Colona Ve

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

UNIDAD DE POSGRADO
Expresión de inmunocitoquinas e
inmunofenotipificación de células mononucleares de
sangre periférica humana tratadas con la lectina de
Lupinus mutabilis sweet (Tarwi), ecotipo Patón Grande
TESIS
Para optar el Grado Académico de Magíster en Biología

Molecular
AUTOR
Erasmo Honorio COLONA VALLEJOS
ASESOR
Libertad ALZAMORA GONZALES
Lima – Perú
2017
El presente estudio fue realizado en el Laboratorio de Inmunología de la
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Mayor de San
Marcos con el financiamiento del Proyecto Especial de Investigación del
Rectorado (RR N° 03761-R-15), Proyecto PIBA del Vicerrectorado de
Investigación (RR N°03912-R-15), Estudios CON CON 2014 (RR N° 00967-
R-14) y 2015 (RR N° 00532-R-15).
“Y si alguno imagina que sabe algo, aún no sabe nada como
debe saberlo”
1 Corintios 8:2
AGRADECIMIENTOS
A Dios quien siempre está a mi lado y que a pesar de haber estado
atribulado, en apuros y derribado evitó que me angustiara, perdiera la calma
y pensara estar destruido. Gracias Dios.
A mi esposa Mary quien siempre ha estado en el momento exacto para

sostenerme y levantarme y, sobre todo acompañarme en este reto.
A mis padres Constantino y Bertha, hermanos y familia en general por

siempre alentarme a seguir adelante.
A mi asesora, maestra, colega y sobre todo amiga, la Dra. Libertad Alzamora

Gonzales, eternamente gracias, siempre serás mi maestra y guía.
Al Dr. Edgar Matos Benavides, Lic. José Manuel Guevara Canales y Lic.
Rosario Inocente Malpartida por brindar los reactivos, equipo y orientación
en el procesamiento de los datos para la realización de los ensayos por
citometría de flujo en el Centro Referencia Nacional de Alergia e
Inmunología del Instituto Nacional de Salud del Niño.
A la Mg. Carolina de Amat Herbozo por su gran apoyo en el procesamiento y

lectura de los datos de citometría de flujo.
A la Dra. Evelyn Alvarez Salazar y la Mg. Ana Mayanga Herrera por su

apoyo en la selección y eficiencia de primers.
Al Mg. Enrique Escobar, por su apoyo en los ensayos cromatográficos y la

disponibilidad para atender nuestras interrogantes.
A mis alumnos y ahora colegas Emely, Luis Antonio y Ricardo por motivarme
a concluir la tesis y siempre contar con su apoyo incondicional,
A los tesistas y ayudantes del Laboratorio de Inmunología: Mónica, Julio,

Dora Luisa, Andrés, Christian, Rosa, Jorge, Mary Luz y Luis por su apoyo en
las prácticas y darme la oportunidad de poder redactar la tesis.
Al Dr. Félix Camarena y la Mg. Amelia Huaringa de la Universidad Agraria La

Molina por la disposición de proveernos las semillas de tarwi.
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN I
ABSTRACT II
LISTA DE TABLAS III
LISTA DE FIGURAS IV
LISTA DE ABREVIATURAS V
1. INTRODUCCIÓN 1
2. ANTECEDENTES 4
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 13
4. MATERIAL Y MÉTODOS 14
5. RESULTADOS 21
6. DISCUSIÓN 44
7. CONCLUSIONES 58
8. RECOMENDACIONES 59
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60
10. ANEXOS 80
RESUMEN
El proteoma de la semilla de Lupinus mutabilis consiste en una mezcla

compleja de proteínas dentro del cual las lectinas tienen la capacidad de
interactuar con células del sistema inmune. La finalidad del presente estudio
fue determinar la expresión génica transcripcional de inmunocitoquinas y el
inmunofenotipo de las células mononucleares de sangre periférica humana
(CMSPh) tratadas con la lectina semipurificada de Lupinus mutabilis Sweet,
ecotipo Patón Grande. El extracto proteico (EPG) elaborado a partir de la
harina desengrasada de semillas de lupino se fraccionó mediante
cromatografía de exclusión molecular. Las lectinas del extracto y fracciones
se identificaron mediante la actividad hemaglutinante y SDS-PAGE. Las
CMSPh se incubaron durante 24 y 72 h con el EPG (5 μg/mL), la fracción 9
del pico I (F9-PI 5 y 25 μg/mL), fitohemaglutinina (PHA, control positivo) y
medio RPMI (control negativo). La expresión génica de las inmunocitoquinas
e inmunofenotipificación se realizó mediante la PCR convencional y
citometría de flujo respectivamente. El EPG y la F9-PI a la concentración de
5 μg/mL durante 24 y 72 h de incubación estimularon la expresión de IL-1α y
TNF-α mRNA con respecto al control (p<0.05). Sin embargo, la fracción F9-
PI (25μg/mL) a las 72 h de incubación aumentó significativamente la
expresión de IL-10 (p<0.05). Las CMSPh tratadas con el EPG y la F9-PI a la
concentración de 5 μg/mL durante 72 h no incrementaron el recuento total
de linfocitos y monocitos, mientras que la F9-PI (25 μg/mL) aumentó
significativamente el número total de monocitos con respecto a los controles
(p<0.05). Se concluye que el EPG y la F9-PI estimulan la expresión de IL-1α
y TFN-α mRNA, mientras que la lectina semipurificada a la concentración de
25 μg/mL eleva la expresión de IL-10 mRNA e induce el incremento del
número total de monocitos CD4+CD16-.
PALABRAS CLAVE
Lupinus mutabilis, lectinas hemaglutinantes, células mononucleares de

sangre periférica, inmunocitoquinas, inmunofenotipificación.
i
ABSTRACT
The proteome of Lupinus mutabilis seed consists of a complex mixture of

proteins within which lectins have the ability to interact with cells of the
immune system. The purpose of the present study was to determine the
gene transcriptional expression of immunocytokines and the
immunophenotype of the human peripheral blood mononuclear cells
(hPBMC) treated with the semipurified lectin of Lupinus mutabilis Sweet,
ecotype Patón Grande. The protein extract (EPG) prepared from the
degreased meal of lupine seeds was fractionated by gel permeation
chromatography. Lectins from the extract and fractions were identified by
haemagglutinating activity and SDS-PAGE. The hPBMC were incubated
during 24 and 72 h with the EPG (5 μg/mL), fraction 9 of peak I (F9-PI 5 and
25 μg/mL), phytohemagglutinin (PHA, positive control) and RPMI medium
(negative control). Gene expression of immunocytokines and
immunophenotyping was performed by conventional PCR and flow cytometry
respectively. The EPG and the F9-PI at the concentration of 5 μg/mL during
24 and 72 h of incubation stimulated the expression of IL-1α and TNF-α
mRNA with respect to the control (p<0.05). However, fraction F9-PI
(25μg/mL) at 72 h of incubation significantly increased the expression of IL-
10 (p<0.05). The hPBMC treated with the EPG and the F9-PI at the
concentration of 5 μg/mL for 72 h did not increase the total lymphocyte and
monocyte count, while the F9-PI (25 μg/mL) significantly increased the total
number of monocytes with respect to the controls (p<0.05). It is concluded
that the EPG and the F9-PI stimulate the expression of IL-1α and TFN-α
mRNA, while the semipurified lectin at the concentration of 25 μg/mL
increases the expression of IL-10 mRNA and induces the increase of the
total number of monocytes CD4 + CD16-.
KEY WORDS
Lupinus mutabilis, hemagglutinating lectins, peripheral blood mononuclear

cells, immunocytokines, immunophenotyping.
ii
LISTA DE FIGURAS Pág.
Figura 1. Diagrama de elaboración del extracto crudo proteico de Lupinus

17
mutabilis, ecotipo Patón Grande………………………………………………….
Figura 2. Perfil cromatográfico y SDS-PAGE del extracto proteico y

25
fracciones de L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande………………………
Figura 3. Actividad hemaglutinante del extracto proteico de L. mutabilis

26
Sweet, ecotipo Patón Grande….…………………………………………………...
Figura 4. Actividad hemaglutinante de las fracciones obtenidas por

26
cromatografía de exclusión molecular….………………………………………….
Figura 5. Concentración de proteínas del extracto crudo proteico y fracciones

27
de L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande…………………………………….
Figura 6. Expresión del gen de la IL-1α y el TNF-α inducida con la F9-PI de

28
L. mutabilis, ecotipo Patón Grande durante 24 horas…………………………...
Figura 7. Expresión del gen de la IL-1α y el TNF-α inducida con la F9-PI de

29
L. mutabilis, ecotipo Patón Grande durante 72 horas.…………………………..
Figura 8. Efecto de la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande sobre la

30
expresión génica de la IL-10 durante 24 y 72 horas……………………………..

32
expresión génica del TFG-β durante 24 y 72 horas…….……………………….
Figura 10. Análisis de la expresión génica de la IL-2 en células

mononucleares humana estimulada con la F9-PI de L. mutabilis, ecotipo
33
Patón Grande durante 24 y 72 horas……………………….……………………..
Figura 11. Análisis de la expresión génica del IFN-γ en células

mononucleares humanas inducida con la F9-PI de L. mutabilis, ecotipo
35
Patón Grande durante 24, 48 y 72 horas………….………………………………
Figura 12. Identificación de las poblaciones celulares CD3-CD16bright y

37
CD3+CD16dim estimulada con la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón
Grande………………………………………………………………………………...
iii
Figura 13. Análisis de la línea monocítica CD4+CD16- estimulada con la F9-
38
PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande…………..……………………………….
Figura 14. Identificación de las poblaciones celulares CD4+CD8-,

CD4+CD8+, CD4-CD8- y CD4-CD8+ estimulada con la F9-PI de L. mutabilis 40
ecotipo Patón Grande……….……………………………………………..............
Figura 15. Análisis de los linfocitos CD3+CD25+ estimulados con la F9-PI de

41
L. mutabilis ecotipo Patón Grande………………………………..………………...
Figura 16 Análisis inmunofenotípico de las células CD3-CD19+ estimulada

42
con la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande…………………...………….
Figura 17. Interacciones hipotéticas de la F9-PI 25 μg/mL de L. mutabilis con

el IGF-1R y su efecto sobre la expresión génica transcripcional de citoquinas 59
y la proliferación celular……………………………………………………………..
Figura 18. Efecto hipotético de la interacción de la F9-PI 25 μg/mL de L.

mutabilis sobre la proliferación de monocitos clásicos de sangre
periférica……………………………………………………………………………… 60
iv
LISTA DE TABLAS Pág.
Tabla 1. Familia de lectinas en plantas (De Schutter & Van Damme 2015)…. 9
Tabla 2. Lectinas de plantas que inducen la producción de citoquinas (Souza
et al. 2013)…………………………………………………………………………… 11
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en la PCR para genes de citoquinas
humanas……………………………………………………………………………… 21
Tabla 4. Resultados de la densidad de señal de la expresión de mRNA de
inmunocitoquinas normalizadas con la señal del control (GAPDH mRNA)
mediante el programa ImageJ (NIH, USA)………………………...................... 36
Tabla 5. Conteo total o absoluto de poblaciones de células mononucleares

de sangre periférica humana, determinado por análisis de citometría de
flujo…………………………………………………………………………………… 44
v
LISTA DE ABREVIATURAS
CD: Cluster of differentation

CD3-CD16bright: Linfocitos Natural Killer (NK). Las células NK expresan una
elevada densidad de CD16 (CD16 bright)
CD3+CD16dim: Linfocitos T Natural Killer (NKT). Las células NKT expresan

baja densidad de CD16 (CD16 dim)
CD3+CD4+CD8-: Linfocitos T helper (LTh)
CD3+CD4-CD8+: Linfocitos T citotóxicos (LTc)
CD3+CD4-CD8-: Linfocitos T doble negativo (LTDN) que corresponden

aproximadamente al 1-5% del total de linfocitos de sangre periférica que son
probablemente linfocitos T γδ, células T regulatorias o NKT CD4-CD8-
CD3+CD4+CD8+: Linfocitos T doble positivo (LTDP) que corresponden el 3-

5% del total de linfocitos T totales de sangre periférica. Presentan funcion
supresora o citotóxica
CD3-CD19+: Linfocitos B
CD45+CD4+CD16-: monocitos clásicos
ConA: Concanavalina A
CMSPh: Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana
CPA: Célula Presentadora de Antígenos
CXC: Quimioquinas α
CC: Quimioquinas β
cDNA: DNA complementario
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
EPG: Extracto Proteico de Patón Grande
F9-PI: Fracción 9 de proteína (con lectina) de L. mutabilis obtenida por

cromatografía de exclusión molecular-pico I
FSC: Forward scatter (Dispersión frontal, valor proporcional al tamaño

celular)
vi
FrP: Fracciones de lectinas de L. mutabilis ecotipo Patón Grande
GAPDH: Gliceraldehido 3-Fosfato Deshidrogenasa
GRCo: Glóbulos Rojos de Conejo
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic acid)
HA: Actividad hemaglutinante

h: Hora
IL: Interleuquina
IGF-1R: Receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1
IR: Receptor de Insulina
IFN: Interferón
KDa: Kilodaltons
KML-C: Lectina del muérdago Koreano-Coloratum
LB: Linfocitos B
LT: Linfocitos T
min: Minutos
NK: Linfocitos Natural Killer. Presentan un inmunofenotipo CD3-CD16 bright
NKT: Linfocitos T Natural Killer. Presentan un inmunofenotipo CD3+CD16dim
PI: Pico I obtenido por cromatografía de exclusión molecular
PII: Pico II obtenido por cromatografía de exclusión molecular
PIII: Pico III obtenido por cromatografía de exclusión molecular
PHA: Fitohemaglutinina
PMN: Polimorfonucleares
PEGE2: Prostaglandina E2
MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad
mRNA: Ácido Ribonucleico mensajero
NIH: National Institute of Health
vii
NO: Óxido Nítrico
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
RNA: Ácido Ribonucleico
SDS: Sodio Dodecilsulfato
SDS-PAGE: Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con SDS
SSE: Solución Salina de Extracción
seg: Segundos
SSC: Side scatter (dispersión lateral, proporcional a la cantidad de

estructuras granulares o complejidad de la célula)
TNF: Factor de Necrosis Tumoral
TGF: Factor de Crecimiento Transformante
Th: Linfocitos T helper o auxiliador
Tr1: Linfocitos T regulador 1
viii
1. INTRODUCCIÓN
La modulación del sistema inmunitario indica cualquier cambio en la

respuesta inmune que puede implicar la inducción, expresión, amplificación
o inhibición de cualquier parte o fase de la respuesta inmune. La actividad
inmunomoduladora es un término general que indica un efecto biológico o
farmacológico sobre factores humorales o celulares que actúan en la
respuesta inmune natural y adaptativa con efectos inmunosupresores y/o
inmunoestimuladores (Sánchez et al. 2003; Saroj et al. 2012).
Las plantas medicinales, en la actualidad satisfacen la atención

primaria de salud por medio de extractos o principios activos (Sasidharan et
al. 2011), lo cual reduce los costos al compararlo con el tratamiento de la
medicina moderna. En la medicina tradicional se cree que diferentes partes
de la planta tienen propiedades medicinales específicas incluyendo la
capacidad de estimular los mecanismos de defensa del organismo (Zhu &
Sang, 2017).
Un reducido número de plantas han sido seleccionadas para

investigar sus actividades inmunoestimulatorias, pero debido a su
inadecuada evidencia no permite su uso en la práctica clínica (Kumar et al.
2011). Sin embargo, las moléculas vegetales con actividad
inmunomoduladora comprobada desde saponinas a lectinas constituyen
una “mina de oro” inexplotada (Granell et al. 2010).
El término lectina deriva del latin “legere” que significa “seleccionar

elegir o escoger”. Esta denominación fue propuesta por Boyd and
Shapleigh (1954) para las aglutininas derivadas de plantas con capacidad
de seleccionar glóbulos rojos de diferentes grupos sanguíneos (Espino
2015).
Las lectinas son un grupo de proteínas o glicoproteínas de origen

no–inmune que comparten la propiedad de enlazarse de forma específica y
reversible a los polisacáridos y glicoproteínas, ya sean libres o que formen
1
parte de estructuras más complejas (Sharon y Lis, 1998; Goldstein et al.
1980). Estas proteínas usualmente tienen al menos dos sitios de unión por
molécula: un azúcar específico y una molécula glicosilada (Castillo y
Abdullaev, 2005). En las plantas, las lectinas se han aislado principalmente
de los cotiledones y endospermos de las semillas constituyendo del 2 al 10
% del total de proteínas de éstas (Hernández et al. 1999).
La familia Leguminosae tiene el grupo más grande de lectinas bien

caracterizadas, que son de interés debido a una variedad de
especificidades de carbohidratos y mayor disponibilidad en la naturaleza.
En general, se ha atribuido una amplia gama de aplicaciones biológicas a
las lectinas vegetales, tales como mediadores de la respuesta inflamatoria
e inmune; antivirales, antibacterianos, antifúngicos y antihelmínticos, efecto
curativo, adyuvantes de fármacos, marcadores histoquímicos, biosensores
de enfermedades y actividades antitumorales (Coelho et al. 2017; Fohona
et al. 2017).
Diferentes mecanismos de inmunomodulación han sido atribuidos a

las lectinas de plantas; por ejemplo, la fitohemaglutinina (PHA), una lectina
específica de N-acetilgalactosamina, extraída de Phaseolus vulgaris (frijol)
presenta efecto inmunosupresor o proliferativo dependiendo de la dosis
(Ruiz et al. 2005) o la Concanavalina A (ConA), lectina específica de
manosa/glucosa aislada de las semillas de Canavalia ensiformis que ha sido
determinada como agente mitogénico de células CD4+ e inhibidor de la
proliferación de células tumorales entre otras lectinas estudiadas (Faheina et
al. 2012).
El género Lupinus es miembro de la familia Leguminosae y presenta

cuatro especies de importancia para la agricultura: L. albus, L. angustifolius,
L. luteus y L. mutabilis (Yorgancilar y Bilgiçli, 2014; Tapia 2015). Los
estudios se realizan principalmente con las semillas de este género debido a
su contenido de proteínas como lectinas; por ejemplo en las semillas de L.
mutabilis Sweet “tarwi”, debido a su elevada proporción de globulinas, han
2
sido caracterizadas en su actividad de lectina (Falcón et al. 2000; Rodriguez
2017).
Existen estudios relacionados a lectinas del género Lupinus, basados

en sus propiedades nutricionales, efecto hipercolesterolémico, hipoglicémico,
actividad antiinflamatoria y antimicrobiana de sus alcaloides, pero hay
escasa información acerca de su actividad inmunomoduladora (Fornasini et
al. 2012; Ruiz et al. 2014; Foley et al. 2015).
El Perú tiene la ventaja de tener una de las especies de lupino con

mayor contenido de proteínas que otras especies: Lupinus mutabilis (Kay
1985). Empleando extractos de L. mutabilis “tarwi” se han determinado las
actividades antiinflamatoria, analgésica, antimicrobiana o sus efectos
bioquímicos y hematológicos in vivo (Castañeda et al. 2002; Castañeda et al.
2007; Castañeda et al. 2013). Existen pocos estudios de los extractos o
purificados proteicos con función de lectina sobre la población de células
mononucleares humanas y su efecto modulador en la expresión de
inmunocitoquinas.
Debido a la gran utilidad de las lectinas vegetales es necesario

realizar estudios que permitan establecer las bases científicas para el uso de
estas proteínas que podrían ser benéficos, neutros o perjudiciales (Gabius
2001).
Recientemente el grupo de investigación MODULANS de la

Universidad Nacional Mayor de San Marcos ha caracterizado
bioquímicamente la lectina de Lupinus mutabilis Sweet, ecotipo Patón
Grande (Rodriguez 2017), demostrando que se trata de la γ-conglutina
coincidiendo con los reportes de investigadores como Duranti et al. (1994) y
Ribeiro et al. (2014). Ante esta perspectiva se hace necesario continuar con
la investigación e incrementar el conocimiento del efecto inmunomodulador
de esta lectina con la finalidad de validar su uso como tratamiento
complementario en patologías como leishmaniasis, tuberculosis, cáncer
entre otras; en el diagnóstico o como adyuvante de vacunas, además de
3
proporcionarle valor agregado al tarwi, aumentar el consumo y mejorar la
calidad de vida de los productores.
El presente estudio tuvo como objetivo determinar la expresión génica

transcripcional de inmunocitoquinas y el inmunofenotipo de las células
mononucleares de sangre periférica humana tratadas con la F9-PI, una
fracción hemaglutinante de Lupinus mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande.
4
2. ANTECEDENTES
2.1 Lupinus mutabilis Sweet

El género Lupinus comprende más de 400 especies, pero solo cuatro
son de importancia para la agricultura: L. albus, L. angustifolius, L. luteus y L.
mutabilis (Yorgancilar y Bilgiçli, 2014; Tapia 2015).
Lupinus mutabilis Sweet conocido como chocho, chochito, chuchus muti,
tarwi, tarhui, tauri, ullush, talwish, lupino, altramuz o ccquella es una
leguminosa oriunda de los andes de Perú, Bolivia y Ecuador, cuyas semillas
desamargadas y cocidas son utilizadas por los pobladores andinos como
alimento y medicina (Jacobsen y Mujica, 2006; Rodríguez, 2009).
2.1.1 Clasificación taxonómica de Lupinus mutabilis Sweet

De acuerdo a Camarena et al. (2012) y Vilcapoma (2002) la
clasificación taxonómica del tarwi, es la siguiente:
Reino Vegetal
División Fanerógama
Clase Dicotiledónea
Orden Fabales
Familia Fabaceae
Tribu Genisteae
Género Lupinus mutabilis Sweet
2.1.2 Variabilidad y diversidad genética
El tarwi muestra una amplia diversidad genética con gran variabilidad

en la arquitectura de la planta, adaptación a suelos, precipitación,
temperatura, altitud y periodo vegetativo (Jacobsen y Mujica, 2006). Existe
muy poca información sobre los miles de genotipos que posee el Perú, sin
embargo, el sector agro nacional, por medio de algunas universidades
públicas e instancias privadas, ha desarrollado el incremento de ecotipos
cultivables y mejoramiento de los mismos llegando a ser el país con más
variedades de L. mutabilis en el mundo (Quispe 2015).
5
2.1.3 Valor nutritivo
Lupinus mutabilis Sweet, domesticada desde la época inca, posee

elevado valor nutricional, sin embargo su consumo es bajo, esto influye en la
producción agrícola por lo que es considerado un cultivo “huérfano”. Este
recurso, constituye una fuente de ingreso y sobrevivencia para los pequeños
productores que podrían ser beneficiados si los estudios que se realizan
para descubrir su propiedad como alimento funcional incrementaran el valor
del cultivo, debido a que los pequeños agricultores resultan ser los más
pobres en las cadenas productivas (Camarena, 2012; Jacobsen y Mujica,
2006; Tapia et al. 2000).
El tarwi es rico en proteínas y grasas por lo cual es una excelente

opción para sustituir o reducir el consumo de proteína animal y evitar
problemas de desnutrición. El contenido de proteínas puede variar entre 24.8
y 49.8 % dependiendo del tipo de colección de tarwi (Tapia, 2015). Sosa
(2000) reportó la mayor concentración de proteína (43.07%) en L. mutabilis
en relación a otras variedades como L. albus, L. angustifolius y L. luteus.
Recientemente Gutiérrez et al. (2016) reportaron una concentración de 53.2
% de proteína en la semilla de tarwi (L. mutabilis) obtenido de la región
Junín. El incremento de la concentración de proteína se puede conseguir
cuando se extraen los lípidos y alcaloides (Tapia, 2015). Además el
contenido proteico del tarwi es rico en globulina, albúmina, aminoácidos
azufrados y calcio total que necesita nuestro organismo diariamente (77.5
mg) (Camarena et al. 2012).
Por otro lado, el escaso consumo de tarwi se atribuye a la presencia

de factores no nutricionales que incluyen alcaloides, fitatos, oligosacáridos
de rafinosa y lectinas (Mori et al. 2008; Tapia et al. 2000; Schoeneberger et
al. 1984). Sin embargo, el desarrollo de trabajos de mejoramiento genético
puede explotar las mejores características de este recurso, tal como se ha
conseguido con algunas accesiones que contienen menor cantidad de
alcaloides (Camarena, 2012).
6
2.1.4 Usos medicinales y agronómicos
El conocimiento tradicional en la cultura Aymara en Puno, le atribuye

al tarwi efectos sobre la diabetes, males renales, hepáticos y eliminación de
ectoparásitos (Jacobsen y Mujica, 2006). Algunas de estas propiedades han
sido demostradas, así por ejemplo el extracto proteico total desengrasado de
L. albus mostró significativo efecto hipocolesterolemiante e
hipotrigliceridemiante (Sirtori et al. 2004; Spielmann et al. 2007). El extracto
metanólico de L. mutabilis Sweet presentó efecto analgésico (Castañeda et
al. 2013). Huamán et al. (2013) determinaron la actividad tripanocida y
antileishmania del extracto acuoso de semillas de L. mutabilis Sweet.
Recientemente Chauca (2016) demostró el efecto leishmanicida de las
lectinas presentes en el extracto de L. mutabilis de los ecotipos Compuesto
Blanco Semiprecoz y las fracciones de L. mutabilis ecotipo Patón Grande.
Además, se ha determinado que el extracto acuoso de semillas de L.
mutabilis inhibió del crecimiento micelial en hongos fitopatógenos como
Alternaria solani y Fusarium solani (Yepes et al. 2009).
2.1.5 Situación general del Tarwi
De acuerdo al Ministerio de Agricultura y Riego (MINAGRI), la

producción de tarwi se centra en los departamentos de La Libertad, Cusco,
Puno, Huancayo y Cajamarca, entre otros (MINAGRI, 2015). En el Perú, la
producción y consumo de Lupinus mutabilis Sweet (tarwi) se ha revalorado
en los últimos años debido a su riqueza nutricional (Aguilar 2015), esta
planta crece de forma natural y en otros casos es cultivada por sus
deliciosas semillas. Lamentablemente, existen pocos estudios llevados en
laboratorio sobre este vegetal y sus ecotipos y, muchas de sus ventajas no
han sido estudiadas o están en fase preliminar (Chirinos 2015; Quispe
2015).
2.1.6 La γ-Conglutina
Es una globulina conservada presente en las semillas del género

Lupinus (Magni et al. 2004). Inicialmente no se le encontró capacidad
7
hemaglutinante ni otros roles fisiológicos (Duranti et al. 1994), sin embargo,
Ribeiro et al. (2014) determinaron la actividad hemaglutinante de la γ-
Conglutina en L. albus. Por otro lado, Rodriguez (2017) describió las
propiedades bioquímicas y demostró la actividad hemaglutinante de la
fracción y lectina purificada de L. mutabilis cuyo peso molecular
corresponden a la γ-Conglutina.
2.2 Lectinas
2.2.1 Definición
Las lectinas son un grupo heterogéneo de proteínas o glicoproteínas
de origen no inmune que se une a carbohidratos a través de sitios
moleculares con alta afinidad y especificidad, interactuando con mono u
oligosacáridos por medio de uniones de hidrógeno, fuerzas de van der Walls
e interacciones hidrofóbicas, con reversibilidad, alta especificidad y ninguna
actividad catalítica o inmune (Coelho et al. 2017). Las lectinas, están
presentes en frutos, semillas y vegetales con actividad biológico-funcional y
potencial benéfico a la salud humana (Vázquez et al. 2012). Estas moléculas
tienen importancia en la investigación biomédica y se han utilizado en
estudios de interacción carbohidrato-proteína, aglutinación, tipificación de
grupos sanguíneos, estimulación mitogénica, inhibición de la fagocitosis,
inmunosupresión, toxicidad celular, inhibición del crecimiento fungal,
bacteriana y viral, propiedades insecticidas, anti-VIH, anticancerígenas,
marcador de células nerviosas, inactivadores ribosomales de neuronas,
actividad tipo nucleasa, detección de anormalidades cromosómicas, entre
otros (Hernández et al. 2005; Castillo & Abdullaev 2005; Hivrale & Ingale,
2013).
8
2.2.2 Clasificación
Las lectinas pueden dividirse en 12 familias en base al dominio
conservado de reconocimiento de carbohidratos (Tabla 1) (De Schutter &
Van Damme 2015).
Tabla 1. Familia de lectinas en plantas y sus ligando glucídicos (De Schutter

& Van Damme 2015)
2.3 Inmunomoduladores de origen vegetal

Los inmunomoduladores son cada vez más considerados en la
industria de los productos naturales, llegando en algunos países a tener más
importancia que la industria farmacéutica, debido a que la población ha
comenzado a tener conciencia de la importancia de un sistema inmunológico
óptimo para el mantenimiento de la salud, prevención o recuperación
después de una enfermedad (Ramasundaram et al. 2005).
Los productos naturales y sus componentes pueden ser una fuente

importante de moléculas con propiedades inmunomoduladoras interesantes
9
(Sánchez et al., 2002). La búsqueda puede estar dirigida hacia compuestos
inmunoestimulantes para el tratamiento de cáncer e infecciones, compuestos
que regulen o supriman respuestas inmunes no deseadas
(hipersensibilidades, enfermedades inflamatorias o autoinmunes) o como
adyuvantes para las vacunas (Patwardhan & Gautam, 2005).
2.3.1 Lectinas de plantas como inmunomoduladores

Diversos estudios in vivo e in vitro han definido el papel que juegan
las lectinas como moduladores de la respuesta inmune contra el cáncer y
activación de los linfocitos T (Reyes et al. 2011). Algunas lectinas de plantas
ejercen su actividad inmunomoduladora interaccionando con glicanos
presentes en la superficie de las células inmunes, desencadenando señales
de transducción para producir citoquinas e inducir una eficiente respuesta
inmune contra tumores o infecciones microbianas (Tabla 2) (Souza et al.
2013).
Algunas lectinas presentan efectos inmunomoduladores como la

actividad mitogénica e inducción de la respuesta Th1, Th2 o Th17. Estos
efectos se inician con la unión de las lectinas a glicanos en la superficie
celular (receptores de lectinas, dominios estimulantes, receptor células T
entre otros) induciendo la respuesta inmune a través de segundos
mensajeros (diacilglicerol e inositol 1, 4,5 trifosfato), incremento de los
niveles de Ca+2 citosólico y liberación de citoquinas especificas (Coelho et al.
2017).
10
Tabla 2. Lectinas de plantas que inducen la producción de citoquinas (Souza
et al. 2013)
La fitohemaglutinina (PHA) es una lectina específica N-

acetilgalactosamina de Phaseolus vulgaris. Las propiedades
inmunomoduladoras de la fitohemaglutinina (PHA) se basan en inducción de
la proliferación in vitro de linfocitos. Ruiz et al. (2005) evaluaron la PHA de
dos variedades de frijol “Cueto” y “Judía roja santo”, determinando que la
PHA obtenida de Phaseolus vulgaris de la variedad “Cueto” estimulaba la
producción de anticuerpos. Sin embargo, se ha comprobado que la PHA
posee un efecto supresor dependiente de la dosis sobre la respuesta inmune
humoral y celular (Folch et al. 1983).
La Concanavalina A (ConA) es la lectina de Canavalia ensiformis que

une específicamente moléculas de α-D-glucosa y α-D-manosa. La ConA
presenta propiedades duales que hacen que pueda realizar tanto inducción
autofágica directa sobre células diana (tumorales) como también actividad
inmunomoduladora indirecta en linfocitos, debido a su unión específica a
manosa (Lei & Chang 2007). La estimulación de monocitos y macrófagos
11
THP-1 con ConA inhibe la expresión de la IL-1β, IL-6, IL-10 y el TNF-α con
excepción de la IL-8 (Chanput et al. 2010). Sin embargo, se ha determinado
que esta lectina estimula directamente los monocitos para producir
citoquinas como el TNF-α y la IL-1β y, activar linfocitos que secretan el IFN-γ
y estimulan la expresión de CD40 en la superficie de monocitos,
promoviendo su interacción con los linfocitos y posterior diferenciación en
macrófagos (Chen et al. 2012). Recientemente se ha demostrado que la
lectina Cbol de Canavalia boliviana inhibe la migración de neutrófilos y el
edema de la pata inducida por carragenano (Bezerra et al. 2014).
La aglutinina 1 del muérdago estimula la fagocitosis de células

polimorfonucleares (PMN) pero presenta un débil efecto sobre macrófagos,
mientras que la ConA estimula la actividad fagocítica en macrófagos (Stoika
et al. 2001). El extracto del muérdago Europeo (Viscum álbum
Loranthaceae) estimula la actividad de monocitos y macrófagos, incrementa
la actividad de las células NK, la citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpos (ADCC) y la producción de citoquinas (Hajto et al. 1989). Yoon
et al. (2001) determinaron que la lectina de Viscum album coloratum
(muérdago Koreano o KML-C) mezclada con un antígeno incrementó
significativamente el título de anticuerpos IgG1, IgG2a e IgG2b relacionados
con la respuesta tipo Th1 y Th2.
Lee et al. (2009) determinaron que la lectina KLM-C incrementó la

actividad de células NK y macrófagos, la producción de óxido nítrico (NO),
IL-1, IL-6, TNF-α, la proporción del peso del bazo y timo y, el número de
células CD4+ y CD8+. Además demostraron que KLM suprime los niveles de
aspartato aminotransferasa (AST), lactato deshidrogenasa (LDH), y
fosfatasa alcalina (ALP) marcadores de daño al corazón, músculo e hígado
respectivamente.
La lectina de frijol mungo induce la expresión de citoquinas como la

IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α e IFN-γ en células mononucleares humanas
presentando efectos inmunoestimulantes y antiinflamatorios. Además, la
aglutinina del germen de trigo (WGA) estimula la actividad fagocítica en
12
polimorfonucleares de sangre periférica humana (PMN) y macrófagos a
bajas concentraciones (0.5-1.0 μg/mL), mientras que a altas concentraciones
(5-10 μg/mL) inhibe el proceso fagocítico (Jeune et al. 1999).
La aglutinina Abrus (AAG) obtenida de las semillas de Abrus

precatorius promueve efectos antitumorales debido a la producción de NO
por células de la inmunidad natural e inmunomodulación por citoquinas tipo
Th1 (IL-2 e IFN-γ) (Ghosh & Maiti 2007). Estudios realizados con la lectina
extraída de las semillas de Cratylia mollis Mart. han demostrado su
capacidad de inducir en linfocitos murinos respuesta Th1 a través de la
producción del IFN-γ, y suprimir la producción de óxido nítrico. Además, se
ha observado que incrementó la producción de la IL-2, IL-6 y el IFN-γ pero
redujo niveles de la IL-10 en esplenocitos de ratón (de Melo et al. 2010b; de
Melo et al. 2011).
Con relación al género Lupinus existen escasos estudios en la

actividad inmunomoduladora de los extractos proteicos o fracciones
parcialmente purificadas o purificadas con actividad hemaglutinante.
Recientemente se ha reportado que hidrolizados proteicos de L. angustifolius
atenúan la expresión de genes de citoquinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6,
IL-1β) e incrementan la expresión de marcadores antiinflamatorios (CCL18)
(Millán et al. 2014a, 2014b).
En el Perú, estudios realizados con extracto de L. mutabilis ecotipo

Patón Grande sobre CMSPh han determinado la activación del receptor de
la IL-2 (CD25), mientras que la lectina de la fracción no presentó variaciones
en los porcentajes de las poblaciones CD4+ y CD8+ (de Amat, 2015).
Chauca (2016) encontró un incremento en la producción de NO en
macrófagos murinos tratados con el extracto de L. mutabilis ecotipo
Compuesto Blanco Semiprecoz. Rodriguez (2017) determinó que las
lectinas purificadas de L. mutabilis ecotipo Patón Grande no afectaron la
producción NO en leucocitos totales y PMN humanos. Además, demostró
que la lectina purificada reduce la producción de especies reactivas de
oxígeno en PMN humanos.
13
Por lo tanto, es imprescindible que se realicen estudios que permitan
conocer cómo las lectinas de Lupinus mutabilis modulan la expresión génica
transcripcional de citoquinas importantes en la respuesta inmune y la
población de células mononucleares de sangre periférica humana (CMSPh)
con la finalidad de validar científicamente los extractos o fracciones y
garantizar su utilización como inmunomoduladores o herramientas de
diagnóstico.
14
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
3.1 Hipótesis
La lectina de Lupinus mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande ejerce

efecto inmunomodulador in vitro sobre la expresión génica transcripcional de
inmunocitoquinas y la activación de células mononucleares de sangre
periférica humana.
3.2 Objetivo General
Determinar la expresión génica transcripcional de inmunocitoquinas y el

inmunofenotipo de las células mononucleares de sangre periférica humana
tratadas con la lectina de Lupinus mutabilis Sweet, del ecotipo Patón
Grande.
3.3 Objetivos Específicos
3.3.1 Obtener el extracto crudo de Lupinus mutabilis Sweet ecotipo Patón

Grande.
3.3.2 Purificar parcialmente la lectina a partir de extractos de Lupinus

mutabilis Sweet ecotipo Patón Grande.
3.3.3 Determinar el efecto de la fracción parcialmente purificada de la

lectina sobre los niveles de expresión transcripcional para la IL-1α,
IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-10 y TGF-β.
3.3.4 Establecer el inmunofenotipo de las células mononucleares de sangre

periférica humana cultivadas con la fracción semipurificada de la
lectina.
15
4. MATERIAL Y MÉTODOS
4.1 Selección de semillas de Lupinus mutabilis Sweet, ecotipo Patón

Grande
Las semillas de Lupinus mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande
fueron proporcionados por el Programa de Leguminosas, Granos y
Oleaginosas de la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM).
4.2 Elaboración del extracto crudo desengrasado de L. mutabilis Sweet,

ecotipo Patón Grande
Se realizó de acuerdo al protocolo de extracción reportado por
Rodriguez (2017). Para este fin, se pesaron 10 gramos de la harina
desengrasada que se maceraron en 100 mL de solución salina de
extracción estéril (SSE, ClNa 0.15M, Cl2Ca 20 mM, Cl2Mn 20mM)
(Anexo 1). Luego se realizó una agitación vigorosa durante 2 min y se
mantuvo en agitación constante a 500 rpm durante 3 h a 4°C y sin
agitación a 4°C durante toda la noche. El sobrenadante se colocó en
microtubos y se centrifugó a 17800 g durante 15 min a 4°C. La harina
sedimentada se maceró nuevamente con SSE en agitación constante a
500 rpm durante 1 h a 4°C y se filtró en gasa estéril. La fase líquida
obtenida fue colocada en microtubos y centrifugada en condiciones
similares. El sobrenadante se colectó en tubos 50 mL (Corning) y se
mantuvo a 4°C durante el procesamiento. Para la precipitación de
proteínas se calculó la cantidad de sulfato de amonio al 80% mediante
el servidor online EncorBio (http://www.encorbio.com/protocols/AM-
SO4.htm). Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante contenido en
un vaso de precipitación y se mantuvo en agitación constante con una
barra magnética a 500 rpm durante 90 min a 4°C. Posteriormente la
solución precipitada se centrifugó a 17800 g durante 30 min. Los pellets
se resuspendieron en SSE y se dializaron contra SSE a 4°C con dos
cambios de la solución. Finalmente el extracto recuperado de la bolsa
de diálisis, fue inmediatamente alicuotado y almacenado a -20°C hasta
su uso.
16
Figura 1. Diagrama de elaboración del extracto crudo proteico de Lupinus
mutabilis, ecotipo Patón Grande. I) Semillas de L. mutabilis, ecotipo Patón Grande y
harina de tarwi tamizada. II) Desengrasado de la harina de tarwi y secado durante 48-
72 h. III) Maceración en la SSE, centrifugación y obtención del sobrenadante. IV)
Precipitación del sobrenadante con SSSA 80%. V) Dializado del precipitado y obtención
del extracto crudo proteico.
4.3 Purificación parcial del extracto crudo proteico de L. mutabilis Sweet,

La cromatografía de exclusión molecular se realizó de acuerdo a lo

descrito por Rodríguez (2017). Para este fin, se emplearon columnas de
Sephadex G-75 de 25 cm de altura y 1.1 cm de diámetro. El volumen del
17
gel fue de 24 mL y el volumen muerto de 8 mL. La columna se equilibró
con 4 volúmenes de buffer HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-
ethanesulfonic acid) 10 mM, ClNa 0.15 M, Cl2Ca 2mM, Cl2Mn 2mM pH
6.8 (Buffer HEPES-NaCaMn) (Anexo 2) durante 24 h. Luego se cargó 1
mL del extracto crudo sobre la columna y se colectaron manualmente 45
fracciones de 1 mL para elaborar el patrón cromatográfico. La velocidad
de flujo fue de 0.2 mL/h. Las fracciones se leyeron a 280 nm. La
identificación de las proteínas en el extracto y las fracciones se realizó
por SDS-PAGE según Laemmli (1970) con ciertas modificaciones
(Anexo 3).
4.4 Ensayos de la actividad hemaglutinante del extracto y las fracciones

de L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande
El criterio universal para la identificación a priori de lectinas es su

capacidad hemaglutinante sobre eritrocitos de diferentes especies, que
también se aplicó en el estudio. Se emplearon glóbulos rojos de conejo
(GRCo) lavados en solución salina fisiológica (SSF, pH 7.0) y
tripsinizados al 0.1% (Anexo 4). Luego se realizó una suspensión de
GRCo al 2% en SSE. El ensayo se efectuó en microplacas de 96 pocillos
con diluciones dobles del extracto y las fracciones. Posteriormente se
incubó la placa a 20°C durante 30 min a 80 rpm en una incubadora con
agitación constante. Las pruebas se realizaron por duplicado (de Amat
2015).
4.5 Determinación de la concentración de proteínas en extractos y

fracciones de L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande
El extracto y las fracciones se cuantificaron mediante el método de

Bradford (Bradford 1976) o el método fluorométrico Qubit de acuerdo a
las indicaciones del producto. Por el método de Bradford las lecturas se
realizaron en un espectrofotómetro a 595 nm y se determinó la
concentración de proteínas mediante una curva de calibración con
seroalbúmina bovina (BSA).
18
4.6 Evaluación de la producción de citoquinas pro y antiinflamatorias
4.6.1 Cultivo de células mononucleares de sangre periférica humana

(CMSPh)
La sangre periférica se obtuvo de personas saludables en tubos

heparinizados por punción venosa, previo consentimiento informado de
acuerdo a la Declaración de Helsinki (Barrios et al. 2016). Las CMSPh
se diluyeron con PBS 0.15 M en la proporción 1:2, se depositó en una
solución de Ficoll-Hypaque y centrifugó a 1500 rpm durante 25 min a
temperatura ambiente. Las células se lavaron una vez con PBS 0.15 M y
dos veces con RPMI-1640 completo. Las CMSPh se resuspendieron en
RPMI-1640 completo enriquecido con suero bovino 10% y suplementado
con Hepes 25mM, bicarbonato de sodio 23 mM, aminoácidos no
esenciales y antibióticos como penicilina (100 UI/mL) y estreptomicina
(100 μg/mL). El recuento diferencial se realizó en cámara de Neubauer
mediante microscopia óptica empleando azul de tripán al 0.4% para
determinar la viabilidad celular. En cada pocillo se colocaron 100-500 μL
de 1x106 células/mL.
4.6.2 Determinación de la expresión mRNA y síntesis de cDNA para

citoquinas IL-1α, IL-2, TNF-α, IFN-γ, IL-10 y TGF-β
Las CMSPh tratadas con las concentraciones del extracto, la

fracción y los controles (PHA y RPMI) fueron centrifugadas a 10000 rpm
durante 5 min a 10°C. El RNA total se obtuvo empleando el kit GeneJET
RNA Purification, #K0739 Thermo Scientific siguiendo las
especificaciones del fabricante. El RNA total se cuantificó por
fluorometría mediante el uso del fluorómetro Qubit 3.0 (Invitrogen). Para
la transcripción reversa del RNA total se utilizó el kit Maxima First Strand
cDNA Synthesis for RT-qPCR (#K1649, Thermo Scientific) siguiendo las
especificaciones del fabricante. Previamente el RNA fue predenaturado
a 65°C durante 5 min. Para la reacción se colocaron 4 µL del Mix de
reacción 5X, 2µL del Mix Maxima Enzyme, 6 µL de agua libre de
nucleasas y RNA total a la concentración de 50 ng/µL hasta obtener un
volumen final de reacción de 20 µL. Las muestras se colocaron en un
19
termociclador Bioer Technology (versión 2009-1.6), incubándose a 25°C
durante 10 min, 50°C durante 15 min y 85°C durante 5 min para terminar
la reacción. El cDNA obtenido fue diluido 1/10 y posteriormente
congelado a –20°C hasta su uso en la prueba de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) convencional.
4.6.3 Reacción en cadena de la polimerasa convencional
Se empleó el kit Master mix PCR Platinum Master MIx (Invitrogen) de

acuerdo a las especificaciones de manufactura. Para la reacción se
colocaron 17 µL Platinum Master MIx, 1 µL primer Forward (0.5 µM), 1
µL primer Reverse (0.5 µM), 1 µL cDNA (aproximadamente 100 ng/µL).
Las muestras se colocaron en un termociclador Bioer Technology
(versión 2009-1.6) de acuerdo al siguiente protocolo: desnaturalización
inicial a 94°C durante 5 min, una fase de 35 ciclos de desnaturalización
a 94°C durante 30 seg., alineamiento 57°C durante 30 seg., extensión a
72°C durante 45 seg y, posteriormente una extensión final de 72°C
durante 7 min. En el proceso de PCR convencional se utilizaron
oligonucleótidos específicos para las citoquinas y oligonucleótidos
específicos para la amplificación del gen GAPDH como control interno
endógeno para el análisis semicuantitativo de la expresión génica (Tabla
3). La selección de los primers se realizó mediante búsqueda
bibliográfica, mientras que su eficiencia se determinó a través del uso de
Primer BLAST y la herramienta bioinformática Oligoanalyzer 3.1.
20
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados en el PCR para genes de citoquinas
humanas
4.6.4 Electroforesis en gel de Agarosa

Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel
de agarosa al 1.5 %. La electroforesis se realizó empleando buffer TAE
1X (Anexo 5). Las muestras se separaron a 100 V durante 60 min
aproximadamente y el gel fue teñido con un marcador fluorescente de
DNA (fluorescent DNA loading dye, GeneON GmbH) y se observó en un
fotodocumentador (Enduro™ GDS, Labnet). Las bandas fueron
fotografiadas para su cuantificación densitométrica empleando el
programa ImageJ (NIH, USA). Los valores fueron normalizados
considerando la proporción de las densidades de mRNA de las
citoquinas versus la densidad de mRNA de GADPH (control interno)
para cada uno de los tratamientos (EPG y F9-PI) y controles.
4.6.5 Inmunofenotipificación de células mononucleares de sangre

periférica mediante citometría de flujo
Las CMSPh fueron analizadas en un citómetro de flujo FACSCanto II

BD (Becton Dickinson) para la determinación de marcadores fenotípicos.
21
Se utilizaron anticuerpos monoclonales BD: anti-CD45-PerCP-Cy5.5;
anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE, anti-CD16-Pacific Blue,
anti-CD19-APC-Cy7 y anti-CD25-PE-Cy5. A los cultivos de CMSPh
(1x106 células) tratadas y controles se agregaron 20 μL de los
anticuerpos anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD45 y 5 μL de anti-
CD16 y anti-CD19, mientras que para la determinación de la subunidad
alfa de la IL-2 se agregaron 5 μL anti-CD3 y 5μL anti-CD25. Luego las
células fueron incubadas durante 10-20 min a temperatura ambiente en
oscuridad, lavadas con PBS, centrifugadas a 2000 rpm durante 5 min y
resuspendidas en 500 μL de PBS.
Para el análisis se adquirieron aproximadamente 100000 eventos en

los tratamientos y controles y, se determinaron los porcentajes de cada
población celular. La denominación de bright o dim se correlaciona con
la expresión del número de marcadores de superficie que confieren
propiedades funcionales únicas a las subpoblaciones (Farag & Caligiuri
2006).
La estrategia de análisis para las poblaciones celulares en CMSPh

por citometría de flujo fue la siguiente: selección de singletes (singlets;
células que pasan una sola vez por el laser y presentan la altura de
señal (FSC-H) y el área de señal (FSC-A) uniforme que el citómetro
registra como un evento), descartando agregados celulares (dos o más
células). Dentro de los singletes se identifican las poblaciones de
linfocitos y monocitos de acuerdo al tamaño (FSC) y complejidad interna
(SSC). La población de monocitos se seleccionó considerando en primer
lugar el FSC/SSC, CD45/FSC y posteriormente el CD4 y CD16. La
población de células NK y NKT se determinaron en primer lugar
mediante la expresión del marcador CD45/FSC en CMSPh y
posteriormente por la presencia o ausencia de los marcadores CD3
coexpresado con CD16+. Las subpoblaciones de linfocitos T se
analizaron mediante los marcadores CD45/FSC, CD3/FSC, CD4 y CD8.
Las células B se determinaron en base a los marcadores CD45/FSC,

CD3 y CD19/FSC. Todos los marcadores se utilizaron tanto para los
tratamientos como para los controles. El análisis de las células
22
mononucleares de sangre periférica humana tratadas con el extracto,
fracciones de lectina y controles (PHA y medio RPMI) se realizó
mediante el programa FlowJo vX10. Los resultados se expresaron
mediante los valores relativos (% de células) y valores absolutos
(células/μL). El número absoluto de cada población celular se calculó de
acuerdo a la siguiente fórmula:
Células/μL= N° de células contadas(a) X concentración de las perlas (b)

N° de perlas contadas(c) volumen de muestra (μL) (d)
(a) Número de eventos celulares positivos.
(b) Número de eventos de perlas.
(c) Concentración de perlas: 46400 y 48100 (datos del producto BD
tubos Trucount™)
(d) Volumen total de CMSPh en el momento de su obtención (150 μL)
Durante el análisis, el número absoluto de células positivas en la
muestra puede ser determinado comparando los eventos celulares con
eventos de perlas.
4.7 Análisis estadístico
Los resultados se analizaron empleando el programa GraphPad

Prisma 5.0. Las diferencias entre el grupo control y los tratamientos se
determinaron mediante análisis de la varianza (ANOVA). Las diferencias
se consideraron significativas cuando p<0.05.
23
5. RESULTADOS
5.1 Obtención del extracto crudo proteico de Lupinus mutabilis

Sweet, ecotipo Patón Grande
El volumen del extracto proteico obtenido fue de aproximadamente 12

mL, que corresponden a 24 mg/mL de proteína. El extracto presentó una
coloración amarillenta.
5.2 Purificación del extracto crudo proteico de Lupinus mutabilis

Sweet, ecotipo Patón Grande (EPG)
El fraccionamiento del extracto crudo proteico mediante cromatografía

de exclusión molecular evidenció la presencia de tres picos que se
denominaron: PI, PII y PIII (Figura 2A).
El perfil electroforético por SDS-PAGE en condiciones no reductoras

permitió reconocer en el EPG 11 bandas, mientras que para el pool de
fracciones (FrPG: F9, F10, F11, F12 y F13) del PI se observó la
presencia de 4 bandas. Las fracciones mostraron una banda
predominante que corresponde a una proteína de aproximadamente 42
KDa, mientras que en la F9-PI se observó la presencia dos bandas
tenues y una banda definida que corresponde exclusivamente a la
lectina de 42 KDa con propiedad hemaglutinante (Figura 2B). El extracto
proteico (EPG) y la F9 del Pico I (F9-PI) se utilizaron para los ensayos
de expresión génica transcripcional de inmunocitoquinas y para la
inmunofenotipificación de poblaciones de células mononucleares
humanas.
24
Figura 2. Perfil cromatográfico y SDS-PAGE del extracto proteico y fracciones de L.
mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande. A) Cromatografía de exclusión molecular
(CEM) en Sephadex G-75. Se observa la presencia de tres picos (PI, PII y PIII). El
número de fracciones colectadas fueron 45. B) SDS-PAGE del EPG y fracciones del
pico I en condiciones no reductoras. En el pico I (PI) se observa la presencia de una
banda de aproximadamente 42 KDa (la flecha amarilla señala la banda de 42 KDa). M:
marcador de pesos moleculares, EPG: extracto proteico, F9: Fracción 9, F10: Fracción
10, F11: Fracción 11, F12: Fracción 12, F13: Fracción 13, FrPG: pool de fracciones 9,
10, 11,12 y 13.
5.3 Evaluación de la actividad hemaglutinante del extracto proteico

y las fracciones hemaglutinantes de Lupinus mutabils Sweet,
Se determinó la actividad hemaglutinante (HA) en el extracto proteico

hasta la dilución 1/32. Debido a una mayor concentración de la lectina en
el extracto proteico sin diluir se observó un fenómeno comparable al
“efecto de prozona” (Van Blitterswijk et al. 1976) (Figura 3).
25
Figura 3. Actividad hemaglutinante del extracto proteico de L. mutabilis Sweet, ecotipo
Patón Grande. Se observa la hemaglutinación (malla) de los glóbulos rojos de conejo al
2% tripsinizados hasta la dilución de 1:32. En el control se observó un botón (HA
negativa). La prueba se realizó por triplicado. SD: extracto proteico sin diluir, HA:
hemaglutinación.
En la Figura 4 se observa la actividad hemaglutinante con las

fracciones obtenidas por cromatografía de exclusión molecular
correspondiente al PI. Con las fracciones 9 y 10 se obtuvieron títulos de
32 mientras que con las fracciones 11 y 12 se observaron títulos de 8 y 4
respectivamente. La fracción 13 sin diluir presentó actividad
hemaglutinante.
Figura 4. Actividad hemaglutinante de las fracciones obtenidas por cromatografía de

exclusión molecular. Las fracciones (F): F9, F10, F11, F12 y F13 presentaron actividad
hemaglutinante hasta la dilución 1:32, 1:32, 1:8, 1:4 y SD respectivamente. En el
control se observó un botón (HA negativa). SD: fracción sin diluir.
26
5.4 Determinación de la concentración de proteínas del extracto
crudo proteico y fracciones de L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón
Grande
El rango de concentración de proteínas en el extracto proteico de

tarwi fue de 12-24 mg/mL. En el caso de las fracciones obtenidas por
exclusión molecular fueron: F9 (0.85 mg/mL), F10 (2.02 mg/mL), F11
(1.82 mg/mL) y F12 (0.89 mg/mL) (Figura 5). Las concentraciones
proteicas por absorbancia a luz UV fueron concordantes con las
obtenidas por el método de Bradford.
Figura 5. Concentración de proteínas del extracto crudo proteico y fracciones de

L. mutabilis Sweet, ecotipo Patón Grande. El EPG y las fracciones fueron
cuantificados mediante el método de Bradford. EPG: extracto proteico, F: fracciones
obtenidas por cromatografía de exclusión molecular.
5.5 Expresión transcripcional para citoquinas IL-1α, TNF-α, IL-2,

IFN-γ, IL-10 y TGF-β
5.5.1 Determinación de la expresión mRNA para citoquinas IL-1α,

TNF-α
En la Figura 6A se observa que el cultivo de CMSPh tratado durante

24 h con el EPG 5 µg/mL y la F9-PI 5 µg/mL incrementó la expresión de
la IL-1α y el TNF-α mRNA con relación al control (p<0.05), sin embargo
al comparar la expresión de la IL-1α con respecto a la PHA 5 µg/mL no
se observaron diferencias estadísticamente significativas (p>0.05). El
EPG 5 µg/mL estimulo una mayor expresión de la IL-1α mRNA pero una
disminución de la expresión del TNF-α mRNA con relación a la F9-PI 5
µg/mL (p<0.05). La expresión del TNF-α mRNA se incrementó en células
27
tratadas con la F9-PI 5 µg/mL respecto a la PHA 5 µg/mL (p<0.05). La
PHA 5 µg/mL presentó un incremento en la expresión de la IL-1α mRNA
respecto a la expresión del TNF-α mRNA (Figura 6 A y B y Tabla 4).
Figura 6. Expresión del gen de la IL-1α y TNF-α estimulada con la F9-PI de L.

mutabilis, ecotipo Patón Grande durante 24 horas. La expresión del gen de la IL-1α
y el TNF-α a nivel transcripcional fue determinada mediante la PCR convencional en
células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas con la F9-PI, EPG,
PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo) durante 24 h. Los productos de la
PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %. Cada banda fue
cuantificada por densitometría empleando el programa ImageJ (NIH, USA). La expresión
del gen de la IL-1α (A) y el TNF-α (B) fueron normalizados con los niveles de expresión
del GAPDH mRNA. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida
por cromatografía de exclusión molecular – pico I, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh:
células mononucleares de sangre periférica, IL: interleuquina, TNF: factor de necrosis
tumoral. GAPDH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
28
A las 72 h se observó un incremento de la expresión de la IL-1α y del
TNF-α mRNA en las células mononucleares tratadas con la F9-PI 5 µg/mL
con respecto al control (p<0.05), sin embargo cuando se comparó con la
PHA 5 µg/mL no se observaron diferencias significativas (p>0.05) (Figura 7
A y B). La expresión de la IL-1α y del TNF-α mRNA en cultivos tratados con
el EPG 5 µg/mL se incrementó con respecto al control (p<0.05), sin
embargo sólo la expresión de la IL-1α mRNA se incrementó
significativamente con relación a la PHA 5 µg/mL (p<0.05) (Figura 7 A y B y
Tabla 4).
Figura 7. Expresión del gen de la IL-1α y el TNF-α inducida con la F9-PI de L.

mutabilis, ecotipo Patón Grande durante 72 horas. La expresión del gen de la IL-1α
y el TNF-α a nivel transcripcional fue determinada mediante la PCR convencional en
células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas con la F9-PI, EPG,
PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo) durante 72 h. Los productos de la
del gen IL-1α (A) TNF-α (B) fueron normalizados con los niveles de expresión del
GAPDH mRNA. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por
cromatografía de exclusión molecular – pico I, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células
mononucleares de sangre periférica, IL: interleuquina, TNF: factor de necrosis tumoral.
GAPDH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
29
5.5.2 Determinación de la expresión mRNA para citoquinas IL-10 y
TGF-β

expresión génica de la IL-10 durante 24 y 72 horas. La expresión del gen de la IL-
10 a nivel transcripcional fue determinada mediante la PCR convencional en células
mononucleares de sangre periférica humana estimuladas con la F9-PI, EPG, PHA
(control positivo) y medio RPMI (control negativo) durante 24 y 72 h. Los productos de la
del gen de la IL-10 fue normalizado con los niveles de expresión del GAPDH mRNA. A-
B. Expresión de la IL-10 mRNA luego de 24 y 72 h de tratamiento. C. Expresión génica
de la IL-10 estimulada con 5 y 25 μg/mL de la F9-PI. EPG: extracto proteico de Patón
Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I,
PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre periférica, IL:
interleuquina, GAPDH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
30
No se observó la expresión de la IL-10 mRNA en las células
mononucleares tratadas durante 24 h con la fracción, el extracto proteico y
el control (Figura 8A y Tabla 4). La PHA 5 µg/mL indujo la expresión de la
IL-10 mRNA durante 24 y 72 h de incubación (Figura 8A y 8B). A las 72 h
de tratamiento se estimuló la expresión de la IL-10 mRNA con la F9-PI 5
µg/mL sin diferencias estadísticamente significativas con respecto a la PHA
5 µg/mL y el control (p>0.05) (Figura 8B y Tabla 4). No se detectó la
expresión de la IL-10 mRNA luego de 24 y 72 h de tratamiento con el EPG
5 µg/mL (Figura 8A y 8B). Cuando se probó la concentración de la F9-PI 25
μg/mL se observó el incremento de la expresión de la IL-10 mRNA con
diferencias estadísticamente significativas con respecto al control, la F9-PI
5 µg/mL y la PHA 5 µg/mL (p<0.05) (Figura 8C y Tabla 4).
En la Figura 9A se observó la expresión del TGF-β mRNA en células

mononucleares tratadas con la F9-PI, EPG, PHA y el control luego de 24 h
de incubación. Los tratamientos (F9-PI, EPG) y la PHA mostraron
diferencias significativas en la expresión transcripcional del gen cuando se
comparó con el control (p<0.05), sin embargo cuando se relacionó los
tratamientos con la PHA no se observaron diferencias estadísticamente
significativas (p>0.05) (Figura 9A y Tabla 4). La expresión transcripcional
del gen del TGF-β disminuyó luego de 72 h de tratamiento con el extracto,
fracción y la PHA, con respecto al control, sin embargo los tratamientos no
presentaron diferencias significativas en su expresión de la
inmunocitoquina con relación a la PHA (Figura 9B y Tabla 4).
31
expresión génica del TFG-β durante 24 y 72 horas. La expresión del gen del TFG-β a
nivel transcripcional fue determinada mediante la PCR convencional en células
mononucleares de sangre periférica humana estimuladas con F9-PI, EPG, PHA (control
positivo) y medio RPMI (control negativo) durante 24 y 72 h. Los productos de la PCR se
analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %. Cada banda fue
cuantificada por densitometría empleando el programa ImageJ (NIH, USA). A-B.
Expresión de IL-10 mRNA normalizados con los niveles de expresión del GAPDH mRNA.
EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de
exclusión molecular – pico I, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de
sangre periférica, IL: interleuquina, TGF: Factor de crecimiento transformante, GAPDH:
gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
32
5.5.3 Determinación de la expresión mRNA para citoquinas IL-2 e
IFN-γ
No se detectó la expresión de la IL-2 mRNA en los tratamientos

con la fracción, el extracto proteico y el control en ninguno de los tiempos
evaluados. La PHA 5 μg/mL incrementó considerablemente la expresión
del gen de la IL-2 mRNA luego de 24 y 72 h de tratamiento (Figura 10 A y
B y Tabla 4).
Figura 10. Análisis de la expresión génica de la IL-2 en células mononucleares

humana estimulada con la F9-PI de L. mutabilis, ecotipo Patón Grande durante
24 y 72 horas. La expresión del gen de la IL-2 a nivel transcripcional fue determinada
mediante la PCR convencional en células mononucleares de sangre periférica humana
estimuladas con F9-PI, EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo)
durante 24 y 72 h. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel
de agarosa al 1.5 %. Cada banda fue cuantificada por densitometría empleando el
programa ImageJ (NIH, USA). A-B. Expresión de IL-2 mRNA normalizados con los
niveles de expresión de GAPDH mRNA. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI:
fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I, PHA:
Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre periférica, IL:
interleuquina, GAPDH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
33
En la Figura 11 se grafica la expresión del IFN-γ mRNA en células
mononucleares tratadas a concentraciones F9-PI (5 y 25 μg/mL) durante
24 h, pero sin diferencias estadísticamente significativas con respecto al
control (p>0.05) (Figura 11A). La F9-PI (5 y 25 μg/mL) a las 48 h aumentó
significativamente el nivel de expresión del IFN-γ mRNA con relación al
control (p<0.05) (Figura 11B). A las 72 h de incubación la expresión IFN-γ
mRNA disminuyó considerablemente con el tratamiento F9-PI 5 μg/mL
(p>0.05), mientras que con la F9-PI 25 μg/mL se indujo el incrementó de
la expresión transcripcional del gen con respecto al control (p<0.05)
(Figura 11C). En todos los tiempos evaluados las dos concentraciones de
la F9-PI no presentaron resultados estadísticamente significativos con
relación a PHA (p>0.05) (Figura 11 A, B y C y Tabla 4).
El gen de referencia GAPDH fue detectado en CMSPh tratadas y

no tratadas. El gen GAPDH mostró un nivel de expresión constante en
cultivo de CMSPh durante 24, 48 y 72 h.
34
Figura 11. Análisis de la expresión génica del IFN-γ en células mononucleares
humanas inducida con la F9-PI de L. mutabilis, ecotipo Patón Grande durante 24,
48 y 72 horas. La expresión génica del IFN-γ a nivel transcripcional fue determinada
mediante la PCR convencional en células mononucleares de sangre periférica humana
estimuladas con la F9-PI, EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo)
durante 24, 48 y 72 h. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en
gel de agarosa al 1.5 %. Cada banda fue cuantificada por densitometría empleando el
programa ImageJ (NIH, USA). A-C. Expresión de la IL-2 mRNA normalizados con los
niveles de expresión del GAPDH mRNA. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI:
fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I, PHA:
Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre periférica, IFN: interferón,
GAPDH: gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. *p<0.05.
35
Tabla 4. Resultados de la densidad de señal de la expresión de mRNA de
inmunocitoquinas normalizadas con la señal del control (GAPDH mRNA)
mediante el programa ImageJ (NIH, USA)
Inmunofenotipificación de células mononucleares de sangre periférica

mediante Citometría de Flujo
5.6.1 Fenotipificación de poblaciones celulares de la inmunidad innata
En la Figura 12 se evidencia el porcentaje de células NK determinado

por el panel CD3-CD16bright (Figura 12 A-E). El porcentaje de células para
F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5 μg/mL, PHA 5 μg/mL y control correspondieron
a 18.7, 25, 19.6, 21.6 y 18.9 respectivamente. Los porcentajes de células
mononucleares obtenidos mediante el tratamiento con el EPG 5 μg/mL, F9-
PI 25 μg/mL y PHA 5 μg/mL fueron estadísticamente significativos con
relación al control (p<0.05). Además, se observó un mayor porcentaje de
células NK con el tratamiento F9-PI 25 μg/mL con respecto a PHA (p<0.05)
(Figura 12F).
El análisis de las células NKT se realizó del mismo modo que para las
células NK, pero considerando la población de células mononucleares que
presentan los marcadores CD3+CD16dim tanto para los tratamientos como
para los controles (Figura 12 A-E). El porcentaje de células CD3+CD16dim
36
(NKT) para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5 μg/mL, PHA 5 μg/mL y control
fueron 1.01, 1, 0.95, 1.39 y 1.01 respectivamente. La PHA 5 μg/mL presentó
porcentaje de células NKT estadísticamente significativo con relación al
control (p<0.05) (Figura 12G).
Figura 12. Identificación de las poblaciones celulares CD3-CD16bright (NK) y

CD3+CD16dim (NKT) estimulada con la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande.
El porcentaje relativo de células CD3-CD16bright (NK) y CD3+CD16dim (NKT) se determinó
mediante citometría en células mononucleares de sangre periférica humana estimuladas
con F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo)
durante 72 h. A-E: Dot plot representativo de las poblaciones celulares seleccionadas
mediante CD3-CD16bright y CD3+CD16dim a partir de las características de complejidad (side
scatter) y tamaño (forward scatter) y CD45+. F-G Gráfico del porcentaje del fenotipo de
células NK y NKT estimuladas con los tratamientos y controles. EPG: extracto proteico de
Patón Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I,
CD: cluster designation, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre
periférica. Los resultados representan la media y desviación estándar de los experimentos
por triplicado. * p< 0.05.
37
El porcentaje de monocitos para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5
μg/mL, PHA 5 μg/mL y el control fue 21.0, 34.3, 21.3, 25.4 y 22.2
respectivamente (Figura 13 A-E). El tratamiento de las CMSPh con la F9-PI
25 μg/mL y la PHA 5 μg/mL presentaron porcentajes de monocitos
estadísticamente significativos con relación al control (p<0.05). Los cultivos
tratados con la F9-PI 25 μg/mL mostraron diferencias significativas en la
población monocítica con relación a la PHA y el control (p<0.05) (Figura
13F).
Figura 13. Análisis de la línea monocítica CD45+CD4+CD16- estimulada con la F9-

PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande. El porcentaje de monocitos CD4+CD16- se
determinó mediante citometría en células mononucleares de sangre periférica humana
estimuladas con la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control
negativo) durante 72 h. A-E: Dot plot representativo de las poblaciones celulares
seleccionadas mediante CD4+CD16- a partir de las características de complejidad (side
scatter) y tamaño (forward scatter) y CD45+. F. Gráfico del porcentaje del fenotipo de
monocitos estimulados con los tratamientos y controles. EPG: extracto proteico de Patón
Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I, CD:
cluster designation, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre
periférica. Los resultados representan la media y desviación estándar de los experimentos
38
5.6.2 Fenotipificación de poblaciones celulares de la inmunidad
adaptativa
5.6.2.1 Inmunofenotipicación de subpoblaciones de linfocitos T
Las subpoblaciones de células T fueron determinadas considerando

los marcadores CD45, CD3, CD4 y CD8. El porcentaje de las
subpoblaciones de células T se seleccionaron mediante el panel de
marcadores CD4+CD8- (Q1), CD4+CD8+ (Q2), CD4-CD8- (Q3) y CD4-CD8+
(Q4) para los tratamientos y controles (Figura 14 A-E). La población de
células CD4-CD8- presentaron valores porcentuales entre 6.42-6.95 para los
controles y tratamientos. Sin embargo la F9-PI 25 μg/mL presentó un valor
porcentual de 8.9. La células CD4+CD8+ presentaron valores porcentuales
entre 0.46-0.84 para el control negativo y tratamientos, mientras que la PHA
5 μg/mL presentó un valor porcentual de 1.54. La relación entre células
CD4+ y CD8+ mostró un rango entre 1.4-2.2 (Anexo 6). El porcentaje de
células CD4+CD8- para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5 μg/mL, PHA 5 μg/mL
y control fueron 54, 60.8, 60.3, 62, y 60.6 respectivamente, mientras que el
porcentaje de células CD4-CD8+ para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5
μg/mL, PHA 5 μg/mL y control fueron 32.3, 28.2, 32.3, 37.5 y 32.2
respectivamente (Figura 14 A-E). La F9-PI 25 μg/mL no presentó diferencias
significativas en el porcentaje de células CD4+CD8- con relación al control
(p>0.05) (Figura 14F), mientras que la PHA 5 μg/mL mostró diferencias
significativas en el porcentaje de células CD4-CD8+ con respecto al control y
tratamientos (p<0.05) (Figura 14G).
39
Figura 14. Identificación de las poblaciones celulares CD4+CD8-, CD4+CD8+,
CD4-CD8- y CD4-CD8+ estimulada con la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón
Grande. El porcentaje de células CD4+CD8-, CD4+CD8+, CD4-CD8- y CD4-CD8+ se
estimuladas con F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control
seleccionadas mediante CD45+, CD3+, CD4+ y CD8+ a partir de las características de
complejidad (side scatter) y tamaño (forward scatter). F-G Gráfico del porcentaje del
fenotipo de células T CD3+CD4+CD8- y CD3+CD4-CD8+ estimuladas con los tratamientos
y controles. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por
cromatografía de exclusión molecular – pico I, CD: cluster designation, PHA:
Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre periférica, Q1: CD4+CD8-,
Q2: CD4+CD8+, Q3: CD4-CD8-, Q4: CD4-CD8+. Los resultados representan la media y
desviación estándar de los experimentos por triplicado. * p< 0.05.
40
5.6.2.2 Inmunofenotipificación del receptor CD25 en células
mononucleares de sangre periférica humana
Las células mononucleares que presentaron el receptor CD25 fueron

seleccionadas en base al marcador CD3 y CD25. El porcentaje de células
positivas CD25 para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5 μg/mL, PHA 5 μg/mL y
control fueron 5.03, 2.45, 4.6, 52.7 y 6.93 respectivamente (Figura 15 A-E).
El extracto y las fracciones no mostraron diferencias significativas (p>0.05),
mientras que la PHA 5 μg/mL mostró un incremento estadísticamente
significativo cuando se comparó con los tratamientos y el control (p<0.05)
(Figura 15F).
Figura 15. Análisis de los linfocitos CD3+CD25+ estimulados con la F9-PI de L.

mutabilis ecotipo Patón Grande. El porcentaje de linfocitos CD3+CD25+ se determinó
mediante citometría en células mononucleares de sangre periférica humana estimulada con
la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control negativo)
durante 72 h. A-E: Dot plot representativo de las poblaciones celulares seleccionadas
mediante CD3+, CD25+ a partir de las características de complejidad (side scatter) y
tamaño (forward scatter). F. Gráfico del porcentaje del fenotipo de células T CD3+CD25+
estimuladas con los tratamientos y controles. EPG: extracto proteico de Patón Grande, F9-
PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I, CD: cluster
designation, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre periférica,
Los resultados representan la media y desviación estándar de los experimentos por
triplicado. * p< 0.05.
41
5.6.2.3 Inmunofenotipificación de linfocitos CD3-CD19+
El porcentaje de células B se determinó por el panel CD3- y CD19+ tanto

para los tratamientos como los controles (Figura 16 A-E). Los resultados
porcentuales de células B para la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG 5 μg/mL, PHA
5 μg/mL y control fueron 7.29, 13.7, 6.84, 7.54 y 7.48 respectivamente. Las
células B tratadas con la F9-PI 25 μg/mL mostraron diferencias significativas
con respecto al control y la PHA (p<0.05) (Figura 16F).
Figura 16. Análisis inmunofenotípico de las células CD3-CD19+ estimulada con la

F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande. El porcentaje de linfocitos CD3-CD19+ se
estimulada con la F9-PI (5 y 25 μg/mL), EPG, PHA (control positivo) y medio RPMI (control
seleccionadas mediante CD3+, CD19+ a partir de las características de complejidad (side
scatter) y tamaño (forward scatter). F. Gráfico del porcentaje del fenotipo de células B
CD3+CD19+ estimuladas con los tratamientos y controles. EPG: extracto proteico de Patón
Grande, F9-PI: fracción 9 obtenida por cromatografía de exclusión molecular – pico I, CD:
cluster designation, PHA: Fitohemaglutinina, CMSPh: células mononucleares de sangre
periférica, Los resultados representan la media y desviación estándar de los experimentos
42
5.6.3 Conteos totales u absolutos de las poblaciones de células
mononucleares de sangre periférica humana
En la tabla 5 se observó que las CMSPh tratadas con el EPG 5 µg/mL

disminuyeron en el número total (absoluto) de células NKT, CD4+CD8+ y
monocitos, mientras que se observó un incremento no significativo en el
conteo total de linfocitos NK y CD4-CD8- con respecto al control y PHA
(p>0.05). El conteo total se incrementó en células CD4+CD8-, CD4-CD8+ y
LB con respecto a PHA, mientras que se observó una disminución de las
mismas poblaciones cuando se comparó con el control (p>0.05). La fracción
F9-PI 5 µg/mL incrementó el número total de linfocitos CD4-CD8+ y CD4-
CD8-, mientras que disminuyó el conteo total de células NKT y monocitos
con respecto al control y PHA (p>0.05), sin embargo se observó un
incremento de las poblaciones NK, CD4+CD8- y LB en comparación a PHA,
mientras que disminuyó el número total de células NK y B con respecto al
control. Además, no se observaron diferencias en el número total de
linfocitos CD4+CD8- cuando se comparó con el control. La fracción F9-PI 25
µg/mL disminuyó en 50% en el número total de linfocitos NKT y
subpoblaciones T con relación al control y PHA. Sin embargo la población de
monocitos se incrementó tres veces más que el control y PHA (p<0.05). La
población de linfocitos NK y B disminuyeron con relación al control, mientras
que se observó un incremento en el número de los linfocitos B con respecto
a PHA. Cabe resaltar que a pesar que la PHA 5 µg/mL no indujo un efecto
mitogénico sobre las poblaciones celulares, se observó un incremento
significativo en el conteo total de linfocitos CD4+CD8+ con respecto al
control y PHA (p<0.05).
43
Tabla 5. Conteo total o absoluto (células/μL) de poblaciones de células
mononucleares de sangre periférica humana, determinados por análisis de
citometría de flujo
44
6. DISCUSIÓN
En el extracto obtenido de semillas de L. mutabilis Sweet, ecotipo

Patón Grande se demostró la presencia significativa de proteínas y la notoria
disminución del pigmento amarillo, luego del proceso de precipitación y
dializado confirmándose lo referido por Caligari et al. (2000) quien afirma que
de todas las especies de lupino, Lupinus mutabilis es el que posee el mayor
porcentaje de proteínas en sus semillas, siendo las globulinas las principales
macromoléculas de reserva que constituyen el 80-90% del total de proteínas
(Suca & Suca 2015). La presencia del pigmento amarillo se debería a la
presencia de ácidos fenólicos, flavonoides, taninos o carotenoides que
formarían complejos con las proteínas (Martínez et al. 2000; Coloma 2009,
Angarita 2016; Andor et al. 2016) los cuales se mantendrían durante el
proceso de dializado (Figura 1).
En la purificación parcial del extracto proteico por cromatografía de

exclusión molecular en Sephadex G-75 se observó la actividad
hemaglutinante en el Pico I que correspondieron a las fracciones 9, 10, 11,
12 y 13 eluídas con buffer HEPESNaCaMn pH 6.8, mientras que los picos II
y III no presentaron actividad hemaglutinante (Figura 2A). Duranti et al.
(1995) identificaron la glicoproteína γ-conglutina en Lupinus albus con
actividad de lectina. Falcon et al. (2000a) reportaron la actividad
hemaglutinante del extracto de semillas maduras de tres especies de
lupinos: L. albus, L. angustifolius y L. mutabilis. Sin embargo, en la
purificación por cromatografía de afinidad realizada por los mismos autores
en semillas maduras de L. albus no encontraron actividad hemaglutinante. A
pesar de estos resultados el SDS-PAGE, la filtración en gel y la estructura
secundaria por dicroismo circular demostraron un espectro similar a la γ-
conglutina (Falcon et al 2000b). Recientemente se ha determinado para la
lectina semipurificada y purificada de L. mutabilis la actividad hemaglutinante
que corresponde por las características físicas y químicas a la γ-conglutina
(Rodriguez 2017); resultados que concuerdan con los obtenidos en este
estudio.
45
Para la realización de la expresión génica e inmunofenotipificación
escogimos la F9-PI debido a que presentaba la mayor actividad
hemaglutinante, una banda de aproximadamente 42 KDa (correspondiente a
la γ-conglutina) y, por la escasa y débil presencia de otras bandas de
proteínas (Figura 2B). Ribeiro et al. (2014) identificaron en semillas de L.
albus por SDS-PAGE no denaturante y otras técnicas una lectina de 42 KDa
correspondiente a la γ-conglutina con actividad hemaglutinante.
Las células mononucleares de sangre periférica humana (CMSPh) se

consideran a menudo el estándar para investigar muchos aspectos de la
respuesta inmunológica en un sistema de cultivo celular. Como una
población mixta de linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales (NK),
monocitos, macrófagos y células dendríticas, las CMSP representan células
clave implicadas en la expresión génica de citoquinas que conducen a
respuestas inmunes innatas, adaptativas e inflamatorias (Denzler et al.
2010).
Algunas lectinas de plantas muestran efectos inmunomoduladores,

tales como la actividad mitogénica y la inducción de respuestas por Th1, Th2
o Th17. El paso esencial para el inicio de la actividad inmunomoduladora de
las lectinas es la unión a glicanos en la superficie celular y la inducción de la
respuesta inmune por medio de mediadores como los segundos
mensajeros, incremento del nivel de Ca+2, producción de citoquinas
específicas, unión a receptores, inicio de cascadas por unión al TCR entre
otros mecanismos (Chilson & Kelly-Chilson 1989; Ashraf & Khan 2003;
Majee & Biswas 2013). Del mismo modo, algunas lectinas pueden actuar
como superantígenos (Licastro et al. 1993; Saul et al. 2000) o tener efectos
apoptóticos indirectos a través de la inducción de citoquinas (Pierson &
Liston 2010).
La IL-1α es una potente citoquina proinflamatoria y pleiotrópica que es

secretada por monocitos, macrófagos, células dendríticas, células B,
fibroblastos, neutrófilos, células epiteliales entre otras. Esta citoquina
estimula la expresión de genes de otras citoquinas inflamatorias, factores de
46
crecimiento de linfocitos, factores estimuladores de colonias y
mesenquimales (Velez et al. 2004; Fettelschoss et al. 2011). El TNF-α es
una citoquina pluripotencial proinflamatoria que regula una diversidad de
respuestas celulares y es producida en primer lugar por monocitos y
macrófagos (Esposito & Cuzzocrea 2009). El TNF-α tiene la capacidad de
inducir la expresión de otras citoquinas proinflamatorias como la IL-1 y
algunas quimioquinas. Además, se ha determinado que la señalización para
TNF-α son mediadas por otras citoquinas proinflamatorias como IL-1
(Probert et al.1995).
En este estudio el tratamiento de la CMSPh con el EPG 5 μg/mL y la

F9-PI 5 μg/mL, incrementó la expresión de la IL-1α y el TNF-α mRNA a las
24 y 72 h de incubación con respecto al control (p<0.05). A las 24 h de
incubación el EPG y la F9-PI incrementó la expresión del TNF-α, mientras
que la expresión de la IL-1α no mostró diferencias significativas con relación
a PHA (p<0.05) (Figura 6 A y B). A las 72 h el EPG 5 μg/mL incrementó
significativamente la expresión de la IL-1α con respecto a la PHA (Figura
7A). Con relación a la expresión de TNF-α mRNA no se observó diferencias
estadísticamente significativas en cultivos tratados con el EPG y la F9-PI 5
μg/mL en relación a la PHA (Figura 7B). La F9-PI 5 μg/mL mostró una
disminución en la expresión génica de la IL-1α y el TNF-α con respecto a la
PHA (p>0.05).
Se ha demostrado que las lectinas tiene la capacidad de inducir y

regular la expresión de citoquinas in vitro e in vivo (Ooi et al. 2002; De Melo
et al 2011; De Oliveira et al. 2013). En 1991 Mämmel et al. determinaron en
cultivos de monocitos de sangre periférica humana tratados durante 2 h con
10 μg/mL de la lectina de Viscum album (MLI), la misma expresión del TNF-
α mRNA que en monocitos activados con 100 U IFN-γ. Además encontraron
que macrófagos peritoneales de ratón estimulados con MLI inducen la
expresión del TNF-α mRNA. Hostanska et al. (1995) encontraron en células
mononucleares de sangre periférica humana tratadas durante 24 h con
concentraciones de ML-I (1-10 ng/mL) la expresión de la IL-1α, IL-1β, IL-6,
TNF-α, IFN-γ, GM-CSF e IL-10 mRNA; mientras que no fue detectada la
47
expresión de la IL-2 e IL-5. Sin embargo a concentraciones de 1 ng/mL ML-I
solo se observó la expresión de IL-10, sin detectar la expresión de la IL-2 e
IFN-γ. Fan et al. (1998) encontraron el máximo nivel de expresión de la IL-2,
IL-6, IL-10, TNF-α e IFN-γ mRNA en CMSPh estimulados con 5 μg/mL PHA
entre 4-24 h de incubación. Lyu & Park (2007) determinaron en cultivos de
linfocitos T humanos tratados con 25 pg/mL de la aglutinina de Viscum
álbum L. var. coloratum (VCA) durante 8 h, la expresión de citoquinas
proinflamatorias como la IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-8 y IFN-γ. Además observaron
que la incubación de células T durante 2 h con 1.5 ng/mL VCA no permitió la
detección de la IL-1α e IL-6 mRNA.
Aunque muchos autores concuerdan en que el tiempo de incubación y

la concentración de la lectina juegan un rol importante en la inducción de la
expresión génica de citoquinas, es necesario tener en cuenta que existen
diferencias dependiendo del individuo evaluado (Fan et al. 1998).
La IL-10 es una potente citoquina inmunorreguladora involucrada

tanto en la respuesta inmune como la inflamación y es producida por células
Th2, células Tr1, células Th1, células Th17, células T CD8+, monocitos-
macrófagos estimulados y subpoblaciones de células dendríticas, células B,
eosinófilos, mastocitos entre otros (Mosser & Zhang 2008). Sus principales
funciones son limitar y terminar la respuesta inflamatoria, bloquear la
secreción de citoquinas proinflamatorias (IL-1, TNF-α, IL-6, IL-12) así como
quimioquinas inflamatorias (tipos CC y CXC), inhibe la síntesis de citoquinas
Th2 (IL-4 e IL-5) y regula la diferenciación y proliferación de las células T,
células B, células NK, células presentadoras de antígeno, mastocitos y
granulocitos (Li et al. 2004; Belisario et al. 2017).
Con relación a la IL-10 no se demostró su expresión en los cultivos

luego de 24 h de incubación con las concentraciones del EPG 5 μg/mL y la
F9-PI 5 μg/mL (Figura 8A). A las 72 h de incubación se determinó la
expresión de la inmunocitoquina en cultivos tratados con la F9-PI 5 μg/mL
sin diferencia estadísticamente significativas con respecto a la PHA (p>0.05)
(Figura 8B). Debido a estos resultados se optó por incrementar la
48
concentración de la fracción a 25 μg/mL encontrándose un aumento
significativo cuando se comparó con el control y la PHA 5 μg/mL (p>0.05)
(Figura 8C).
Aunque la mayoría de los tipos celulares tanto de la inmunidad natural

como adaptativa son capaces de expresar la IL-10 en varios grados, los
productores clave son las células T reguladoras (Treg) Foxp3 +. La IL-10
presenta funciones opuestas, por un lado promueve su propia producción,
así como la función de las células Treg, iniciando un ciclo de
retroalimentación positiva y por otro aumentaría la apoptosis de células T
doble negativas (DN) (Pierson & Liston 2010).
El TGF-β es una citoquina inmunorreguladora producida por amplio

rango de células que incluyen macrófagos, células NK, células T y células B.
Esta citoquina es un importante regulador de la inflamación ya que posee
propiedades proinflamatorias y anti-inflamatorias dependiendo de su
concentración; a bajas concentraciones tiene propiedades proinflamatorias y
recluta monocitos, células T y neutrófilos al lugar de inflamación durante una
infección, mientras que a altas concentraciones presenta actividad
antiinflamatoria, suprimiendo el TNF-α y el óxido nítrico en macrófagos,
inhibe la producción del IFN-γ y el TNF-α en células NK e indirectamente
disminuye la expresión MHC clase II (López & Ramos 2008).
En el caso de la expresión del TGF-β mRNA en células

mononucleares tratadas con el extracto y la fracción durante 24 h no se
observó diferencias significativas con respecto a la PHA (p>0.05), sin
embargo su expresión presentó resultados significativos con respecto al
control (p<0.05) (Figura 9A), mientras que a las 72 h de tratamiento la
expresión no mostró diferencias significativas con relación al control y PHA
(Figura 9B).
El TGF-β ha sido identificado como un inductor de células productoras

de IL-17 en condiciones inflamatorias (Weaver et al. 2006) y bajo
condiciones de cultivo en combinación con la IL-6 promueve la diferenciación
49
de Th17 (Wan & Flavell 2007), pero inhibe la diferenciación de células Treg
(Kimura & Kashimoto 2010). En este estudio encontramos la expresión de la
IL-6 luego de 24 de tratamiento con la fracción (datos no mostrados) lo que
llevaría a pensar que podría inducirse la diferenciación de células Th17. Sin
embargo, se observó luego de 72 h un incremento de la expresión de IL-10 a
concentraciones de la fracción de 25 μg/mL, que unido a la presencia del
TGF-β induciría un patrón de células T reguladoras. Los resultados
obtenidos concuerdan con los de Peron (2015) quien encontró en células
esplénicas de ratón tratadas con 37 ng de la lectina de Tabernaemontana
hystrix un aumento de la expresión del TGF-β. Sin embargo al incrementar la
concentración de la lectina no observaron diferencias estadísticamente
significativas en la expresión del TNF-α, IL-10 e IL-6 mRNA luego de 72 h de
incubación.
En este estudio la expresión de la IL-2 mRNA en cultivos tratados con

el extracto y la fracción luego de 24 y 72 horas fue negativa (Figura 10).
Con relación al IFN-γ, se observó que el tratamiento de las células con

5 μg/mL del extracto proteico no induce la expresión de mensajeros de RNA
(datos no mostrados). Sin embargo, cuando se evaluó la fracción a
concentraciones de 5 y 25 μg/mL durante 24, 48 y 72 h se observó la
expresión génica de IFN-γ sin diferencias estadísticamente significativas con
respecto a PHA (p>0.05) (Figura 11 A, B y C). Sin embargo, a las 48 y 72 h
se observaron diferencias significativas en su expresión con relación al
control (p<0.05) (Figura 11 B y C). El IFN-γ es sintetizado por linfocitos
Th1CD4+, linfocitos citotóxicos CD8+, células NK, células B, células NKT y
células presentadoras de antígeno (CPA). La secreción de IFN-γ por células
NK y CPA es importante en estadios iniciales de la infección, mientras que
su producción por linfocitos T es importante en la respuesta inmune
adaptativa (Razaghia et al. 2016).
Los resultados obtenidos mediante citometría de flujo demostraron

que el tratamiento de las CMSPh con la concentración de la fracción F9-PI
25 μg/mL disminuyó la población de linfocitos FSC SSC con relación a los
50
controles y los tratamientos (EPG 5 μg/mL y F9-PI 5 μg/mL) (Anexo 6). Esto
se debería a un probable efecto apoptótico lo que influiría sobre el
incremento de los porcentajes relativos de las poblaciones celulares. Cabe
destacar que se ha determinado que bajas concentraciones de las lectinas y
cortos tiempos de incubación producen efectos mitogénicos, mientras que
mayores concentraciones y tiempos más prolongados de incubación inducen
la muerte celular (Benoist et al. 2009). A pesar de este efecto, en cultivos
tratados con la F9-PI 5 μg/mL, no se observó un incremento significativo en
el porcentaje de células de la inmunidad innata y adaptativa con relación al
control y PHA (p>0.05), mientras que el tratamiento con F9-PI 25 μg/mL
demostró un aumento significativo del porcentaje de linfocitos CD3-
CD16bright, CD4+CD8-, CD4-CD8-, CD3-CD19+ y monocitos CD45+CD4+
con respecto al control y PHA (p<0.05) (Figura 12, 13, 14 , 16 y Anexo 6). Se
ha observado que la lectina Morniga M (Morus nigra) y artocarpina
(Artocarpus integrifolia) activan linfocitos T y NK en estudios in vitro con
CMSPh, mientras que la artocarpina activa algunas células B (CD19+).
Además, Morniga M facilita la selección de linfocitos CD4+CD8+ (Benoist et
al. 2009). Es probable como en el caso de la ConA que el entrecruzamiento
con el TCR produzca la activación de vías de señalización de sobrevivencia
en células CD4+CD8+ (Pongracz et al. 2003).
Las CMSPh tratadas con el extracto y la fracción no presentaron

diferencias significativas en las células NKT con relación al control y PHA
(p>0.05). Miyagi et al. (2014) demostraron que bajas dosis de ConA induce
la activación de células NK y NKT. Los tratamientos con el EPG 5 μg/mL no
mostraron diferencias en los porcentajes de las poblaciones estudiadas en
comparación al control. Sin embargo, cuando se comparó el tratamiento
EPG 5 μg/mL con la PHA se observó una disminución en el porcentaje de
linfocitos CD4+CD8+, CD4-CD8+, CD4-CD8-, CD3-CD19+, CD3+-CD16bright
(NK), CD3-CD16dim (NKT) y monocitos CD45+CD4+. La PHA 5μg/mL
presentó poco incremento en el porcentaje de poblaciones de linfocitos,
CD4+CD8+, CD4-CD8+, CD4-CD8-, CD3-CD19+, CD3+-CD16bright (NK),
CD3-CD16dim (NKT) y monocitos CD45+CD4+ con respecto al control
(Anexo 6).
51
El origen de las células T doble positivos (DP) CD4+CD8+ periféricas
no está bien definido. Las células T CD4+CD8+ han sido identificados en
sangre periférica humana y representan el 1-3 % del total de linfocitos T
(Giraldo et al. 2011). Estas células constituirían timocitos DP que han
escapado prematuramente del timo denominado “teoría del escape del timo”
o células T simple positivo que expresan un “segundo marcador” como
consecuencia de una sobreestimulación antigénica (Jiménez et al. 2002;
Giraldo et al. 2011). Las células T doble negativas (DN) CD4-CD8-
comprenden el 1-3% de las células T periféricas y han sido identificadas por
sus funciones regulatorias (Treg DN) y efectos inflamatorios asociados con
enfermedades autoinmunes. Estas células originadas en el timo escapan de
la selección negativa y migran a la periferia donde se expanden luego del
contacto antigénico (D´Acquisto & Crompton 2010; Ji et al 2016). Crispin &
Tsokos (2009) han determinado que las células T (CD4-CD8-) derivarían de
células T CD8 estimuladas, adquiriendo una distintiva producción de
citoquinas proinflamatorias (IL-1 e IL-10). Del mismo que De Amat (2015)
quien trabajó con una fracción del extracto de lectinas de L. mutabilis ecotipo
Patón Grande no hemos encontrado diferencias significativas con relación al
porcentaje de linfocitos CD4+CD8- y CD4-CD8+ con el EPG 5 μg/mL y la
F9-PI 5 μg/mL con respecto al control (Anexo 6).
En el caso del receptor CD3+CD25+ se observó un incremento

estadísticamente significativo en el tratamiento con PHA 5 μg/mL (p<0.05),
mientras que el EPG 5 μg/mL y las fracciones F9-PI (5 y 25 μg/mL) no
mostraron diferencias significativas con respecto al control (p>0.05) (Figura
15). Se ha determinado que CMSPh estimulados con jacalin no inducen la
expresión de IL-2 mRNA, sin embargo expresan CD25 lo cual sería
simplemente consecuencia de la activación de las células T ocasionada por
los altos niveles de IL-6 e IFN-γ (Blasco et al. 1995). Por otro lado, de Amat
(2015) determinó que el tratamiento de CMSPh con concentraciones de el
EPG 1, 5, 10, 20 y 50 μg/mL estimula la expresión del receptor CD25 y la
formación de rosetas en cultivos de células mononucleares; siendo la menor
concentración la que indujo la mayor expresión en 43.7%; resultados que
52
difieren de los obtenidos en este estudio, probablemente debido a un mayor
tiempo de incubación con el extracto proteico.
El TGF-β inhibe la sobrerregulación de CD25 inducida por IL-2 (Kehrl

et al. 1986). Los estudios indican que en el inicio de la respuesta inflamatoria
el TGF-β incrementa el reclutamiento de células vírgenes y durante el curso
de la reacción promueve la expansión celular y la generación de células
memoria; sin embargo una vez que el estímulo inicial ha sido eliminado y la
producción local de IL-2 cesa promovería la eliminación de células pos
activadas (Sillett et al. 2001).
Se ha observado que la aglutinina de Viscum album (VCA) inhibe la

proliferación de CMSPh y linfocitos T humanos estimulados con anticuerpos
anti-CD3/CD28 a elevadas concentraciones por inducción de apoptosis (Lyu
et al. 2007).
El número total de células (valor absoluto) obtenidos por citometría de

flujo tratadas con el EPG 5 μg/mL no presentaron diferencias significativas
en el número total de linfocitos células CD3-CD16bright (NK), CD3+CD16dim
(NKT), linfocitos CD4+CD8+, CD4-CD8-, linfocitos CD3-CD19+ y monocitos
CD45+CD4+ con respecto a los controles (p>0.05), sin embargo se observó
un incremento en el número de linfocitos CD4+CD8- y CD4-CD8+ cuando se
relacionó con la PHA. En el caso de la fracción F9-PI 5μg/mL se observó un
incremento del número total de linfocitos NK, CD4+CD8-, CD4-CD8+, CD4-
CD8- y LB con respecto a PHA, pero con una disminución en la población de
NKT y monocitos con respecto al control (p>0.05). Cuando la concentración
de la fracción se incrementó F9-PI 25 μg/mL todas las poblaciones
disminuyeron con excepción de los monocitos quienes se incrementaron
significativamente con respecto al control y PHA (p<0.05) (Tabla 5). La PHA
5 μg/mL indujo el incrementó significativo del número de linfocitos
CD4+CD8+ (20.3 células/μL) en comparación al control (p<0.05), mientras
que se observó un aumento no significativo en el número total de monocitos
CD45+CD4+ y linfocitos CD3+CD16dim (NKT) con respecto al control
53
(p>0.05) (Tabla 5). Se ha determinado que la PHA induce la expresión de
CD4 en células T CD8 y la expresión de CD8 en células T CD4 (Sullivan et
al. 2001).
El tratamiento de CMSPh con la F9-PI 25 μg/mL incrementó

significativamente el porcentaje y número total de monocitos
(CD45+CD4+CD16-) (Tabla 4 y Anexo 6). Al respecto, Guzmán et al. (2013)
determinaron en CMSPh una mayor afinidad de la lectina de Olneya tesota
(IF2) sobre monocitos que en linfocitos T y B. Zhen et al. (2014) demostraron
que la activación de la molécula CD4 en monocitos humanos al interaccionar
con MHC II promueve la expresión de citoquinas proinflamatorias y su
diferenciación en macrófagos. Además, se ha determinado que la
combinación de la IL-4/IL-10/TGF-β induce el fenotipo inmunosupresor de
macrófagos M2 que se caracterizan por una elevada producción de IL-10 y
un descenso en la expresión del TNF-α, IL-6, CD86, CD274 y MHC II (Mia et
al. 2014).
En su conjunto, cuando se relaciona el ligando glucídico de la lectina,

su efecto en la expresión génica y los porcentajes y/o recuento total de las
poblaciones de CMSPh se puede inferir de acuerdo a los resultados que el
tratamiento de las células mononucleares con la lectina contenida en el
extracto proteico y la fracción podría interaccionar con una estructura del
receptor que contiene D-galactosa de los monocitos/macrófagos (Mämmel et
al. 1991). Es importante considerar que Rodriguez (2017) determinó el
efecto inhibitorio de la galactosa y melibiosa sobre la capacidad
hemaglutinante de la lectina en el EPG y la fracción de L. mutabilis. Además,
la afinidad de la galactosa se corroboró debido a la actividad hemaglutinante
de la lectina sobre eritrocitos de conejo que exponen este monosacárido en
sus membranas (Yamakahua 2005). El análisis por citometría y la expresión
génica en CMSPh tratadas con el EPG 5 μg/mL a las 72 h de incubación
indujo la expresión del gen IL-1α con relación a los controles, mientras que
incrementó y disminuyó la expresión del TNF-α mRNA con respecto al
54
control y la PHA respectivamente. Además, mostró mayor número total de
linfocitos NK y CD4-CD8- con respecto a los controles.
En el caso de F9-PI 5 μg/mL se observó una disminución en la

expresión del gen IL-1α, TNF-α, TGF-β, IL-10 e IFN-γ con respecto a la PHA,
sin embargo mostró un incremento en la expresión de IL-1α y TNF-α cuando
se comparó con el control. Además, el tratamiento a la misma concentración
aumentó el recuento total de células NK, CD4+CD8-, CD4-CD8+, CD4-CD8-
y LB con relación a la PHA (Tabla 5). Por otro lado, cuando se incrementó la
concentración de la fracción a 25 μg/mL se observó una elevada expresión
del gen IL-10. En este estudio no se realizaron pruebas con esta
concentración para determinar la expresión génica de la IL-1α, TNF-α y
TGF-β. Sin embargo, fue la concentración donde se observó un incremento
en el porcentaje de las poblaciones de NK, CD4+CD8-, CD4-CD8-, LB, y
monocitos, mientras que el conteo total de células indicó un mayor número
de LB con relación a la PHA (p>0.05) y un aumento significativo de
monocitos con respecto a la PHA y el control (p<0.05) (Tabla 5).
Es preciso indicar que la PHA 5 μg/mL incrementó significativamente

la expresión de la IL-1α, TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-10, TGF-β. Además, se
observó un incremento significativo en el número total de CD4+CD8+ con
relación al control. Mueller & Anderer (1990) determinaron que una fracción
parcialmente purificada de Viscum album activa células NK pero cuando se
preincuba con CMSPh activa únicamente a monocitos/macrófagos. Además,
demostraron que la falta de activación de las células NK en CMSPh tratadas
con la fracción se relacionó con un incremento de la prostaglandina E2
(PGE2) generados por monocitos/macrófagos en asociación con la
producción de IFN-γ o por efectos sinérgicos con la IL-1 y el TNF-α. Se ha
determinado que la lectina jacalin especifica de galactosa puede interactuar
con el CD45 en células T incrementando la señalización por TCR y
regulando positivamente los umbrales de activación de las células T y la
secreción de citoquinas Th1/Th2 (Baba et al. 2007).
55
Los monocitos humanos se dividen en tres tipos: monocitos clásicos
(CD14++CD16-), monocitos intermedios (CD14++CD16+) y monocitos no
clásicos (CD14+CD16++) (Ziegler-Heitbrock et al. 2010). El fenotipo
CD14+CD16- representa el 80-90% del total de monocitos sanguíneos y
produce la IL-10 en lugar del TNF y la IL-1 en respuesta a LPS in vitro
(Auffray et al. 2009) Los monocitos son células que circulan en la sangre,
médula ósea y bazo y, no proliferan en un estado estacionario (steady state)
(Geissmann et al. 2010). Sin embargo, existen evidencias de la proliferación
de monocitos luego de la inducción del CD137 (Langstein et al. 1999),
estimulación in vitro con Factor estimulante de colonias macrófagos (M-CSF)
y CSF-1 (Clanchy et al. 2006; Lari et al. 2009), ligando Flt3 (FL, citoquina
hematopoyética) (Kim et al. 2015) e insulina (Naderi 2015).
Debido a la proliferación de los monocitos humanos y al incremento

transcripcional del gen de la IL-10, a partir de los resultados obtenidos en el
presente estudio se postulan las siguientes hipótesis:
(1) Sobre la expresión génica transcripcional y proliferación de

monocitos. Se conoce que la lectina de la F9-PI (γ-conglutina) mimetiza a la
insulina en su interacción por el IR fosforilando y activando quinasas
intracelulares comunes a la cascada de señalización de la insulina (Terruzi
et al. 2011). Además, se ha comprobado que la insulina presenta actividad
proliferativa sobre monocitos (Naderi 2015). Por tanto, la F9-PI (γ-conglutina)
podría unirse al IGF-1R y activar vías de señalización intracelulares que
producirían un efecto proliferativo de los monocitos y la expresión génica de
citoquinas (Figura 17).
(2) Sobre la interacción de la F9-PI (γ-conglutina) con el receptor
CD45 de monocitos clásicos, y el receptor IGF-1R. El receptor CD45 de
los monocitos tiene galactosa en su estructura que le confiere afinidad por la
F9-PI (γ-conglutina) cuyo ligando también es galactosa (Rodriguez 2017);
por tanto el CD45 interaccionaría con la lectina (γ-conglutina); esta relación
se ha observado con otras lectinas (Mämmel et al. 1999; Baba et al. 2007).
La γ-conglutina captada mediante el CD45 tanto de monocitos clásicos
(CD14++CD16-), monocitos intermedios (CD14++CD16+) y monocitos no
56
clásicos (CD14+CD16++) activaría la expresión transcripcional de diversas
citoquinas.
La lectina F9-PI (γ-conglutina) también podría ligarse al receptor IGF-
1R transduciendo señales que conllevan principalmente a la proliferación de
los monocitos clásicos (80-90% del total de monocitos) e incrementando la
expresión transcripcional del gen IL-10. Los monocitos no clásicos también
podrían contribuir con el incremento de la expresión génica de la IL-10
(Wong et al. 2015). El IFN-γ producido por los linfocitos NK, NKT, LTh y LTc;
unido a la IL-10 producida por los monocitos clásicos y no clásicos regularía
de manera negativa la expresión de IL-1α y TNF-α generada por los
monocitos intermedios (Auffray et al. 2009). Esta citoquina (IL-10) activaría
células reguladoras (Treg y Breg) incrementando la transcripción (mRNA)
para IL-10 y TGF-β, citoquinas que inciden sobre la población de LB
inhibiendo su proliferación y el cambio de clase (Rosser & Mauri 2015;
Sanjabi et al. 2017). Además, la IL-10 influiría en los efectos anti-apoptóticos
(Eslick et al. 2004) (Figura 18).
Es conocido que la IL-10 se produce a las 24-48 h después de la

activación de los linfocitos y que la síntesis generada de esta citoquina por
los monocitos se incrementa por el TNF-α y la IL-1 (Parry et al. 1997). De
Wall et al. (1993) demostraron un efecto directo de la IL-10 en la
proliferación de las células T CD4+ de sangre periférica humana en ausencia
de CPA. La interacción de la IL-10/IL-10R en las células T interfiere con la
producción de IL-2 pero no interfiere en la expresión de IL-4, IL-5, IFN-γ y
GM-CSF. Se ha demostrado que la IL-10 afecta de manera indirecta la
proliferación de las células T a través de la inhibición de las funciones
coestimulatorias de las CPA (Groux et al. 1998). Los estudios sobre el efecto
de la IL-10 en la producción de citoquinas son variables. Eder (2000)
demostró la capacidad de la IL-10 de bloquear la proliferación activada por
PHA y la producción de IL-2, IFN-γ o TNF-α en CMSP en comparación a la
IL-4 y TGF-β. Las células CD8+ son más sensibles que las células CD4+ a
la inhibición inducida por IL-10 (Nishijima et al. 1994).
57
El pleiotropismo (capacidad para actuar en diferentes tipos de células)
de las citoquinas sobre la inmunidad innata y adaptativa, aunque permite
diversas actividades, produce numerosos efectos secundarios que limitan su
uso terapéutico (Souza et al. 2013). Al parecer la inducción de varias
citoquinas indicaría el carácter pleiotrópico de la lectina de L. mutabilis al
activar una variedad de células del sistema inmune con la capacidad de
equilibrar los efectos pro y antiinflamatorios.
Si bien la expresión de un número limitado de citoquinas no permite

proporcionar una compresión amplia y completa del efecto de la lectina sobre
las CMSPh; el estudio realizado proporciona nuevas luces para la búsqueda
de las ventajas y desventajas del uso de esta lectina.
58
Figura 17. Interacciones hipotéticas de la F9-PI 25 μg/mL de L. mutabilis con
el IGF-1R y su efecto sobre la expresión génica transcripcional de citoquinas
y la proliferación celular. Del mismo modo que la insulina se une a los
receptores IR/IGF-1R y activa las vías de señalización involucradas en la
proliferación celular, la lectina F9-PI (γ-conglutina) que mimetiza a la
insulina, podría unirse al receptor del factor de crecimiento de la insulina tipo
I (IGF-1R) y activar la fosforilación/activación de quinasas intracelulares
comunes a la cascada de señalización de la insulina que permitirían la
proliferación celular, activación y expresión de citoquinas. ISR: sustrato
receptor de la insulina, PI3K: fosfoinositol 3 kinasa, AKT: proteína kinasa B,
MAPK: protein kinasas activadas por mitógenos.
59
Figura 18. Efecto hipotético de la interacción de la F9-PI 25 μg/mL de L.
mutabilis sobre la proliferación de monocitos clásicos de sangre periférica.
La F9-PI (γ-conglutina) con afinidad por galactosa presente en el receptor
CD45 de monocitos clásicos (CD14++CD16-), monocitos intermedios
(CD14++CD16+) y monocitos no clásicos (CD14+CD16++) podría activar la
expresión transcripcional de citoquinas. La F9-PI también podría ligarse con
el IGF-1R produciendo principalmente la proliferación de los monocitos
clásicos e incrementando la expresión transcripcional del gen IL-10. El IFN-γ
producido por los linfocitos NK, NKT, LTh y LTc unido a la IL-10 regularía de
manera negativa la expresión de la IL-1α y el TNF-α producido por los
monocitos intermedios. La IL-10 activaría células reguladoras (Treg y Breg)
productoras de IL-10 y TGF-β inhibiendo la proliferación de LB. Además, la
IL-10 produciría efectos anti-apoptóticos.
60
7. CONCLUSIONES
7.1 El extracto proteico de L. mutabilis estimula la expresión transcripcional

de IL-1α y TNF-α.
7.2 La lectina semipurificada F9-PI (γ-conglutina) a la concentración de 5

μg/mL estimula el aumento de la expresión transcripcional del gen de IL-
1α y TNF-α, mientras que a la concentración de 25 μg/mL incrementa
significativamente la expresión de IL-10.
7.3 El extracto proteico y la lectina de la F9-PI (γ-conglutina) a la

concentración de 5 μg/mL no producen el incremento del porcentaje y
número total de linfocitos y monocitos.
7.4 La lectina semipurificada F9-PI a la concentración 25 μg/mL ocasiona el

incremento significativo del porcentaje y número total de monocitos
clásicos CD4+CD16- in vitro.
61
8. RECOMENDACIONES
8.1 Evaluar a la concentración de 25 μg/mL sobre la expresión génica de la

IL-1α, el TNF-α y el TGF-β.
8.2 Determinar el efecto citotóxico de la fracción a la concentración de 25

μg/mL mediante ensayos de apoptosis.
8.3 Evaluar la secreción de citoquinas pro y antinflamatorias a través de

ensayos de ELISA con el fin de compararlos con la expresión génica.
8.4 Realizar el marcaje de la lectina con compuestos fluorescentes y ampliar

el panel de anticuerpos anti-CD con el objetivo de definir la diferencia de
afinidad de la lectina sobre las poblaciones celulares.
8.5 Evaluar la lectina sobre la población de monocitos de sangre periférica o

líneas celulares monocíticas de origen humano.
62
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Journal of Virology, 88(17), 9934–9946.
http://doi.org/10.1128/JVI.00616-14.
160. Zhu, Y., & Sang, S. (2017). Phytochemicals in whole grain

wheat and their health-promoting effects. Molecular Nutrition Food
Research, 61(7), 1-23. doi: 10.1002/mnfr.201600852.
82
10. ANEXOS
ANEXO 1. Soluciones para extracción de lectinas

Solución salina de extracción
Cloruro de sodio (0.15 M). ……………………………………………………….. 8.766 g
Cloruro de calcio (20 mM)………….……………………………………………… 2.94 g
Cloruro de manganeso (20 mM)………………………………………………….. 3.96 g
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………… 1L
Disolver todos los componentes. Almacenar a T° ambiente.
ANEXO 2. Tampón para purificación parcial de lectina
Tampón HEPES (HEPES NaMnCa) para cromatografía de exclusión

HEPES (10 mM)…………………………………………………………………….. 2.383 g
Cloruro de sodio (0.15 M)………………………………………………………..… 8.766 g
Cloruro de calcio (2 mM) …………………………………………………………... 0.294 g
Cloruro de manganeso (2 mM) …………………………………………………….. 0.396 g
Agua destilada c.s.p. ………………………………………………………………… 1 L
Disolver todos los componentes con excepción del MnCl2. Ajustar a pH 6.8 con KOH 2 N y
posteriormente agregar el MnCl2. Almacenar a T° ambiente.
ANEXO 3. Reactivos para electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Solución acrilamida – bisacrilamida 30:0.8%

Tampón de gel concentrador SDS-PAGE
Tris base (0.25M)……………………………………………………………… ……... 0.75 g
SDS (0.2%)…………………………………………………………………………… 0.05 g
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………….. 25 mL
Disolver todos los componentes. Ajustar pH a 6.8 con ácido clorhídrico 1N.
Tampón de gel de resolución SDS-PAGE

Tris base (0.75 M)………………………………………………………………… 2.268 g
SDS (0.2%)………………………………………………………………………… 0.05 g
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………. 25 mL
Disolver todos los componentes. Ajustar pH a 8.8 con ácido clorhídrico 1N.
Tampón de muestra SDS-PAGE (3X) no reductor

Tampón de gel concentrador……………………………………………………. 0.5 mL
SDS………………………………………………………………………………… 0.04 g
Glicerol…………………………………………………………………………….. 0.2 mL
Azul de bromofenol 1%.................................................................................. 2 gotas
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………. 2 mL
Agregar los componentes a un microtubo, homogeneizar y almacenar a -20°C.
Tampón de corrida SDS-PAGE (1X)

Tris base……………………………………………………………………………… 3g
Glicina………………………………………………………………………………… 14.4g
SDS…………………………………………………………………………………… 1g
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………… 1L
Disolver todos los componentes. Almacenar a T° ambiente.
Gel de resolución 10% SDS-PAGE
83
Acrilamida – bisacrilamida 30:0.8%.................................................................. 2.24 mL
Tampón de gel de resolución SDS-PAGE……………………………………….. 3.36 mL
Agua destilada………………………………………………………………………. 1.12 mL
TEMED………………………………………………………………………………. 7 μL
Persulfato de amonio (APS) 10%..................................................................... 33 μL
Volumen total 6.76 mL. Mezclar los componentes, agregar el APS al final y cargar la cámara
rápidamente.
Gel concentrador 6%
Acrilamida – bisacrilamida 30:0.8%.................................................................. 0.3 mL
Tampón de gel concentrador SDS-PAGE……………………………………….. 0.8 mL
Agua destilada………………………………………………………………………. 0.4 mL
TEMED (N, N, N´, N. tetrametiletilendiamina)…………………………………… 5 μL
Persulfato de amonio (APS) 10%…………………………………………………. 10 μL
Volumen total 6.76 mL. Mezclar los componentes, agregar el APS al final, cargar la cámara
rápidamente y colocar el peine.
Solución colorante
Etanol absoluto………………………………………………………………………. 40 mL
Ácido acético glacial………………………………………………………………… 10 mL
Azul de Coomasie 1%....................................................................................... 20 mL
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………… 100 mL
Mezclar todos los componentes. Almacenar a temperatura ambiente
Solución decolorante
Etanol absoluto……………………………………………………………………….. 400 mL
Ácido acético glacial…………………………………………………………………. 100 mL
Agua destilada c.s.p…………………………………………………………………. 1 L
Mezclar todos los componentes. Almacenar a temperatura ambiente
ANEXO 4. Soluciones para tripsinización

Solución salina 1X
Cloruro de sodio (0.15 M)……………….…………………………………………. 0.8766 g
Agua destilada c.s.p………………………………………………………………… 100 mL
Disolver el NaCl. Almacenar a 4° C.
Tripsina 0.1%
Tripsina porcina……………………………………………………………………… 10 mg
Solución salina 1X…………………………………………………………………… 10 mL
Disolver la tripsina porcina. Almacenar a -20 °C.
ANEXO 5. Buffer para electroforesis en gel de agarosa (Buffer TAE 10X)

Tris base (0.4M)………………………………………………………………………. 24.23 g
EDTA (10mM)…………………………………………………………………………. 1.86 g
Ácido acético glacial (200mM)...…………………………………………………… 5.72 mL
Adua destilada c.s.p…………………………………………………………………. 500 mL
Mezclar todos los componentes. Para su uso diluir 1/10. Almacenar a temperatura ambiente.
84
ANEXO 6. Porcentaje de poblaciones de células mononucleares de sangre periférica
humana, determinados por análisis de citometría de flujo
85

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Figura 6. Expresión del gen de la IL-1α y el TNF-α inducida con la F9-PI de

Figura 7. Expresión del gen de la IL-1α y el TNF-α inducida con la F9-PI de

Figura 8. Efecto de la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande sobre la

Figura 9. Efecto de la F9-PI de L. mutabilis ecotipo Patón Grande sobre la

Figura 10. Análisis de la expresión génica de la IL-2 en células

Figura 11. Análisis de la expresión génica del IFN-γ en células

Figura 12. Identificación de las poblaciones celulares CD3-CD16bright y

Figura 14. Identificación de las poblaciones celulares CD4+CD8-,

Figura 15. Análisis de los linfocitos CD3+CD25+ estimulados con la F9-PI de

Figura 16 Análisis inmunofenotípico de las células CD3-CD19+ estimulada

Figura 17. Interacciones hipotéticas de la F9-PI 25 μg/mL de L. mutabilis con

Figura 18. Efecto hipotético de la interacción de la F9-PI 25 μg/mL de L.

Tabla 5. Conteo total o absoluto de poblaciones de células mononucleares

CD: Cluster of differentation

CD3+CD16dim: Linfocitos T Natural Killer (NKT). Las células NKT expresan

CD3+CD4+CD8-: Linfocitos T helper (LTh)

CD3+CD4-CD8+: Linfocitos T citotóxicos (LTc)

CD3+CD4-CD8-: Linfocitos T doble negativo (LTDN) que corresponden

CD3+CD4+CD8+: Linfocitos T doble positivo (LTDP) que corresponden el 3-

CD45+CD4+CD16-: monocitos clásicos

CMSPh: Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana

CPA: Célula Presentadora de Antígenos

cDNA: DNA complementario

DNA: Ácido Desoxirribonucleico

EPG: Extracto Proteico de Patón Grande

F9-PI: Fracción 9 de proteína (con lectina) de L. mutabilis obtenida por

FSC: Forward scatter (Dispersión frontal, valor proporcional al tamaño

GAPDH: Gliceraldehido 3-Fosfato Deshidrogenasa

GRCo: Glóbulos Rojos de Conejo

HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic acid)

HA: Actividad hemaglutinante

IGF-1R: Receptor del factor de crecimiento insulínico tipo 1

IR: Receptor de Insulina

KML-C: Lectina del muérdago Koreano-Coloratum

NK: Linfocitos Natural Killer. Presentan un inmunofenotipo CD3-CD16 bright

NKT: Linfocitos T Natural Killer. Presentan un inmunofenotipo CD3+CD16dim

PI: Pico I obtenido por cromatografía de exclusión molecular

PII: Pico II obtenido por cromatografía de exclusión molecular

PIII: Pico III obtenido por cromatografía de exclusión molecular

MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad

mRNA: Ácido Ribonucleico mensajero

NIH: National Institute of Health

RPMI: Roswell Park Memorial Institute