FACULTAD DE CIENCIAS EN LA SALUD.

LICENCIATURA EN LABORATORIO CLINICO

MANUAL DE DIAGNOSTICO BACTERIOLOGIC O.

INTRODUCCIN.

El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Bacteriologa, con el fin de conocer las vas bioqumicas y metablicas que sirven de base en las identificaciones bacterianas, a la vez se hace mencin de las normas de bioseguridad tiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, as como tambin normas generales en toma, manejo y envo de muestras para los diferentes anlisis bacteriolgicos, y su respectivo control de calidad. Adems est elaborado de tal manera que sea aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos de laboratorio en Bacteriologa.

CONSIDERACIONES PARA SU PROTECCIN PERSONAL

Todas las muestras de especimenes biolgicos deben considerarse potencialmente infecciosas. Vacunarse contra los principales agentes infecciosos. Procurar no producir "salpicaduras" con la muestra obtenida. Debe limpiarse y desinfectarse cualquier superficie contaminada por algn espcimen biolgico. Lavarse las manos correctamente, despus de haber tenido contacto con cada paciente y al concluir cualquier procedimiento. No deben ingerirse comidas, bebidas, goma de mascar o fumar durante los diferentes procedimientos en el Laboratorio. Vigile que los elementos de trabajo estn en perfectas condiciones fsicas. Algn elemento en mal estado, podra causarle una herida. ESTERILIZACIN Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida de los microorganismos de un objeto o de una sustancia para evitar su reproduccin. ASEPSIA: Libre de microorganismos. MTODOS DE ESTERILIZACIN Comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes patgenos. A travs de esta, los materiales quirrgicos y la piel del enfermo alcanzan un estado de desinfeccin que evita la contaminacin operatoria. Hay varias formas de esterilizar como:

MTODOS QUMICOS Estos mtodos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. Hipoclorito de Sodio: Es el mas utilizado por su fcil adquisicin y por su efectividad en la desinfeccin. Vida media 20 minutos. Oxido de etileno: Destruye todos los microorganismos incluso virus. Aldehdos: Son agentes alquilantes que actan sobre las protenas. Estos compuestos destruyen las esporas. Glutaraldehdo: Este mtodo tiene la ventaja de ser rpido y ser el nico esterilizante efectivo fro. Formaldehdo: Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 horas. Gasplasma de Perxido de Hidrgeno: Es proceso de esterilizacin a baja temperatura la cual consta en la transmisin de perxido de hidrgeno en fase plasma. Alcohol: Esteriliza superficies, pero se evapora fcilmente.

MTODOS FSICOS Calor: La utilizacin de este mtodo y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposicin y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la accin del calor. El calor provoca desnaturalizacin de protenas, fusin y desorganizacin de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos. Calor Hmedo: El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas.

Autoclave Se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 121 C, 15Lb de presin, por 20 minutos.

Calor seco: El calor seco produce desecacin de la clula, es esto txico por niveles elevados de electrolitos, fusin de membranas.

Estufas Hornos Doble cmara, el aire caliente generado por una resistencia, circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cmaras, a temperatura de 170 C para el instrumental metlico y a 140 C para el contenido de los tambores.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Mantenga el lugar de trabajo en ptimas condiciones de higiene y aseo. Evite fumar, beber y comer cualquier alimento en el sitio de trabajo. NO SE DEBE UTILIZAR ELTELEFONO CELULAR DENTRO DE LAS PRACTICAS DE LABORATORIO No guarde alimentos, en las neveras ni en los equipos de refrigeracin de sustancias contaminantes o qumicos. Maneje todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales deben aplicarse con todos los pacientes, independientemente del diagnstico, por lo que se hace innecesaria la clasificacin especfica de sangre y otros lquidos corporales.

Lvese

cuidadosamente

las

manos

antes

despus

de

cada

procedimiento e igualmente si se tiene contacto con material patgeno. Utilice en forma sistemtica guantes plsticos o de ltex en

procedimientos que con lleven manipulacin de elementos biolgicos y/o cuando maneje instrumental o equipo contaminado en la atencin de pacientes. Utilice un par de guantes por paciente. Abstngase de tocar con las manos enguatadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento. Emplee mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras gticas -aerosoles- de sangre u otros lquidos corporales. Use batas o cubiertas plsticas en aquellos procedimientos en que se esperen salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros lquidos orgnicos. Evite deambular con los elementos de proteccin personal por fuera de su sitio de trabajo. Mantenga sus elementos de proteccin personal en ptimas condiciones de aseo, en un lugar seguro y de fcil acceso. Evite la atencin directa de pacientes si usted presenta lesiones exudativas o dermatitis serosas, hasta tanto stas hayan desaparecido. Las mujeres embarazadas que trabajen en ambientes hospitalarios expuestas al riesgo biolgico VIH/SIDA y/o Hepatitis B, debern ser muy estrictas en el cumplimiento de las precauciones universales y cuando el caso lo amerite, se deben reubicar en reas de menor riesgo. Aplique en todo procedimiento asistencial las normas de asepsia necesarias. Utilice las tcnicas correctas en la realizacin de todo procedimiento. 6

No cambie elementos cortopunzantes de un recipiente a otro. Abstngase de doblar o partir manualmente las hojas de bistur, cuchillas, agujas o cualquier otro material cortopunzante. Evite reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bistur. Realice desinfeccin y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo al final dcada procedimiento y al finalizar la jornada. En caso de derrame o contaminacin accidental de sangre u otros lquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio a 5.000 ppm (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; despus limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma concentracin y realice limpieza con agua y jabn. El personal encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.

En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro lquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor, nunca con las manos.

Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y cierre hermtico. Deben tener preferiblemente el tapn de rosca.

Manipule, transporte y enve las muestras disponindolas en recipientes seguros, con tapa y debidamente rotuladas, empleando gradillas limpias para su transporte. Las gradillas a su vez se transportarn en recipientes hermticos de plsticos o acrlico que retengan fugas o derrames accidentales. Adems deben ser fcilmente lavables.

En caso de contaminacin externa accidental del recipiente, ste debe lavarse con hipoclorito de sodio al 0.5% (5.000 ppm) y secarse.

Restrinja el ingreso a las reas de alto riesgo biolgico al personal no autorizado, al que no utilice los elementos de proteccin personal necesarios y a los nios.

La ropa contaminada con sangre, lquidos corporales u otro material orgnico debe ser enviada a la lavandera en bolsa plstica roja. Disponga el material patgeno en bolsas resistentes de color rojo que lo identifique con smbolo de riesgo biolgico. En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante haga el reporte inmediato de accidente de trabajo.

GENERALIDADES

A. OBJETIVO GENERAL Conocer las tcnicas, procedimientos y controles que se desarrollan en el rea de bacteriologa dentro de un Laboratorio Clnico.

B. OBJETIVOS ESPECFICOS. Verificar los controles de calidad que se llevan a cabo en el rea de bacteriologa. Conocer las normas de bioseguridad que se realizan en bacteriologa. Conocer el manejo y envo de muestras en el rea de bacteriologa. Conocer los diferentes procedimientos que se realizan en la preparacin de medios de cultivo. Conocer las diferentes tcnicas bacteriolgicas aplicables para la identificacin de cepas bacterianas.

I- NORMAS GENERALES DE LA TOMA, MANEJO Y ENVI DE MUESTRAS PARA ANLISIS CLNICOS.

1. Los anlisis clnicos se practicarn a los pacientes que sean referidos al laboratorio, por el personal autorizado del Establecimiento. 2. Todo examen deber ser solicitado en el formulario proporcionado por el laboratorio, completando los siguientes datos: Nombre del paciente, nmero de registro, edad, sexo, servicio que lo refiere, sello del establecimiento, diagnstico clnico, firma y nombre de quien lo refiere y especificar si es de urgencia. 3. Todo paciente con solicitud de exmenes de Laboratorio, deber presentarse a ste para que se le de la orientacin sobre la coleccin de la muestra, la hora y la fecha en que se le recibir. Estos datos debern ser anotados en la hoja de solicitud del examen y en el libro de citas del laboratorio. 4. Toda solicitud de examen de Laboratorio, deber revisarse confirmando los datos requeridos y comparando los datos de identificacin con la tarjeta del expediente del paciente.

5. El Laboratorio Clnico de cada establecimiento para efecto de control de

exmenes llevar un libro de entrada en el que anotar el nmero correlativo, fecha, nombre del paciente y anlisis a realizarse. 6. Los tubos, lminas, cajas de petri y frascos utilizados para colectar las muestras, debern ser identificados inmediatamente despus de tomadas o recibida la muestra con el nmero correlativo de Laboratorio, nombre o iniciales del paciente.

10

7. Previo al envo de muestras a otro laboratorio debe hacerse contacto con ste para notificar del envi y saber quien recibir la muestra. 8. Toda muestra clnica que se enve a otro laboratorio, debe ser transportada en envases y condiciones que proporcionen la mayor seguridad para evitar roturas, derramamientos de la misma o extravo. 9. En el transporte de la muestra se consideran tres aspectos importantes: a) Protegerlas del calor excesivo. b) Protegerlas de la luz solar. c) Acondicionarlas en forma tal que no haya riesgo de derrame.

10. Para el envi de la muestra es conveniente disponer de cajas de madera

con tabiques interiores; si no se dispone de ellas se puede usar una caja de cartn grueso en la que se anotar la direccin del Laboratorio al cual se enva y se le marcarn flechas verticales indicado la posicin en que debe mantenerse. Cada envo deber ir acompaado de la lista con la identificacin de cada muestra contenida en la caja. RECEPCIN DE LA MUESTRA: Comprobar que las muestras estn bien identificadas y que correspondan a la lista adjunta.

1. Si hay derrame del material, desinfectar el exterior del envase con algodn o
toallas de papel impregnado en fenol al 5 % u otra solucin bactericida. Si se comprueba derrame masivo esterilizar el envase por autoclave o incineracin 2. Notificar al servicio remitente las deficiencias que hubieren en la calidad y cantidad de las muestras o en la forma en que se hizo el envo.

11

ENVI DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE REFERENCIA.

ALMACENAMIENTO Y ENVI: 1. Suero: Deben almacenarse entre- 20C y/o 4C y transportarse a iguales temperaturas, evitando as el congelamiento y descongelamiento de las mismas que daara a los microorganismos. 2. Deben hacerse: llegar al laboratorio con la mayor prontitud, y por la va ms rpida, mximo una semana, adems cada envo de muestra debe acompaarse con la ficha epidemiolgica correspondiente.

3. Sangre completa: Debe almacenarse a 4 C (refrigeradora) y enviarlas

rpidamente al laboratorio dentro de las 24 horas siguientes a la obtencin de la sangre. Nunca deben congelarse, pues se hemolizan, adems siempre deben ser acompaadas por su ficha epidemiolgica correspondiente. 4. Empaque: Los mtodos de empaque y envo deben garantizar proteccin tanto a la muestra como al personal que las manipula. 5. Los sueros enviados estarn en tubos o viales perfectamente cerrados, las tapas o tapones se aseguran bien con cinta adhesiva para que no se aflojen con la vibracin del transporte. Se pueden sujetar con una banda de goma y colocar cada lote en un recipiente de plstico o en una pequea bolsa del mismo material, cada paquete se dispondr verticalmente en una hielera que contenga bloques refrigerantes. 6. Al enviar sangre completa debe evitarse el contacto de los bloques refrigerantes o del hielo de agua con las paredes de los tubos, para que las muestras no se hemolicen.

12

NORMAS DE BACTERIOLOGA.
Siempre que sea posible, la muestra para cultivos tiene que ser recolectada antes de la administracin de antibiticos.

ORINA.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, puncin suprapbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta ltima exige las siguientes condiciones: a) Antes de tomar la muestra practicar un cuidadoso aseo de la zona genital con agua y jabn. b) Colectar la primera orina de la maana o tener como mnimo 2 horas de retencin urinaria.

c) En un frasco estril de boca ancha, tapn de rosca, transparente, recoger

una cantidad de 15 a 20 ml de orina medio chorro. d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su proceso, no debe exceder de 2 horas; sino se puede procesar al recibirla, se puede refrigerar hasta por 12 horas.

SECRECIN URETRAL.
Toma de muestra: efectuar presin suave sobre la uretra, eliminar la secrecin luego exprimir desde atrs con fuerza y recoger la secrecin con dos hisopos estriles, 1 para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer Martn o Agar chocolate). Si la secrecin es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para coloracin de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar colocarlo en medio de transporte de Stuart , Amies o Cary Blair. Si no se puede sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de transporte.

13

SECRECIN VAGINAL.
Toma de muestra: colocar a la paciente en posicin ginecolgica, introducir el especulo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se recomienda sea tomada por el mdico. El hisopo debe estar estril e impregnado con solucin salina fisiolgica al 0.85% estril. Hacer de inmediato un frotis para coloracin de Gram y hacer un examen directo al fresco, colocando una gota de solucin salina en un porta objetos y suspender en ella la secrecin vaginal; cubrir con el cubre objetos y buscar Trichomonas vaginalis o levaduras. Si el examen al fresco no se puede hacer de inmediato colocar el hisopo en 0.5 mL de solucin salina, en refrigeracin no ms de 2 horas. En la coloracin de Gram reportar Vaginosis bacteriana si hay predominio de bacilos gram negativos.

HECES
La muestra debe tomarse en los tres primeros das de la enfermedad y antes de comenzar el tratamiento antimicrobiano. En los lactantes lo indicado es el hisopado rectal. Introducir el hisopo, ( previamente humedecido con solucin salina estril ), dos o tres cms. en el ano imprimindole movimientos de rotacin amplia, pero con suavidad arrastrando mucosidad de la pared del recto. En el adulto la muestra puede obtenerse del recipiente con heces o del hisopo rectal. Las mejores muestras son aquellas diarreicas, con mucus, o con sangre, la muestra debe ser de 1 a 2 gramos si es slida y de 3 a 4 mL. si es diarreica. Si el cultivo se hace dentro de las dos horas despus de tomada la muestra, no se requiere medio de transporte. Pasado ese perodo se recomienda usar el medio de transporte Cary & Blair, o el caldo de Selenito o Tioglicolato.

14

SECRECIN FARINGEA.
La muestra debe tomarse de amgdalas y faringe, colocar al enfermo en posicin cmoda y buscando la mejor iluminacin, pedir al paciente que pronuncie la letra A, baje la lengua suavemente con un bajalengua, frote el hisopo con firmeza pero con suavidad en ambas caras de las amgdalas y luego en la pared posterior de la faringe de manera que el hisopo quede impregnado de exudado farngeo, evite tocar con el hisopo lengua y vula. Introducir el hisopo en 1mL. de medio de enriquecimiento, 0.5 mL de caldo de tripticasa soya, infusin cerebro corazn, o sembrar de inmediato en agar sangre y Mac Conkey. Si hay pseudomembrana hacer un frotis y colorear por Gram para investigar difteria.

EXPECTORACIN.
Toma de muestra: el paciente debe efectuar repetidos enjuagatorios previos con solucin de bicarbonato de sodio o con solucin salina estril. Tomar la primera expectoracin de la maana (este esputo debe ser purulento no saliva). El frasco debe ser de boca ancha, con tapn de rosca y estril, debe taparse bien e identificarse correctamente. Enviarlo al Laboratorio inmediatamente.

SECRECIN NASAL.
Introducir el hisopo con solucin salina estril profundamente en direccin paralela al piso de la fosa nasal. Frotar suave y firmemente (1 minuto en cada fosa nasal). Colocar el hisopo en 0.5 mL. de caldo de tripticasa soya o inocular de inmediato en agar sangre y Mac Conkey.

SECRECIN OCULAR.
La muestra debe tomarse con cuidado y con la ayuda de otra persona para que inmovilice la cabeza del paciente. Previa separacin del prpado inferior con el

15

pulgar de la otra mano, tomar con un hisopo de la secrecin conjuntival dirigida hacia el ngulo interno del ojo, rotar el hisopo suavemente (tomar 2 hisopos uno para lcera corneal) sembrar en el medio de agar sangre, Mac Conkey, tioglicolato y tambin un tubo de sabouraud. En este caso es recomendable que el oftalmlogo, con anestesia local tome la muestra con careta. Siempre hacer examen directo.

SECRECIN OTICA.
Con dos hisopos colectar el pus del conducto auditivo externo. Hacer un frotis y teirlo con Gram e inocular en agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey.

PUS DE HERIDAS.
En un absceso cerrado si el contenido es fluido extraer con jeringa, si el absceso es abierto tomar con un hisopo o bistur de las paredes internas y no del centro: hacer frotis de inmediato y colocar los hisopos en medio de tioglicolato.

LESIONES DE LA PIEL.
Lavar con agua, jabn y desinfectar con alcohol o yodo. Primero remover las costras y la piel que cubre las pstulas o vesculas, frotar firmemente con hisopo o bistur dentro de la lesin. Si la lesin es seca usar hisopo hmedo y colocarlo en caldo tioglicolato.

SANGRE.
Para la toma de muestra realizar aseo cuidadoso con jabn y agua despus aplicar tintura de yodo al 1% y luego limpiar con alcohol al 70%. Con jeringa colectar 5 a 10 mL. y colocar en medio de cultivo lquido en volumen 10 veces mayor.

16

LQUIDOS CEFALORRAQUDEO Y OTROS LQUIDOS DE DERRAME.

Este examen es uno de los de mayor urgencia dentro del Laboratorio Bacteriolgico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad es de evolucin rpida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es bsico la identificacin del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1 a 2 mL. de muestra en tubos de tapn de roscas estriles, enviarlos al Laboratorio a temperatura ambiente: usualmente se toman 2 tubos uno para bacteriologa y otro para qumica. Si no es posible, primero procesar bacteriologa y luego remitirlo para qumica, la muestra debe guardarse en la estufa a 35C. hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra y con el sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis para Gram y una preparacin con tinta china.

1. PUS.
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabn y colectar con bistur el pus del borde de las lesiones. Colocarlo directamente en los medios de cultivo o en porta - objetos. Si el pus es abundante colocarlo en un tubo estril con tapn de rosca.

2. SECRECIONES.
Lavado bronquial, lquidos de derrame, LCR, mdula sea y biopsia. Sern colectadas por el mdico con estricta asepsia y colocadas en un tubo estril con tapn de rosca u otro recipiente estril sin preservativo.

17

Las muestras deben ser procesadas de inmediato y si no es posible, guardarlas en refrigeracin no ms de 24 horas.

EXAMEN DIRECTO. 3. SECRECIONES VAGINALES, URETRALES Y ORALES.

Colocar una gota de secrecin en un porta objeto y cubrir con laminillaexaminar al microscopio. Es recomendable hacer simultneamente un frotis de la secrecin y colorearla por Gram.

4. PUS Y MEDULA
Hacer un frotis delgado en un portaobjeto y colorearlo por Giemsa.

5. ESPUTO Y LAVADO BRONQUIAL.

Seleccionar las porciones purulentas y hacer frotis y colorear por Giemsa al mismo tiempo hacer una preparacin con KOH al 10 20%.

6. LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y LQUIDOS DE DERRAME

Centrifugar la muestra a 3000 rpm. Por 15 minutos. Del sedimento tomar 1 gota pequea y colocarla a la par de una gota de tinta china. Cubrir ambas gotas con una laminilla para que se forme un gradiente de color negro. Observar con el objetivo 10 x; si se ven crculos claros, contra fondo negro observar con el 45x para apreciar la morfologa. Adems colocar una gota del sedimento en un porta objeto y dejar secar. Colorear por Giemsa y observar con objetivo de inmersin, esto para LCR. En caso de lquido pleural y asctico se agrega 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10 ml. Y se conserva en refrigeracin si la muestra no se procesar inmediatamente.

18

7. BIOPSIA
Macerar el tejido con 1 mL. de solucin salina en un mortero o con un homogenizador estril, preparar un frotis y colorear con Giemsa y hacer preparacin al fresco.

8. SANGRE
Colocar la sangre en un tubo de Wintrobe y centrifugar a 3000 rpm. Por 15 minutos. Con pipeta Pasteur descartar el plasma y tomar 1 gota de la capa de leucocitos, preparar un frotis en un porta objetos y colorearlos por Giemsa.

TOMA DE MUESTRA PARA LA IDENTIFICACION DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Para que el Laboratorio pueda obtener resultados confiables, no solo es necesario que ejecute las tcnicas en forma correcta, sino que reciba una buena muestra que provenga del sitio de la lesin a investigar y obtenida en cantidad suficiente. La muestra de mayor rendimiento para la baciloscopa es la expectoracin, especialmente de la maana, proveniente del rbol bronquial, se le pide al paciente que inspire profundamente, que retenga un instante el aire en sus

19

pulmones

y que lo expulse violentamente con un esfuerzo

de tos hasta

obtener no menos de tres esputos.

Para el diagnstico se requiere dos muestras: la primera se tomar en el momento de la consulta, la segunda ser recogida al despertar la persona (matinal) previo aseo de la boca. Para control de tratamiento: dos baciloscopas al segundo, cuarto y sexto mes de tratamiento. Para control post tratamiento: se deben realizar baciloscopas a los 12 y 24 meses de finalizado el tratamiento. Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el recipiente y marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.

20

CONTROL DE CALIDAD.
1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVO DESHIDRATADOS: Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos y absorven agua del exterior, (as como la formacin de agua dentro de una botella) como consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Adems favorecen el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. Tambin la exposicin a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los constituyentes del medio de cultivo. Tomando en cuenta los factores antes sealados, los medios de cultivo deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe hacerse en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento adecuadas, los medios elaborados en forma de polvo tienen una vida til de al menos un ao y los medios en forma granular tienen una duracin de al menos tres aos. Para asegurarnos que un medio de cultivo est en buen estado, es conveniente marcar cada frasco de medio con la fecha en que fue recibido y tomarse las previsiones necesarias para que la existencia del mismo en bodega cubra las necesidades del laboratorio por perodos de al menos seis meses. De esta manera controlaremos su vida til y evitaremos que se nos deterioren durante el almacenamiento. El material que ha sufrido cambios sustanciales, tales como hidratacin y endurecimiento, debe descartarse. 2. RECONSTITUCIN O REHIDRATACIN. El grado de disolucin del medio deshidratado, as como la eficacia del medio de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento empleado en la rehidratacin.

21

Debe

emplearse

siempre

agua

recin

destilada

completamente

desmineralizada y erlenmeyers con un volumen, al menos, dos veces mayor a la cantidad de medio que se va a preparar. Siempre se agrega la cantidad indicada de medio deshidratado a la mitad del volumen de agua requerido, se mezcla vigorosamente hasta obtener una suspensin homognea y luego, se agrega el resto del agua asegurndose que cualquier partcula de medio adherida a la pared del erlenmeyers sea lavada en el proceso. Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para este propsito, se utilizan soluciones de NaOH y HCL 0.1 N y un potencimetro debidamente calibrado. En el caso que no se disponga de ste y para medios que no tengan colorantes o indicadores pueden utilizarse las tiras del pH. Si un medio de cultivo contiene Agar, gelatina o cistina, es indispensable calentarlo en un bao de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta lograr su disolucin completa. Esta se logra cuando no se observen partculas adheridas a la pared del erlenmeyer y el medio disuelto se observe homogneo. Una vez logrado el propsito anterior, debe suspenderse el calentamiento, ya que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos constituyentes del medio, tornndolo inadecuado. Si el medio debe ser distribuido en tubos (TSI, Citrato, etc.) debe agitarse frecuentemente para asegurar una distribucin homognea del mismo en cada tubo. Los medios que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin necesidad de calentarlos.

3. ESTERILIZACIN. El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera necesario) debe someterse al proceso de esterilizacin, excepto aquellos que no lo requieran (agar SS, por ejemplo).

22

Deben seguirse las instrucciones en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtencin de medios de cultivo tiles. Debe tenerse en mente que la presin vara de acuerdo con la altura y por tanto no es un factor constante. De tal manera que son el tiempo y la temperatura los parmetros que deben tomarse en consideracin en el proceso de autoclavado.

4. DISTRIBUCIN DEL MEDIO EN PLACAS. El medio esterilizando debe enfriarse a 45- 50C en un bao mara ajustado a esa temperatura para evitar la formacin de agua de condensacin. Debe ser vertido en las placas evitando la formacin de burbujas. En caso de que stas se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la superficie del medio con ayuda de la llama del mechero. Durante el vaciado los componentes del medio deben estar distribuidos uniformemente, por lo que es necesario agitarlo con frecuencia. Si el medio de cultivo se ha enfriado a 45-50C, el agua de condensacin que pueda formarse en las placas ser poca y por tanto, pueden mantenerse cerradas para evitar contaminacin. Debe guardarse una pequea cantidad del medio para determinar el pH despus de autoclavado. Si el valor no es el indicado para el medio, descrtelo. 5. PRUEBA DE ESTERILIDAD. Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y someterla a control de esterilidad a 35C por 24 horas. Este procedimiento dar una idea sobre la contaminacin obtenida en la preparacin del medio. Esto a su vez permitir determinar si se deben tomar medidas ms rigurosas en la limpieza y desinfectacin del sitio en que se preparan los medios de cultivo y en el procedimiento de distribucin del medio.

6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO. El medio de cultivo reconstituido tiene una vida til limitada. Si no se emplea de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para garantizar su utilidad durante un perodo de tiempo.

23

El almacenamiento a 4C es el mejor para la mayora de los medios. Sin embargo, aquellos que contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a temperatura ambiente para que mantengan su viabilidad.

Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede afectar algunos de sus componentes. Para evitar la desecacin los medios pueden guardarse en bolsas plsticas bien cerradas. Las placas de petri almacenadas de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.

Dado que los medios almacenados temperatura ambiente tienden

en refrigeracin cuando pasan agua de

a formar

condensacin en la

superficie, se recomienda poner las placas en el incubador a 35C por un perodo de dos horas, colocndolas con el fondo hacia arriba. De esta manera se obtendr una superficie seca.

CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE IDENTIFICACIN. Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en pruebas de identificacin bacteriana funcionen adecuadamente, deben utilizarse bacterias que muestren las diferentes caractersticas distintivas para cada prueba o tincin. Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterias de referencia y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al almacenamiento de reactivos, inoculacin de medios, perodos de incubacin, metodologa para efectuar las pruebas y tiempo de lectura de las mismas.

24

PRACTICA No.1 PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO.

PRACTICA No.1 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo usados en Bacteriologa contienen los nutrientes y factores fsicos y qumicos (pH, concentracin de iones), necesarios para la reproduccin bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los medios lquidos permiten la proliferacin bacteriana por todo el medio, son de fcil manejo. Los medios slidos permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias (colonias) cuyas caractersticas macroscpicas sirven de gua para la identificacin de ciertas bacterias.

COMPETENCIA. Preparar adecuadamente, medios de cultivos lquidos y slidos, a partir de medios deshidratados, siguiendo las instrucciones correspondientes. MATERIAL. Caldo tripticasa soya o caldo tioglicolato Agar tripticasa soya deshidratado Soporte con maya metlica Frascos Erlenmeyer o balones volumtricos con apon de algodn o gasa Cajas de petri Bajalenguas de madera Balanza Agua destilada Probetas tubos de ensayo 25

Olla de presiona Mecheros

PROCEDIMIENTO. MEDIO DE CULTIVO LIQUIDO 1. se pesa el CTS sobre una balanza granataria (calibrada previamente). Se observan las especificaciones en el frasco. 2. el CTS debe ser pesado sobre un papel especial para que no haga contacto con la superficie de la balanza. 3. colocar 50 ml de agua destilada en un erlenmeyer (el volumen se mide en una probeta) 4. agregar el medio deshidratado. Disolver por agitacin y calentamiento hasta que empiece a hervir. Luego esterilizar en la olla de presin ( 15 lbs de presin por dos horas). 5. despus de esterilizar se procede a colocar el medio de cultivo sobre cada tubo de ensayo (esterilizados previamente) quedando as listo el medio de cultivo. Los medios lquidos deben mantenerse debidamente evitar la contaminacin. enroscados o sellados para

MEDIO DE CULTIVO SLIDO. 6. se pesa el medio TSA o algn medio slido, en una balanza granataria ( instrucciones en el frasco) 7. el procedimiento es igual a la de los medios lquidos

26

PRACTICA No. 2 OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO

Un paso fundamental para el diagnostico bacteriolgico es el aislamiento de bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza variada (pruebas bioqumicas, coloraciones, serologa, etc.) se procede a su identificacin. Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las tcnicas para obtencin de cultivos puros a partir de una flora mixta. OBJETIVOS 1- Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.

2- Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los

resultados que obtenga en esos medios.

3- Que constate por observacin macroscpica y microscpica si obtuvo cultivo

puro.

PARTE I. MATERIAL POR LADO DE MESA. Una suspensin de heces 1:1000

- Una placa de Agar de tripticasa soya - Una placa de Agar Mac Conkey - Una placa de Agar sangre.
PROCEDIMIENTO Sembrar las placas de agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre con la suspensin de heces utilizando el mtodo de estras para extenderlo.

27

Incubar todas las placas a 36C +/- 1C, hasta la siguiente practica de laboratorio.

PARTE II MATERIAL:

- Colorante para Gram y dos placas de agar tripticasa soya.

PROCEDIMIENTO

1- Observar el nmero y tipo de colonias que hayan crecido en las placas de

agar tripticasa soya, Mac Conkey y agar sangre. Notar las diferencias que hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los resultados.

2- Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey y

agar sangre, colorearlos por el mtodo de Gram. Observarlos en el microscpio y anotar los resultados. 3- En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada por bacterias Grampositivas y resembrarla en el medio de agar tripticasa soya, incubarla a 36C hasta el prximo laboratorio. Hacer lo mismo con una colonia Gramnegativa.

28

PARTE III PROCEDIMIENTO

1- De cada una de las placas sembradas tomar tres colonias aisladas, hacer
frotis y colorearlo por Gram. Observar al microscopio indicar si obtuvo cultivos puros. 2- Discusin a) Mtodo de estras (fundamento y objetivo) b) Anlisis de cada medio de cultivo: nombre, funcin, clasificacin, composicin (sustratos, nutrientes e inhibidores) c) Descripcin de colonias. d) Anlisis de los resultados. Frotis Bacteriano. 1. Se observa Morfologa 2. Se observa tincin ( Gram, Acido resistencia).

29

PRACTICA No. 3 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA)

PROPOSITOS La prueba de susceptibilidad sirve para determinar IN VITRO a que antibiticos es susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente. Este mtodo permite al mdico escoger el antibitico ms adecuado con base cientfica proporcionada por el laboratorio y as poder dar un buen tratamiento. Bsicamente hay dos tcnicas para verificar estas pruebas: dilucin en tubo y difusin en agar. La tcnica del disco sobre agar, se adapta a las necesidades y fines de la prctica diaria en el laboratorio. Adems las pruebas de susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la eleccin de los agentes antimicrobianos ms apropiados para el tratamiento de las enfermedades infecciosas. OBJETIVOS 1. Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los antimicrobianos por el mtodo de difusin en agar (mtodo de KIRBY BAUER). 2. Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles. 3. Analizar las posibles fuentes de error inherentes al mtodo e indicar la forma de evitarlas. Suceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infeccin son inhibidos por concentraciones de antibiticos obtenidos con un rgimen usual de dosificacin. 30

Resistente: Si los microorganismos que causan la infeccin, toleran concentraciones de antibiticos superiores a las que pueden obtenerse en la sangre por medio de un rgimen usual de dosificacin. Intermedio: Hoy en da se considera como prueba errtica, que por lo tanto debe repetirse, ya que realmente se trata de una poblacin bacteriana resistente. PROCEDIMENTO Por medio de la tcnica de Kirby-Baver modificada se obtienen resultados confiables, reproducibles y de gran utilidad clnica siempre y cuando se sigan al pie de la letra las instrucciones. Es una tcnica relativamente sencilla. Y siempre debe efectuarse con el Agar de Mueller-Hinton; el grosor de la caja, concentracin del inoculo, humedad, temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es muy importante tomar en cuenta que esta tcnica solo sirve para efectuar el antibiograma a las siguientes bacterias aerbicas o facultativas de crecimiento rpido: 1. Staphylococcus aureus 2. Enterobacterias 3. Pseudomonas

El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria sp, debe hacerse en Mueller-Hinton con 5% de sangre achocolatado. Para prepara el agar de Mueller-Hinton debe seguir las siguientes indicaciones: 1. Las cajas de petri deben tener un tamao estndar (100 mm de dimetro) deben llenarse con aproximadamente 25 mL de agar lquido ya

autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4mm de grueso.

31

2. Deben guardarse en refrigeracin dentro de bolsas plsticas selladas (de 2 a 8C) por no ms de 7 das. 3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4. 4. De cada lote de medio, incubar de 2 5 cajas por 24 horas a 36C para comprobar su esterilidad.

ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBITICOS:

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no pierdan su potencial: 1. Congelar (idealmente a 20C) los discos de Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina y Cefalosporinas. Descongelar peridicamente slo los discos que sern usados durante la semana. Descongelarlos por lo menos 2 horas antes de usarlos. 2. Los discos del resto de antibiticos pueden almacenarse refrigerados sin congelacin. De preferencia con un desecante.

PROCEDIMIENTO: 1. Con el asa flameada y fra tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual morfologa del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro. 2. Inocular un tubo con 4 mL de caldo tripticasa soya o caldo infusin de cerebro - corazn. 3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 36C, hasta que aparezca una ligera turbidez.

32

4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estndar de Mac farland 0.5. Si el caldo es ms turbio que el estndar, agregar ms caldo o solucin salina estril. 5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton as: introducir un hisopo estril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionndolo ligeramente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo. 6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido. 7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no ms de 15 minutos, con la tapadera cerrada. 8. Con pinzas estriles, colocar los discos impregnados de antibiticos a manera que queden lo ms separado entre s. Escoger los antibiticos a colocar dependiendo de la bacteria aislada. 9. Invertir las cajas o incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con candela (excepto para Hemophiles spp y Neisseria spp) INTERPRETACIN DE RESULTADOS. 1. Despus de 16 a 18 horas de incubacin, examinar con buena luz las cajas ya con crecimiento. 2. Medir en milmetros el dimetro de los halos de inhibicin completa con una regla por detrs de la caja petr. 3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el cual no debe tomarse en cuenta. 4. Transformar las medidas de los dimetros de los halos de inhibicin en milmetros, hacer lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.

33

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS DE INHIBICIN

Agente antimicrobiano Amikacina Amoxicilinacido clavulnico Ampicilina Ampicilinasulbactan Aztreonam Cefamandol Cefazolina Cefmetazol Cefonicida Cefoperazina Cefotaxima Cefotetan Cefoxitina Ceftazidima Ceftizoxima Ceftriaxona Cefuroxima (oral) Cefuroxima (parenteral) Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Gentamicina Imipenem Kanamicina Mezlocilina Netilmicina Piperacilina Tetraciclina Ticarcilina

(mm)
Contenido del disco (meg)

PARA

MIEMBROS
Intermedio

DE

LA

FAMILIA
Susceptible 17 18 17 15 22 18 18 16 18 21 23 16 18 18 20 21 23 18 18 18 21 15 16 18 21 15 21 19 20
(Continuacin)

ENTEROBACTERIACEAE
Resistente 14 13 13 11 15 14 14 12 14 15 14 12 14 14 14 13 14 14 14 12 15 12 13 13 17 12 17 14 14 13-17 16-20 13-14 14-15 14-17 18-20 13-14 18-20 15-18 15-19 30 20/10 10 10/10 30 30 30 30 30 75 30 30 30 30 30 30 30 30 30 30 5 10 10 30 75 30 100 30 75 15-16 Moderadamente susceptible 14-17 14-16 12-14 16-21 15-17 15-17 13-15 15-17 16-20 15-22 13-15 15-17 15-17 15-19 14-20 15-22 15-17 15-17 15-17

Agente antimicrobiano

Ticarcilina-cido clavulnico Tobramicina Trimetoprimsulfametoxazol

Contenido del disco (mcg) 75/10 10 1.25/23.75

Resistente

Intermedio

Moderadamente susceptible 15-19

Susceptible 20 15

14 12 10 13-14

11-15

16

34

Reportar slo en Urocultivo Carbenicilina Cinoxacina Nitrofurantona Norfloxacina Ofloxacina Sulfisoxazol Trimetroprim

100 100 300 10 5 250 300 5

19 14 14 12 12 12 10 15-18 15-16 13-16

20-22

23 19 17 17

13-15 13-16 11-15

16 17 16

INTERPRETACIN DE LOS DIMETROS DE LAS ZONAS

Agente Contenido del antimicrobiano disco(mcg)
Resistente Intermedio Moderadamente susceptible Susceptible

Amoxicilinacido clavulnico Ampicilina Ampicilinasulbactan Cefazolina Cefotaxima Ceftriaxona Cefalotina Cloranfenicol Ciprofloxacina Clindamicina Eritromicina Gentamicina Imipenem

20/10mcg 10mcg/ml 10/10mcg. 30mcg. 30mcg 30mcg 30mcg 30mcg 5mcg 2mcg 15mcg 10mcg. 10mcg.

19 28 11 14 14 13 14 12 15 14 13 12 13 15-17

14-16

20 29 15 18 23 21 18 18 21 18 23 15 16

12-14 15-22 14-20 15-17 13-17 16-20 15-17 14-22 13-14 14-15

Continuacin Agente antimicrobiano Contenido del disco (mcg) Resistente

Intermedio

Moderadamente susceptible

Susceptible

Meticilina 5mcg Ofloxacina 5mcg Oxacilina 1 mcg Penicilina G 10 U Rifampicina 5mcg Tetraciclina 30mcg Trimetoprim1.25/23.75m sulfametoxazol cg. Vancomicina 30mcg Reportar slo en Urocultivo

9 12 10 28 16 14 10 9

10-13 13-15 11-12 17-19 15-18 11-15 10-11

14 16 13 29 20 19 16 12

35

Nitrofurantona 300mcg Norfloxacina Sulfisoxazol Trimetroprim 10mcg 250 300mcg 5mcg 14 12 12 10 15-16 13-16 13-16 11-15 17 17 17 16

DISCUSION 1- Caractersticas del medio de cultivo. 2- Principio del mtodo de difusin. 3- Elaboracin del reporte. 4- Antibitico. Quimioteraputico. 5- Otros controles: inculo, discos, siembra e incubacin.

PRACTICA No. 4 COPROCULTIVO

La infecciones ntericas pueden ser causadas por varios microorganismos, siendo de mayor importancia las bacterias del genero Shigella, Salmonella y desde 1991 el Vibrio cholerae O1 PROPSITO: Demostrar por medio del cultivo, la presencia de bacterias enteropatgenas, es decir que infectan el intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal, fiebre y a veces la muerte. OBJETIVOS 1- Observar y describir la morfologa de las Enterobacterias aisladas de la muestra de heces. 36

2- Utilizar un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de bacterias entricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.

3- Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioqumica de las

bacterias que aisle e intrprete los resultados obtenidos. 4- Realizar pruebas serolgicas para la identificacin de las principales Enterobacterias patgenas.

5- Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando las

tablas de referencia para la identificacin de Enterobacteriaceae.

MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras: Heces frescas (la mejor muestra) Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces) Material obtenido por proctoscopia. Biopsia de mucosa intestinal.

Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibiticos. Las heces debern procesarse lo ms pronto posible, de preferencia antes de 2-3 horas de ser emitidas. El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el ano un hisopo estril 4 centmetros, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda. En nios, introducir el hisopo 2.5 centmetros y dar la misma cantidad de vueltas. Cuando las heces, que se encuentran a 37C dentro del intestino, son colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20C), el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente

37

Shigella sp pierdan su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por esta razn si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada, debe colocarse en un medio de transporte bufferado que evite los cambios bruscos de pH. Para ste propsito colocar con hisopo estril una porcin de las heces (con sangre, moco o pus) bien cargado en tubos con 3 mL del siguiente medio de transporte: Glicerol Salino bufferado, (especialmente para Shigella). Caldo de Hagna GN (Gramnegativo). Pero el mejor medio de transporte para Enterobacterias es el Cary - Blair.

Otros caldos de enriquecimiento como Selenito, no deben usarse excepto en encuestas especiales para buscar Salmonella sp, ya que su uso retrasa 24 horas el resultado del coprocultivo, lo que disminuye considerablemente su utilidad clnica. La coloracin de Gram en heces nunca debe practicarse por carecer de significado clnico a menos que el mdico lo solicite. PROCEDIMIENTO: Debe conocerse la edad del paciente, anotar si es nio menor de 6 meses. Para efectuar el coprocultivo deben usarse medios que sean selectivos (contienen inhibidores, por lo que slo permiten el crecimiento de bacilos gram-negativos) y diferenciales (contienen lactosa e indicadores de pH que viran cuando se produce cido, lo que hace cambiar el color de las colonias y as las diferencia). Algunos de estos medios contienen sales de hierro que precipitan en forma de sulfuro ferroso de color negro intenso si las bacterias producen cido sulfdrico. El coprocultivo debe efectuarse en dos medios selectivos-diferenciales de preferencia uno ms inhibidor que otro. Se recomienda usar rutinariamente agar

38

Mac Conkey, Agar XLD o Agar SS (Salmonella-Shigella). En caso de heces con moco y sangre (disentera) debe incluirse adicionalmente el medio de Hektoen.

EFECTUAR EL COPROCULTIVO DE LA SIGUIENTE MANERA:

1. Inocular una porcin anormal de heces (con moco, sangre o pus) o de muestra similar, directamente en una caja de Mac Conkey y una caja de SS. El inculo se coloca con asa en anillo (flameada y fra) o con hisopo en las cajas de ambos medios. Inocular slo cm en un extremo en el Mac Conkey y 1 cm en el SS. El Hektoen se inocula igual que el Mac Conkey. 2. Diseminar el inculo utilizando dos asas en anillo. Flamear una de las asas mientras la otra se enfra. 3. Ya diseminadas de esta manera las muestras en la superficie de las cajas, incubar a 36C por 18 a 24 horas.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
1. Despus de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe contarse con una luz de lmpara que ilumine las cajas por detrs y observarlas. Marcar por detrs con un crculo de crayn graso cada tipo diferente de colonias sospechosas as: primero Mac Conkey escoger colonias lactosanegativo (incoloras). Si el paciente es un nio menor de un ao, se marcaran colonia tpica de Escherichia col (roja, brillante y de bordes lisos pero no mucosa). Examinar el SS de la misma forma, en este medio el crecimiento ser ms escaso ya que es ms inhibidor. Marcar por detrs una colonia lactosanegativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (cido

39

sulfhdrico) si las hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequea verde azulado (lactosa-negativo). 2. Colocar las cajas con las colonias previamente marcadas, usando una asa en aguja bien recta, flameada y fra, toque la superficie de la colonia seleccionada, teniendo cuidado de no pincharla o pasar tocando otras colonias cercanas. Con cuidado de no contaminar la punta del asa que ya toc la colonia sospechosa, destape un tubo (13 x 100mm) de TSI flame la boca del tubo, luego pnche el medio en el centro y hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retire el asa sin salir del tubo de TSI y estre rpido y parejo en la superficie inclinada. Flamear y con la misma asa inocule el medio de Citrato de Simmons, estre la superficie del medio, flamear y con la misma asa toque la misma colonia e inocule al medio de urea, flamee nuevamente y proceda a inocular el medio de movilidad y los caldos, siempre tocando la misma colonia inocule indol, rojo metilo y el Voges Proskauer. 3. Incube a 36C la gradilla que contiene las bioqumicas. Deben permanecer en incubacin de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar ligeramente flojos para permitir la entrada de oxgeno. 4. Examine las reacciones e interprete los resultados de acuerdo a la tabla de identificacin de pruebas bioqumicas. 5. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma).

40

COPROCULTIVOS
Heces frescas o Hisopo rectal Inocular Mac Conkey, SS y Selenito Incubar 18 24 horas a 36C Crecimiento colonias lactosa Lactosa Incubar 8 horas Subcultivar Mac Conkey (placas standard)

Incubar de 18 a 24 horas a 36C

(-)

41

Incubar TSI-Movilidad - Urea (-) Reportar NBP (adultos) Segn crecimientos y numero de Colonias Identificar y hacer antibiogramas en nios. Urea (-) Urea
Pruebas bioqumicas Primarias Tipeo Serolgico (Antisueros: B.C.D.A.AD. Shigella

(+)
Otras Enterobacterias Antibiograma

K/A Urea

Urea

Urea

PRACTICA No.5 CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE VIBRIO CHOLERAE O1

En el caso de clera el reporte debe ser inmediato, ya que en los casos graves la vida del paciente puede depender de ste resultado. MATERIALES: Hisopos estriles

42

Tubos de vidrio 15 x 100 mm Tubos de vidrio 16 x 100 mm Asa redonda

MEDIOS: Cary Blair 2 hisopos impregnados con heces o vmito. Agua pectonada alcalina (APA) Agar T.C.B.S.(Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa).

MUESTRAS: Heces lquidas Hisopo rectal Vmito

PROCEDIMIENTO: 1. Con uno de los hisopos del tubo con medio de transporte colocar el inoculo en el medio T.C.B.S regresar el hisopo al tubo de medio.

2. Estriar por agotamiento e incubar a 35C por 18 a 24 horas.

3. El otro hisopo introducirlo en el agua peptonada alcalina e incubar a 35C por 6 a 8 horas mxima a las 8 horas, hacer un subcultivo del agua peptonada, tomando 2 a 3 asadas de la superficie de dicho caldo o inocular otra caja de medio de TCBS, estriar por agotamiento o incubar a 35C por 18 a 24 horas. LECTURA:

43

Observar ambas cajas de TCBS buscando colonias amarillas cremosas y chiclosas, de estas inocular un TSI y un TSA (Tripticas soya agar), incubar a 35C por 18 a 24 horas.

Al observar el TSI A/A sin gas, hacer del TSA la prueba del hilo mucoso: en una lmina porta objetos suspender el inoculo de un cultivo de 18 a 24 horas en una gota de suspensin acuosa de desoxicolato de sodio al 0.5%) y la prueba de oxidasa.

Si ambas pruebas son positivas pasar a la serotipificacin con: antisuero polivalente y solucin salina para ver si es una cepa autoaglutinable. Con solucin salina no tiene que aglutinar.

Si aglutina con el suero polivalente continuar con el antisuero INABA, si con ste antisuero tambin aglutina reportamos: Se asla Vibrio cholerae O1 INABA, si no aglutina con el INABA, continuar con el antisuero OGAWA. Si este aglutina, reportamos. Se asla Vibrio cholerae 01 OGAWA.

Si en los tres antisueros aglutina se reporta: Se asla Vibrio cholerae O1 HIKOJIMA.

Si la oxidasa nos da positiva y con el antisuero polivalente no aglutina se reporta: Se asla Vibrio cholerae N O1.

Si no se observan colonias con caractersticas antes mencionadas se reporta: No se asla Vibrio cholerae.

VIBRIO CHOLERAE
Cary Blair TCBS Colonias lactosa (-) Colonias amarilla de 3 mm de dimetro (Trabajar con varias colonias sospechosas) Hisopo rectal Vmito Heces

Agar Mac Conkey

Agua Peptona Resiembra en TCBS a las 6-8 horas

44

Identificar Salmonella o Shigella Si No crecimiento No se asla Vibrio cholerae TSI TSA A/A K/A Gas (-) H-S(-) Reporte No

Si

TSA

No se asla Vibrio cholerae

Oxidasa y prueba del collar POSITIVO

NEGATIVO

Reporte No se asla Vibrio cholerae

Aglutina con Antisuero Polivalente anti. V.Cholerae Serogrupo 01.

POSITIVO V. cholerae Serogrupo 01

NEGATIVO V. cholerae No Serogrupo 01

DISCUSION
1. Definir coprocultivo. Casos especiales (nios menores de 5 aos e inmunodeprimidos) 2. Muestras clnicas: Cmo se toman? Cundo se indican? Cuidados en el manejo. Procesamiento. 3. Medios de cultivo: consistencia, composicin, aplicacin e importancia. 4. Reporte preliminar. Importancia, indicacin, como se hace, como se reporta. 5. Anlisis del resultado del cultivo.

45

6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubacin e interpretacin. 7. Antibiograma. Importancia. Antibiticos recomendados por la Organizacin mundial de la salud. 8. Uso de tablas para identificacin bacteriana. Reporte.

PRACTICA No. 6 UROCULTIVO

PROPSITO: El cultivo de orina que ha sido colectada adecuadamente o Urocultivo se efecta para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias.

46

En condiciones normales, la orina dentro del cuerpo es estril, pero siempre se contamina con bacterias al obtener la muestra. Por esta razn, el criterio para interpretar el crecimiento es cuantitativo. De acuerdo con el llamado Criterio de Kass un nmero de bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de colonias por mililitro de orina) se considera infeccin verdadera, es decir es un recuento significativo. A diferencia de otros cultivos bacteriolgicos, las bacterias que causan la infeccin urinaria, se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rpido. Las principales bacterias que afectan el sistema urinario son las Enterobacterias (bacilos Gramnegativos). La Escherichia coli es sin duda la bacteria que con ms frecuencia se asla de urocultivos positivos, luego tenemos: Klebsiella spp. Enterobacter spp. Proteus spp. Pseudomona aeruginosa (no es Enterobacteria).

De menor frecuencia tenemos los cocos grampositivos: Enterococcus spp. Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes y Streptococus spp. (raros). Staphylococcus epidermidis (puede ser por contaminacin) Staphylococcus saprophyticos(puede ser por contaminacin).

Las infecciones mixtas causadas por dos o ms especies bacterianas son raras, por lo que el crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminacin. La demostracin de piuria (presencia de leucocitos poliformonucleares en el sedimento urinario) y la Bacteriuria (bacterias en orina), son ambas de gran importancia para establecer el diagnstico de infeccin urinaria. OBJETIVOS 47

1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre dicho procedimiento. 2. Realizar examen directo con coloracin de Gram de las muestras de orina proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer el reporte preliminar. 3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el mtodo del asa calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados. 4. Identificar resultados. RECOMENDACIONES GENERALES. TOMA DE UROCULTIVO EN EL HOMBRE: a) Desinfectar bien el glande del pene del paciente con una gasa estril empapada con jabn antisptico no irritante. Remover el jabn con otra gasa estril, empapada en agua estril. b) Pedir al paciente que orine directamente en el inodoro. c) Despus de transcurrido unos 3 a 5 segundos, destapar rpidamente pero con cuidado un frasco estril de boca ancha tomar al vuelo a medio chorro una muestra de orina de la parte central de la miccin. Se deja correr la primera porcin de orina para que remueva las bacterias de la parte anterior del meato urinario, que contaminara el Urocultivo. Tapar rpidamente el frasco. d) Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en refrigeracin se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por un mximo de 48 horas. TOMA DE UROCULTIVO EN LA MUJER: los posibles microorganismos patgenos. Interprete los

48

En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en la toma de la muestra, ya que sus genitales estn expuestos, por lo tanto hay una abundante colonizacin de bacterias. Proceder de la siguiente manera: a) Solicitar a la paciente que se coloque sobre la tasa del inodoro con las piernas abiertas. Con los dedos ndices y medio de la mano derecha izquierda debe separarse los labios genitales mayores. b) Con una gasa empapada con jabn antisptico no irritante, limpiar bien toda el rea y luego remover el jabn con otra gasa empapada con agua estril. c) Obtener la muestra de orina a medio chorro, que corra el chorro de orina unos segundos y luego la tomar de la porcin central de la miccin. Tapar rpidamente. d) Sembrar antes de una hora refrigerar la muestra. TOMA DE UROCULTIVO EN NIOS PEQUEOS: a) En nios varones desinfectar bien con jabn antisptico no irritante, todo el pene y el rea genital. En las nias desinfectar bien los labios mayores y el rea genital que los rodea. Quitar bien el jabn con gasa y agua estril, luego secar gasa estril seca. b) Pegar una bolsita de plstico estril y descartable, especial para tomar urocultivos pediatricos. En nios tener la precaucin de introducir todo el pene en el orificio del llenado y en las nias que el agujero de la bolsa quede pegado al centro por donde saldr la orina. MATERIALES Placas de agar sangre. Placas de Mac Conkey Tubos de orina de pacientes con pielonefritis (la traer el alumno) Asa calibrada de 0.001ml finalmente con una

49

PROCEDIMIENTO: 1. Sembrar la orina en dos medios de cultivo segn la tcnica del Asa calibrada. Los medios de cultivo a utilizar son: a. Agar sangre de carnero al 5% crecen la mayora de microorganismos b. Agar Mac Conkey: Crecen solo bacilos Gramnegativos aerobios (Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.

2. Para sembrar usar un asa calibrada de platino (95% platino, 5% radio) que tome 0.001 mL. agitar el frasco de orina, abrir delante del mechero y flamear la boca del mismo. Introducir verticalmente el asa flameada y fra en la orina, justamente por debajo de la superficie.

3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo de la caja de petri pasando por el centro. Flamear o inocular en igual forma el medio de Mac Conkey.

4. Inmediatamente estriar con asa corriente en anillo el inoculo de orina, en ambas cajas, haciendo estras tupidas y perpendiculares a la estra dejada por el asa calibrada.

5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 36C en jarro de boca ancha con un trozo de papel absorbente hmedo y una candela encendida, cerrar bien.

6. Incubar el Mac Conkey sin jarro en la incubadora a 36C.

INTERPRETACIN:

50

1. Despus de incubar ambas cajas durante 18-24 horas interpretar resultados de ambas cajas simultneamente y con buena luz. 2. Contar el nmero de colonias presentes y multiplicar por 1000; si se us el asa calibrada de 0.001 mL, multiplicar por 100 si se utiliz un asa calibrada de 0.01 mL. 3. Recuento mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura: identificarlo con bioqumica, hacer sensibilidad y reportarlo.
UFC/ML 0 10,000 10,000-50,000 CRITERIO PARA REPORTAR Negativo a las 24 horas de incubacin a 36C Sugerir repetir cultivo. Revisar condiciones de toma de muestra y correlacin de leucocitos en sedimento urinario. Se aisl ___, _____, 000 UFC / mL(reportar el 50,000-100,000 nmero de UFC contado y especie bacteriana con su sensibilidad antimicrobiana. Se aisl ___, ms de 100,000 UFC / mL infeccin urinaria verdadera, hacer antibiograma y reportar.

100,000 ms

UROCULTIVOS
Sembrar con Asa calibrada de 0.001 mL Agar sangre (carnero) Agar Mac Conkey Incubar 18 a 24 horas

Crecimiento

No Crecimiento

51

Recuentos mayores de 50,000 de un solo tipo de bacterias

Recuentos menores de 50,000 de un solo tipo de bacterias

Reporte
Recuento de ms de un tipo de bacterias

Reporte

Recuento y cultivo negativo

Identificar bacteria sensibilidad

Identificar bacteria

Crecimiento mixto. Pedir nueva muestra

Reporte

Reporte

Recuento Bacteriano Sensibilidad

Recuento y nombre de bacteria

DISCUSION
1- Muestra de orina. Obtencin. Cantidad y procesamiento. 2- Deteccin de bacterias por la coloracin de Gram en orina no centrifugada. Aplicacin 3- Utilidad de usar agar sangre y agar Mac Conkey. 4- Cultivo. Inculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de cultivo. 5- Uso del factor y reporte.

52

PRACTICA No. 7 LQUIDO CEFALORRAQUDEO Y OTROS LQUIDOS DE DERRAME.

PROPSITO: Demostrar por medio de la tincin de Gram y el cultivo, la presencia de bacterias en estas muestras que normalmente deben ser lquidos estriles ya 53

que son tomadas por el mdico que las solicita en condiciones quirurgicas estriles, por eso, todo microorganismo que se aisle es patgeno. Las bacterias de mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son: GRAMNEGATIVOS. Neisseria meningitidis (causa meningitis meningococica severa) Haemophilus influenzae (Meningitis en nios de 6 meses a 4 aos de edad) Escherichia coli y otras Enterobacterias (en pacientes inmunodeficientes) Pseudomonas aeruginosa

GRAMPOSITIVOS: Streptococcus pneumoniae (muy importante) Staphyloccus aureus Streptococcus sp Streptococcus pyogenes.

OTROS MICROORGANISMOS IMPORTANTES: Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum Cryptococcus neoformans, Candida albicans

OBJETIVOS 1. Realizar el examen directo del Lquido cefalorraquideo, interpretar y hacer su reporte. 2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y otros lquidos de derrarme, inocularlos e incubarlos en condiciones adecuadas. 3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados. 4. Aislar e identificar hongos causantes de meningitis. 5. Procesar otros lquidos de derrame. MUESTRA:

54

Las muestras incluidas en los fluidos corporales son: Lquido cefalorraqudeo Lquido ventricular Fluido abdominal (lquido peritoneal o asctico) Lquido pleural Lquido pericardico Lquido sinovial Mdula sea.

Las muestras deben transportarse rpidamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no despus de 30 minutos de recolectados. Rotular con el nombre del paciente, nmero de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si el mdico sospecha que la muestra puede contener bacilos alcohol cido resistentes debe hacerlo saber en su solicitud al laboratorio. PROCEDIMIENTO: 1. El mdico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal del cual desee examen completo). 2. Uno de los tubos no se centrfuga, enviarlo para que se le haga el citoqumico (recuento total de clulas) recuento diferencial (frmula) y anlisis qumico. El otro tubo sirve para anlisis microbiolgico. 3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad. (2500-3000 RPM). Decantar aspticamente, tapar, agitar y procesar slo el sedimento. 4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de estos medios: a. Agar sangre de carnero al 5% b. Agar chocolate c. Agar Mac Conkey d. Sabouraud (hongos) e. Tioglicolato f. Lowenstein-Jensen (solo si se investiga BAAR) 55

5. Diseminar por estras en toda la superficie de los medios slidos. Introducir el agar sangre de carnero y el agar chocolate en jarro hmedo con candela encendida. Incubar todos los medios a 36C, excepto el sabouraud que se incuba a temperatura ambiente, para el aislamiento de hongos patgenos especialmente (Cryptococcus neoformans). 6. En porta-objetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis pequeos (de aproximadamente un centmetro de dimetro) en el centro de la lmina. 7. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl- Neelsen. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: Observa los frotis de sedimento de LCR con el objetivo de inmersin. En vista que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes con infeccin grave de las meninges, su observacin debe hacerse con todo cuidado. Observar las siguientes morfologas: 1. Diplococos gram-negativos (rojos o rosados), arrionados, dispuestos en parejas como granos de caf, idnticos a N. gonorrhoeae de pus uretral: morfologa compatible con N. meningitidis. Dar alerta al mdico inmediatamente. 2. Cocobacilos gram-negativos (rojo plido) pleomorficos, con escasas formas bacilares: morfologa compatible con H. Influenzae agente de meningitis en nios de 6 meses a 4 aos. 3. Cocos gram-positivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en parejas o cadenas cortas, la cpsula se insina como halo claro alrededor de las bacterias: En LCR morfologa compatible con Streptococcus pneumonae.

56

4. Bacilos gram-negativos (rojos) de coloracin slida, no pleomorficos, bacilos alargados: morfologa compatible con Enterobacterias o Pseudomonas (E. Coli, Salmonella sp, Pseudomonas aeruginosa). 5. Levaduras redondeadas. Algunas con gemaciones laterales, gram positivo se insina cpsula, hacer tinta china, para demostrar la presencia de levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus neoformans. 6. En Zielh-Neelsen: bacilos alcohol-cido resistente (rojos) cortos, algunos con coloracin dispareja en forma de grnulos: morfologa compatible con Mycobacterium tuberculosis. INFORME: El primer informe, entregar el mismo da de la obtencin del muestra: Frotis de Gram: se observan morfologa de bacterias, cantidad de leucocitos. Cultivo pendiente. El segundo informe; entregar el da que termina la identificacin: Cultivo: se asla: Nombre de la bacteria, gnero, especie ms antibiograma.

L.C.R. Y LQUIDOS DE DERRAME

Agar sangre Agar chocolate Caldo, Tripticasa soya Gram Incubar 18 a 24 horas

57

Crecimiento ms

No crecimiento Reincubar 24 horas

Gram Identificar bacteria Sensibilidad Reporte Crecimiento No crecimiento Reporte

Bacteria aislada Sensibilidad

Gram Subcultivo del caldo Identificar bacteria Antibiograma Reporte Cultivo negativo a las 48 horas

Se aislo: (Dar nombre de bacteria y sensibilidad

DISCUSIN 1- Muestra. Cantidad y procesamiento. 2- Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clnico. 3- Diagnostico preliminar. 4- Medios de cultivo. 5- Aislamiento e identificacin bacteriana. 6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 7- Reporte definitivo.

58

PRACTICA N. 8 HEMOCULTIVO
PROPSITO: El hemocultivo o cultivo de sangre, sirve para detectar las bacterias que se estn reproduciendo en la sangre, lo que provoca septicemia. Cuando las bacterias se multiplican a una velocidad que excede la capacidad del sistema retculo-endotelial para removerlos de la sangre, ocurre la septicemia. Se

59

diferencia de la bacteremia, que es la presencia transitoria de bacterias en el torrente circulatorio. Usualmente causa septicemia una sola especie bacteriana. OBJETIVOS 1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones aspticas e inocularlas en los medios de cultivo apropiados. 2. Reconocer en forma macroscpica los signos visibles de crecimiento bacteriano de un hemocultivo positivo. 3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculacin de muestras de sangre en el laboratorio, as como tambin los procedimientos efectuados para la identificacin bacteriana. 4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si los hay. MUESTRA: Los sntomas del paciente que indican la necesidad de obtener un hemocultivo son: Aumento sbito del pulso y la temperatura, cambios sensoriales, escalofros, postracin y presin baja. Adems la recuperacin de las bacterias de la sangre depende de los siguientes factores. 1. Cantidad de sangre que se cultiva. En nios debe ser al menos 2.5 mL y en adultos usualmente 5 mL. 2. La relacin entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10 es decir sangre al diez por ciento en caldo, con el objeto de evitar coagulacin. 3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como anticuerpos, complemento o antibiticos. 4. La caracterstica de la bacteria de ser fastidiosa es decir que requiere de un medio de cultivo enriquecido y complejo. 5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar el tratamiento con antibiticos. 6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en tiempo y sitios diferentes, es decir seriado. 60

INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO: 1. Destapar el frasco con caldo de hemocultivo, para descubrir el tapn de hule perforable. Dejar la tapadera a un lado y con un algodn empapado en solucin de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapn perforable. Dejar secar mientras se atiende al paciente. 2. Colocar la ligadura en el brazo del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisin el sitio donde se va a puncionar. 3. Lavar con agua y jabn el brazo del paciente, antes de aplicar desinfectante. Limpiar el sitio correcto con un algodn empapado en tintura de yodo al 3%. Dejar secar y luego limpiar el sitio de puncin con un algodn empapado en alcohol, con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio de puncin. 4. Con aguja y jeringa estriles, puncionar la vena y obtener aspticamente 5 mL o ms de sangre. 5. Inyectar exactamente 5 mL de sangre en el frasco que contiene 45 mL de caldo o 10 mL en un frasco con 90 mL de caldo. En los hemocultivos peditricos, inyectar 2.5 mL de sangre en 25 mL de caldo. 6. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 36C.

PROCEDIMIENTO: 1. Incubar los hemocultivos por siete das, excepto en casos especiales en los cuales debe prolongarse la incubacin, por ejemplo para el aislamiento de Brucella spp. 2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, examinar diariamente los frascos contra la luz, para buscar algunos de los siguientes signos visibles que indican crecimiento bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que esta creciendo:

61

Signos Visible Turbidez

Posible Bacteria Bacilos Gramnegativos aerobios

Staphylococcus spp. Bacteroides spp. Estreptococcus spp. Staphylococcus spp

Hemlisis

Listeria spp Clostridium spp. Bacillus spp. Bacilos Gramnegativos aerobios Anaerobios Staphylococcus spp. Streptococcus Pseudomonas spp. Bacillus spp. Levaduras

Formacin De Gas Colonias Visibles Como Motas de Algodn

Formacin De Pelcula

Coloracin Verdosa (Raro)

Pseudomonas aeruginosa

1. En caso de observar cualquiera de estas caractersticas, agitar suavemente, limpiar el tapn perforable con algodn y alcohol, puncionar con jeringa y aguja estril, y aspirar una pequea cantidad de caldo. Inocular una gota y luego estriar con asa sobre una caja de agar sangre y una caja de agar chocolate; incubar ambas en jarro con candela. Simultneamente dejar secar dos gotas del caldo sobre un porta objetos, colorear con Gram.

2. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de inmersin, pues la observacin de las bacterias es la base de su caracterizacin. Adems, algunas bacterias como Haemophilus influenzae, 62

no producen signos visibles en el caldo si se observan bacilos o cocobacilos gram-negativos, inocular adicionalmente una caja de Agar Mac Conkey; incubar aerbicamente. Esto es especialmente importante para el

aislamiento o identificacin de Salmonella typhi.

3. Si se observan cocos gram-positivos esfricos y con tendencia a agruparse en racimos, inocular una caja de agar manitol-sal, para facilitar el aislamiento e identificacin de Staphylococcus aureus. Si se observan diplococos o cadenas cortas de cocos gram-positivo ovalados, aplicar los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda estra del agar sangre, para aclarar la identificacin presuntiva de Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.

4. Rutinariamente

revisar

los

hemocultivos

aparentemente

negativos.

Proceder as: hacer aspticamente un frotis de Gram del caldo a las 48 horas y tambin al sptimo da de incubacin. La incubacin prolongada puede producir una leve turbidez de fibrina.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 1. Con siete das de incubacin a 36C se recupera el 95% de las bacterias clnicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento de colonias lactosa-negativo sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar inmediatamente el crecimiento en agar sangre con antisuero polivalente antisalmonella, anti-salmonella del grupo D y anti-antgeno Vi. Si hay aglutinacin franca, reportar inmediatamente la presencia de salmonella typhi.

63

2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son las siguientes:

Salmonella typhi Escherichia coli Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae

3. Algunas bacterias que frecuentemente crecen en hemocultivos como contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:

Bacillus sp Corynebacterium sp.

INFORME: 1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observan bacterias en el Segundo control por coloracin de Gram, a los siete das de incubacin, NUNCA ANTES. Reportar as: NEGATIVO A LOS SIETE DAS DE INCUBACIN A 36C.

2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubacin reporta cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta 64

especie, aunque la identificacin sea presuntiva. Reportar as: SE AISL ____________________SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.

3. En el caso del aislamiento e identificacin de Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes de hemocultivo, se reportar as: SE AISLO con

Streptococcus________________,

recomienda

tratamiento

penicilina. S se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad a la penicilina.

4. Despus de interpretar

los resultados de la prueba de susceptibilidad

antimicrobiana, enviar otro reporte, as: Se aisl:__________________________________ Susceptible a:______________________________ Intermedio a:_______________________________ Resistente a: _______________________________

HEMOCULTIVOS
Muestra N 1 Muestra N 2 5 mL de sangre 45 mL de medio Incubar 24 horas Sub-cultivo en agar chocolate y hacer coloracin de Gram 65

Subcultivo y Gram positivo

Subcultivo y Gram negativo

Incubar

Identificar bacteria Sensibilidad

Observar diariamente

Reporte Bacteria Sensibilidad 7 da hacer Subcultivo en agar chocolate y Gram

Cultivo negativo al 6 da de incubacin

DISCUSION
1- Obtencin de la muestra 2- Medios de cultivo utilizados e incubacin 3- Elaboracin del reporte preliminar 4- Resultado Final 5- Resultado del antibiograma

66

PRACTICA N0.9 IDENTIFICACION DE MICOBACTERIAS

Este grupo de bacterias en forma de bacilos, se tien con dificultad por el alto contenido de grasa en su pared celular. Para lograr teirlas deben usarse coloraciones con fenol y calor. Una vez teidas con fucsina carblica, no se decoloran con alcohol acidificado. Por esta caracterstica muy particular se les llama BACILOS ALCOHOL-CIDO RESISTENTES. Las mycobacterias son aerobios estrictos, no mviles, no poseen cpsula no producen esporas. Su crecimiento es sumamente lento, la mayora de especies patgenas crecen despus de 2 a 6 semanas de incubacin a 36C en el medio de Lowenstein-Jensen. Aproximadamente 12 especies de Mycobacterium se

67

asocian con enfermedad , en nuestro medio, sin lugar a duda, es la especie ms importante PROPOSITO.

M. tuberculosis

Demostrar por medio de coloracin y cultivos especiales la presencia de bacterias pertenecientes al gnero Mycobacterium, especialmente Mycobacterium tuberculosis. OBJETIVOS 1-Conocer las tcnicas de laboratorio tiles para la identificacin de M. tuberculosis. 2-Conocer las tinciones utilizadas para la identificacin presuntiva de M. tuberculosis. MUESTRAS. 1. Esputo: Es la muestra que con mayor frecuencia se remite al laboratorio para la investigacin de tuberculosis.

El esputo debe colectarse temprano en la maana, inmediatamente al

despertar. De preferencia tres a cuatro muestras (seriadas) en das alternos.

El primer esputo de la maana es la ms adecuada para el anlisis, pues

es ms concentrada y menos contaminada.

Colectar la muestra antes de iniciar tratamiento. Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca dos veces con
agua corriente, no debe de usar pasta dental o cualquier otro antisptico.

El paciente debe depositar la muestra en un recipiente estril de boca

ancha.

El paciente que tiene dificultad para producir esputo puede usar estos
mtodos:

68

b) Nebulizacin de solucin salina hipertnica (cloruro de sodio al 10%, sin propilenglicol), es excelente para inducir la produccin de esputo, generalmente diluido. c) Los hisopos farngeos pueden ser usados en estos pacientes para extraer el esputo. Especialmente este procedimiento es aconsejable para nios pequeos a los cuales no se les pude pedir una muestra adecuada. d) Broncoscopa: Puede ser usada para obtener las muestras

directamente del sitio infectado. 2. Lavado gstrico: Frecuentemente se solicita lavado gstrico para anlisis de micobacterias. No se usa para detectar tuberculosis del estmago, sirve para demostrar micobacterias del esputo que el paciente involuntariamente se ha tragado. 3. Orina: Se debe examinar un mnimo de tres muestras de la PRIMERA ORINA DE LA MAANA colectar a medio chorro en un recipiente estril de boca ancha. 4. Otro tipo de Muestra:

Lavado bronquial Fragmentos de pulmn Hisopado farngeo Lquido cefalorraqudeo Lquido pleural Lquido articular Pus Raspado endometrial (sangre menstrual) Mdula sea

69

 Lquido pericardico Trozos de tejido de biopsias.

PROCEDIMIENTO: El diagnstico de Micobacterias se basa en la observacin de los bacilos alcohol-cido resistentes en la muestra y su cultivo IN VITRO. Los bacilos alcohol-cido resistentes deben teirse con las coloraciones de Zielh-Neelsen o Kinyoun. Ambas tcnicas dan buen resultado.

COLORACIN DE KINYOUN: Tiene la ventaja de que no necesita calentamiento. Proceder as: 1. Preparar el frotis de igual forma que para Zielh-Neelsen y fijarlo con calor. 2. Colocar la lmina en la gradilla de coloracin y dejar que enfre. Cubrir el frotis con Fucsina de Kinyoun y dejar que se coloree por 4 minutos. No es necesario calentar. 3. Lavar con agua corriente 4. Decolorar el frotis con alcohol-cido hasta que ya no salga ms colorante rojo. 5. Lavar con agua corriente. 6. Cubrir el frotis con azul de metileno por 1 2 minutos. 7. Lavar con agua corriente. 8. Dejar secar y examinar con lente de inmersin.

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN:

1-Cubrir el frotis previamente fijado con fucsina fenicada por 5 minutos y calentar hasta la emisin de vapores. (No hervir). 2- Lavar con agua de chorro.

70

3- Decolorar con alcohol-cido por 2 minutos. 4- Lavar con agua de chorro. 5- Cubrir el frotis con azl de metileno por 1 minuto. 6- Lavar con agua de chorro y dejar secar.

INTERPRETACIN DE LA BACILOSCOPA: Nmero de Bacilos Alcohol-cido Resistente 0 1 a 2 en todo el frotis 3 a 9 en todo el frotis 10 ms en todo el frotis 1 ms por campo Reporte No se observan bacilos Alcohol-cido Resistente Informar el nmero de BAAR encontrados y pedir nueva muestra + escasos ++ regular cantidad +++ abundantes

CULTIVO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Antes de inocular los medios de cultivo para la identificacin final de M. tuberculosis deben realizarse una serie de procedimientos para tener xito en los aislamientos. Dentro de los procedimientos a realizar tenemos: A) Descontaminacin B) Neutralizacin C) Centrifugacin Luego de realizar estos procedimientos se procede a inocular los medios de cultivo apropiados. DISCUSION 1- Medios de cultivo utilizados en la identificacin de Mycobacterias. 2- Tinciones utilizadas. Uso de cada colorante.

71

3- Reporte preliminar. 4- Baciloscopia. Ventajas, desventajas y utilidad clnica.

PRACTICA No. 10 CULTIVO DE GARGANTA.

Debido a la gran ocurrencia de procesos infecciosos en el rea farngea, el estudio bacteriolgico del exudado farngeo es uno de los procedimientos que con mayor frecuencia se realizan en el laboratorio clnico. La flora aislada incluye cocos y bacilos, tanto Grampositivos como Gramnegativos adems de encontrarse cierto nmero de levaduras. Para un estudio satisfactorio del exudado farngeo es necesario tomar una adecuada muestra de la regin de amgdalas y faringe. El cultivo se efecta para demostrar la presencia de Sreptococcus pyogenes, Steptococcus agalactiae y otras especies del gnero Streptococcus. Otras bacterias que frecuentemente se pueden aislar en un cultivo de garganta son las siguientes: 72

 Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa
Estos microorganismos solo se deben reportar si predominan sobre la microbiota normal. OBJETIVOS 1- Colectar muestras de exudado farngeo en forma adecuada y cuando sea conveniente la estudie por la tcnica del examen directo con la coloracin de Gram y Azul de metileno. 2- Observar los microorganismos presentes en las preparaciones anteriores y determinar cuales pudieran ser patgenos de la faringe. Escribir el reporte correspondiente. 3- Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas de sus compaeros. 4- identificar los posibles microorganismos patgenos aislados en los medios de cultivo y realizar pruebas especiales para su identificacin. MUESTRA: La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algn tratamiento con antibiticos. Adems si el paciente ya comi se recomienda dejar pasar unas dos horas para que se vuelva a formar la secrecin deglutida.

73

Localizar el fondo de la garganta y en las amgdalas (que se encuentran a los lados), observar las siguientes lesiones: Inflamacin (Enrojecimiento) Pus (secrecin blanquecina o amarillenta) lceras blanquecinas.

Con un hisopo estril frotar firmemente las lesiones con sumo cuidado de no tocar la lengua, la campanilla, la pared interna de los carrillos, labios y dientes al retirar el hisopo.

PROCEDIMIENTO: 1. Inocular inmediatamente una caja (placa) de agar sangre al 5%, hacer dos cortadas en el agar durante la siembra. Las cortadas deben ser aproximadamente de 1 cm de largo y el asa debe llegar al fondo de la caja. El propsito de las cortadas es introducir las bacterias dentro del agar para alejarlos del oxgeno atmosfrico y as incrementar la hemlisis tipo beta. 2. Con el objeto de obtener cultivos evidentes de Streptococcus pyogenes, sin necesidad de hacer sub-cultivos proceder as: Con pinza flameada y fra, colocar en la zona de ms fuerte inoculacin en el agar sangre de carnero (primera estra), un disco de 30 mcg de neomicina. A unos 8 10 mm de distancia, colocar un disco de 0.04 unidades de bacitracina. Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae son resistentes al antibitico neomicina, por lo que crecen en cultivos casi puro alrededor de ste disco. 3. Introducir la caja en un frasco de vidrio de boca ancha, poner en el fondo una toalla de papel hmeda, colocar la caja con el medio y luego introducir una candela corta y encendida, cerrar el frasco. La candela se apagar sola. 4. Incubar por 18 a 24 horas a 36C

74

INTERPRETACIN. Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de exudados farngeos, tomar en cuenta lo siguiente: Tipo de Hemlisis ALFA BETA Inhibicin por Bacitracina + (Si produce halo) Apariencia del Halo Verde (Incompleta) Claro, del color del medio (Completa ) REPORTE Reportar Se aisl Streptococcus pyogenes beta hemoltico Lancefield - (No inhibicin) DISCUSION 1- Reporte preliminar 2- Toma de muestra. 3- Cultivo. Medios utilizados. Inoculacin. Lectura e interpretacin. 4- Subcultivo. Identificacin. Antibiograma. 5- Reporte final. Streptococcus sp. beta hemoltico no del grupo A de Lancefield del grupo A de

75

PRACTICA No.11 SECRECIONES GENITALES

PROPSITO: Demostrar la presencia de microorganismos de varios tipos bacterianos que infectan los rganos genitales femeninos y masculinos, tales como: Neisseria gonorrhoeae: Bacteria, causante de la gonorrea. Garnerella vaginalis: Bacilo gramnegativo causante de la vaginosis. Treponema pallidum: Bacteria causante de la sfilis. Candida albicans: Hongo levaduriforme, causante de la vulvovaginitis. Trichomonas vaginalis: Protozoo, causante de tricomoniasis vaginal.

OBJETIVOS

76

1. Realizar el examen directo de la secrecin uretral utilizando la coloracin de Gram. 2. Elaborar el reporte preliminar. 3. Cultivar la muestra en los medios de cultivo adecuados y seguir la marcha bacteriolgica correspondiente para la identificacin del microorganismo causante de la infeccin. 4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 5. Elaborar el reporte final.

LA TOMA DE LA MUESTRA
HOMBRES: 1. Tener listo: hisopos estriles, porta-objetos limpios, agar sangre y agar Thayer Martin. 2. Con el hisopo estril tomar una gota de la secrecin. 3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el porta objetos, haciendo rodar el palillo sobre la lmina, no frotar 4. Simultneamente inocular los medios slidos (agares) MUJERES: 1. En las mujeres la muestra la debe obtener el gineclogo. Tener listo el mismo material que en el caso de los hombres. 2. Hacer el mismo procedimiento. PROCEDIMIENTO: 1. Colorear los frotis con coloracin para Gram. 2. Con asas flameadas y fras, diseminar por estras el inoculo sobre la superficie de las placas. 3. Incubar el agar sangre y el de Thayer Martn durante 24 a 48 horas a 36C en jarro hmedo con candela encendida.

77

INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de caf y Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular.)

CULTIVO: Despus de 24 a 48 horas de incubacin a 36C en jarro con candela, examinar el Thayer Martn, ya que este contiene sustancias enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorreae. Efectuar la prueba de oxidasa para verificar gnero. La prueba de oxidasa puede efectuarse aplicando directamente el reactivo lquido al cultivo o sobre discos de papel filtro ya impregnado con el reactivo. Luego identificar la especie Neisseria gonorreae por medio de la prueba de oxidacin de tres azcares (CTA): maltosa, glucosa y sacarosa (sucrosa). DISCUSION 1- Toma de muestra. 2- Diagnostico preliminar. 3- Medio de cultivo. Composicin. Incubacin. 4- Interpretacin del cultivo 5- Pruebas bioqumicas utilizadas. 6- Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos. 7- Reporte final.

78

SECRECIONES

Incubar de 18 a 24 horas

Agar Sangre Agar Chocolate Agar Mac Conkey Tioglicolato Gram

Crecimiento

No crecimiento Reincubar 24 horas ms

Gram Identificar bacteria Sensibilidad

Crecimiento en placas en subcultivos de caldo

No crecimiento Reporte 79

Reporte Bacteria aislada Sensibilidad

Cultivo negativo a Gram las 48 horas de Identificar bacteria incubacin Sensibilidad

Reporte nombre de bacteria y sensibilidad

BIBLIOGRAFA
Gustavo A. Gini Q.B. Manual de Procedimientos para la Identificacin de las bacterias con importancia clnica, Segunda Edicin, Guatemala 1995.

Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social. Unidad de Laboratorio Manual Normativo, toma, manejo y envi de muestras para anlisis de laboratorio. Pginas 1-11, San Salvador. El Salvador 1995.

Miguel Francisco Torres. Manual Prctico de Bacteriologa Mdica. Segunda Edicin. Pginas 41-189, Guatemala 1999.

Giuseppe Nicoletti, Vito Nicolosi Diccionario de Bacteriologa Humana Centro Documentacin Cientfica Menarini Barcelona 1990.

80

Hospital Nacional de Nios Benjamn Bloom. Manual de Tcnicas de Microbiologa Pg. 1-44. San Salvador, El Salvador 1996.

Koneman/ Allen/ Dowell/ Janda y otros. Texto y Atlas, Diagnostico Microbiolgico. 4ta Edicin. Editorial Mdica Panamericana.

Anexos

81

Anexo 1 Coloraciones
COLORACIN DE GRAM. 1. Hacer un frotis. 2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar. 3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 1 minuto. 4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua 5. Cubrir el frotis con lugol para Gram por 1 minuto. 6. Lavar con agua de chorro. 7. Decolorar con alcohol acetona por 20-30 segundos. 8. Lavar con agua de chorro. 9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos. 10. Lavar con agua de chorro. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo 100x. INTERPRETACION Bacterias Gramnegativas: Color rojo o rosado. Bacterias Grampositivas: Color violeta oscuro.

82

TINCION DE ALCOHOL CIDO RESISTENTE. (Ziehl- Neelsen).

Esta es una tincin diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias que por su alto contenido de sustancias lipdicas o creas se tien con dificultad por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teidas resisten el colorante an cuando se les lave con una mezcla de alcohol- cido clorhdrico. Esta tincin es importante para distinguir, entre otras las bacterias cido resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. (Mycobacterium sp). Existen varias tcnicas para este tipo de tincin, sin embargo nos referimos a la de Ziehl- Neelsen. REACTIVOS: 1. CARBOLFUCSINA: Fucsina bsica...................................... 0.3 g Etanol 95C........................................... 10.0mL Cristales de fenol fundidos por calor...... 5. 0mL Agua destilada....................................... 95.0mL Disuelva la fucsina bsica en el alcohol y el fenol en el agua. Mezcle las dos soluciones y deje en reposo por una semana antes de usar. Almacene en frascos mbar a temperatura ambiente. 2. ALCOHOL- CIDO: Etanol 95C.............................................97.0mL cido clorhdrico concentrado................ 3.0mL Agregue el HCL al alcohol, homogenice y almacene en frascos a temperatura ambiente. 3. AZUL DE METILENO:

83

Azul de metileno.................................... 0.3 g Agua destilada....................................... 100.0mL Disuelva el azul de metileno en el agua mediante agitacin. Almacene en frascos mbar a temperatura ambiente. FILTRE LOS COLORANTES AL MENOS UNA VEZ AL MES. PROCEDIMIENTO: 1. Prepare un frotis adecuado de la muestra a estudiar.

2. Cubra la lmina con CARBOLFUCSINA y caliente suavemente hasta que

haya emisin de vapor. NO DEJE QUE EL COLORANTE HIERVA NI SE SEQUE. Agregue ms carbolfucsina si es necesario. Mantenga la emisin de vapor durante 3-5 minutos. 3. 4. Lave la preparacin con agua del grifo. Decolore con alcohol- cido durante 2 minutos o hasta que queden slo trazas de color rosado. 5. Lave con agua del grifo

6. Aplique el colorante de contraste AZUL DE METILENO por un minuto.

7. 8. Lave con agua del grifo. Deje secar y observe con objetivo de inmersin.

RESULTADO: Bacterias alcohol- cido resistentes: rojas. Bacterias alcohol- cido sensibles: azules.

84

CONTROL DE CALIDAD: Utilice una mezcla de bacterias que contengan bacilos alcohol cido resistentes (Mycobacterium sp.) y cocos alcohol- cido sensibles (Staphylococcus sp.)

COLORACIN DE AZUL DE METILENO PARA MUESTRAS DE HECES.

Es una coloracin directa simple usada para diferenciar las caractersticas morfolgicas de microorganismos y glbulos blancos en materia fecal. Utilizado para diferenciacin de glbulos blancos en muestras de heces el procedimiento puede desarrollarse: Con un montaje hmedo (directo al fresco) o con frotis de heces que contengan leucocitos (el cual ha sido previamente fijado). PROCEDIMIENTOS PARA FROTIS FIJADOS. 1. Hacer un frotis a partir de una muestra de heces dejar sacar al aire.

2. Fijar con metanol al 95% por 1-2 minutos dejar secar. 3. Cubrir la preparacin con azul de metileno por 30-60 segundos.
4. Lavar con agua. Dejar secar. Observar microscopio con objetivo 100x.

INTERPRETACIN.

85

En este caso se usa para diferenciar leucocitos fecales en enfermedades invasivas. Predominio de Neutrfilos: se asume que existe un proceso infeccioso de origen bacteriano. Predominio de Linfocitos: se asume que el proceso infeccioso es de origen viral. Elevado nmero de Eosinfilos: Se sospecha la presencia de parsitos o una enfermedad crnica.

REPORTE. Contar 100 clulas y reportar: porcentaje de linfocitos y porcentaje de PMN. Si estn escasas las clulas reportar: solo el nmero de clulas encontradas sin reportar porcentaje. Ejemplo: 25 PMN, 2 Linfocitos. Si no se observan clulas, reportar: 0% de linfocitos, 0% de PMN.

86

Anexo 2. Otras pruebas bacteriologicas

PRUEBA DEL CORDN.
En una lmina colocar unas gotas de desoxicolato de sodio al 0.5% y suspender las colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve sumamente viscosa si es una bacteria del gnero Vibrio. Esta viscosidad se puede visualizar mejor si se sumerge dentro de la mezcla un asa. Al retirar el asa de la preparacin se forma un cordn o hilo de mucosidad entre el asa y la mezcla.

PRUEBA DE LA COAGULASA.
La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibringeno que est presente en el plasma humano o animal, en fibrina, lo cual se evidencia en el laboratorio por la formacin de un cogulo visible. Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la producen.

87

La coagulasa est presente en las bacterias en dos formas: a) libre y b) unida a la pared de la bacteria. La coagulasa unidad a la pared se evidencia haciendo la prueba en lmina, y la coagulasa libre se determina haciendo la prueba en tubo. La prueba en lmina es presuntiva y a todos los cultivos que den la prueba dbil o negativa se les debe hacer la prueba en tubo, porque algunas cepas de S. aureus slo producen la coagulasa libre.

MEDIOS Y REACTIVOS. 1. 2. Plasma de conejo o plasma humano obtenido de sangre fresca estril, no nitratada. Cloruro de calcio al 5%: Pese 5.0 gramos de Cloruro de calcio, deposite en un baln aforado de 100 mL y lleve con agua destilada hasta la marca de aforo.

3. Medio de cultivo: Cualquier medio slido, libre de sal (NaCl) debe usarse
para que crezca el microorganismo a probar.

PRUEBA EN LAMINA. 1. Ponga una gota de solucin salina estril en un portaobjeto limpio.

2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber crecido
en un medio libre de sal. Haga con el asa una emulsin homognea en la gota de solucin salina. 3. 4. Agregue una gota de plasma a la suspensin de bacterias y mezcle. Observe si hay formacin inmediata o no de un precipitado granular de cogulos blancos.

PRUEBA EN TUBO. 1. Agregue aspticamente 0.5 mL de plasma a un tubo estril 12 x 75 mm.

88

2. 3.

Aada 0.5 mL de cultivo crecido en caldo infusin de cerebro y corazn o una asada de un cultivo crecido en un medio slido. Incube el tubo en un bao Mara a 35C.

LECTURA E INTERPRETACIN
1. PRUEBA EN LAMINA:

PRUEBA POSITIVA: Formacin de un precipitado granular dentro de un perodo de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Despus de 1 minuto si aparece precipitado, monte la prueba en tubo.

PRUEBA NEGATIVA: Suspensin homognea. Confirme el resultado con la prueba en tubo. 2. PRUEBA EN TUBO: Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas est negativa, deje 24 horas en el bao Mara. PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de cogulo. PRUEBA NEGATIVA: Suspensin permanece homognea. CONTROL DE CALIDAD: a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35C. b. Control de coagulacin: Agregue una gota de solucin de Cloruro de calcio al 5% a 0.5 mL de plasma. El plasma debe coagular en un periodo de 1 minuto.

89

c. Control positivo: S. aureus. d. Control negativo: S. epidermidis.

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES: 1. Si se usa plasma citrato, agregue 5 unidades de heparina/ mL para eliminar
falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que microorganismos que utilizan citrato causan coagulacin del plasma al consumirlo. 2. Si el cultivo a probar tiene ms de 24 horas o es escaso se puede obtener una prueba de coagulasa dbil.

3. Si una colonia no se suspende en la solucin salina en la prueba en lmina, el resultado es imposible de interpretar. 4. No se deben emplear inculos provenientes de medios con alta concentracin de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solucin salina. 5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la formacin de cogulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un rompimiento del cogulo inicial que no se formar de nuevo. 6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen cepas de S. aureus que producen grandes cantidades de fibrinolisina, por lo que el cogulo se puede lisar antes de 4 horas e interpretar errneamente el resultado como negativo.

90

7. Algunas cepas producen poca coagulasa, por lo que la formacin del cogulo se evidencia hasta las 24 horas de incubacin.

PRUEBA DE LA CATALASA.
La catalasa, es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas. El perxido de hidrgeno es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal para el microorganismo. La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin: CATALASA H202 2H2O+O

Esta prueba es de vital importancia en la diferenciacin de Streptococcus (catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).

91

REACTIVO Perxido de hidrgeno al 3%: Se prepara con perxido de hidrgeno y agua destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se descompone fcilmente. Debe almacenarse en refrigeracin y en botella color mbar. Adems justo cuando se va a usar debe revisarse que d bien con los controles de calidad. 1. PRUEBA EN LAMINA. a) Con una aguja bacteriolgica o un aplicador estril, pique el centro de una colonia bien aislada y transfiera el inculo a un portaobjeto limpio. b) Aada 1 o 2 gotas de perxido al 3%. c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo. d) Descarte la lmina en un recipiente con desinfectante.

2. MTODO EN PLATO O TUBO CON AGAR. a) Aada unas gotas del perxido de hidrogeno al 15% directamente sobre la superficie donde hay crecimiento. b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.

CONTROL DE CALIDAD.

a) Control positivo: Staphylococcus sp. b) Control negativo: Streptococcus sp.

PRECAUCIONES. 1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de nihcrome no interfiere.

92

2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.

3. El perxido de hidrgeno es extremadamente custico por lo que se debe

evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras dolorosas. En caso que ocurran, inunde de inmediato el rea afectada con alcohol al 70% para neutralizar la accin. NO DEBE USAR AGUA.

PRUEBA DE OXIDASA.
La enzima Oxidasa, conocida tambin como CITOCROMO O OXIDASA O INDOFENOL OXIDASA. Se encuentra presente en una gran variedad de seres vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su funcin es la de promover la oxidacin del citocromo c a expensas del oxgeno molecular. En bacteriologa se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una poblacin bacteriana con su sustrato oxidable como el dimetil o tetrametil- pfenilendiamina y el resultado observado es la aparicin de color que va del rosado al prpura. Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:

2 citocromos c reducidos + 2H* + O2 CITOCROMO.c2 citocromo c oxidativos + H2O OXIDASA.

2 citocromos c reducidos + REACTIVO OXIDACIN

COMPUESTO COLOREADO

93

Esta prueba es sumamente importante en la identificacin de bacterias Gram negativas y en la diferenciacin de cocos Gram positivos de importancia clnica: Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa excepto S. Sciuri).

REACTIVOS.

I.

PARA GRAM NEGATIVOS.

Tetrametil P- fenilendiamina dihidrocloruro....................... 0.1 g Agua destilada................................................................... 10 mL.

1. REACTIVO DE KOVAC

Agregue agua al tetrametil p- fenilendiamina y disulvalo. Si es necesario caliente lentamente para lograr la disolucin completa. Este reactivo debe ser incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si presenta otro aspecto, descrtelo; es poco estable y se oxida rpidamente, de tal forma que debe prepararse justo antes de usarlo. De los reactivos empleados para detectar OXIDASA, este es el MS SENSIBLE. 2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Dimetil p- fenilendiamina monohidrocloruro...................0.1 g Agua destilada...................................................................10 mL Agregue el agua al dimetil p- fenilendiamina y disulvalo. Si es necesario, caliente lentamente para lograr la disolucin completa. Este reactivo debe presentar un tono lila muy tenue. Si presenta otro aspecto, descrtelo. Es ms estable que el reactivo de Kovac pero MENOS SENSIBLE. Debe prepararse justo antes de usarlo.

II.

PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

94

1. REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Tetrametil p- fenilendiamina dihidrocloruro...................0.6g Dimetilsulfxido.................................................................10 mL. Agregue el dimetilsulfxido al tetramil- p- fenilendiamina y disulvalo. Este reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible. Almacnelo en botellas color mbar. DESCARTELO. Si el reactivo presenta otro color,

PROCEDIMIENTO I. PARA GRAM NEGATIVOS A. TIRAS DE PAPEL A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inculo denso con asa de platino o palillo de madera estriles y depostelo sobre una tirilla de papel filtro impregnada con el reactivo para oxidasa

B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA. Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.

II.

PARA COCOS GRAM POSITIVOS.

A partir de un agar incubado a 36C por 18-24 horas en atmsfera aerobia tome una asada del cultivo y esprzala en una tira de papel filtro. Agregue 1 gota del reactivo de Faller y Schleifer.

LECTURA E INTERPRETACIN:
a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un perodo de hasta 10 segundos.

95

b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD: Se debe de leer en un perodo de hasta 30 minutos. c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe leer en un perodo de hasta 2 minutos.

PRUEBA POSITIVA: Aparicin de color prpura en el tiempo estipulado PRUEBA NEGATIVA: No aparicin de color prpura en el perodo sealado.

CONTROL DE CALIDAD: a) Control positivo para: Gram negativos: Aeromonas hydrophila. Pseudomonas aeruginosa. Gram positivos: Micrococcus sp.

b) Control negativo para: Gram negativos: Escherichia coli

Gram positivos: Staphylococcus aureus.

PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES: 96

1.

La cristalera empleada para preparar y almacenar los reactivos para oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de materia orgnica, ya que sta contribuye a oxidar el reactivo.

2.

No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en medios que contengan glucosa, ya que su fermentacin inhibe la actividad de la enzima y ocasiona falsos negativos.

3. 4.

La prueba debe realizarse nicamente a colonias provenientes de medios no selectivos y no diferenciales. Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (NIHCROME) dado que sta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidacin del reactivo y dar falsos positivos.

5. La reaccin debe observarse NICAMENTE en la colonia y no alrededor

de sta. 6. El dimetil- p- fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas (mucosas) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca penetracin del reactivo.

97

Anexo 3.
PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICOS PARA LA INOCULACIN O INTERPRETACIN DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS.
1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES (TSI).
A partir de una colonia pura y bien aislada, tomar una asada, utilizando el asa en punta. Picar el medio hasta el fondo solamente una vez y luego estriar el Bisel. Incubar a 36C. Por 18 a 24 horas. Interpretacin de las reacciones en TSI: A- Utilizacin de los carbohidratos. 1. Fermentacin slo de la glucosa: Bisel: alcalino (rojo), Fondo: cido (amarillo). 2. Fermentacin de la glucosa y otro azcar: Bisel: cido (amarillo), Fondo: cido (amarillo). 3. Ninguno de los carbohidratos es fermentado: Bisel: alcalino (rojo), Fondo: alcalino (rojo).

98

B- Produccin de gas. Positivo: Burbujas dentro del medio Rompimiento del medio Desplazamiento del medio hacia arriba. Negativo: No se produce lo anteriormente descrito en el medio.

C- Produccin de H2S
Positivo: Todo el fondo del tubo se observa negro, se produce un precipitado escaso, (se observa un color negro, entre el fondo y el bisel). Negativo: No se observa ningn precipitado negro.

2. LA UTILIZACIN DEL CITRATO.

99

Se inocula el medio slido de Simmons a partir de un cultivo puro o colonia aislada, se estra nicamente el bisel. Incubar por 24-48 horas a 35- 36C, en algunos casos puede requerirse una incubacin de 4 das. INTERPRETACIN. Positivo: Crecimiento con viraje azul del indicador (Control: Citrobacter freundii). Negativo: No hay crecimiento ni cambio de color (Control: Escherichia col ATCC 25922).

3. PRUEBA DE LA UREASA:
Inocular el medio de urea (caldo o slido) a partir de una colonia pura, el ms utilizado es el Medio de Christensen, el cual se estra nicamente en el bisel. Incubar a 35C, leer de 6 - 24 horas y dejar hasta 6 das si es necesario. INTERPRETACIN. Positivo: Color rosado intenso en el bisel (Control: Proteus mirabilis). Negativo: No hay cambio de color (amarillo) (Control: E. Col ATCC 25922).

4. PRUEBA DE LA MOVILIDAD.
Deben de inocularse dos tubos de agar movilidad a partir de un cultivo de 18-24 horas, utilizando para ello la aguja bacteriolgica e introducindola en el centro hasta una profundidad de 1.5 cm. un tubo se incuba a 35C por 2448 horas y el otro se mantiene durante el mismo perodo de tiempo a temperatura ambiente, por cuanto existen bacterias que presentan movilidad nicamente a temperatura ambiente. INTERPRETACIN

100

Una vez transcurrido el tiempo de incubacin, se observan los tubos inoculados comparndolos con un tubo sin inocular para determinar si la bacteria es mvil. Prueba positiva: Se observar migracin de la bacteria a partir de la lnea de inculo que se manifiesta por la aparicin de turbidez en el tubo. En bacterias no fermentadoras puede observarse esta misma migracin pero a nivel de la superficie del medio. Prueba negativa: La bacteria crecer solamente a lo largo de la lnea de inoculacin y el resto del tubo permanece sin turbidez.

CONTROL DE CALIDAD:
a) Control de esterilidad: 24 horas a 35C. b) Control positivo: Escherichia col y Pseudomonas sp. c) Control negativo: Klebsiella sp.

5. PRUEBA DE INDOL.
Inocular el microorganismo en un caldo o medio semislido que contenga triptfano. Incubar a 36C por 24 horas. Agregar al medio cultivo 5 gotas del reactivo de Kovac y agitar suavemente. INTERPRETACIN Positivo: Color rojo en el anillo de interfase del reactivo con el medio. Negativo: No hay cambio de color y el reactivo queda amarillo Control positivo: E. Col ATCC 225922. Control negativo: Enterobacter cloacae.

ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER

101

Inocular un tubo de caldo RM-VP con un cultivo puro o con una colonia bien aislada. Incubar por 18 a 24 horas a 36C. INTERPRETACION ROJO DE METILO (RM). A partir del tubo incubado con el microorganismo pasar 2. 5 mL a otro tubo limpio. Agregar a ste 5 gotas del indicador rojo de metilo. Positivo: El indicador permanece rojo. Negativo: El indicador cambia a un color amarillo.

VOGES-PROSKAUER (VP): A los otros 2.5 mL del medio que quedaron del paso anterior, agregarles 6
gotas del reactivo de alfa- naftol ( - naftol) y luego 2 gotas de KOH al 40%. Agitar fuertemente y luego dejar en reposo por 15 minutos. sugiere agitar de vez en cuando. Se

INTERPRETACION Positivo: Color rojo o rosado en el medio. Negativo: El medio no tiene color o es amarillo. Control positivo: Klebsiella pneumoniae. Control negativo: Escherichia Col ATCC 25922.

102

TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.

BACTERIA

BISEL

FONDO GAS

H2S

CITRATO UREA

INDOL MOVILIDAD

ROJO DE METILO

VOGESPROSKAUER

Proteus vulgaris Proteus mirabilis Morganella morganii Proteus retgeri Providencia stuartii Providencia alkalifaciens Edwarciella torda Yersinia pseudoteberculosis Yersinia
enterocolitica

AK K K K K K K A A K K K K K

A A A A A A A A A K K K K K

+ + + - +w + -

2-4+ 4+ + -

++ (+) + + + + + ++

+ + -+ 1/2 + + + -

+ + + + + + +-

+ + + + + + + -A -A + + + + +

+ + + + + + + + + -

-/+ -

Pseudomona s aeroginosa Pseudomona flurorecens Pseudomona s multophilia Pseudomona s cepacias

Pseudomonas

pseudomollei

103

Pseudomona s mallei Pseudomona s stutzeri

Pseudomonas

K K K K K K

K K K K K K

+ -

+ ++ +

+ +++

putrefaciens Alcaligenes fecales Alcaligenes odorans Alcaligenes Denitrificans

TABLA PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS.

ROJO DE METILO + +

BACTERIA

BISEL

FONDO A A

GAS H2S +-

CITRATO -

UREA -

INDOL + +

MOVILIDAD -+ -

VOGESPROSKAUER

Escherichia col A K Escherichia col K Alcalescens dispar Shigella K dysenteriae Shigella K flexneri Shigella boydii K Shigella sennei K Salmonella sp. K Salmonella K Typha Salmonella K paratyphi A Salmonella d arizonae Arizona sp. KA Citrobacter A intermedius Citrobacter KA freundii Klebsiella A pneumoniae Klebsiella K ozonae Klebsiella K rhinoschleronal is Enterobacter A cloacae Enterobacter A aerogenes Enterobacter K hafnae Enterobacter AK agglomerans

A A A A A A A A A A A A A A A A A A

d + + + + + + + + + + -+

-** -*** D +w + 2-4+ 2-4+ -

+ + + + + D + + ++-

+ d (+) + d + - +s

d d d + -+

+ + + + + + + + + + +

+ + + + + + + + + + + + -/+

+ + + +/-

104

NOMENCLATURA. D = Diferentes tipos de bioqumicas. **= Algunas S. Flexneri serotipo 6 producen. ***= Serotipos 13 y 14 son gas+ W = reaccin dbil. (+) = positivo lento tardo. S = dbil A cido - negativo. Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas fluorecens Pseudomonas multophilia. Pseudomonas cepacia. Pseudomonas pseudomallei Pseudomonas mallei Pseudomonas stutzeri Pseudomonas putrefaciens. Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva Oxidasa positiva

BIBLIOGRAFIA

105

Microbiologia Mdica Jawetz, Brooks, Geo 1997, Manual Moderno, Mexico 15 Edicin. Tecnologa y Mtodos de Lab. Clnico, Gonzlez de Butriago, Jos, 1990 Editorial Salvat, Mxico 1 Edicin. Microbiologa e Inmunologia, Levison Warren, Manual Mxico 2 Edicin, 1998. Microbiologa Mdica de Divo, Carmona Osvaldo, Editorial McGraw Caracas 5ta. Edicin 1997. Microbiologa. Brock Thomas, Prentice Hill, Mxico, 4ta Edicin 1987. Microbiologa Zinsser, Jolik, Walfgang K, Editorial Medica Buenos Aires, 20 Edicin 1997. Diagnstico y Tratamiento para el Laboratorio, Henry- John Masson S.A., Espaa 9 edicin, 1993. Microbiologa y Parasitologa, Romero Cabello Ral y otros, Panamericana, Mxico, 2 edicin, 1993. Laboratorio Clnico. Microbiologa, Delgado Iribarren, Alberto, Graw Hill, Madrid, 1 edicin, 1994. Prevencin de enfermedades Nosocomiales OMS, 2003, edicin.
NAR/aa

Moderno,

Hill,

Panamericana,

Bernard,

Medica

Mc

Ginebra,

106