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Boletín Latinoamericano y del Caribe de

Plantas Medicinales y Aromáticas

ISSN: 0717-7917

editor.blacpma@usach.cl
Universidad de Santiago de Chile Chile

OJEDA, Juan; JARA, Evelyn; MOLINA, Luis; PARADA, Fabiana; BURGOS, Rafael A.; HIDALGO, Maria A.; HANCKE, Juan
L.
Efectos del jugo de bayas de Aristotelia chilensis sobre la expresión de ciclooxigenasa 2, NF-kB, NFAT, ERK1/2 y activación de
PI3K/Akt en células de cáncer de colon

Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, vol. 10, núm. 6, noviembre, 2011, pp.
543-552 Universidad de Santiago de Chile Santiago, Chile

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=85622434007

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© 2011 Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas 10 (6): 543 - 552
ISSN 0717 7917
www.blacpma.usach.cl

Artículo Original | Original Article

Efectos del jugo de bayas de Aristotelia chilensis en la expresión de ciclooxigenasa

Activación de NF-ÿB, NFAT, ERK1/2 y PI3K/Akt en células de cáncer de colon

[Efecto de un concentrado del fruto de Aristotelia chilensis sobre la expresión de cicloxigenasa 2, NF-ÿB, NFAT,
ERK1/2 y activación de PI3K/Akt en células de cancer de colon]

Juan OJEDA, Evelyn JARA, Luis MOLINA, Fabiana PARADA, Rafael A. BURGOS, Maria A. HIDALGO and Juan L. HANCKE.

Instituto de Farmacología y Morfofisiología, Universidad Austral de Chile, Apartado Postal 567, Valdivia, Chile
contacto | Contactos: Juan L. HANCKE – Correo electrónico: jhanckeo@gmail.com

Resumen
Aristotelia chilensis es una baya nativa del sur de Chile con un alto contenido de antocianinas, compuestos que exhiben propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. En el
presente estudio, evaluamos los efectos del jugo de bayas de A. chilensis sobre la expresión de ciclooxigenasa (COX)-2, las vías de señalización intracelular y la viabilidad
celular en células de cáncer de colon. El tratamiento de células Caco-2 con jugo diluido de A. chilensis durante 24 h redujo la expresión de proteína y ARNm de COX-2, así
como la actividad de luciferasa NF-ÿB inducida por TNF-ÿ y la activación de NFAT. Por el contrario, 4 h después de la administración, A. chilensis redujo transitoriamente los
niveles citoplasmáticos de IÿBÿ y aumentó la fosforilación de ERK1/2 y Akt, así como la expresión de c-fos. A concentraciones que redujeron la expresión de COX-2,
A. chilensis no afectó la viabilidad de las células Caco-2. Nuestros resultados sugieren un potencial efecto anticancerígeno y antiinflamatorio de A. chilensis.

Palabras clave: Aristotelia chilensis, COX-2, NF-ÿB, cáncer de colon.

Resumen
Aristotelia chilensis es un berrie originario del sur de Chile, que posee un alto contenido de antocianinas, compuestos con propiedades antioxidantes y anti inflamatorias. En
este estudio, se evaluó los efectos de un concentrado de A. chilensis sobre expresión de ciclooxigenasa (COX)-2, vías de señalización y viabilidad en células de cáncer de
colon. El tratamiento de células Caco-2 con A. chilensis por 24 h redujo la expresión de la proteína y mRNA de COX-2, y disminuyó la actividad luciferasa regulada por NF-
ÿB o NFAT. El tratamiento de células Caco-2 por 4 h con A. chilensis redujo transitoriamente los niveles citoplasmáticos de IÿBÿ, aumentó la fosforilación de ERK1/2 y Akt y
la expresión de c-fos. A. chilensis no afectó la viabilidad celular, a concentraciones que redujo la expresión de COX-2. Los resultados sugieren un potencial efecto
anticancerígeno y antiinflamatorio de A. chilensis.

Palabras Clave: Aristotelia chilensis, COX-2, NF-ÿB, cáncer de colon.

Recibido | Recibido: 11 de agosto de 2011.

Aceptado en versión corregida | Accepted in revised form: September 28, 2011.
Publicado en línea | Published online: November 30, 2011.
Declaración de intereses | Declaración de intereses: Este trabajo fue apoyado por la subvención CTI-Salud CTE-06, CHILE.
Este artículo puede ser citado como / This article must be cited as: Juan Ojeda, Evelyn Jara, Luis Molina, Fabiana Parada, Rafael A. Burgos, Maria A. Hidalgo, Juan L. Hancke.
2011. Efectos del jugo de bayas de Aristotelia chilensis en la expresión de ciclooxigenasa 2, NF-ÿB, NFAT, ERK1/2 y activación de PI3K/Akt en células de cáncer de colon. Bol Latinoam Caribe
Plant Med Aromat 10(6): 543 – 552.

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Ojeda et al.
INTRODUCCIÓN
Aristotelia chilensis (Maqui) es una baya chilena endémica.
Es una planta dioica que pertenece a la familia
Elaeocarpaceae que crece en suelos ligeramente ácidos,
moderadamente fértiles y bien drenados. Produce pequeñas
bayas comestibles de color morado/negro, de unos 6 mm
de diámetro, que se comen frescas o se utilizan para zumos,
mermeladas o elaboración de vino. Las hojas y frutos son
astringentes y han sido utilizados en la medicina popular
chilena como antidiarreicos, antiinflamatorios,
antihemorrágicos y febrífugos (Hoffmann et al., 1992). El
color rojo del extracto acuoso de su fruto se debe a la
presencia de pigmentos antociánicos.
El contenido medio de antocianinas totales es de
137,6 ± 0,4 mg/100 g de fruta fresca, con un 73% de
derivados de delfinidina y un 37% de cianidina. Los
principales pigmentos identificados son 3-glucósidos, 3,5-
diglucósidos, 3-sambubiósidos y 3-sambubiósido-5-glucósidos de
delfinidina y cianidina, con delfinidina 3-
sambubiósido-5-glucósido (34% de las antocianinas totales)
como antocianina principal (Escribano-Bailon et al., 2006).
La presencia de derivados poliglicosilados altamente polares
y solubles en agua en A. chilensis ilustra que esta baya es
atractiva para la extracción y para el uso potencial en la
producción de colorantes alimentarios, así como para usos
farmacológicos. El jugo concentrado de A. chilensis tiene un
alto contenido de compuestos fenólicos con capacidad
antioxidante, que protegen tanto a las LDL de la oxidación
como a las células endoteliales del estrés oxidativo
intracelular, lo que sugiere que A. chilensis podría tener
propiedades antiaterogénicas (Miranda-Rottmann et al.,
2002) .
Se sabe que las antocianinas son poderosos
antioxidantes y se ha demostrado que inhiben la expresión
de COX-2, una enzima regulada al alza en el cáncer de
colon. Las antocianinas inhiben la producción de COX-2 y
PGE2 a través de un factor nuclear -kappaB (NF-ÿB)-
vía dependiente, así como regular la vía PI3 quinasa/Akt
activada por UVB en la línea celular de queratinocitos
humanos HaCaT (Tsoyi et al., 2008).
La delfinidina inhibe la expresión de COX-2 en diferentes
células, como las células epidérmicas de piel de ratón
sensibles a la promoción JB6 (JB6 P+) (Kang et al., 2008) y
las células HT-29 estimuladas con TPA (Kim et al., 2008).
La cianidina redujo la expresión de COX-2 y la producción
de PGE2 en células de cáncer de próstata humano (Munoz-
Espada et al., 2006) y en células HT-29 estimuladas con
TPA (Kim et al., 2008). Además, la cianidina-3-O-beta-
glucósido inhibe la expresión de iNOS y COX-2 en los
macrófagos THP-1 (Wang et al., 2008). Por otro lado, el
jugo de diferentes bayas comestibles pequeñas ha sido
evaluado por sus efectos en diferentes líneas de células cancerosas, revelando una
Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/544
Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon
inhibición de la proliferación celular, activación del factor de
transcripción nuclear NF-ÿB y activación de la expresión de
COX-2 inducida por TNF (Boivin et al., 2007).
Todos estos antecedentes sugieren un potencial efecto
antiinflamatorio y anticancerígeno de A. chilensis. En este
estudio, evaluamos el efecto in vitro de A. chilensis en la
línea celular de cáncer de colon Caco-2,
que exhibe un alto nivel de expresión de COX-2. Evaluamos
el efecto de A. chilensis sobre los niveles de mRNA y
proteína COX-2 y las vías de señalización implicadas en la
expresión de COX-2 como NF-ÿB, NFAT, c-fos, ERK1/2
MAPK y Akt en células Caco-2 . Nuestros resultados
mostraron dos efectos diferentes de A. chilensis: el
tratamiento a corto plazo provocó una estimulación transitoria
de IÿBÿ, c-fos, Akt y ERK/1/2, mientras que el tratamiento a
largo plazo provocó una fuerte reducción de COX-2 fue detectad
MATERIAL Y MÉTODOS
El jugo de bayas de A. chilensis fue proporcionado
amablemente por Herbal Powers (Bradenton, FL, EE. UU.).
El contenido de antocianinas se determinó por HPLC. El
jugo concentrado de A. chilensis se diluyó en medio de
cultivo antes de cada experimento y en todos los
experimentos se utilizó una concentración equivalente a 50 ng/m
HPLC
El jugo concentrado de A. chilensis se analizó según el
método analítico descrito por Escribano-Bailon (Escribano-
Bailon et al., 2006).
Cultivo de células
La línea celular de adenocarcinoma colorrectal Caco-2
(ATCC, Manassas, VA, EE. UU.) se cultivó en medio medio
esencial mínimo de Eagle (Gibco, Grand Island, NY, EE.
UU.) suplementado con FBS al 10 %. Las células se
mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de CO2
al 5%.
Inmunotransferencia. Se incubaron células Caco-2 con A.
chilensis por diferentes tiempos y se prepararon extractos
de proteínas totales o extractos citosólicos. Posteriormente,
se resolvieron 50 ÿg de proteínas en SDS/PAGE al 12%, se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. El
inmunoblotting se realizó utilizando anticuerpos contra
COX-2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE. UU.), fosfo-
ERK1/2, fosfo-Akt (ser473), Akt total, c-fos, IÿBÿ (Cell
Signaling Technology, Boston, MA, USA), ERK1/2 total
(Santa Cruz Biotechnology, California, CA, USA), según la
dilución recomendada por el fabricante (Hidalgo et al., 2004).
Las transferencias se desarrollaron con una
quimioluminiscencia mejorada
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Ojeda et al.
sistema. Las proteínas fosforiladas se normalizaron frente a las
proteínas no fosforiladas o COX-2 y c-fos frente a beta-actina
(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) o alfa-tubulina (Molecular
Probes, Eugene, OR, EE. UU.). Se empleó el software ImageJ de
NIH para analizar las transferencias.
PCR en tiempo real
Las células Caco-2 se incubaron con A. chilensis o solvente
durante 24 h. El ARN total se aisló con el kit RNAEasy (Qiagen,
Hilden, Alemania) y se utilizó 1 ÿg para la síntesis de ADNc con
cebadores oligo dT y transcriptasa inversa MMLV (Promega,
Madison, WI, EE. UU.). La PCR en tiempo real se realizó utilizando
2 ÿl de cDNA, master mix SYBRGreen (Stratagene, La Jolla, CA,
EE. UU.) y el siguiente cebador: COX-2 sense 5'– TGC ATT CTT
TGC CCA GCA CT – 3' y antisentido 5' – AAA GGC GCA GTT
TAC GCT
GT-3'; GAPDH sentido 5'– GGC GTG AAC CAC GAG AAG TAT
AA – 3' y antisentido 5'– CCC TCC ACG ATG CCA AAG T – 3'.
Actividad de luciferasa
Las células Caco-2 se transfectaron con 1 ÿg de plásmido pGL3-
NF kB o pNFAT-luc y 0.5 ÿg de plásmido pRL-TK como control,
en reactivo FuGene 6 (Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN,
EE. UU.) para 24 h, según instrucciones del fabricante. Las
células se trataron con A. chilensis durante 30 min y luego se
estimularon con 10 ng/ml de TNF-ÿ, 100 ng/ml de PMA/ 0,5 ÿM
de ionomicina o disolvente durante 16 h. Se obtuvieron los
extractos celulares y se midió la actividad luciferasa con el Dual-
Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA)
en un luminómetro (Luminoskan, Thermo). La actividad de
luciferasa se expresó como la relación RLU pGL-NF kB/pRL-TK
o pNFAT/pRL.
Viabilidad celular - ensayo MTT
Las células Caco-2 se incubaron con diferentes concentraciones
de A. chilensis, solvente o butirato (10 mM) durante 24, 48, 72 o
96 h. Luego, la actividad mitocondrial fue medida por el 3-[4,5-
modificado
Ensayo de bromuro de dimetiltiazol 2-il]-2,5 difeniltetrazolio (MTT)
(Mosmann, 1983). Esto implica determinar la actividad
deshidrogenasa mitocondrial en células intactas mediante
incubación durante 4 ha 37 °C con MTT (10 ÿl de solución de
MTT de 5 mg/ml por pocillo). La reacción se detuvo mediante la
adición de tampón de lisis celular (50 % de dimetilformamida y 20
% de SDS, pH 7,4). Los valores de ÿA a 550–650 nm se
determinaron de la siguiente manera
Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/545
Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon
día utilizando un lector de placas de microtitulación (Tecan). Los
resultados se expresan como porcentaje del control.
Citometría de flujo
Las células Caco-2 se incubaron con el jugo diluido de
A. chilensis, solvente o butirato 10 mM por 24 h. Luego, las
células se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio (BD)
según las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron
en un citómetro de flujo (FACSCanto II, BD).
análisis estadístico
Los resultados se expresaron como la proporción o veces del
aumento del control y se representaron como la media ± se. Se
realizó un ANOVA y se aplicó una prueba de comparación múltiple
de Dunnet usando GRAPH PAD V 2.0. Se utilizó un nivel de
significancia del 5%.
RESULTADOS
Identificación de antocianina en jugo concentrado de A.
chilensis
El análisis HPLC mostró que el jugo concentrado de A. chilensis
posee 0,5423 % (p/p) de antocianinas (p/p)/100 g de fruto seco y
se detectaron las siguientes especies específicas de antocianinas:
0,1359 % (p/p) delphinidin 3-O-sambubiósido-5 -o-glucósido,
0,1112 % (p/p) delfinidina 3,5-o-diglucósido, 0,1297 % (p/p)
cianidina 3-O-sambubiosido-5-o-glucósido, 0,0516 % (p/p)
delfinidina 3 -O-sambubiosido, 0,0735 % (p/p) delfinidina 3-o-
glucósido, 0,0271 % (p/p) cianidina 3-O-sambubiosido y 0,0115
% (p/p) cianidina 3-o-glucósido.
A. chilensis reduce la expresión de COX-2 en células Caco-2
Ha sido bien establecido que COX-2 se expresa altamente en
células de cáncer de colon humano y Caco-2 (Accioly et al., 2008;
Eberhart et al., 1994; Kargman
et al., 1995; Sano et al., 1995). En este estudio, las células
Caco-2 se incubaron con A. chilensis durante 0, 24, 48 o 72 h y
la proteína COX-2 se analizó mediante inmunotransferencia. El
tratamiento de células Caco-2 con A. chilensis mostró una
reducción del 50% en el nivel de proteína COX-2 a partir de las
24 h de incubación en comparación con el control (Figura 1A). La
expresión de mRNA de COX-2 a las 24 h de tratamiento con A.
chilensis se analizó mediante PCR en tiempo real, y similar a la
expresión de proteínas, se observó una reducción del 50% con
respecto al control en las células tratadas con A. chilensis (Figura
1B). Estos resultados indican que A. chilensis interfiere con la
expresión basal de COX-2 a nivel de proteína y ARNm en células
Caco-2.
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Ojeda et al. Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon

Figura 1

Efecto de A. chilensis sobre la expresión de COX-2. Las células Caco-2 se incubaron con A. chilensis (A.ch.) durante 0, 24, 48 o 72 h,
seguido del aislamiento de proteínas totales o ARN. (A) El nivel de proteína COX-2 se analizó mediante inmunotransferencia con un
anticuerpo contra COX-2, y la transferencia se extrajo y se volvió a sondear con anticuerpo anti-ÿ-actina. (B) La expresión de ARNm de
COX-2 a las 24 h de tratamiento con A. chilensis se evaluó mediante transcripción inversa y PCR en tiempo real. Los gráficos muestran la
media ± SE de tres experimentos independientes. *p < 0,05 en comparación con el control.

La activación
ÿ de NF-B y NFAT es reducida por A. chilensis
NF-ÿB es un factor de transcripción activado por mediadores
proinflamatorios, que regula la expresión de COX-2 (Duque et al.,
2006). Las células Caco-2 se transfectaron con el plásmido
reportero pNF-ÿB-luc y pRL-TK, se trataron con A. chilensis o
vehículo y se incubaron con TNF-ÿ o vehículo durante 16 h. El
tratamiento con A. chilensis por sí solo no modificó la actividad de
NF-ÿB-luc en comparación con el control (Figura 2A).
inhibición de la activación de NF-ÿB inducida por TNF-ÿ.
Estos resultados indican que A. chilensis ejerce los efectos
inhibitorios sobre NF-ÿB solo cuando esta vía es activada por una
citocina proinflamatoria.
En células de carcinoma de colon, el factor nuclear de
células T activadas (NFAT) tiene implicaciones importantes en la
regulación de la expresión de Cox-2 (Corral et al., 2007; Duque et
al., 2005). Evaluamos el efecto de A. chilensis sobre la activación
de NFAT en células Caco-2 transfectadas con el plásmido

Adicionalmente, se observó un aumento en la actividad luciferasa informador pNFAT-luc.

inducida por TNF-ÿ, y el pretratamiento de las células con A. PMA/Ionomicina indujo la activación de NFAT y el pretratamiento
chilensis por 30 min y seguido de estimulación con TNF-ÿ resultó con A. chilensis disminuyó estadísticamente este efecto, sugiriendo
en un la participación de NFAT en la expresión de Cox-2 (Fig. 2B).

Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/546

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Ojeda et al. Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon

Figura 2

Efecto de A. chilensis sobre la activación de NF-ÿB y NFAT. Las células Caco-2 se transfectaron transitoriamente con pGL3-
plásmidos NF-ÿB (A) o pNFAT (B) y pRL-TK durante 24 h, tratados con 50 ng/ml de A. chilensis o vehículo durante 30 min,
luego se añadió TNF-ÿ, PMA/Io o disolvente durante 16 H. La actividad de luciferasa se midió en un luminómetro. Cada barra
*
representa la media ± SE, n=3, p<0,05 en comparación con TNF-ÿ en (A) o PMA/Io en (B).

A. chilensis induce la degradación

ÿ ÿ de IB, la expresión
de c-fos, la fosforilación de ERK1/2 y Akt
Estudiamos el efecto de A. chilensis sobre NF-ÿB y sobre c-
fos, un componente del factor de transcripción AP-1. A.
chilensis se incubó por diferentes períodos de tiempo (0,
0.5, 1, 2, 4, 8 o 24 h) y se evaluó el nivel de IÿBÿ y c-fos
por inmunoblot. Evaluamos la activación de la vía NF-ÿB
por IÿBÿ
degradación, una proteína inhibidora de la traslocación de
NF-ÿB en el núcleo, que está regulada transcripcionalmente
por la vía de NF-ÿB. El inmunoblotting de IÿBÿ mostró que
A. chilensis redujo transitoriamente los niveles de esta
proteína entre las 2 y 4 h de incubación, sugiriendo
activación de NF-ÿB. Como control positivo se utilizó la
estimulación con TNF-ÿ y se evidenció una reducción en el
nivel de IÿBÿ
(Figura 3A). Por otro lado, las células Caco-2 no expresaron
c-fos en ausencia de estímulos, pero cuando las células
fueron tratadas con A. chilensis se observó un aumento en
la expresión de c-fos entre las 4 y 24 h de tratamiento
( Figura 3B).
Debido a que los factores de transcripción AP-1 y
NF-ÿB están controlados por la vía ERK1/2 MAPK y Akt,
las células Caco-2 se incubaron por diferentes tiempos (0
a 240 min) con A. chilensis, luego se fosforilaron con
ERK1/2 y Akt fue analizado por inmunoblot. En el tiempo 0
se observó una ligera fosforilación de ERK1/2, sin embargo,
el tratamiento por 2 y 4 h con A. chilensis mostró un
aumento en la fosforilación de ERK1/2, con un efecto
máximo a las 4 h (Figura 3C). Por otro lado, A. chilensis
indujo la fosforilación de Akt entre 30 y 120 min, con la
máxima intensidad a los 60 min (Figura 3D).

Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/547

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Ojeda et al. Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon

figura 3

Efecto de A. chilensis sobre la degradación de IÿBÿ , la expresión de c-fos y la fosforilación de ERK1/2 y Akt. Se incubaron células
Caco-2 con 50 ng/ml de A. chilensis durante diferentes tiempos y se prepararon extractos de proteínas citosólicas y se analizaron mediante
inmunotransferencia para detección de IÿBÿ (A) o se obtuvieron proteínas totales y se usaron para el análisis de c-fos ( B), fosforilación de
ERK1/2 (C) y Akt (D) por inmunotransferencia. Las transferencias se eliminaron y se volvieron a sondear con ÿ-tubulina, ÿ-actina o las
proteínas no fosforiladas, como control de carga. Imagen representativa de tres experimentos independientes.

Efecto de A. chilensis sobre la viabilidad celular en células Caco-2
El efecto de A. chilensis sobre la viabilidad celular se estudió
mediante la tinción con yoduro de propidio y anexina V y el ensayo MTT. inhibir la expresión de COX-2 en células HT-29 estimuladas con
Las células Caco2 se trataron con A. chilensis durante 24 hy se
evaluó la apoptosis mediante tinción con anexina V FITC y yoduro
de propidio. La Figura 4 (AC) muestra que, a las 24 h de tratamiento,
A. chilensis no indujo apoptosis temprana ni muerte de células
Caco-2 (se utilizó butirato como control muerto). El efecto de A.
chilensis
Se estudió la viabilidad de las células Caco-2 a diferentes tiempos
(24-96 h) mediante ensayo MTT. Las células Caco-2 tratadas con
A. chilensis no mostraron cambios en la viabilidad en comparación
con el control en ningún momento (Figura 4D).
DISCUSIÓN
Los efectos anticancerígenos de las bayas se han atribuido
principalmente a sus actividades antioxidantes y antiinflamatorias.
Los compuestos fenólicos, como las antocianinas, presentes en
diferentes bayas muestran una actividad antioxidante comparable
a la de los antioxidantes comerciales y una actividad inhibidora de
la ciclooxigenasa (Seeram et al., 2001). En nuestro estudio,
demostramos por primera vez que el jugo de bayas de A. chilensis
redujo la expresión basal de ARNm y proteína de COX-2 en la línea
celular de adenocarcinoma Caco-2. Esto podría explicarse por el
alto contenido de antocianinas en el jugo de A. chilensis . Varios
informes muestran que las antocianinas reducen la expresión de
COX-2 (Kang et al., 2008; Kim et al.
al., 2008; Muñoz-Espada et al., 2006; Tsoyi et al., 2008). Además,
también se ha observado la capacidad de las antocianidinas para
TPA (Kim et al., 2008) y en ratas alimentadas con extractos ricos
en antocianinas (Lala
et al., 2006). Además, los extractos ricos en antocianinas redujeron
los focos de criptas aberrantes en el cáncer de colon en ratas (Lala
et al., 2006). Los informes sugieren un papel esencial de la COX-2
en el cáncer de colon. COX-2 se sobreexpresa en el 40% de los
adenomas humanos y en el 80% de los adenocarcinomas en
relación con la mucosa normal (Eberhart et al., 1994; Kargman et
al., 1995; Kutchera
et al., 1996). La inhibición de la COX-2 con fármacos antiinflamatorios
no esteroideos (AINE) se ha propuesto en la quimioprevención del
cáncer (Antonakopoulos et al., 2007; Cha et al., 2007; Harris, 2009).
Varios estudios sugieren que los inhibidores COX-2 no selectivos o
selectivos producen una reducción significativa en el riesgo de
cáncer de colon (Chan et al., 2007; Harris et al., 2008; Huls et al.,
2003). Un efecto diferente de celecoxib, un inhibidor selectivo de la
COX-2, mostró una disminución en la expresión de ICAM-1 y
VCAM-1 en células HT-29, afectando las propiedades adhesivas
de las células (Dianzani
et al., 2008; Gallicchio et al., 2008). También se ha descrito que la
aspirina y el salicilato de sodio inhiben la expresión de COX-2
estimulada por VEGF en células de cáncer de colon (Shtivelband
et al., 2003). El mecanismo inhibitorio del salicilato sobre la
expresión de COX-2 ha

Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/548

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Ojeda et al. Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon

se ha descrito a través de la inhibición de la unión de CCAAT/ concentraciones suprafarmacológicas, actúa a través de la

proteína de unión potenciadora beta a la región promotora inhibición de la actividad de I(kappa)B quinasa-beta (Kopp
de COX-2 (Saunders et al., 2001); sin embargo, informes et al., 1994; Yin et al., 1998).
anteriores mostraron que el salicilato, en

Figura 4
Efecto de A. chilensis sobre la viabilidad celular. Las células Caco-2 se incubaron con A. chilensis o butirato 10 mM
durante 24 hy luego se tiñeron con AnnexinV-FITC y PI, o se analizaron mediante ensayo MTT. Las señales de AnnexinV-
FITC y PI se detectaron mediante citometría de flujo (AC) y el cristal de formazán producido a partir de MTT se registró en un
lector de microplacas (D). Cada barra representa la media ± SE, n=8. ** p<0,01 frente al control.

Evaluamos el efecto de A. chilensis en NF- sobre la expresión de COX-2 basal sugieren que NF-ÿB
activación de ÿB en células Caco-2, y observaron que A. podría desempeñar un papel menor en la expresión de
chilensis no modificó los niveles basales de actividad de NF- COX-2 basal en células Caco-2. Así, se han identificado
ÿB-luc ni la degradación de IÿBÿ a las 24 h de tratamiento. varios elementos reguladores transcripcionales potenciales
Este resultado y las observaciones del efecto de A. chilensis en la región flanqueante 5' del gen COX-2, incluido un
Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/549
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Ojeda et al.
elemento de respuesta del proliferador de peroxisoma
(PPRE), dos elementos de respuesta de AMP cíclico (CRE),
un elemento de respuesta de esterol (SRE), dos sitios NF-
ÿB, un sitio SP1, un motivo de proteína de unión al
potenciador CAAT (C/EBP), dos AP -2 sitios, un E-box,
TATA box y sitios NFAT (Corral et al., 2007; Duque et al.,
2005; Kang et al., 2007). Observamos que la activación de
NFAT inducida con PMA/Ionomicina fue reducida por A.
chilensis en células Caco-2. Además, no descartamos un
efecto inhibitorio de A. chilensis sobre la vía NF-ÿB.
Mostramos que A. chilensis redujo la actividad de NF-ÿB-luc
inducida por TNF-ÿ, lo que indica que A. chilensis puede
reducir la activación de NF-ÿB por citocinas proinflamatorias .
Un informe anterior mostró que el jugo de diferentes bayas
inhibía significativamente la expresión de NF-ÿB y COX-2 de
activación inducida por TNF-ÿ en líneas celulares de cáncer
de estómago, próstata, intestino y mama (Boivin et al., 2007).
Sorprendentemente, A. chilensis, en momentos cortos, indujo
IÿBÿ
degradación, sin embargo este efecto fue transitorio y volvió
al nivel basal a las 24 h.
La activación de NF-ÿB se regula a través de vías
de señalización intracelular como las cascadas PI3K/Akt y
MAPK (Kyriakis et al., 2001). Observamos que A. chilensis
aumentó transitoriamente la fosforilación de Akt y ERK1/2
después de 60 min y 240 min de incubación, respectivamente.
El efecto de A. chilensis sobre la fosforilación de Akt también
mostró una relación directa con el aumento de la degradación
de IÿBÿ y la localización nuclear de p65 NF-ÿB a las 4 h de
tratamiento, ya que se ha demostrado ampliamente que la
vía PI3K/Akt puede regular NF -Activación de ÿB (Kok et al.,
2009). También se ha propuesto que la vía PI3K regula la
expresión de COX-2. El uso de los inhibidores de PI3K
wortmannin y LY294002 reguló al alza la expresión de COX-2
en células HT-29 y Caco-2, y la activación de PI3K con IL-4
e IL-13 reguló a la baja la expresión de COX-2, lo que
demuestra que PI3K regula negativamente la expresión de
COX-2 en estas células (Weaver et al., 2001). Para evaluar
el
papel de PI3K en el efecto de A. chilensis sobre la expresión
de COX-2, se preincubaron células Caco-2 con el inhibidor
LY294002 y luego se estimularon con A. chilensis durante
24 h; sin embargo, no hubo diferencias entre los tratamientos
con A. chilensis o LY294002 más A. chilensis (datos no
mostrados). Un objetivo conocido aguas abajo de la cascada
ERK es el gen temprano inmediato c-fos, un componente del
factor de transcripción AP-1, que se expresa y activa a través
de MAPK (Buzzi et al., 2009; Kyriakis et al., 2001). Mostramos
que A. chilensis aumentó c-fos
Boletin Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas/550
Efecto de A. chilensis en células de cáncer de colon
expresión a partir de las 4 h de tratamiento, sin embargo
queda por estudiar el papel del incremento de expresión de
c-fos inducido con A. chilensis sobre células Caco-2. Por otro
lado, ERK1/2 MAPK se ha relacionado con la proliferación
de células Caco-2 (Buzzi et al., 2009), por lo que analizamos
si el aumento de la fosforilación de ERK1/2 podría estar
correlacionado con cambios en el ciclo celular, sin embargo ,
no observamos cambios por efecto de A. chilensis (datos no
mostrados).
Además, el tratamiento con A. chilensis a
concentraciones que redujeron la expresión de COX-2
(equivalente a 50 ng/ml de antocianina) no modificó la
viabilidad celular de las células Caco-2. Se ha estimado que
la ingesta diaria de antocianinas es de 12,5 mg/día/persona
en los Estados Unidos (Wu et al., 2006).
Por el contrario, concentraciones más altas de jugo de A.
chilensis afectaron la viabilidad celular e indujeron apoptosis
temprana y muerte en células de cáncer de colon (datos no
mostrados).
CONCLUSIONES
Mostramos que el jugo de bayas de A. chilensis podría
contener actividad antiinflamatoria en las células de cáncer
de colon, a través de la reducción en la expresión de COX-2.
Curiosamente, A. chilensis mostró un efecto rápido y
transitorio como estimulante celular. En conjunto, estos
resultados indican que el jugo de A. chilensis muestra efectos
diversos y distintivos en comparación con otras bayas
(Seeram, 2008), lo que podría ser atribuible a su composición.
RECONOCIMIENTO
Este trabajo fue apoyado por la subvención CTI-Salud CTE
06, CHILE.
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