TEMA 3.

PARED INTESTINAL: MODELOS Y TÉCNICAS DE ESTUDIO

EL INTESTINO

Hay dos tipos de intestino:

- Delgado: Con microvellosidades para absorber
- Grueso: Mucho más muscular. Destaca por la capa mucosa.

Capas del intestino:

1) Mucosa
2) Submucosa
3) Muscular
a. Circular
b. Longitudinal
4) Serosa

Sistema nervioso entérico

Es un sub-sistema del nervioso autónomo, representado por:

- Plexo mientérico: Se encuentra entre las capas musculares circular y longitudinal del
intestino. Abundante en el intestino.
- Plexo submucoso: se encarga de la regulación de la secreción de hormonas, enzimas
y todo tipo de sustancia secretada por las diferentes glándulas que se encuentran a
lo largo del tubo digestivo.

Funciones del intestino

- Motilidad
- Absorción
- Secreción: agua/electrolitos
- Función barrera/inmunitaria: Critica, si no enfermas
- Microbiota: NO es función como tal pero es importante

ESTUDIO DE LAS FUNCIONES DEL INTESTINO

MOTILIDAD
Estudios in vivo

- Transito colónico: en un animal anestesiado se introduce 2 cm intrarectalmente una

microesfera de vidrio y se espera a que sea expulsada. No es muy buena opción.
- Tránsito intestinal completo: se tiñe la comida de un animal con un colorante (azul
de Evans) que no se absorbe. Por sonda gástrica se introduce azul de Evans con goma
arábiga y simplemente debes esperar a que expulse el color.

Estudios ex vivo

- Baño de órganos: sistema para ensayar la respuesta contráctil de un órgano.

Necesitamos un ordenador y amplificador de señal. Se conectan 8 copas con doble
cristal y burbujeamos oxígeno, con un hilo se suspende un trozo de tejido y
podremos detectar cómo se contrae. En función de la forma en que esté cortado el
tejido, rodajas o tiras, podemos estudiar cada una de las capas del intestino, circular
o longitudinal, de manera independiente.

- Microelectrodos intracelulares: Por si queremos estudiar la motilidad una sola

célula, pinchamos dos electrodos en una misma célula. Lo tengo en una placa de
Petri y voy a ir viendo cómo se contrae al añadir diferentes sustancias.

- (In vitro: Sobre todo existen cultivos primarios, lo malo es que las células no están
organizadas como músculo). No ha mencionado.

ABSORCIÓN INTESTINAL

Podemos tener dos en función de si el transporte necesita o no energía:

- Difusión pasiva:
o Las sustancias pueden pasar por uniones estrechas o poros
o Difusión facilitada por una proteína transportadora o canal.
- Transporte activo:
o Primario: el consumo energético,
normalmente de ATP, está
acoplado directamente al
movimiento del soluto a
transportar.
o Secundario: el consumo de energía
se realiza para generar un
gradiente químico o
electroquímico que se convierte
en un depósito energético que se
gastará para el empuje del soluto a
transportar. Ejemplo: simporte y antiporte.
Estudios ex vivo

 Membranas artificiales

Sirven para comprobar si un elemento va a atravesar la

membrana. Son dos bicapas lipídicas en las que añadimos la
sustancia y vemos si es capaz de atravesar la membrana de
la célula o no.

Ensayo de permeabilidad de membrana artificial en

paralelo (PAMPA) determina la permeabilidad de sustancias
de un compartimento donante, a través de una membrana
artificial infundida con lípidos en un compartimento aceptor.
Si es capaz de pasar podemos confirmar que sin necesidad
de transportador puede pasar a una célula.

Estudios in vivo

Consisten en ingerir una cantidad concreta de la sustancia de estudio, esperar un tiempo

que se absorba y posteriormente, extraer una muestra de sangre, orina o heces para
analizar su concentración.

 Test de D-xilosa

La D-xilosa es una pentosa que se absorbe en forma activa y por difusión pasiva y se
utiliza para evaluar la capacidad de absorción del intestino delgado, ya que no requiere
la presencia de enzimas digestivas para su absorción.

El paciente ingiere 25 gramos de D-xilosa disueltos en medio litro de agua. Después se

obtiene la orina emitida durante las 5 horas siguientes. Niveles reducidos de xilosa en
orina sugieren la presencia de un defecto de absorción a nivel de intestino delgado.
Si no nos llega la D-xilosa a la orina podemos decir que tenemos malabsorción
secundaria a patología de la mucosa intestinal.

 Balance de grasas

Ingerir una cantidad conocida de grasas, recoger heces durante 3 días y por
determinadas técnicas detectarlas. Consiste en recoger las heces emitidas durante 3
días mientras el paciente ingiere una cantidad conocida de grasa (70-120g/día) y analizar
después las heces por distintas técnicas: NIRA, tinción de glóbulos grasos con Sudán III,
esteatocito ácido...
El porcentaje de grasa absorbida puede se calcula como la grasa ingerida menos la grasa
eliminada dividido entre la grasa ingerida, siendo normal si es mayor al 94%.

 Tolerancia a la lactosa
La intolerancia a la lactosa se debe al déficit de una disacaridasas, la lactasa.

El paciente ingiere 50 gr. de lactosa disueltos en agua y se recogen muestras de sangre

basal, a los 5, 10, 30, 60, 90 y 120 minutos para determinar glucosa. Para que la glucosa
aparezca en sangre es necesario que la lactosa haya sido adecuadamente degradada y
absorbida.

Ahora, se está sustituyendo por el test del hidrógeno expirado que es más sencillo y
consiste en: las bacterias intestinales tienen la capacidad de descomponer los azucares
liberando Hidrógeno. Este pasa al torrente circulatorio y de aquí al pulmón,
expulsándose finalmente al exterior mediante la respiración.
El test de Hidrógeno espirado consiste en la medición de hidrógeno en el aire que
respiramos tras la administración de un azúcar que nos sirve como sustrato según la
aplicación que le queramos dar al test.
In vivo – ex vivo (medio camino entre in y ex vivo)

Se basan en aislar el órgano del tejido periférico manteniendo su inervación y

vascularización.
 Estudios de perfusión
Basado en el método de Doluisio. En este método la
solución a ensayar se mantiene en el segmento intestinal
del cual se toman muestras para observar la desaparición
del fármaco. Consiste en el animal vivo, cogemos un trozo
de intestino sin sacarlo y la entrada y salida la controlo con
jeringuillas. Yo le añado solución con molécula de estudio,
pasa todo el intestino, se absorberá o no y con la jeringuilla
final mido a ver.

La constante de permeabilidad intestinal efectiva (Peff) es la

constante aparente de velocidad de absorción que se obtiene
por ajuste a regresión no lineal. La transformación de la
constante aparente de velocidad de absorción nos da la
siguiente fórmula, donde R es el diámetro del segmento
intestinal.

Modelos ex vivo – tejidos aislados

 Sacos invertidos (Wilson-Wilman)

Se emplea en la realización de estudios de acumulación de fármacos en segmentos

intestinales completos. Para ello, los segmentos intestinales se invierten y dividen en
pequeñas secciones a modo de anillos. Éstos se incuban en tampones oxigenados que
contienen el fármaco problema, en condiciones de agitación y temperatura controladas
(79). El sistema de sacos invertidos permite el estudio de las limitaciones que puede
presentar un fármaco frente a la absorción intestinal.
 Cámaras de difusión

Las cámaras de difusión son modelos de absorción que cuantifican el flujo transepitelial
de fármacos a través del tejido epitelial intacto. El segmento intestinal que se somete a
estudio se aísla y secciona convenientemente con el fin de obtener capas planas de
tejido. Éstas se disponen posteriormente sobre las células de difusión estándar,
disponible comercialmente, que se rellenan con un tampón adecuado que simula los
fluidos extracelulares.
Este sistema experimental es muy versátil y permite la cuantificación de la
permeabilidad de un tejido, el transporte intestinal paracelular y transcelular, la
secreción intestinal y la influencia del metabolismo intestinal en la biodisponibilidad de
un fármaco.

Ejemplo: Cámara de Ussing (leer)

Cuatro entradas para electrodos, dos

para medir la diferencia de potencial
transepitelial y dos para proveer
corriente. Conectado a un baño
termorregulado, que mantiene a
temperatura constante las soluciones. La
cámara también posee un par de
entradas destinadas al suministro de una
mezcla de aire 95% Oxígeno y 5% CO2,
por medio de un burbujeo constante,
para equilibrar el ión bicarbonato y
establecer un pH fisiológico durante el
período de tiempo que dure el
experimento, mantener oxigenado el
epitelio, promover la circulación y
agitación para lograr la homogeneidad
de las soluciones dentro de las hemicámaras.

 Fracciones subcelulares

Vesículas enriquecidas para estudiar los mecanismos de transporte de los compuestos

que se absorben a través de la vía transcelular. Se preparan a partir de diversos tejidos,
por homogeneización y sedimentación diferencial de los mismos (producida
generalmente por centrifugación en gradiente de densidad y precipitación diferencial) y
posterior fraccionamiento. Dos tipos:
 Celulas enriquecidas en borde en cepillo
 Celulas enriquecidas en membrana basolateral.
Epitelio intestinal

El epitelio intestinal está formado por una capa simple de diferentes tipos de células,
cada una de las cuales tienen una función específica. En el intestino delgado, las células
más abundantes son los enterocitos cuya función principal es la absorción de nutrientes
desde la luz al interior del organismo. Estas células presentan microvellosidades en su
superficie apical, que se conoce como borde en cepillo y tienen la finalidad de
incrementar la superficie de absorción.
También presenta células secretoras, como las células goblet o caliciformes, que
secretan moco; las enteroendocrinas, productoras y secretoras de hormonas y
neuropéptidos que tienen funciones importantes en el control de la ingesta y en la
homeostasis de la glucosa; las células de Paneth, productoras y secretoras de péptidos
antimicrobianos hacia la luz.

Los enterocitos en vez de repararse, son renovados constantemente mediante una alta
producción de nuevos enterocitos y por la eliminación mediante extrusión desde la capa
epitelial o por muerte por apoptosis los más viejos y dañados.
Nota: Cuando llegan arriba mueren por anoikis.

Líneas celulares

Las líneas celulares son altamente polarizados bioquímica, morfológica y

funcionalmente pues las zonas apical y basolateral de la membrana son esencialmente
diferentes. Las células en suspensión rápidamente se fusionan y despolarizan, perdiendo
de esta forma la diferenciación entre las zonas antes mencionadas.
Nos permiten evaluar:
- Permeabilidad alta/baja.
- Transporte activo y pasivo
- Interacciones a nivel de transportadores

Caco-2

Establecida por Fogh en 1977 a partir de carcinoma de colón humano

(hombre de 77 años). Es la única línea celular capaz de diferenciarse
morfológica y funcionalmente a enterocitos de manera espontánea
aunque requiere mucho tiempo.

HT-29
Aisladas de cáncer de colon en 1964 por Fogh. Se diferencian a enterocito,
pero debe inducirse la diferenciación gracias a varios factores (forskolina,
colchicina, ausencia de glucosa…). Tiene el metabolismo de glucosa
alterado (diferencia con enterocito) pero la ventaja es que puede secretar
moco y eso es más realista.

T84
Derivada de una metastasis en pulmón de un carcinoma de colon por
Dharmsathaphorn et al. 1985. Morfología similar a colonocitos Útil para
transporte iónico.

HIEC-6
Derivada de intestino de un feto de 18 semanas proveniente de un
aborto por Quaroni et al en 1991 También existe versión en rata
(IEC-6). Útil para el estudio de la diferenciación celular ya que
contiene criptas
 MDCK
Células epiteliales renales de perro, utilizadas para modelos de
transporte. Diferenciación típica renal (no representa al enterocito)
No tienen nada que ver con enterocitos, pero se usa mucho para
estudiar la resistencia transepitelial que viene más adelante.

Estudios de transporte (Transwell)

Los soportes permeables, también conocidos como insertos de cultivo celular, son una
herramienta esencial para el estudio de líneas celulares. Puede utilizar insertos de
cultivo celular para:
 Producir un ambiente de cultivo celular que se asemeja mucho a un estado in
vivo
 Cocultivo de células con o sin contacto célula célula
 Diseñar una diversidad de experimentos utilizando varios tamaños de poro, tipos
de membrana, y revestimientos
Los estudios Transwell permiten la polarización de las células con el desarrollo del borde
apical y basolateral. Crea dos compartimentos para el estudio, pudiendo medir flujos A-
B y B/A.

Para medir la actividad de un transportador hay que añadir el tampón I, luego el II que
es igual, pero con la molécula de estudio marcada. Se da un tiempo prudencial y
retiramos tampón II y añadimos el III frio que paraliza la situación.
Rompemos las células y vemos la concentración que hay. Primero podemos hacer
estudio por PAMPA no vaya a ser que pase por difusión facilitada.
FUNCIÓN BARRERA

La función barrera está definida por permeabilidad de moco, uniones estrechas y

barrera inmunitaria.

Mucinas

Las mucinas son una familia de proteínas de alto peso

molecular y altamente glicosiladas producidas por las
células de los tejidos epiteliales. Alrededor de 21
diferentes. Presentan 1 dominio transmembrana, con
parte posterior altamente glicosidada que atrae agua y
crea esa mucosidad. Difíciles de estudiar.
Por microscopía electrónica podemos ver lo ancha que es.

Medida de permeabilidad del glicocálix

Podemos usar bolitas, según la permeabilidad de moco veremos cuánto se
acercan al tejido. También influye el peso de dextrano.

Uniones estrechas
Representadas por muchas proteínas. Podemos hacer estudios de:
- Expresión: PCR, Western…
- Funcional: Cómo de fuertes son para dar más permeabilidad o menos
(medida de TEER).
TEER: La resistencia transepitelial es una manera de evaluar la integridad
de la barrera (permeabilidad de las uniones intercelulares).

PRRs (sistema inmune)

Encargados de reconocer patrones moleculares asociados a patógenos. Constituyen la
primera respuesta inmune contra patógenos.
En un epitelio podemos estudiar cuan eficaz es la barrera inmunitaria midiendo la
actividad de estos receptores PRRs.

MICROBIOTA

Gut – brain axis se ha demostrado (relación intestino y cerebro).

PCR-DGGE
Consiste en PCR normal con primers universales que amplifican el S16.

Analizar la microbiota:
- Metataxonomía: Analizo el ADN, pero yo no sé si 100% seguro están vivas. es la
estrategia más utilizada para caracterizar la composición y la cantidad relativa de las
comunidades microbianas. A partir de una muestra a la que se extrae el ADN total,
 se amplifica el gen ADNr 16S con cebadores universales y después se secuencian
masivamente los amplicones. A cada secuencia se le asigna el grupo taxonómico
mediante búsquedas en las bases de datos públicas como Ribosomal Database
Project
- Metataxonomía de la fracción activa: Se pasa a ARN porque eso nos asegura que
están vivas. Pero saberlo tampoco de mucha información. Los estudios de
metataxonomía permiten conocer la composición de la microbiota sin diferenciar
entre las bacterias vivas y las muertas, latentes o inactivas. Para poder identificar a
las bacterias activas es necesario extraer el ARN de la muestra, transformarlo en
ADNc mediante retrotranscripción y, finalmente, secuenciarlo.
- Metabolómica: Miramos los metabolitos que producen las bacterias pues esos si que
son lo que finalmente me van a afectar. Esta estrategia aborda la identificación y
caracterización de los metabolitos desde un punto de vista funcional. Desde el punto
de vista de la química analítica, para el análisis de metabolomas se requieren 2 tipos
de herramientas: la resonancia magnética nuclear y la espectrometría de masas.