Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas

ISSN: 1870-0195
rmcf@afmac.org.mx
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
México

Drago Serrano, María Elisa; Sainz Espuñes, Teresita del R.

Sistemas de expresión para proteínas terapéuticas recombinantes
Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, vol. 37, núm. 1, enero -marzo, 2006, pp. 38-44
Asociación Farmacéutica Mexicana, A.C.
Distrito Federal, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57937106

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Volumen 37 • No. 1 • enero - marzo 2006

Revisión Bibliográfica

Sistemas de expresión para proteínas

terapéuticas recombinantes
Expression Systems for Therapeutic Recombinant Proteins

Maria Elisa Drago Serrano,

Teresita del R. Sainz Espuñes
Departamento Sistemas Biológicos, UAM-Xochimilco.

RESUMEN: Diversos biofármacos basados en proteínas recombinantes son producidos en la actualidad por la industria biofar-
macéutica. Los sistemas de expresión para la obtención de biofármacos, se basan en vectores que permiten la clonación del
gen que codifica la proteína de interés en una célula hospedera como bacterias, levaduras y líneas celulares. Diversos biofár-
macos como factores de coagulación, hormonas, citocinas y enzimas han sido aprobados para su distribución comercial. La
demanda creciente de medicamentos para el tratamiento de enfermedades, está impulsando el desarrollo de biotecnologías
para la producción sustentable de biofármacos inocuos, efectivos y de costo razonable. Por la importancia de los biofármacos
para la industria biofarmacéutica, el presente trabajo de revisión bibliográfica pretende exponer los sistemas de expresión
aplicados en el presente para la producción de proteínas terapéuticas recombinantes.

ABSTRACT: Several biopharmaceutical products based on recombinant proteins are manufactured at present by biopharma-
ceutical industry. Expression systems to obtain biopharmaceuticals are based on cloning vectors of genes coding for the protein
of interest into a suitable host cell such as bacteria, yeast and cellular lines derived from mammals. Several biopharmaceuticals
such as clotting factors, hormones, cytokines and enzymes have been approved for their commercial distribution. Growing
demand of medicines intended for the treatment of infectious and chronic diseases is impelling the development of new bio-
technologies focused on the ecological production of harmless, efficient and fair cost biopharmaceuticals. By the relevance of
biopharmaceutical products to biopharmaceutical industry, the aim of this work was to review the expression systems currently
applied for the production of therapeutic recombinant proteins.

Palabras clave: biofármacos, proteínas recombinantes, biotecno- Key words: Biopharmaceuticals, recombinant proteins, biotechno-
logía logy.

Correspondencia:
Maria Elisa Drago Serrano
Departamento de Sistemas Biológicos, UAM-Xochimilco
Introducción
Calzada del Hueso No. 1100. Col. Villa Quietud.
A mediados de 1970 se inició el desarrollo de la ingeniería ge-
CP. 04960. Delegación Coyoacán, México D.F.
nética basada en la tecnología de ADN recombinante que marcó
Tel. (52) 55 5483-7253
a su vez, el comienzo de la industria biofarmacéutica actual.
Fax (52) 55 5483-7237
Mediante la tecnología de ADN recombinante ha sido posible
e-mail: mdrago@correo.xoc.uam.mx
modificar geneticamente diversos tipos de células que actúan
como “reactores” biológicos, capaces de sintetizar biofármacos
Fecha de recepción: 31 de mayo de 2005 con aplicaciones terapéuticas basados en proteínas recombi-
Fecha de aceptación: 12 de octubre de 2005 nantes. Esta breve revisión bibliográfica presenta un panorama
general sobre los principales sistemas de expresión aplicados en
la industria biofarmacéutica para la producción de diversos tipos

38
de biofármacos derivados de proteínas recombinantes aplicados
a la bioterapia y se enfoca sobre todo en aquellos sistemas de
expresión de biofármacos que han sido aprobados para su dis-
tribución comercial.
I. Esquema general de producción de biofármacos
Los biofármacos son producidos por organismos genéticamente
modificados (genetically modified organisms GMOs). A diferen-
cia de las proteínas de origen natural, las proteínas recombinantes
pueden ser producidas en grandes cantidades lo que ha permitido
cubrir la creciente demanda actual. En contraste con las proteínas
no humanas obtenidas de animales como por ejemplo la insulina
de cerdo, las proteínas recombinantes son idénticas o difieren
ligeramente respecto a las proteínas nativas de origen humano,
por lo que las reacciones inmunológicas adversas disminuyen
significativamente 1.
La fase inicial “upstream” (cuesta arriba) de producción de
biofármacos consiste en el diseño del sistema de expresión que
implica la elaboración mediante ingeniería genética, del vector
de clonación del gen que codifica la proteína de interés en
la célula hospedera adecuada. La segunda fase “downstream”
(cuesta abajo) se enfoca al proceso de purificación, evaluación
del control de calidad y validación de dicho producto. En
términos generales, la producción de proteínas recombinantes
sigue el siguiente esquema: 1) tratamiento con enzimas de
restricción de un vector de clonación y del ADN que contiene
el gen que codifica la proteína de interés, 2) ligamiento del
gen con el vector para obtener el ADN recombinante (ADNr),
3) internalización y replicación (clonación) del ADNr en una
célula hospedera y 4) expresión del gen en la proteína 2.
Los vectores más conocidos son plásmidos bacterianos
que se caracterizan por replicarse en forma independiente
al cromosoma de la bacteria. Los vectores son moléculas de
ADN bicatenario que actúan como vehículos de clonación
cuya función es acarrear y expresar el gen en la célula hos-
pedera. Los virus también son empleados como vectores de
clonación ya que se aprovecha su capacidad de introducir y
replicar su genoma en la célula 3.
El diseño del vector basado en técnicas de ingeniería
genética y la elección de la célula hospedera determinan en
gran parte, las características de la proteína recombinante,
las estrategias de su purificación, rendimiento y el costo de
su producción 4.
En la industria biofarmacéutica suelen emplearse como
células receptoras del ADNr la bacteria Escherichia coli (E.
coli), la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) y células
de mamíferos como la línea celular CHO (Chinese Hamster
Ovary) y BHK (Baby Hamster Kidney 5.
A continuación se describen las principales características de
los sistemas de expresión aplicados en la industria biofarmacéu-
tica para la producción de proteínas recombinantes que han sido
aprobadas para su aplicación terapéutica en humanos 6,7.
II. Sistemas de Expresión
a. Bacterias
Para la expresión de proteínas no glicosiladas recombinantes suele
emplearse a la E. coli como célula hospedera. A escala industrial,
el cultivo de E. coli para la producción de proteínas recombi-
nantes suele llevarse a cabo en medios químicamante definidos
8
. Los medios sintéticos facilitan el aislamiento y purificación
del producto y reducen el costo de su producción. En términos
generales, los vectores de clonación para E. coli contienen: el gen
que codifica la proteína de interés, un origen de replicación que
determina el número de copias del vector, un marcador de se-
lección que puede ser un gen de resistencia a antibióticos (como
ampicilina, kanamicina y tetraciclina), un promotor que regula la
transcripción del gen insertado (inserto) y un gen de terminación
de transcripción 8 .
A nivel laboratorio, la ampicilina es el marcador frecuente-
mente empleado en la selección de bacterias recombinantes, sin
embargo, a escala industrial, la ampicilina no es el antibiótico de
elección en la producción de bioterapéuticos para uso humano
debido a su probable efecto alergénico8. Para evitar el uso de
antibióticos, se están desarrollando cepas mutantes de E. coli a
las cuales se les elimina un gen que codifica una proteína esencial,
por ejemplo las enzimas que sintetizan la pared celular. Este gen
esencial se fusiona con el operador de lac. En ausencia de lactosa
este gene no se transcribe debido a que la molécula represora se
une al operador de lac, y por lo tanto la célula no sobrevive, sin
embargo, si la célula posee un plásmido con el sitio operador
habrá una competencia del represor y se unirá preferentemente
al operador del plásmido permitiendo la transcripción del gen
esencial y la proliferación celular 8,9.
En estudios de investigación, suele emplearse como parte
del vector de clonación en E. coli al promotor lac cuya expresión
es regulada por el isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG).
Debido al costo elevado del IPTG, a escala industrial, dentro del
vehículo de clonación en E. coli se emplea más frecuentemente el
promotor de triptofano (trp operon) el cual puede inducirse en
medios de cultivo carentes de dicho aminoácido 8.
La principal limitante de la aplicación de E. coli como célula
hospedera radica en que esta bacteria al igual que otras, no es
capaz de llevar a cabo modificaciones postraduccionales de la
proteína recombinante que permitan, por ejemplo su glicosilación,
necesaria para su estabilidad y actividad biológica 10.
Los sistemas de expresión en E. coli que favorecen la secreción
del producto hacia el sobrenadante del cultivo suelen con frecuen-
39
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cia, ser aplicados a escala industrial debido a que no se requiere el
rompimiento de la bacteria para su obtención 11. La desventaja de
este sistema estriba en el efecto de dilución del producto 8.
Por otra parte, se han diseñado vectores plasmídicos de clo-
nación para E. coli que propician la exportación del producto
recombinante hacia el espacio periplásmico 8. Este proceso
facilita el aislamiento del producto pero dificulta su proceso de
purificación por el exceso de contaminantes provenientes de la
célula hospedera como son proteínas y ADN 12. Por otra parte,
existe el riesgo de la pérdida de actividad derivada de la acción
enzimática de proteasas periplásmicas 8.
Otra estrategia de obtención de proteínas recombinantes en
E. coli incluye su producción intracitoplásmica. Este método no
requiere que la proteína sea solubilizada ni renaturalizada para un
correcto replegamiento (refolding), sin embargo su purificación
es larga y costosa 8.
Otro sistema de expresión en E. coli incluye la producción
de proteínas recombinantes insolubles en forma de cuerpos de
inclusión citoplásmica12. Este sistema tiene como ventaja un
alto rendimiento del producto sin embargo se precisan métodos
costosos para replegar el producto 8 y para eliminar las proteínas
y ADN de la célula hospedera12 por ello, su aplicación a escala
industrial resulta económicamente desventajosa.
Algunos productos biofarmacéuticos recombinantes aproba-
dos para su aplicación y producidos en E. coli incluyen: insulina
(hormona), Ecokinase (anticoagulante), citocinas como interferon
alfa 2b (IFN-α−2b), IFN-β-1a y al factor de necrosis tumoral
alfa (TNF-α) entre muchos otros 13 .
b. Levaduras
La producción de proteínas recombinantes comerciales se ha
basado también, en el cultivo en medios químicamente definidos
de levaduras como Pichia pastoris (P. pastoris) y S. cerevisiae 14. Los
vehículos de clonación empleados en levaduras suelen acarrear
como promotores al gene PGK (3-phosphoglycerate kinase, 3-
fosfoglicerato quinasa), ADH1 (alcohol dehydrogenase1, alcohol
deshidrogenasa 1), fosfatasa ácida y genes del cluster GAL
(galactosa)5,15,16. En la industria biofarmacéutica, los sistemas de
expresión con levaduras son altamente valorados ya que pueden
realizarse en medios químicamente definidos y además no se re-
quiere remover endotoxinas bacterianas, ambos aspectos reducen
el costo de la producción del producto.
Se han logrado obtener cepas recombinantes de S. cerevisiae
capaces de llevar a cabo la N-glicosilación (adición de carbohi-
dratos al grupo R del aminoácido asparagina de la proteína) de
proteínas heterólogas15. A pesar de la habilidad de las levaduras
de glicosilar proteínas, la composición de los azúcares de estas
40
glicoproteínas difiere de la proteína nativa de origen animal. Las
glicoproteínas provenientes de levaduras pueden tener una vida
media baja debido a que al unirse a receptores de manosa expresa-
dos en la superficie de macrófagos, son captadas y eliminadas por
estas células fagocíticas14. Lo anterior ha limitado la aplicación de
levaduras en sistemas de expresión de proteínas heterólogas huma-
nas que no requieren ser glicosiladas. Esta limitante, ha motivado
la búsqueda de sistemas alternativos de expresión en levaduras
diferentes a S. cerevisiae que han probado ser más eficientes para
la producción de glicoproteínas de naturaleza humana como es el
caso de la cepa recombinante Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)17.
Algunos productos recombinantes generados en S. cerevisiae son
hirudina (anticoagulante), hormonas como insulina y glucagon,
vacuna cuádruple contra difteria, tétanos, tosferina y hepatitis14.
c. Líneas celulares
Para la producción de proteínas glicosiladas humanas recombinan-
tes se emplean cultivos derivados de líneas celulares de mamíferos
como la línea celular BHK (Baby Hamster Kidney)18, HEK293
(Human embryonic kidney)19 y principalmente la línea celular
CHO (Chinese Hamster Ovary)18,20. En términos generales, los
requerimientos básicos de un vehículo de clonación para células
eucariontes21 son: un promotor eucarióntico generalmente de ori-
gen viral, que regule y promueva la expresión del gen que codifica
la proteína de interés, un sitio de clonación, una secuencia de po-
liadenilación, un origen bacteriano de replicación y un marcador de
selección. A escala industrial los genes de selección más populares
son el gen que codifica la enzima glutamina sintetasa (GS) y el gen
que codifica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) implicada
en el metabolismo de nucleótidos22. Usualmente se adiciona un
agente tóxico como el metotrexato (MTX) frecuentemente em-
pleado para seleccionar las células resistentes receptoras del gen
de selección22.
Los vehículos de clonación en células eucariónticas suelen
portar promotores derivados del virus SV40, virus del papiloma,
virus vaccinia, promotores retrovirales LTR (long terminal repeat)5
y adenovirus 20.
En sistemas de expresión de proteínas recombinantes que
emplean como vector el adenovirus recombiante humano (rhAD),
las células CHO han mostrado ser más estables y por tanto más
eficientes que las HEK ya que éstas últimas son más vulnerables a
sufrir efecto citopático como resultado de la replicación viral 20.
Aun cuando la capacidad de células CHO para expresar gli-
coproteínas es alta, estas células carecen de enzimas que permiten
la glicosilación terminal de proteínas observada en las proteínas
humanas18. Por ello, se han diseñado líneas celulares CHO
transfectadas con genes que codifican dichas enzimas y que son
capaces de producir proteínas con un patrón de glicosilación de
las glicoproteínas humanas18.
 Generalmente las líneas celulares expresan mezclas hete-
rogéneas de proteínas con patrones diferentes de glicosilación
(glicoformas) 23, por ello, su composición debe ser estimada24, 25
para cubrir los estándares permitidos para su producción
industrial. Mediante el diseño de estrategias de ingeniería
genética enfocadas a la regulación de rutas de glicosilación,
se ha modificado el procesamiento postraduccional de pro-
teínas recombinantes para mejorar su actividad, tal como fue
demostrado en hibridomas generados con células CHO que
sobreexpresan la enzima UDP-glucoaminoacil transferasa III
y producen anticuerpos IgG con mayor capacidad citotóxica
dependiente de anticuerpos (ADCC) 26 que los anticuerpos
no modificados.
Aun cuando el sistema más eficiente de expresión de
proteína glicosiladas humanas se realiza en líneas celulares,
es preciso reconocer que muchas líneas derivan de células tu-
morales y pueden ser portadoras de retrovirus. Por otra parte,
las líneas celulares son muy vulnerables a la contaminación
viral proveniente de los componentes del medio como el suero
fetal 27. Debido a lo anterior, los productos recombinantes
producidos en líneas celulares tienen un riesgo potencial de
transmitir enfermedades ocasionadas por virus, priones 28 y
micoplasmas 29. Hoy en día se disponen de medios de cultivo
comerciales libres de suero (Hyclone, Invitrogen) que han
permitido disminuir el riesgo de contaminación exógena de
las líneas celulares22. En ciertas condiciones, el costo de pro-
ducción de biofármacos en líneas celulares aumenta debido
a las pérdidas derivadas del efecto citopático ocasionado por
la replicación del vector de clonación o de la apóptosis. Esta
última denominada muerte celular programada, puede surgir
debido a que las líneas celulares se ven forzadas a portar un
número extremo de copias de genes exógenos ocasionando
su inestabilidad 30. La identificación de genes que limitan la
apoptosis 31 podrá permitir en un futuro, solventar los pro-
blemas de estabilidad de las líneas celulares destinadas a la
generación de biofármacos.
En la actualidad, cerca de un 50 a 60% de proteínas glico-
siladas humanas aprobadas para su distribución comercial se
producen en células inmortales de ovario de hamster CHO22.
A partir de esta línea celular se han obtenido una amplia gama
de proteínas bioterapéuticas recombinantes entre las que se
incluyen: el factor de coagulación IX, tirotropina alfa, eritro-
poyetina, IFN-β-1a (citocinas) 7,13. Con la línea BHK se han
obtenido el factor de coagulación VIIa y VIII 7.
III. Control de biofármacos aprobados para su distri-
bución comercial
A lo largo del proceso de producción de biofármacos se apli-
can obligatoriamente rigurosas pruebas de control de calidad
que cumplan las normas basadas en las buenas prácticas de
manufactura (Good Manufacturing Practice, GMP) de biofár-
macos antes de ser lanzados para su distribución comercial32.
Dichas normas son acordadas por organismos como EMEA
(The European Medicines Evaluation Agency) (http://phar-
macos.eudra.org) el CDER (Center for Drug Evaluation
and Research del U.S. Food and Drug Administration, FDA
(http://www.fda.gov). que legislan entre otros aspectos, la
producción y aplicación de bioterapeúticos recombinan-
tes así como el impacto ambiental de su producción32. En
México las GMP para la fabricación de fármacos sean o no
recombinantes están reguladas por la norma oficial mexicana
NOM-164-SSA1-1998.
Estas instancias regulan la utilización de productos po-
tencialmente dañinos que son empleados a nivel laboratorio
para la producción de biofármacos pero que son totalmente
inaceptables para su aplicación a nivel industrial 9. En la in-
dustria farmacéutica para la producción de biofármacos de uso
humano, es inaceptable el empleo de ampicilina, para la selec-
ción de clonas por sus posibles efectos alergénicos8 tampoco
es aceptable la aplicación de lisozima, ARNasa pancreática,
fenol, cloroformo, agentes mutágenos como bromuro de etidio
y cloruro de cesio entre muchos otros 9.
En términos generales, las pruebas clave de evaluación que
se aplican en etapas intermedias y en la fase final de produc-
ción de biofármacos son: esterilidad, pureza, homogeneidad,
identidad, estabilidad, rendimiento, potencia, proteína celular,
evaluación de endotoxinas e inocuidad9, 33. La selección y
aplicación de dichas pruebas depende de las características
del producto. La evaluación de la calidad de biofármacos es
un proceso complejo que involucra métodos de control de tipo
analítico, bioquímico, microbiológico, biológico, inmunológico
y molecular. En relación a estos métodos de control se incluyen
entre muchos otros, a la espectrometría de masas de ionización
por deserción por láser asistida por matriz (MALDI-MS) 23,
cromatografía liquida de alta resolución en fase inversa (RP-
HPLC), cromatografía de intercambio iónico12, cromatografía
de afinidad 34, bioluminiscencia y quimioluminiscencia35,
ensayo inmunoenzimático (ELISA) 12, reacción en cadena
de polimerasa (PCR) 29, 37 y bioensayos en cultivos celulares
y en animales de prueba 36. Además del control obtenido con
estos métodos, se lleva a cabo un proceso de validación en el
cual se aplican pruebas de control para evaluar la eliminación
de moléculas y agentes biológicos potencialmente dañinos 27.
Por otra parte, la evaluación preclínica del producto en hu-
manos es una etapa crucial previa al lanzamiento comercial
del producto 33.
Debido a que el aspecto del control está fuera del alcance
de la presente revisión, se sugiere consultar el sitio web de la
FDA que provee una excelente fuente de información sobre
este rubro (http://www.fda.gov/cber/gene.htm). En el Cuadro
1 se muestran algunos biofármacos que han sido aprobados
para su aplicación clínica.
41
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Cuadro 1. Biofármacos aprobados para su aplicación clínica. Basado de 13 y 41.

Producto Compañía Indicación terepéutica Año*

Kogenate (rh-Factor VIII producido en cél. BHK). Bayer Hemofilia A 1993

Nutropin (rh GH producido en E. coli) Genetech Deficiencia de GH en niños 1994

Norditropin (rh Gh) Novo Nordisk Deficiencia de GH en niños 1995

Puregon (rh FSH producido en cél. CHO) N.V. Organon Anovulación y superovulación 1996

Benefix (rh-Factor IX producido en cél. CHO ) Genetics Institute Hemofilia B 1997

Regranex (rh-PDGF producido en S. cerevisiae) Ortho-McNeil Diabetes, úlceras neuropáticas 1997

Follistim (rh-FSH producido en cél. CHO) Organon Algunas formas de infertilidad 1997

Insuman (rh-Insulin producido en E. coli) Hoechst AG Diabetes mellitus 1997

Glucagen (rh-Glucagon producido en S. cerevisiae) Novo Nordisk Hipoglicemia 1998

Thyrogen (Thyrotrophin-α, rh-TSH producido en cél. CHO) Genzyme Detección/tratamiento de cáncer tiroideo 1998

Beromun (rh TNFa producido en E. coli) Boehringer-Ingel Tratamiento post-remoción de tumores 1999

Virtron (rh-IFN-a-2b producido en E. coli) Schering Plough Hepatitis crónica B y C 2000

Viraferon (rIFN-a-2b producido en E. coli) Schering Plough Hepatitis crónica B y C 2000

Nutropin AQ (rh-GH producido en E coli) Schwartz Pharma Falla crecimiento, síndrome Turner 2001

Infuse (rh proteina 2 ósea morfogénica producida en CHO) Medtronic Promueve fusión de vértebras 2002

Advate Factor VIII producido en células CHO Baxter AG Hemofilia A 2004

Apidra (insulina Glulisina) Aventis Diabetes mellitus 2004

Dukoral toxina colérica oral) SBL vaccine AB Inmunización contra V. cholerae 2004

r, recombinant (recombinante); rh, recombinant human (humana recombinante); E. coli (Escherichia coli); CHO, Chinese
hamster ovary; BHK, baby hamster kidney; hGH, human growth hormone (hormona humana de crecimiento); FSH,
follicle stimulating hormone (hormona foliculo estimulante); TSH, thyroid stimulating hormone (hormona estimulante
de tiroides); IFN, interferon; PDGF, platelet derived growth factor (factor de crecimiento derivado de plaquetas). (*) año
de aprobación

V. Conclusión y perspectivas
Mediante los sistemas de expresión aplicados en la industria de
biofármacos ha sido posible generar estos productos en cantida-
des que anteriormente resultaba difícil por no decir imposible
de lograr. Otra ventaja adicional de biofármacos radica en que
se ha incrementado el nivel de su bioseguridad a diferencia de
lo que ocurre con los productos terapéuticos de origen natural
como hormonas protéicas como la insulina obtenida del páncreas
porcino cuya aplicación ha sido asociada a reacciones inmuno-
lógicas adversas o como la hormona de crecimiento y factores
de coagulación sanguíneos provenientes de cadáveres humanos,
que han sido señalados como fuentes potenciales de transmisión
de enfermedades infecciosas como hepatitis C y de la enferme-

42
dad de Creutzfeldt-Jakob respectivamente2. La producción de 9. Shamlou P.A. 2003. Scaleable processes for the manufacture
biofármacos a escala industrial está siendo optimizada por la of therapeutic quantities of plasmid DNA. Biotechnology
aplicación de tecnologías de vanguardia como son los sistemas de and Applied Biochemistry, 37(Pt 3):207-218.
clonación que no requieren del uso de enzimas de restricción 38, la
síntesis de cromosomas artificiales 39 y los microarreglos40, método 10. Suzuki T., Kitajima K., Inoue S., Inoue Y. 1995. N-glycosyla-
mediante el cual es posible analizar simultáneamente los niveles tion/deglycosylation as a mechanism for the post-translatio-
de expresión de miles de genes. La aplicación de bioensayos en nal modification/remodification of proteins. Glycoconjugate
cultivos de tejidos36 y métodos moleculares como la PCR37 para la Journal, 12(3):189-193.
detección de retrovirus y la aplicación de transposones42 en lugar
de plásmidos para abatir el riesgo de la transmisión horizontal de 11. Schmidt F.R. 2004. Recombinant expression systems in the
genes de resistencia hacia antibióticos, son algunas herramientas pharmaceutical industry.
que serán fundamentales para asegurar la inocuidad y bioseguri- Applied Microbiology and Biotechnology, 65(4):363-372.
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reto a enfrentar para la producción de proteínas recombinantes 12. Rathore A.S., Sobacke S.E., Kocot T.J., Morgan D.R., Dufield
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