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Tema 23
Biotecnología

CONTROL DE LOS PRODUCTOS BIOTECNOLÓGICOS

Y BIOSEGURIDAD
 Objetivos
Aprender los requisitos especiales en la fabricación de productos.

Minimizar los riesgos de contaminación microbiana, del personal y equipos de elaboración.

Conocer la importancia de Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP).

Peligro de los Microorganismos

Yersinia pestis
Escherichia coli MC4100 HBV

Ebolavirus
Guerra Biológica

Mundo Antiguo (peste, cornezuelo, etc) 1500 a.C.

Medievo (peste en catapultas y atar a cadáveres)
…
Siglo XX: Desarrollo de Microbiología
WWII:
China : Japón (Antrax, y otros)
EE.UU. Reino Unido y Canadá
Tularemia
Antrax
Brucelosis
Toxina Botulismo
George W. Merck:
Farmacéutico
1er director de Fort Detrick
Reino Unido: Porton Down

Guerra Fría: 1946-1972
Israel infecta pozos de Gaza con Tifus
EE.UU. Operación Batablanca (objetores)
Brucella
Vectores: Pulgas: peste
Mosquitos: Fiebre Amarilla
BMBL: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories

1955: Reunión Militar para compartir conocimientos sobre seguridad biológica.

1966: Conferencia Militar y Civil (Universidades, Hospitales y laboratorios privados)

1977: Clasificación de microorganismos en función de su riesgo biológico
Medidas de Seguridad con Virus Oncogénicos (3 niveles de contención)

1978: Pike y Sulkin: 4.079 LAIs (Laboratory-associated infections) 168 muertes (1930-1978)
Brucella spp., Coxiella burnetii, virus de la hepatitis B (HBV), Salmonella typhi, Francisella tularensis,
Mycobacterium tuberculosis, Blastomyces dermatitidis, Virus de la encefalitis venezolana,
Chlamydia psittaci, y Coccidioides immitis

1984: Publicación del BMBL en Fort Detrick: www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/
Riesgos
Precauciones recomendadas manejo de patógenos humanos y animales
Niveles de contención BSL1-4

2004: Requisitos de Confinamiento de OMG. Real Decreto 178/2004.
Comisión Nacional de Bioseguridad

2016: Propuesta EHSI por Vilchez et al.

BMBL: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories:
http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/
BMBL: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories:
http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/

TRABAJO AUTÓNOMO
Descargar BMBL
y leer Capítulo IV
BMBL: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories

Descripción de los Riesgos Manejo de Patógenos Humanos y Animales

Precauciones Recomendadas
Niveles de Contención adecuados Instalaciones Para Albergar Vertebrados

Si el agente supone un riesgo para personal de laboratorio

Si tiene alto potencial para producir LAIs (aunque no haya casos documentados)

Si causa enfermedades graves è Si supone riesgo para resto de población.

ESTRUCTURA: 8 SECCIONES y 12 APENDICES

SECCIÓN I: Introducción de cómo se ha gestado este manual

SECCIÓN II: Características del Riesgo de los Agentes: 4 Grupos de Riesgo
ESTRUCTURA: 8 SECCIONES y 12 APENDICES
Barreras Primarias (EPI)
SECCIÓN III: Manual de Buenas Prácticas; Equipos de Seguridad
Barreras Secundarias

Normas de trabajo
SECCIÓN IV: 4 Niveles de Bioseguridad Equipos de Protección
Requerimientos Especiales del Laboratorio

SECCIÓN V: Trabajo con Animales (4 niveles de Bioseguridad con Animales)

Metodología de Control de Riesgos
SECCIÓN VI: Bioprotección del Laboratorio
Sistema de Bioprotección del Laboratorio

SECCIÓN VII: Protocolos Médicos en Bioprotección (Vacunas, revisiones, cobertura)
Características del Agente
SECCIÓN VIII: Describe cada Agente Biológico Infecciones en el Lab y en Naturaleza
Medidas Preventivas y de Contención
Grupos de Riesgos de los Microorganismos

GRUPO DE RIESGO 1:
No se han descrito como causantes de enfermedades en personas sanas
Se trabaja con ellos en BSL-1.

GRUPO DE RIESGO 2: ingestión
Pueden producir enfermedades si se introducen vía percutánea
Enfermedades de Riesgo Medio vía membrana mucosa
Se trabajo con ellos en BSL-2

GRUPO DE RIESGO 3:
Causan enfermedades graves
Potencialmente Letales
Se transmiten por vía aerosólica

GRUPO DE RIESGO 4:
Agentes de alto riesgo de transmitir enfermedades letales
Se transmiten por aerosoles
NO EXISTE TRATAMIENTO EN LA ACTUALIDAD
 TRABAJO AUTÓNOMO
En base al 1er Trabajo Autónomo: Buscar los Grupos de Riesgo Biológico al que pertenecen
los siguientes microorganismos:
A.- Vibrio cholerae CECT512 B.- Aspergillus niger CECT2088 C.- Xanthomonas campestris
D.- Pseudomonas aeruginosa E.- Salmonella typhi (409 T) F.- Clostridium botulinum CECT551

En base a la Sección III del BMBL contestar para cada microorganismo:
1.- ¿En qué tipo de BSL se ha de trabajar?
2.- ¿Cuándo hay que lavarse las manos?
3.- ¿Con qué cepas se permite pipetear con la boca? ¿Y maquillarse? ¿Y manipular lentillas?
4.- ¿Qué se hace con los restos de cultivos?
5.- ¿En qué BSL ha de haber un programa de desinsectación y contra roedores?
6.- ¿Con qué cepa no se permite el acceso a personas con riesgo de infectarse?
7.- ¿Con qué cepa el personal tiene que tener una formación específica
para el trabajo con patógenos?
8.- ¿Con qué cepa se debería vacunar el personal?
9.- ¿Con qué cepas se ha de trabajar en laboratorios con puertas de cierre automático?
10.- ¿Con qué cepas se requiere que las ventanas estén selladas?
11.- ¿Con qué cepas se debería trabajar en un laboratorio con lavabo automático
o que no requiera usarse con las manos?

Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP).

Hazard Analysis and Critical Control Points

Identifica Peligros y toma medidas.
Existen varios modelos (p.ej. HACCP para Alimentos):
Evaluar el riesgo
Establecer medidas
Análisis de Vulnerabilidad
Mejora
HACCP de Riesgo Biológico:
1.- Identificar y clasificar los agentes biológicos y toxinas
2.- Identificar y priorizar el tratamiento para esos agentes
3.- Analizar el Riesgo de distintos escenarios de seguridad
4.- Diseñar y desarrollar un programa general de control de riesgos
5.- Evaluar regularmente los objetivos de protección
6.- Verificación del Sistema
7.- Registro de Datos
Análisis de Riesgos y Control de Puntos Críticos (HACCP).

HACCP de Riesgo Biológico:

PASO 1.- Identificar y clasificar los agentes biológicos y toxinas:
¿Qué agentes hay?
Forma (aerosoles, suspensión líquida, criogenizado, liofilizado, etc).
Localización (frigo con comida, cerca de un extractor, colegios…)
Cantidades (écantidad: ériesgo)
Consecuencias de un uso incorrecto (negligente o intencionado)

PASO 2.- Identificar y Priorizar las amenazas de sustancias biológicas
Personas de la institución (falta de formación, uso malintencionado)
Personas externas (visitantes, curiosos, ladrones, terroristas…)

PASO 3.- Analizar el Riesgo de Casos de Seguridad Específicos
Qué se haría en el caso de que ocurriesen fallos en el sistema

Experimentación con Animales

PRINCIPIOS DE LAS 3Rs

REDUCCIÓN: Reducir el número de animales que se utilizan. Utilizar estudios estadísticos.


REEMPLAZAMIENTO: Si se puede evitar utilizar MODELOS alternativos. En caso contrario
utilizar los animales más sencillos (pez->ratón->rata->gato->perro->primates).


REFINAMIENTO: Tomar las medidas necesarias para evitar el sufrimiento animal.
Medidas de Confinamiento (espacios, alimentos, actividades sociales, etc).
Reducción del Estrés
Analgésicos y anestésicos.
Eutanasia.

Organismos Manipulados Genéticamente
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

Focus Change
European Parliament and the
Council of the European Union :

New Regulations for 2017

Current Regulation

(EC) No 2003/2003:
Regulates correct use of materials
to provide nutrients to plants.

(EC) No 1107/2009:
Plant Protection products may
involve risks and hazards for
humans, animals and the
environment…
…Authorisation of Plant Protection Products
SHOULD be HARMONISED
Índice de Seguridad Ambiental y Humana
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

Interactions with the Environment

THE SOIL FOOD WEB

Arthropods
Shredders
Arthropods Higher Animals
Predators Predators

Plants Nematodes
Organic Root-feeder
Matter
Microorganisms
Earthworms Humans
First Second Third Fourth Fifth & higher
Trophic Level: Trophic Level: Trophic Level: Trophic Level: Trophic Levels
Photosynthesiszers Decomposers Shredders, Higher level Higher level
Predators, Grazers Predators Predators
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

1st Trophic Level: Photosynthesiszers

Regulation No 1107/2009 the microorganisms “present a clear benefit for plant production”.
FW: Fresh Weight RWC: Relative Water Content
DW: Dry Weight
(FW-DW)
FTW: Fully Turgid Weight RWC=
RL: Root Length (FTW-DW)
SL: Shoot Length

14
Dry Weight (mg) 12
10
8
6
4
2
0
P. putida B. cepacia Uninoculated
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

2nd Trph Level: Microbiota

Decomposer
Natural PGPB: Control other pathogens, production of biomolecules that
enhance plants growth, removal of toxics and nutrients assimilation.

Escherichia coli MC4100: Laboratory Model Bacteria -> Survival.

Vibrio fischeri ATCC 49387: Microtox® -> Metabolism Health.
O2
NAD(P) + FMNH2 RCHO NAD(P)+ + AMP + PPi

Flavin reductase Luciferase Fatty acid synthesis (luxD) +
(luxG) (luxAB) Reductase (luxCE) complex


NAD(P)H+H+ FMN RCOOH NAD(P)H + ATP
H2O + hν (490nm)

2 PGPB models: Pseudomonas putida KT2440 and Burkholderia cepacia CC-A174
GRASS: SAFE Risk Group 2 Strain
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

SURVIVAL TEST
2 Trph Level: Microbiota
nd

PGPB Candidates 0,5 ml sterile supernatant

mid-log
1,5 h
120
5 ml (108-109 UFC)
E. coli MC4100 100

80
% Survival

Small et al., 1994 60 *

Peters et al., 2003 40

20

0
P. putida B. cepacia E. coli MC400 E. coli MC400
KT2440 (1xM9) (TSB)
 Índice de Seguridad Ambiental y Humana

METABOLIC TEST
2 Trph Level: Microbiota
nd

PGPB Candidates 1 ml sterile supernatant

Stationary
5 min

10 μl (approx 104 UFC)

P. putida KT2440 B. cepacia CC-A174 TSB
Vibrio fischeri 100
90
80
Onorati & Mecozzi, 2004
EC50 (%)

70
60
23.75% ± 2.31
50
40 77.81% ± 2.02
30
20
10
0
0,5 5,63 11,25 22,5 45 90 100
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

2 Trophic Level: Nematodes

nd

Natural Decomposer (Bioindicator of soil health) >300 eggs/plate

Model for human infectious diseases Generation time: 1 week
Easy cultivation
Laid Eggs
Juveniles
Adults
Dead bodies
PGPB Candidates PDA Plates 5 pre-adult 1 week
1000 C. elegans 20oC
Darby et al., 1999,
Ruiz-Diez et al., 2003 P. putida
KT2440
Navas et al., 2007
100 B. cepacia
# of individuals

E. coli OP50

10
Adults

1
0h 24h 48h 72h 96h 168h
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

2 Trophic Level: Earthworms

nd

Natural Decomposer (Bioindicator of soil health), microbial controllers

Model for human infectious diseases

Length
Weight
Clitellum formation
# Ootheca and # Juveniles
PGPB Candidates 10 Earthworms 30-60 days
108 CFU
Ensayo Guía OECD No. 222 (OECD, 2004)
Day 0
Neuhauser & Callahan, 1990 1
Day 30
0,8 Day 60
Weight (g)

0,6
Highly resistant to infections
0,4
Sensitive to toxics
0,2

0
P. putida KT2440 B. cepacia Trehalose NaCl 2%
 Índice de Seguridad Ambiental y Humana

3 Trophic Level: Lower Predators

rd

Natural pests controllers

Model of supraedafic Organisms

Length
Adalia bipunctata Weight
& Mortality
PGPB Candidates 0, 7 & 15 days
108 CFU Chrysoperla carnea

Medina et al., 2004 12

Day 0
Alvarez-Alfageme et al., 2011 10
Day 7
8
Weight (mg)

Day 15
6
4
2
0
P. putida KT2440 B. cepacia Treh
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

3 Trophic Level: Lower Predators

rd

Natural pests controllers

Model of supraedafic Organisms

Length
Adalia bipunctata Weight
& Mortality
PGPB Candidates 0, 7 & 15 days
108 CFU Chrysoperla carnea
5

3
mg

0
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

Other Ecological Niches

Aquatic Environments
Model of Toxicity 5 individuals

PGPB Candidates 24-48 h

ISO 6341
OECD No. 211
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

4 Trop Level: Higher LevelPredators

th

Vertebrate and Mammal

Natural pests controllers
Model of human diseases
Body Weight

# Deaths
PGPB Candidates 5 Mus musculus CD1 7 & 14 days
109 CFU 29
28
Stelma et al., 1987
27
26 Day 0
Final Weight (g)

25
24 Day 7

23
Day 14
22
21
20
P. putida B. cepacia 0.1% Peptone
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

4 Trop Level: Higher LevelPredators

th

Vertebrate and Mammal

Natural pests controllers
Model of human diseases
Body Weight

# Deaths
PGPB Candidates 5 Mus musculus CD1 7 & 14 days
109 CFU # Deaths
Stelma et al., 1987 4

0
P. putida B. cepacia 0.1% Peptone
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

EHSI: Environmental and Human Safety

Index P. putida B. cepacia TOTAL
SURVIVAL TEST (CFU/ml) 10 5 10
METABOLIC TEST (EC50) 5 1.25 5
# Adults 6 1.5 6
# Juveniles 10.5 2.6 10.5
# Eggs 6 1.5 6
# Deaths 25 6.25 25
Length 1 1 1
Weight 2 2 2
# Deaths 3.75 3.75 3.75
Length 1 1 1
Weight 2 2 2
# Deaths 3.75 3.75 3.75
Weigth 3 3 3
# Juveniles 4.5 4.5 4.5
# Ootheca 3 3 3
EC50 5.625 5.625 7.5
Shoot length 1 1 1
Dry Weight 2 2 2
RWC 1 1 1
TOTAL: 98.125 50 100
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

EHSI vs Mice Tests

P. putida B. cepacia TOTAL
ESHI TOTAL: 98.125 50 100

Final Weight 15 15 15
Weight Gain 35 8.75 35
# Deaths 50 25 50
TOTAL: 100 48.75 100
Índice de Seguridad Ambiental y Humana

EHSI of different strains

Índice de Seguridad Ambiental y Humana

Modular System
P. putida B. cepacia TOTAL
SURVIVAL TEST (CFU/ml) 10 5 10
METABOLIC TEST (EC50) 5 1.25 5
# Adults 6 1.5 6
# Juveniles 10.5 2.6 10.5
# Eggs 6 1.5 6
# Deaths 25 6.25 25
Length 1 1 1
Weight 2 2 2
# Deaths 3.75 3.75 3.75
Length 1 1 1
Weight 2 2 2
# Deaths 3.75 3.75 3.75
Weigth 3 3 3
# Juveniles 4.5 4.5 4.5
# Ootheca 3 3 3
EC50 5.625 5.625 7.5
Shoot length 1 1 1
Dry Weight 2 2 2
RWC 1 1 1
TOTAL: 98.125 50 100
Useful for other intentional releases

Bioremediation
Biomining
Snowmaking, etc.

Índice de Seguridad Ambiental y Humana

Conclusions

1.- New evaluation method for human and environment safety

2.- P. putida KT2440 is safe while additional tests for B. cepacia should be
implemented before use.

3.- EHSI results are comparable with mice tests.

4.- EHSI represents a harmonized protocol and adaptable for bacterial release
purposes.
BIBLIOGRAFÍA

[1] CDC (Centers for Disease Control). 1974. Classification of Etiologic Agents on the Basis
of Hazard, 4th Ed. U.S. Department of Health, Education and Welfare, Public Health Service,
Center for Disease Control, Office of Biosafety, Atlanta, GA.

[2] National Cancer Institute safety standards for research involving oncogenic viruses.
Bethesda: The National Institutes of Health (US), National Cancer Institute, Office of
Research Safety; 1974, DHEW Publication No. (NIH) 75-790.

[3] NIH guidelines for research involving recombinant DNA molecules. Bethesda:
The National Institutes of Health (US), Office of Biotechnology Activities; 2002, April.

[4] Pike RM. Laboratory-associated infections: summary and analysis of 3921 cases.
Health Lab Sci. 1976;13:105-14.

[5] Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition.
http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/

[6] Guía Práctica para la Remisión de Solicitudes de Registro de Instalaciones para llevar a
cabo actividades de utilización confinada con organismos modificados genéticamente.
http://www.magrama.gob.es/es/calidad-y-evaluacion-ambiental/temas/biotecnologia/
Gu%C3%ADa_de_utilización_confinada_(junio_2014)_tcm7-334024.pdf

BIBLIOGRAFÍA

[7] Vilchez JI; Navas A; González-López J; Arcos S; and Manzanera M. (2016). Biosafety Test
for Plant Growth-Promoting Bacteria: Proposed Environmental and Human Safety Index
(EHSI) Protocol. Frontiers in Microbiology 6:1514.