfórico (H3PO4) y Clorhídrico (HCl)

PASOS A SEGUIR EN CASO DE UN ACCIDENTE

➢ Salpicaduras por ácidos y álcalis.- Lavarse inmediatamente y con

INCENDIO DE PRODUCTOS QUÍMICOS

1. Agua, polvo seco o anhídrido carbónico.

IMAGEN PELIGROSIDAD DESCRIPCION

Sustancias y preparados que

Sustancias y preparados que en

Sustancias y preparados líquidos

[F] Sustancias y preparados cuyo punto

Son sustancias y preparados que

Son sustancias y preparados que

Son sustancias y preparados que en

Son sustancias y preparados que

Competencias específicas a desarrollar

Tabla 1. Descripción de la competencia específica: “Realizar procedimientos

Enunciado de la competencia Contexto de realización

iii. Con ayuda de manuales de referencia y

Elementos de competencia Criterios de rendimiento

2.1 Manipulación de los reactivos y material de

3.1 Selección correcta del procedimiento según

4.1 Identificación correcta del equipo apropiado.

5.1 Conocimiento del fundamento teórico del

Tabla 2. Descripción de la competencia específica: “Aplicar principios de

Elementos de competencia Criterios de rendimiento

1) Determinación de 1.1 Realiza el análisis microbiológico de diferentes

2) Recuento de bacterias 2.1 Identificar los factores que intervienen en el

3) Coliformes totales y 3.1 Identificación adecuada de técnicas de

3.2 Realiza siembras microbiológicas que le

infiere) en diferentes tareas.

4) Evaluación microbiológica 4.1 Habilidad en el cultivo, de microorganismos y

5) Análisis microbiológico de 5.1 Conocimientos de las metodologías de cultivo