CARRERA:INGENIERÍA ASIGNATURA: MICROBIOLOGÍA

AGROPECUARIA
NRO.PRÁCTICA 7 TÍTULO DE LA PRÁCTICA: Determinación
de la sensibilidad antimicrobiana y micro dilución
INTEGRANTES: Casanova Daniela, Pasquel Ivon

1.- OBJETIVOS:
OBJETIVOS GENERALES:
 Explicar cómo cada grupo de agentes antimicrobianos afecta estructuras clave o
rutas metabólicas en las bacterias.
 Describir como las bacterias adquieren resistencia a los agentes antimicrobianos.

1.2.- OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Discutir los dos métodos básicos de preparación del inóculo y la aplicación de cada uno de
ellos.
Usar los criterios de interpretación que se encuentran en los estándares NCCLS para
reportar resultados de susceptibilidad.

2 MARCO TEORICO:
La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con las que contamos
en el laboratorio para ayudar a los profesionales en medicina controlar los procesos
infecciosos que se desarrolla en los pacientes

La razón fundamental de una prueba de sensibilidad es la de realizar una predicción a

través de una prueba in vitro, observar la respuesta del paciente a un determinado
antibiótico, la evolución de la infección y detectar una resistencia relevante del organismo
que está causando este proceso infeccioso.

Hay aún muchos agentes microbianos para los cuales la escogencia de una terapia
antimicrobiana continúa siendo empírica, porque estos agentes no han desarrollado
resistencia contra los antibióticos.
Por esta razón, la prueba de sensibilidad adquiere una mayor importancia para algunas
especies     bacterianas que no tienen una sensibilidad predecible. Ejemplos claros de este
último tipo de microorganismos son: Staphylococcus
sp., Enterococcus sp., Pseudomonas sp. y los miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Otros organismos donde la prueba de sensibilidad, sobre todo en los últimos años, ha
adquirido una gran importancia son: Streptococus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae y Mycobacterium tuberculosis.

Para efectuar las pruebas de sensibilidad, se cuenta con los siguientes métodos.

A.    Difusión en agar (Técnica de Bauer & Kirby)

B.     Dilución en agar

C.     Macrodilución en caldo

D.     Microdilución en caldo

E.     Epsilon test (E test)

F.     Métodos aumatizados

G.     Pruebas especiales.

A-Disfusión en agar (Técnica de Bauer & Kirby)

Esta técnica, el inóculo bacteriano llevado a una concentración igual a la del estándar 0,5 de
McFarlane, se aplica sobre la superficie de una placa seca de agar Müeller-Hinton que
tenga un pH entre 7, 2 y 7,4 medido a temperatura ambiente y una vez solidificado el medio
de cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de solidificado el medio de
cultivo. La cepa se debe rayar sobre la superficie del medio de forma tal que se logre un
crecimiento confluente. Una vez realizado esto, en un plazo no mayor de 15 minutos, se
procede a colocar los discos o las pastillas con el antibiótico.

Si se emplean placas de petri de 100 mm de diámetro, el número máximo de discos a

colocar es de 5. Luego, la placa se incuba a 35ºC en aire ambiente y por un periodo no
mayor a las 18 horas excepto para los aislamientos de Staphylococus sp y Enterococcus sp,
para los cuales se recomienda una incubación de 24 horas, principalmente para lograr una
mejor detección de la resistencia a la oxacilina y a la vancomicina.

La técnica de difusión en agar, presenta varias ventajas como:

Es fácil de efectuar y de gran reproducibilidad, bajo precio, no requiere equipo especial, sus
resultados son fácilmente interpretados por los clínicos, es muy flexible a la hora de
escoger los antibióticos a probar.
B-Método de Dilución en agar

Siendo la técnica de difusión en agar únicamente cualitativa, y teniendo en mente que en

muchas oportunidades clínicas se hace necesario conocer con exactitud qué concentración
de antibiótico es la necesaria para lograr controlar un proceso infeccioso dado, es evidente
la necesidad de contar con metodología que solvente ese problema.

En la técnica de la dilución en agar, se preparan tubos con la concentración definida de

antibiótico y se le agrega a cada tubo una cantidad conocida del agar Müeller-Hinton, este
tubo se homogeniza y se chorrea en una placa de Petri vacía con lo que se logra una placa
de agar Müeller-Hinton con el antibiótico diluido a una concentración determinada.

Para inocular el medio de cultivo, se emplea un inoculador conocido como el inoculador de

Éster. Este es una placa de metal de 32 pozos y una lámina de metal con 32 proyecciones
que toman, cada una, 20 ul del inóculo estandarizado del agente y que se coloca sobre la
superficie del agar con antibióticos. Adicional a esto, se inocula una placa de Müeller-
Hinton sin antibiótico, que sirve como control positivo de crecimiento. La placa se incuba a
35ºC por 18 a 24 horas y se revisa el crecimiento, siempre contra el control positivo.

Basándose en este criterio, al escogerse dos concentraciones, una abajo y otra arriba del
punto de quiebra, si la cepa crece en las dos concentraciones es resistente, si crece sólo en
la concentración bajo el punto de quiebra, la cepa es intermedia y sensible si no crece en
ninguna.

A un utilizando sólo dos concentraciones, esta técnica exige mucho trabajo técnico y es
lenta para la     interpretación de los resultados; por eso se ha empleado otra técnica
derivada de ésta: la micro titulación.

C-Macro titulación en tubo

Esta técnica se deriva de la anterior, pero no se utiliza por la cantidad de material que
emplea, y porque presenta el grave problema de la dificultad para detectar contaminaciones
del medio de cultivo, lo que podría producir una falsa resistencia.

Sin embargo, la técnica que se usa es la misma de la micro dilución y la interpretación es la

misma también.

D-Micro titulación

Aquí empleamos unas placas plásticas, estériles, con tapa, de 96 pozos y un fondo en U.

Cada placa permite realizar una CMI de un antibiótico a ocho cepas diferentes, o una CMI
de una cepa contra ocho diferentes antibióticos.

El medio de cultivo empleado es Müeller-Hinton en caldo o el medio caldo HTM, si la cepa

a estudiar es un Haemophilus sp.
Resumiendo, en el primer pozo hemos puesto 50 ul de medio de cultivo, 50 ul de la
solución madre de 512 ul, hemos sacado 50 ul y hemos colocado 50 ul del inóculo
bacteriano. En este primer pozo la concentración del antibiótico, si iniciamos con la
solución madre de 512 ul, sería de 128 ug, por consiguiente, el pozo 2 tendrá una
concentración de 64 ug, el siguiente de 32, el siguiente de 16 y así hasta el pozo 10 que
tendría una concentración final de 0,125 ug/ml.

La placa se incuba a 35ºC por 18 a 24 horas, cubierta, ya sea con la tapa de la placa o con
un plástico adhesivo permeable al oxígeno.

Una vez lista la placa, se hace una serie de diluciones del inóculo, se realiza el plateo final
en un medio de cultivo apropiado a la cepa y se incuba en las condiciones apropiadas hasta
el otro día. Luego de este periodo de incubación, se cuentan las ufc, se multiplican por la
dilución y se obtiene la concentración (ufc/ml) del inóculo empleado.

E-E test

Este método emplea una tira con una matriz plástica que tiene una concentración
decreciente de un antibiótico determinado. El medio que se usa es agar sangre con sangre
de caballo al 5% y con una base de Müeller-Hinton o puede utilizarse agar HTM o agar
chocolate suplementado.

En E test ha venido a resolver una serie de problemas y a hacer más rápida y fácil la
determinación de la CMI. Actualmente, se pueden adquirir tiras de E test para pruebas de
sensibilidad de las bacterias tradicionales y de las especiales como organismos
anaerobios, Campylobacter sp., Helicobacter pylory y Micobacterium tuberculosis.

3. RECURSOS UTILIZADOS

3.1 MATERIALES

DESCRIPCIÓN CANTIDAD
Tub’s de referencia McFarland 0,5 1
Agar Mueller Hinton 1
Discos de sensibilidad sin antibióticos 1
Pinzas pequeñas estériles 1
Tubos pequeños con 4ml de solución salina 1
(0,85%)
Cajas de AN con E.coli 1
Cajas de AN con P.aeruginosa 1
Cajas de AN con Salmonella 1
Cajas de AN con S.aureus 1
Viales Trimetoprim/sulfametoxazol 1
Viales Ciprofloxacino 1
 Viales Tetracilina 1
Viales Cloranfenicol 1
Vial Penicilina 1
Vial Cefotaxima 1
Vial Ceftazidima 1
Vial Cefazolina 1
Frescos’ con hisopos estériles 1
Microdilusion
Antimicrobianos/desinfectantes a evaluar 1
Caldo de cultivo (Muller hinton) 1
Placa de microdilucion 2

3.2 REACTIVOS

Solución Salina (0,85%) Para llenar tubos de ensayo

Hipoclorito de sodio al 2% 2 frascos 100ML

Amonio cuaternario 2 frascos 100ML

3.3 EQUIPOS

-Incubadora a 36°C

4. PROCEDIMIENTO

Difusión en agar

4.1 Preparación del inóculo

De la placa de cultivo durante 18 a 24 h, seleccione varias colonias cíclicas y ajuste el

inóculo a una turbidez equivalente a 0,5 en una escala de McFarland de 0,5 en solución
salina fisiológica (1,5 × 10 UFC/ml). No reflejan colonias no aisladas

4.2 Inoculación de las placas

Dentro de los 15 minutos de haber ajustado el inóculo, inserte una gasa en la suspensión y,
cuando la retire, gire la pared del tubo varias vueltas por encima del nivel del líquido para
eliminar el exceso de inóculo. Los tableros de Mueller-Hinton se impregnan por completo,
sin dejar áreas vacías. Esto se logra pasando el hisopo por la superficie del agar cuatro
veces, girando la placa unos 60° cada una y finalmente colocándola alrededor de la
circunferencia del agar para lograr una capa uniforme. Deje que se seque durante 3 a 5
minutos antes de colocar el disco.
4.3 Dispensación de los discos

Los discos deben almacenarse en el refrigerador entre 4 y 8 °C, con un desecante similar y
protegidos de la luz y la humedad. Solo deben retirarse momentáneamente antes de aplicar.
Coloque las placas con pinzas estériles. Se debe tener cuidado para asegurarse de que esté
en completo contacto con la superficie del agar, así que golpéelo suavemente sobre la
superficie del agar. No debe estar a menos de 15 mm del borde de la placa y debe
distribuirse de manera que los halos de amortiguamiento no se superpongan. No se
recomienda utilizar más de 6 placas por placa Petri. 55 Incube las placas invertidas (capa de
agar arriba), en grupos de hasta 5 placas, a 35 °C automáticamente durante 15 min. Los
platos se incubarán de 16 a 18 horas.

4.4 Evaluación de desinfectantes

En cajas de Petri que contengan medio MH e inoculadas con bacterias, agregue una placa
de control positivo (desinfectada, preparada según las recomendaciones del fabricante) y
otra placa de control negativo (agua esterilizada). Agregue 200 µL de control positivo y
control negativo a cada placa. Incubar a 35 ° C durante 16-18 horas. Luego mida el aura
inhibidora y saque una conclusión.

Microdilución

En el método de Microdilusion cada una de los pocillos de la placa de micro titulación con
pocillos de fondo en “U” representa uno de los tubos del método de macro dilución. Las
placas de Microdilusion con diferentes concentraciones de antimicrobianos se pueden
preparar en el propio laboratorio o bien se pueden comprar a diferentes compañías que los
suministran congelados, deshidratados o liofilizados. En muchos laboratorios el empleo de
paneles comerciales se basa en la utilización de sistemas semiautomáticos de incubación-
lectura interpretación; esto facilita su uso, pero tiene el inconveniente del incremento del
gasto. Algunas compañías han introducido en el mercado paneles en los que el medio de
cultivo incluye un indicador fluorescente que permite la obtención rápida (menos de 8
horas) de los resultados; sin embargo, no existen aún datos suficientes que permitan
aconsejar el uso rutinario de este tipo de paneles.

Varias compañías comerciales están evaluando, también, sistemas expertos (programas

informáticos) que facilitan la interpretación clínica de los resultados obtenidos; es
presumible que su uso se generalizará en un futuro. No se discutirá el uso de estos sistemas
comerciales; se remite al lector a la información proporcionada por los propios fabricantes.
En lo sucesivo nos referiremos al método de Microdilusion preparando las placas en el
propio laboratorio.

RESULTADOS

Difusión
El estudio de susceptibilidad in vitro a antimicrobianos de los microorganismos patógenos,
puede realizarse a través de diversos métodos, el de uso más común por los laboratorios de
microbiología es el de difusión en agar, estandarizado para microorganismos de
crecimiento rápido y algunos fastidiosos. El método estandarizado y recomendado por el
NCCLS se basa en el descrito originalmente por Bauer et al, que obtiene resultados
cualitativos que correlacionan bien con los resultados cuantitativos obtenidos mediante
determinación de CIM (concentración inhibitoria mínima). en agar

Microdilución

El método de Microdilusion es el más práctico en estos momentos y da resultados

comparables al método de dilución en agar que se considera el de referencia. Una micro
placa de múltiples pocillos que contienen concentraciones crecientes de varios
antimicrobianos, es inoculada con una suspensión en un caldo de la bacteria anaerobia a
estudiar. Tras 48 horas de incubación a a35o C en una atmósfera anaerobia, se determina la
CMI como la menor concentración de antimicrobiano que inhibe un crecimiento visible.
Los paneles se pueden preparar en el día o tenerlos congelados. Además, hay paneles
comercializados para anaerobios con los antimicrobianos congelados o liofilizados.

Preguntas:

▪ De los antimicrobianos utilizados ¿Cuál presentó mayor espectro de inhibición?

Las Ciprofloxacino es un agente antimicrobiano de la clase de las

fluoroquinolonas .Durante años las fluroquinolonas fueron consideradas como un grupo
homogéneo de antibióticos, con propiedades semejantes y, por tanto, como la segunda y
última posibilidad de generación de quinolonas, pero las posibilidades de transformación de
su estructura química ha producido un desarrollo vertiginoso de este grupo, que lo ha
convertido en el más acelerado dentro de los antibióticos, con compuestos de mayor
espectro antibacteriano, penetración tisular y seguridad, y con menor manifestación de
resistencia antimicrobiana, demostrada hasta el presente, lo cual ha hecho que actualmente
existan 4 generaciones de quinolonas, que se haya ampliado su uso y que continúe su
desarrollo.

▪ Explique el mecanismo bioquímico de inhibición de cada uno de los antimicrobianos

probados.

 Gentamicina. A pesar que el aislamiento es susceptible a gentamicina, este

antibiótico no es reportado en forma rutinaria porque los amino glucósidos no se
consideran agentes de primera línea contra estafilococos. Estos se utilizan, a veces,
en combinación con un agente activo de pared celular (eje. vancomicina) para tratar
infecciones estafilocócicas severas.
 Fluoroquinolonas. El aislamiento del paciente es resistente a ciprofloxacina que es
una fluoroquinolona. Esto no es inusual en ORSA. Los estafilococos que son
resistentes a una fluoroquinolona son típicamente resistentes a otras
fluoroquinolonas.
  El cloranfenicol, quinupristina-dalfopristina, y rifampicina no están en el panel de
rutina del laboratorio para estafilococo, sin embargo, si alguno de estos se considera
para tratamiento, estos deben ser analizados.
 El S. pneumoniae se vuelve resistente a la penicilina a través de alteraciones en las
proteínas de unión a la penicilina (Pobos) de la pared celular. Estas PBPs alteradas
tienen disminuida la afinidad por los antibióticos beta-lactámicos. Puesto que los
beta-lactámicos no se unen a sus sitios blanco (primordialmente PBP 2b), estos no
inician la lisis celular.
 Estas enzimas son inhibidas por el ácido clavulánico. A medida que se incrementa
el nivel de expresión de las betalactamasas de amplio espectro, aparece la
resistencia a otra beta lactámicos como cefalotina y cefazolina.
 Sería poco común encontrar que las Enterobacteriaceae sean resistentes a
cefotaxima, pero susceptible a cefazolina. En raras ocasiones, esto podría ocurrir
con cepas productoras de BLEE; sin embargo, el resultado de cefazolina será
reportado como resistente

▪ Indique los criterios para clasificar por niveles a los desinfectantes e indique en qué
nivel se encuentra el hipoclorito y los amonios cuaternarios.

La desinfección de alto nivel consiste en la acción letal sobre todos los microorganismos,

incluyendo bacterias, hongos y algunas esporas. No reemplaza a los procedimientos de
esterilización. Dentro de este grupo encontramos el glutaraldehido activado al 2% en
solución acuosa.

En la desinfección de nivel intermedio hay destrucción de todas las formas vegetativas de

los microorganismos exceptuando las esporas. A este grupo pertenece el Hipoclorito de
Sodio y Alcohol etílico al 70% .

La desinfección de nivel bajo no alcanza a esporas, ni hongos, solo bacterias vegetativas y

algunos virus. En este grupo encontramos los compuestos acuosos de amonio cuaternario
0,1 a 0,2%.

Hipoclorito de sodio al 1%
A pesar de ser un desinfectante de alto nivel tiene un uso clínico más limitado porque el pH
alcalino disminuye su actividad, lo mismo con la presencia de materia orgánica, y corroe el
material metálico.  

▪ Consulte la aplicación de los desinfectantes evaluados, en qué tipo de industrias o

productos son aplicados.

Glutaraldehido. Son biosidas de amplio espectro, eficientes contra bacterias,

mohos, virus y micro bacterias.
Sales de amonios cuaternarios. Estos son bactericidas, fungicidas y virucidas, son
efectivos tanto en el medio alcalino como acido, mostrados mejores resultados en el
alcalino.
Alcoholes. Son antimicrobianos, son buenos solventes de otros productos y poseen
una rápida acción. Actúan sobre bacterias gram positivas y gram negativas,
incluyendo además micro bacterias, hongos y virus.
Peróxido de hidrogeno. Este es efectivo frente a bacterias y virus según la
concentración y condiciones de utilización. Demuestra amplio espectro de eficacia
frente a bacterias gram positivas.
Ácidos y álcalis. Estas son altamente bactericidas, la eficacia de estos dos agentes
está ligada a la concentración de iones H+ y OH-.
Ácido peracético. Es un antiséptico de tipo oxidante, en concentraciones inferiores
a 100ppm inhibe y mata bacterias gram positivas, gram negativas, micro bacterias,
hongos y levaduras.

▪ ¿Cuáles son las ventajas y limitaciones de la técnica de micro dilución, frente a la de

difusión en agar?

La técnica de difusión en agar, presenta varias ventajas como:

a.    Es fácil de efectuar y de gran reproducibilidad

b.    Bajo precio

c.    No requiere equipo especial

d.    Sus resultados son fácilmente interpretados por los clínicos

e.    Es muy flexible a la hora de escoger los antibióticos a probar

Los glicopéptidos son moléculas de gran tamaño que difunden mal en el agar, por lo que
tendrá que controlarse el grado de humedad del agar al realizar los antibiogramas y la
distribución homogénea del antibiótico al preparar las placas de cribado o las diferentes
placas para determinación de la CMI por el método de dilución en agar.

REFERENCIAS:

 Amsterdan, D. (1998). Obtenido de coesant-seimc.org:

https://www.flowchem.com.co/conoce-los-desinfectantes-mas-utilizados-la-
industria-alimentos/

 Leich, C. (Agosto de 1992). Obtenido de manejoheridas:

http://www6.uc.cl/manejoheridas/html/antiseptico.html
 Madigan MT, Martnko JM, Parker J. Brock, Biología de los microorganismos. 10a
ed. Buenos Aires: Pearson Educacion; 2004.