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Objetivo
Ilustrar sobre los principios de la fotometría, las formas de operación práctica de los equipos, las
características de absorción de la luz por soluciones y sus aplicaciones cuantitativas.
Parte I
Determinación de las concentraciones de una mezcla de permanganato y dicromato
en una solución.
Reactivos
Solución de dicromato de potasio 0.01 M
-3
Solución de permanganato de potasio 3. 10 M
Solución de ácido sulfúrico al 15% v/v.
Parte experimental
Encienda el espectrofotómetro y aguarde a que se estabilice la fuente de radiación, al menos por 10 minutos.
Seleccione el modo ABSORBANCIA y luego una longitud de onda inicial de 340 nm. Coloque la cubeta con
en ácido sulfúrico al 15 % (solución blanco) en el porta celda, cierre la tapa del compartimento de muestras y
presione la tecla correspondiente para obtener el 0 de Absorbancia (usar siempre la misma cubeta y en la
misma posición).
-4
Coloque una solución de K2Cr2O7 6.10 M (en ácido sulfúrico al 15 %) en la cubeta hasta aproximadamente
4/5 partes de su volumen. Seque y limpie la superficie externa de la celda con papel absorbente libre de
pelusas. Cuando la absorbancia indicada en la pantalla resulte estable, registre el valor.
Seleccione las siguientes longitudes de onda y determine los valores de Absorbancia. Para cada nuevo
valor de longitud de onda se debe ajustar el 0 de Absorbancia según lo indicado anteriormente.
400 – 410 – 420 – 425 – 430 –435 – 440 – 445 – 450 – 455 – 460 – 465 – 470 – 475 – 480 – 490 – 500 –
510 – 520 – 525 – 530 – 535 – 540 – 545 – 550 – 555 – 560 – 570 – 580 – 590 – 600 nm.
-4
Repita el mismo procedimiento para una solución de KMnO4 1.8.10 M (en ácido sulfúrico al 15 %)
Represente en un mismo gráfico, absorbancia vs. longitud de onda para las soluciones de KMnO4 y K2Cr2O7.
Los equipos actuales pueden determinar los espectros de absorción en forma automática. Se debe indicar
tipo de lectura (A o %T), rango de longitudes de onda donde se desea el equipo realice el barrido y solicitar
una corrección de base con la solución blanco en el compartimiento de la muestra.
En caso de utilizar un equipo de doble haz, la corrección de la línea de base se realiza conjuntamente con las
lecturas de absorbancia de las muestras.
Es posible determinar las concentraciones de dos componentes en una mezcla en forma simultánea
realizando mediciones espectrofotométricas a dos longitudes de onda.
- 2-
A partir de las soluciones estándar de MnO4 y Cr2O7 realice las siguientes diluciones:
2-
a) Cr2O7 . Tome respectivamente 3, 4 y 6 ml de solución de dicromato de potasio 0.01 M y lleve a
50.0 ml con ácido sulfúrico al 15 % en un matraz aforado.
- -3
b) MnO4 . Tome respectivamente 2, 3 y 4 ml de solución de permanganato de potasio 3. 10 M y
lleva a 50,0 ml con ácido sulfúrico al 15 % en un matraz aforado.
Calcule en ambos casos las concentraciones finales de permanganato y dicromato para todas las
diluciones, pues le resultarán imprescindibles para la construcción de las representaciones de la ley de
Beer.
Para cada una de las longitudes de onda anteriormente seleccionadas, obtenga las representaciones de
la ley de Beer de la siguiente manera:
Finalmente usted obtendrá cuatro series de datos para la realización de los 4 gráficos de Absorbancias vs.
Concentración, más las correspondientes a la solución incógnita a ambas longitudes de onda.
Represente gráficamente absorbancia (en ordenadas) vs. concentración. Estime la mejor recta de acuerdo
a los valores medidos.
Observe el intervalo dinámico lineal de trabajo. Si es necesario, descarte aquellos puntos que se alejen de
la linealidad ocasionando desviaciones a la ley de Lambert – Beer.
Del gráfico de A vs concentración, calcule los valores de absortividad molar (a) de cada una de las
especies a ambas longitudes de onda.
A 2= a x bxC + a x b xC
Cr2O72-2 Cr2O72 -
MnO4- 2 MnO4-
Parte II
Determinación colorimétrica de Fósforo en alimentos según una modificación del método de
Gomori.
Fundamento
El fósforo reacciona con el molibdato en medio sulfúrico para generar un ácido complejo como el
heteropolifosfomolibdico, de color amarillo. En presencia de un reductor adecuado solo se reduce el
molibdeno combinado con el fósforo, generándose azul de heteropolimolibdeno que es un producto
intensamente coloreado de composición muy poco definida pero cuya intensidad de color puede resultar
directamente proporcional a la concentración inicial de fósforo en la muestra.
Reactivos
Reactivo sulfomolíbdico. Mezclar 2 partes de solución de molibdato de sodio al 5 % (Na 2MoO4.2H2O) con
1 parte de H2SO4 10 N y una parte de agua.
Solución reductora. Disolver 1 g de metil-para-aminofenolsulfato (elón) en 100 ml de solución de bisulfito
de sodio al 3%
Solución patrón de fósforo de 1000 ppm. Disolver cuantitativamente 11,0 g de KH 2PO4 en agua destilada,
agregar 1 ml de H2SO4 (c) y completar hasta 2,5 L con agua destilada.
Solución de Trabajo de fósforo. A partir del patrón de fósforo de 1000 ppm, realizar cuantitativamente 2
diluciones sucesivas 1/10 hasta llegar a una concentración de 10 ppm.
Técnica
A = .b . C
RECOMENDACION
El fósforo que contienen los detergentes caseros puede ser motivo de resultados elevados, por lo tanto se
recomienda abstenerse de su uso durante la limpieza del material. Puede ser reemplazado por la mezcla
sulfocrómica o detergentes no iónicos.
Cuestionario
5. Dibuje un diagrama de los componentes necesarios en los instrumentos para realizar mediciones de
absorción molecular en el uv - visible.
Defina:
a. ancho de banda espectral
b. radiación monocromática
6. ¿Cuál es la geometría mas adecuada y el material mas recomendado para la construcción de cubetas de
lectura en el uv- visible?.
7. Una solución de una especie absorbente presenta el siguiente espectro de absorción molecular. De las λ
señaladas en el espectro indique cuál seleccionaría para la cuantificación espectrofotométrica de la
misma y cuales no utilizaría. Justifique ordenando los puntos señalados en orden creciente, según la
sensibilidad.
A 1 2 3 4 5 6
8. Indique los pasos a seguir para determinar experimentalmente la concentración de una mezcla de dos
sustancias absorbentes.
9. ¿Cuál será el efecto sobre la concentración aparente (indique si aumenta, disminuye o no se modifica) si:
a. Se detecta una huella digital sobre la celda mientras se lee la Absorbancia del estándar, y se limpia
antes de tomar las lecturas para las muestras en la misma celda.
b. No se ajusta el cero del instrumento con disolvente antes de tomar las mediciones de absorbancia
para el estándar (A= 0.751) y para una muestra a la misma concentración?.
10. Indique como procedería experimentalmente para determinar el Límite de detección, Límite de
cuantificación y el rango de trabajo en una determinación espectrofotométrica
Problemas
1. Se mide la transmitancia de la solución resultante del siguiente tratamiento. Se disuelve la muestra que
contiene el compuesto X, se desarrolla un complejo coloreado y se diluye a 250 ml. Porciones de 1 g
de 4 patrones y una muestra dan los siguientes resultados:
1 2 3 4 Muestra
%T 64.5 47.4 37.6 25.0 30.2
%X 0.200 0.400 0.600 1.00 ?
2. Una solución de una muestra coloreada que responde a la ley de Beer, muestra una transmitancia de
80.0% cuando se mide en una celda de 1,00 cm de longitud.
a) Calcule el % T para una solución de doble concentración en la misma celda.
b) ¿Cuál debe ser la longitud de la celda para obtener la misma transmitancia (80%) en el caso de una
solución cuya concentración es dos veces la original?
c) Si la concentración original era 0,005% (p/v), ¿cuál es el valor de la absortividad a?
Rta.: a) 64% T b) 0.5 cm c) a = 1.938 L / g.cm
3. El calciferol (vitamina D2) medido a 264 nm en alcohol como solvente, cumple la ley de Beer sobre un
rango amplio de concentraciones con una absortividad molar de 18200.
a) Si el peso molecular es 396, ¿cuál es el valor de a?
b) ¿Qué rango de concentraciones, expresado en %, puede ser usado para el análisis si se desea mantener
la absorbancia dentro de los límites 0,4-0,9?. Suponga b = 1cm
-4 -3
Rta.: a) a = 45.96 L / g.cm b) 8.7 10 a 1.96 10 g%
4. En etanol, la acetona a 366 nm tiene una absortividad molar de 2,75 10-3 L / cm mol. ¿Qué intervalo de
concentración de acetona podría determinarse si los tantos por ciento de transmitancia de las soluciones
deben limitarse al intervalo del 10 % al 90% y se usan cubetas de 1.25 cm?
-4 -5
Rta: 2.91 10 M a 1.33 10 M
6. Una alícuota de una sustancia S coloreada se diluye con un volumen igual de agua y se mide su
absorbancia, siendo ésta de 0.325. Otra alícuota se diluye con un volumen igual de una solución patrón
–4
que contiene 3.00 10 M de S y la absorbancia es de 0.657. Calcule la Concentración de S en la
-4
solución original. Rta.: 2.94 10 M
7. La absortividad molar de una sustancia X es de 3500 a una longitud de onda determinada. Una solución
que contiene una concentración desconocida de X y otra sustancia Y que también absorbe, tiene una
transmitancia de 37.0 % a la longitud de onda determinada en una celda de 1.00 cm. Una solución
-4
patrón de 2.00 10 M en X y la misma concentración en Y que la muestra, tiene una transmitancia de
18.5 %. ¿Cuál es la concentración de X en la muestra?.
-4
Rta.: 1.14 10 M
- =
8. Una solución de una muestra que contiene MnO4 y Cr2O7 da una absorbancia de 0.688 a 500 nm en
-
cierta celda. Luego de decolorar el MnO4 con KNO2, la absorbancia bajó a 0.306. Una solución patrón de
MnO4 (10.0 g/ ml de MnO4 ) tiene una A: 0.310, mientras que una solución patrón de Cr 2O7 (200 g de
- - =
9. Una determinación simultánea de cobalto y níquel se puede basar en la absorción simultánea de sus
respectivos complejos de 8- hidroxiquinolinol. La s absortividades molares correspondientes a sus
máximos de absorción son:
Absortividad molar, ε
365 nm 700nm
Co 3529 428.9
Ni 3228 10.2
10. Porciones de un milimol de un ácido débil AH y su sal NaA se disuelven en volúmenes de un litro de
diversos buffers. Las absorbancias de las soluciones resultantes a 650 nm y en una celda de 2.00 cm
son:
absorbancia 0.950 0.950 0.677 0.000 0.000
pH 12.00 10.00 7.00 2.00 1.00
-
Calcule las absortividades molares de HA y A y la constante de disociación del ácido HA.
-7
Rta.: Kd 2.48 10
11. Se ha demostrado que la cafeína (pf: 212.1) tiene una A: 0.510 para la concentración de 1 mg/ 100 ml a
272 nm. Una mezcla de 2.5 g de una muestra de café soluble se mezcló con agua hasta un volumen de
500 ml y se transfirió una alícuota de 25,00 ml a un matraz que contenía 25 ml de H 2SO4 0.1 N. Esto fue
sometido a un tratamiento de clarificación y se aforo a 500 ml. Una parte de esta solución tratada mostró
una absorbancia de 0.415 a 272 nm.
a. Calcular la absortividad molar.
b. Calcular el número de gramos de cafeína por gramo de café.
Dato: b: 1.00cm
-2
Rta.: 3.25 10 g de cafeína por g de café
12. Se disuelven separadamente con HNO3 una muestra de 1.0 g de acero que contiene 0.41 % de Mn y otra
muestra de una acero análogo que pesa 1.1 g y cuyo % en Mn se desconoce. Se oxida el Mn de ambas
- -
muestras a MnO4 con IO4 , se diluyen ambas al mismo volumen y se comparan en un colorímetro de
espesor variable. Se comprueba que las intensidades de color se igualan cuando el espesor de la
solución patrón es un 10% menor que el de la otra solución. Calcular el porcentaje de Mn en la muestra
problema.
Rta.: 0.369 g% de Mn
2-
13. El quelato CuA2 presenta un máximo de absorción a 480 nm. Cuando el reactivo complejante está
presente en un exceso de al menos 10 veces, la absorbancia depende sólo de la concentración analítica
del Cu(II) y cumple la ley de Beer en un largo intervalo. Una solución en la que la concentración analítica
-4 2- -3
de Cu(II) es de 2.30 10 M y que cuando A es 8.60 10 M tiene una absorbancia de 0.690 cuando se
mide en una cubeta de 1 cm a 480 nm. Una solución en la que la concentración analítica de Cu(II) es
-4 2- -4
2.30 10 M y la de A es 5.00 10 M tiene una absorbancia de 0.540 cuando se mide en las mismas
condiciones. Utilizando esta información calcular la constante de formación de la reacción:
14. Se realiza una determinación de Gomori según la técnica del TP. Las absorbancias obtenidas son las
siguientes:
Calcule la concentración de P en las muestras de dulce de leche si luego de la mineralización las cenizas
se solubilizaron y se colocaron en matraces de 10.00 mL. Luego se realizó una dilución 1 en 25 y se tomaron
5.00 mL para la reacción de color que se desarrolló en matraces de 50.00 mL.