CAPÍTULO 2 - Técnica Histológica

Universidad
Vasco de Quiroga UVAQ
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Histología y biología celular, 3e
CAPÍTULO 2: Técnica histológica
Raquel Guerrero Alquicira; Marcela Rojas Lemus; Teresa I. Fortoul van der Goes
Técnica histológica
El objeto de estudio de la histología son los tejidos (y las células que los componen). A fin de estudiarlos y comprenderlos, cuenta con dos poderosas
herramientas que le permiten observar la microestructura celular y tisular: la microscopía y la técnica histológica.
La técnica histológica es la serie de pasos ordenados que permiten preparar al tejido para su observación a través del microscopio. El tejido se prepara
para su observación de acuerdo con el tipo de microscopio que será utilizado.
En el caso de la microscopía de campo claro, la técnica más común para preparar las muestras es la técnica histológica ordinaria o de inclusión en
parafina. En este proceso, las muestras se infiltran en parafina, con el fin de que tengan la consistencia adecuada para obtener los bloques con las
muestras o especímenes. Una vez que se tienen los bloques (inclusión), éstos se cortan en un equipo que se llama micrótomo y con el que se obtienen
cortes muy delgados (micrómetros de espesor) lo que permite observar las estructuras celulares y tisulares. Un paso más allá que ofrece la
información más detallada corresponde al momento de aplicar la tinción, que da colores a la muestra y gracias a ello es posible identificar diversas
estructuras mediante la observación de estas preparaciones con el microscopio de campo claro.
Pasos de la técnica histológica
A continuación se describen los pasos y objetivos principales de la técnica histológica ordinaria o de inclusión en parafina.
Obtención
Estrictamente, este paso no está considerado dentro de la técnica histológica; sin embargo, cualquier muestra a procesar primero debe obtenerse. En
esta sección vale la pena hacer mención de algunos conceptos importantes relacionados con la obtención de las muestras:
Biopsia. La muestra se obtiene de un individuo vivo.
Necropsia. La muestra se obtiene de un cadáver.
Biopsia incisional. Se obtiene una sección de la lesión.
Biopsia excisional. Es extraída la lesión completa.
Tipos de biopsias. De acuerdo con el tipo de tejido que sea necesario obtener, es el tipo de biopsia adecuado. Considere algunos ejemplos:
Punción y aspiración con aguja fina (PAAF). Tejidos líquidos como la sangre se obtienen por este método.
Punción y aspiración con aguja gruesa (PAAG). La médula ósea roja, al ser un tejido más viscoso que la sangre, se obtiene con una aguja de
mayor calibre.
Citología exfoliativa. Las células que se pueden desprender de los epitelios (como las de endocérvix y exocérvix), de cavidad oral o de alguna
lesión, se obtienen a partir de un raspado o cepillado.
Una vez adquirida la muestra que se desea estudiar, de inmediato debe procederse al paso siguiente y que es crucial: la fijación.
Fijación
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CAPÍTULO 2: Técnica histológica, Raquel Guerrero Alquicira; Marcela Rojas Lemus; Teresa I. Fortoul van der Goes Page 1 / 9
La importancia de este paso radica en que es el momento en el que se detienen los procesos vitales de las células del tejido obtenido, se evitan los
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procesos autolíticos y se estabilizan las biomoléculas de la muestra; además, provee un poco de dureza a ésta. Con la fijación se obtiene un elemento
clave: se conservan las proteínas de la célula. Sólo si se realiza una fijación adecuada de la muestra los pacientes pueden recibir un diagnóstico
preciso y acertado, los proyectos de investigación para observar las diferencias entre los tratamientos serán exactos y toda la información derivada del
Citología exfoliativa. Las células que se pueden desprender de los epitelios (como las de endocérvix y exocérvix), de cavidad oral o de alguna
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lesión, se obtienen a partir de un raspado o cepillado. Access Provided by:
Una vez adquirida la muestra que se desea estudiar, de inmediato debe procederse al paso siguiente y que es crucial: la fijación.
Fijación
La importancia de este paso radica en que es el momento en el que se detienen los procesos vitales de las células del tejido obtenido, se evitan los
procesos autolíticos y se estabilizan las biomoléculas de la muestra; además, provee un poco de dureza a ésta. Con la fijación se obtiene un elemento
clave: se conservan las proteínas de la célula. Sólo si se realiza una fijación adecuada de la muestra los pacientes pueden recibir un diagnóstico
preciso y acertado, los proyectos de investigación para observar las diferencias entre los tratamientos serán exactos y toda la información derivada del
examen histológico será confiable.
La fijación de una muestra puede efectuarse mediante inmersión o perfusión. La inmersión ocurre cuando la muestra se sumerge en el fijador y éste
penetra de manera paulatina de la periferia al centro de la muestra, en tanto que la perfusión se propicia cuando el fijador se inyecta al torrente
sanguíneo del organismo y, por ende, se distribuye y fija a los tejidos acorde con el flujo de la circulación. En la fijación se emplean sustancias
denominadas fijadores; el fijador más utilizado es el formol o formalina al 10 por ciento.
A fin de que una muestra se fije de manera adecuada, debe ser embebida en el fijador en pequeños trozos (no mayores a 1 cm3); por cada centímetro
cúbico de muestra, se deben colocar 10 cm3 de fijador. El tiempo ideal para que el formol penetre en los tejidos es de 24 a 48 horas. Una vez que la
muestra se fija, puede continuarse con el siguiente paso.
Deshidratación
Una vez que la muestra está fijada, es necesario considerar que las células tienen agua en su interior, debido a que es un componente tisular
abundante. Las muestras se deshidratan con alcohol en concentraciones crecientes. El agua abandona de manera paulatina los tejidos y, al final de
este paso, el agua ha sido reemplazada con alcohol.
Aclaración o difanización
El alcohol debe ser reemplazado con un agente aclarante (xileno, tolueno o benceno), debido a que la parafina no es miscible en alcohol, pero sí lo es
en los solventes orgánicos como los agentes aclarantes. En este paso, la muestra también adquiere cierta transparencia.
Infiltración e inclusión
Son dos pasos simultáneos en los que se emplea parafina líquida. La infiltración ocurre cuando la parafina penetra al interior de las células y de las
estructuras tisulares; la inclusión alude al momento en que el tejido es embebido en la parafina, para formar un bloque.
Corte o microtomía
Una vez que la parafina se ha solidificado y tiene la consistencia adecuada, entonces el tejido está listo para cortarse. Las rebanadas de tejido que se
deben obtener para que la muestra permita el paso de la luz del sistema óptico del microscopio deben tener en promedio un espesor de 510
micrómetros. Los cortes se obtienen con el micrótomo, que es el instrumento que permite obtener estas rebanadas tan delgadas.
Desparafinización
Los cortes deben ser desparafinizados, ya que los colorantes no son miscibles en la parafina y sería imposible teñirlos, por lo que es preciso realizar el
proceso inverso: se emplean agentes aclarantes para que reemplacen a la parafina. Tales agentes confieren también transparencia al corte.
Rehidratación
Ahora en el corte los espacios están ocupados por agentes aclarantes, los cuales deben ser reemplazados por alcohol y al final con agua. En este
proceso el corte se somete a la rehidratación mediante la inmersión en alcohol en concentración decreciente.
Tinción
Los cortes, al ser tan delgados y al haber pasado por el agente aclarante, son totalmente transparentes. A fin de diferenciar estructuras, se tiñen para
conferirles contraste. Los cortes pueden ser coloreados con tinciones monocrómicas, bicrómicas o tricrómicas. Este apartado se ampliará más
adelante.
Montaje
Una vez que el corte ha sido teñido, debe ser protegido para que se conserve. A cada corte se le coloca resina sintética (transparente) y un
proceso el corte se somete a la rehidratación mediante la inmersión en alcohol en concentración decreciente.
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Tinción
Los cortes, al ser tan delgados y al haber pasado por el agente aclarante, son totalmente transparentes. A fin de diferenciar estructuras, se tiñen para
conferirles contraste. Los cortes pueden ser coloreados con tinciones monocrómicas, bicrómicas o tricrómicas. Este apartado se ampliará más
adelante.
Montaje
Una vez que el corte ha sido teñido, debe ser protegido para que se conserve. A cada corte se le coloca resina sintética (transparente) y un
cubreobjetos.
Métodos de coloración
Existen diversos colorantes y diversas combinaciones de éstos que se emplean para teñir las muestras. De acuerdo con el número de colorantes
empleados es factible clasificarlos en monocrómicos, bicrómicos o tricrómicos. A continuación se listan algunos que son empleados con mayor
frecuencia.
Tinciones monocrómicas
Azul de toluidina. Con esta tinción se observa la muestra en diferentes tonos de azul.
Azul del metileno. Con esta tinción se observa la muestra en diferentes tonos de azul.
Tinciones bicrómicas
Hematoxilinaeosina. Es la más utilizada —por ello recibe también el nombre de “tinción convencional”— y ayuda a identificar los componentes
ácidos (basófilos) y los básicos (acidófilos) de las muestras. Se emplean dos colorantes (hematoxilina y eosina) por lo que también se le conoce como
HE o H y E.
La tinción HE es muy útil porque permite diferenciar entre los dos compartimentos más importantes de la célula: el núcleo y el citoplasma (figura 21).
En el cuadro 21 se describen los componentes tisulares y los colores que exhiben con esta tinción.
Figura 21.
En A se observa un corte de la pared de la tráquea, en el que se identifican diferentes tejidos: tejido conjuntivo (▼), adenómeros mucosos (♦),
adenómeros serosos (→) y cartílago hialino (*). En B se observa músculo liso. Ambos cortes están teñidos con hematoxilinaeosina (HE). Fotografías
cortesía de Armando Zepeda y Francisco Pasos.
Cuadro 21.
Componentes tisulares y los colores que muestran con la tinción hematoxilina y eosina (HE).
Componente Ejemplos Colorante que captan Color que exhiben Término
Ácido DNA, RNA Hematoxilina Azulmorado Basófilo
Básico Proteínas Eosina Rosanaranja Eosinófilo o acidófilo
Tinciones tricrómicas
Masson, Gallego y Gomori. En las tinciones tricrómicas se emplean tres colorantes. Las tinciones tricrómicas utilizadas con mayor frecuencia son:
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Cuadro 21.
Componentes tisulares y los colores que muestran con la tinción hematoxilina y eosina (HE).
Componente Ejemplos Colorante que captan Color que exhiben Término
Ácido DNA, RNA Hematoxilina Azulmorado Basófilo
Básico Proteínas Eosina Rosanaranja Eosinófilo o acidófilo
Tinciones tricrómicas
Masson, Gallego y Gomori. En las tinciones tricrómicas se emplean tres colorantes. Las tinciones tricrómicas utilizadas con mayor frecuencia son:
Masson, Gallego y Gomori, las cuales ayudan a diferenciar entre tejidos básicos (epitelial, conjuntivo y muscular) (figura 22). El cuadro 22 describe las
diferencias de coloración de los componentes tisulares.
Figura 22.
Se muestran cortes de lengua teñidos con tres tinciones tricrómicas: el corte A está teñido con Masson, el B con Gallego y C con Gomori. Los triángulos
(▼) señalan al músculo, las flechas (→) al tejido conjuntivo (colágena) y los asteriscos (*) al epitelio. Fotografías cortesía de Armando Zepeda y
Francisco Pasos.
Cuadro 22.
Tinciones tricrómicas y los colores que exhiben los componentes tisulares.
Componente tisular
Tinción Músculo Tejido conjuntivo (colágena) Núcleo
Masson Rojo Azul rey Negro
Gallego Amarillo Verde Rojo
Gomori Rojo Verde brillante Negro
Tinciones selectivas
Las tinciones selectivas sirven para hacer evidentes biomoléculas específicas en los tejidos o en las células.
Carbohidratos. Para demostrar carbohidratos (es decir, mucina o moco, glucocálix y glucógeno) se emplean tinciones como PAS (tinción del ácido
peryódico de Schifft) (figura 23) o carmín de Best; con estas tinciones dichos componentes adoptan un color rojo carmín (magenta).
Figura 23.
Gomori Rojo Verde brillante Negro
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Tinciones selectivas
Las tinciones selectivas sirven para hacer evidentes biomoléculas específicas en los tejidos o en las células.
Carbohidratos. Para demostrar carbohidratos (es decir, mucina o moco, glucocálix y glucógeno) se emplean tinciones como PAS (tinción del ácido
peryódico de Schifft) (figura 23) o carmín de Best; con estas tinciones dichos componentes adoptan un color rojo carmín (magenta).
Figura 23.
En A se muestra un corte de hígado teñido con PAS. Dentro de los hepatocitos se observan las inclusiones de glucógeno en color magenta. En B se
observa un corte de la glándula sublingual teñida con mucicarmín de Mayer, en el cual es posible apreciar los adenómeros mucosos en color rosa.
Lípidos. Con la finalidad de demostrar lípidos es preciso emplear tinciones y métodos especiales, ya que durante la técnica histológica ordinaria esta
biomolécula se disuelve y, por tanto, lo que se observa es su ausencia, misma que constituye evidencia de lípidos en la muestra. Con tetraóxido de
osmio los lípidos adoptan un color oscuro, en tanto que con sudán rojo y rojo oleoso obtienen un color rojo.
DNA. Para hacer la diferenciación entre los dos tipos de ácidos nucleicos, ya sea ácido desoxirribonucleico (DNA) o ácido ribonucleico (RNA), se
emplea la tinción de Feulgen, misma que colorea de rojo magenta específicamente al DNA (figura 24).
Figura 24.
Corte de raíz de lirio con tinción de Feulgen, contrastada con verde brillante. El material genético de las células se observa en color magenta.
Proteínas. Hay diferentes tipos de tinciones que se utilizan según se trate de fibras elásticas o reticulares.
Fibras elásticas. Las tinciones de Reyes (rosamagenta), Orceína (morado intenso) y Verchöeff (café oscuro) se emplean para hacer notorio este
componente tisular (figura 25).
Fibras reticulares. La técnica de Wilder (que es una impregnación metálica) sirve para demostrar las fibras reticulares, constituidas por
colágena III (o reticulina). Mediante esta técnica las fibras se observan en color negro (figura 26).
CAPÍTULO 2: Técnica histológica, Raquel Guerrero Alquicira; Marcela Rojas Lemus; Teresa I. Fortoul van der Goes
Figura 25. Page 5 / 9
Se muestran cortes de elementos vasculares con tinciones específicas para fibras elásticas (señaladas con el símbolo ▲). Tinción de orceína ( A ),
ReyesMota (B) y Verchöeff (C).
Proteínas. Hay diferentes tipos de tinciones que se utilizan según se trate de fibras elásticas o reticulares.
Fibras elásticas. Las tinciones de Reyes (rosamagenta), Orceína (morado intenso) y Verchöeff (café oscuro) se emplean para hacer notorio este
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componente tisular (figura 25).
Fibras reticulares. La técnica de Wilder (que es una impregnación metálica) sirve para demostrar las fibras reticulares, constituidas por
colágena III (o reticulina). Mediante esta técnica las fibras se observan en color negro (figura 26).
Figura 25.
Se muestran cortes de elementos vasculares con tinciones específicas para fibras elásticas (señaladas con el símbolo ▲). Tinción de orceína ( A ),
ReyesMota (B) y Verchöeff (C).
Figura 26.
Corte de bazo con la técnica de Wilder para mostrar fibras reticulares (se observan en negro).
Otros métodos para resaltar componentes específicos
Hay, sin embargo, componentes que deben demostrarse con métodos más específicos.
Inmunomarcaje. Así, por ejemplo, dentro del gran universo de las proteínas, es factible encontrar un tipo en particular a través del inmunomarcaje,
técnica en la que se aprovecha la especificidad antígenoanticuerpo. Mediante dicha técnica se identifica un antígeno específico por medio de un
anticuerpo asociado con un cromógeno (inmunohistoquímica) o con un fluorocromo (inmunofluorescencia).
Técnicas argénticas. Las impregnaciones metálicas emplean sales de oro que se adhieren a la superficie de las células, en especial a las del tejido
nervioso (figura 27).
Figura 27.
Impregnación metálica. A ) Método de Golgi rápido en el que se observa una neurona con sus prolongaciones (fotografía cortesía de la doctora. Laura
Colín Barenque). B ) Tinción KluverBarrera, aquí se muestra un corte de cerebelo en el que se señala con la flecha (→) la capa molecular de la corteza
(sustancia gris) y las fibras que componen a la sustancia blanca (t), que con este método se tiñen de azul intenso.
Técnicas argénticas. Las impregnaciones metálicas emplean sales de oro que se adhieren a la superficie de las células, en especial a las del tejido
nervioso (figura 27).
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Figura 27.
Impregnación metálica. A ) Método de Golgi rápido en el que se observa una neurona con sus prolongaciones (fotografía cortesía de la doctora. Laura
Colín Barenque). B ) Tinción KluverBarrera, aquí se muestra un corte de cerebelo en el que se señala con la flecha (→) la capa molecular de la corteza
(sustancia gris) y las fibras que componen a la sustancia blanca (t), que con este método se tiñen de azul intenso.
Tinciones que se utilizan en el tejido nervioso. Debido a su alto componente lipídico, para el tejido nervioso se emplean tinciones especiales,
como las de KluverBarrera, Nissl o Luxol fast Blue, mismas que colorean a los lípidos sin sacrificar el resto de las características histológicas de la
muestra (figura 27).
Tinciones para microorganismos. A continuación se citan las tres más importantes.
ZiehlNeelsen. Se emplea para identificar a las bacterias ácido alcohol resistentes, como las Mycobacterias (figura 28).
Brown Brenn para bacterias. Técnica que identifica a las bacterias grampositivas (Gram+), que toman el color azul y las gramnegativas (Gram
−) que lucen de color rosa o rojo (figura 28).
Grocott. Con esta tinción es posible hacer visibles a los hongos y también a Pneumocystis carinni e Histoplasma spp. Los tiñe de color negro.
Figura 28.
A ) Es posible apreciar micobacterias (rosa magenta) en el tejido pulmonar tras aplicar la tinción ZiehlNeelsen. B ) Mediante la tinción de Brown Brenn
se hacen evidentes las bacterias grampositivas (Gram+) en color azul y las gramnegativas (Gram−) en color rosa.
Figura 28.
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A ) Es posible apreciar micobacterias (rosa magenta) en el tejido pulmonar tras aplicar la tinción ZiehlNeelsen. B ) Mediante la tinción de Brown Brenn
se hacen evidentes las bacterias grampositivas (Gram+) en color azul y las gramnegativas (Gram−) en color rosa.
Correlación clínica
El departamento de Patología de los hospitales procesa las muestras obtenidas de los pacientes; es muy importante que tales muestras se obtengan
con el procedimiento correcto, que hayan sido fijadas de manera adecuada e inmediata (lo que constituye trabajo y responsabilidad del médico que
realiza el procedimiento), ya que el diagnóstico que emita el patólogo está en función de las características morfológicas que observe al analizar dicha
muestra. Por supuesto, sería muy grave que el diagnóstico del paciente resultara ser erróneo debido a una mala fijación o falta de apego al
procedimiento bosquejado en este capítulo.
¿Sabias que…?
Aunque el proceso al que se somete la muestra se haga con todo cuidado, siempre existe la posibilidad de que ocurra lo que los histólogos
denominan “artefactos o artificios de la preparación”.
A menudo sucede que lo primero que identifican los estudiantes son estos “artefactos”. La figura 29 muestra algunas imágenes para ilustrar esto e
identificarlos. Tales artefactos ocurren por errores en el proceso de la técnica y es factible observar precipitados, dobleces, desgarros, etc. Durante
el corte, si la cuchilla está mellada, en el tejido habrá evidencia de ello. Las burbujas que puede formar la resina no son propiamente un artefacto,
pero es común que cuando los estudiantes las encuentran piensen que esas son las células. Es labor del docente instruir de manera adecuada a sus
alumnos sobre estos artefactos y aclarar las dudas que hacen surgir.
Figura 29.
Artefactos o artificios en las preparaciones histológicas. En A se observa una fractura en el tejido; en B, precipitados; en C, mella dejada por la cuchilla;
en D y E, plegamientos; en F, burbujas.
Figura 29.
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Artefactos o artificios en las preparaciones histológicas. En A se observa una fractura en el tejido; en B, precipitados; en C, mella dejada por la cuchilla;
en D y E, plegamientos; en F, burbujas.

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Ácido DNA, RNA Hematoxilina Azulmorado Basófilo

Básico Proteínas Eosina Rosanaranja Eosinófilo o acidófilo

Tinción Músculo Tejido conjuntivo (colágena) Núcleo

Masson Rojo Azul rey Negro

Gallego Amarillo Verde Rojo

Gomori Rojo Verde brillante Negro

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