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FASE 1

ANTE-PROYECTO
OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE ASPERGILLUS NIGER UTILIZANDO
MELAZA DE CAÑA DE AZÚCAR Y RESIDUOS CÍTRICOS COMO FUENTE DE
CARBONO.

CP-RG-07
Rev. 02
13-06-18

Av. Principal, Zona Industrial “Agustín Rivero”, La Independencia, Yaracuy. Aptdo. 100. Telefax: (0254) 231.33.92 -231.28.22-2319811-231.15.96 -
231.07.16. Correo Electrónico: ciepe@ciepe.gob.ve ginvestigacion@ciepe.gob.ve Pág. Web:
www.ciepe.gob.ve
I. DATOS GENERALES DEL PROYECTO

1.1 Título propuesto para el proyecto:

Obtención de ácido cítrico a partir de Aspergillus niger utilizando melaza de caña de


azúcar y residuos cítricos como fuente de carbono.

1.2 Palabras clave:


Aspergillus
Ácido cítrico Aditivo Melaza Prototipo
niger

1.3 Estatus del proyecto

Por Iniciar En Ejecución Por Reactivar

% Avance Físico % Avance Financiero

Fechas de Inicio Enero 2019 Diciembre 2019

Fecha de Culminación

1.4 Equipo responsable del proyecto:

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Thais del valle Gómez 7.593.961 División Frutas y Hortalizas


Nivel académico Especialidad Cargo
Tecnología de
procesamiento de frutas Investigador jefe de la División de
y hortalizas y frutas y Hortalizas
ingeniero en Alimentos
aseguramiento de la
calidad

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Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico Tipo de participación
proyecto (%)
tgomez@ciepe.gob.ve
0254-2313807
0254-2313392 gomezthaisv@gmail.co coordinador 30
m

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Efraín García 7.578.198 Biotecnología


Nivel académico Especialidad Cargo
Tecnología de
Personal de investigación de la División
M.Sc. en Biotecnología Alimentaria procesamiento,
de Biotecnología
aplicando biotecnología
Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico Tipo de participación
proyecto (%)
0254-2313807 efraing@ciepe.gob.ve
0254-2313392 Co- responsable 30

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

División Frutas y Hortalizas


Gabriel Gómez 18.757.655
Nivel académico Especialidad Cargo
Tecnología de Personal de investigación de la
Licenciado en Ciencia y Cultura de procesamiento de frutas División de Frutas y Hortalizas
la Alimentación y hortalizas
Tipo de Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico
participación proyecto (%)

0254-2313807 Personal
0254-2313392 ggomez@ciepe.gob.ve
técnico 50

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Mabeth Caro 20.178.939 División Frutas y Hortalizas

Nivel académico Especialidad Cargo


Tecnología de Personal de investigación de la
procesamiento de frutas División de Frutas y Hortalizas
Ingeniero Agroindustrial
y hortalizas
Tipo de Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico
participación proyecto (%)

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231.07.16. Correo Electrónico: ciepe@ciepe.gob.ve ginvestigacion@ciepe.gob.ve Pág. Web:
www.ciepe.gob.ve
0426-3550074 0254-2313807 mcaro@ciepe.gob.ve Personal
técnico 50

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Adriana Duran 18.053.587 División Frutas y Hortalizas

Nivel académico Especialidad Cargo


Tecnología de Personal de investigación de la
Técnico Superior Universitario en procesamiento de frutas División de Frutas y Hortalizas
Alimentos y hortalizas
Tipo de Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico
participación proyecto (%)
0416-1511944 0254-2313807 aduran@ciepe.gob.ve Personal
técnico 50

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Darlene Peralta División de Biotecnología


Nivel académico Especialidad Cargo
Magister en Biotecnología Alimentaria Biotecnología Alimentaria PII
Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico Tipo de participación
proyecto (%)
dperalta@ciepe.gob.ve Participante 30

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Belkys Tovar 7.556.886 Biotecnología


Nivel académico Especialidad Cargo
TSU Tecnología de Alimentos PI.
Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico Tipo de participación
proyecto (%)
0424-5049411 0254- 2313807 btovar@ciepe.gob.ve Participante 40

Nombres y Apellidos Cédula de identidad Unidad a la que pertenece

Thay Veliz División de Biotecnología


Nivel académico Especialidad Cargo
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www.ciepe.gob.ve
Ingeniera PII
Tiempo que dedicará al
Teléfono Fax Correo electrónico Tipo de participación
proyecto (%)
thayzv@ciepe.gob.ve Participante 30

1.5 Instituciones Participantes:

Denominación de la Institución Siglas Dependencia


Ministerio del Poder Popular para
Centro de Investigaciones del Estado para
CIEPE Educación Universitaria, Ciencia y
la Producción Experimental Agroindustrial
Tecnología.
Dirección Teléfono y Fax Correo electrónico
Av. Principal, Zona Industrial “Agustín
(0254)2312822/
Rivero”, La Independencia, San Felipe, ciepe@ciepe.gob.ve
(0254)2313807
Edo. Yaracuy

1.6 Entidad Proponente:

Denominación de la Institución Siglas Dependencia


Ministerio del Poder Popular para
Centro de Investigaciones del Estado para
CIEPE Educación Universitaria, Ciencia y
la Producción Experimental Agroindustrial
Tecnología.
Dirección Teléfono y Fax Correo electrónico
Av. Principal, Zona Industrial “Agustín
(0254)2312822/
Rivero”, La Independencia, San Felipe, ciepe@ciepe.gob.ve
(0254)2313807
Edo. Yaracuy

1.7 Unidad Administradora:

Denominación de la Institución Siglas Dependencia


Ministerio del Poder Popular para
Centro de Investigaciones del Estado para
CIEPE Educación Universitaria, Ciencia y
la Producción Experimental Agroindustrial
Tecnología.
Dirección Teléfono y Fax Correo electrónico
Av. Principal, Zona Industrial “Agustín
(0254)2312822/
Rivero”, La Independencia, San Felipe, ciepe@ciepe.gob.ve
(0254)2313807
Edo. Yaracuy

1.8 Recursos Financieros del Proyecto:


Partida Presupuestaria Monto Estimado
Personal (SOLO POR HP) 800.000.000
Materiales, Suministros y Equipos Menores 961.680.000
Maquinarias y Equipos (Activos)
Servicios 1.772.201.600

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Transferencias y Donaciones
Otros Gastos
Total Recursos Financieros 3.553.881.600
*Especificar el tipo de gasto requerido

1.9 Transferencia de Recursos Financieros a otras instituciones por parte de CIEPE

Institución que
Monto a Transferir Institución que recibe Acción a Ejecutar
Transfiere
N/A N/A N/A N/A

1.10 Aportes de Recursos Financieros de otras instituciones al CIEPE

Institución que
Monto a Transferir Institución que recibe Acción a Ejecutar
Transfiere
Ministerio de Adscripción Fundación CIEPE Obtener de ácido cítrico
a partir de Aspergillus
niger utilizando melaza
de caña de azúcar y
residuos cítricos como
fuente de carbono.

II. DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO

2.1 BREVE RESUMEN

El ácido cítrico es un ácido orgánico de amplio uso en la industria de alimentos, se trata de


un ácido considerado “GRAS" (reconocido como seguro). Por lo general en Venezuela, el
ácido cítrico, es adquirido a través de Divisas. Con la ejecución de este proyecto se busca
definir la tecnología a escala de laboratorio para definir el proceso de producción de ácido
cítrico mediante la producción metabólica del Aspergillus niger, utilizando melaza obtenida
del jugo de la caña de azúcar y de los residuos generados del procesamiento de cítricos
como fuente de carbono, cuyo sustrato será metabolizado por el moho Aspergillus niger
para la producción de ácido cítrico como metabolito el cual posteriormente sera separado,
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refinado y purificado aplicando técnicas de proceso unitario hasta lograr un producto de alta
pureza, de esta manera se podrá colocar a la disposición el diseño tecnológico de un proto-
tipo para el estado o algún ente que pueda financiar y cristalizar a escala industrial el logro
alcanzado con este proyecto y que será de gran utilidad como insumo para la industria ali-
mentaria, farmacéutica y química por la versatilidad de su aplicación.

2.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El ácido cítrico es muy utilizado como conservante y aditivo alimentario en la industria ali-
mentaria Nacional. Actualmente Venezuela pasa por una grave situación económica por el
bloqueo económico que se mantiene, por ello se ha generado el aumento progresivo de
precios y la disminución al acceso en el mercado, principalmente de productos importados
como es el caso de los insumos y reactivos químicos empleados en el procesamiento de
alimentos, provocando con ello que se dificulte la adquisición de estos por los altos cos-
tos. A nivel industrial, el ácido cítrico es uno de los insumos que con mayor frecuencia se
utilizan en diversos procesos tecnológicos, el cual es utilizado como conservante y aditivo
alimenticio, por sus propiedades antioxidantes, reguladoras de color, regulador de acidez
y potenciador del sabor. Gracias a la importancia del uso de este ácido en la industria, se
genera la necesidad de producción de este insumo para obtener acceso a este a un me-
nor costo, ya que los altos costos y la dependencia de importación de este insumo, atenta
contra la soberanía alimentaria y el desarrollo endógeno sustentable del país.

2.3 OBJETIVO GENERAL

Obtener ácido cítrico a partir de Aspergillus niger utilizando melaza obtenida a partir de la
caña de azúcar y residuos generados del procesamiento de cítricos como fuente de car-
bono, para ser utilizado en la industria alimentaria.

2.4 FASES DEL PROYECTO

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Fase I: Caracterización de materia prima a ser utilizada en la obtención de ácido cítrico a
partir del Aspergillus niger a nivel de laboratorio.
Fase II: Desarrollo del proceso de fermentación del Aspergillus niger para la obtención de
ácido cítrico a partir de melaza de caña y residuos cítricos.
Fase III: Desarrollo de los procesos unitarios para la purificación del ácido cítrico producido
por el Aspergillus niger.
Fase IV: Caracterización del ácido cítrico obtenido.

2.5 ALCANCE

Desarrollar un prototipo tecnológico a escala de laboratorio para la obtención de ácido cítri-


co a partir de melaza de caña de azúcar y residuos cítricos empleando la tecnología de fer-
mentación en las instalaciones de los Laboratorios de Biotecnología y Frutas y Hortalizas
de la Fundación CIEPE.

2.6 PREMISAS Y RESTRICCIONES

Premisas:
 Presencia de normas, leyes e instituciones que velan y promueven la evaluación,
aceptación y aseguramiento de la calidad e inocuidad de los aditivos y conservantes
alimentarios.
 Personal formado en el área de biotecnología y en el procesamiento de alimentos,
para llevar a cabo el desarrollo del proyecto.
 Infraestructura, cepa, equipos, reactivos con el que se puede ejecutar el proyecto

Restricciones:
 Disponibilidad y tiempos de entrega asociados a la adquisición de materia prima,
insumos materiales, repuestos especializados para el desarrollo de la investigación.
 El presupuesto disponible se vea afectado por la situación hiper inflacionaria existente.
 Falla irreparable de algún equipo que pueda afectar el desarrollo de la investigación.
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2.7 ANÁLISIS DE RIESGOS

 Incumplimiento de la meta establecida para la culminación del proyecto, debido a


factores externos o internos como presupuesto, materiales e insumos, etc.
 Insuficiencia presupuestaria por inflación.
 Problemas relacionados con el microorganismo en estudio, insumos, materiales, equi-
pos que puedan afectar el feliz termino de la investigación.

2.7.1 ACCIONES PARA ABORDAR LOS RIESGOS

 Solicitar con tiempo el personal requerido para el desarrollo del proyecto.


 Establecer contacto con proveedores puntuales con anterioridad para eliminar
retrasos en el cumplimiento de las metas.
 Ajustar la planificación de acciones a fin de dar cumplimiento a los objetivos.
 Priorizar los requerimientos e insumos solicitados.

2.8 METODOLOGÍA A UTILIZAR

Para el desarrollo del siguiente proyecto se plantea utilizar técnicas apropiadas para la
obtención de ácido cítrico por vía fermentativa adaptadas a la disponibilidad de equipos de
los Laboratorios de la División de Frutas y Hortalizas y Microbiología Experimental de la
División de Biotecnología de la Fundación CIEPE, utilización de normas venezolanas e
internacionales, antecedentes relacionados al tema y para ello se plantean las siguientes
actividades:

1. Caracterización de la materia prima a utilizar como fuente de carbono.


Caracterización de la fuente de carbono.

Muestreo de la melaza a utilizar como materia prima para ello se harán los contactos y
muestreo para la adquisición de las mismas, las cuales se llevaran a los laboratorios de
análisis físico químicos para ser analizadas y determinar su composición en el contenido

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de azucares reductores, no reductores, minerales y otros componentes que pueden ser de
interés para el metabolismo del hongo en estudio, como es la presencia de fósforo, nitró-
geno, entre otros, para ellos se hará uso de los métodos analíticos utilizando las normas
COVENIN o la utilización de alguna otra norma internacional o en su defecto la contrata-
ción de algún laboratorio que nos pueda suministrar el servicio.

2. Desarrollo del proceso de fermentación del Aspergillus niger para la obtención


de ácido cítrico utilizando melaza de caña y residuos citricos.

Repique y puesta en crecimiento la cepa de Aspergillus niger ubicada en el cepario del la-
boratorio de biotecnología.
Definir la curva de crecimiento del Aspergillus niger, a fin de determinar el tiempo en que se
alcanza un nivel de conidios de diez a la seis, diez a la ocho.
Estudio de diferentes concentraciones de melaza como fuentes de carbono utilizando con-
cha de naranja como inductor para la obtención de ácido cítrico por vía fermentativa.
Evaluación de los rendimientos que arrojan las diferentes concentraciones de fuente de car-
bono para la obtención de ácido cítrico por vía fermentativa.
Definir la tecnología de recuperación del ácido cítrico obtenido del metabolismo microbiano
del Aspergillus niger.
Evaluación de la calidad, física, química y microbiológica del producto terminado y deter-
minar los reajuste de la formulación.
Determinar los rendimientos de ácido cítrico obtenido.

Reproducción de la cepa del Aspergillus niger.

Para la reproducción de la cepa del microorganismo Aspergillus niger, la cual se reprodu-


cirá conforme a los requerimientos descritos en la ficha técnica adjunta al microorganismo,
se prepara un medio de cultivo PDA (Patata Dextrosa Agar) en el que se sembrará la
cepa de Aspergillus niger, se incubará a temperatura de 28 ± 1 °C por un tiempo de 72 ho-
ras.

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Etapa de fermentación

Tras el acondicionamiento y la esterilización del medio de cultivo dentro del equipo de


fermentación, se introduce el starter o inoculó, el cual comenzará a crecer en un medio
rico en nutrientes, aireado y agitado convenientemente, la aireación y agitación son
esenciales para el correcto crecimiento del cultivo.

A lo largo del ciclo fermentativo, de 144 horas de duración, el microorganismo crecerá


hasta alcanzar la fase terminal de desarrollo, donde tiene lugar en mayor medida la
producción de ácido cítrico. Con el fin de maximizar la producción, se controla a lo largo
del proceso una serie de factores como son temperatura, pH, grado de agitación, grado de
aireación...etc, no controlar estos factores da lugar a una menor producción de ácido
cítrico.

Para esta etapa se utilizará un biorreactor el cual consta de: un frasco de fermentación de
doble camisa de vidrio con una capacidad de trabajo de 2 litros, dentro del cual se
encuentra un agitador de aspas accionado por un rotor conectado a un regulador de
velocidad de rotación 35 (rpm), un dispositivo de aireación que se conecta a una de las
válvulas de entrada del equipo, el equipo además cuenta con un sistema de recirculación
de agua para el control de temperatura, que puede ser regulado a la disposición que se
requiera, adicional a esto, se dispone de un potenciómetro el cual consta de dos sondas
encargadas de la medición de pH y temperatura.

Para la fermentación se preparará una solución que actuará como sustrato para el desa-
rrollo del microorganismo, que consta de melaza de caña de azúcar y de agua destilada,
se acidificará con ácido fosfórico hasta llegar a un pH entre 3,5 – 4,5 y se agregara nitrato
de amonio como nutriente según la ficha técnica del microorganismo, se esterilizará en el
autoclave a 121 °C, 15 psi, 15 min, una vez enfriado se colocara en el fermentador previa-
mente esterilizado. Se realizará un raspado de esporas de acuerdo a la cantidad con que
se desee para el tratamiento, esto se inocula en la solución sustrato y se inicia la fermen-
tación en las siguientes condiciones: temperatura de 28 °C y 30 °C, 200 rpm y 250 rpm
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respectivamente, aireación, por un tiempo ≥ 6 días. La toma de datos se realizara cada 8
horas durante toda la etapa de fermentación.
3. Desarrollo de los procesos unitarios para la purificación del ácido cítrico produci-
do por el Aspergillus niger.
Etapa de recuperación del ácido cítrico.

Una vez terminado el proceso fermentativo se separa el ácido cítrico del resto de
componentes del caldo post-fermentativo. En primer lugar, se separa el micelio,
compuesto por células muertas de Aspergillus niger, del resto del caldo mediante un
proceso de filtración. En segundo lugar se realiza el llamado proceso cal-sulfúrico que
consiste en mezclar el caldo post-fermentativo con una lechada de cal, lo cual ocasiona
que se forme la sal de calcio del ácido cítrico, el citrato cálcico, que precipita y se separa
mediante otra filtración.

El citrato cálcico se descompone al mezclarlo con ácido sulfúrico, quedando ya el ácido


cítrico libre y un residuo sólido de sulfato cálcico que se separa mediante filtración.

El liquido de fermentación será sometido a filtrado en papel Whatman n° 1 para remover el


micelio, el liquido filtrado se someterá a precipitación con hidróxido de calcio para dar lu-
gar a la formación de citrato de calcio, a una temperatura de 60 - 65 °C. Después de la
neutralización el citrato de calcio se filtrara y se lavara para remover los azúcares adheri-
dos. Seguidamente el citrato de calcio se acidulará con ácido sulfúrico concentrado para
alcanzar un pequeño exceso de ácido al final de la operación, removiendo un precipitado
de sulfato de calcio formado y es separado por filtración.

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La solución de ácido cítrico es purificada por decoloración y desmineralización, este paso
envuelve una filtración con carbón activado,

El ácido cítrico desmineralizado es concentrado en un evaporador de vacío, a una tempe-


ratura de 60 – 70 °C, a una densidad de 42 °Be y luego enfriada. El residuo se separa en
caliente en una centrífuga y los cristales son lavados y secados a una temperatura supe-
rior de 36 °C. El remanente del licor madre separado de la centrifuga se reciclará al siste-
ma de recuperación antes de la adición del hidróxido de calcio.

Variables a evaluarse:

 pH.

 Variable de rendimiento de ácido cítrico.

 Temperatura.

 Humedad del producto terminado.

 Variable tiempo de fermentación.

 Variable pureza del producto terminado

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PURIFICACIÓN

Tras el proceso cal-sulfúrico nos encontramos con el ácido cítrico ya separado de las
impurezas del caldo post-fermentativo, pero se presenta en dilución con gran cantidad de
agua. Para obtener el producto sólido de esta disolución se efectúa un proceso de
evaporación y cristalización mediante el cual la disolución de ácido cítrico pasa a un
evaporador de doble efecto que retirará el agua necesaria para que en el cristalizador la
disolución llegue al punto de saturación y se formen los cristales de ácido cítrico.

Los cristales formados en el proceso de cristalización aun contienen humedad, la cual ha


de ser retirada antes de proceder al envasado del producto, ya que el consumidor
demanda un producto seco, por lo tanto, para retirar esta humedad, se realiza una
centrifugación y posteriormente un secado del producto lo que retirará toda el agua
sobrante quedando el ácido cítrico en forma granular listo para ser empaquetado para su
transporte.

4. Caracterización del ácido cítrico obtenido.

Tras el proceso de deshidratación del producto se tomara muestra representativa y se so-


meterá a caracterización físico química y microbiología con lo cual se determinará su com-
posición y la inocuidad del mismo, para ello se llevaran muestras a los laboratorios respecti-
vos para la aplicación de normas COVENIN y normas internacionales.

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III. OBJETIVO GENERAL, OBJETIVOS ESPECIFICOS, METAS Y ACCIONES

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IV. RESULTADOS ESPERADOS (BIENES O SERVICIOS)

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Productos o Servicios Indicador de Efectividad
Prototipo tecnológico desarrollado para la producción de ácido cítrico Tecnologías desarrolladas / tecnologías
planificadas

V. LOCALIZACIÓN POLÍTICO-ADMINISTRATIVA
Estado Municipio Centro Poblado
Yaracuy, Distrito Independencia, Yaritagua, Independencia, la Morita,
Federal Bolívar, Veroes, Cocorote, Yumare, Yaritagua
Caracas

VI. IMPACTOS
6.1) Efectos a futuro del Proyecto:
Disponibilidad de una tecnología propia para la producción de ácido cítrico a nivel de 10 litros de fermentación y un
rendimiento de producción de 7 gramos por litro de solución.

6.2) Impacto Institucional y Social


Proporcionar una tecnología para escalamiento industrial con los estándares de calidad y empleando materias pri-
mas nacionales.

Científico Social
Ponderación Metas Relacionadas Ponderación Metas Relacionadas
6.2.1) INSTITUCIONAL
M1-M2-M3-M4-M5-
100% NA NA
M6-M7-M8-M9
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Beneficiarios del Proyecto:

Beneficiarios del proyecto


Tipos Directos Indirectos Población Objetivo
MPPCTII 1 2 3
6.2.2) SOCIAL
Empleos generados por el proyecto Géneros
Directos Indirectos Varones Hembras
2 4 2 2

VII. N° DE PUBLICACIONES ESPERADAS

N° TOTAL A NIVEL CIENTIFI- A NIVEL DIVULGATIVO A NIVEL DE CONGRESOS


CO
2 1 1 0

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS

 Sierra, A. y Gonzalez, A. (2018). Aplicaciones biotecnológicas de microorganismos genéticamente modificados


en la producción industrial de ácido ascórbico. Colombia.
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ciepe@ciepe.gob.ve ginvestigacion@ciepe.gob.ve Pág. Web: www.ciepe.gob.ve
 Pérez, O. Ley, N. Rodriguez, K. y Gonzalez, E. (2016). Oportunidades de producción de ácido cítrico por vía
fermentativa a partir de sustratos azucarados en cuba. Revista Centro Azúcar, Vol. 43, N° 2, Abril- Junio 2016,
pp 85-99. Cuba.
 Pérez, M. (1984). Producción de ácido cítrico. Venezuela.

29/06/2018 Tahis Gomez/ Efrain García

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