UNIVERSIDAD*COMPLUTENSE*DE*MADRID*

FACULTAD*DE*CIENCIAS*QUÍMICAS*
DEPARTAMENTO*DE*BIOQUÍMICA*Y*BIOLOGÍA*MOLECULAR*I*

ESTUDIOS*ESTRUCTURALES*Y*FUNCIONALES*DE*LA*LISOZIMA*CPL67*
DEL*BACTERIÓFAGO*CP67*DE*NEUMOCOCO**

TESIS*DOCTORAL*

ROBERTO*DÍEZ*MARTÍNEZ*

CONSEJO*SUPERIOR*DE*INVESTIGACIONES*CIENTÍFICAS*

CENTRO*DE*INVESTIGACIONES*BIOLÓGICAS*

**

MADRID,*2014
 FACULTAD(DE(CIENCIAS(QUÍMICAS(

DEPARTAMENTO*DE*BIOQUÍMICA*Y*BIOLOGÍA*MOLECULAR*I*

ESTUDIOS(ESTRUCTURALES(Y(FUNCIONALES(DE(LA(LISOZIMA(CPL57(DEL(
BACTERIÓFAGO(CP57(DE(NEUMOCOCO((

Tesis*doctoral*presentada*por*
Roberto*Díez*Martínez*
para*optar*al*Grado*de*Doctor*por*la*
Universidad*Complutense*de*Madrid*
*

Director:*

Dr.*Pedro*García*González*

CONSEJO*SUPERIOR*DE*INVESTIGACIONES*CIENTÍFICAS*

CENTRO*DE*INVESTIGACIONES*BIOLÓGICAS*

((
MADRID,(2014

!
!

A mis Padres
A Irene
La#realización#de#esta#Tesis#ha#sido#posible#gracias#a#la#concesión#de#una#beca#dentro#del#
Programa# de# Becas# Predoctorales# de# Formación# de# personal# investigador# (FPI)# del#
Ministerio# de# Economía# y# Competitividad# (MINECO)# y# al# CIBER# de# Enfermedades#
Respiratorias#(CIBERES).#No#podría#faltar#mi#agradecimiento#al#centro#de#investigación#que#
ha# hecho# posible# la# realización# de# este# trabajo,# el# Centro# de# Investigaciones# Biológicas#
(CSIC).##
En# primer# lugar# me# gustaría# expresar# mi# más# sincero# agradecimiento# al# Dr.# Pedro#
García,#mi#director#de#Tesis,#por#ofrecerme#la#oportunidad#de#formar#parte#de#su#grupo#y#
confiar# en# mis# posibilidades# para# desarrollar# un# buen# trabajo# en# él.# Cómo# no,# al# Prof.#
Ernesto#García,#por#su#enorme#paciencia#a#lo#largo#de#estos#años#y#sus#grandes#consejos,#
sabios# e# inspiradores.# Sin# duda# a# ambos,# MUCHAS# GRACIAS# por# hacerme# partícipe# del#
conocimiento# que# engloba# a# nuestra# querida# bacteria# “el# neumococo”.# Aún# recuerdo# esa#
entrevista#de#aquel#día#de#invierno#de#2010,#y#como#si#de#un#anuncio#se#tratara#acabó#con#la#
frase…¿y#tú#de#quien#eres?#Sin#duda#todo#lo#que#se#plasmó#en#aquella#entrevista,#junto#a#
nuevos#retos#que#han#surgido#durante#el#transcurso#de#este#bonito#camino,#aunque#no#por#
ello#sencillo,#se#ha#visto#realizado,#en#definitiva#MUCHAS#GRACIAS#por#todo.##
A!Rubén&y&Concha,&los&padres&de&este&laboratorio.&Gracias&por&creer&en&todos&nosotros,&
por$vuestras$múltiples$visitas$al$laboratorio$durante$este$tiempo$y$sobre$todo$por$creer$en$
los# fagos,# sin# ellos# esta# tesis# hubiera# tomado# otro# cariz.# A" los" Drs." Eduardo" Díaz," Auxi"
Prieto,( Teresa( Zamarro,( Manuel( Carmona,( Beatriz( Galán( y( José( Luis( García,( por( vuestros#
consejos,#ayudas#y#apoyos,#tanto#científicos#como#extra#científicos.##
A#los#neumos,#creo#que#esta#palabra#quedará#grabada#de#por#vida#en#mí,#qué#decir#de#
los#neumos,#sin#duda#que#tenemos#una#gran#madre,#una#persona#que#día#a#día#está#ahí#para#
hacernos#las#cosas#más#fáciles,#más#amenas#y#cuidarnos#como#a#hijos,#Elo#gracias#por#todos#
estos#años#y#por#los#consejos#y#ayudas#que#nos#has#dado.#A#Miri,#la#chica#de#rosa,#creo#que#
siempre#que#vea#una#presentación,#un#póster#o#simplemente#algo#con#un#motivo#rosa#me#
vendrá# a# la# mente…¡¡Miri!!# Gracias# Miri,# por# tu# ayuda# en# el# laboratorio,# por# enseñarme# a#
crecer#biofilmes#y#por#enseñarme#multitud#de#cosas.#Cómo#no,#tengo#que#acordarme#de#Eli,#
la#chica#“moderna#del#labo”,#mil#gracias#por#la#multitud#de#risas#que#nos#has#dado,#por#hacer#
que# un# día# difícil# acabe# siendo# un# día# alegre# y# sobre# todo# por# dejar# que# provocara# estrés#
hídrico#en#tus#plantas.#
Sin# duda# tengo# que# agradecer# de# forma# especial# a# dos# personas# importantes,# a# mi#
hermano#de#laboratorio,#el#gran#Héctor,#y#a#mi#mamá#pato,#María#Morales.#Héctor,#bendita#
serendipia#la#que#te#trajo#a#este#laboratorio,#juntos#éramos#los#zipi#y#zape#del#CIB,#quisimos#
crear# una# empresa# de# caviar# y# acabó# en# un# gran# paper,# ya# sabemos# que# los# peces# cebra#
como# caviar# poco# éxito# tienen# pero…¿quién# sabe?,# gracias# por# todo,# por# instruirme# en# el#
mundo# raphaeliano# con# tus# cánticos# y# tus# bailoteos# (creo# que# sigo# dejándotelo# a# ti),# en#
definitiva#GRACIAS#y#como#un#día#me#dijiste…#para#un#hermano#pequeño#que#tienes,#si#me#
encuentro# en# peligro# tan# solo# silbaré.# María,# mi# mamá# pato,# la# primera# que# me# enseñó#
todo#lo#que#sabía#sobre#neumo,#¡¡mi#primera#compañera#de#laboratorio!!#Gracias#por#todo,#
por#ayudarme,#y#por#haberme#acogido#como#uno#más.#A#Esther#mi#nueva#compañera!!#La#
chica#de#los#“en#5#minutos”,#tras#estos#años#te#tengo#que#dar#las#gracias#por#saber#que#5#son#
10#o#incluso#20,#pero#sin#duda#agradecer#tu#trato#amable,#comprensivo#y#la#confianza#que#
siempre#me#has#mostrado,#por#cierto,#creo#que#podemos#crear#un#“best#seller”#con#nuestras#
frases# épicas# ¡¡nos# lo# tendríamos# que# pensar!!.# También# agradecer# a# Jose# Yuste,# no#
pudimos#coincidir#muchos#años#en#el#laboratorio#pero#sin#duda#tengo#que#decir#que#tengo#
en# ti# un# gran# amigo# y# un# gran# maestro.# No# puedo# dejar# de# agradecer# al# resto# de# mis$
compañeros*de*laboratorio,# Miriam# Moscoso,# Susana,# Lidia,#Violeta# y# Mar,#por# supuesto,#
con# los# cuales# he# compartido# abundantes# horas# de# trabajo.# Gracias# por# estar# ahí# y#
compartir# tanto# los# buenos# como# malos# momentos,# por# escucharme# y# apoyarme# y# por#
hacer#que#esas#horas#juntos#sean#minutos.#
Me#gustaría#dar#las#gracias#al#resto#de#Rubenes#y#en#especial#a#Julia#y#Carlitos,#la#“New#
Generation”,# sin# duda# mis# dos# compañeros# de# batallas# durante# estos# 4# años,# el# ying# y# el#
yang,#el#norte#y#el#sur.#Gracias#Julia#por#tus#charlas,#tu#apoyo#y#tu#saber#estar,#gracias#por#
compartir# ese# ritual# de# la# fuente# que# hemos# creado# después# de# las# comidas,# gracias# por#
todo.#Carlitos,#el#bético,#el#grande,#el#insustituible,#el#hombre#que#es#capaz#de#ayudarte#en#
cualquier# momento,# la# enciclopedia# japonesa# andante,# y# sin# duda# el# gran# maestro# en#
nuevos# temas# musicales,# gracias# por# todo,# por# tu# compañía,# tu# amistad# y# por# esas# ideas#
locas# que# hacían# que# acabáramos# hablando# de# lo# más# surrealista# que# a# uno# se# le# puede#
pasar#por#la#cabeza.#A#ambos#gracias#por#vuestra#confianza,#vuestra#generosidad#y#vuestra#
gran# amistad.# Para# el# resto# de# compañeros,# Ana# V,# Helga,# Zaira,# Fernando,# Olga,# Juan,#
Gonn,#Igor,#Lucía,#las#Natalias,#Cris,#Lorena,#Carmen,#Loreine,"Virginia,"Javier,"Ife,"Andrés,"
Nina,#Valle#e#Iria,#¡gracias,#gracias#y#gracias!#Sin#duda#ha#sido#un#placer#haber#compartido#
comidas,#seminarios#gastronómicos,#y#un#largo#etc.#con#vosotros.#
Agradezco# de# manera# especial# al# Prof.# V.# Fischetti,# de# la# Universidad# Rockefeller# de#
Nueva#York,#por#permitirme#realizar#la#estancia#breve#en#su#laboratorio.#Debo#agradecerle#
también#de#manera#especial#su#amabilidad,#su#trato#y#su#disponibilidad#al#Dr.#Chad#Euler,#el#
“big# brother”# como# se# hacía# llamar,# por# enseñarme# todo# lo# referente# a# los# modelos#
animales,#por#ayudarme#y#por#tratarme#como#uno#más#durante#mi#estancia.#Rolf,#mi#gran#
compañero# sueco,# por# las# charlas# mantenidas,# Anna,# Bryan,# Doc,# Asaf,# June,# Mya,# Shu,#
Aurelia,#Daniel,#Yong,#Atila,#Jennifer#y#Jesse,#gracias#por#permitirme#vivir#una#experiencia#
tan#importante#tanto#en#mi#formación#investigadora#como#personal.#Gracias#también#a#mi#
compañero#español#de#piso#Juan,#por#hacer#que#esos#casi#4#meses#hayan#sido#como#4#días,#
por# los# grandes# momentos# juntos# y# sobre# todo# por# hacer# que# de# una# pequeña# estancia#
haya#surgido#una#gran#amistad.#
A#Maite#y#a#todo#el#personal#de#microscopía,#gracias#por#la#ayuda#durante#la#elaboración#
de# esta# Tesis,# y# por# hacer# que# los# niveles# de# glucosa# tras# horas# delante# del# microscopio#
nunca# decaigan# con# vuestros# bombones.# Por# supuesto,# también# a# Mónica# por# su#
inestimable#ayuda#en#la#elaboración#del#vídeo.#
Me#gustaría#extender#mi#agradecimiento#a#la#Dra.#Margarita#Menéndez#y#todo#su#grupo#
(Noemí,# Palma,# Cristina,# Lupe# y# Manu),# por# vuestra# ayuda,# experiencia# y# amplio#
conocimiento# en# el# campo# de# proteínas;# al# Dr.# Jesús# Sanz# y# su# grupo,# por# aportar# un#
conocimiento# más# químico# y# dar# siempre# una# vuelta# de# tuerca# a# todo# lo# que# concierne# a#
“neumo”.#
A#toda#mi#familia,#sin#duda#si#me#dijeran,#tienes#que#volver#a#nacer#y#elegir#familia,#no#
dudaría# ni# un# segundo,# os# elegiría# con# los# ojos# cerrados# porque# esta# es# mi# familia,# mi#
apoyo,#mi#alegría#y#el#cariño#personificado.#
Tengo# que# agradecer# y# no# existirían# palabras# suficientes# para# ello,# a# mis# padres.#
Vosotros#me#enseñásteis#desde#pequeño#que#quien#quiere#puede,#que#con#esfuerzo#y#valor#
las# cosas# se# consiguen,# vosotros# sois# mi# espejo# y# el# cimiento# de# todo# lo# que# soy,# me#
educásteis,#me#enseñásteis#y#seguís#haciéndolo,#no#tengo#palabras#para#expresar#mi#cariño#
y#mi#amor#hacia#vosotros,#sé#que#soy#de#pocas#palabras#pero#gracias#por#todo,#os#quiero.#
A# mis# amigos,# Ernesto# y# Andrea,# por# hacer# que# la# estancia# en# esta# gran# ciudad# sea#
llevadera# y# amena,# y# sobre# todo# por# su# gran# amistad,# a# la# cuadrilla# Pamplonica# Pepe,#
Rocío,#Maite,#Aitor,#Gurbindo,#Ylenia,#Iranzu,#“el#Quillo”#y#Alvarito,#a#la#cuadrilla#de#VB,#sin#
duda# el# grito# de# Vb# existe# nunca# morirá# con# gente# como# vosotros,# y# por# supuesto# a# la#
cuadrilla#montiquense.#
Por#último,#quisiera#agradecer#a#una#persona#muy#especial,#una#pequeña#princesilla#que#
me# ha# enseñado# que# el# esfuerzo# merece# la# pena,# que# cuando# menos# te# lo# esperas#
encuentras#a#la#persona#con#la#que#quieres#compartir#todo#lo#importante#el#resto#de#tu#vida,#
que# a# pesar# de# malos# momentos,# siempre# existe# tiempo# para# una# sonrisa.# Gracias# Irene,#
por# ser# como# eres,# por# cuidarme# como# me# cuidas,# por# ayudarme# como# me# ayudas,# por#
todo#lo#que#hemos#vivido#y#nos#queda#por#vivir.#Tendría#que#escribir#otra#tesis#con#todas#las#
cosas# que# se# me# pasan# por# la# cabeza,# así# que# simplemente# te# diré…gracias# por# hacerme#
sentir#la#persona#más#especial#del#mundo.#
#
 ABREVIATURAS

Además de las unidades y abreviaturas aceptadas por el Sistema Internacional de

Medidas (SI) (http://physics.nist.gov/cuu/Units/index.html) y la International Union of
Pure and Applied Chemistry (UIPAC)
(http://old.iupac.org/publications/epub/index.html#nt), en esta Tesis se han utilizado
las siguientes abreviaturas:

Amp, ampicilina.

ANOVA, análisis de la varianza.

ATCC, American Type Culture Collection.

BLOSUM, matriz de sustitución de bloques de aminoácidos o blocks of amino acid

substitution matrix.

BSA, seroalbúmina bovina o bovine serum albumin.

C+Y, medio CpH8 conteniendo 0.08% de extracto de levadura.

CBD, dominio de unión a colina o choline-binding domain.

CBP, proteína de unión a colina o choline-binding protein.

CBR, repetición de unión a colina o choline-binding repeat.

Cdn, cefditoren.

CECT, Colección Española de Cultivos Tipo.

CHAP, cisteína, histidina-dependiente amidohidrolasa/peptidasa.

CLSM, microscopio (y microscopía) de barrido láser confocal.

CMI,!concentración mínima inhibitoria.

CpH8, medio C ajustado a pH 8.0.

cpm, cuentas por minuto.

CPS, polisacárido capsular.

Cro, ceftriaxona.

CRP, proteína C-reactiva.

CWBM, módulo de unión al sustrato o cell wall binding module.

CW_7, repetición de unión a sustrato de Cpl-7.

DEAE, dietilaminoetanol.

DMSO, dimetilsulfóxido.

DNA, ácido desoxirribonucleico.

dNTP, desoxinucleótido(s) trifosfato.

DO, densidad óptica.

Doc, desoxicolato sódico.

dpf, días post fertilización o days post fertilization.

DS, desviación estándar.

DSMZ,!Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen.

EDTA, ácido etilendiaminotetraacético.

GalpNAc, N-acetil-D-galactopiranosa.

GFP, proteína con fluorescencia verde o green fluorescent protein.

GlcNAc, N-acetilglucosamina.

HEWL, lisozima de clara de huevo.

hpf, horas post-fertilización o hours post-fertilization.

hpi, horas post-infección o hours post-infection.

IN, intranasal.

IP, intraperitoneal.

IPTG, isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido.

Kana, kanamicina.

LTA, ácido lipoteicoico.

MPa, megapascal.

Mpb, mega par(es) de bases.

MRSA, S. aureus resistentes a meticilina.

MurNAc, ácido N-acetilmurámico.

m/z, relación masa carga.

NCTC, colección nacional de cultivos tipo o National Collection of Type Cultures.

Opt, optoquina.

Orf, marco abierto de lectura u open reading frame.

pb, par(es) de bases.

PBS, solución salina tamponada con fosfato o phosphate-buffered saline.

PCho, fosforilcolina.

PCR, reacción en cadena de la polimerasa o polymerase chain reaction.

PCV7, vacuna conjugada antineumocócica 7-valente.

PCV13, vacuna conjugada antineumocócica 13-valente.

Pen, penicilina.

Ply, neumolisina.

PPSV23, vacuna conjugada antineumocócica 23-valente

p/v, relación peso/volumen.

R
, resistente.

RBS, secuencia de unión al ribosoma o ribosomal binding site.

rpm, revoluciones por minuto.

S
, susceptible o sensible.

SDS, dodecilsulfato sódico.

SGM, estreptococo(s) del grupo mitis.

T
, cepa tipo.

TA, ácido teicoico.

Tet, tetraciclina.

Tris, tris (hidroximetil) amino metano.

TSB, caldo de tripticaseína y soja.

U,!unidad(es) de actividad enzimática.

UFC, unidades formadoras de colonias.

v/v, relación volumen/volumen.

 ÍNDICE

SUMMARY......................................................................................................... i-iii

I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 1

1. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE .................................................................... 3

1.1. Reseña histórica ...................................................................................... 3
1.2. Características generales ....................................................................... 4
1.3. Importancia clínica, epidemiología y virulencia.................................... 5
1.4. Tratamientos y prevención de la infección neumocócica ................... 10

2. ESTRUCTURA DE LA PARED BACTERIANA ...................................................... 12

2.1. Ácidos teicoicos....................................................................................... 15
2.2. Proteínas de unión a colina .................................................................... 17

3. LAS LISOZIMAS, UN TIPO DE MUREÍN-HIDROLASAS ......................................... 21

3.1. Clasificación de las lisozimas................................................................. 21
3.2. Lisozimas presentes en S. pneumoniae y sus bacteriófagos ............. 22

4. TERAPIA FÁGICA Y ENZIBIÓTICOS .................................................................. 23

5. MODELOS ANIMALES ..................................................................................... 25

II. OBJETIVOS.................................................................................................. 27

III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 31

1. CEPAS BACTERIANAS, PLÁSMIDOS Y OLIGONUCLEÓTIDOS ............................ 33

2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO ............................................................. 37

3. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE ESCHERICHIA COLI ................................ 39

4. TÉCNICAS DE DNA .......................................................................................... 39

4.1. Aislamiento de DNA plasmídico ............................................................. 39
4.2. Aislamiento de DNA cromosómico ........................................................ 40
4.3. Aislamiento de DNA fágico ..................................................................... 40
4.4. Electroforesis de DNA en geles de agarosa .......................................... 41
4.5. Amplificaciones de DNA por PCR .......................................................... 41
4.6. Secuenciación de DNA ............................................................................ 41
4.7. Construcción de genes sintéticos.......................................................... 42

5. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS.......................................................................... 47

6. TÉCNICAS DE PROTEÍNAS .............................................................................. 48

6.1. Producción y purificación de proteínas................................................. 48
6.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS ..................................... 50

7. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA IN VITRO CON PAREDES PURIFICADAS . 50

8. ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA .......................................... 52

9. ENSAYOS DE UNIÓN DE PROTEÍNAS A BACTERIAS ................................................. 53

10. ENSAYOS DE ACTIVIDAD BACTERIOLÍTICA Y BACTERICIDA DE LAS ENZIMAS 54

11. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL ......................................................................... 55

11.1. Modelo de colonización en embriones de pez cebra ......................... 55
11.2. Modelo de sepsis en ratón .................................................................... 56
11.3. Modelo de colonización en ratón ......................................................... 57

12. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA ........................................................................ 58

13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................ 59

IV. RESULTADOS ............................................................................................ 61

1. ANÁLISIS DEL GENOMA DEL FAGO CP-7 ......................................................... 63

1.1. Estrategia de secuenciación ................................................................... 63
1.2. Identificación de genes y organización del genoma del fago Cp-7 ... 63
1.3. Comparación filogenética del fago Cp-7 ............................................... 69

2. EL PRODUCTO DEL GEN CPL-7: LA LISOZIMA CPL-7 ........................................ 72

3. ACTIVIDAD IN VITRO DE DIFERENTES MUREíN-HIDROLASAS DE NEUMOCOCO . 77

4. MODIFICACIONES DE CPL-7............................................................................ 81
4.1. Localización de las mutaciones introducidas en Cpl-7........................ 82
4.2. Caracterización físico-química de Cpl-7S ............................................. 86

5. ACTIVIDAD DE LA LISOZIMA CPL-7S SOBRE S. PNEUMONIAE Y OTRAS BACTE-

RIAS ................................................................................................................... 95
5.1. Concentración mínima inhibitoria .......................................................... 96
5.2. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes cepas de
neumococo ...................................................................................................... 97
5.3. Estudios de unión de CWBM7S a diferentes especies bacterianas ... 100
5.4. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes bacterias Gram-
positivas........................................................................................................... 104
5.5. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes bacterias Gram-
negativas.......................................................................................................... 108
6. ACTIVIDAD BACTERICIDA DE CPL-7S EN UN MODELO ANIMAL DE INFECCIÓN .. 111
6.1. Modelo de embriones de pez cebra ....................................................... 111
6.2. Modelo murino de colonización intranasal ........................................... 115

7. CONSTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS QUIMÉRICAS A PARTIR DE CPL-1 Y CPL-7S ... 119

7.1. Estudios de actividad enzimática de las quimeras............................... 120
7.2. Estudios de actividad bactericida de Cpl-711 frente a cepas
capsuladas y multirresistentes...................................................................... 124

8. CPL-711 EN UN MODELO MURINO DE INFECCIÓN ............................................. 129

V. DISCUSIÓN .................................................................................................. 133

VI. CONCLUSIONES ........................................................................................ 157

VII. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 161

ANEXO ............................................................................................................. 185

 SUMMARY

INTRODUCTION: The Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (the

pneumococcus) is a common asymptomatic resident of the human nasopharynx and
is also an important etiologic agent in several diseases like pneumonia, otitis media,
meningitis, and sepsis. Current numbers of morbidity and mortality impose a
significant burden in healthcare costs in developed and non-developed countries.
Therapeutics against pneumococcus is hampered by insufficient vaccine coverage
and an increase in antibacterial resistance, which makes urgent the identification of
new targets and development of new antimicrobials.
Bacteriophage endolysins constitute an alternative (or complementary) approach
to classic antibiotics in the search for novel therapeutic strategies for fighting
invasive diseases. Endolysins are phage murein-hydrolases that cleave the major
bond types in the peptidoglycan and specifically break the host cell wall, provoking
cellular death. This bactericidal effect of the endolysins is now fostering to use them
as exogenous enzymes to kill susceptible bacteria and is also named “enzybiotics”.
Most murein-hydrolases reported so far in the pneumococcal system, from either
host or phage origin, are choline-binding proteins (CBPs) that depend on their
attachment to the choline moieties of pneumococcal teichoic acids for activity. There
is a single exception to this rule, the Cpl-7 lysozyme, encoded by the lytic
pneumococcal phage Cp-7, whose cell-wall binding module (CWBM) is built by three
identical CW_7 repeats that are sequentially and structurally unrelated to the
choline-binding motifs of the CBPs. In contrast, its N-terminal catalytic module is
85.6% identical to that of Cpl-1 lysozyme.

PRINCIPAL FINDINGS: In this Thesis, it has been completely sequenced the Cp-7
genome, a 19 741 bp linear DNA that harbors a terminal protein covalently linked to
their 5’-ends. A comparison between the modular arrangement of different open
reading frames of Cp-1 and Cp-7 has been made and major emphasis has focused
on the lytic enzymes of the lysis cassette, the lysozymes Cpl-1 and Cpl-7,
respectively. Both enzymes had similar specific activities when tested on purified
pneumococcal cell walls, but their bactericidal effects were very different when
added exogenously on pneumococcal cells resuspended in PBS. After a careful
analysis of physico-chemical differences between Cpl-1 and Cpl-7, the sign of the
charge of the CWBM of Cpl-7 was inverted (from −14.93 to +3.0 at neutral pH). The
resulting engineered variant, Cpl-7S, harbors 15 amino acid changes (5 in each
CW_7 repeat) and it showed an increased lytic activity against S. pneumoniae
(including different encapsulated and multiresistant strains), Streptococcus
pyogenes, and other pathogens. Furthermore, a combined action of 0.01% carvacrol
(an essential oil) and Cpl-7S, a protocol designed to destabilize the outer membrane
of Gram-negative bacteria, was capable to render Escherichia coli and
Pseudomonas putida susceptible to the killing activity of the lysozyme, an effect not
described previously.
To check whether Cpl-7S could bind to a variety of bacteria, a fusion protein
between Green Fluorescent Protein (GFP) and CWBM of Cpl-7S was constructed,
GFP-CWBM7S. Addition of this fusion protein to Gram-positive bacteria or a mixture
of GFP-CWBM7S and carvacrol to Gram-negative bacteria demonstrated a
fluorescent signal, which suggested that Cpl-7S interacted with several bacteria.
Complementary experiments carried out with the entire Cpl-7S added to susceptible
bacteria allowed measuring the bactericidal effect of this lysozyme against each
pathogen.
In order to search a better enzyme related to a stronger killing effect, different
chimeric proteins were constructed using the well defined structural elements of Cpl-
1 and Cpl-7S lysozymes: the two modules involved in the catalysis and substrate
recognition, and linkers connecting both modules. Thus, Cpl-711, Cpl-771, Cpl-117,
and Cpl-177 enzymes were produced in E. coli and subsequently purified. All these
new enzymes were assayed as before, on purified cell walls and on living bacteria,
and Cpl-711 was found to be the most active one, even more potent than Cpl-1 that,
until now, was the more lethal weapon against different pneumococcal strains.
Validation of the above in vitro results has been carried out using two animal models
of infection. Initially, a zebrafish embryo was chosen to test Cpl-7S. In these
experiments a single 25-µg of Cpl-7S significantly increased the survival rate of such
embryos infected with pneumococcus or S. pyogenes, confirming the killing effect of
Cpl-7S in vivo. This is the first example to use zebrafish embryos as a successful
animal model to measure the protective effect of an antibacterial compound against
an infection provoked by two important pathogens, pneumococcus and S. pyogenes.
Also, a mouse model was set up to assay the bactericidal effects of Cpl-7S and Cpl-
711, with two versions of infection. Cpl-7S was checked in an intranasal colonization
of mixed infection of S. pneumoniae and S. pyogenes demonstrating that was also
capable to reduce a significant population of both bacteria, although was more
effective against S. pyogenes. On the other hand, chimeric Cpl-711 endolysin was
tested in a sepsis model by intraperitoneal injection of the enzyme, once established
the bacteremia with the pneumococcal D39_IU strain. Results were also very
promising, as protection of 50% of mice was achieved with as little as 50 µg of Cpl-
711.

CONCLUSIONS: All these results allow the conclusion that modulation of the net
charge of cell wall-binding motifs might be a general way of improving the enzymatic
efficiency and selectivity of putative or actual enzybiotics, thereby expanding the
range of susceptible pathogens. In this sense, currently available results support the
notion that even lysins with a wider range of antimicrobial activity would exert a less
dramatic effect on the normal microbiota than conventional antibiotics. Moreover,
swapping structural elements of phage lysozymes have led to the construction of
new chimeric enzymes with noticeable bactericidal effects, compared to their
parental enzymes.
 I. INTRODUCCIÓN
!
1. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

1.1. Reseña histórica

L
a enfermedad conocida como neumonía era considerada una afección respirato-
ria hasta los años 80 del siglo XIX, sin un tratamiento específico más allá de
diferentes preparados medicinales a base de plantas, todas ellas sin efecto directo
evidente sobre el agente causal. No fue hasta 1880 cuando, independientemente
aunque de manera simultánea, se describió este microorganismo por Louis Pasteur
y George M. Sternberg, inicialmente denominado Micrococcus pneumoniae (Klein,
1884) y, años más tarde, como Diplococcus pneumoniae (Weichselbaum, 1886).
Esta nomenclatura que permaneció vigente hasta 1901 en que se reclasificó por su
capacidad de formar cadenas y a su asociación con neumonías, con lo que pasó a
denominarse Streptococcus pneumoniae (Chester, 1901).
Los estudios realizados sobre S. pneumoniae jugaron un papel importante en el
desarrollo de la biología a lo largo de la segunda mitad del siglo XX, a partir de los
resultados de los experimentos de F. Griffith (1928). Se pudo establecer que el DNA
es la unidad básica del material genético al tratar de explicar el mecanismo por el
cual se daban variantes de colonia lisa y rugosa del microorganismo en función de
la producción de cápsula y por tanto de su patogenicidad. Este investigador descu-
brió que ratones infectados con una preparación mixta de células de S. pneumoniae
vivas de tipo II rugosas (sin cápsula) y de células tipo III lisas (capsuladas) muertas
por calor desarrollaban la enfermedad, aislándose neumococos de tipo III vivos a
partir de cultivos de muestras procedentes de los animales. Tras muchos experi-
mentos similares con neumococos lisos y rugosos de diferentes tipos, llamó a este
fenómeno “transformación” (Griffith, 1928). Más adelante, Oswald T. Avery investigó
el papel del DNA en el proceso de transformación y, trabajando también con neu-
mococo, llegó al descubrimiento de que el “principio transformante”, nombre dado a
la sustancia de naturaleza desconocida responsable del cambio observado por
Griffith, era realmente el DNA y no una proteína o un carbohidrato, como se creía
hasta entonces (Avery et al., 1944; McCarty y Avery, 1946).
A partir de los años 50 se hicieron otros descubrimientos relevantes con esta
bacteria, entre los que cabe destacar la capacidad de incorporar en su genoma
fragmentos de DNA monocatenario, un proceso que se denominó “competencia”.
Muchos investigadores, entre los que se encuentran S. Lacks, D. Morrison y J.P.

!
Claverys, estudiaron la naturaleza y mecanismos por los que se produce la compe-
tencia y la transformación genética, descubriendo que estos procesos son la base
de fenómenos tan importantes como el intercambio o switching capsular o la resis-
tencia a los antimicrobianos (Lacks, 1977; Håvarstein y Morrison, 1999; Claverys et
al., 2000).

1.2. Características generales

S. pneumoniae (comúnmente denominado neumococo), es un patógeno exclusiva-

mente humano, una bacteria Gram-positiva de entre 0.5 y 1.25 µm, inmóvil, que no
forma endosporas y es un miembro α-hemolítico del género Streptococcus. Se trata
de un microorganismo cuyo hábitat natural es la nasofaringe humana, pudiendo
tener lugar la colonización durante los primeros días de vida, denominándose en-
tonces como “estado de portador”. Cuando se cultiva en placas de agar-sangre en
aerobiosis presenta una marcada α-hemólisis (Butterfield y Peabody, 1913; Cole,
1914), debido a la producción de peróxido de hidrógeno (Barnard y Stinson, 1996)
pero, si se incuba en anaerobiosis se observa β-hemólisis debida a la acción de la
neumolisina (Ply) (Johnson et al., 1982). Desde el punto de vista metabólico, neu-
mococo es un microorganismo anaerobio facultativo, catalasa negativo y sensible a
las sales biliares como el desoxicolato sódico (Doc) (Neufeld, 1900), el cual dispara
la acción incontrolada de la principal autolisina, LytA, una N-acetilmuramoil-L-
alanina amidasa o NAM-amidasa, que degrada la pared celular en un proceso ab-
solutamente dependiente del aminoalcohol colina (Mosser y Tomasz, 1970; Höltje y
Tomasz, 1975; García et al., 1985). Este patrón de susceptibilidad a Doc se utiliza
en la identificación del microorganismo. Es importante reseñar que neumococo es
auxótrofo para colina (Rane y Subbarow, 1940a, b) siendo este aminoalcohol, en
forma de fosforilcolina (PCho), un componente estructural de los ácidos teicoicos
(TAs) y lipoteicoicos (LTAs) de su pared celular (Tomasz, 1967; Brundish y Baddi-
ley, 1968; Briles y Tomasz, 1973; Gisch et al., 2013).
Existen diferentes pruebas diagnósticas para la identificación de neumococo en
el laboratorio clínico, aparte de la ya mencionada sensibilidad al Doc. Esta bacteria
es sensible a la optoquina (Opt), un derivado de la quinina (Lund y Henrichsen,
1978) que actúa como inhibidor específico de determinadas proteínas que forman
+
parte de la subunidad F0 de la ATPasa protón-motriz (H -ATPasa) de neumococo
(Fenoll et al., 1994; Balsalobre et al., 2006). Sin embargo, la prueba que ha ganado

!
una mayor aceptación en la identificación de neumococo ha sido la prueba de "que-
llung" (Neufeld, 1902). Esta técnica se utiliza tanto para la serotipificación de cepas,
usando sueros monovalentes frente a los, al menos, 94 tipos descritos (Song et al.,
2013), como para la identificación de aislados, para lo cual se utiliza un suero poli-
valente, denominado OMNISERUM, que contiene una mezcla de antisueros frente
a todos esos tipos.
Cabe destacar que aunque neumococo es sensible a la presencia de Opt, exis-
R
ten cepas de S. pneumoniae resistentes (Opt ) a dicho antibiótico así como estrep-
tococos filogenéticamente muy próximos a neumococo, los denominados estrepto-
cocos del grupo mitis o SGM, que pueden ser susceptibles a la acción de Opt
S
(Opt ) (de la Campa et al., 1997; Martín-Galiano et al., 2003; Balsalobre et al.,
2006). No obstante, la identificación de este microorganismo resulta más fiable si se
realizan las pruebas anteriormente detalladas de forma conjunta (Lund y Hen-
richsen, 1978).
El genoma de neumococo tiene una longitud media de 2.1 millones de pares de
bases (Mpb), presentando un contenido en G+C en torno al 40% y aproximadamen-
te sólo el 75% del genoma (1.5 Mpb) es común a todos los aislados (Donati et al.,
2010).

1.3. Importancia clínica, epidemiología y virulencia

S. pneumoniae es un patógeno exclusivamente humano —salvo algunas excepcio-

nes descritas en algunos animales (van der Linden et al., 2009; Denapaite y
Hakenbeck, 2011)— que presenta una gran capacidad para causar diversas infec-
ciones y procesos invasivos severos. Esta bacteria se encuentra normalmente de
modo asintomático en la nasofaringe de un elevado porcentaje de niños sanos (20-
40%) y, de manera menos frecuente (5–10%), en adultos sanos (Bogaert et al.,
2004). Una vez que el neumococo coloniza la nasofaringe humana, éste puede
diseminarse causando variadas enfermedades infecciosas, como algunas patolo-
gías leves tras invadir y colonizar el oído (otitis media) u ojos (conjuntivitis), hasta
patologías más severas como el caso de neumonías invasivas, septicemia y me-
ningitis. Se estima que las enfermedades respiratorias son responsables de la ter-
cera parte de muertes anuales en el mundo, causando el fallecimiento de 4 millones
de personas cada año, siendo S. pneumoniae el agente causal predominante (Mo-
rens et al., 2004).

!
 A pesar de que en la actualidad dicha tendencia ha cambiado, en continentes
como África o Asia las infecciones neumocócicas siguen siendo la principal causa
de mortalidad infantil. Según estimaciones de la Organización Mundial de la Salud,
de los 10.6 millones de muertes anuales en niños menores de 5 años, S. pneumo-
niae es responsable de casi el 30% de las mismas, siendo el causante más fre-
cuente de neumonía infantil severa, tanto en países desarrollados como en aquellos
en vías de desarrollo (UNICEF y WHO, 2006).
S. pneumoniae es uno de los patógenos más frecuentes de las infecciones ad-
quiridas en la comunidad, existiendo una clara relación entre la edad y la susceptibi-
lidad a la infección por esta bacteria. Ésta es especialmente elevada en ciertos gru-
pos de edad, como en la población pediátrica, entre los que se encuentran neona-
tos y niños menores de 2 años, debido a que su sistema inmunitario no se encuen-
tra completamente desarrollado. La susceptibilidad disminuye en adolescentes y
adultos jóvenes y aumenta de nuevo en adultos mayores de 65 años, afectando
tanto a individuos sanos (sin enfermedad de base conocida) como a pacientes in-
munodeprimidos (Parsons y Dockrell, 2002; Butler, 2004). El estado de portador
presenta una duración variable de entre 1 y 17 meses y depende del serotipo, sien-
do más prolongada normalmente en niños que en adultos (Ghaffar et al., 1999). Los
aislados bacterianos que se encuentran colonizando la nasofaringe de la población
infantil constituyen el reservorio ecológico principal, a partir del cual surgen y se
diseminan las resistencias del microorganismo y reflejan los aislados circulantes en
la comunidad (Lencastre y Tomasz, 2002). Ciertos factores, además de la edad,
predisponen a padecer la enfermedad neumocócica, como las inmunodeficiencias
congénitas (Lingappa et al., 2011), las infecciones respiratorias previas o concomi-
tantes, principalmente las de origen vírico (McCullers, 2006; Short et al., 2012), el
virus de inmunodeficiencia humana (Siemieniuk et al., 2011), la leucemia o los lin-
fomas (Wong et al., 2010).
S. pneumoniae posee diferentes elementos estructurales, considerados como
factores de virulencia, que le confieren capacidad patogénica en el ser humano,
facilitando la colonización, adhesión e invasión de diferentes tejidos. El principal
factor de virulencia de neumococo es la cápsula o polisacárido capsular (CPS)
(Brueggemann et al., 2003), que le confiere la capacidad de evadir el reconocimien-
to del mismo por parte del hospedador, impidiendo así la fagocitosis (Llull et al.,
2001; Yother, 2004; Hyams et al., 2010). La cápsula de neumococo, la estructura
más externa (Fig. 1), está formada por polisacáridos complejos que, a su vez, están

!
 compuestos por unidades repetidas de azúcares (Kamerling, 2000). En la mayoría
de los casos estos polisacáridos se encuentran unidos al peptidoglicano, posible-
mente mediante enlaces covalentes (Sørensen y Blom, 1992), o a componentes de
la membrana, que a veces pueden liberarse de la célula (Yother, 2011; Eberhardt et
al., 2012). En la actualidad, se han descrito más de 94 serotipos capsulares inmu-
nológicamente diferentes, 90 de los cuales ya estaban descritos en 1995 (Hen-
VOL. 67, 1999 richsen, 1995). VARIATION OF S. PNEUMONIAE CELL SURFACE CARBOHYDRATES 2329

Downloaded from http://iai.asm.org/ on April 22, 2014 by Red de Bibliotecas del CSIC
Fig. 1. Imagen al microscopio electrónico de transmisión de un
corte ultrafino de una cepa capsulada de serotipo 3 de neumoco-
co mostrando la cápsula polisacarídica que rodea a la célula (Kim
et al., 1999). Barra: 0.3 µm.

En la producción de cápsula se encuentran involucrados diferentes genes, loca-

lizados en un mismo locus denominado, según diferentes autores, cap o cps. Éstos
codifican una flipasa, una polimerasa y varias transferasas que catalizan la forma-
ción de enlaces, adición de azúcares y modificación de unidades repetidas. Una de
las características más llamativas del locus cap es su enorme divergencia genética,
FIG. 1. Immunoelectron microscopy of pneumococcal capsules showing an increased zone of capsular material in opaque (A and B) compared to transparent (C
and D) variants of type 6B pneumococcal strain P324. Bar, 1 "m (A and C) and 0.3 "m (B and D).
puesto que sólo unos pocos genes se encuentran conservados entre los diferentes
clusters (Bentley et al., 2006). Los primeros cuatro genes del locus, referidos como
Effect of capsular polysaccharide on the content of teichoic containing choline or equal concentrations of ethanolamine,
capa-D/cpsA-D (Reeves et al.,
acid. The previously documented inverse relationship in con-
1996), están altamente conservados en todos los
2-(methylamino)ethanol, or 2-dimethylaminoethanol in lieu of
tent of capsular polysaccharide
serotipos and teichoic
—excepto acid suggested
en los choline (19).
serotipos 3 yThe
37— content
y seof capsular polysaccharide
han asignado, in each
entre otras funcio-
that there could be a codependence in the expression of the growth condition was compared to that in choline-containing
two surface carbohydrate-containing
nes, a la structures.
regulación To define
de fur- controls by the
la biosíntesis capture
del CPS ELISA (Fig.et
(Llull 3). The
al.,absence
2001;of López
choline y García,
ther this relationship, the amount of teichoic acid as measured was confirmed by the loss of reactivity against ChoP in ELISAs
by the content of ChoP2004;was compared
Moscosofor mutants
y García, with aYother,
lacking cap-2009a; MAb with 2011).
specificity Por
to thisotro
structure (datalas
lado, not shown).
condiciones am-
sule or expressing different capsular types. There were no sig- The more fully methylated the structural analog, the greater
nificant differences in bientales
the quantity ofejercen un papel
cell-associated teichoic importante
was the amount enofla cantidadcapsular
cell-associated de CPS sintetizado
polysaccharide ex- por neu-
acid detected in a type 9V encapsulated parent strain, a sponta- pressed by the organism. These differences were statistically
neous capsule-deficientmococo
mutant, and(Ogunniyi
an encapsulatedet al., 2002), modificando el grado de exposición de las proteínas
revertant significant when growth in ethanolamine was compared to
of this strain (Fig. 2A). Similar results were shown with a type growth in choline (2.7-fold-more capsular polysaccharide for
2 encapsulated parent strain, an unencapsulated mutant, and a the opaque variant). This observation was seen for both the
transformant expressing a type 3 capsule (Fig. 2B). These re- opaque and the transparent variants, though the amounts of
sults demonstrated that the presence or type of capsular poly- capsular polysaccharide associated with the transparent organ-
saccharide does not affect the amount of cell-associated teichoic isms were about 12-fold less than those of the opaque organ-
acid. isms grown in the same medium. These findings suggested that
Effect of altered teichoic acid on the content of capsular structural differences in teichoic acid affect the content of
polysaccharide. The possibility that differences in expression of capsular polysaccharide.
!
the cell wall carbohydrate affect the amount of capsular poly- Relationship between phenotype and opsonophagocytic ac-
saccharide was then addressed. No mutants lacking teichoic acid tivity. The effect of colony phenotype, content of capsular
have been described. The composition of the cell wall carbo- polysaccharide, and teichoic acid on opsonophagocytic killing
hydrate, however, can be modified by replacing choline in the was examined in a standardized assay which compared op-
growth medium with structural analogs differing in the num- sonophagocytic activity between opaque and transparent vari-
bers of N-methyl groups (18). Opaque and transparent variants ants of strains for types 6B, 9V, and 18C (Table 2). There were
of a type 6B strain were grown in chemically defined media statistically significant differences (P ! 0.03) between the
de superficie, y por ende, repercutiendo de este modo en la patogénesis de neumo-
coco (Kim y Weiser, 1998). Existen diferentes mecanismos asociados al CPS por
los cuales S. pneumoniae es capaz de evadir la fagocitosis: a) las células fagocíti-
cas carecen de receptores específicos para reconocer los CPSs, y éstos presentan
diferentes cargas que repelen a aquellas; b) los anticuerpos frente a constituyentes
de la pared celular y el componente C3b del complemento, que pueden haberse
fijado a la pared celular, están envueltos siquiera parcialmente por la cápsula, por lo
que se produce un enmascaramiento de dichos elementos que facilitarían la fagoci-
tosis; c) el CPS es capaz de inhibir la activación del complemento (Musher, 2010).
Además, los neumococos son capaces de realizar un intercambio capsular con
otros neumococos, lo que da lugar a modificaciones de la virulencia (Kelly et al.,
1994), así como a una modificación de la susceptibilidad a determinados antimicro-
bianos (Muñoz-Almagro et al., 2009; Wyres et al., 2012).
Entre los factores de virulencia, además de los ya mencionados, podemos des-
tacar diferentes proteínas de superficie que participan en numerosos procesos de
interacción con el hospedador y que son esenciales para la patogénesis de la bac-
teria durante la colonización y los estados de dispersión e invasión, por lo que mu-
chas de ellas son también consideradas factores de virulencia (Nobbs et al., 2009;
Moschioni et al., 2010; Gámez y Hammerschmidt, 2012; Pérez-Dorado et al., 2012).
Las proteínas de unión a colina o CBPs tienen particular relevancia porque definen
una familia de proteínas de superficie típicas de las pocas bacterias que contienen
colina en su pared (Fig. 2). Entre ellas se encuentra la principal autolisina, LytA
(Sánchez-Puelles et al., 1986; Ronda et al., 1987) y la lisozima LytC (García et al.,
1999), que también puede causar eventualmente la lisis a 30°C. Estas dos autolisi-
nas desempeñan un papel esencial en el denominado “fratricidio”, un proceso que
permite a S. pneumoniae lisar a neumococos no competentes (Claverys y
Håvarstein, 2007; Wei y Håvarstein, 2012). Este proceso se ha propuesto como un
mecanismo de predación que contribuye a la patogenicidad mediante la regulación
de la liberación de distintos factores de virulencia. Además, LytA puede producir
autolisis espontánea (tanto en la fase estacionaria como la producida por determi-
nados antibióticos) y la concomitante liberación de Ply al medio extracelular (Berry y
Paton, 2000; López y García, 2004). Por su parte, la glucosaminidasa LytB es la
principal responsable de la separación de las células hijas (de las Rivas et al., 2002)
y, junto con LytC, es un importante factor de virulencia implicado en la colonización
de la nasofaringe y en el progreso de la enfermedad invasiva evitando la respuesta

!
inmune del hospedador (Ramos-Sevillano et al., 2011).

CÁPSULA
Autolisinas LytA y LytC
Liberación de neumolisina

→
→
CBPs PARED CELULAR
PspA
→
→
PspC Sistema de transportador ABC

→
PsaA

Neuraminidasa →
→ Sortasa
→ Lipoproteínas
PavA

→
Ácido lipoteicoico

→ →
Proteínas con motivos LPXTG Hialuronidasa Ácido teicoico

Fig. 2. Representación esquemática de algunas proteínas y otras moléculas de superficie im-

plicadas en la virulencia de S. pneumoniae. Modificada de Mitchell (2003).

Otras CBPs de neumococo con un papel importante en virulencia son: 1) PspA,

una adhesina que bloquea la fijación del complemento y dificulta la fagocitosis
(McDaniel et al., 1987, 1991); 2) La fosforilcolinesterasa Pce (Höltje y Tomasz,
1974; Vollmer y Tomasz, 2001; de las Rivas et al., 2001; Hermoso et al., 2005), que
libera residuos de PCho de los TAs de la pared celular y participa en la adhesión a
las células de la nasofaringe humana (Gosink et al., 2000); 3) PcpA, que se propuso
originalmente como una adhesina (Sánchez-Beato et al., 1998), cuya expresión es
2+ 2+
dependiente de las concentraciones de Mn y Zn (Johnston et al., 2006;
Kloosterman et al., 2008; Ogunniyi et al., 2010); también ha demostrado su valor
como vacuna protectora en modelos murinos de neumonía y sepsis (Glover et al.,
2008).
Por último, hay que destacar la formación de biofilmes como un importante factor
de virulencia para esta bacteria. Las células que forman biofilmes exhiben un feno-
tipo alterado con respecto a sus equivalentes de vida libre o planctónica en cuanto
a su tasa de crecimiento y patrones de expresión génica. Los biofilmes en general
se definen como agrupaciones de microorganismos adheridos a la superficie de un
sustrato orgánico o inorgánico embebido en una matriz extracelular (Costerton et

!
al., 1995). Esta matriz está formada por una mezcla de sustancias poliméricas sin-
tetizadas en gran parte por los propios microorganismos, lo que le da estabilidad
mecánica a la estructura (Domenech et al., 2013a), ayudando así a mantener las
bacterias alejadas de las defensas del hospedador, como se ha descrito en otras
comunidades microbianas (Schaudinn et al., 2007; Moscoso et al., 2009b). Además,
en el caso particular de neumococo las células que forman el biofilm dificultan el
reconocimiento por el sistema inmune y resisten concentraciones de antibióticos y
biocidas entre 100 y 1000 veces superiores a las que inhiben a las correspondien-
tes células planctónicas (Domenech et al., 2013b; El-Azizi et al., 2005).

1.4. Tratamientos y prevención de la infección neumocócica

El tratamiento de las enfermedades neumocócicas invasivas se ha basado durante

casi 40 años en la utilización de la penicilina —perteneciente al grupo de los antibió-
ticos β-lactámicos— debido a la gran susceptibilidad inicial de S. pneumoniae a
este antibiótico. Dentro de esta familia merecen también destacarse la cefotaxima y
ceftriaxona — dentro del grupo de las cefalosporinas de uso parenteral— y el cefdi-
toren, cefalosporina de uso oral y parenteral (Yamada et al., 2007). Sin embargo, la
aparición de cepas resistentes frente a éstos y otros compuestos antimicrobianos,
especialmente tras el brote surgido en Sudáfrica en 1987 que causó la muerte de
muchos niños (Appelbaum et al., 1987), ha alterado notablemente la situación y ha
impulsado el estudio de las diferentes resistencias de S. pneumoniae. También se
han utilizado los macrólidos, una familia de antibióticos que ejerce su efecto sólo en
los microorganismos que se encuentran en proceso de replicación y penetran más
fácilmente en las bacterias Gram-positivas. Sin embargo, presentan el mismo in-
conveniente que los β-lactámicos, es decir, la aparición de resistencias que en el
caso de España son elevadas, alcanzando porcentajes de entre el 30 y el 50%
(Pérez-Trallero et al., 2005). Por último, las quinolonas han sido la otra gran familia
de antibióticos utilizados contra neumococo, especialmente las fluoroquinolonas.
Son compuestos de amplio espectro cuyo mecanismo de acción es el bloqueo o
inhibición de la DNA girasa y/o la DNA topoisomerasa que interfieren en la replica-
ción del DNA (Wolfson y Hooper, 1989).
El desarrollo de vacunas contra neumococo se ha basado en el hecho bien con-
trastado de que los anticuerpos frente a un serotipo capsular protegían de una in-
fección posterior causada por cepas del mismo serotipo o de serotipos que presen-

!
tasen alguna reacción cruzada con aquel (Lyall y Odell, 1939; Welch et al., 1939;
Heidelberger, 1983). Por ello, se consideró la combinación de CPSs de aquellos
serotipos que mostraran mayor prevalencia. Los CPSs, al activar únicamente a los
linfocitos B, no producen memoria inmunológica, por lo que la respuesta inmune se
va perdiendo con el tiempo (Pitsiou et al., 2011). Para aumentar la inmunogenicidad
de los polisacáridos se desarrolló en 2001 la vacuna conjugada 7-valente (PCV7),
que contenía 2 µg de cada polisacárido de los serotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F, 23F y
4 µg del 6B, conjugados individualmente con 20 µg de una proteína transportadora
CRM197, que es una variante no tóxica de la toxina diftérica capaz de estimular la
respuesta mediada por linfocitos T por lo que sí genera memoria inmunológica
(American Academy of Pediatrics, 2000). Esta vacuna ha dado lugar a diferentes
cambios en los serotipos circulantes por lo que, en 2011, la PCV7 fue ampliada con
6 serotipos más, comercializándose la vacuna conjugada 13-valente (PCV13) que
incluye, además de los presentes en la PCV7, los serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F y 19A
(Paradiso, 2011, 2012). Actualmente se está empleando la vacuna 23-valente
(PPSV23) que contiene una mezcla de los 23 CPSs responsables de la mayor parte
de las infecciones neumocócicas (1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14,
15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F). Está recomendada para adultos de
más de 65 años o menores de esta edad con enfermedades pulmonares o cardio-
vasculares crónicas así como para niños de más de 2 años con patologías que
aumenten el riesgo de desarrollar infecciones neumocócicas (Centers for Disease
Control and Prevention, 2013). Los aspectos negativos de las vacunas conjugadas
son el limitado número de serotipos frente a los que protege, el alto coste de cada
dosis y el fenómeno de “reemplazo de serotipo” por otros no presentes en la vacuna
(Weinberger et al., 2011).
Como resultado de los problemas planteados por vacunas basadas en antígenos
polisacarídicos, numerosos grupos de investigación de todo el mundo trabajan en la
búsqueda de nuevas vacunas basada en proteínas de la bacteria que sean comu-
nes a todos o, al menos, a la mayoría de aislados clínicos, que posean un alto gra-
do de conservación y que confieran inmunidad. En la actualidad se han descrito
diferentes proteínas antigénicas de neumococo como posibles candidatas a formar
parte de una vacuna de naturaleza proteica siendo Ply, PspC, PspA, PsaA, y NanA,
las más estudiadas (Lebon et al., 2011; Prevaes et al., 2012). Sin embargo, al me-
nos hasta ahora, ninguna de ellas ha sido considerada como un candidato adecua-
do para proporcionar protección suficiente cuando se utiliza de forma individualiza-

!
da, debido posiblemente al marcado polimorfismo de algunas de ellas (Iannelli et
al., 2002). A pesar de ello, se piensa que las vacunas de naturaleza proteica tienen
un elevado potencial desarrollo, ya que se ha descrito que ciertas combinaciones
de proteínas proporcionan un efecto aditivo, o incluso sinérgico, en términos de
inmunoprotección (Ogunniyi et al., 2007; Lebon et al., 2011).

2. ESTRUCTURA DE LA PARED BACTERIANA

La pared celular consiste en una red covalente situada alrededor de la membrana

celular, a modo de exoesqueleto, que le aporta flexibilidad y rigidez, protegiendo a
la bacteria de su posible lisis, ya sea osmótica o mecánica (Salton, 1994). La pared
bacteriana, además de ser el medio de intercambio de solutos entre el exterior y el
interior celular, sirve de sistema de anclaje para toda una batería de proteínas im-
plicadas en procesos de multiplicación y división celular, y en las interacciones de la
célula con el medio exterior. El componente básico de la pared, muy conservado
entre todas las bacterias, es el polímero denominado peptidoglicano que está for-
mado por un entramado tridimensional de cadenas glicánicas constituidas por resi-
duos alternados de ácido N-acetilmurámico (MurNAc) y N-acetil-glucosamina
(GlcNAc) unidos mediante enlaces glicosídicos β(1→4) que se entrecruzan median-
te cortos segmentos peptídicos (Fig. 3) (Weidel y Pelzer, 1964). A modo de ejemplo
en la figura 3 se representan los componentes de la pared celular de neumococo.
Se ha descrito que cada cadena glicánica posee alrededor de unos 35 disacáridos
(Beveridge, 1981), lo que supone en su conformación más extendida, una longitud
media de 35 nm (Formanek, 1983).

!
 GlcNAc MurNAc GlcNAc MurNAc GlcNAc MurNAc

L-Ala L-Ala L-Ala

D-Glx D-Glx D-Glx
L-Lys L-Lys L-Lys
L-Ser-L-Ala
D-Ala D-Ala D-Ala

L-Ala-L-Ala

D-Ala
L-Lys L-Lys L-Lys

D-Glx D-Glx D-Glx

L-Ala L-Ala L-Ala

GlcNAc MurNAc GlcNAc MurNAc GlcNAc MurNAc

Fig. 3. Representación esquemática de los componentes de la pared celular de neumococo.

Las cadenas glicánicas están formadas por repeticiones del disacárido N-acetil-glucosamina–
N-acetil-murámico (GlcNAc-β(1→4)-MurNAc) que se entrecruzan a través de segmentos pep-
tídicos (en negro) unidos a los residuos de MurNAc. Las uniones interpeptídicas (en granate)
pueden ser directas o mediadas por puentes peptídicos cortos. Las flechas indican los enlaces
de la pared hidrolizados por los distintos tipos de mureín-hidrolasas: glucosaminidasas (en
azul), muramidasas (en morado), amidasas (en rojo) y endopeptidasas (en gris). Modificada de
Weidel y Pelzer (1964).

Tradicionalmente, se ha aceptado que las cadenas glicánicas adoptan una es-

tructura helicoidal con los péptidos dirigidos hacia el exterior de la hélice formando
una red tridimensional que rodea a la célula bacteriana, debido a la formación de
enlaces cruzados con los péptidos de cadenas cercanas (Beveridge, 1981; Barni-
ckel et al., 1983). En los últimos años, sin embargo, se ha propuesto un nuevo mo-
delo espacial para la pared, mediante estudios con fragmentos sintéticos del pepti-
doglicano (Meroueh et al., 2006). Según este modelo las cadenas glicánicas se
dispondrían de forma perpendicular a la membrana, con las cadenas peptídicas
giradas cada 120°, permitiendo así la interacción con los péptidos adyacentes, y

!
 imágenes de bacterias obtenidas por microscopía de fuerza atómica (Touhami et
o PGRPs) (Royet & Dziarski, 2007). Aunque todas las PGRPs forman parte
al., 2004).
sistema de defensa del hospedador, las estrategias utilizadas son muy difere
Además de ser una diana pudiendo
para funcionar
diferentes tipos como simples sensores
de antibióticos, el que disparan los mecanismo
peptidoglicano bacteriano también esdefensa del microorganismo
un blanco para el sistema oinmune
como auténticos
del efectores antimicrobianos (Roy
hospedador a través de los receptores de 2007).
Dzjarski, los denominados patrones de
reconocimiento (Pattern Recognition Receptors o PRRs), entre los que se incluyen
las proteínas que reconocen al peptidoglicano (Peptidoglycan Recognition Proteins
o PGRPs) (Royet & Dziarski, 2007). Aunque todas las PGRPs forman parte del
sistema de defensa del hospedador, las estrategias utilizadas son muy diferentes,
pudiendo funcionar como simples sensores que disparan los mecanismos de
formando, en conjunto, una estructura tipo “panal de abeja” (Fig. 4), más acordeFigura 1.5. (A) Vista superior y (B) late
defensa del microorganismo o como auténticos efectores antimicrobianos (Royet & modelo tridimensional de la arquitectura
con las imágenes de bacterias obtenidas por microscopía de fuerza atómica
Dzjarski, 2007). pared bacteriana, basado en la estructu
(Touhami et al., 2004). solución del tetrasacárido-di-pentap
(GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-isoGln-L-Lys-D-Al

A B Ala)2 (Meroueh et al., 2006). En n

aparecen las cadenas glicánicas y en ver

Figura 1.5. (A) Vista superior y (B) lateral del peptídicas. Las flechas indican la dim

modelo tridimensional de la arquitectura de la variable de los poros (dependiente del gra

pared bacteriana, basado en la estructura en entrecruzamiento de las cadenas pept
solución del tetrasacárido-di-pentapéptido cuyo tamaño mínimo sería ~70 Å.
(GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-isoGln-L-Lys-D-Ala-D-
100 Å
Ala)2 (Meroueh et al., 2006). En naranja
aparecen las cadenas glicánicas y en verde las
peptídicas. Las flechas indican la dimensión
variable de los poros (dependiente del grado de
Fig. 4. Estructura del segmento de peptidoglicano polimérico. (A) Vista
entrecruzamiento de superior y (B) lateral
las cadenas del
peptídicas)
modelo tridimensional de la arquitectura de la pared bacteriana,
cuyo tamaño basado en la~70
mínimo sería estructura
Å. en solu-
ción del tetrasacárido-di-pentapéptido (GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-isoGln-L-Lys-D-Ala-D-Ala)2. En
naranja, se muestran las cadenas glicánicas y en verde las peptídicas. Las flechas indican la di-
mensión variable de los poros (dependiente del grado de entrecruzamiento de las cadenas peptí-
dicas) cuyo tamaño mínimo sería ≈70 Å. Tomado de Meroueh et al. (2006).

En el caso de neumococo, el grado de acetilación de la cadena glicánica, contra-

riamente a lo que ocurre en otras bacterias Gram-positivas, está regulado por 7dos
enzimas: una GlcNAc desacetilasa A (PdgA) que reduce la acetilación de los resi-
duos de glucosamina hasta valores cercanos al 10% (Vollmer y Tomasz, 2000) y
una O-acetiltransferasa (Adr) de los residuos de MurNAc (Crisóstomo et al., 2006;
Davis et al., 2008). Este tipo de modificación ha demostrado ser importante durante
la colonización, siendo parte de los mecanismos de virulencia de S. pneumoniae ya
que, a pesar de que se ha propuesto que los dobles mutantes pgdA adr poseen una
eficacia biológica menor que la cepa salvaje, adquieren ventaja a la hora de evadir
el reconocimiento por parte de la lisozima del hospedador, compensando así dicha
deficiencia (Vollmer y Tomasz, 2000, 2002; Davis et al., 2008).
La unión entre el polisacárido y las pequeñas cadenas peptídicas tiene lugar en
la posición 3 del anilllo de MurNAc, a través del grupo D-lactilo. Las cadenas peptí-
dicas de neumococo contienen mayoritariamente tres (L-Ala–D-isoGlx–L-Lys) o
cuatro (L-Ala–D-isoGlx–L-Lys–D-Ala) aminoácidos (Fig. 3), apareciendo en mucha
menor proporción el pentapéptido L-Ala–D-isoGlx–L-Lys–D-Ala–D-Ala (García-
Bustos y Tomasz, 1990). Existen dos tipos de conexiones interpeptídicas: la prime-

!
ra tiene lugar entre la D-Ala en posición terminal de la unidad donadora y la L-Lys
en posición 3 de la unidad receptora mediante el puente L-Ala–L-Ser (o menos
frecuentemente L-Ala–L-Ala); el segundo tipo es el enlace directo entre la D-Ala
terminal y la L-Lys (Fig. 3). El primer tipo es el más abundante y, aunque estos son
los aminoácidos que se han encontrado en mayor proporción en las uniones inter-
peptídicas, se ha descrito también la presencia minoritaria de puentes Gly/Asp-Lys
(Fischer y Tomasz, 1985; García-Bustos y Tomasz, 1987).
Por otro lado, se ha descrito que en las cepas de neumococo resistentes a peni-
cilina o β-lactámicos el patrón de las cadenas peptídicas cambia, observándose un
mayor contenido de péptidos ramificados, mientras que las cepas sensibles presen-
tan el 70% de los péptidos en forma lineal (García-Bustos y Tomasz, 1990; Severin
y Tomasz, 1996).

2.1. Ácidos teicoicos

Los TAs, descritos por primera vez en 1930 bajo la denominación de polisacárido C,
debido a su interacción con la proteína C-reactiva (CRP) humana (Tilled et al.,
1930), se encuentran anclados a la pared celular a través de un conector formado
por glicerolfosfato, ribitolfosfato o glucosilfosfato que, a su vez, se une a la cadena
glicánica en la posición 6 del MurNAc a través de un disacárido mediante un enlace
fosfodiéster (Behr et al., 1992). Por otro lado, los LTAs se encuentran anclados a la
membrana plasmática a través de un residuo de glucosa unido de forma covalente
a un diacilglicerol (Seo et al., 2008).
Los TAs que se incorporan al peptidoglicano durante la formación de la pared
celular están formados en general por repeticiones variables, entre 4 y 8, de un
pentasacárido: (→1)–2-acetamido-4-amino-2,4,6-tridesoxigalactopiranosa-β(3→1)–
D-glucopiranosa-(6→O)–D-ribitol-5-fosfato-β(1→1)–D-N-acetil-6-O-fosforilcolina-
galactopiranosa-α(3→1)–D-N-acetil-6-O-fosforilcolina-galactopiranosa. La primera
unidad de este polisacárido se une mediante un enlace tipo β a la glucosa, mientras
que el resto se une a la repetición anterior mediante enlaces de configuración α a la
glucosa. Todas las repeticiones contienen dos residuos de N-acetilgalactopiranosa
(GalpNAc) que presentan el sustituyente PCho en posición 6, a excepción de la
repetición terminal que puede o no contenerlo (Fig. 5) (Gisch et al., 2013).
La distribución uniforme de los TAs y LTAs en la pared celular (Umeda et al.,
1992) le confiere carga negativa debido a sus numerosos grupos fosfato, capaces

!
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de formar quelatos con magnesio y otros cationes divalentes, lo que contribuye a
aumentar la rigidez del exoesqueleto. Una de las características más notables de la
pared de neumococo es la presencia en su estructura de TAs y LTAs con residuos
de PCho unidos covalentemente a través de un enlace fosfodiéster a los residuos
de GalpNAc. Es importante destacar que, a diferencia de lo que ocurre con otras
bacterias Gram-positivas, los LTAs presentan una composición idéntica a los TAs
(Fischer, 1994), siendo S. pneumoniae un caso único hasta la fecha. Los TAs de
neumococo, como sucede en otras bacterias Gram-positivas, contienen D-Ala que
les confiere resistencia frente a la acción de péptidos antimicrobianos de naturaleza
catiónica
Figure 10 (Kovácks et al., 2008).

X = H ó PCho
R = H ó D- Ala
n = 2–6
PCho

configuración-β

configuración-β

configuración-α n#

UR#
UR terminal UR 2 UR 1

Fig. 5. Composición de los ácidos lipoteicoicos de neumococo. La estructura propuesta se ha

realizado a partir de datos con las cepas D39Δcps y TIGR4Δcps. Los residuos de N-acetil-D-
22
galactopiranosa llevan unido en posición 6 un residuo de fosforilcolina. El conector glicolipídico
estaría formado por D-glucopiranosa-α(1→3)–di-acil-glicerol. UR, unidad de repetición. Modifi-
cada de Gisch et al. (2013).

La presencia de colina como componente estructural de la pared celular se ha

considerado durante mucho tiempo como una característica específica de S. pneu-
moniae (Tomasz, 1967). Sin embargo, hace unos años se publicó que también es-
taba presente en las estructuras periféricas de otros patógenos del tracto respirato-
rio (Weiser et al., 1998a, b). En neumococo, el 83% de la colina se encuentra for-
mando parte de los TAs (Yother et al., 1998) y el 17% restante corresponde a los
LTAs. Los residuos de PCho participan directamente en el proceso de internaliza-
ción de la bacteria por parte de las células del hospedador (Cundell et al., 1995).
Estos residuos son reconocidos durante el proceso de inflamación por la CRP hu-

!
mana (Mold et al., 1982) y actúan como receptores de las CBPs, entre las que se
encuentran las enzimas que hidrolizan la pared celular (mureín-hidrolasas) y otros
factores implicados en la infectividad de la bacteria (Rosenow et al., 1997; Je-
drzejas, 2001; Frolet et al., 2010). Por otro lado, se ha descrito que tanto los TAs
como los LTAs son altamente antigénicos, siendo responsables entre otras cosas
de estimular la formación de interleuquina-1 en los monocitos humanos (Riesenfeld-
Orn et al., 1989), activar la ruta alternativa del complemento (Hummell et al., 1985),
e incluso actuar como agentes quimiotácticos en la inflamación meníngea (Tuoma-
nen et al., 1985). Además, los TAs y LTAs, a través de los residuos PCho, forman
parte de los receptores del bacteriófago Dp-1 (López et al., 1982).

2.2. Proteínas de unión a colina

Las CBPs, como ya se ha indicado anteriormente, reconocen los residuos de PCho

de los TAs y LTAs para su anclaje no covalente a la superficie celular. Proteínas de
la familia de las CBPs pueden encontrarse también en otras familias bacterianas
que contienen residuos de colina en su pared, como ocurre en SGM y, en particular,
S. pseudopneumoniae (Llull et al., 2006; Shahinas et al., 2011, 2013), S. mitis
(Moscoso et al., 2005; Denapaite et al., 2010; Madhour et al., 2011) y S. oralis
(Ronda et al., 1988, 1989; Horne y Tomasz, 1993; Reichmann et al., 2011) o incluso
en otras familias bacterianas más alejadas filogenéticamente de neumococo como
Actinomycetaceae,! Coriobacteriaceae,! Bacillaceae, Lachnospiraceae,! Clostridia-
ceae (García et al., 2000; Demarest et al., 2005; Ho et al., 2005; del Cerro et al.,
2013),! Eubacteriaceae, Erysipelotrichaceae (To y Nagai, 2007; Ogawa et al., 2011)
o Carnobacteriaceae (Morales, 2014).

!
 Número de aminoácidos
Proteína Origen
0 100 200 300 400 500 600 700
Nt# Ct#

LytASPN
PS
LytB
PS
LytC
PS
Pce
PS S. pneumoniae
CbpD
PS
CbpF
PS
PspA
PS
PspC

LytASGM SGM

ΦSPN Profagos

Pal (Dp-1) Fago lítico

S. pneumoniae
Cpl-1 (Cp-1) Fago lítico

Cpl-7 (Cp-7) Fago lítico

Amidase_2 Lactamase_B SH3_5 RICH

(PF01510) (PF00753) (PF08460) (PF05062)
Glucosaminidase Amidase_5 CW_binding _7 CW_binding_1*
(PF01832) (PF05382) (PF08230)
Familia GH_25 CHAP CW_binding_1 Desconocido
(PF01183) (PF05257) (PF01473)

Fig. 6. Representación esquemática de la organización modular de algunas CBPs de S. pneumoniae y

sus fagos. Los diferentes módulos han sido denominados como se indica en la base de datos Pfam
(versión 25.0) (Finn et al., 2010). Las regiones homólogas se indican con idénticos colores y sombrea-
dos. El asterisco indica una repetición de unión a colina que contiene una deleción característica de dos
aminoácidos encontrada en alelos LytA de estreptococos del grupo mitis y alguno de sus fagos (Obregón
et al., 2002; Llull et al., 2006; Morales et al., 2010). PS, péptido señal.

La familia de CBPs se ha considerado como un buen ejemplo de proteínas mo-

dulares. Desde el punto de vista conceptual, la palabra “módulo” define a los frag-
mentos de proteínas con diferente estructura, función y/o historia evolutiva. Por su
parte, los “dominios estructurales” se asignaron inicialmente a los segmentos de
cadenas polipeptídicas que se pliegan en unidades globulares, pero que también
pueden llevar a cabo funciones especializadas. Cuando el mismo, o muy similar,
dominio se encuentra en muchas proteínas diferentes, se asume que se ha origina-
do por duplicación génica y eventos de recombinación. Tales dominios genética-

!
mente móviles se llaman módulos (Copley et al., 2003). En el caso de las CBPs los
dominios son también propiamente módulos y por eso en la literatura se pueden
encontrar ambas nomenclaturas indistintamente.
Con la excepción de CbpF (Molina et al., 2009), todas las CBPs están compues-
tas por, al menos, 2 dominios diferentes: uno de reconocimiento de colina, denomi-
nado dominio de unión a colina (CBD, Choline Binding Domain) —que le permite a
la proteína unirse de forma no covalente a los residuos de colina de la superficie
bacteriana— y otro dominio funcional, responsable de la actividad biológica de la
proteína, ya sea ésta enzimática o no (López y García, 2004; Pérez-Dorado et al.,
2010). Los CBDs se caracterizan por estar formados por un número variable de
repeticiones (CBRs, repeticiones de unión a colina, Choline Binding Repeats), de
unos 20 aminoácidos cada uno, muchos de ellos aromáticos (García et al., 1988).
Salvo LytB y LytC, en las demás CBPs, el CBD se encuentra localizado en el domi-
nio C-terminal. Gracias a los resultados de cristalización se sabe que el CBD se
pliega de forma análoga en todas las estructuras resueltas formando una horquilla β
que da lugar a una superhélice levógira con forma característica de solenoide (Fer-
nández-Tornero et al., 2001, 2002; Hermoso et al., 2005; Molina et al., 2009; Zhang
et al., 2009; Pérez-Dorado et al., 2010). Con la notable excepción de LytA, CbpG y
CbpI, las demás CBPs de neumococo poseen un péptido señal (PS) que determina
su localización en la superficie celular (Fig. 6).
Las CBPs de la cepa no capsulada R6 de neumococo incluyen cinco hidrolasas
de pared celular que rompen enlaces específicos del peptidoglicano o de los TAs:
a) LytA, una N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa que participa en una variedad de
funciones fisiológicas y es la principal autolisina de neumococo (García et al.,
1985b, 1986); b) LytB, una N-acetilglucosaminidasa implicada en la separación de
las células hijas al final de la división celular (García et al., 1999; de las Rivas et al.,
2002) y con gran importancia en la formación de biofilmes (Domenech et al., 2013a,
b); c) LytC, una lisozima que participa en la autolisis a 30°C, lo que sugiere que
podría desempeñar un importante papel en las vías respiratorias superiores (Ra-
mos-Sevillano et al., 2011), además de participar en el proceso del fratricidio (Pé-
rez-Dorado et al., 2010); d) CbpD, una endopeptidasa que también participa en el
proceso de fratricidio (Eldholm et al., 2009, 2010), y e) Pce, una fosforilcolinestera-
sa que modula el nivel de colina en la superficie mediante liberación de residuos de
PCho.

!
 Además de estas hidrolasas también hay otras proteínas pertenecientes a la
misma familia: a) adhesinas como CbpA y PspA, que desempeñan un importante
papel en la adhesión y colonización del hospedador evadiendo el sistema inmune
así como en la degradación de proteínas de la matriz extracelular (Jedrzejas, 2006;
Mann et al., 2006; Li et al., 2007; Frolet et al., 2010); b) CbpC y CbpG, identificadas
como factores de virulencia en diferentes estudios realizados en modelos de rato-
nes; c) CbpF, que inhibe la actividad de la autolisina LytC y podría controlar la viru-
lencia de la infección (Molina et al., 2009; Silva-Martin et al., 2014); d) CbpI y CbpJ,
cuyas funciones son desconocidas hasta la fecha. Por su parte, Spr0583 (corres-
pondiente a SP0667 en la cepa TIGR4), es una proteína controvertida debido al
polimorfismo entre diferentes cepas de neumococo, aunque es improbable que
también pertenezca a la familia de las CBPs.
Es interesante destacar que tanto los fagos líticos, de la familia Dp y Cp (García
et al., 1987b, 1988, 1990; Sheehan et al., 1997), como los atemperados de neumo-
coco (Romero et al., 1990a, b; Romero et al., 2009a, b) codifican enzimas líticas de
pared (endolisinas) que también pertenecen a la familia de las CBPs. Sólo se cono-
ce una excepción a esta regla, la del fago Cp-7 cuya enzima lítica (endolisina) (Cpl-
7) es la única en el sistema de neumococo y sus fagos que no depende de colina y,
por tanto, es capaz de degradar paredes celulares conteniendo tanto colina como
etanolamina (García et al., 1990; Bustamante et al., 2010) (Fig. 6). En la figura 7 se
muestran micrografías al microscopio electrónico de dos viriones purificados, Dp-1 y
Cp-7, representantes de las dos familias de fagos líticos descritos en neumococo.

A B

!
Fig. 7. Micrografía electrónica de fagos purificados con tinción negativa. (A) Dp-1; (B) Cp-7.
Barra: 200 nm.

!
3. LAS LISOZIMAS, UN TIPO DE MUREÍN-HIDROLASAS

Las lisozimas o N-acetilmuramidasas (EC 3.2.1.17) son hidrolasas que rompen

específicamente el enlace β-1,4- existente entre el MurNAc y el GlcNAc del pepti-
doglicano bacteriano (es decir, el extremo reductor) (Fig. 3). Las lisozimas se sinte-
tizan tanto en animales, como en plantas y bacterias, y forman parte de una de las
familias de enzimas más antiguas y eficaces de la naturaleza. Desde el punto de
vista evolutivo, se originaron a partir de genes de bacteriófagos y/o bacterias codifi-
cantes de enzimas líticas de pared que, posteriormente, dieron lugar a todas las
subfamilias conocidas (Masschalck y Michiels, 2003). De todas ellas, la más em-
pleada y estudiada es la lisozima de clara de huevo (HEWL, Hen Egg White Ly-
sozyme).

3.1. Clasificación de las lisozimas

De acuerdo con la clasificación propuesta por Jollès y Jollès en 1984, las lisozimas
se pueden agrupar en los siguientes tipos:
Lisozimas tipo-c (“chicken type”). La enzima más representativa de este grupo
es la lisozima de clara de huevo de pollo (Canfield, 1963) o pavo (LaRue y Speck,
1970), aunque también se incluyen lisozimas de origen humano (Peters et al.,
1989), de roedores (Yeh et al., 1993), reptiles (Siritapetawee et al., 2009), peces
(Hikima et al., 2000) o incluso insectos (Araújo et al., 2006). Sus características
principales son: a) presentan alrededor de 130 aminoácidos, con cuatro puentes
disulfuro; b) los dos aminoácidos implicados en el mecanismo catalítico de la li-
sozima HEWL, Glu-35 y Asp-52, se conservan en posiciones similares en todas las
lisozimas de esta clase; c) poseen una cierta actividad quitinasa, lo que posibilita la
hidrólisis de polímeros compuestos únicamente por GlcNAc.
Lisozimas tipo-g (“goose type”). Este grupo recibe su nombre debido a que la
primera lisozima de esta clase descubierta lo fue en la clara de huevo de ganso
Embde “Embde goose” (Canfield y McMurry, 1967). Las enzimas de este grupo se
caracterizan por tener un tamaño de unos 180 aminoácidos, con cuatro puentes
disulfuro. Sobre la base de estudios cristalográficos, se ha postulado que los ami-
noácidos Glu-73 y Asp-86 podrían corresponder a los aminoácidos Glu-35 y Asp-52
de la HEWL. Dentro de esta clase podemos encontrar enzimas de pollo (Nakano y
Graf, 1991) y otras aves que poseen lisozimas tanto de tipo-g como tipo-c, de peces

!
(Larsen et al., 2009), de humanos y roedores (Irwing y Gong, 2003) así como de
algunos invertebrados (Zhao et al., 2007; Nilsen et al., 2003).
Lisozimas tipo-i (“invertebrate type”). Esta clase se propuso en 1975 tras la com-
paración de las secuencias de aminoácidos de las regiones N-terminal de las li-
sozimas aisladas de una estrella de mar con el tipo-c y otra de tipo-g (Jollès y
Jollès, 1975), aunque no fue hasta 1999 cuando se obtuvo la secuencia completa
de aminoácidos de una lisozima perteneciente a esta clase (Ito et al., 1999). Ejem-
plos de este tipo se encuentran en los moluscos (Xue et al., 2007), anélidos (Jos-
ková et al., 2009), equinodermos (Cong et al., 2009), nematodos (O’Rourke et al.,
2008) o artrópodos (Paskewitz et al., 2008).
Lisozimas de bacteriófagos, bacterias y hongos. Algunos de los ejemplos más
representativos que podemos encontrar dentro de esta familia son las lisozimas de
los bacteriófagos T4 y lambda, la muramidasa de Escherichia coli, además de las
quitinasas de Streptomyces sp. y Bacillus circulans, entre otras.

3.2. Lisozimas presentes en S. pneumoniae y sus bacteriófagos

Las muramidasas o lisozimas codificadas por S. pneumoniae y sus bacteriófagos

pertenecen a la familia GH-25 de las glicosilhidrolasas (Felch et al., 1975; Lichens-
tein et al., 1990). A este grupo pertenecen LytC, codificada por la bacteria, y las
endolisinas Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-9, codificadas por los bacteriófagos Cp-1, Cp-7 y Cp-
9, respectivamente. Todas ellas dependen de la presencia de los residuos de PCho
para su unión a la pared y su máxima actividad enzimática, con la excepción de
Cpl-7 que presenta un módulo de unión a la pared (CWBM, Cell Wall Binding Modu-
le) totalmente diferente al resto.
LytC tiene una masa molecular, en su forma madura, de 58.7 kDa y posee un
péptido señal de 33 aminoácidos (García et al., 1999). El CBD está en su extremo
N-terminal, al contrario de la organización general de las CBPs, y contiene once
CBRs. Además, como ya se ha comentado en esta Memoria, esta lisozima es, junto
a LytA, un importante factor de virulencia.
La endolisina Cpl-1 codificada por el fago Cp-1, tiene una masa molecular de
39.2 kDa y difiere en sólo 10 aminoácidos (9 de ellos en el módulo catalítico) de la
lisozima Cpl-9 (García et al., 1990). En ambas endolisinas el CBD, situado en posi-
ción C-terminal, está formado por 6 CBRs (Monterroso et al., 2005, 2008).
Un caso único dentro de la familia es Cpl-7. Esta lisozima tiene una masa mole-

!
cular de 38.4 kDa, siendo capaz de hidrolizar indistintamente paredes que conten-
gan colina o etanolamina. Estructuralmente, el módulo catalítico comparte un 85.6%
de la secuencia con el de Cpl-1 (27 aminoácidos diferentes), mientras que el
CWBM es absolutamente distinto y está formado por 3 repeticiones (CW_7) idénti-
cas no sólo en aminoácidos ―48 aminoácidos por repetición― sino también en
nucleótidos.

4. TERAPIA FÁGICA Y ENZIBIÓTICOS

La capacidad de los bacteriófagos de lisar a sus bacterias hospedadoras, su amplia

distribución y su elevada especificidad hicieron que estas entidades biológicas fue-
ran propuestas desde un principio como herramientas de control de la población
bacteriana. Fue F. d’Herelle en 1917 el primero que utilizó los fagos como agentes
antimicrobianos y, durante varios años la terapia fágica fue una práctica muy común
en EE. UU., Europa así como en la antigua URSS (Brüssow, 2005). Sin embargo, el
escaso conocimiento de la biología de los fagos, la falta de resultados concluyentes
y el descubrimiento de los antibióticos hicieron que tanto en Europa occidental co-
mo en EE. UU. se abandonara progresivamente esta estrategia (Merril et al., 2006).
En cambio se mantuvo en Europa Oriental, especialmente en el Instituto Eliava de
Tiflis (Georgia), donde siguieron desarrollando técnicas para la obtención, purifica-
ción y selección de bacteriófagos utilizados contra una variedad de infecciones bac-
terianas (Hanlon, 2007).
La capacidad de los antibióticos para curar enfermedades infecciosas que en el
pasado eran mortales está viéndose seriamente amenazada debido al incremento
progresivo de cepas multirresistentes. A esto se añade la dificultad de obtener nue-
vos fármacos dirigidos a nuevas dianas terapéuticas. Debido a estos inconvenien-
tes, hace algunas décadas se relanzaron los estudios de terapia fágica sobre infec-
ciones en animales con resultados esperanzadores (Smith y Huggins, 1982, 1983).
Se puede decir que a partir de estos ensayos la utilización de fagos (o de sus pro-
ductos) está viviendo una época de renovado interés científico y de gran esperanza
para el tratamiento de ciertas infecciones recalcitrantes.
La terapia fágica es una estrategia basada en productos naturales, como son los
viriones o alguno de sus productos codificados en el genoma fágico. Los viriones
presentan características destacadas, entre ellas la elevada especificidad (evitando
así disbiosis y desarrollo de infecciones secundarias), la inexistencia de efectos

!
secundarios graves, así como un aislamiento fácil con costes de producción signifi-
cativamente menores a los de otros antibacterianos. No obstante, hay que tener en
cuenta algunos inconvenientes que deben ser seriamente considerados como la
dificultad a la hora de obtener preparaciones de gran pureza así como la conserva-
ción de los mismas (estabilidad/viabilidad) e incluso la búsqueda de regulaciones
específicas para productos basados en fagos ya que su farmacodinámica es com-
pletamente distinta a la de cualquier otro fármaco (Kudva et al., 1999; García y
López, 2002; Skurnik et al., 2006; Fischetti, 2006a, b; Mattey et al., 2008; Parisien
et al., 2008).
A pesar de los posibles inconvenientes de la terapia fágica, una muestra del cre-
ciente interés por la misma es el estudio publicado en el año 2009 por la Autoridad
Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, European Food Safety Authority), donde
se exploraba la posible aplicación de los bacteriófagos en alimentos y se estable-
cían las bases para las futuras regulaciones sobre su uso (EFSA, 2009).
El término “enzibiótico” fue acuñado hace algo más de 10 años como la fusión
de “enzima” y “antibiótico” (Nelson et al., 2001). Este concepto incluía inicialmente
las endolisinas codificadas por bacteriófagos que mostraban una elevada capacidad
de degradar la pared celular y con alto potencial antibacteriano, pero hoy en día se
ha ampliado a toda clase de enzimas que, independientemente de su origen, pre-
senten actividad antibacteriana y/o antifúngica, péptidos antimicrobianos e incluso
enzimas que bloquean la síntesis del peptidoglicano (Biziulevicius et al., 2008). En
los últimos años, numerosas proteínas pertenecientes a estos grupos han sido obje-
to de estudio como posibles candidatos a enzibióticos (Fischetti et al., 2006b; Her-
moso et al., 2007; Donovan y Foster-Frey, 2008; Schuch et al., 2009).
Respecto a las endolisinas capaces de degradar la pared de neumococo, se ha
demostrado que tanto las enzimas fágicas Cpl-1 y Pal como la autolisina bacteriana
LytA pueden actuar como antibacterianos eficaces y específicos en el tratamiento
de las infecciones causadas por neumococo, en modelos animales de infección
(Loeffler et al., 2001, 2003a, b; Jado et al., 2003; Rodríguez-Cerrato et al., 2007a).
Además, Cpl-1 y Pal actuaban sinérgicamente entre ellas y, en el caso de Cpl-1, la
sinergia también se consigue con antibióticos clásicos como la penicilina, moxiflaci-
na, gentamicina o la daptomicina (Djurkovic et al., 2005; Rodríguez-Cerrato et al.,
2007b; Vouillamoz et al., 2013). Los experimentos realizados con estos enzibióticos
sólo han conseguido, hasta ahora, resultados positivos en bacterias Gram-positivas
debido, probablemente, a que las Gram-negativas poseen una membrana externa

!
que dificulta el acceso de estas enzimas a su diana (Kropinski, 2006; Skurnik et al.,
2006). No obstante, se ha descrito recientemente un ejemplo en el que se ha com-
binado la lisina con un transportador de membrana externa para solventar el incon-
veniente del acceso al peptidoglicano (Lukacik et al., 2012). Teniendo en cuenta
todas estas características, es previsible que el estudio de los enzibióticos cobre
mayor interés cada día, ya que estos compuestos ofrecen grandes posibilidades en
la lucha contra las infecciones bacterianas, especialmente las provocadas por ce-
pas multirresistentes.

5. MODELOS ANIMALES

En el estudio de las enfermedades infecciosas y su tratamiento es imprescindible la

validación de los datos obtenidos in vitro mediante el uso de modelos animales de
experimentación. Gracias a estos modelos se han podido evaluar diferentes meca-
nismos implicados en patogénesis, determinando la eficacia de nuevos compuestos
antimicrobianos o caracterizando posibles candidatos a vacunas (Chiavolini et al.,
2008). En la actualidad existen diferentes modelos para analizar las diversas en-
fermedades causadas por las bacterias del género Streptococcus, desde los mode-
los más sencillos como los modelos de invertebrados Caenorhabditis elegans (Jan-
sen et al., 2002) o Galleria mellonella (Evans y Rozen, 2012), hasta el pez cebra
(Danio rerio) del que se han documentado recientemente numerosos estudios tanto
en el animal adulto como en embriones (Rounioja et al., 2012). No obstante, el mo-
delo de ratón ha sido tradicionalmente el más usado para el caso de estreptococos
(Chiavolini et al., 2008; Daniel et al., 2010; Ramos-Sevillano et al., 2011).
En este tipo de ensayos es importante hacer un estudio cuidadoso y exhaustivo
a la hora de elegir tanto el modelo animal como la cepa bacteriana sometida a es-
tudio, ya que existen diferentes factores que pueden afectar a los resultados. Las
cepas de S. pneumoniae más utilizadas en modelos animales son la cepa D39 de
serotipo 2 (Lanie et al., 2007) y la cepa TIGR4 de serotipo 4 (Tettelin et al., 2001).
Está documentado que la virulencia de neumococo, tanto en seres humanos como
en ratones, se ve afectada por el serotipo capsular. Así, se ha observado que los
serotipos asociados a resistencia antibiótica, como por ejemplo los 9V, 14, 19 y 23
(Briles et al., 1992), suelen ser mucho menos virulentos en modelos animales que
los habitualmente sensibles, como los neumococos de serotipos 2, 3, 4, 5 y 6 (Ben-
ton et al., 1997).

!
 Sin duda, uno de los modelos animales más prometedores en los últimos tiem-
pos es el pez cebra. Éste ha sido empleado como modelo experimental a lo largo
de los años por las grandes industrias farmacéuticas sobre todo en el screening de
nuevos medicamentos estudiando el efecto sobre embriones de quimiotecas y sus
posibles efectos derivados (Bowman et al., 2010). Además, este modelo está to-
mando especial relevancia en el estudio de patógenos humanos (van der Sar et al.,
2004), entre otras cosas, debido a que se ha descrito que los sistemas inmunitarios
de humanos y peces cebra son notablemente similares (Traver et al., 2003; Meeker
et al., 2008; Lieschke et al., 2009), empleándose en dichos estudios tanto animales
adultos como larvas o, incluso, embriones. El uso de estos últimos está adquiriendo
en los últimos años un importante papel en el estudio de enfermedades infecciosas
debido a diferentes factores: a) permanecen transparentes durante 7–8 días hasta
llegar a la etapa de larva; b) tras un día post-fertilización (dpf) los embriones pre-
sentan macrófagos funcionales que son capaces de responder a infecciones micro-
bianas (Herbomel et al., 1999); c) permite el seguimiento de la infección mediante
microscopía óptica (Herbomel et al., 1999) o de fluorescencia (Schaaf et al., 2009).
Estas ventajas han permitido emplear embriones de pez cebra no sólo en estudios
con S. pneumoniae (Rounioja et al., 2012) sino también con otras especies patóge-
nas como Streptococcus pyogenes (Lin et al., 2009), Staphylococcus aureus
(Prajsnar et al., 2008), Pseudomonas aeruginosa (Brannon et al., 2009), Listeria
monocitogenes (Levraud et al., 2009) o Haemophilus influenzae (Phennicie et al.,
2010).

!
 II. OBJETIVOS
!
S. pneumoniae es uno de los principales patógenos causantes de enfermedades
como la meningitis, neumonía y otitis, entre otras, siendo una de las principales
causas de morbilidad y mortalidad en niños y adultos en el mundo. Las infecciones
por neumococo se han venido tratando rutinariamente con antibióticos y, para su
prevención, se están administrando vacunas. Sin embargo, en las últimas décadas
y debido al abuso en el consumo de antibióticos se han diseminado cepas multirre-
sistentes que amenazan con inutilizar dichos antibióticos y desembocar en un serio
problema de salud pública. En este contexto, el desarrollo de tratamientos alternati-
vos capaces de prevenir y erradicar las infecciones neumocócicas se ha convertido
en una cuestión urgente.
La denominada terapia fágica se ha revitalizado después de muchas décadas de
casi total abandono y, hoy en día, se están utilizando los viriones enteros o algunos
de sus productos como método alternativo (o, en ocasiones, complementario) para
luchar contra las infecciones bacterianas en general. Las endolisinas son mureín-
hidrolasas codificadas por fagos que, cuando se añaden exógenamente, tienen un
efecto bactericida sobre el patógeno susceptible. En el sistema de neumococo, las
mureín-hidrolasas, tanto de la bacteria como de los fagos que la infectan, muestran
una gran especificidad por el sustrato porque todas ellas poseen un dominio de
unión a colina y sólo son activas en presencia de este aminoalcohol. Hay una sola
excepción en este conjunto de enzimas, la lisozima Cpl-7 que está codificada por el
fago lítico Cp-7. Esta enzima tiene sustituidas las repeticiones que constituyen el
dominio de unión a colina por otras tres repeticiones completamente distintas y
situadas en el dominio C-terminal de la proteína.
Las endolisinas fágicas de neumococo Cpl-1 (lisozima) y Pal (amidasa) han de-
mostrado su eficacia como agentes antibacterianos específicos frente a neumoco-
co. Sin embargo, no se habían estudiado hasta ahora las características enzimáti-
cas de Cpl-7.
Teniendo en cuenta lo expuesto anteriormente, los objetivos experimentales
planteados en la presente Tesis son los siguientes:

1. Caracterización y optimización de Cpl-7.

2. Determinación del efecto bactericida de Cpl-7 frente a diferentes pató-

genos para evaluar su rango de huésped.
 !

3. Construcción de nuevas enzimas quiméricas utilizando los diferentes

elementos estructurales de las lisozimas fágicas de neumococo.

4. Validación de los resultados utilizando modelos animales de infección.

!
 III. MATERIALES Y MÉTODOS
!
1. CEPAS BACTERIANAS, PLÁSMIDOS Y OLIGONUCLEÓTIDOS

Las cepas bacterianas, plásmidos y oligonucleótidos utilizados durante el desarrollo

de esta Tesis se detallan en las Tablas 1 a 4.

Tabla 1. Cepas bacterianas de S. pneumoniae

Cepa Descripción Referencia

R6 Cepa no capsulada Hoskins et al. (2001)!

D39a Serotipo 2 Lanie et al. (2007)!

D39_IUb Serotipo 2 Lanie et al. (2007)!

P007c M11 (Serotipo 3) Domenech et al. (2009)!

P008d M11 (Serotipo 4) Moscoso et al. (2006)!

Serotipo 19F
D48
[Pen CMI = 16 µg ml–1; Cdn CMI = 4 µg ml–1; Cro CMI = 8 µg ml–1] Soriano et al. (2008)!
Serotipo 19F
69 Soriano et al. (2008)!
[Pen CMI = 2 µg ml–1; Cdn CMI = 2 µg ml–1; Cro CMI = 4 µg ml–1]
Serotipo 6B
1515/97 Yuste et al. (2002)!
[Pen CMI = 2 µg ml–1; Cdn CMI = 1 µg ml–1; Cro CMI = 2 µg ml–1]
Serotipo 6B
541 Casal et al. (2002)!
[Pen CMI = 2 µg ml–1]
a
, Cepa NCTC 07466.
b
, Cepa IU 1680 (Lilly).
c
, Cepa M11, derivada de R6, transformada con DNA cromosómico del serotipo capsular 3.
d
, Construida como la cepa P007 pero con DNA del serotipo capsular 4.
Tabla 2. Otras cepas bacterianas

Bacteria! Cepa! ATCCa! Referencia/Origenb!

Bacillus anthracis! 45, dSterne strain pX02(−)! ! RU!

Bifidobacterium adolescentisT! ! 12 600! CECT!

Clostridium difficile! ! 43 255! RU!

Corynebacterium jeikeiumT! ! 43 734! DSMZ!

Enterococcus faecalisT! ! 19 433! CECT!

Lactococcus lactis subsp. lactisT! ! 9 936! CECT!

Mycobacterium smegmatis! mc2155! 19 420! Uhía et al. (2011); CIB!

Propionibacterium acnes ! AD21! ! Holmberg (2009); RU!

Staphylococcus aureusT ! ! 12 600! CECT!

Staphylococcus epidermidis! 414! ! RU!

Streptococcus agalactiaeT! ! 13 813! CECT!

Streptococcus dysgalactiae subsp.
! 9 542! CECT!
equisimilisT !
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ! ! 700 400! RU!

Streptococcus gordonii! ! 10 558! RU!

Streptococcus iniaeT! ! 29 178! CECT!

Bergström et al. (2003);
Streptococcus mitis! SK598 !
CIB
! SK137! ! CIB!
Denapaite et al. (2010);
! B6! !
CIB!
! ! 49 456! CIB!
a
, ATCC, American Type Culture Collection.
b
, CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; CIB, Centro de Investigaciones Biológicas; DSMZ, Deutsche Sam-
mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; RU, Lab. Prof. Fischetti, Rockefeller University, Nueva York.
T
, Cepa tipo.
Tabla 2. Otras cepas bacterianas (continuación)

Bacteria! Cepa! ATCCa! Referencia/Origenb!

Streptococcus mutans ! ! 25 175! RU!

Streptococcus porcinus! ! 12 391! RU!

Streptococcus pyogenesT! ! 12 344! CECT!

! MGAS5005! ! Sumby et al. (2005); RU!

Streptococcus rattus! BHT! ! RU!

Streptococcus sanguinis! ! 10 556! RU!

Streptococcus sobrinus! ! 6 715! RU!

Streptococcus suis! Serotipo 2! 43 765! RU!

Streptococcus uberis! ! 27 958! RU!

Acinetobacter baumanniic! ! 1 791! RU!

Escherichia colic ! DH10B! ! CIB!

! BL21(DE3)! ! Studier (1991); CIB!

! Tuner (DE3)! ! CIB!

! RB791! ! Brent y Ptashne (1981); CIB!

Klebsiella pneumoniaec! ! ! RU!

Pseudomonas putidac ! KT2442! ! Franklin et al. (1981); CIB!

a
, ATCC, American Type Culture Collection.
b
, CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; CIB, Centro de Investigaciones Biológicas; RU, Lab. Prof. Fischetti,
Rockefeller University, Nueva York.
c
, Bacterias Gram-negativas.
T
, Cepa tipo.
Tabla 3. Plásmidos

Nombre! Descripcióna! Referencia/Origen!

pT7-7! Vector de expresión, AmpR! Tabor (1990)!

pET-28a! Vector de expresión con tag de histidinas en posición N-terminal, KanaR! Novagen!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-1 derivado de pIN-III-A3,
pCIP100! Sanz y García, (1990)!
AmpR!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-7 derivado de pIN-III-A3, Diaz et al. (1991); Bustamante
pCP700!
AmpR! et al. (2010)!
pGL100! Plásmido recombinante que sobreexpresa lytA derivado de pIN-III-A3, AmpR! García et al. (1987a)!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-7S derivado de pT7-7, que
pHP200! Esta tesis!
contiene una mutación en el linker 608→614 (HindIII), AmpR!
Plásmido recombinante que sobreexpresa gfp-cwbm7S derivado de
pHP201! Esta tesis!
pET-28a, KanaR!
pHP771! Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-771 derivado de pT7-7, AmpR! Esta tesis!

pMSP11 Plásmido recombinante que sobreexpresa pal derivado de pIN-III-A3, AmpR! Sheehan et al. (1997)!
Plásmido recombinante que sobreexpresa gfp+lytB derivado de pT7-7,
pRGR25B de las Rivas et al. (2002)
AmpR
pTRD750! Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-7S derivado de pT7-7, AmpR! Esta tesis!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-117S derivado de pT7-7,
pTRD760! Esta tesis!
AmpR!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-177S derivado de pT7-7,
pTRD761! Esta tesis!
AmpR!
pTRD762! Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-711 derivado de pT7-7, AmpR! Esta tesis!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cwbm7S-cpl-711 derivado de
pTRD764! Esta tesis!
pT7-7, AmpR!
Plásmido recombinante que sobreexpresa cpl-7S-lasA derivado de pT7-7,
pTRD765! Esta tesis!
AmpR!
a R R
, Amp , ampiciliina-resistente; Kana , kanamicina-resistente.
Tabla 4. Oligonucleótidos

Nombre! Secuencia (5’→3’)a,b! Localización!

(A)!A_Fw_GFP_cw7! TTAGAATTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC! 5’ de gfp

(B)!A_Rv_GFP_cw7! TTCGTCGTCTTTGTATAGTTCATCCATGC! 3’ de gfp

(C) B_Fw_GFP_cw7! CTATACAAAGACGACGAAAAAGAAGAC! 5’ de cpl-7

(D)!B_Rv_GFP_cw7! TATAGTCGACAGTTTTTATGAAAGTAATTCATTCAC! 3’ de cpl-7

(E) ClaI_Cpl7slH! ATTATCGATGGCTGCAGTTTTTATGAAAGTAATTCATT! 5’de cpl-7

(F)!Cpl7slH_Rv! AAACACCCTGAAAAGCTTAACGACCGTTG! 3’ de cpl-7

(G)!Cpl7slH_fw! CAACGGTCGTTAAGCTTTTCAGGGTGTTT! 5’ de cpl-7

(H)!pt7.7_Cpl7s_Rv! GGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAG! 3’ de cpl-7

(I)!HindIII_Cpl1CWBD_fw! TATAAAGCTTAGCTGGAACGTGGAAACAAG! 5’ de cpl-1

(J)!ClaI_Cpl1CWBD_Rv! TTATATCGATTTATGCTACGGTTATAAGCCC! 3’ de cpl-1

a
, Subrayados los sitios de restricción.
b
, En negrita se señalan las zonas de identidad con los genes correspondientes.

2. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en este trabajo se esterilizaron

por calor húmedo en autoclave a 120°C y 1 atmósfera de presión, o mediante filtra-
ción utilizando filtros estériles Millipore de 0.2 µm de diámetro.
Los antibióticos se prepararon en soluciones concentradas en agua, excepto el
cloranfenicol que se disolvió en etanol 100%. Estas soluciones se esterilizaron por
filtración y se almacenaron a −20°C.
Para su conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de
cultivo correspondiente con glicerol al 10% (v/v) y se mantuvieron a −80°C. En el
instante de sembrarlos, los cultivos bacterianos se descongelaron y se incubaron a
37°C ó 30°C en los medios correspondientes, con agitación cuando se trataba de
cepas de A. baumannii, E. coli, K. pneumoniae, P. putida, S. aureus o S. epidermi-
dis; o sin agitación para el resto de bacterias empleadas en esta Tesis.
Las cepas de S. pneumoniae se multiplicaron en medio C ajustado a pH 8.0 (La-
cks y Hotchkiss, 1960) suplementado (C+Y) o no con extracto de levadura (Difco)
(0.08%) o en placas de agar de soja tripticaseína o agar D suplementado con 5%
de sangre desfibrinada de carnero (Oxoid). El crecimiento de los cultivos se siguió
por turbidimetría a 550 nm (DO550) con un espectrofotómetro Thermo Scientific He-
lios Epsilon.
Las cepas de E. coli se cultivaron a 37°C en medio LB (Sambrook et al., 1989)
con una agitación de 250 rpm, añadiendo agar al 1.5% (p/v) para cultivos en medio
sólido. La concentración de antibiótico añadida al medio LB para el cultivo de cepas
−1 −1
resistentes fue de 100 µg ml para ampicilina (Amp), 5 µg ml para tetraciclina
−1
(Tet) ó 5 µg ml para kanamicina (Kana). El crecimiento de los cultivos se siguió
por turbidimetría a 600 nm (DO600) con un espectrofotómetro Thermo Scientific He-
lios Epsilon. La morfología celular se analizó con un microscopio de contraste de
fases Leica (DFC360-FX) y se examinó con el software de Leica AF6000-DFC.
Para el resto de cepas bacterianas utilizadas en esta Tesis se emplearon los
medios específicos detallados en la Tabla 5.

Tabla 5. Medios de cultivo para distintas cepas

Nombre Cepasa Referencia

Enterococcus
BHI (Brain Heart Infusion) Staphylococcus Sutton (2003)
Streptococcus

Bifidobacterium sp. Medium Bifidobacterium Payne (1999)

LB (Luria-Bertani) Pseudomonas Sambrook et al. (1989)

M17 Lactococcus Terzaghi y Sandine (1975)

RCM (Reinforced Clostridial Medium) Clostridium Hirsch y Grinstead (1954)

Bacillus
Corynebacterium
TSB (Tryptic Soy Broth) Klebsiella MacFaddin (1985)
Propionibacterium
Streptococcus
a
, Se indican los géneros de las bacterias utilizadas.

Los medios de cultivo fueron suministrados por las casas comerciales Difco,
Oxoid, Pronadisa, Sigma-Aldrich, Merck y Becton Dickinson. La agarosa fue sumi-
nistrada por Pronadisa. La solución de 40% acrilamida:bisacrilamida (37.5:1) se
compró a Bio-Rad. La catalasa fue de Boehringer Mannheim y la proteinasa K de
3
Roche. El cloruro de [metil- H] colina fue suministrado por Perkin-Elmer NEN (New
England Nuclear). La RNasa, DNasa y todos los antibióticos (Amp, Tet, Kana) fue-
ron suministrados por Sigma-Aldrich.
Los fluorocromos y anticuerpos utilizados se detallan en la Tabla 6.

Tabla 6. Fluorocromos y anticuerpos utilizados en esta Tesis

Compuesto Descripción a Excitación/ Emisión (nm) Fabricanteb

Anticuerpo primario Anticuerpo policlonal frente a serotipo 2 (conejo) SSI

Anticuerpo secundario-A Anti-conejo: Alexa 568 (burro) 578/603 I-M

Viables 480/500
BacLight SYTO 9/yoduro de propidio I-M
No viables 490/635
Suero normal de caballo Kit Vectastain Elite Pk-6200 Universal VL

a
, El origen de los anticuerpos se indica entre paréntesis.
b
, SSI, Staten Serum Institute; I-M, Invitrogen. Molecular Probes; VL, Vector Laboratories.

3. TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE ESCHERICHIA COLI

Las células de E. coli se transformaron utilizando dos procedimientos distintos: cho-

que térmico y electroporación. La transformación por choque térmico requiere la
preparación previa de células competentes con RbCl (Hanahan, 1983; Sambrook y
Rusell, 2001). La transformación por electroporación (Wirth et al., 1989) se llevó a
cabo en un equipo Gene Pulser/Pulse Controller (Bio-Rad), según las recomenda-
ciones del fabricante.

4. TÉCNICAS DE DNA

Las técnicas empleadas en la manipulación del DNA en este trabajo fueron esen-
cialmente las que se describen en Sambrook y Russell (2001).

4.1. Aislamiento de DNA plasmídico

Para la extracción de plásmidos de E. coli, se inoculó la cepa correspondiente en 5

ml de medio LB (con el antibiótico requerido) y se incubó a 37°C en agitación duran-
te 12–16 h hasta que alcanzó una DO600 de 1.5–5. Las etapas posteriores se hicie-
ron con el protocolo del QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). En ocasiones, el
plásmido se purificó en mayores cantidades mediante centrifugación isopícnica en
gradientes de CsCl-bromuro de etidio (Sambrook et al., 1989).
 4.2. Aislamiento de DNA cromosómico

El DNA cromosómico de S. pneumoniae se preparó utilizando un procedimiento

descrito previamente con pequeñas modificaciones (Fenoll et al., 1994). Para ello,
las células crecidas en medio C ajustado a pH 8.0 a DO550 de 0.6–0.7 (10 ml), se
sedimentaron por centrifugación a 10 000 rpm, utilizando un rotor SS-34 durante 10
min a 4°C. Posteriormente, el cultivo se resuspendió en 0.4 ml de tampón de lisis
(Tris-HCl 50 mM, pH 8.0; EDTA 30 mM, Sarkosyl 0.4% y Tritón X-100 0.1%) (Mo-
rrison, 1978), y se incubó a 37°C hasta la lisis del cultivo. A continuación, se añadió
−1
RNasa (100 µg ml ) y se incubó durante 1 h a 37°C. Después, se añadió proteina-
−1
sa K (100–200 µg ml ) prolongando la incubación a 37°C durante 1 h más. Las pro-
teínas restantes se eliminaron mediante un tratamiento con fenol:cloroformo:alcohol
isoamílico (25:24:1) y se centrifugó a 12 000 × g durante 5 min para separar la fase
acuosa de la orgánica e interfase (proteínas y contaminantes). Para precipitar el
DNA, se pasó la fase acuosa a un tubo limpio y se añadieron 0.1 volúmenes de 3 M
acetato potásico, pH 4.8 y 2 volúmenes de etanol absoluto. La mezcla se mantuvo
durante 20 min a −20°C y se sedimentó por centrifugación a 12 000 × g durante 20
min a 4°C. Para eliminar las sales que podrían haber coprecipitado con el DNA, se
realizó un lavado con 1 ml de etanol al 70% y se centrifugó de nuevo a 4°C, 10 min.
El DNA sedimentado se dejó secar al aire para la eliminación completa del etanol
de la muestra y se resuspendió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8.0; EDTA 1
mM).

4.3. Aislamiento de DNA fágico

El DNA de Cp-7 se obtuvo por extracción fenólica (v/v) después del tratamiento del
−1
fago con proteinasa K (50 µg ml ) en un tampón Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 10
mM, NaCl 10 mM y SDS 0.5% a 37°C durante 4 h. Este tratamiento evita que el
complejo DNA-proteína que se aísla del virión quede retenido en la interfase (López
et al., 1984). Después del tratamiento con fenol, el DNA se precipitó y se disolvió en
TE.
 4.4. Electroforesis de DNA en geles de agarosa

Se utilizaron geles de agarosa al 0.7 ó 1.5% en tampón TAE (Tris-HCl 40 mM, ácido
acético 20 mM, EDTA 2 mM, pH 8.1). A las muestras se les añadió 1/4 de su volu-
men de una solución compuesta por Ficoll 400 30% (p/v), azul de bromofenol 0.2%
(p/v), xilencianol 0.2% (p/v) y EDTA 40 mM (pH 8.0). La electroforesis se llevó a ca-
bo a 100–150 V durante 60–90 min y, una vez finalizada, los geles se tiñeron con
GelRed durante 20 min (Biotium) y los fragmentos de DNA se visualizaron con ra-
diación ultravioleta. Como marcadores de tamaño molecular se utilizó el marcador
de 1 kb en escalera de Biotools.

4.5. Amplificaciones de DNA por PCR

Para llevar a cabo la amplificación de fragmentos de DNA se empleó un equipo

TM
T100 Thermal Cycler (BioRad) y se usaron las enzimas DNA polimerasa Taq o
Pfu de acuerdo con las instrucciones del proveedor, ambas proporcionadas por Ta-
kara. Las mezclas de reacción contenían MgCl2 1.5 mM, oligonucleótidos 0.5 µM y
dNTPs 0.25 mM. Los productos amplificados se purificaron con el sistema High Pu-
TM
re PCR Product Purification Kit (Roche).

4.6. Secuenciación de DNA

La secuenciación de DNA se llevó a cabo utilizando un secuenciador automático

TM
modelo ABI Prism 3700 (Applied Biosystems), en el servicio de secuenciación
(Secugen) del Centro de Investigaciones Biológicas, a excepción del DNA de Cp-7
cuyo genoma se obtuvo con un secuenciador 454 de la casa Roche en la empresa
LifeSequencing (Valencia).
Para la reacción de secuenciación se utilizó el Dye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), y la DNA polimerasa AmpliTaq FS, si-
guiendo las recomendaciones de los proveedores. Las reacciones se llevaron a ca-
bo mediante la técnica de PCR con un termociclador Gene Amp PCR System 2400
(Perkin-Elmer).
 4.7. Construcción de genes sintéticos

Para la construcción de los genes sintéticos cpl-7S, cpl-711, cpl-117S, cpl-177S,

cwbm7S-cpl711 y cpl-7S-lasA se diseñaron las secuencias nucleotídicas para su
óptima expresión en E. coli mediante el empleo del software de libre acceso Optimi-
zer (Universitat Rovira i Virgili, URV). La síntesis se llevó a cabo en la empresa
ATG: Biosynthetics GmbH (Merzhausen, Alemania) y los genes sintéticos suminis-
trados estaban clonados en un plásmido recombinante derivado de un pUC. Estos
plásmidos se digirieron con las enzimas específicas NdeI y PstI, de acuerdo con las
instrucciones del proveedor. Los fragmentos de DNA obtenidos se purificaron me-
diante el producto QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
A continuación, se realizó la ligación de los fragmentos digeridos con el plásmido
pT7-7, previamente cortado con las mismas enzimas, usando la DNA ligasa del fa-
go T4 durante toda la noche a 16°C. Con la mezcla de ligación se transformaron cé-
lulas competentes de E. coli BL21(DE3) y se analizaron por tamaño y secuencia los
clones que contenían los plásmidos recombinantes adecuados.
La construcción del gen gfp-cwbm7S se llevó a cabo mediante la fusión de dos
fragmentos de DNA codificantes del CWBM de Cpl-7S y de GFP (Green Fluores-
cent Protein). Para ello, se empleó el método de extensión de cebadores solapan-
tes, dos de los cuales son complementarios en una parte de sus secuencias (Tabla
4) (Higuchi et al., 1988; Ho et al., 1989).
En primer lugar, se realizaron dos reacciones de PCR paralelas, una utilizando
los oligonucleótidos A y B que amplificaban el fragmento correspondiente al gen gfp
del plásmido pRGR25B y otra utilizando los oligonucleótidos C y D que amplificaban
el fragmento correspondiente al CWBM del gen cpl-7S del plásmido pTRD750. De
esta forma se generaron dos fragmentos de DNA que tenían una secuencia común
en un extremo. Estos dos fragmentos sirvieron de molde en una tercera reacción de
PCR, de modo que con los oligonucleótidos A y D que incorporan sitios EcoRI y Sa-
lI respectivamente en los extremos, se obtuvo un fragmento suma correspondiente
al gen gfp-cwbm7S (Fig. 8).
 EcoRI
A C
NdeI
gfp
NdeI! cpl-7S
PstI!

B lytB D
pRGR25B pTRD750

PstI!

PCR1 PCR2

PCR3
(Extensión solapante)

EcoRI SalI!
gfp-cwbm7S

Secuencia complementaria

Fig. 8. Esquema del método de extensión de fragmentos solapantes para la construc-

ción del gen gfp-cwbm7S. Los oligonucleótidos A, B, C y D se indican en la Tabla 4. Ca-
da reacción de PCR se nombra como PCR1, PCR2 y PCR3, para indicar que son reac-
ciones separadas. Los detalles de la construcción se indican en el texto. Por simplificar
sólo se muestran algunas de las dianas de restricción de los plásmidos pRGR25B y
pTRD750.

Las condiciones que se emplearon para realizar la PCR1 y PCR2 fueron: un ci-
clo a 94°C durante 4 min, seguido de 30 ciclos a 94°C, 30 s; 51°C, 30 s y 72°C, 4
min; y una etapa de terminación a 72°C durante 5 min. Para la PCR3, se realizaron
5 ciclos de desnaturalización y amplificación (94°C, 1min; 51°C, 30 s y 72°C, 4 min)
utilizando los dos productos anteriores, amplicones de las PCR1 y PCR2, como
molde para después realizar 30 ciclos con los oligonucleótidos A y D (94°C, 30 s;
57°C, 30 s; 72°C, 4 min).
Una vez obtenidos los fragmentos de DNA, se purificaron mediante High Pu-
reTM PCR Product Purification Kit (Roche) y el amplicón final, así como el plásmido
pET-28a, se digirieron con las enzimas EcoRI y SalI. Los fragmentos de DNA obte-
nidos se purificaron mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). A continuación,
se realizó la ligación de los fragmentos digeridos usando la DNA ligasa del fago T4
durante toda la noche a 16°C. Con la mezcla de ligación se transformaron células
competentes de E. coli BL21(DE3), obteniéndose así los clones que contenían el
plásmido recombinante pHP201.
Para la construcción del gen cpl-771 se empleó el mismo método explicado an-
teriormente mediante la fusión de dos fragmentos de DNA codificantes del módulo
catalítico y linker de Cpl-7 y del CBD de Cpl-1. Inicialmente se diseñaron 4 oligonu-
cleótidos, dos de los cuales contienen la mutación que se desea introducir y son
complementarios en una parte de sus secuencias (Tabla 4).
En primer lugar, se realizaron dos reacciones de PCR paralelas, una utilizando
los oligonucleótidos E y F (el último lleva la mutación) con el plásmido pTRD750
como molde, y otra utilizando los oligonucleótidos G y H (donde G contiene la mu-
tación y es parcialmente complementario a F) con el mismo plásmido. De esta for-
ma se generaron dos fragmentos de DNA que tenían una secuencia común en un
extremo y contenían la mutación deseada. Estos dos fragmentos sirvieron simultá-
neamente de molde en una tercera reacción de PCR, de modo que empleándose
los oligonucleótidos E (que incorpora un sitio ClaI) y H, se obtuvo un fragmento su-
ma correspondiente al gen cpl-7S que contenía la mutación deseada, un sitio Hin-
dIII en la posición 608→614 (Fig. 9).
 E G

F H
PCR1 PCR2

PCR3
(Extensión solapante)

ClaI cpl-7S NdeI!

HindIII

Fig. 9. Esquema del método de extensión de fragmentos solapantes para la construc-

ción del gen cpl-771. Los oligonucleótidos E, F, G y H se indican en la Tabla 4. Cada
reacción de PCR se nombra como PCR1, PCR2 y PCR3, para indicar que son reaccio-
nes separadas.

Las condiciones empleadas para realizar las PCR1 y PCR2 fueron: un ciclo a
94°C durante 4 min, seguido de 25 ciclos a 94°C, 30 s; 65°C, 30 s y 72°C, 2 min; fi-
nalmente una etapa de terminación a 72°C durante 5 min. Para la PCR3, se realiza-
ron 5 ciclos de desnaturalización y amplificación (94°C, 1 min; 60°C, 30 s y 72°C , 4
min) utilizando los dos productos anteriores, amplicones de las PCR1 y PCR2, co-
mo molde para después realizar 25 ciclos con los oligonucleótidos E y H (94°C, 30
s; 65°C, 30 s; 72°C, 4 min).
TM
Una vez obtenidos los fragmentos de DNA, se purificaron mediante High Pure
PCR Product Purification Kit (Roche) y el amplicón final, así como el plásmido pT7-
7, se digirieron con las enzimas NdeI y ClaI. Los fragmentos de DNA obtenidos se
purificaron mediante QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Posteriormente, se reali-
zó la ligación de los fragmentos y el plásmido pT7-7 digeridos, usando la DNA liga-
sa del fago T4 durante toda la noche a 16°C. Con la mezcla de ligación se trans-
formaron células competentes de E. coli BL21(DE3), obteniéndose así los clones
que contenían el plásmido recombinante pHP200.
A continuación, se realizó una nueva reacción de PCR, utilizando los oligonu-
cleótidos I y J que amplificaban el fragmento correspondiente al CBD del gen cpl-1
del plásmido pCIP100. De esta forma se generó un fragmento que incorpora sitios
ClaI y HindIII en los extremos. Las condiciones que se emplearon para realizar la
reacción de PCR fue: un ciclo a 94°C durante 4 min, seguido de 25 ciclos a 94°C,
30 s; 65°C, 30 s y 72°C, 2 min; finalmente una etapa de terminación a 72°C durante
TM
5 min. Una vez obtenido el fragmento de DNA, se purificaron mediante High Pure
PCR Product Purification Kit (Roche) y el amplicón final, así como el plásmido
pHP200, que contiene el gen cpl-7S, se digirieron con las enzimas ClaI y HindIII.
Los fragmentos de DNA obtenidos se purificaron mediante QIAquick Gel Extraction
Kit (Qiagen). Posteriormente, se realizó la ligación de los fragmentos y el plásmido
pHP200 digeridos, usando la DNA ligasa del fago T4 durante toda la noche a 16°C.
Con la mezcla de ligación se transformaron células competentes de E. coli
BL21(DE3), obteniéndose así los clones que contenían el plásmido recombinante
pHP771 (Fig. 10).
 NdeI
BamHI

cpl-1
HindIII!
I

cpl-7S
pCIP100 pHP200
J
ClaI!
BamHI!

PCR
HindIII ClaI

ClaI / HindIII
+
Ligación

NdeI

HindIII!

cpl-771
pHP771

ClaI!

Fig. 10. Esquema de construcción del gen cpl-771. Los oligonucleótidos I y J se indican
en la Tabla 4. Los detalles de la construcción se indican en el texto. Por simplificar sólo
se muestran algunas de las dianas de restricción de los plásmidos pCIP100 y pHP200.

5. ANÁLISIS BIOINFORMÁTICOS

Para el análisis de las secuencias de DNA se utilizó el paquete de programas de

DNAStar (DNAStar Inc.) y los programas y bases de datos disponibles en las si-
guientes direcciones de Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.ebi.ac.uk/
y http://www.jcvi.org/cms/home/.
El análisis de los marcos abiertos de lectura (orf; open reading frame) de los ge-
nomas fágicos se realizó utilizando los programas ORF Finder
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) y GeneMark
(http://opal.biology.gatech.edu/).
 Las potenciales Orfs se determinaron mediante las bases de datos BlastP
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) y HMMER (http://hmmer.janelia.org/). La lo-
calización de los promotores y terminadores se efectuó mediante las aplicaciones
FindTerm y BProm de Softberry (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) y RNAfold
de la Universidad de Viena (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi). Asimis-
mo, se utilizaron las aplicaciones de Glimmer
(http://ccb.jhu.edu/software/glimmer/index.shtml) para la detección de los RBS y la
dirección de Internet WebLogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi) para la crea-
ción de la secuencia consenso de los promotores. Para la búsqueda y comparación
de los diferentes módulos presentes en las proteínas se determinaron mediante la
base de datos Pfam (http://pfam.xfam.org/).

6. TÉCNICAS DE PROTEÍNAS

6.1. Producción y purificación de proteínas

Para la purificación de la lisozima Cpl-7 se siguió el protocolo previamente descrito

(Bustamante et al., 2010). Brevemente, un cultivo de E. coli RB791 conteniendo el
plásmido pCP700, derivado del pIN-III-A3 (Inouye e Inouye, 1985), se incubó en
−1
medio LB con Amp (100 µg ml ) en agitación a 37°C hasta alcanzar una DO600 ≈
0.6. En ese momento se añadió 2% de lactosa, concentración final, para inducir el
cultivo y la incubación se siguió toda la noche a 30°C. Posteriormente, el cultivo se
dejó en hielo durante 15 min, las células se recogieron por sedimentación a 15 000
× g durante 20 min a 4°C y se lavaron, repitiendo la centrifugación, con tampón fos-
fato sódico 20 mM, pH 6.0. La lisis celular se realizó pasando la suspensión por una
prensa de French a una presión de 8.3 MPa y se descartaron los restos celulares
con una centrifugación a 13 000 × g durante 20 min a 4°C. Los restos de DNA del
sobrenadante se precipitaron añadiendo sulfato de estreptomicina (0.6 mg/mg pro-
teína total). Tras incubar la mezcla durante 20 min a 4°C con agitación suave, se
separó el precipitado por centrifugación a 13 000 × g durante 20 min a 4°C. La frac-
ción soluble obtenida se mantuvo en hielo y se sometió a un fraccionamiento por
precipitación de proteínas mediante la adición, en frío y con agitación suave, de una
solución saturada de sulfato amónico preparada en tampón fosfato sódico 20 mM a
pH 7.0. Las proteínas precipitadas entre el 20 y el 35% (p/v) de saturación se diali-
zaron y se separaron en una cromatografía de intercambio iónico, en una columna
de DEAE-celulosa previamente equilibrada con tampón sódico 20 mM a pH 6.0. A
continuación, se pasaron concentraciones crecientes de NaCl de 0.3 a 0.5 M y Cpl-
7 eluyó a una concentración de NaCl de 0.46 M.
Para la purificación de la lisozima Cpl-7S (una variante sintética de Cpl-7) se si-
guió un protocolo muy parecido al anterior. Para ello, la cepa de E. coli BL21(DE3)
conteniendo el plásmido pTRD750 (Tabla 3), se incubó en medio LB con Amp (100
−1
µg ml ) en agitación a 37°C hasta alcanzar una DO600 ≈ 0.6. En este punto se reali-
zó la inducción de la expresión del gen cpl-7S mediante la adición de IPTG 0.1 mM
y el cultivo inducido se incubó durante toda la noche a 30°C. Posteriormente, Cpl-
7S se purificó siguiendo un protocolo similar a Cpl-7, salvo que la elución de la
misma, en una columna de DEAE-celulosa, se produjo a una concentración de
NaCl de 0.3 M.
Para la purificación de las enzimas que son CBPs (LytA, Pal, Cpl-1, Cpl-711,
Cpl-771 y CWBM7S-Cpl711) se siguió la misma metodología descrita anteriormente
para este tipo de proteínas, basada en la purificación en un solo paso mediante una
columna de DEAE-celulosa, que se comporta como cromatografía de afinidad
(Sanz y García, 1990). Para la purificación de las quimeras Cpl-117S, Cpl-177S y
Cpl7S-LasA, se siguió el mismo protocolo descrito para la purificación de Cpl-7
(Bustamante et al., 2010).
En el caso de la proteína de fusión GFP-CWBM7S, se partió de un cultivo de E.
coli BL21(DE3) conteniendo el plásmido pHP201, derivado del pET-28a, incubado
−1
en medio LB con Kana (50 µg ml ) en agitación a 37°C hasta alcanzar una DO600 ≈
0.6. En este punto se realizó la inducción de la expresión del gen gfp-cwbm7S me-
diante la adición de IPTG 0.1 mM y se incubó durante toda la noche a 30°C. Poste-
riormente, el cultivo se dejó en hielo durante 15 min y las células se recogieron por
sedimentación a 15 000 × g durante 20 min a 4°C, se lavaron con tampón Tris-HCl
20 mM pH 6.0, KCl 250 mM, glicerol 10%, imidazol 20 mM. La lisis celular se realizó
pasando la suspensión por una prensa de French a una presión de 8.3 MPa y se
descartaron los restos celulares con una centrifugación a 13 000 × g durante 20 min
a 4°C. Los restos de DNA del sobrenadante se precipitaron añadiendo sulfato de
estreptomicina (0.6 mg/mg proteína total). Tras incubar la mezcla durante 20 min a
4°C con agitación suave, se separó el precipitado por centrifugación a 13 000 × g
durante 20 min a 4°C. El clarificado obtenido se cargó en una columna de afinidad
HisTrap HP 5 ml Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare) previamente
equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM pH 6.0, KCl 250 mM, glicerol 10%, imidazol
20 mM. Se pasaron concentraciones crecientes de imidazol y la proteína GFP-
CWBM7S eluyó pura a una concentración de imidazol de 250 mM. Esta columna se
acopló a un equipo ÄKTA (GE Healthcare).

6.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

Las electroforesis de proteínas se realizaron en todos los casos en condiciones

desnaturalizantes en presencia de SDS (Laemmli, 1970). Se utilizaron geles de po-
liacrilamida en placa (100 × 75 × 1 mm) a una concentración de 10, 12.5 ó 15%,
según los experimentos. Las muestras se hirvieron durante 10 min en presencia del
tampón de ruptura (Tris-HCl 62.5 mM, pH 6.8; SDS 2%, β-mercaptoetanol 5%, gli-
cerol 10% y azul de bromofenol 0.005%). Las electroforesis se realizaron a tempe-
ratura ambiente y a 100 V (voltaje constante), utilizando un tampón que contenía
Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0.1%. Las proteínas se tiñeron con azul bri-
llante de Coomassie R-250 (Swank y Munkres, 1971) y se destiñeron con una solu-
ción de metanol 30% y ácido acético 7.5%. Las proteínas empleadas como marca-
dores de masa molecular (miosina 200 kDa; β-galactosidasa 116 kDa; fosforilasa B
97.4 kDa; BSA 66.2 kDa; ovoalbúmina 45 kDa; anhidrasa carbónica 31 kDa; inhibi-
dor de tripsina 21.5 kDa) fueron de BioRad.

7. ENSAYOS DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA IN VITRO CON PAREDES PURIFICADAS

Para el aislamiento y purificación de paredes celulares radiactivas de S. pneumo-

niae, se siguió un método descrito previamente (García-Bustos y Tomasz, 1987).
Se partió de dos litros de cultivo de la cepa R6 en medio CpH8 en presencia de clo-
3
ruro de [metil- H] colina (2.22-3.14 TBq/mmol; Perkin-Elmer NEN) (Mosser y To-
masz, 1970) y se incubó hasta que el cultivo alcanzó una densidad celular aproxi-
8 −1
mada de 4 × 10 unidades formadoras de colonias (UFC ml ). Seguidamente, se
enfrió el cultivo en un baño de agua-hielo durante 10 min y se centrifugó a 12 000 ×
g durante 10 min. El sedimento se resuspendió en 25 ml de agua destilada fría y se
inactivaron las autolisinas calentando la suspensión a 70°C durante 15 min. Poste-
riormente, se centrifugaron las células a 12 000 × g durante 10 min a 4°C. El sedi-
mento se resuspendió en 10 ml de agua fría y se procedió a la rotura de las células
por medio de bolitas de vidrio con un diámetro de 150–212 µm (Sigma-Aldrich),
dando diez pulsos con el vórtex (1 min/pulso). Para eliminar las bolitas y restos de
bacterias, la suspensión se centrifugó a 4°C a 1 100 × g durante 5 min, tomándose
cuidadosamente el sobrenadante. Posteriormente, se hizo una nueva centrifugación
a 4°C a 27 000 × g durante 10 min eliminándose el sobrenadante. A partir de aquí
todas las centrifugaciones se realizaron en estas condiciones para asegurar la pre-
cipitación de las paredes. El sedimento anterior se resuspendió en 10 ml de aceto-
na y se volvió a centrifugar. El sedimento se lavó con agua destilada y se resus-
−1
pendió en 15 ml de solución salina conteniendo DNasa (50 µg ml ), RNasa (50 µg
−1
ml ) y 40 µl de MgCl2 0.5 M. Se incubó la suspensión a 37°C durante 30 min y se
volvió a centrifugar. El sedimento se resuspendió en 10 ml de solución salina con-
teniendo 8 mg de tripsina, 20 µl de CaCl2 1 M y 100 µl de tolueno. Se incubó la sus-
pensión a 37°C durante 12–16 h, se centrifugó y el sedimento se lavó cinco veces
con solución salina. Finalmente, las paredes celulares purificadas se resuspendie-
ron en un volumen final de tampón SPSH (tampón fosfato sódico 25 mM, pH 8.0; β-
mercaptoetanol 20 mM y NaCl 0.15 M) ajustándose la radiactividad a 700 000 cuen-
−1
tas por minuto (cpm) ml aproximadamente.
Los ensayos in vitro de las enzimas purificadas (Cpl-1, Cpl-7, Cpl-7S, Cpl-711,
Cpl-771, CWBM7S-Cpl-711, Cpl-117S, Cpl-177S, Cpl-7S-LasA, Pal y LytA) para va-
lorar sus actividades específicas se hicieron sobre paredes de neumococo, según la
técnica previamente descrita (Höltje y Tomasz, 1976). La mezcla de reacción con-
3
tenía 10 µl de paredes de neumococo marcadas radiactivamente con [metil- H] co-
lina y de 5 a 50 µl de la dilución adecuada de la enzima purificada ajustando a un
volumen final de 250 µl con tampón fosfato sódico 20 mM a pH óptimo para cada
enzima. La mezcla se incubó a 37°C durante 15 min y se paró la reacción con la
adición de 10 µl de formaldehído 35% y 10 µl BSA 4%. Posteriormente, la muestra
se centrifugó a 12 000 × g durante 15 min y se tomaron 200 µl del sobrenadante, a
los que se añadió líquido de centelleo para determinar la radiactividad liberada en
un contador Wallac 1450 MicroBeta TriLux (Perkin-Elmer). Una unidad (U) de acti-
vidad enzimática se define como la cantidad de enzima que cataliza la hidrólisis de
1 µg de paredes (≈ 715 cpm netas) en 15 min a temperatura óptima de la enzima.
8. ENSAYOS DE CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA

Los experimentos para estudiar las condiciones óptimas de actividad enzimática de

Cpl-7S y Cpl-711 se realizaron mediante el ensayo bacteriolítico explicado en el
apartado 10. Para ello, se utilizó la cepa no capsulada de S. pneumoniae R6 y con
−1
unas concentraciones de proteínas de 5 µg ml . Los tubos con la suspensión de
células contenían PBS modificado para estudiar distintos parámetros: a) pH (4.5–
2+ 2+
8.0); b) NaCl (0–500 mM); c) Ca y Mg (0–20 mM); d) detergentes (0–1%); y e)
EDTA (0–100 mM). Las muestras también se ensayaron a diferentes temperaturas:
4°C, ≈ 25°C o 37°C.
Algunos ensayos de caracterización se llevaron a cabo en colaboración con el
grupo de la Dra. Margarita Menéndez del Instituto de Química-Física Rocasolano
(IQFR-CSIC) de Madrid.
Los experimentos de velocidad de sedimentación con Cpl-7S se realizaron en
una centrífuga analítica Optima-XLA (Beckman Coulter) a 20°C, aplicando una ve-
locidad angular de 45 000 rpm. Las medidas se realizaron utilizando células de do-
ble sector con cuerpos centrales de dos agujeros y a una concentración de proteína
−1
de 0.3 mg ml (400 µl). Los coeficientes de sedimentación se calcularon a partir del
ajuste de los perfiles de sedimentación con el programa SEDFIT (Schuck y Ross-
manith, 2000). Los datos experimentales se corrigieron al valor en agua a 20°C
!
( !!",! !)! con el programa SEDNTERP (Laue et al., 1992), utilizado también para cal-
cular el radio de Stockes (RS) de la partícula. "
Las muestras de Cpl-7S utilizadas en los estudios de dicroísmo circular se diali-
zaron previamente durante 24 h frente al tampón fosfato 20 mM pH 7.0 de medida
(5 x 500 ml). Los espectros se registraron en un espectropolarímetro JASCO J-810
(Jasco Corporation) equipado con un sistema Peltier de control de temperatura, uti-
lizando un tiempo de respuesta de 4 s, una velocidad de barrido de 20 nm/minuto y
recogiendo datos cada 0.2 nm. Para las medidas tanto de UV-lejano como UV-
cercano se utilizaron concentraciones de proteína comprendidas entre 0.2 y 0.8 mg
−1
ml y cubetas de cuarzo de 0.1 y 0.02 cm de paso óptico. Todos los espectros se
registraron, al menos, por triplicado y para cada uno de ellos se recogieron cuatro
acumulaciones con el fin de obtener una buena relación señal/ruido. La recogida de
los datos experimentales y el análisis de los mismos se realizaron con el programa
Spectra Manager. El espectro del tampón de medida fue sustraído del espectro de
la proteína y los datos experimentales corregidos se transformaron en elipticidades
molares por residuo teniendo en cuenta que el peso molecular promedio por resi-
duo es 112.76 Da (Cpl-7S).
La homogeneidad de las muestras purificadas de Cpl-7S se analizó mediante
espectrometría de masas (MALDI-TOF) en el servicio de espectrometría de masas
del Instituto de Química-Física Rocasolano. Los experimentos se llevaron a cabo en
un espectrómetro de masas Voyager DEPRO (Applied Biosystems) equipado con
un láser de nitrógeno (λ = 337 nm, anchura de pulso = 10 ns y ν = 3 Hz) y una fuen-
te iónica con extracción retardada. Los iones positivos generados por la deserción
láser fueron introducidos en el tubo de vuelo (1.3 m de longitud) con un voltaje de
aceleración de 25 kV, trabajándose en modo lineal. Todos los espectros de masas
se obtuvieron recogiendo una media de 500 disparos. La matriz utilizada fue ácido
sinapínico (10 mg/ml en ácido trifluoroacético 0.3%: acetonitrilo 70:30). La calibra-
ción necesaria para los espectros de masas fue externa y se empleó anhidrasa car-
bónica (29 024 Da) y enolasa (46 672 Da) (Sigma-Aldrich), cubriendo un rango m/z
de 16 000 a 50 000.
La carga neta tanto de las proteínas como de los módulos se estimó a partir de
las respectivas secuencias mediante el programa SEDNTERP (Laue et al., 1992).
Los potenciales electrostáticos de la superficie de las repeticiones CW_7 se calcula-
ron a partir del modelo del CWBM propuesto por Bustamante y cols. (2010), me-
diante el software Adaptativa de Poisson-Bolztmann Solver (APBS) (DeLano, 2005).
El algoritmo basado en la geometría libre Fpocket (Le Guilloux et al., 2009) se utili-
zó para examinar el modelo tridimensional del CWBM con el objetivo de identificar
los potenciales sitios de unión al sustrato de cada repetición CW_7.

9. ENSAYOS DE UNIÓN DE PROTEÍNAS A BACTERIAS

Los estudios de unión del CWBM de Cpl-7S a diferentes bacterias se llevaron a ca-
bo usando un protocolo modificado de los descritos previamente por Loessner y
cols. (2002) y Schmelcher y cols. (2010). Las bacterias se trataron como en la téc-
nica explicada en el apartado 10 y, tras ajustarse a una DO550 ≈ 0.6, se transfirieron
8
200 µl por muestra (1.25 × 10 UFC/pocillo) en placas estériles de poliestireno de 96
pocillos con fondo plano (Falcon, BD). Éstos contenían 5 µg/pocillo de la proteína
GFP-CWBM7S (junto a carvacrol 0.01% en el caso de las bacterias Gram-
negativas), y se usó como control GFP sin CWBM7S. Posteriormente, las placas se
®
incubaron en un equipo Thermomixer comfort de Eppendorf a 37°C durante 1 h
con agitación suave. Después, se tomaron los 200 µl de las muestras, se centrifu-
garon descartándose el sobrenadante y se lavó cada muestra dos veces con 300 µl
de PBS. El último sedimento se resuspendió en 100 µl de PBS de los cuales se to-
maron 10 µl para analizar mediante microscopía de fluorescencia.

10. ENSAYOS DE ACTIVIDAD BACTERIOLÍTICA Y BACTERICIDA DE LAS ENZIMAS

Los experimentos llevados a cabo para analizar la actividad bacteriolítica y bacteri-

cida de las diferentes enzimas se hicieron usando un protocolo modificado del des-
crito previamente por Loessner y cols. (2002) y Schmelcher y cols. (2010). Breve-
mente, los cultivos de diferentes bacterias (Tablas 1 y 2) se incubaron en los me-
dios específicos (Tabla 5) a 37°C ó 30°C según la cepa, hasta alcanzar una DO550
de 0.3 y, a continuación, se enfriaron en agua-hielo durante 15 min. Posteriormente,
las células se sedimentaron por centrifugación y se lavaron dos veces con PBS,
ajustándose la DO550 ≈ 0.6. A partir de aquí se siguieron dos procedimientos diferen-
tes para bacterias Gram-positivas y Gram-negativas:
a) Las suspensiones de las bacterias Gram-positivas se transfirieron a tubos de
plástico estériles que contenían las enzimas sometidas a estudio en un rango de
−1
dosis comprendido entre 0.01 y 50 µg ml . Los tubos control se trataron con el
mismo volumen de tampón fosfato sódico pH 6.0 en el que se encuentran las enzi-
mas. Las muestras se incubaron a 37°C durante 1 h, y se midió la disminución de
turbidez, DO550, a diferentes intervalos de tiempo, hasta 60 min. A continuación, se
tomaron muestras, se realizaron diluciones seriadas y se sembraron en placas de
agar-sangre para determinar las bacterias viables. Los experimentos se repitieron al
menos tres veces. Los aislados clínicos de S. pneumoniae usados en estos experi-
mentos correspondieron a las cepas 1515/97 (serotipo 6B), 69 (serotipo 19F) y 48
(serotipo 19F). El resto de las bacterias Gram-positivas estudiadas se encuentran
detalladas en las Tablas 1 y 2.
b) A las suspensiones de las bacterias Gram-negativas se les añadió carvacrol
[2-metil-5-(1-metiletil) fenol] 0.01% (Sigma-Aldrich), previamente disuelto en etanol,
siguiéndose el mismo protocolo descrito anteriormente para las bacterias Gram-
positivas. Los tubos control se trataron con el mismo volumen de tampón fosfato
sódico pH 6.0 y carvacrol 0.01%. A continuación, se incubaron a 37°C siguiéndose
la DO550 como se ha explicado anteriormente. Asimismo, a diferentes tiempos se
tomaron muestras, se realizaron diluciones seriadas y se sembraron en placas de
LB para determinar las bacterias viables. Los experimentos se repitieron al menos
tres veces.

11. EXPERIMENTACIÓN ANIMAL

11.1. Modelo de colonización en embriones de pez cebra

Los embriones de pez cebra se adquirieron en ZF-Biolabs (Tres Cantos, Madrid) y

los experimentos se realizaron en el Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC).
Para la infección de dichos embriones se utilizó la cepa D39 (NCTC 7 466) de S.
pneumoniae, así como la cepa tipo de S. pyogenes (CECT 985), crecidas ambas en
medio C+Y y posteriormente centrifugadas y resuspendidas en PBS.
Los embriones se trataron de acuerdo con los protocolos estándar para este tipo
de experimentación (Westerfield, 2007) y se eliminó el corion mediante tratamiento
−1
con pronasa (2 mg ml ) durante 2 min. Inicialmente se determinó la dosis letal mí-
nima en un periodo de 5 días. Para ello, se infectaron mediante la técnica de inmer-
sión grupos de 24-36 embriones de pez cebra silvestres, una vez eliminado el co-
rion, con diferentes diluciones bacterianas de S. pneumoniae y de S. pyogenes en
medio E3 (NaCl 5 mM, KCl 0.17 mM, CaCl2 0.33 mM, MgSO4 0.33 mM).
A continuación, una vez determinada la dosis letal mínima y después de 24 h
post-fertilización (hpf), los embriones se sumergieron en una suspensión de medio
8 −1
E3 que contenía 1 × 10 UFC ml de S. pneumoniae o de S. pyogenes, en una pla-
ca multipocillo de 96 pocillos. Se realizaron dos controles, embriones inoculados
8 −1
con un placebo (PBS) y embriones inoculados con 1 × 10 UFC ml de S. pneumo-
niae o S. pyogenes, inactivadas por calor por incubación a 65°C durante 10 min.
Después de 7 h de contacto entre los embriones y las bacterias a 28.5°C, se lava-
ron 12 veces de forma exhaustiva con medio E3 estéril con la finalidad de eliminar
todas las bacterias. Posteriormente, los embriones recibieron una dosis única de
proteína mediante inmersión. Para ello, se les cambió a una nueva placa multipoci-
llo que contenía medio E3 estéril suplementado con 25 µg (5 µl) de Cpl-7S o Cpl-1
o el mismo volumen de tampón fosfato sódico 20 mM pH 6.0 en el que están solo
las enzimas, como controles. A continuación, se incubaron a 28.5°C en condiciones
estériles siguiéndose la mortalidad varias veces al día durante 5 días. El medio E3
se renovó diariamente durante los 5 días. Los embriones se consideraron que esta-
ban muertos cuando no se observó ningún movimiento, incluso si había un leve la-
tido de corazón. Los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los resultados
se expresaron como porcentaje de supervivencia. Una vez terminado el experimen-
to los embriones se sacrificaron, manteniéndolos a 4°C durante 24 h según protoco-
los estándar.

11.2. Modelo de sepsis en ratón

Los experimentos con ratones se realizaron durante mi estancia en el grupo del

Prof. Fischetti en la Universidad Rockefeller de Nueva York. Todos los procedimien-
tos científicos para dichos ensayos se realizaron según el Real Decreto 53/2013 del
8 de febrero de 2013 y según las leyes de National Institutes of Health Guide for the
Care and Use of Laboratory, que fueron aprobadas por el Comité institucional de
uso y cuidado animal de la Universidad Rockefeller (Nueva York, NY). El comité
perteneciente a dicha institución aprobó todos los experimentos realizados con
animales en este estudio (protocolo #11005).
Los ratones se criaron en el Comparative Bioscience Center (CBC) de la misma
Universidad y se adquirieron en Charles River Labs (Wilmington, MA). Los experi-
mentos de infección murina se realizaron en dicho CDC. Para calcular la dosis letal
mínima que producía el 100% de mortalidad en un período de 7 días, se inocularon
grupos de 5 hembras de la estirpe BALB/C de 4–6 semanas por vía intreaperitoneal
(IP) con diferentes diluciones bacterianas en medio TSB de la cepa D39_IU de S.
pneumoniae, también llamada IU1680 o D39 (Lilly) (Lanie et al., 2007).
Una vez determinada la dosis letal mínima, los ratones BALB/C de 4–6 semanas
5 −1
se inocularon por vía IP con un total de 500 µl que contenían 5.5 × 10 UFC ml de
la bacteria D39_IU crecida en medio TSB. Después de 1 h, se administró una dosis
letal de CO2 recogiéndose los diferentes órganos (bazo, riñones, corazón e hígado),
que fueron homogenizados en 1 ml de PBS, para determinar el nivel de infección.
Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los resultados se
−1
expresaron como log10 UFC ml .
Para estudiar la protección mediada por la quimera Cpl-711, grupos de 5 hem-
bras BALB/C de 4–6 semanas de edad, se infectaron por vía IP con una dosis letal
5
de bacteria D39_IU (5.5 × 10 UFC). Después de 1 h, los animales se trataron ad-
ministrando 500 µl de Cpl-711 por vía subcutánea en un rango de dosis comprendi-
−1 −1
do entre 0.8 mg kg y 16.6 mg kg de peso corporal. Los ratones incluidos en el
grupo control se trataron con PBS. Los animales se observaron varias veces al día
y el número de muertos se registró diariamente a lo largo de los 7 días de segui-
miento.

11.3. Modelo de colonización en ratón

Inicialmente se estudió la dosis letal mínima que producía el 100% de mortalidad en

un período de 7 días de las cepas D39_IU de S. pneumoniae, así como la cepa de
S. pyogenes MGAS5005 serotipo M1 (Sumby et al., 2005). Para ello se inocularon
grupos de 7 hembras de la estirpe C57BL/6 de 4–6 semanas por vía intranasal (IN)
con diferentes diluciones bacterianas en PBS. A continuación, se evaluó la capaci-
dad de las cepas virulentas D39_IU y S. pyogenes MGAS5005 para inducir una co-
lonización prolongada en los ratones. Para ello, se inocularon grupos de 7 ratones
8 −1
por vía IN con 20 µl de una suspensión bacteriana conteniendo 2.5 × 10 UFC ml
8 −1
de la cepa D39_IU de S. pneumoniae, 2.5 × 10 UFC ml de la cepa MGAS5005 de
8 −1
S. pyogenes o 5 × 10 UFC ml de una combinación de las mismas (en una sus-
4 −1
pensión de infección de 20 µl conteniendo 2.5 × 10 UFC ml de cada cepa). Los
animales se mantuvieron a lo largo de los 7 días sacrificándose un individuo por
día, con una dosis letal de CO2. De cada ratón se realizaron diluciones seriadas de
los distintos órganos (nariz y pulmones) y se sembraron en placas de agar-sangre
para determinar las bacterias viables, diferenciándose entre ellas mediante el tipo
de hemólisis que producen: α-hemólisis por parte de S. pneumoniae y β-hemólisis
por parte de S. pyogenes. Los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los
−1
resultados se expresaron como log10 UFC ml .
Para estudiar la protección mediada por Cpl-7S, se infectaron grupos de 7 hem-
bras C57BL/6 de 4–6 semanas de edad por vía IN con dosis letales de las bacterias
D39_IU de S. pneumoniae, MGAS5005 de S. pyogenes o una mezcla de las mis-
mas. Los animales pertenecientes al grupo control se inocularon con un placebo
(PBS). Transcurridas 24 h, a los animales se les administraron 30 µl de Cpl-7S por
−1
vía IN en una de dosis de 4 mg kg de peso corporal. Los animales incluidos en el
grupo control fueron tratados con PBS. Transcurridas 24 h del tratamiento (48 hpi,
horas post-infección) se sacrificaron todos los animales, con una dosis letal de CO2,
se realizaron diluciones seriadas de las muestras procedentes de la nariz y se sem-
braron en placas de agar-sangre para determinar las bacterias viables.
12. TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA

Todas las muestras se observaron en un microscopio Leica con un objetivo de con-

traste de fases 100× (DM4000B). Las imágenes se obtuvieron usando una cámara
Leica (DFC360-FX) y se analizaron con el software de Leica AF6000-DFC.
La microscopía láser confocal (CLSM) se utilizó para confirmar la presencia de
S. pneumoniae en los embriones de pez cebra. Brevemente, los embriones se in-
fectaron con S. pneumoniae, utilizando la metodología anteriormente descrita. Una
vez establecida la infección, y siguiéndose los protocolos estándar (Westerfield,
2007), los embriones fueron anestesiados por inmersión en tricaína (MS-222, Sig-
−1
ma-Aldrich) a una concentración de 200 mg ml . A continuación, los embriones se
fijaron en la solución BT Fix (1 g sacarosa, 18.75 µl CaCl2 2 M, 5 ml tampón fosfato
sódico 500 mM pH 7.3, 10 ml paraformaldehído 10%), durante toda la noche a 4°C.
La permeabilización de los embriones se llevó a cabo mediante la congelación de
los mismos en acetona a −20°C durante 7 min, seguido de diferentes lavados en
agua destilada y un lavado final con tampón fosfato sódico 100 mM pH 7.3.
La tinción de S. pneumoniae se visualizó añadiendo el correspondiente anti-
cuerpo primario en una solución DMSO 1%, diluido 1/200, previo tratamiento duran-
te 30 min a temperatura ambiente de los embriones con una solución de
PBS/BSA/DMSO (50 ml PBS pH 7.3, 1 g BSA, 1 ml DMSO en un volumen final de
100 ml) conteniendo 10% de suero de caballo, para bloquear los sitios de unión
inespecíficos. Transcurrida 1 h de incubación a temperatura ambiente, los embrio-
nes se lavaron durante 2 h con una solución PBS/BSA/DMSO, con cambios cada
10–15 min, y se incubaron finalmente con el correspondiente anticuerpo secundario
en una solución de 50 µl de 1% DMSO diluido 1/25 durante toda la noche y en os-
curidad a 4°C. El anticuerpo secundario utilizado fue anti-conejo Alexa flúor 568.
Los embriones sin teñir y teñidos únicamente con el anticuerpo secundario se
utilizaron como controles negativos. Tras el periodo de incubación con el anticuerpo
secundario, los embriones se lavaron tres veces durante 10 min en una solución
PBS/BSA/DMSO.
Los embriones teñidos se analizaron utilizando el microscopio Leica TCS-SP2-
AOBS-UV CLSM y los objetivos de aceite de inmersión HC PL APO CS 10×/0.40,
20×/0.70 y HCX PL APO CS 40×/1.25 a 0.75. Las imágenes se analizaron mediante
el software de Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) y NIH Ima-
geJ. Se obtuvieron las proyecciones de los planos x–y y x–z.
13. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos que se muestran a lo largo de esta Tesis son representativos de los re-
sultados obtenidos de la repetición de experimentos independientes. Además, cada
dato muestra la media y la desviación estándar (DS) de 3–5 réplicas. Para el análi-
sis estadístico se empleó el test t de Student de dos colas mientras que, para las
comparaciones múltiples, se usó un análisis de la varianza (ANOVA).
Para los experimentos de supervivencia, en los que se determinó el efecto pro-
tector de las enzimas Cpl-7S y Cpl-711 en los diferentes modelos animales, se utili-
zó un análisis de la varianza (ANOVA) más un test post hoc Dunnett así como el
test log-rank ordinal (Mantel"Cox), para comparar el valor significativo de los anima-
les supervivientes en los diferentes grupos experimentales.
Para el análisis estadístico se utilizó el programa GraphPad InStat version 3.0
(GraphPad Software, San Diego, CA).
 IV. RESULTADOS
!
1. ANÁLISIS DEL GENOMA DEL FAGO CP-7

1.1. Estrategia de secuenciación

El bacteriófago Cp-7 se aisló en nuestro laboratorio a partir de frotis faríngeos de

niños sanos de Alcalá de Henares. Este fago pertenece a la familia Podoviridae,
posee una cabeza irregular hexagonal de aproximadamente 60 × 45 nm y una cola
corta de casi 20 nm de longitud y 15 nm de grosor. La cabeza, con proyecciones,
muestra una base aplastada con apéndices en el cuello (Ronda et al., 1981). El
DNA contiene una proteína covalentemente unida a los extremos 5’, al igual que
otros fagos como el φ29 que infecta a Bacillus subtilis. La extracción del DNA de
Cp-7 se hizo de acuerdo a la técnica que se describe en Ronda y cols. (1983) y que
se resume en Materiales y Métodos. A continuación, se obtuvo la secuencia nu-
cleotídica de su genoma con un secuenciador 454 de la casa Roche en la empresa
LifeSequencing (Valencia). Para ello, se siguió la técnica shotgun, mediante la cual
se rompe al azar y de forma mecánica (sonicación o nebulización) el DNA en pe-
queños fragmentos de 100 a 1 000 pb para, posteriormente ser secuenciados. Se
obtuvieron un total de 35 971 lecturas con una media de 406.9 nucleótidos de longi-
tud obteniéndose en su conjunto 16 contigs que se ensamblaron finalmente en uno
solo. Hay que resaltar que, anteriormente, ya se había publicado la secuencia de
los extremos del DNA de este fago, concretamente 908 pb del extremo 5’ y 755 pb
del extremo 3’ que contienen una repetición terminal invertida de 347 pb (Escarmis
et al., 1985). Sin embargo, desde entonces, no se había secuenciado ninguna re-
gión más del DNA del fago Cp-7. El análisis de la secuencia indicó que el tamaño
del genoma es de 19 741 pb, con un contenido en G+C del 47.2%. La secuencia
obtenida se depositó en el banco de datos con el número de acceso WEBIN ID
(Hx2000040309).

1.2. Identificación de genes y organización del genoma del fago Cp-7

El análisis de las orfs presentes en el genoma del fago Cp-7, así como su traduc-
ción a secuencias de aminoácidos mediante el programa GeneMark, predijo 30
posibles Orfs. Cada una de éstas se analizó con los programas BlastP (NCBI) y
HMMER para buscar similitudes con proteínas ya descritas. Tras este estudio, el
número definitivo de genes se redujo a 28 (Tabla 7), revelándose que el genoma de
Cp-7 presentaba una elevada similitud con el del fago Cp-1 de neumococo.

Tabla 7. Análisis comparativo de los productos génicos del genoma del fago Cp-7
Gen Producto génico (coordenadas) Secuencia con mayor similitud
Valor E
orf Cadenaa Inicio Final Aab Función propuesta Proteína (origen) (% identidad) Nº acceso
(superposición de aab)
orf1 + 375 641 88 - Proteína hipotética (fago Cp-1) (95.5) 6.20E−53 (84) NP_044813.1
Dominio de repetición conservado de
orf2 + 656 841 61 - Sebaldella termitidis 2.00E−13 (10) YP_003307859.1
(25.6)
orf3 + 855 1 145 96 - Orf2 (fago Cp-1) (34.7) 3.70E−12 (33) NP_044814.1
orf4 + 1 551 2 243 230 Proteína terminal Proteína terminal (fago Cp-1) (98.7) 6.00E−164 (227) NP_044816.1
orf5 + 2 241 3 946 568 DNA polimerasa DNA polimerasa (fago Cp-1) (96.8) 1.00E−102 (550) NP_690635.1

!
orf6 + 3 903 4 349 148 - Orf6 (fago Cp-1) (91.9) 2.40E−84 (136) NP_044818.1
orf7 + 4 342 4 851 169 - Orf7 (fago Cp-1) (100) 9.10E−106 (169) NP_044819.1
Proteína de andamiaje (fago Cp-1)
orf8 + 5 072 5 362 96 Proteína de andamiaje 1.00E−57 (92) NP_044820.1
(95.8)
orf9 + 5 381 5 605 74 - - - -
Proteína mayoritaria de la Proteína mayoritaria de la cápsida
orf10 + 5 607 6 707 366 4.40E−227 (350) NP_044821.1
cápsida (fago Cp-1) (95.1)
orf11 + 6 762 7 775 337 Conector Conector (fago Cp-1) (98.2) 7.10E−223 (331) NP_044823.1
orf12 + 7 762 8 409 215 Proteína del cuello Proteína del cuello (fago Cp-1) (97.4) 1.10E−122 (189) NP_044824.1
orf13 + 8 421 9 005 194 Apéndice Apéndice (fago Cp-1) (92.3) 6.60E−120 (179) NP_044825.1
orf 14 + 9 002 9 319 105 DUF464c Orf13 (fago Cp-1) (61.5) 3.40E−28 (59) NP_044826.1
a
, +, Corresponde a la cadena incluida en la base de datos.
b
, Aa, Aminoácidos.
c
, DUF, Dominio de función desconocida (Domain of Unknown Function).
Tabla 7. Análisis comparativo de los productos génicos del genoma del fago Cp-7 (continuación)

Gen Producto génico (coordenadas) Secuencia con mayor similitud

Valor E
orf Cadenaa Inicio Final Aab Función propuesta Proteína (origen) (% identidad) Nº acceso
(superposición de aab)
orf15 + 9 306 10 175 289 Fibra de la cápsida Fibra de la cápsida (fago Cp-1) (59.1) 2.10E−41 (75) NP_044827.1

orf16 + 10 191 10 967 258 Apéndice Orf15 (fago Cp-1) (84.2) 3.90E−114 (187) NP_044828.1

orf17 + 10 967 11 728 253 Apéndice Apéndice (fago Cp-1) (96.8) 8.70E−166 (245) NP_044830.1
Apéndice (fago Cp-1) (97.9) 1.70E−145 (231) NP_044832.1
orf18 + 11 695 13 257 520 Proteína de la cola
Proteína de la cola (fago Cp-1) (93.7) 9.50E−136 (208) NP_044831.1
orf19 + 13 261 15 099 612 Proteína de la cola Antirreceptor (fago Cp-1) (98.3) 0 (573) NP_044833.1
Proteína de encapsidación (fago
orf20 + 15 173 16 219 348 Proteína de encapsidación 8.10E−224 (342) NP_044835.1
Cp-1) (98.3)
orf21 + 16 209 16 613 134 Holina Holina (fago Cp-1) (99.3) 3.90E−81 (133) NP_044836.1
Lisozima (fagos Cp-1 y Cp-9) 4.40E−111 (202) NP_044837.1
orf22 + 16 613 17 641 342 Lisozima
(82.8; 81.2) 7.70E−111 (203) MUBPC9
orf23 − 18 086 17 718 122 - - - -

orf24 − 18 333 18 091 80 - Proteína hipotética (fago Cp-1) (100) 1.40E─47 (80) NP_044838.1

orf25 − 18 613 18 337 91 - - - -

orf26 − 18 884 18 615 89 - Proteína hipotética (fago Cp-1) (60.7) 1.10E−30 (54) NP_044839.1

orf27 − 19 104 18 886 72 - - - -

- Fago Sfi-11 de Streptococcus (37.5) 3.60E−10 (30) NP_056702.1
orf28 − 19 367 19 119 82 Gp83 Fago 5093 de Streptococcus (37.5) 7.60E−11 (30) YP_002925121.1
Orf83 Streptococcus TP-J34 (37.5) 3.60E−100 (30) YP_007392305.1
a
, +, Corresponde a la cadena incluida en la base de datos; −, corresponde a la cadena complementaria a la incluida en la base de datos.
b
, Aa, Aminoácidos.
 Dado el elevado nivel de compactación de los genomas fágicos, muchos de los
promotores se encuentran solapados en regiones codificantes. La búsqueda de
dichos promotores se realizó mediante el programa BPROM (Softberry). De esta
manera, se detectaron 48 posibles secuencias promotoras pero, teniendo en cuenta
su posición respecto a los genes, se seleccionaron sólo 10 de ellas (Tabla 8) que
presentan las secuencias consenso de las cajas −10 y −35, TATAAT y TTGACA,
respectivamente. En la caja −10 se han tenido en cuenta los nucleótidos TG que
constituyen lo que se conoce como “caja −10 extendida” (TGXTATAAT). En las
secuencias de ambas cajas las bases que presentan mayor grado de conservación
se correlacionan con el tamaño de las letras (Fig. 11).

Tabla 8. Localización de las posibles secuencias promotoras del fago Cp-7

Caja −35 Caja −10

Cadenab
Posicióna Secuencia Posicióna Secuencia

178 TTGACA 159 TGATATAAT −

223 TTGACA 242 TGCTATAAT +

316 TTGACA 336 TGCTATAAT +

1 119 TTTACA 1 138 ATAAATAAT +

1 278 CTGACA 1 298 TCTTTTAAT +

4 860 TTCCCA 4 880 AATTATAAA +

5 016 TTGCTT 5 036 TGATATACT +

19 426 TTGACA 19 406 TGCTATAAT −

19 519 TTGACA 19 500 TGCTATAAT −

19 564 TTGACA 19 583 TGATATAAT +

a
, La coordenada se refiere al primer nucleótido de las cajas −10 y −35.
b
, +, Corresponde a la cadena incluida en la base de datos; −, corresponde a la cadena
complementaria a la incluida en la base de datos.

!
 2$

!
bits$

1$

0$
5 $ 3 $
−32$

−26$
−29$
−28$
−27$

−25$
−24$

−19$
−35$
−34$
−33$

−30$

−23$
−22$
−21$

−18$
−17$

−11$
−31$

−15$
−14$
−13$
−12$

−10$
−16$
−20$
weblogo.berkley.edu$

Fig. 11. Secuencias consenso de las cajas −10 y −35 de los 10 promotores del fago Cp-7. La se-
cuencia consenso se obtuvo mediante el programa Weblogo a partir de las posibles secuencias
promotoras de Cp-7 incluidas en la Tabla 8, mostrando la frecuencia relativa de cada base en
cada posición. La altura individual de cada base indica el nivel de conservación dentro de cada
posición en bits de información.

El codón de inicio de traducción de los 28 genes predichos se identificó clara-

mente ya que todos estos genes presentaban el codón ATG, a excepción de las
orfs 5 y 12 que contenían los codones GTG y TTG, respectivamente. Además, en
todos los casos se encontraron secuencias típicas de unión al ribosoma y a la dis-
tancia adecuada del codón de inicio. En referencia a los codones de final de traduc-
ción, los tres se encuentran presentes, siendo TAA el codón mayoritario con una
presencia del 71.4% (20/28), mientras que el codón TGA se halla en el 10.7%
(3/28) de los genes y el codón TAG en el 17.8% (5/28).
En la Tabla 9 y la figura 13 se indica la localización de 3 posibles terminadores
de transcripción Rho-independientes detectados mediante los programas FindTerm
(Softberry) y RNAfold de la Universidad de Viena, así como una comparación con
los datos ya publicados de la secuencia de Cp-1 (García et al., 1990). El primer
terminador se localiza en posición 3’ del gen orf3, el segundo en posición 3’ del gen
orf7 y el tercero en posición 3’ del gen codificante de la enzima lítica Cpl-7.
 Tabla 9. Posibles terminadores de transcripción Rho-independientes
en el genoma del fago Cp-7

Energía libre
Terminador Inicio Final Cadena
(kcal mol−"1)
T1 1 488 1 543 + −20.49

T2 5 005 5 033 + −14.95*

T3 16 649 16 674 + −14.24

+, Corresponde a la cadena incluida en la base de datos.

Para asignar las funciones de los genes identificados, se realizó un análisis bio-
informático determinándose la similitud con las secuencias incluidas en las bases
de datos. De este modo, fue posible asignar una función a 16 de los 28 genes pre-
sentes en el genoma del fago Cp-7. De los 12 genes potenciales restantes, todos
presentaron similitud (34.7–100%) con alguno ya descrito, pero no se les pudo ad-
judicar con claridad una función determinada (Tabla 7).
Los resultados obtenidos en las comparaciones realizadas permitieron organizar
el genoma de este fago en 3 módulos funcionales, formados por genes próximos
físicamente y relacionados con una función determinada (Fig. 13), como se descri-
be a continuación:
Módulo de replicación, formado por 7 genes. El gen orf4, que codifica la proteína
terminal, presenta un 98.7% de similitud con orf4 del fago Cp-1. El gen orf5, que
codifica una DNA polimerasa, presenta un 96.8% de similitud con orf5 de Cp-1. El
resto de genes que forman este módulo presentan una similitud del 34.7–100%
respecto a los de Cp-1.!
Módulo de morfogénesis, formado por trece genes, es decir, que incluye prácti-
camente la mitad del genoma. En este módulo se encuentran los genes que codifi-
can la proteína mayoritaria de la cápsida, proteína de andamiaje, conector, proteí-
nas del cuello, cola y de encapsidación, fibras de la cápsida y apéndices. Todos
estos genes presentan una similitud igual o superior al 93.7% respecto a sus homó-
logos de Cp-1. Además, también tienen un importante porcentaje de similitud cuan-
do se compararon con otros fagos de la familia Podoviridae. Así, hay que destacar
que los genes que codifican las proteínas de la cápsida, del conector y de encapsi-
dación presentan un porcentaje de similitud entre el 27.9 y 59.6% con el fago φ29 o
entre el 29.1 y 64.8% con el fago B103 de B. subtilis. Además, también se ha en-

!
contrado una importante similitud con otros fagos de Actinomyces, Bacillus, Clostri-
dium, Lactococcus, Staphylococcus y Weisella con un porcentaje de similitud que
varía entre el 27% y el 63.6%.
Módulo de lisis, formado únicamente por dos genes situados hacia el extremo 3’
del genoma. El primero de ellos (orf21) que codifica la holina, presenta un 99.3% de
similitud con su homólogo en Cp-1. El segundo gen (orf22) que codifica la lisozima
encargada de lisar a la bacteria, tiene un 82.8% y un 81.2% de similitud con los
respectivos homólogos de Cp-1 y Cp-9. Hay que resaltar que esta similitud está
concentrada exclusivamente en la región 5’ de los genes, que codifican los frag-
mentos N-terminales de las correspondientes enzimas líticas (véase más adelante).

1.3. Comparación filogenética del fago Cp-7

Como ya se ha comentado anteriormente, Cp-7 pertenece a la familia de fagos de

neumococo denominada Cp de la cual se estudiaron tres de ellos: Cp-1, Cp-7 y Cp-
9 (García et al., 1990). A partir de la secuencia completa del DNA de Cp-7 se dedu-
jo una similitud global con la del Cp-1 en torno al 92%, presentando una disposición
física de los genes y una organización funcional muy similar entre ambos (Fig. 13).
Esta similitud ya se había deducido mediante los experimentos de formación de
heterodúplex de DNAs, es decir, al hibridar los DNAs purificados de los dos fagos y
visualizarse con el microscopio electrónico. El dibujo interpretativo de la figura 12
corresponde a la imagen que obtuvo la Dra. Alicia Romero en su Tesis Doctoral
(Romero, 1992), donde se observan 7 lazos que podrían corresponder a zonas de
DNA monocatenario de cada fago que no llegan al valor mínimo de similitud para
que se produzca una hibridación eficaz. De hecho, el análisis pormenorizado de
todas las regiones similares entre los dos DNAs fágicos pone de manifiesto que, de
todos los genes presentes en el genoma de Cp-7, 23 de ellos tienen una elevada
similitud (34.1–100%) con sus homólogos del fago Cp-1, pudiéndose asignar la
localización de los lazos con mucha probabilidad a las 5 regiones de menor similitud
entre los dos genomas. Por tanto, estas regiones podrían localizarse así: a) los
lazos 1, 2 y 3, situados en los extremos 5’ de los genomas, cuyas secuencias están
depositadas en la base de datos; b) el lazo 4, correspondiente a las regiones 3’ de
los genes que codifican las lisozimas; c) los lazos 5 y 6, situados en la zona central
de los genomas; d) el lazo 7 situado en el extremo 3’ de ambos genomas.
 1 2

→
→
→ 3

→
4 →

5 →
6 →

Fig. 12. Dibujo interpretativo de la formación de heterodúplex entre los DNAs de los fagos Cp-1 y
Cp-7. El ensayo se llevó a cabo mezclando los DNAs purificados a una concentración de 30 µg
−1
ml , según el procedimiento previamente descrito (Romero, 1992). La muestra se extendió sobre
las rejillas mediante la técnica del carbonato (Spiess y Lurz, 1988) con el citocromo C (Serva)
como coadyuvante y se visualizó en un microscopio electrónico Philips EM 300 a 80 kV.

!
 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 kb

Cp-1 19 343 pb

Cp-7 19 741 pb

Identidad de nucleótidos (%)

Promotor <80 80 85 88 >90
Terminador de transcripción
Repetición terminal invertida

Fig. 13. Organización génica del fago Cp-7 en comparación con la de Cp-1. En naranja se detallan los genes que codifican las lisozimas.
2. EL PRODUCTO DEL GEN CPL-7: LA LISOZIMA CPL-7

Como ya se ha detallado en la Introducción de esta Memoria, el gen cpl-7 codifica

la endolisina Cpl-7, con actividad muramidasa (lisozima). Cpl-7 constituye un caso
singular dentro de las lisozimas codificadas por S. pneumoniae y sus bacteriófagos
ya que es la única mureín-hidrolasa que no depende de colina para su actividad.
Por tanto, Cpl-7 no es una CBP, como el resto de mureín-hidrolasas del sistema de
neumococo, y es la única capaz de hidrolizar indistintamente paredes que conten-
gan colina o etanolamina en sus TAs (López y García, 2004; Bustamante et al.,
2010). Desde el punto de vista estructural, el módulo catalítico situado en posición
N-terminal, pertenece a la familia GH_25 de las glicosilhidrolasas, compartiendo un
85.6% de identidad (95.2% de similitud) con el de Cpl-1 (Fig. 13) (García et al.,
1987b). Por su parte, el CWBM es completamente distinto al de las CBPs y su se-
cuencia contiene 3 repeticiones CW_7 idénticas, no sólo en aminoácidos sino tam-
bién en nucleótidos. El alineamiento de las repeticiones CW_7 pone de manifiesto
que, en realidad, son las dos primeras las que son idénticas en los 48 aminoácidos
que las forman, mientras que la tercera sólo contiene 42 aminoácidos y los tres
últimos son distintos, comparados con las dos primeras repeticiones (García et al.,
1990). Análisis posteriores han sugerido que la unidad repetida debe contener 42
aminoácidos y los seis últimos residuos corresponden de hecho a un linker que
conecta las CW_7 entre sí (Bustamante et al., 2010).

!
 Origen \ Referencia

Streptococcus \ AAA72844

Streptococcus \ AAA32204, CAY56544

Lactobacillus \ ACO37048

Lactococcus \ AAG24366; Lactobacillus \ ABY84320; Oenococcus \ CAF32671; Enterococcus \ ACZ64018

Leuconostoc \ AAD02487

Lactobacillus \ AAQ75056

Lactobacillus \ AAK27917; Bacillus \ ABX56141; Pediococcus \ AER59806; Lactobacillus johsonii (profago) \ AAK27940

Lactobacillus \ CAA62097

Listeria \ ACI00386

Clostridium \ ABG87925

Streptococcus \ AAN28166

Rhodococcus \ AEV52146

Lactobacillus \ ADA79896

Bacillus \ AEQ34462

Paenibacillus \ CBA18122

Mycobacterium \ AAN12694; Bacillus \ ABS83795; Leuconostoc \ ADP69243; Clostridium \ ADL40330

Lactococcus \ AAC00557; Enterococcus \ ADX81356; Lactobacillus \ ACJ68919; Streptococcus \ ABD48922

Familia GH_25 LysM Amidase_2 SH3_3 Cu_ amino oxidN1 CW_binding_1

(PF01183) (PF01476) (PF01510) (PF08239) (PF01179) (PF01473)

Familia GH_66 SH3_5 Peptidase M23 CHAP CW_binding_7

(PF13199) (PF08460) (PF01551) (PF05257) (PF08230)

Fig. 14. Representación esquemática de proteínas de origen fágico que contienen el módulo ca-
talítico GH_25.

Como se ha comentado, el módulo catalítico de Cpl-7 pertenece, al igual que

otras lisozimas del sistema de neumococo, a la familia GH_25: la codificada por la
bacteria (LytC) o por algunos de sus fagos (Cpl-1 y Cpl-9). El prototipo de este tipo
de enzimas es la lisozima del hongo Chalara (Hash y Rothlauf, 1967). La búsqueda
en las bases de datos de las diferentes proteínas de origen fágico que contienen
este módulo catalítico dio como resultado la presencia del mismo en otras 76 pro-
teínas. Éstas se pueden organizar en 15 tipos diferentes dependiendo del CWBM
que contengan (tipo CBD, LysM, SH3_3, SH3_5), así como de algún otro módulo
catalítico que puedan contener, como el caso de un dominio Amidase_2 o Peptida-
se M23 (Fig. 14).
Por otra parte, el análisis de secuencias centrado sólo en una de las repeticio-
nes idénticas del CWBM, CW_7, dio como resultado 7 proteínas diferentes de ori-
gen fágico, incluyendo Cpl-7, organizadas en 5 tipos dependiendo del módulo cata-
lítico asociado (Fig. 15). Pero si la búsqueda se amplía mucho más y se incluyen
las secuencias de bacterias, la repetición CW_7 se encuentra presente en 202 pro-
teínas diferentes organizadas en 30 tipos estructurales dependiendo de los diferen-
tes módulos asociados a CW_7, la mayoría de las cuales parecen estar implicadas
en el metabolismo de la pared celular (última fecha de acceso, 6 de junio 2014)
(Fig. 16). Estos módulos asociados a las repeticiones CW_7 se pueden agrupar
junto con: a) módulos lisozima (GH_25); b) módulos N-acetylmuramoyl-L-alanina
amidasa (Amidase_2, PF01510; Amidase_5, PF05382); c) módulos N-
acetilglucosaminidasa (Glucosaminidase; PF01832); d) módulos transglicosilasa
(Transglycosylase, PF05036); e) módulos cisteína, histidina-dependiente amidohi-
drolasa/peptidasa (CHAP, PF05257). Más de la mitad de estas especies bacteria-
nas (76 de 127) pertenecen a los filos Firmicutes ―perteneciendo la mayoría de
ellas a la orden Clostridiales― o Actinobacteria (40 de 127), siendo la mayoría de
ellos del orden Actinomicetales.

Origen \ Referencia

Streptococcus \ AAA72844

Streptococcus \ ABK91888

ND* \ AFB75826

ND* \ AFB75729

Lactococcus \ ABG21617

Familia GH_25 Amidase_5 CHAP

(PF01183) (PF01510) (PF05257)

Glucosaminidase Transglicosilase CW_binding_7

(PF01832) (PF06737) (PF08230)

*ND: No Definido!
!
Fig. 15. Representación esquemática de proteínas de origen fágico que contienen las repe-
ticiones CW_7.

Es interesante resaltar que, dentro de las 127 especies que contienen proteínas
con motivos CW_7, aparece un elevado número de representantes de la microbiota
del tracto gastrointestinal humano. Por lo general, estas especies son inocuas para

!
el ser humano, aunque se han descrito algunos casos de patologías asociadas a
estas bacterias como, por ejemplo: a) endocarditis (Corynebacterium jeikeium, Gra-
nulicatella elegans o Lactococcus garvieae); b) infecciones orales (Bifidobacterium
dentium o Parvimonas micra); c) infecciones cutáneas (Propionibacterium acnes o
Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis). Por otra parte, también se han iden-
tificado los motivos CW_7 en un elevado número de bacterias beneficiosas (bifido-
bacterias) o con relevancia industrial (Lactococcus lactis), así como en bacterias
presentes en aguas residuales y contaminadas como los casos de Ethanoligenens
harbinense o Dehalococcoides ethenogenes.
La búsqueda inicial de las proteínas que contienen repeticiones CW_7 en las
bases de datos dio como resultado que 7 de ellas están codificadas por profagos o
fagos líticos. Sin embargo, cuando se examinaron más en profundidad las regiones
situadas en posición 5’ de los genes codificantes de proteínas con repeticiones
CW_7 de las 127 especies bacterianas diferentes, se observó que, frecuentemente,
aparecían genes que codifican holinas (u otras proteínas relacionadas con fagos),
sugiriendo que, al menos, el 80.1% de las especies secuenciadas hasta la fecha
que contienen proteínas con motivos CW_7 provienen de profagos o restos de los
mismos.
 Origen \ Referenciaa Origen \ Referenciaa Origen \ Referenciaa
Clostridium \ EFE12573 NDb \ EGC74937 Anaerococcus \ EEI85350
Clostridium \ EEG51680 Parvimonas \ EDP23940 Collinsella \ EEA89601
Bacteroides \ EDS16215 Streptococcus \ BAH82103 Bifidobacterium \ EDT45852
Lactobacillus \ AEI56707 Streptococcus \ ABF38229 Collinsella \ EEP44864
Parascardovia \ E6JZS4 Anaerostipes \ EEP22199 Coprococcus \ EEG89729
Lactococcus \ AAK05760 Bacteroides \ EEC56840 Dehalococcoides \ AAW39696
Propionibacterium \ ADD99701 Anaerococcus \ EEI86118 Ruminococcus \ EDN76657

!
Corynebacterium \ EEW16061 NDb \ AFB75729 NDb \ CBL42507
Mobiluncus \ EFU82458 Coprobacillus \ EFW04307 Eremococcus \ EFR30600
Clostridium \ EDO61912 Coprococcus \ EEG89528 Catonella \ EEP22668
Familia GH_25 Amidase_2 Amidase_5 Glucosaminidase CW_binding_7 CW_binding_1 CHAP SPOR
(PF01183) (PF01510) (PF01510) (PF01832) (PF08230) (PF01473) (PF05257) (PF05036)
LysM DUF3597c Transglicosilase
(PF01476) (PF12200) (PF06737)
a, número de acceso de cada proteína
b, ND: No Definido
c, DUF: Dominio de función no conocida (Domain of unknown function)!
Fig. 16. Representación esquemática de proteínas de origen bacteriano y fágico que contienen el módulo CW_7.
!
3. ACTIVIDAD IN VITRO DE DIFERENTES MUREÍN-HIDROLASAS DE NEUMOCOCO

Dado el aparentemente imparable aumento de cepas de S. pneumoniae resistentes

a diferentes compuestos antimicrobianos (Liñares et al., 1992; Maestro y Sanz,
2007), en los últimos años se han ensayado varias mureín-hidrolasas como una
prometedora alternativa a los antibióticos para un eventual tratamiento más eficaz
contra dichas cepas (Hermoso et al., 2007). Estas mureín-hidrolasas purificadas
añadidas externamente sobre diferentes cultivos bacterianos se conocen como
enzibióticos y han demostrado poseer una notable actividad bactericida in vitro e in
vivo, tanto en cultivos planctónicos como en biofilmes y modelos animales. En el
caso de neumococo, las enzimas ensayadas con buenos resultados han sido Pal y
Cpl-1 (codificadas por los fagos líticos Dp-1 y Cp-1, respectivamente), así como la
autolisina LytA (Loeffler et al., 2001; Jado et al., 2003; Djurkovic et al., 2005; McCu-
llers et al., 2007; Rodríguez-Cerrato et al., 2007a, b; Witzenrath et al., 2009).
Inicialmente y con el fin de determinar la actividad específica de las diferentes
enzimas de neumococo sometidas a estudio (LytA, Cpl-1, Pal y Cpl-7), se realizaron
ensayos in vitro con paredes de neumococo marcadas con colina tritiada como
sustrato, ajustándose en cada caso el pH del tampón al valor óptimo de cada enzi-
ma. De este modo, se observó que las enzimas de origen fágico presentaban una
actividad específica comparable entre sí mientras que la autolisina LytA tenía una
actividad específica mucho mayor que las fágicas (Tabla 10). A continuación, para
determinar el efecto bacteriostático y bacteriolítico de estas enzimas líticas, se lle-
varon a cabo ensayos de actividad sobre S. pneumoniae R6 (cepa no capsulada)
siguiendo el protocolo descrito en Materiales y Métodos. Así, se realizaron varias
pruebas para determinar la concentración óptima de enzima para conseguir un
efecto lítico adecuado.
 Tabla 10. Actividad in vitro sobre paredes radiactivas de algunas enzimas líticas de
neumococo y sus fagos

pH Actividad
Enzima Actividad Temperatura
óptimo específica (U mg−1)
LytA 37ºC 6.9 4.1 × 105
Amidasa
Pal 37ºC 6.9 3.4 × 104

Cpl-1 37ºC 6.0 8.0 × 104

Lisozima
Cpl-7 37ºC 6.0 6.2 × 104

−1
De esta manera, se probaron diferentes concentraciones (1–50 µg ml ) de las
enzimas a un pH estándar de 6.0. Tras 1 h de incubación a 37°C se determinó,
basándose en la caída de DO550, que la concentración de proteína óptima en la cual
se observaban diferencias significativas (P <0.001) entre los diferentes enzibióticos
−1
era de 5 µg ml (datos no mostrados). Una vez establecida la concentración ade-
cuada de proteína, se llevaron a cabo los estudios de actividad sobre cultivos planc-
tónicos.
Un cultivo de S. pneumoniae R6 se centrifugó y se resuspendió en PBS (pH 6.0)
a una DO550 ≈ 0.6. A continuación, se transfirió a tubos de plástico estériles que
−1
contenían las distintas enzimas a una concentración de 5 µg ml y se incubaron a
37°C durante 1 h, siguiéndose las variaciones de DO550 y calculándose el número
de células viables de cada muestra después de 60 min de incubación. Los resulta-
dos mostraron que la adición exógena de estos enzibióticos a células vivas de S.
pneumoniae, utilizadas como sustrato, provocaba una respuesta muy diferente en-
tre ellos, tanto en su efecto bacteriolítico como bactericida (Fig. 17). Así, la lisozima
Cpl-1 y la amidasa LytA fueron muy eficientes pues en estas condiciones disminu-
yeron más de 7 unidades logarítmicas el número de células viables mientras que, la
amidasa Pal, mostró una actividad intermedia entre las anteriores y la lisozima Cpl-
7 que fue la enzima menos eficaz de estos enzibióticos ya que la disminución de la
viabilidad fue en torno a dos unidades logarítmicas. Estos resultados contrastaban
claramente con los ensayos in vitro con las mismas enzimas y con paredes radiacti-
vas purificadas como sustrato donde, con la excepción de LytA, las demás tenían
una actividad específica similar.

!
 A B
0.8$
8"
Control$
0.6$
6" *"

Log10"CFU"ml–1"
DO550$

0.4$

Cpl:7$
4"
*"
0.2$
Pal$ 2"
LytA$ *"
0$
Cpl:1$ *"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$

Cpl31"

Cpl37"
Control"

LytA"

Pal"
Tiempo$(min)$

Fig. 17. Efecto bacteriolítico y bactericida de LytA, Pal, Cpl-1 y Cpl-7 sobre la cepa R6 de neu-
mococo. (A) Cultivos de R6 se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en au-
−1
sencia o presencia de 5 µg ml de los enzibióticos seleccionados, continuándose la incubación a
37°C. La evolución de la DO550 de las suspensiones bacterianas se siguió durante 60 min. Los
datos son representativos de 4 experimentos independientes. (B) Las células viables de las
muestras después de 60 min de incubación se determinaron en placas de agar-sangre. Los datos
son media de 4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los aste-
riscos indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en ausen-
cia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P
<0.001.

A continuación, se llevó a cabo este tipo de estudios con los enzibióticos Cpl-
1 y Cpl-7 sobre cepas capsuladas para determinar la posible influencia del CPS
sobre la actividad de estas lisozimas. Los resultados de la figura 18 demostraron
que ambas enzimas mantenían el mismo patrón de comportamiento sobre las
cepas de serotipo 2 (D39), 3 (P007) y 4 (P008) que sobre la cepa R6 de neumo-
coco, a pesar de la diferencia de tamaño de la cápsula que, potencialmente,
podría llegar a ser un impedimento para su acción.
 8"

6"
Log10"UFC"ml–1"

*" *" *"

4"

2"

*" *" *"

Cpl.1"
Control"

Cpl.1"

Control"

Cpl.7"
Cpl.7"

Control"

Cpl.1"

Cpl.7"
D39" P007" P008"

Fig. 18. Efecto bactericida de Cpl-1 y Cpl-7 sobre diferentes cepas capsuladas de S. pneumo-
niae. Cultivos de D39, P007 y P008 se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron
−1
en ausencia o presencia de 5 µg ml de Cpl-1 y Cpl-7, continuándose la incubación a 37°C. Las
células viables se determinaron en placas de agar-sangre después de 60 min de incubación en
las mismas condiciones. Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las barras de
error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significati-
vos en comparación con los controles en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de
una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

!
4. MODIFICACIONES DE CPL-7

A la vista de las importantes diferencias respecto a las actividades bactericidas de

las diferentes enzimas cuando se añaden de forma externa a un cultivo de células,
se estudiaron minuciosamente todos los datos disponibles de las enzimas para
intentar comprender la razón de dicho comportamiento. Si el análisis se hace a nivel
estructural, se comprueba que una gran diferencia entre ellas reside en el módulo
de reconocimiento del sustrato: LytA, Pal y Cpl-1 presentan un módulo dependiente
de colina, mientras que la lisozima Cpl-7 presenta un CWBM completamente dife-
rente al ser independiente de colina. No obstante, esta diferencia no parece ser de
vital importancia para explicar los datos enzimáticos entre ellas, ya que Cpl-1 y LytA
son mucho más activas que Pal y las tres presentan homología en su CWBM (Fig.
17).
Por otra parte, se ha descrito recientemente la correlación entre la carga neta de
los dominios catalíticos de algunas enzimas líticas fágicas y su actividad bacteriolí-
tica (Low et al., 2011). La idea central de este estudio era que, en el proceso de
interacción entre las enzimas líticas y el peptidoglicano, cuando éstas se añadían
externamente, existen otros factores como los CPSs y la presencia de TAs y LTAs
que podrían influir de manera importante en la carga neta de las paredes celulares
de las bacterias Gram-positivas generando una elevada carga negativa (Neuhaus et
al., 2003). Estas atracciones o repulsiones electrostáticas podrían tener un papel
determinante a la hora de ensayar la actividad lítica de cada enzibiótico con el sus-
trato bacteriano correspondiente.
 Carga neta
Número de aminoácidos Proteína Origen
0 100 200 300 400 ZCM Zlink ZCWBM ZTotal
Nt# Ct#

Amidase# −7.89! −1.99 −4.69 −14.57 LytA S. pneumoniae

Amidase# −4.74! +1.00 − 6.83 −10.57 Pal

−9.86! −3.98 − 0.98 −14.82 Cpl-1 Fago lítico

−10.86! −3.98 −14.93 −29.77 Cpl-7

Familia GH_25 Amidasa_2 Amidasa_5 CW_binding_7 CW_binding_1

(PF01183) (PF01510) (PF01510) (PF08230) (PF01473)

Fig. 19. Representación esquemática y carga neta de las mureín-hidrolasas sometidas a estudio.
ZCM, carga neta referida al módulo catalítico; Zlink, carga neta referida al linker; ZCWBM, carga neta
referida al módulo de unión a sustrato; Ztotal, carga neta total.

A partir de la hipótesis avanzada por Low y cols. (2011), se hizo un análisis deta-
llado de la carga neta de las enzimas estudiadas, tanto de las proteínas completas
como de sus módulos y linkers por separado. Las tres con mejor actividad bacterio-
lítica (LytA, Pal y Cpl-1) presentan una carga neta total muy similar, mientras que la
lisozima Cpl-7 tiene mucha mayor carga negativa (Fig. 19). La comparación de las
dos enzimas de origen fágico Cpl-1 y Cpl-7 demuestra que la mayor diferencia en
carga neta se centra en sus respectivos CWBMs, puesto que las cargas de los mó-
dulos catalíticos (−9.86 y −10.86 para Cpl-1 y Cpl-7, respectivamente) y los linkers
(−3.98 tanto para Cpl-1 como Cpl-7) son muy similares. Por el contrario, el CWBM
de Cpl-1 tiene una carga de −0.98 mientras el de Cpl-7 es de −14.93, lo que podría
explicar que ambas enzimas tengan actividades bacteriolíticas muy diferentes
cuando se añaden exógenamente (Figs. 17 y 18), aunque ambas presenten una
actividad específica in vitro muy similar sobre preparaciones de paredes purificadas
(Tabla 10).

4.1. Localización de las mutaciones introducidas en Cpl-7

Después del análisis in silico de algunas enzimas líticas de neumococo y con el fin
de probar la importancia de la carga neta de la proteína (−29.77), se examinó la
secuencia de las repeticiones CW_7 con el objetivo de producir una variante de
Cpl-7 con actividad antimicrobiana mejorada. Para ello, en primer lugar, se determi-

!
naron los residuos cuya mutación permitiera una inversión de la carga neta, tratan-
do de no afectar al plegamiento de la proteína y, por ende, al reconocimiento de la
pared celular. Para analizar las posibles opciones se realizó un alineamiento múlti-
ple de una muestra representativa de las secuencias de aminoácidos de los motivos
CW_7 presentes en diferentes bacterias o fagos con la finalidad de no cambiar las
regiones conservadas dentro de la familia CW_7 y elegir así las modificaciones de
aminoácidos más conservadas de todas (Fig. 20).

Organismo Secuencia de aminoácidos de los motivos CW_7

!
Fago Cp-7 Streptococcus
Lactococcus gasseri ATCC 33323
Dehalococcoides mccartyi 195
Coprococcus eutactus ATCC 27759
Clostridium leptum DSM 753
Anaerostipes caccae DSM14662
Ruminococcus gnavus ATCC29149
Parvimonas micra ATCC 33270
Ruminococcus gnavus ATCC 29149
Ruminococcus obeum ATCC 29174
Ruminococcus gnavus ATCC 29149
Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11
Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403
Fago KSY1 Lactococcus
Profago λSa2 Streptococcus agalactiae 2603V/R
Fago SMP Streptococcus
Streptococcus pyogenes MGAS10750
Bifidobacterium adolescentis L2-32
Bifidobacterium breve
Bifidobacterium dentium ATCC 27678
Bifidobacterium adolescentis L2-32
Predicción de estructura secundaria
LTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILN!
PDQLAAEVLNGQWGNGVDRQKRLTAAGYDYSVVQEKVNKLLN !
VDQIAREVIRGSWGNGNERITRLKQAGYDPIQIQKRVNQLL-!
VDELAKEVLDGKWGNGTDRKERLTAAGYDYSAVQAKVNALVK !
IDVIAKEVIAGRWGNGENRKKRLKTAGYDYDKVQEKVNAIVK !
IDEIAREVIAGDWGNGEDRKNRLKKSGYEYDKVQKRVNELLG!
TDQVAREVIQGLWGNGADRTNRLKVAGYDPSVIQNRVNQLLK !
VDELAREVIQGKWGNGADRKNRLTKAGYNYDAVQKRVNELLR !
NEEIASEVIAGKWGNGAERQKLLSQAGYDYSAIQSIVNKKLS !
VDEIAREVIHGDWGNGTERKNRISAAGYDYSAVQKRVNELLK!
IREVAKEVIQGNWGNGELRRARLENAGYNYEEVQKEVNRLLK !
TSTVAHEVIAGQWGNDPERSTALKAAGYDPEVIQAEVNKILN !
VSTVAHEVIAGQWGNGEARRKALSASGYDPDTIQKEVNRILN !
IEEVAGEVIQGKYANGKERRKKLCDMGYDPDAVQREVNRQLS !
THEVAIEVINGNYGNGDARVTNLKTKGFDVKAIQTEVNNILT !
THEVAIEVINGNYGNGDTRVTNLQSKGFDVKAIQTEVNNILT !
KQNEALVVINGNHRNGEDRKVSLKANGFDYDEIQNIVNQIIW !
LDTLVKETLAGNYGNGEARKAVL---GNQYEAVMSVINGKTT !
VDQLVQEVIAGKHGNGEARKKSL---GSQYDAVQKRVTELLK!
LDTLVKETLAGKYGNGDQRKAAL---GNQYEAVMAVINGKAT !
VDQLAQEVIQGKHGNGEDRKKSL---GPDYDAVQKRVTEILQ!
IDELVQEVLSGKHGSGEQRKISL---GTNYDAVQAKVNEMLK !
LQALATATIRGDYGNGQQRRDAL---GANYDKVMAIVNQRLG !
LQALATATIRGDYGNGRQRRDAL---GANYDKVMAIVNQRLN !
LNALASAVIRGEYGNGQDRRNRL---GSNYDKVMAIVNSRLT !
YNDMATKVIRGVYGNGNERRQAL---GGAYDRVMAIVNQRLG!
!
-HHHHHHHHH------HHHHHHHHH----HHHHHHHHHHH--!

Fig. 20. Alineamiento representativo de las secuencias del motivo CW_7 presente en diferentes bacte-
rias o fagos. La combinación de colores representa: naranja, residuos estrictamente conservados;
verde, residuos conservados y, azul, residuos semiconservados (basados en matrices de sustitución
BLOSUM). H, α-hélice.
 Tras realizar dicho análisis, los cambios consistieron en la sustitución de 5 ami-
noácidos por cada repetición (15 en todo el CWBM) (Fig. 21A). Para ello, se intro-
dujeron tres aminoácidos básicos, Lys o Arg, en las zonas no conservadas (L216K,
D225K y A230R) (esta numeración corresponde a la de la primera repetición CW_7
del CWBM de Cpl-7), mientras que en zonas parcialmente conservadas se mutaron
dos Asp por dos Asn (D233N y D239N). Estas mutaciones dieron lugar a un cambio
de carga total del módulo de −14.93 a +3.0 o, lo que es lo mismo, de −29.77 a
−11.84, en la carga neta de toda la proteína Cpl-7 (Fig. 22). Esta importante reduc-
ción de la carga neta tendría como consecuencia la presumible disminución de las
interacciones electrostáticas desfavorables que se establecen entre la envuelta
celular (cargada negativamente) y la enzima, cuando ésta actúa desde el exterior.
Todas estas mutaciones se encuentran fuera de las cavidades identificadas como
posibles sitios de unión en el CWBM, determinado en cada repetición mediante el
software Fpocket, tal y como se explica en las figuras 21B y C. Esta variante de
Cpl-7, denominada a partir de ahora como Cpl-7S, tiene una carga neta total com-
parable a las otras mureín-hidrolasas del sistema de neumococo (LytA: −14.57; Pal:
−10.57; Cpl-1: −14.82; Cpl-7S: −11.84).

!
 A
LTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDPQAVQDKVNEILN AREIAD
K K R N N
α-1 α-2 α-3

B D287N

D281N

A278R

L264K
C D273K

Fig. 21. Modificación de la carga neta del CWBM de Cpl-7. (A) Distribución de los aminoácidos
sustituidos a lo largo de la secuencia de CW_7. La fila de arriba muestra la secuencia de ami-
noácidos de un módulo de repetición de Cpl-7 así como el linker de unión entre módulos, con los
residuos ácidos y básicos marcados en rojo y azul, respectivamente. Las posiciones mutadas se
representan subrayadas indicando en la parte inferior el aminoácido por el cual ha sido sustituido
(en azul, los aminoácidos básicos y, en verde, los neutros). Las cajas grises muestran las regio-
nes conservadas en la familia CW_7 (PF08230). (B) Modelo tridimensional de la segunda repeti-
ción del CWBM de Cpl-7 (Bustamante et al., 2010). En azul se representan los residuos sustitui-
dos por aminoácidos básicos y, en verde, los Asp sustituidos por Asn. (C) Modelo de superficie
molecular de la misma repetición coloreada de acuerdo a su potencial electrostático en Cpl-7 (iz-
quierda) y Cpl-7S (derecha) (rojo para los residuos ácidos y azul para los básicos). La cavidad de
unión al sustrato identificado mediante el software Fpocket, se representa con unas pequeñas es-
feras amarillas.
 Carga neta
Número de aminoácidos Proteína
0 100 200 300 400 ZCWBM ZTotal
Nt# Ct#
−14.93 −29.77 Cpl-7

+3.00 −11.84 Cpl-7S

Familia GH_25 CW_binding_7 CW_binding _7

(PF01183) (PF08230) modificado

Fig. 22. Carga neta de los CWBMs y de las proteínas enteras de Cpl-7 y Cpl-7S.

4.2. Caracterización físico-química de Cpl-7S

Una vez determinadas las mutaciones en las repeticiones CW_7 se decidió sinteti-
zar el correspondiente fragmento de DNA que codificara la enzima Cpl-7S. Además,
se aprovechó el proceso de síntesis para optimizar el uso de codones para E. coli
con lo que, al mismo tiempo, se rompía la identidad de secuencia de nucleótidos
entre las tres repeticiones CW_7 (Fig. 23). Asimismo, se añadieron los sitios de
restricción NdeI y PstI en posiciones 5’ y 3’, respectivamente, para su posterior clo-
nación en el vector pT7-7. El fichero con los nucleótidos a sintetizar (fragmento 1)
se envió a la empresa ATG: Biosynthetics (Merzhausen, Alemania), que generó un
plásmido recombinante (pGH-fragmento1) derivado de un vector pUC. A continua-
ción, este plásmido recombinante se cortó con NdeI y PstI y se ligó al plásmido
pT7-7 digerido con las mismas enzimas (Fig. 24). Este nuevo plásmido conteniendo
el gen sintético, llamado pTRD750, se transformó en la cepa BL21(DE3) de E. coli
para inducir el gen e hiperproducir Cpl-7S. Esta proteína se purificó de acuerdo a lo
descrito en el apartado 6.1 de Materiales y Métodos y, con ella, se realizaron los
diferentes ensayos de caracterización físico-química, así como los experimentos de
actividad bactericida sobre diferentes bacterias.

!
 CW_7 (1)
CWBM7 L T T V A N E V I Q G L W G N G Q E R Y D S L A N A G Y D P Q A V!
CTTACCACAGTAGCCAACGAGGTCATTCAGGGACTTTGGGGCAACGGTCAAGAACGTTATGACAGTTTAGCGAATGCAGGGTATGACCCCCAAGCGGTT!
!
CTGACGACCGTTGCGAATGAAGTTATCCAAGGTAAATGGGGTAATGGCCAGGAGCGCTACAAATCTCTGGCCAACCGTGGTTACAATCCGCAGGCCGTG!
CWBM7S L T T V A N E V I Q G K W G N G Q E R Y K S L A N R G Y N P Q A V!
linker CW_7 CW_7 (2)
CWBM7 Q D K V N E I L N A R E I A D L T T V A N E V I Q G L W G N G Q E!
CAAGACAAAGTGAATGAAATCTTAAACGCTAGAGAAATTGCAGACCTTACCACAGTAGCCAACGAGGTCATTCAGGGACTTTGGGGCAACGGTCAAGAA!
!
CAGAATAAAGTTAACGAGATTCTGAATGCGCGTGAGATCGCGGATCTCACTACGGTGGCAAACGAAGTGATTCAAGGCAAGTGGGGGAACGGGCAGGAA!
CWBM7S !Q N K V N E I L N A R E I A D L T T V A N E V I Q G K W G N G Q E!
linker CW_7

CWBM7 R Y D S L A N A G Y D P Q A V Q D K V N E I L N A R E I A D L T T!
CGTTATGACAGTTTAGCGAATGCAGGGTATGACCCCCAAGCGGTTCAAGACAAAGTGAATGAAATCTTAAACGCTAGAGAAATTGCAGACCTTACCACA!
!
CGGTACAAGTCCTTGGCAAACCGCGGCTACAACCCACAGGCAGTACAGAACAAGGTAAACGAAATCTTGAACGCTCGCGAAATTGCTGACCTTACCACA!
CWBM7S !R Y K S L A N R G Y N P Q A V Q N K V N E I L N A R E I A D L T T!
CW_7 (3)
CWBM7 V A N E V I Q G L W G N G Q E R Y D S L A N A G Y D P Q A V Q D K !
GTAGCCAACGAGGTCATTCAGGGACTTTGGGGCAACGGTCAAGAACGTTATGACAGTTTAGCGAATGCAGGGTATGACCCCCAAGCGGTTCAAGACAAA!
!
GTAGCCAATGAGGTCATTCAGGGAAAATGGGGCAACGGTCAAGAACGTTATAAAAGTTTAGCGAATCGAGGGTATAATCCCCAAGCGGTTCAAAATAAA!
CWBM7S !V A N E V I Q G K W G N G Q E R Y K S L A N R G Y N P Q A V Q N K!
!

CWBM7 V N E L L S * !
GTGAATGAATTACTTTCATAA!
!
GTGAATGAATTACTTTCATAA!
CWBM7S ! V N E L L S *!

Fig. 23. Optimización del uso de codones en el módulo CWBM7S. Los nucleótidos con fondo rojo indican las modificaciones con
respecto al gen parental, cwbm7; los aminoácidos con fondo azul indican las modificaciones con respecto a la proteína parental,
cwbm7; en verde se indican las repeticiones CW_7 y en naranja los linkers de unión entre las diferentes repeticiones CW_7.

!
 NdeI
MCS!

MCS!
cpl-7S

pGH-fragmento1 pT7-7

PstI!
AmpR! AmpR!
MCS!

NdeI / PstI
+
Ligación

NdeI

cpl-7S

pTRD750
!!! !
!!!!!!!!!!!
PstI!
AmpR!

!
Fig. 24. Representación esquemática de la construcción del plásmido pTRD750. El plásmido recombi-
nante pGH-fragmento1 y el vector pT7-7 se cortaron con NdeI y PstI y, después de la ligación, se obtuvo
el nuevo plásmido pTRD750. Por simplificar, sólo se muestran algunas de las dianas de restricción.
MCS, Sitio múltiple de clonación o MultiCloning Site.

En colaboración con el grupo de la Dra. Margarita Menéndez se realizaron dife-

rentes estudios con la finalidad de determinar la conservación estructural de Cpl-7S.
Para ello, una vez purificada esta enzima según lo descrito en Materiales y Méto-
dos, se comprobó por dicroísmo circular que los espectros obtenidos de Cpl-7S a
20°C en un tampón fosfato pH 7.0 tanto de Cpl-7S como de la proteína parental
Cpl-7 eran superponibles confirmando que las estructuras secundarias y terciarias
eran comparables entre ambas enzimas. Además, experimentos de ultracentrifuga-
ción analítica mostraron que, a todas las concentraciones de Cpl-7S ensayadas,
!
ésta sedimentó como una muestra monodispersa con un coeficiente! !!",! !!de 2.93
S, correspondiente al monómero de la proteína (≈ 38.8 kDa) (M. Menéndez, comu-
nicación personal).!

!
 Una de las vías clásicas para determinar las propiedades enzimáticas de las mu-
reín-hidrolasas de neumococo ha sido el ensayo de dichas enzimas con paredes
purificadas de neumococo marcadas con colina tritiada como sustrato (Mosser y
Tomasz, 1970). Este método es sencillo, rápido y de mucha sensibilidad pues basta
muy poca cantidad de proteína para detectar actividad lítica. Inicialmente, se reali-
zaron ensayos de actividad enzimática in vitro con dichas paredes, en un tampón
estándar de 20 mM fosfato pH 6.0. En estas condiciones, tanto Cpl-7 como Cpl-7S
4 −1
presentaron actividades específicas muy parecidas (Cpl-7: 6.2 × 10 U mg ; Cpl-
4 −1
7S: 6.5 × 10 U mg ). Sin embargo, en este ensayo, el acceso al sustrato de la
enzima se ve facilitado al máximo ya que se emplean fragmentos heterogéneos de
pared y, por tanto, los resultados pueden ser distintos de los obtenidos cuando se
añade directamente la enzima purificada a una suspensión con bacterias intactas.
Por ello, una alternativa para estudiar el efecto de diferentes condiciones sobre la
actividad de un enzibiótico es añadir dicha enzima sobre una suspensión de bacte-
rias vivas (Lood et al., 2014). Así, se investigó el efecto de diferentes parámetros
sobre la actividad bacteriolítica de Cpl-7S, utilizando como sustrato neumococos
resuspendidos en PBS ajustado a diferentes condiciones, midiendo la diferencia de
turbidez entre el control y los tratamientos a DO550 entre las muestras control y las
tratadas durante la incubación de 1 h a 37°C.
Como se había descrito que la actividad de varias lisinas de fagos se incremen-
taba en presencia de concentraciones bajas de cationes divalentes (Celia et al.,
2008), se incubó Cpl-7 con bacterias y PBS en presencia de diferentes concentra-
ciones de CaCl2 y MgCl2 pero, en este caso, no se observaron diferencias significa-
tivas en la actividad (Fig. 25C y D). Se probaron también otros parámetros de posi-
ble influencia sobre Cpl-7S como pH, NaCl, EDTA, detergentes y diferentes tempe-
raturas. Los resultados obtenidos mostraron que Cpl-7S presentaba su mayor acti-
vidad en un rango de pH comprendido entre 5.0 y 7.5 siendo el valor óptimo 6.0,
disminuyendo notablemente a valores superiores de pH 7.5 o inferiores a 5.0 (Fig.
25A). Asimismo, la adición de NaCl en el rango de 0–200 mM no afectó a la activi-
dad de la lisozima (Fig. 25B) ni tampoco la presencia de EDTA en el medio (Fig.
26C). En cuanto a los detergentes, se comprobó que el Tritón X-100 no tenía de-
masiada influencia en un rango de 0–1% (Fig. 26B) mientras que el SDS a bajas
concentraciones no afectaba a Cpl-7S pero, a partir de 0.01%, su actividad bacte-
riolítica resultaba notablemente inhibida (Fig. 26A). La temperatura óptima de ac-
tuación de Cpl-7S fue 37°C (coincidente con la de Cpl-7 y Cpl-1). Respecto al efec-
to de la estabilidad térmica de Cpl-7S, la enzima se incubó durante 7 días a 4°C, ≈
25°C y 37°C antes de ensayarse a su temperatura óptima, siguiendo el protocolo
estándar. Se observó que la enzima sometida a las diferentes temperaturas era
muy estable térmicamente, presentando únicamente un descenso del 6–10% (Fig.
27). Debido a que su actividad bacteriolítica apenas se vio afectada durante varios
días en estas condiciones y con el fin de analizar la estabilidad de Cpl-7S durante
un tiempo de incubación prolongado a una misma temperatura, se mantuvo la en-
zima durante 7 días a una temperatura de ≈ 25°C pero, esta vez, se comprobó la
capacidad bactericida remanente siguiendo el protocolo estándar. Se observó que
Cpl-7S, en estas condiciones, sólo perdió ≈ 1 unidad logarítmica de su capacidad
bactericida (Fig. 28).
En resumen, se ha demostrado que la proteína Cpl-7S es estable en un amplio
intervalo de valores de pH (5.5–7.0), activa en presencia o ausencia de cationes
divalentes y mantiene la mayor parte de su actividad enzimática después de una
incubación a 37°C, al menos, 7 días. Todos estos resultados sugerían que Cpl-7S
debería ser activa en un entorno in vivo durante un tiempo prolongado y, por lo tan-
to, podría tener un potencial uso terapéutico.

!
 A B
100# *# *# *# *# 100#
*# *# *# *# *# *#
75# *# *# *#
75#
*#
50# *# 50#

25# 25#

Descenso#de#DO550#(%)#
Descenso#de#DO550#(%)#
*#
0# 0#
Control# 4.5# 5.0# 5.5# 6.0# 6.5# 7.0# 7.5# 8.0# Control# 10# 20# 50# 100# 150# 200# 300# 500#

Cpl=7S# Cpl97S#
pH# (mM)%
C D
100# *# *# 100#
*# *# *# *# *#
*#
75# 75#

50# 50#

25# 25#

Descenso#de#DO550#(%)#
Descenso#de#DO550#(%)#
0# 0#
Control# 1# 2# 5# 10# 20# Control# 1# 2# 5# 10# 20#

Cpl67S# Cpl67S#
(mM)% (mM)%

2+ 2+
Fig. 25. Efecto del pH (A), de las concentraciones de NaCl (B), de Ca (C) y de Mg (D) sobre la actividad enzimática de Cpl-7S. Cultivos de
R6 se resuspendieron en PBS a diferentes pHs, concentraciones de NaCl y cationes divalentes, se ajustaron a una DO550 ≈ 0.6 y se añadieron
−1
5 µg ml de Cpl-7S, continuándose la incubación a 37°C durante 1 h. El porcentaje del descenso de DO550 al final de la incubación es el resul-
tado de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente
2+ 2+
significativos en relación al control (A: control sin Cpl-7S; B, C y D: ausencia de NaCl, Ca o Mg ). Se aplicó el test de ANOVA de una vía
seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

Representación esquemática de proteínas de origen bacteriano y fágico que contienen el módulo CW_7.

!
 A
100#

Descenso#de#DO550#(%)#
75#

50#
*# *# *# *# *#
25# *# *#

0#
Control# 0.01# 0.05# 0.08# 0.1# 0.2# 0.5# 0.8# 1#

Cpl:7S#
(%)$
B
100# *# *# *# *# *#
*#
Descenso#de#DO550#(%)#

75#

50#

25#

0#
Control# 0.01# 0.05# 0.08# 0.1# 0.2# 0.5# 0.8# 1#

Cpl:7S#
C (%)$
100# **# *# **# **# **# **# **#
# #
Descenso#de#DO550#(%)#

75#
# # # #

50#

25#

0#
Control# 1# 2# 5# 10# 20# 50# 100#

Cpl87S#
(mM)$

Fig. 26. Efecto de SDS (A), Tritón X-100 (B) y EDTA (C) sobre la actividad enzimática de Cpl-7S.
Cultivos de R6 se resuspendieron en PBS a diferentes concentraciones de SDS, Tritón X-100 y
−1
EDTA, se ajustaron a una DO550 de 0.6 y se añadieron 5 µg ml de Cpl-7S, continuándose la in-
cubación a 37°C durante 1 h. El porcentaje del descenso de DO550 al final de la incubación es el
resultado de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteris-
cos indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en ausencia
de SDS, Tritón X-100 o EDTA. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de
Dunnett; *, P <0.001.

!
 A B
100# *# *# *# *#
*# *# 100#
*# *# *# *#
Descenso#de#DO550#(%)#

Descenso#de#DO550#(%)#
75# 75#

50# 50#

25# 25#

0# 0#
Control# 1# 3# 5# 7# Control# 1# 3# 5# 7#

Cpl>7S# Cpl>7S#
Tiempo#(días)# Tiempo#(días)#

C
*# *# *#
100#
*# *#
Descenso#de#DO550#(%)#

75#

50#

25#

0#
Control# 1# 3# 5# 7#

Cpl>7S#
Tiempo#(días)#

Fig. 27. Efecto de la estabilidad térmica sobre la actividad enzimática de Cpl-7S. La enzima se
mantuvo a 4°C (A), temperatura ambiente (≈ 25°C) (B) o 37°C (C) durante varios días. Para cal-
cular la actividad remanente, cultivos de R6 se resuspendieron y ajustaron a una DO550 de 0.6, a
−1
los que se añadieron 5 µg ml de Cpl-7S que fueron tomados a distintos días y a diferentes tem-
peraturas de incubación, siguiéndose el protocolo estándar de valoración enzimática. El porcen-
taje del descenso de DO550 al final de la incubación es el resultado de 3 experimentos indepen-
dientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son esta-
dísticamente significativos en relación al control con Cpl-7S. Se aplicó el test de ANOVA de una
vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.
 8"

6" *"

Log10"UFC"ml–1"
*"
4"

2"

Control" 0" 7"

Cpl@7S"
Tiempo"(días)"

Fig. 28. Efecto de la estabilidad térmica sobre la actividad enzimática de Cpl-7S. La enzima se
mantuvo a ≈ 25°C durante 7 días. Para calcular la actividad remanente, cultivos de R6 se resus-
−1
pendieron y ajustaron a una DO550 de 0.6, se añadieron 5 µg ml de Cpl-7S, continuándose la in-
cubación a 37°C durante 60 min y se determinaron las células viables en placas de agar-sangre.
Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y
los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en
ausencia de Cpl-7S. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P
<0.001.

!
5. ACTIVIDAD DE CPL-7S SOBRE S. PNEUMONIAE Y OTRAS BACTERIAS

Una vez estudiadas las diferentes características bioquímicas de Cpl-7S en un en-

sayo bacteriolítico sobre neumococo, se procedió a evaluar la actividad bactericida
de esta enzima sobre diferentes bacterias en comparación con la enzima parental
Cpl-7. Ya se ha comentado que, a pesar de presentar Cpl-1 y Cpl-7 (y también Cpl-
7S) actividades enzimáticas in vitro muy similares, es plausible que, cuando estas
enzimas se añaden exógenamente sobre células vivas de S. pneumoniae, su acti-
vidad podría variar considerablemente. Por ello, siguiendo el mismo protocolo que
en el apartado 3 de Resultados, se probó el efecto bacteriolítico y bactericida de las
lisozimas Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S sobre la cepa R6 (Fig. 29). Los resultados obtenidos
demostraron que la actividad bacteriolítica de Cpl-7S es bastante mejor que la de
Cpl-7, disminuyendo un 50% más la DO550 de la suspensión bacteriana que la co-
rrespondiente a la proteína parental (Fig. 29A). Sin embargo, cuando la compara-
ción se hacía examinando el efecto bactericida se comprobó que Cpl-7S no era tan
letal como Cpl-1 ya que, mientras ésta era capaz de esterilizar prácticamente el
3 -1
cultivo, Cpl-7S reducía hasta 5.1 × 10 UFC ml . No obstante, la enzima sintética
5 -1
era más eficaz que Cpl-7 pues ésta se quedaba en 6.2 × 10 ! UFC ml , es decir
había 2 unidades logarítmicas de diferencia entre los efectos bactericidas de Cpl-7
y Cpl-7S (Fig. 29B).
La notable capacidad bactericida de Cpl-1 se conseguía con una concentración
−1
tan baja como 1 µg ml , puesto que el número de células viables de R6 bajaba 8
unidades logarítmicas después de 60 min de incubación a 37°C. Aunque Cpl-7 y
Cpl-7S no llegaban a producir el mismo efecto bactericida que Cpl-1, se probó un
−1
rango de concentraciones de 1 a 50 µg ml observándose que, para obtener la
misma disminución de 8 unidades logarítmicas en el número de células viables, era
−1 −1
necesaria una concentración de 20 µg ml de la proteína Cpl-7S o 50 µg ml de
Cpl-7 (datos no mostrados).! Esto sugería que el cambio de carga de Cpl-7S mejora
de forma sustancial la actividad bactericida cuando se añade de forma exógena
sobre células vivas de S. pneumoniae R6, necesitando un 60% menos de Cpl-7S
que de Cpl-7 para tener el mismo efecto. En cualquier caso, estas dos lisozimas no
son tan activas como Cpl-1, la proteína más eficaz contra neumococo descrita has-
ta la fecha.
 A B

8"

0.6
*"

Log10"UFC"ml–1"
Control 6"

0.4
4" *"
550
DO550%

Cpl97
OD

0.2 2"
Cpl97S

Cpl91
0
4 10 15 30 45 60
*"

Cpl67S"
Control"

Cpl61"

Cpl67"
Time-(min)
Tiempo%(min)%

Fig. 29. Efecto bacteriolítico y bactericida de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S sobre la cepa R6 de neumo-
coco. (A) Cultivos de R6 se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en ausen-
−1
cia o presencia de 5 µg ml de los enzibióticos seleccionados, continuándose la incubación a
37°C durante 60 min. Los datos son representativos de 4 experimentos independientes. (B) Las
células viables se determinaron en placas de agar-sangre después de 60 min de incubación en
las mismas condiciones. Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las barras de
error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significati-
vos en relación al control en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía se-
guido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

5.1. Concentración mínima inhibitoria

Con el fin de evaluar la concentración más baja de Cpl-7 y Cpl-7S que es capaz de
inhibir el crecimiento bacteriano de forma visible entre 20–24 h de incubación a
37°C, se determinó la CMI utilizando los criterios del CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute) mediante el sistema de microdilución empleando la cepa de
neumococo ATCC 49619 y usando como control Cpl-1, cuyos resultados se habían
publicado previamente (Rodríguez-Cerrato et al., 2007a). Estos ensayos de suscep-
tibilidad se repitieron 5 veces (Tabla 11).

Tabla 11. CMI de los diferentes enzibióticos

Enzima CMI (µg ml−1)

Cpl-1 16 ± 4

Cpl-7 256 ± 50

Cpl-7S 64 ± 10

!
 Los valores de CMI obtenidos para las tres enzimas mantenían la correlación de
sus actividades bactericidas comparativas; es decir, Cpl-7S era 4 veces más eficaz
que Cpl-7 pero, a su vez, Cpl-1 era 4 veces más eficaz que Cpl-7S. Se puede afir-
mar, por tanto, que las actividades in vitro de estas tres enzimas son muy similares
cuando se ensayaban con paredes purificadas como sustrato, pero se diferencia-
ban sustancialmente cuando se probaban frente a bacterias vivas. En estos últimos
ensayos, los datos fueron bastante coincidentes, tanto si se empleaba la técnica de
CMI como si se añadía la enzima a las bacterias resuspendidas en PBS.

5.2. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes cepas de neumococo

Los datos comentados anteriormente demostraron que la proteína sintética Cpl-7S

mostraba una mayor actividad enzimática que Cpl-7 en el ensayo estándar, refleja-
da en un 50% más de disminución de DO550 de la suspensión bacteriana empleada
como sustrato y en la disminución de ≈ 2 unidades logarítmicas en el correspon-
diente número de células viables. Dada la existencia de distintos factores que pue-
den alterar la actividad bactericida y bacteriolítica de una enzima cuando se añade
de forma exógena (Neuhaus et al., 2003), se determinó también la posible influen-
cia de la diferente composición de CPS de neumococo sobre la actividad de los
diferentes enzibióticos. Para ello, se utilizaron 3 cepas con diferente serotipo capsu-
lar, la cepa D39 con cápsula de serotipo 2 y dos transformantes de la cepa M11 con
cápsulas de serotipos 3 (P007) o 4 (P008).
Los resultados pusieron de manifiesto que las tres enzimas probadas mantenían
el mismo patrón bactericida frente a los serotipos capsulares 2 y 4 que el observado
frente a la cepa no capsulada (Fig. 30). Así, Cpl-7S reducía una unidad logarítmica
más el número de células viables comparado con Cpl-7. Sin embargo, frente a la
cepa P007, de serotipo 3, la eficacia de Cpl-7S era sólo ligeramente mayor que Cpl-
7, lo que sugiere que el espesor, la composición química de la cápsula de tipo 3 o
ambas, podrían afectar más a la actividad lítica de la enzima sintética Cpl-7S que a
la natural. En este caso, el efecto bactericida de Cpl-7S provocó la disminución de 2
unidades logarítmicas, en vez de reducir la viabilidad al nivel de las cepas D39 y
P008. Cabe destacar que, frente a estas tres bacterias capsuladas, la eficacia bac-
tericida de Cpl-1 fue similar a la observada frente a la cepa R6 no capsulada.
Después de comprobar el efecto de Cpl-7S sobre la cepa no capsulada de labo-
ratorio y diferentes cepas capsuladas, se extendió el mismo tipo de análisis a algu-
nas estirpes de gran importancia clínica por presentar un espectro de multirresis-
tencia a varios antibióticos, como son las cepas 1515/97 (serotipo 6B) y 69 (serotipo
19F). De nuevo se pudo concluir que Cpl-7S mantenía una actividad bacteriolítica y
bactericida sobre estas dos cepas muy parecida a la observada en las otras, la R6
no capsulada y las capsuladas con serotipo 2 y 4 (Fig. 31). Por otra parte, es muy
notable que Cpl-1 tuvo en todos los casos un efecto drástico que prácticamente
esterilizaba los cultivos, excepto frente a la cepa 1515/97, en el que todavía queda-
−1
ban 86 UFC ml después de 60 min de incubación a 37°C.

8"

6" *" *" *" *"

Log10"UFC"ml–1"

*" *"
4"

2"

*" *" *"

Cpl.7S"
Cpl.1"

Control"
Cpl.7S"

Cpl.7S"
Cpl.7"

Control"

Cpl.7"
Control"

Cpl.7"

Cpl.1"
Cpl.1"

D39" P007" P008"

Fig. 30. Efecto bactericida de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S sobre diferentes cepas capsuladas de S.
pneumoniae. Cultivos de D39, P007 y P008 se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se
─1
incubaron en ausencia o presencia de 5 µg ml de los enzibióticos seleccionados, continuándose
la incubación a 37°C durante 60 min. Las células viables se determinaron en placas de agar-
sangre después de 60 min de incubación. Los datos son media de 4 experimentos independien-
tes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísti-
camente significativos en comparación con los controles en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el
test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

!
 A S.#pneumoniae#1515/97& B S.#pneumoniae#1515/97&

8&
0.6$ Control$
*&

Log10&UFC&ml–1&
6&
*&
0.4$
DO550$

4&
Cpl97$
0.2$ Cpl97S$
2& *&
Cpl91$

0$

Control&

Cpl61&

Cpl67&

Cpl67S&
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$
C D
10&
S.#pneumoniae#69# S.#pneumoniae#69#

0.6$ 8&
Control$
*&

Log10&UFC&ml–1&
6& *&
0.4$
DO550$

4&
Cpl97$
0.2$ Cpl97S$
0&
2&
Cpl91$
0$ *&
Control&

Cpl11&

Cpl17&

Cpl17S&
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$

Fig. 31. Efecto bacteriolítico y bactericida de diferentes lisozimas sobre dos cepas multirresisten-
tes neumocócicas. (A y C) Cultivos de 1515/97 (serotipo 6B) y 69 (serotipo 19F) se resuspendie-
−1
ron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en ausencia o presencia de 5 µg ml de Cpl-1,
Cpl-7 y Cpl-7S, continuándose la incubación a 37°C durante 60 min y siguiéndose la DO550. Los
datos son representativos de 4 experimentos independientes. (B y D) Las células viables se de-
terminaron en placas de agar-sangre después de 60 min de incubación. Los datos son media de
4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican
los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en ausencia de enzibió-
tico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.
 5.3. Estudios de unión de CWBM7S a diferentes especies bacterianas

Como ya se ha comentado, uno de los aspectos más relevantes de la proteína Cpl-

7 es su CWBM formado por tres repeticiones CW_7, que se encuentran presentes
en un elevado número de proteínas bacterianas y fágicas con funciones muy dispa-
res entre sí. Debido a que, en la naturaleza, se producen intercambios frecuentes
de fragmentos de DNA codificantes de módulos funcionales por transferencia hori-
zontal de genes permitiendo numerosas combinaciones de genes dentro de la po-
blación de fagos, Cpl-7 podría ser una quimera natural de origen intergenérico for-
mada por la fusión de dos fragmentos modulares: uno que codificaría el módulo
catalítico GH_25, presente en algunos fagos de neumococo y otro, de procedencia
desconocida, que codificaría el implicado en el reconocimiento y unión a la pared
celular. Ejemplos de estos genes quiméricos se encuentran en muchas bacterias y
fagos; un caso del sistema de neumococo lo representa la amidasa Pal del fago Dp-
1 (Sheehan et al., 1997).
Se ha descrito que la diana del CWBM de Cpl-7 se encuentra dentro del entra-
mado del peptidoglicano (Bustamante et al., 2010), por lo que se decidió comprobar
si este módulo era capaz de unirse a la pared celular de otras bacterias Gram-
positivas. Para ello, se clonó el fragmento codificante del CWBM de Cpl-7S
(CWBM7S) en una fusión traduccional con la proteína verde fluorescente (GFP),
ocupando ésta el extremo N-terminal de la correspondiente proteína de fusión (Fig.
8). Este tipo de estudios se ha descrito como una manera rápida y eficaz de deter-
minar de forma cualitativa la unión de un módulo de reconocimiento del sustrato de
una endolisina de origen fágico a diferentes bacterias (Loessner et al, 2002.; Sch-
melcher et al., 2010). Por ello, una vez obtenido el clon recombinante y purificada la
proteína de fusión (GFP-CWBM7S) se llevaron a cabo ensayos de unión en bacte-
rias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Estos estudios de unión se realiza-
ron mediante la observación de fluorescencia con un microscopio adecuado, donde
un resultado positivo significaba la unión efectiva de GFP-CWBM7S a la bacteria,
mientras que un resultado negativo quedaría reflejado en la ausencia de fluores-
cencia en la bacteria (Tabla 12). Como control, se corroboró que la proteína GFP
sola, en ausencia de CWBM7S, no mostraba unión a ninguna de las bacterias pro-
badas.
Entre las bacterias Gram-positivas a las que GFP-CWBM7S fue capaz de unirse,
aparte de neumococo, destacan otras del género Streptococcus como, por ejemplo,

!
S. pyogenes y S. mitis. En esta última especie se incluyen tanto una cepa que con-
tiene colina en sus TAs y LTAs (SK137) como otra que posee etanolamina (SK598).
La localización espacial de la fluorescencia debida a la unión de la proteína de fu-
sión era variable dependiendo de la bacteria localizándose, preferentemente, en las
zonas polares, o en el septo, en el caso de E. faecalis, P. acnes, S. pyogenes, S.
mitis SK598, S. equi subsp. zooepidemicus, S. sanguinis o S. gordonii. En cambio,
se observaba una distribución menos específica, a lo largo de la pared celular, en
los casos de S. uberis o S. suis (Fig. 32). Hay que señalar que P. acnes se ha des-
crito como uno de los patógenos causantes de numerosas infecciones en prótesis,
junto a otro Gram-positivo de gran importancia clínica como es S. aureus, al cual
dicha proteína no es capaz de reconocer (Ramage et al., 2003).
Tabla 12. Estudios de unión de GFP-CWBM7S a diferentes bacterias

Bacteria Unión Bacteria Unión

Bacillus anthracis 45 − Streptococcus pyogenes MGAS5005 +

Bifidobacterium adolescentisT! − Streptococcus porcinus +

Clostridium difficile! − Streptococcus mitis SK598 +

Corynebacterium jeikeiumT! − SK137 +

Enterococcus faecalisT! + B6 +

Lactococcus lactis subsp. lactisT! + 49 456 +

Mycobacterium smegmatis! mc2155! − Streptococcus mutans ! −

Propionibacterium acnes AD21 + Streptococcus rattus BHT +

Staphylococcus aureusT ! − Streptococcus sanguinis +

Staphylococcus epidermidis 414 − Streptococcus sobrinus −

Streptococcus agalactiaeT! − Streptococcus suis Serotipo 2 +

Streptococcus dysgalactiae
+ Streptococcus uberis +
subsp. equisimilisT!
Streptococcus equi subsp.
+ Acinetobacter baumanniia +b
zooepidemicus
Streptococcus iniaeT! + Klebsiella pneumoniaea +b

Streptococcus gordonii + Escherichia colia DH10B +b

Streptococcus pyogenesT! 12 344 + Pseudomas putidaa KT2442 +b

Las bacterias se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en presencia de 5 µg/pocillo de GFP-
CWBM7S. Las muestras se tomaron después de 60 min de incubación y se analizaron por microscopía de fluorescencia.
−, Indica que GFP-CWBM7S no se une a la bacteria.
+, Indica que GFP-CWBM7S se une a la bacteria.
a
, Bacterias Gram-negativas.
b
, Unión tras tratamiento con carvacrol 0.01%.
T
, Cepa tipo.

!
A B C
A B C
AA BB C C

D E F
D E F
D D E E FF

G H I

G H I

G H I
G H I
J K L

J K L

J K L
Fig. 32. Unión de GFP-CWBM7S a diferentes bacterias Gram-positivas o Gram-negativas. Las imá-
J K L
genes se tomaron con un microscopio de fluorescencia y son representativas de 4 experimentos in-
−1
dependientes. Los cultivos bacterianos se incubaron 60 min a 37°C en presencia de 5 µg ml de
GFP-CWBM7S junto a carvacrol 0.01%, en el caso de bacterias Gram-negativas (K y L). Como con-
trol se empleó la proteína GFP en ausencia de CWBM7S (imagen no mostrada). (A) S. pyogenes; (B)
E. faecalis; (C) S. mitis SK598; (D) S. equi subsp. zooepidemicus; (E) S. uberis; (F) S. porcinus; (G)
P. acnes; (H) S. sanguinis; (I) S. gordonii; (J) S. suis; (K) A. baumannii; (L) K. pneumoniae. Barra: 4
µm.
 La principal característica de las bacterias Gram-negativas es la presencia de la
membrana externa que actúa como una barrera protectora para la integridad celular
y presenta una permeabilidad selectiva frente a distintas sustancias. Ésta es la ra-
zón por la que los enzibióticos no han mostrado hasta ahora efectividad frente a los
patógenos Gram-negativos. Por ello, una posible estrategia para solventar dicho
inconveniente podría ser la utilización de los llamados aceites esenciales (Burt,
2004). Éstos afectan en cierta medida a la membrana externa produciendo una
desestabilización de la misma y facilitan de esta manera el paso de las enzimas a
través de la membrana y el acceso al peptidoglicano. A partir de esta idea, se incu-
baron a 37°C varias bacterias Gram-negativas (A. baumannii, E. coli, K. pneumo-
niae y P. putida) en presencia de tres aceites esenciales (eugenol, timol o carvacrol)
a diferentes concentraciones, comprobándose que la condición más adecuada para
este tipo de experimentos era utilizar carvacrol al 0.01%. A continuación, se añadió
la proteína de fusión GFP-CWBM7S a las bacterias incubadas en presencia de
carvacrol 0.01% siguiendo el protocolo descrito en el apartado 9 de Materiales y
Métodos. En la figura 32 se observa que, en estas condiciones, esta proteína era
capaz de unirse a las diferentes bacterias Gram-negativas probadas. Es destacable
que la fluorescencia obtenida con dos importantes patógenos, como son A. bau-
mannii y K. pneumoniae, se distribuye uniformemente a lo largo de toda la pared
celular.

5.4. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes bacterias Gram-

positivas

Una vez determinada la capacidad del módulo CWBM7S de unirse a una variedad
de bacterias, se evaluó la capacidad bactericida y bacteriolítica de la enzima com-
pleta Cpl-7S sobre bacterias Gram-positivas, siguiendo el mismo tipo de ensayo
explicado en el apartado 10 de Materiales y Métodos. Además, se aprovecharon
estos experimentos para comparar el poder bactericida de las lisozimas Cpl-1 y Cpl-
7 con respecto al de Cpl-7S.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 13 pudiéndose concluir de los
mismos que la adquisición del dominio CWBM7 confería tanto a Cpl-7 como a Cpl-
7S la capacidad de matar con elevada eficacia un buen número de bacterias no
neumocócicas, mostrando Cpl-7S una mejor actividad bactericida con respecto a
Cpl-7, como en los casos de S. pyogenes, la cepa SK137 de S. mitis y S. equi

!
subsp. zooepidemicus. Por el contrario, Cpl-1 se mostró totalmente ineficaz sobre
todas estas bacterias, con la excepción de la cepa SK137 de S. mitis cuyo número
de células viables disminuyó 4 unidades logarítmicas. Este hecho concuerda per-
fectamente con que Cpl-1 sólo actúa sobre bacterias que contienen colina y esta
cepa de S. mitis era la única de las probadas que contenía este aminoalcohol.

Tabla 13. Actividad bactericida de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S sobre bacterias Gram-positivas

Enzima

Bacteria Cpl-1 Cpl-7 Cpl-7S

Bacillus anthracis 45 − − −

Bifidobacterium adolescentisT − − +

Clostridium difficile − − −

Corynebacterium jeikeiumT − − −

Enterococcus faecalisT − ++ ++
Lactococcus lactis subsp.
− − −
lactisT
Mycobacterium smegmatis mc2155 − − −

Propionibacterium acnes AD21 − − −

Staphylococcus aureusT − − −

Staphylococcus epidermidis 414 − − −

Streptococcus agalactiaeT! − − −
Streptococcus dysgalactiae
− + +
subsp. equisimilisT,a !
Streptococcus equi subsp.
− + ++
zooepidemicus
Streptococcus gordonii − − −

Streptococcus iniaeT! − + +
−1
Las bacterias se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en presencia de 5 µg ml de Cpl-1,
Cpl-7 y Cpl-7S. Las células viables se determinaron después de 60 min de incubación.
−, Indica que la enzima no tiene efecto.
+, Indica que la enzima reduce una unidad logarítmica el número de células viables.
++, Indica que la enzima reduce dos unidades logarítmicas el número de células viables.
+++, Indica que la enzima reduce tres unidades logarítmicas el número de células viables.
++++, Indica que la enzima reduce cuatro o más unidades logarítmicas el número de células viables.
a
, Determinadas por microscopía de fluorescencia mediante kit BacLight.
T
, Cepa tipo.
Tabla 13. Actividad bactericida de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S sobre bacterias Gram- positivas (continuación)

Enzima

Bacteria Cpl-1 Cpl-7 Cpl-7S

Streptococcus mitis SK598 − ++ ++

SK137 ++++ +++ ++++

B6 − ++ ++

49 456 − − −

Streptococcus mutans ! − − −

Streptococcus porcinus − − −

Streptococcus pyogenes 12 344T! − +++ ++++

MGAS5005 − +++ ++++

Streptococcus rattus BHT − + +

Streptococcus sanguinis − − −

Streptococcus sobrinus − − −

Streptococcus suis Serotipo 2 − + +

Streptococcus uberis − − +
−1
Las bacterias se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en presencia de 5 µg ml de Cpl-1, Cpl-
7 y Cpl-7S. Las células viables se determinaron después de 60 min de incubación.
−, Indica que la enzima no tiene efecto.
+, Indica que la enzima reduce una unidad logarítmica el número de células viables.
++, Indica que la enzima reduce dos unidades logarítmicas el número de células viables.
+++, Indica que la enzima reduce tres unidades logarítmicas el número de células viables.
++++, Indica que la enzima reduce cuatro o más unidades logarítmicas el número de células viables.
T
, Cepa tipo.

A modo de ejemplo, se puede observar el efecto bacteriolítico y bactericida que

mostraron las tres lisozimas frente a dos patógenos humanos tan relevantes clíni-
camente como son S. pyogenes y E. faecalis. Sobre estas dos especies, Cpl-7S
mejora de forma sustancial el efecto bacteriolítico en comparación con la proteína
Cpl-7 (Fig. 33). Sin embargo, estas dos lisozimas no tuvieron el mismo comporta-
miento bactericida ya que, frente a S. pyogenes, Cpl-7S mataba mejor que Cpl-7,
mientras que frente a E. faecalis, no se observaron diferencias significativas dismi-
nuyendo ambas enzimas 2 unidades logarítmicas el número de células viables (Fig.

!
33D). Además de presentar actividad frente a estos dos patógenos, Cpl-7S fue ca-
paz de actuar sobre S. mitis, mostrando un gran efecto sobre la cepa que contiene
etanolamina en lugar de colina en la pared celular (SK598), disminuyendo 4 unida-
des logarítmicas, mientras que sobre S. dysgalactiae y S. iniae redujo un 90% las
−1
células viables tras incubar las bacterias 1 h a 37°C en presencia de 5 µg ml de la
enzima.
Hay que resaltar el caso del cálculo de células viables de S. dysgalactiae ya que,
al tratarse de una bacteria que forma cadenas de gran longitud, el contaje directo
de las UFC en placas de agar era inexacto, lo que se solventó con el empleo del kit
BacLight. Con este procedimiento se pudo evaluar el número exacto de bacterias
viables pues éstas aparecían con fluorescencia verde mientras que las bacterias no
viables emitían una fluorescencia roja.
Una vez más, y de manera análoga a lo observado en los ensayos con neumo-
coco, estos resultados demostraron que la enzima Cpl-7S era la lisozima más acti-
va cuando no existía colina en los TAs y LTAs de las bacterias.
 A B
8"
0.6$
S.#pyogenes# S.#pyogenes#

Log10"UFC"ml–1"
6"
Control$
0.4$ Cpl.1$ *"
4" *"
DO550$

Cpl.7$
0.2$
Cpl.7S$ 2"

0$

Control"

Cpl61"

Cpl67"

Cpl67S"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$

C D
10"
E.#faecalis# E.#faecalis#
0.6$
8" *" *"
Control$

Cpl91$ Log10"UFC"ml–1" 6"

0.4$ Cpl97$
DO550$

4" 0"
Cpl97S$
0.2$
2"

0$
Control"

Cpl61"

Cpl67"

Cpl67S"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$

Fig. 33. Efecto bacteriolítico y bactericida de lisozimas de fagos de neumococo sobre S. pyoge-
nes y E. faecalis. (A y C) Cultivos de S. pyogenes y E. faecalis se resuspendieron en PBS a una
−1
DO550 de 0.6 y se incubaron en ausencia o presencia de 5 µg ml de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S, con-
tinuándose la incubación a 37°C durante 60 min y siguiéndose la DO550. Los datos son represen-
tativos de 4 experimentos independientes. (B y D) Las células viables se determinaron en placas
de agar-sangre después de 60 min. Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las
barras de error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente
significativos en relación al control en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una
vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.05.

5.5. Actividad bactericida de Cpl-7S frente a diferentes bacterias Gram-

negativas

Como ya se ha comentado, una posible manera de sortear el impedimento que

supone la presencia de la membrana externa en bacterias Gram-negativas podría

!
ser mediante el empleo de aceites esenciales, concretamente con carvacrol, que se
ha mostrado como el más prometedor de todos los ensayados. Por ello, siguiendo
el mismo protocolo que en el apartado 10 de Materiales y Métodos, se probó el
efecto bactericida de la lisozima Cpl-7S sobre diferentes bacterias Gram-negativas.
Los resultados de la Tabla 14 indicaron que, en efecto, Cpl-7S era eficaz contra
bacterias Gram-negativas en presencia de carvacrol. Además, se observó que la
−1
tasa de muerte inducida por 5 µg ml de Cpl-7S, después de 60 min de incubación,
variaba dependiendo del organismo, siendo capaz de reducir una, dos o tres unida-
des logarítmicas en A. baumannii y K. pneumoniae, P. putida o E. coli DH10B, res-
pectivamente. Cuando estos datos se compararon con los de Cpl-7, ésta presentó
una actividad similar a la observada con Cpl-7S en P. putida, pues ambas enzimas
redujeron la viabilidad dos unidades logarítmicas, mientras que, en el resto de las
bacterias ensayadas, Cpl-7 presentó bien una eficacia mucho menor que Cpl-7S,
como en el caso de E. coli DH10B, o fue totalmente ineficaz como contra A. bau-
mannii o K. pneumoniae. Paralelamente, y como era de esperar, se comprobó que
Cpl-1 era completamente inactiva contra estas bacterias siguiendo el mismo proto-
colo anterior, por la inexistencia de colina en las paredes celulares de dichos micro-
organismos.

Tabla 14. Actividad bactericida de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S en bacterias Gram-negativas

Enzima

Bacteria Cpl-1 Cpl-7 Cpl-7S

Acinetobacter baumannii! ! − − +

Escherichia coli ! DH10B! − + +++

Klebsiella pneumoniae! ! − − +

Pseudomonas putida KT2442 − ++ ++

!
Las bacterias se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en presencia de carvacrol 0.01% y 5 µg
−1
ml de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S. Las células viables se determinaron después de 60 min de incubación.
−, Indica que la enzima no tiene efecto.
+, Indica que la enzima reduce una unidad logarítmica el número de células viables.
++, Indica que la enzima reduce dos unidades logarítmicas el número de células viables.
+++, Indica que la enzima reduce tres unidades logarítmicas el número de células viables.
++++, Indica que la enzima reduce cuatro o más unidades logarítmicas el número de células viables.
 Con el fin de analizar en mayor detalle el comportamiento de las diferentes li-
sozimas sobre la bacteria Gram-negativa en la que las diferencias eran más eviden-
tes (E. coli DH10B), se examinó la relación entre el descenso de DO550 y el número
de células viables, siguiendo el mismo protocolo que en la figura 32. De esta mane-
ra, se concluyó que a pesar de que las bacterias tratadas únicamente con 0.01%
carvacrol presentaban, después de 1 h de incubación, un descenso de un 30% en
DO550 con respecto a la bacteria sin tratamiento (Fig. 34A), el número de células
viables prácticamente no variaba entre ambos cultivos (Fig. 34B). Este casi nulo
descenso de la letalidad se daba igualmente cuando el cultivo de E. coli se trataba
con carvacrol y Cpl-1. Por el contrario, Cpl-7S fue capaz de disminuir sustancial-
mente la DO550 con respecto al control tratado únicamente con carvacrol. Esto se
tradujo en que, tras 1 h de tratamiento con estas dos lisozimas en presencia del
aceite esencial, Cpl-7S redujo 2 unidades logarítmicas más el número de células
viables que la proteína Cpl-7.

A B
8"
0.6$ Control$ *"
Log10"UFC"ml–1"

6"
Carvacrol$
0.4$
Cpl91$
4" *"
DO550$

Cpl97$
+$Carvacrol$
Cpl97S$
0.2$
2"

0$
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$ Control" Cpl61" Cpl67" Cpl67S"
Tiempo$(min)$

0.01%"Carvacrol"

Fig. 34. Efecto bacteriolítico y bactericida de lisozimas de fagos de neumococo sobre E. coli. (A) Cul-
tivos de E. coli DH10B se resuspendieron en PBS conteniendo 0.01% carvacrol a una DO550 de 0.6 y
−1
se incubaron en ausencia o presencia de 5 µg ml de Cpl-1, Cpl-7 y Cpl-7S, continuándose la incu-
bación a 37°C durante 60 min y siguiéndose la DO550. Los datos son representativos de 4 experimen-
tos independientes. (B) Las células viables se determinaron en placas de LB después de 60 min de
incubación. Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las barras de error representan
la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al con-
trol con 0.01% carvacrol en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido
de un test de Dunnett; *, P <0.05.

!
6. ACTIVIDAD BACTERICIDA DE CPL-7S EN UN MODELO ANIMAL DE INFECCIÓN

Sobre la base de los resultados de actividad enzimática in vitro e in vivo de Cpl-7S,

mencionados en el apartado anterior, el siguiente objetivo propuesto fue la valida-
ción de estos datos en un modelo animal de infección.
Se optó por dos modelos diferentes: un modelo alternativo al clásico de ratón y
relativamente nuevo para el estudio de la patogénesis por estreptococos, los em-
briones de pez cebra (Danio rerio) (Miller y Neely, 2004; Rounioja et al., 2012) y
otro más establecido para neumococo, como es el modelo murino de colonización
(Briles et al., 2005; Hernani Mde et al., 2011).

6.1. Modelo de embriones de pez cebra

Para estudiar la posible protección que podría ejercer la proteína sintética Cpl-7S
frente a la infección bacteriana en un modelo de embriones de pez cebra, se infec-
taron embriones de 72 hpf. Inicialmente, se verificó si las bacterias elegidas, la cepa
de origen clínico S. pneumoniae D39 y S. pyogenes, eran viables en el medio E3 en
un rango de temperaturas que oscilaba entre 25°C y 30°C, margen de temperatura
óptima para estos embriones. Se demostró que, efectivamente, ambas bacterias se
mantenían viables durante horas en dicho medio (datos no mostrados), eligiéndose
finalmente la temperatura de 28.5°C (óptima para un desarrollo normal del em-
brión). Del mismo modo, se llevaron a cabo una serie de experimentos sobre los
embriones con el fin de determinar la concentración de bacteria necesaria para
matar, al menos, un 50% de ellos. Este objetivo resultó bastante complicado de
ajustar ya que una elevada dosis de bacteria provocaba la muerte del 50% de em-
briones pero, simultáneamente, el aumento de turbidez en el medio afectaba tanto
al desarrollo como a la supervivencia de los mismos (Westerfield, 2007), por lo que
la muerte no puede ser asignada únicamente a la acción de la bacteria sino también
a la disminución de oxígeno presente en el medio. Por ello, para determinar exac-
tamente dicha dosis se añadieron como controles las mismas concentraciones de
bacterias muertas por calor (10 min a 65°C), determinándose que la dosis adecua-
8 −1
da para el estudio era 1 × 10 UFC ml para ambas especies (datos no mostrados).
 100#

Supervivencia#(%)# *#
75#
*#
50#

25#

0#
Control#

Control#
+#Cpl97S#

–#

Cpl97S#

–#

Cpl97S#
S.#pneumoniae# S.#pyogenes#

Fig. 35. Infección por patógeno en el modelo de embrión de pez cebra. Supervivencia de los em-
briones de pez cebra infectados con S. pneumoniae o S. pyogenes, tratados o no con 25 µg de
Cpl-7S (n = 24–36 embriones/condición) después de 7 h post-infección. Los datos son media de
4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican
los valores que son estadísticamente significativos en comparación con los controles en ausencia
de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

Una vez determinada la dosis y la temperatura óptima del ensayo, los embriones
8 −1
se pusieron en contacto con 1 × 10 UFC ml de cada especie mediante la técnica
de inmersión en el medio específico E3 durante 7 h a 28.5°C, usando como contro-
les las bacterias muertas por calor. Posteriormente, los embriones se lavaron ex-
haustivamente (12 veces) con el mismo medio y se trataron con 25 µg de Cpl-7S, o
el volumen correspondiente de tampón fosfato pH 6.0, como se detalla en Materia-
les y Métodos.
Como se puede deducir de los datos obtenidos, la tasa de mortalidad de los em-
briones fue significativa en las muestras que contenían la bacteria, 28.7% de morta-
lidad para S. pneumoniae y 35% para S. pyogenes (Fig. 35), observándose diferen-
tes cambios morfológicos en el transcurso del tiempo dependiendo del patógeno.
Así, por ejemplo, los embriones expuestos a S. pneumoniae D39 mostraron infla-
mación en diferentes partes del cuerpo (principalmente el corazón y el hígado) y la
muerte se produjo a las 96 hpi, mientras que los embriones tratados con S. pyoge-
nes sí mostraron una necrotización aparente sin ninguna deformación visible, mu-

!
riendo transcurridas 24 hpi.
Entre las diversas cepas de neumococos analizadas (ya sean encapsuladas o
no), D39 era la cepa más letal. Es interesante hacer notar que S. pneumoniae R6
(cepa no capsulada) era prácticamente avirulenta, confirmando que, como en los
seres humanos y modelos animales de infección neumocócica descritos hasta la
fecha, la cápsula es también un factor de virulencia esencial en este modelo de pez
cebra.
La adición de una dosis única de 25 µg de Cpl-7S protegía a los embriones in-
fectados de la muerte, alcanzando una notable tasa de supervivencia (99% para el
neumococo y el 95.3% para S. pyogenes) (Fig. 35). Cabe destacar que en este
mismo tipo de ensayo, la enzima Cpl-1 produjo, en los embriones infectados con S.
pneumoniae el mismo nivel de protección, pero no hubo ninguna protección en los
embriones infectados con S. pyogenes y tratados con Cpl-1 (datos no mostrados).
Por último, para asegurar que la infección bacteriana era la causa real de la
muerte de los embriones, se determinó la localización de S. pneumoniae en los
embriones mediante técnicas de inmunohistoquímica analizadas por CLSM. De
esta manera, mediante el uso de un anticuerpo policlonal que reconoce el polisacá-
rido capsular de la cepa D39 como anticuerpo primario y el secundario marcado con
Alexa flúor 568, se pudieron detectar las señales específicas de fluorescencia co-
rrespondientes a los neumococos y confirmar la internalización de dichas señales
en la zona perteneciente a las branquias (Fig. 36B y C), una fluorescencia que no
se observó en el control (Figs. 36A y 37). No obstante, tanto en los embriones con-
trol como en los infectados eran patentes unas señales en la zona de los ojos, pro-
bablemente debido a su alto contenido en células pigmentarias que producen una
fluorescencia basal inespecífica (Fig. 36).
 A B C

!
Fig. 36. Localización de S. pneumoniae D39 en embriones de pez cebra infectados. Imágenes representativas de embriones de
pez cebra tras 48 h post-infección (5 días post-fertilización) analizadas mediante CLMS. Células D39 (fluorescencia roja) se marca-
ron con un anticuerpo policlonal que reconoce el polisacárido capsular neumocócico tipo 2. Se construyeron las proyecciones
máximas de 15 capas-z a partir de imágenes de fluorescencia y contraste de fases. Los paneles superiores, fluorescencia roja
(bacteria); paneles inferiores, superposición de las imágenes de luz transmitida y fluorescencia roja (bacteria). (A) Embriones con-
trol de 5 días post-fertilización libres de bacteria (Objetivo 20×; detalle de las branquias en figura 37). (B) Cabeza de embrión de
pez cebra infectado con S. pneumoniae (Objetivo 20×). (C) Detalle de la infección de S. pneumoniae alrededor de las branquias
(Objetivo 40×). Barra (A y B): 250 µm; (C): 25 µm.
!
 A B

Fig. 37. Imágenes representativas de embriones de pez cebra usados como control sin infectar.
Se construyeron las proyecciones máximas de 15 capas-z a partir de imágenes de fluorescencia
y contraste de fases. (A) Embriones libres de bacteria en ausencia de anticuerpos (Objetivo 20×),
tratados como en la figura 36. (B) Detalle alrededor de las branquias (Objetivo 40×). Barra: 250
µm.

6.2. Modelo murino de colonización intranasal

La elección de la vía intranasal para un modelo de infección se justifica por su rapi-

dez y sencillez de ejecución, que convierte a esta técnica en especialmente indica-
da para utilizarla en un numeroso grupo de animales de experimentación. Los resul-
tados publicados tanto por Wu y cols. (1997) como por Lizcano y cols. (2010) admi-
nistrando S. pneumoniae por vía IN no difieren de los obtenidos en nuestro labora-
torio, en este caso obtenidos por la inoculación IP (Jado et al., 2003; Rodríguez-
Cerrato et al., 2007a, b), más allá de lo que sería atribuible a la mera utilización de
distintas cepas bacterianas y de ratón.
Con el fin de investigar el papel protector de Cpl-7S en una infección mixta pro-
vocada por S. pneumoniae y S. pyogenes, se puso a punto un modelo experimental
murino de colonización IN, utilizando grupos de 7 ratones hembras C57BL/6 de 4 a
6 semanas de edad. Inicialmente, se determinó la dosis letal mínima y se evaluó si
ésta era capaz de producir una colonización prolongada. Para ello, las cepas S.
pneumoniae D39_IU y S. pyogenes MGAS5005 se inocularon por vía IN y se calcu-
ló el número de bacterias presentes mediante recuento de células viables en la
cavidad nasal de los ratones tras 24 h. Las tasas de colonización se mantuvieron
relativamente constantes a lo largo de los 7 días de seguimiento, obteniéndose
 4 −1
niveles de bacteria que oscilaban entre 3.5 × 10 UFC ml para S. pneumoniae y
3 −1
7.2 × 10 UFC ml para S. pyogenes. Además, se sacrificó un animal por día para
recoger muestras de pulmón sin detectar la presencia de bacterias en ellos, com-
probándose así que los animales no desarrollaban neumonía (datos no mostrados).
−1
A las 48 hpi y tras administrar, a las 24 hpi, 120 µg ml de Cpl-7S en grupos in-
fectados con S. pneumoniae D39_IU o S. pyogenes MGAS5005, esta enzima mos-
tró una elevada capacidad protectora, reduciendo 3 y 1.5 unidades logarítmicas el
número de células viables de S. pneumoniae y S. pyogenes, respectivamente (Fig.
38A y B). En el caso de infecciones mixtas, Cpl-7S únicamente fue capaz de mos-
trar una elevada eficacia sobre S. pyogenes reduciendo en 2 unidades logarítmicas
el número de bacterias, mientras que, en el caso de S. pneumoniae, apenas tuvo
efecto reduciendo únicamente un 70% de bacterias (Fig. 38C).
Para analizar el mayor grado de efectividad de Cpl-7S sobre S. pyogenes en una
infección mixta, se llevó a cabo un experimento in vitro ensayando tres concentra-
−1
ciones diferentes de la enzima (5, 2.5 y 1.25 µg ml ), siguiendo el mismo protocolo
utilizado en la infección in vivo. De nuevo, la mayor eficacia de Cpl-7S sobre S.
pyogenes fue similar a la obtenida in vivo, lo que indicaba que esta enzima sigue
manteniendo una mayor afinidad por S. pyogenes que por S. pneumoniae en un
cultivo mixto (Fig. 39).

!
 A B
S.#pneumoniae##D39_IU#
S.#pneumoniae##D39_IU# S.#pyogenes#MGAS5005#
6'

Log10'UFC'ml–1'
4' 4"

Log10"UFC"ml–1"
2'
*' 2" *"

Control"

Cpl37S"
Control'

Cpl)7S'

C
Infección(mixta(
6"
Log10"UFC"ml–1"

4"

2" *"
Control"

Cpl47S"

Control"

Cpl47S"

S.#pneumoniae# S.#pyogenes#

Fig. 38. Infección por patógeno en el modelo murino de colonización intranasal. (A) Colonización
intranasal a las 48 h post-infección en ratones infectados con S. pneumoniae D39_IU y tratados
−1
con 120 µg ml de Cpl-7S a las 24 h post-infección (barras blancas) o sin tratamiento enzimático
(barras negras). (B) Colonización intranasal a las 48 h post-infección en ratones infectados con
−1
S. pyogenes MGAS5005 y tratados con 120 µg ml de Cpl-7S a las 24 h post-infección (barras
blancas) o sin tratamiento enzimático (barras negras). (C) Colonización intranasal mixta a las 48
h post-infección en ratones infectados con S. pneumoniae D39_IU y S. pyogenes MGAS5005 tra-
−1
tados con 120 µg ml de Cpl-7S a las 24 h post-infección (barras blancas) o sin tratamiento en-
zimático (barras negras). Los datos representan la media de 3 experimentos independientes rea-
lizados en las mismas condiciones. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican
los valores que son estadísticamente significativos en comparación con los controles en ausencia
de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.
 A
S.#pneumoniae##D39_IU# S.#pyogenes#MGAS5005# Infección3mixta3
10" 10" 10"

8" 8" 8"

*" *"

Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"
6" 6" 6"
*" *"
4" 4" 4"

2" Control" 2" 2"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"
S.#pneumoniae# S.#pyogenes#
B
S.#pneumoniae##D39_IU# S.#pyogenes#MGAS5005# Infección3mixta3
10" 10" 10"

8" 8" 8"

*" *"
Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"
6" 6" 6"

4" 4" 4"

2" 2" 2"

Control"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"

Control"

Cpl67S"
S.#pneumoniae# S.#pyogenes#
C
S.#pneumoniae##D39_IU# S.#pyogenes#MGAS5005# Infección3mixta3
10" 10" 10"

8" 8" 8"

Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"

Log10"UFC"ml–1"

6" 6" 6"

4" 4" 4"

2" 2" 2"

Control"

Cpl57S"

Control"

Cpl57S"

Control"

Cpl57S"

Control"

Cpl57S"

S.#pneumoniae# S.#pyogenes# !
Fig. 39. Efecto bactericida de Cpl-7S sobre cultivos mixtos de S. pneumoniae D39_IU y S. pyo-
genes MGAS5005. Las bacterias se incubaron a 37°C en PBS (DO550 ≈ 0.6) y se trataron 60 min
−1
con 5 (A), 2.5 (B) o 1.25 µg ml de Cpl-7S (C). Los datos representan la media de 4 experimen-
tos independientes realizados en las mismas condiciones. Las barras de error representan la DS
y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significativos en comparación con
los controles en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un
test de Dunnett; *, P <0.01.

!
7. CONSTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS QUIMÉRICAS A PARTIR DE CPL-1 Y CPL-7S

Las endolisinas fágicas se han especializado, a través de la evolución, en causar

una lisis rápida y eficiente de la célula huésped, una vez que todos los viriones se
han terminado de formar en el citoplasma, asegurando así la supervivencia del fa-
go. Sin embargo, esto no implica que no se pueda pensar en mejorar la actividad de
una determinada enzima para usarla como enzibiótico, es decir añadirla externa-
mente con mayor actividad bactericida que la correspondiente enzima parental.
Con este objetivo, se planteó la síntesis de los fragmentos de DNA codificantes
de nuevas enzimas quiméricas resultantes de intercambiar tres elementos estructu-
rales de las lisozimas más activas estudiadas en esta Tesis, Cpl-1 y Cpl-7S: los
módulos catalíticos, los módulos de unión a pared y los linkers. En la figura 40 se
muestra un esquema de las enzimas parentales y de las cuatro nuevas proteínas
quiméricas construidas, así como los valores de las cargas netas de cada elemento
estructural y de la proteína completa.

Carga neta
Número de aminoácidos Proteína Origen
0 100 200 300 400 ZCM Zlink ZCWBM ZTotal
Nt# Ct#

−9.86 −3.98 −0.98 −14.82 Cpl-1 Fago lítico

−10.86 −3.98 +3.00 −11.84 Cpl-7S

−10.86 −3.98 −0.98 −15.82 Cpl-711

−10.86 −3.98 −0.98 −15.82 Cpl-771 Sintético

−9.86 −3.98 +3.00 −10.84 Cpl-117S

−9.86 −3.98 +3.00 −10.84 Cpl-177S

Familia GH_25 (Cpl-7) Linker Cpl-7 CW_binding _7

(PF01183) modificado

Familia GH_25 (Cpl-1) Linker Cpl-1 CW_binding_1

(PF01183) (PF01473)

Fig. 40. Representación esquemática y carga neta de las lisozimas parentales y las quimeras
construidas sintéticamente a partir de sus fragmentos de DNA correspondientes. ZCM, carga neta
del módulo catalítico; Zlink, carga neta del linker; ZCWBM, carga neta del módulo de unión a sustra-
to; Ztotal, carga neta total.
 7.1. Estudios de actividad enzimática de las quimeras

Aunque la actividad antimicrobiana de algunas de las enzimas parentales está do-

cumentada, las variaciones que introducen las combinaciones de módulos realiza-
das en las lisinas quiméricas no son totalmente previsibles por lo que, una vez
puesto a punto el mejor protocolo para la producción de cada una de estas mureín-
hidrolasas en E. coli, se purificaron las correspondientes proteínas y se llevaron a
cabo ensayos de actividad enzimática, tanto in vitro como in vivo.
En primer lugar, se valoraron las enzimas purificadas con paredes de neumoco-
co marcadas radiactivamente, en un tampón fosfato a pH 6.0. El resultado puso de
manifiesto que todas ellas, tanto las de origen fágico como las quimeras de origen
sintético, presentaban una actividad específica muy similar y dentro del mismo or-
den de magnitud (Tabla 15).

Tabla 15. Actividad enzimática in vitro sobre paredes ra-

diactivas de las diferentes lisozimas

Enzima Actividad específica (U mg−1)

Cpl-1 8.0 × 104

Cpl-7S 6.5 × 104

Cpl-711 7.25 × 104

Cpl-771 9.5 × 104

Cpl-117S 4.65 × 104

Cpl-177S 6.75 × 104

!

A continuación, y teniendo en cuenta los resultados previos obtenidos en esta

Memoria, se ensayaron las diferentes enzimas sobre un cultivo de neumococo R6,
−1
a una concentración de 5 µg ml por ser a ésta en la que se observaban diferen-
cias significativas. Los ensayos se hicieron según el mismo protocolo explicado en
el apartado 5 de Resultados.

!
 8"
Log10"UFC"ml–1"
6"

4" *" *" *"

2"

*" *" *"

Cpl6177S"
Cpl6771"

Cpl6117S"
Cpl6711"
Control"

Cpl61"

Cpl67S"

Fig. 41. Efecto bactericida de las diferentes enzimas sobre la cepa R6 de neumococo. Las
células viables se calcularon después de 60 min de incubación a 37°C en ausencia (control)
−1
o presencia de las diferentes enzimas (5 µg ml ), siguiendo el protocolo estándar. Los datos
son media de 4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los as-
teriscos indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en
ausencia de enzima. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *,
P <0.001.

Los resultados demostraron que la actividad bactericida de las quimeras estaba

estrechamente relacionada con la naturaleza del módulo de su CWBM (Fig. 41). El
efecto bactericida de Cpl-711 y Cpl-771, que presentan un CBD, era similar al ob-
servado con la proteína parental Cpl-1; por el contrario, tanto Cpl-117S como Cpl-
177S, ambas con un CWBM7S, mostraron una actividad bactericida similar a la de
la proteína Cpl-7S. Después de corroborar el efecto drástico que producían Cpl-1,
−1
Cpl-711 o Cpl-771 a 5 µg ml sobre la cepa R6 de neumococo, se decidió analizar
con detalle el grado de efectividad de estas enzimas a tres concentraciones diferen-
−1
tes: 1, 0.1 y 0.01 µg ml . Los resultados evidenciaron que ambas enzimas quiméri-
cas mejoraban la actividad de la proteína parental Cpl-1, observándose las mayores
−1
diferencias con 0.1 y 0.01 µg ml . Así, Cpl-711 fue la enzima quimérica más activa
pues redujo 3 y 2 unidades logarítmicas el número de células viables, con 0.1 y
 −1
0.01 µg ml , respectivamente, frente a 2 o 1 unidades logarítmicas que redujo Cpl-
771, o una unidad logarítmica o sólo un 3% de Cpl-1, respecto a las mismas con-
−1
centraciones de 0.1 y 0.01 µg ml (Fig. 42).
De los datos anteriores se pudo concluir que, de estas cuatro nuevas enzimas
quiméricas, Cpl-711 tenía el mayor efecto bactericida frente a neumococo y, por
tanto, se decidió estudiar sus propiedades más en profundidad. Las características
físico-químicas, en cuanto al pH, temperatura óptima de actuación y demás pará-
metros eran las mismas que las de las proteínas parentales Cpl-1 y Cpl-7S. En
cuanto a su estabilidad térmica, se observó que Cpl-711 mantenía buena parte de
su capacidad bactericida, incluso después de mantener la enzima a ≈ 25°C durante
una semana (Fig. 43).

!
 10"
A B

8"
0.6$

Log10"UFC"ml–1"
Control$
6"
0.4$
DO550$

4"
**" **"
**"
0.2$ " "
Cpl9771$
Cpl91$
2" "
Cpl9711$
0$

Control"

Cpl61"

Cpl6771"

Cpl6711"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$
C D
10"

8" *"
0.6$ *"
*"

Log10"UFC"ml–1"
6"
Control$
0.4$
DO550$

4"

0.2$ Cpl91$
Cpl9771$ 2"

Cpl9711$
0$
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$
E F
10"

8" *"
0.6$ *"
Log10"UFC"ml–1"

Control$
6"
0.4$
Cpl91$
DO550$

4"
Cpl9771$
0.2$
Cpl9711$ 2"

0$
Control"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"

4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$

Tiempo$(min)$

Fig. 42. Efecto bacteriolítico y bactericida de Cpl-1, Cpl-771 y Cpl-711 sobre la cepa R6 de neu-
mococo. Cultivos de R6 se resuspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se trataron 60 min con 1
−1 −1 −1
µg ml de los enzibióticos (A), o con 0.1 µg ml (C), o con 0.01 µg ml (E). La incubación se con-
tinuó a 37°C durante 60 min y se midió la DO550. Los datos son representativos de 4 experimen-
tos independientes. Las células viables se determinaron en placas de agar-sangre después de 60
min de incubación (B, D y F). Los datos son media de 4 experimentos independientes. Las barras
de error representan la DS y los asteriscos indican los valores que son estadísticamente significa-
tivos en relación al control en ausencia de enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía se-
guido de un test de Dunnett; **, P <0.001; *, P <0.01.
 8"

6"

Log10"UFC"ml–1"
*"
4"

2"

*"
Control" 0" 7"

Cpl@711"
Tiempo"(días)"

Fig. 43. Efecto de la estabilidad térmica sobre la actividad enzimática de Cpl-711. La lisozima Cpl-
711 se mantuvo 7 días a ≈ 25°C. La actividad remanente se ensayó sobre cultivos de R6, según el
−1
protocolo estándar, añadiéndose 5 µg ml de Cpl-711. La incubación se continuó a 37°C durante 60
min y en ese momento se determinaron las células viables en placas de agar-sangre. Los datos son
media de 4 experimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos
indican los valores que son estadísticamente significativos en relación al control en ausencia de Cpl-
711. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; *, P <0.001.

7.2. Estudios de actividad bactericida de Cpl-711 frente a cepas capsuladas

y multirresistentes

De los resultados anteriores se pudo concluir que Cpl-711 era la enzima más activa
sobre la cepa R6 de neumococo, pues tenía el mismo efecto bactericida que la
enzima más activa hasta la fecha, Cpl-1, pero con 10 veces menos de cantidad de
proteína. Para comprobar si esta máxima actividad se mantenía igualmente sobre
diferentes cepas capsuladas, se realizaron ensayos sobre cepas de serotipo 2
−1
(D39), 3 (P007) y 4 (P008) y a una concentración de 0.1 µg ml , ya que es la con-
centración a la que en ensayos previos se observaron mejor las diferencias de acti-
vidad entre las diferentes enzimas. Los resultados demostraron que, en efecto, Cpl-
711 seguía siendo la más eficaz sobre todas las cepas de neumococo, indepen-
dientemente del tamaño o composición de la cápsula (Fig. 44).

!
 Así, Cpl-711 reducía 2 unidades logarítmicas más el número de células viables
comparado con Cpl-1, mientras que la eficacia de Cpl-1 y Cpl-771 dependía de la
cepa ensayada, lo que sugiere que el espesor y/o el tipo de cápsula afecta más a la
actividad lítica de estas dos enzimas que a la enzima quimérica Cpl-711 (Fig. 44D y
F). En este caso, la letalidad de Cpl-1 y Cpl-771 disminuyó claramente puesto que,
en vez de reducir la viabilidad 1 o 1.5 unidades logarítmicas respectivamente (frente
a D39), sólo lo hicieron 0.5 o 1 unidad logarítmica (frente a P007).
Una vez comprobado el efecto de estas enzimas quiméricas sobre diferentes
cepas capsuladas de neumococo, se completó el mismo tipo de estudios con algu-
nas cepas de gran importancia clínica, como las cepas 1515/97 (serotipo 6B) y 69
(serotipo 19F) empleadas previamente en estudios con Cpl-7S, así como la cepa
D48 (serotipo 19F). Se pudo concluir que Cpl-711 conservaba sobre estas tres ce-
pas una actividad bacteriolítica y bactericida muy similar a la observada frente a las
utilizadas anteriormente (Fig. 45).
 10"
A B
*"
8" " **"
0.6$
" **"

Log10"UFC"ml–1"
Control$
6" "
0.4$
OD550$

4"
Cpl91$

0.2$ Cpl9771$
2"
Cpl9711$
0$

Control"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Time$(min)$
C D 10"

0.6$
8" *"

Log10"UFC"ml–1"
Control$ 6"
0.4$
Cpl9771$ Cpl91$
DO550$

4"
Cpl9711$
0.2$
2"

0$

Control"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Tiempo$(min)$

E F 10"

8"
0.6$ *"
Log10"UFC"ml–1"

Control$ 6"
0.4$
Cpl91$
DO550$

4"
Cpl9771$
0.2$
Cpl9711$ 2"

0$
4$ 10$ 15$ 30$ 45$ 60$
Control"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"

Tiempo$(min)$

Fig. 44. Efecto bacteriolítico y bactericida de Cpl-1, Cpl-711 y Cpl-771 sobre diferentes cepas
capsuladas de S. pneumoniae. (A, C y E) Cultivos de las cepas D39, P007 y P008 se resuspen-
−1
dieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en ausencia o presencia de 0.1 µg ml de las
enzimas, continuándose la incubación a 37°C durante 60 min y siguiéndose la DO550. Los datos
son representativos de 4 experimentos independientes. (B, D y F) Las células viables se determi-
naron en placas de agar-sangre después de 60 min de incubación. Los datos son media de 4 ex-
perimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican los va-
lores que son estadísticamente significativos en comparación con los controles en ausencia de
enzima. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; **, P <0.001; *, P
<0.01.

!
 10"
**"
8" *" *"
Log10"UFC"ml–1"

6"

4"

2"
Control"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"

Cpl51"

Cpl5771"

Cpl5711"

Cpl51"
Control"

Control"

Cpl5771"

Cpl5711"
69" 1515/97" D48"

Fig. 45. Efecto bactericida de diferentes lisozimas sobre tres cepas multirresistentes neumocóci-
cas. Cultivos de las cepas 69 (serotipo 19F), 1515/97 (serotipo 6B) y D48 (serotipo 19F) se re-
−1
suspendieron en PBS a una DO550 de 0.6 y se incubaron en ausencia o presencia de 0.01 µg ml
de Cpl-1, Cpl-771 y Cpl-711, continuándose la incubación a 37°C. Las células viables se determi-
naron en placas de agar-sangre después de 60 min de incubación. Los datos son media de 4 ex-
perimentos independientes. Las barras de error representan la DS y los asteriscos indican los va-
lores que son estadísticamente significativos en comparación con los controles en ausencia de
enzibiótico. Se aplicó el test de ANOVA de una vía seguido de un test de Dunnett; **, P <0.001; *,
P <0.01.
 Con objeto de ilustrar claramente la extraordinaria capacidad bactericida y bacte-
riolítica de Cpl-711 frente a neumococo, se eligió la cepa no capsulada R6 para
tratar de visualizar el efecto de lisis celular provocada por la enzima, tanto en el
tubo de ensayo como en la observación con el microscopio. Así, cuando se añadió
Cpl-711 purificada a una suspensión de bacterias de la cepa R6 en el tubo de en-
sayo, se observó, en tiempo real, el poder bacteriolítico de esta lisozima mediante
la completa clarificación de la suspensión (Vídeo 1).
Además, este mismo efecto de Cpl-711 frente a la cepa R6 se pudo apreciar en
el microscopio donde se puede ver claramente, también en tiempo real, cómo las
bacterias se van lisando progresivamente a los pocos segundos del contacto con
dicha enzima. Como resultado de esta lisis se observa muy bien la impronta de la
célula ya lisada y con el contenido intracelular liberado al medio (Vídeo 2).

1. 2.

Vídeos 1 y 2. Efecto bacteriolítico de Cpl-711 sobre un cultivo de neumococo. (1) Para observar la lisis,
se resuspendió un cultivo de R6 a DO550 ≈ 0.3. Posteriormente, dos alícuotas de este cultivo se incuba-
ron en tubos de cristal durante 5 min a 37°C añadiéndose o no (control) Cpl-711 purificada, justo al
comienzo de la toma de las imágenes, y se siguió su efecto durante 45 segundos
(http://vimeo.com/96838475). (2) Con un protocolo similar al anterior, se comprobó el efecto producido
por el contacto de Cpl-711 purificada sobre la cepa R6 de neumococo, desde el momento en el que se
añade Cpl-711 y durante un minuto aproximadamente (http://vimeo.com/96889807). Para la realización
de los vídeos, las imágenes se tomaron con una cámara Nikon D5100 (1) o empleando un microscopio
óptico Nikon (DFC450-FX) con un objetivo 100× mediante el software Leica application suite V4.2 (2).
Para visualizar los vídeos es necesario un lector de códigos QR disponible, de forma gratuita, desde
cualquier teléfono inteligente.

!
8. CPL-711 EN UN MODELO MURINO DE INFECCIÓN

Para complementar y validar los datos del efecto bactericida de Cpl-711 y Cpl-1
sobre cepas de neumococo en el tubo de ensayo, se puso a punto un modelo mu-
rino de sepsis neumocócica utilizando ratones BALB/C silvestres. El objetivo fue
comparar los resultados de protección de estas dos enzimas frente a la muerte de
los animales provocada por la sepsis de una cepa virulenta de neumococo. Estos
ensayos se hicieron durante mi estancia en el laboratorio del Prof. Fischetti, en la
Universidad Rockefeller de Nueva York.
Inicialmente, se comprobó la dosis letal más adecuada para estos ratones para
que la muerte de los mismos tuviera lugar a los 3 días, aproximadamente. De esta
5 −1
manera, se inocularon grupos de 20 ratones con 5.5 × 10 UFC ml de la cepa
D39_IU por vía IP, como se ha descrito anteriormente. Una hora después se com-
probó que la sepsis ya estaba establecida y los ratones se trataron con diferentes
concentraciones de Cpl-711, en el rango de 25 a 500 µg/ratón, o únicamente con
PBS (control). La supervivencia de los ratones se controló durante 7 días y los re-
sultados de cuatro experimentos diferentes se combinaron y se representaron gráfi-
camente en una curva de supervivencia de Mantel Cox (Fig. 46).
Con estas condiciones, las muertes provocadas por S. pneumoniae D39_IU en
los ratones control ocurrieron, como se esperaba, dentro de los 3 primeros días,
mientras que los niveles de supervivencia de los ratones tratados variaba depen-
diendo de la concentración de proteína usada. Los ratones tratados con 500 µg de
Cpl-711 presentaban un 100% de supervivencia (20/20) al final del experimento,
mientras que, a medida que la cantidad de enzima disminuía, la supervivencia se
veía afectada. Así, la supervivencia de ratones tratados con 200 µg fue de un 70%
(14/20), disminuyendo hasta un 50% (10/20) o un 45% (9/20) en ratones tratados
con 50 µg o 25 µg, respectivamente (Fig. 46).
A continuación, los resultados obtenidos con Cpl-711 se compararon con la pro-
tección ejercida por Cpl-1. En este estudio se emplearon las tres concentraciones
más bajas, 200, 50 y 25 µg, observándose que la supervivencia de los ratones tra-
tados con 200 µg de Cpl-1 era del 35% (7/29), mientras que de los tratados con 50
o 25 µg sobrevivía un 20% (4/20). Este nivel de protección fue, aproximadamente,
un 50% menor que el obtenido por la proteína quimérica Cpl-711 (Fig. 47). Estos
resultados confirmaron los datos obtenidos in vitro en los que Cpl-711 era capaz de
mejorar el efecto bactericida de Cpl-1 frente a diferentes cepas de S. pneumoniae.
 100#
Supervivencia#(%)#

75#

50#

25#

0#
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#

Tiempo#post9infección#(días)#

Fig. 46. Curvas de supervivencia de ratones en un experimento de infección. Las líneas repre-
sentan la supervivencia de los ratones tratados o no con diferentes concentraciones de Cpl-711.
La línea naranja corresponde a los ratones tratados con 500 µg, la verde a los tratados con 200
µg, la roja con 50 µg, la azul con 25 µg y la negra corresponde a los ratones que no han sido tra-
5 −1
tados. Se infectaron 20 ratones por condición con 5.5 × 10 UFC ml de S. pneumoniae D39_IU.
Los resultados fueron estadísticamente significativos (P <0.001) cuando se compararon los trata-
dos con respecto al control sin tratar (test de Mantel Cox).

!
 100#
Supervivencia#(%)#

75#

*#
50# *#
*#
*# *# #
25# *#
# #
0#
1# 2# 3# 4# 5# 6# 7#

Tiempo#post9infección#(días)#

Fig. 47. Curvas de supervivencia de ratones en un experimento de infección. Las líneas repre-
sentan la supervivencia de los ratones tratados o no con diferentes concentraciones de Cpl-711
(líneas azules) o de Cpl-1 (líneas rojas). Las líneas punteadas corresponden a los ratones trata-
dos con 200 µg, las discontinuas a los tratados con 50 µg y las continuas a los tratados con 25
µg. La línea negra corresponde a los ratones que no han sido tratados. Se infectaron 17 ratones
5 −1
por condición con 5.5 × 10 UFC ml de S. pneumoniae D39_IU. ** P <0.01 (test de Mantel Cox).
 V. DISCUSIÓN
!
Neumococo sigue siendo uno de los patógenos humanos más importantes según
se desprende de las tasas de morbilidad y mortalidad, lo que le convierte en la prin-
cipal causa de otitis media aguda, sinusitis, neumonía adquirida en la comunidad y
meningitis, con un alto impacto social y económico. Desde principios de la década
de 1950, el descubrimiento y uso consiguiente de varios antibióticos representaron
hitos importantes en la lucha contra las infecciones microbianas. Sin embargo, en
los últimos años y como consecuencia del uso abusivo de los antibióticos, se ha
producido un aumento considerable de las cepas multirresistentes lo que ha gene-
rado uno de los problemas más importantes para la salud pública (Putnam et al.,
2000). Además, esta situación se ha visto agravada por el cambio estratégico de las
prioridades de las grandes compañías farmacéuticas que se ha traducido en una
menor inversión en la búsqueda de nuevos compuestos antimicrobianos (Talbot et
al., 2006). Con este panorama tan poco tranquilizador, la comunidad científica está
tratando de encontrar tratamientos alternativos, sobre todo para los patógenos más
peligrosos debido a la difusión de las cepas frente a las que se dispone de menor
arsenal antibiótico. Es en este contexto donde se enmarca el renacimiento de la
llamada “terapia fágica” que engloba tanto el uso de bacteriófagos enteros (viriones)
como de alguno de sus productos.
Los bacteriófagos son virus que infectan bacterias y por tanto, al igual que éstas,
su distribución es general en el planeta, incluyendo los ambientes terrestres, acuáti-
cos o cualquier entorno extremófilo donde se ha demostrado la presencia de bacte-
31
rias. Se ha estimado que puede haber del orden de 10 fagos en la biosfera, clasi-
8
ficados en 13 familias y en unos 30 géneros, distribuidos en cerca de 10 especies
distintas (Brüssow y Hendrix, 2002; Rohwer y Edwards, 2002). Los fagos se ingie-
ren regularmente en los alimentos y son colonizadores habituales del intestino hu-
mano (Kutter y Sulakvelidze, 2005). Según su ciclo de vida los fagos se dividen en
líticos o virulentos —que producen la lisis de la bacteria a la que infecta— y atem-
perados, que normalmente se integran en el genoma bacteriano sin inducir la lisis
(Weinbauer, 2004). Diversos estudios han demostrado que en el sistema de neu-
mococo las cepas lisógenas representan alrededor del 75% de las muestras anali-
zadas y todos los fagos atemperados analizados hasta la fecha portaban alelos del
tipo lytA (Ramirez et al., 1999; Romero et al., 2009; Morales, 2014). No obstante, en
los últimos meses, gracias a los avances y abaratamiento de la secuenciación ma-
siva, se han depositado en los bancos de datos centenares de genomas de nuevos
aislados de S. pneumoniae y, algunos de ellos, poseen genes fágicos tipo cpl-1. Sin
embargo, aún no se ha descrito ninguno que posea genes tipo cpl-7. Por otra parte,
es curioso que en este mismo sistema de neumococo sólo se hayan descrito tres
tipos de fagos líticos diferentes: los fagos Dp (McDonnell et al., 1975), los fagos ω
(Tiraby et al., 1975 ) y los fagos Cp (Ronda et al., 1981). Los dos primeros pertene-
cen a la familia Siphoviridae mientras que los Cp son Podoviridae.
Dentro de la familia Cp, los fagos más estudiados han sido Cp-1 y Cp-7 (Ronda
et al., 1981; López et al., 1984). Un análisis global del genoma del fago Cp-1 y de
su organización reveló que éste y el fago φ29 de B. subtilis mostraban una alta simi-
litud compartiendo, además de un elevado parecido morfológico, el mismo meca-
nismo de replicación. En cuanto al fago Cp-7, aunque no se ha estudiado tan deta-
lladamente como Cp-1, la información conocida permite aventurar que es muy pro-
bable que comparta similares características morfológicas y estructurales con Cp-1
(López et al., 1984). En esta Tesis se ha secuenciado completamente el genoma de
Cp-7 (19 741 pb frente a los 19 343 pb de Cp-1) y, de su análisis in silico, se puede
destacar que contiene una repetición terminal invertida extremadamente larga (347
pb) y que la similitud global entre los genomas de ambos fagos alcanza el 92%.
Además, Cp-7 codifica también su propia DNA polimerasa y, muy probablemente,
una proteína terminal unida al extremo 5’ del DNA. Ambas proteínas resultan im-
prescindibles para el inicio de la replicación del DNA por el mecanismo mediado por
la proteína terminal, que ha sido extensamente estudiado en el caso de φ29 (Meijer
et al., 2001) y que se demostró muy similar al de Cp-1, aunque con interesantes
diferencias (Martín et al., 1996).
En el análisis comparativo entre los DNAs de Cp-1 y Cp-7 se observó la presen-
cia de 5 regiones con una identidad <80% (Fig. 13). Estos resultados confirman
plenamente los experimentos de formación de heterodúplex llevados a cabo duran-
te la Tesis de la Dra. Alicia Romero (Romero, 1992) (Fig. 12), pudiéndose asignar
con bastante certidumbre la localización aproximada de los 7 lazos de regiones
monocatenarias que no hibridan entre sí como el resto de los genomas de ambos
fagos.
Por otro lado, el DNA de Cp-7 mostró similitud con otros fagos de la familia Po-
doviridae como φYS61 de Weisella cibaria, S24-1 de S. aureus, asccφ28 de L. lactis
o los fagos Nf, B103 y GA-1 de B. subtilis. Pero no sólo se encontró similitud con
fagos de la familia Podoviridae sino también con los fagos BM13, ul36.K1 y
ulk36.k1t1 de Lactococcus, φFL3B, ϕEf11 y BC-611 de Enterococcus faecalis, S13’
de S. aureus o los fagos JX01 y LYGO9 de Streptococcus agalactiae, entre otros.
Todos estos últimos están englobados en la familia Siphoviridae, mientras que pre-
sentaba una similitud menor con los fagos GIL16c y pGIL01 de Bacillus thuringien-
sis pertenecientes a la familia Tectiviridae.
Un aspecto muy característico del sistema de neumococo, tanto de la bacteria
como de sus fagos, es la influencia determinante que juega el aminoalcohol colina
en varias etapas de su ciclo fisiológico. En el caso del fago Dp-1, se demostró que
tanto el proceso de adsorción como el de liberación de sus partículas fágicas al
medio dependían de colina (López et al., 1982; García et al., 1990). No obstante,
cuando neumococo se multiplicaba en un medio donde la colina se sustituía por
etanolamina, un análogo estructural, este nuevo aminoalcohol se incorporaba en los
ácidos teicoicos de la pared y las bacterias no podían ser lisadas por ningún fago
de la familia Dp o Cp, a excepción de Cp-7 (García et al., 1990) lo que dio una pista
de la peculiaridad de este fago en el contexto de los fagos líticos de neumococo.
Aunque ya se apuntó entonces que la enzima del casete lítico, la lisozima Cpl-7,
podía estar implicada en este proceso, quedaba por confirmar la verdadera razón
por la que este fago era el único capaz de producir un ciclo lítico completo en las
células que contenían etanolamina y elucidar qué clase de sustratos (peptidoglica-
nos) era capaz de reconocer y degradar Cpl-7.
Las lisinas fágicas (endolisinas) son enzimas codificadas por los genomas de fa-
gos, tanto de bacterias Gram-positivas como Gram-negativas, que se sintetizan en
el citoplasma bacteriano durante la fase tardía del ciclo lítico con la finalidad de
degradar la pared celular facilitando así la liberación de la progenie. Normalmente,
estas enzimas no contienen un péptido señal que les facilite su transporte al espa-
cio periplásmico y así poder acceder al sustrato por lo que, para solventar este in-
conveniente, los fagos, al final de su ciclo lítico, producen proteínas hidrofóbicas de
pequeño tamaño denominadas holinas, las cuales forman poros en la membrana
citoplásmica que permite a la endolisina pasar a través de ellos y alcanzar el pepti-
doglicano (Wang et al., 2000). En principio, se podría pensar que las endolisinas
podrían añadirse exógenamente a un cultivo bacteriano para acceder a su sustrato
y ser capaces de romper los enlaces adecuados, provocando la lisis y la muerte de
la bacteria susceptible. Esta idea, aparentemente simple, no se probó con éxito
hasta los trabajos pioneros de V. Fischetti (Nelson et al., 2001; Loeffler et al., 2001).
Como ya se ha detallado en la Introducción de esta Memoria, las endolisinas se
encuentran actualmente englobadas dentro del término “enzibiótico”, inicialmente
acuñado para incluir exclusivamente enzimas codificados por bacteriófagos que
mostraban actividad antibacteriana. En la actualidad se ha ampliado este concepto
para incluir toda clase de enzimas que, independientemente de su origen, presen-
ten actividad antibacteriana y/o antifúngica e incluso antiviral (Veiga-Crespo et al.,
2007). El mecanismo de acción de los enzibióticos es distinto del de los antibióticos
ya que, mientras que algunos de éstos interfieren en alguna etapa de la síntesis del
peptidoglicano, aquellos catalizan su destrucción (Borysowski et al., 2006). Esto
implica que tienen gran efectividad frente a bacterias multirresistentes, como por
ejemplo S. pneumoniae (Loeffler et al., 2001), B. anthracis (Schuch et al., 2002), S.
aureus (Gilmer et al., 2013), L. monocytogenes (Gaeng et al., 2000) o estreptoco-
cos del grupo B (Cheng et al., 2005). Además, parece difícil encontrar mutantes
resistentes a estas endolisinas pues la baja probabilidad de que esto ocurra está
relacionada con que las dianas de los enzibióticos, mediada por sus CWBMs, son
estructuras de la pared celular y, más concretamente, del peptidoglicano que es un
polímero altamente conservado entre todas las bacterias y, por tanto, difícil de que
soporte un cambio estructural que resulte inocuo para la fisiología bacteriana (Loef-
fler et al., 2001; Schuch et al., 2002). Así, en el único caso en que se ha descrito el
desarrollo de resistencia a un enzibiótico (lisostafina), la bacteria mostró una mar-
cada reducción de su virulencia (Kusuma et al., 2007).
Uno de los grandes problemas que podría acarrear el empleo de enzibióticos es
la posible respuesta inmunitaria del hospedador frente a este tipo de compuestos.
En este sentido se ha demostrado que ratones preinyectados con diferentes dosis
de enzimas, Cpl-1 o MV-L del fago φMR11 de S. aureus, produjeron anticuerpos
frente a las proteínas pero, cuando unos días después, los ratones se infectaron
con bacterias y se trataron de nuevo con los mismos enzibióticos, éstos mostraron
niveles de protección similares a los producidos en los ratones que no habían sido
inmunizados con estas enzimas (Jado et al., 2003; Loeffler et al., 2003b; Rashel et
al., 2007). Por tanto, los anticuerpos específicos ejercieron poco o ningún efecto
neutralizante frente a este tipo de enzimas y no se observaron efectos secundarios
ni signos de anafilaxis.
Respecto a la especificidad de las endolisinas por su sustrato bacteriano, el caso
de la lisozima Cpl-7 era especial porque se sabía que, contrariamente al resto de
las mureín-hidrolasas del sistema de neumococo (bacterianas y fágicas), su activi-
dad enzimática no dependía de la presencia de colina degradando indistintamente
paredes de neumococo conteniendo colina o etanolamina. Por esta razón, se pensó
que Cpl-7 podría tener un efecto antibacteriano sobre un amplio rango de hospeda-
dores. Aunque la secuencia de Cpl-7 se publicó en 1990 no se reportaron secuen-
cias similares hasta el año 2002 cuando se describieron similitudes en varios profa-
gos de S. pyogenes y S. agalactiae (Beres et al., 2002; Tettelin et al., 2002). Desde
entonces y hasta ahora, gracias a los avances en las técnicas de secuenciación
masiva y en los análisis bioinformáticos, ha aumentado considerablemente el núme-
ro de genes que codifican proteínas conteniendo repeticiones homólogas a CW_7,
pertenecientes a un elevado número de genomas bacterianos. Hace unos años se
describió la presencia de al menos un motivo CW_7 en 67 proteínas distribuidas en
46 especies (Bustamante et al., 2010) pero, en un análisis exhaustivo en la base de
datos PFAM 27.0, se ha podido constatar que CW_7 aparece en la secuencia de
202 proteínas (correspondientes a 127 especies) que se organizan en 30 arquitec-
turas diferentes. El motivo CW_7 puede aparecer como repetición única o como un
conjunto de repeticiones fusionadas a diferentes módulos supuestamente funciona-
les (Fig. 16) (última fecha de acceso 6 de junio de 2014). Además, esta búsqueda
puso de manifiesto que muchas de las supuestas mureín-hidrolasas que contienen
repeticiones CW_7, pero no todas, corresponden muy probablemente a lisinas de
origen fágico ya que, en posición 5’ de estos genes, aparecen orfs que parecen
codificar holinas, es decir forman parte del casete lítico característico de los fagos.
Hasta la fecha, aparte de la lisozima Cpl-7, sólo se han caracterizado bioquími-
camente y han demostrado tener actividad bactericida otras dos enzimas con
CW_7, las endolisinas λSa2 y SMP, codificadas, respectivamente, por el profago
LambdaSa2 de S. agalactiae y el fago SMP de S. suis (Pritchard et al., 2007; Wang
et al., 2009). Resulta interesante remarcar que las proteínas que contienen repeti-
ciones CW_7 parecen estar presentes sólo en cuatro de los 25 filos bacterianos:
Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi y Firmicutes. Sorprendentemente, parece
que este tipo de módulos no aparecen en bacterias pertenecientes al filo Proteobac-
teria, a pesar de que la base de datos del NCBI contiene las secuencias de más de
1800 genomas de proteobacterias. La mayoría de las especies bacterianas que
poseen proteínas con al menos una repetición CW_7 pertenecen al filo Firmicutes y
casi todas forman parte de la microbiota presente en el intestino humano. Cuando
se analiza más en profundidad la presencia de estas repeticiones CW_7 en las 127
especies se observa que éstas aparecen en bacterias que comparten nicho ecoló-
gico pero que pertenecen a filos diferentes. Ejemplos de esta situación son los de
D. ethenogenes (filo Chloroflexi) y E. harbinense (filo Firmicutes) que viven en
aguas contaminadas y poseen genes con un porcentaje de identidad muy elevado
entre ellas, lo que refuerza la hipótesis de que la adquisición de CW_7 se debe a un
proceso de transferencia horizontal de genes (Regeard et al., 2005). Nuevamente
hay que subrayar el hecho de que la mayoría de las proteínas que contienen repeti-
ciones CW_7 parecen estar relacionadas con la presencia de profagos (o partes de
ellos) que actúan como vehículos para la transferencia horizontal de genes entre
diferentes especies bacterianas. Un ejemplo entre muchos que se pueden citar, es
la notable similitud (72%) encontrada entre los profagos φ3396 de S. dysgalactiae
subsp. equisimilis y φ315.1 de S. pyogenes (Davies et al., 2007).
Las lisozimas Cpl-1 y Cpl-7 son muy similares en sus módulos catalíticos pero
poseen un CWBM totalmente diferente ya que, mientras Cpl-1 se estructura en 7
repeticiones que permiten el anclaje a la pared celular a través del reconocimiento
de los residuos de PCho de los TAs, Cpl-7 muestra tres repeticiones que reconocen
la pared celular por un mecanismo independiente de la presencia de colina. Este
CWBM presenta una característica muy particular ya que está formado por tres
repeticiones idénticas no sólo en aminoácidos sino también en nucleótidos, sugi-
riendo que el evento de duplicación ha tenido lugar hace relativamente poco tiempo,
en términos evolutivos. Este hecho hace única a esta endolisina ya que no se cono-
ce otro ejemplo de repeticiones dentro de una proteína o en su gen codificante, al
menos bacteriana o fágica, que tenga una secuencia idéntica en aminoácidos y en
nucleótidos. Respecto al módulo catalítico de ambas lisozimas, éste pertenece a la
familia GH_25 de las glicosilhidrolasas y está situado en posición N-terminal con un
85.6% de identidad en la secuencia de aminoácidos (95.2% de similitud) entre am-
bas. Este módulo se caracteriza por poseer una estructura de tipo α/β acorde con el
plegamiento en barril de tipo (βα)5β3 que se ha descrito en otras lisozimas pertene-
cientes a esta familia (Porter et al., 2007). Por el contrario, los linkers son diferentes
en composición y longitud lo que sugiere que, probablemente, ello venga determi-
nado por las diferencias de plegamiento y de interacción entre los dos módulos de
cada enzima.
Las actividades específicas de las diferentes mureín-hidrolasas estudiadas en
esta Tesis, tanto naturales como sintéticas, se valoraron mediante el ensayo in vitro
de las proteínas purificadas frente a paredes marcadas radiactivamente, utilizadas
como sustrato. Con este método, muy usado en nuestro laboratorio por su sensibili-
dad y rapidez, se llegó a la conclusión de que todas las enzimas fágicas probadas
tenían unos valores de actividad específica similares. No obstante, y en contraste
con lo anterior, las actividades bactericidas de Cpl-7 y Cpl-1 eran muy diferentes
cuando se utilizaron de forma exógena, pues Cpl-7 quedaba muy por debajo de la
capacidad letal que mostraba Cpl-1. Una posible explicación a este hecho podría
residir en la diferencia en el modo de acceso o en la propia afinidad por el peptido-
glicano, ya que ambas presentan un CWBM totalmente diferente. De este modo, en
una suspensión de paredes purificadas, la capacidad de unión a su diana por parte
de las enzimas así como su capacidad de hidrólisis de los enlaces específicos, se
vería favorecida por la falta de cualquier impedimento estérico. Sin embargo, cuan-
do estas enzimas se añaden exógenamente sobre células intactas, la accesibilidad
a la diana se podría ver modulada no sólo por el grado de reticulación del muropép-
tido, la presencia de CPS o los TAs y LTAs, sino también por la carga negativa neta
que generalmente confieren estos polímeros a las envueltas de bacterias Gram-
positivas. Por tanto, la estructura tridimensional del peptidoglicano y la carga neta
que soporta toda la pared celular podrían jugar un papel determinante en el grado
de reconocimiento de este tipo de enzimas por su sustrato y, en último término, por
la bacteria susceptible (Neuhaus y Baddiley, 2003). En relación con ello, la caracte-
rística más distintiva de Cpl-7, en comparación con otras hidrolasas de pared celu-
lar, era la elevada carga negativa que presentaba tanto su CWBM como la proteína
completa. Según esta hipótesis, esta carga muy negativa podría obstaculizar, a
través de interacciones electrostáticas desfavorables, la accesibilidad de Cpl-7 a su
diana en el peptidoglicano y traducirse en una menor actividad bactericida. En este
sentido, se demostró recientemente que la mutación, en la lisina XlyA del profago
PBSX de B. subtilis, de cinco aminoácidos del módulo catalítico no implicados direc-
tamente en el centro del canal que forma el sitio catalítico, provocaba el cambio de
la carga neta de −3 a +3, con el consiguiente aumento de la actividad de la lisina
(Low et al., 2011). Teniendo en cuenta las actividades bactericidas discordantes de
Cpl-1 y Cpl-7, y sobre la base de estos antecedentes, se decidió construir una nue-
va variante de la lisozima Cpl-7, mediante ingeniería de proteínas, con la idea de
que su actividad enzimática, traducida en efecto bactericida, aumentara sustancial-
mente con relación a la enzima parental.
Como los módulos catalíticos de ambas lisozimas eran muy similares, se decidió
cambiar la carga del CWBM de Cpl-7 mediante la mutación de una serie de resi-
duos de las tres repeticiones CW_7 que conforman dicho CWBM. Entre los factores
favorables que permitieron la síntesis de la variante de Cpl-7 se pueden citar: a) el
conocimiento detallado de la relación estructura-función de Cpl-7, pues aunque no
se disponía de la estructura del cristal de la enzima completa, sí se tenía la estruc-
tura de su módulo catalítico (Silva-Martín et al., 2010), de una estructura incompleta
del CWBM (Silva-Martín, 2012), así como de un modelo de la enzima completa
basado en los estudios de SAXS (Bustamante et al., 2010); b) la secuencia compa-
rada de todas las proteínas que contenían el motivo repetido CW_7, tomado del
banco de datos; c) las conclusiones sobre los residuos más conservados entre las
proteínas citadas anteriormente, lo que sugería los aminoácidos más apropiados
para mutarlos, conservando el plegamiento y contribuyendo a la disminución de la
carga neta; d) la disminución de los precios de las empresas de síntesis de genes,
lo que ya convierte a esta posibilidad en una alternativa rápida y económicamente
viable para conseguir la obtención de plásmidos recombinantes. Teniendo en cuen-
ta todas estas razones se construyó una nueva variante sintética, Cpl-7S, que con-
tenía 15 aminoácidos mutados (5 por repetición) y con una carga neta de −11.84,
es decir, 18 unidades menos que la lisozima natural Cpl-7 (Figs. 21 y 22). Los resul-
tados obtenidos con Cpl-7S mostraron que la enzima sintética poseía una actividad
bacteriolítica y bactericida claramente superior a la mostrada por Cpl-7 frente a la
mayoría de cepas de neumococo ensayadas, incluyendo algunas multirresistentes y
cepas con diferentes tipos capsulares (Figs. 30 y 31). Estos datos han permitido
demostrar, por primera vez, la correlación entre la carga neta del CWBM de una
endolisina y su actividad bactericida.
Como se ha comentado anteriormente, a Cpl-7 se le suponía un rango de hos-
pedador más allá del reconocimiento de neumococo, por lo que se decidió estudiar
si la nueva proteína sintética poseía también esta característica. Para ello, se em-
pleó una técnica rápida que permite evaluar la capacidad de unión a paredes celu-
lares, así como el efecto bacteriolítico y bactericida de una determinada enzima. Lo
primero, su capacidad de unión, se puede conseguir mediante la fusión del CWBM
de la enzima con un marcador fluorescente, añadiendo exógenamente esta proteí-
na quimérica a una suspensión bacteriana y comprobando la señal fluorescente que
confirme la unión efectiva del módulo a dicha bacteria. Además, y como comple-
mento a estos datos, se puede ensayar la enzima completa con las bacterias que
se han mostrado positivas en la unión y completar los datos con los efectos bacte-
riolítico y bactericida de la enzima estudiada. En los últimos años, este tipo de expe-
rimentos se ha llevado a cabo con diferentes enzimas y bacterias, como en el caso
de LysA2, del fago A2, sobre diferentes cepas lácticas (Ribelles et al., 2012), de
PlyPSA y Ply118 sobre cepas de Listeria (Schmelcher et al., 2011), de LysGH15B
sobre Staphylococcus (Gu et al., 2011) o de PlyC sobre una variedad de cepas de
Streptococcus (Lood et al., 2014), que han permitido dilucidar el rango de hospeda-
dor de cada enzima. En este trabajo de Tesis se ha construido una quimera entre el
CWBM7S y GFP, esta última en posición N-terminal. Los resultados obtenidos con
la fusión (GFP-CWBM7S) demostraron que el CWBM de Cpl-7S era capaz de unir-
se no sólo a S. pneumoniae sino también a diferentes bacterias del género Strepto-
coccus, como S. pyogenes o S. mitis, o incluso a otros géneros como Enterococcus
o Propionibacterium. El perfil de las bacterias a las que se unía este módulo indica-
ba el amplio rango de hospedador de actuación, como se podría esperar de una
enzima que no dependía estrictamente de colina (Fig. 32 y Tabla 12). No obstante,
los experimentos con la proteína completa Cpl-7S y con la parental Cpl-7, añadidas
−1
a una concentración de 5 µg ml , permitieron concluir que la actividad de unión no
se correlaciona necesariamente con la actividad lítica, y viceversa. Por ejemplo, S.
porcinus, S. gordonii y S. sanguinis, mostraron una notable unión de GFP-CW7S, a
pesar de no ser susceptibles a la acción de Cpl-7S (Tabla 13). Sin embargo, Cpl-7S
mostró el comportamiento inverso frente a B. adolescentis ya que, a pesar de que la
construcción GFP-CWBM7S no fue capaz de unirse, la enzima entera sí resultó
activa. También hubo datos no coincidentes en cuanto a la actividad bactericida de
las dos lisozimas pues Cpl-7S (pero no Cpl-7) fue capaz de disminuir una unidad
logarítmica el número de células viables de B. adolescentis o S. uberis.
A diferencia de las bacterias Gram-positivas, la presencia de la membrana ex-
terna de las bacterias Gram-negativas les confiere una protección adicional, siendo
ésta la principal razón por la que los enzibióticos se han mostrado ineficaces frente
a este tipo de bacterias. No obstante, recientemente se ha publicado el ejemplo de
una proteína quimérica, resultado de la fusión de un transportador de membrana de
Yersinia pestis y el dominio catalítico de la lisozima del fago T4, con capacidad de
reducir una unidad logarítmica el número de células viables de E. coli, es decir de
matar la décima parte de las bacterias del cultivo (Lukacik et al., 2012). Aparte de
este único ejemplo, sólo se ha descrito algún protocolo para solventar la dificultad
de acceso de las endolisinas a la pared de las bacterias Gram-negativas mediante
ciertos agentes desestabilizantes de la membrana externa como el agente quelante
−1
EDTA que, a una concentración de 10 mM y añadido junto a 50 µg ml de la endo-
lisina EL188 del bacteriófago EL, conseguía matar entre 3 y 4 unidades logarítmicas
a P. aeruginosa (Briers et al., 2011). Sin embargo, la eventual aplicación clínica de
EDTA junto a una endolisina podría resultar problemática debido al carácter tóxico
del quelante. En este contexto de dificultad de tratamiento de las bacterias Gram-
negativas con los enzibióticos, se describió que ciertos aceites esenciales desesta-
bilizan su membrana externa, modificando las propiedades físico-químicas de la
misma y permitiendo el paso de diferentes compuestos antimicrobianos (Helander
et al., 1998). Uno de estos aceites esenciales es el carvacrol, presente en el aceite
de Origanum vulgare (orégano) y en el de Thymus vulgaris (tomillo). De hecho este
compuesto se emplea como inhibidor del crecimiento microbiano en productos ali-
menticios, a concentraciones en el rango de 5–15 mM, para disminuir el crecimiento
bacteriano (Roller y Seedhar, 2002). Además, recientemente se ha publicado que el
carvacrol, tanto solo como en combinación con antibióticos como eritromicina, baci-
tracina o colistina, es un excelente conservante de productos alimentarios (Zanini et
al., 2014).
Los resultados obtenidos con el carvacrol, a una concentración de 0.01% (0.6
mM), demostraron que este compuesto no afectaba a la viabilidad de A. baumannii,
E. coli, K. pneumoniae o P. putida y, mediante la desestabilización de la membrana
externa, permitió el acceso efectivo tanto de la quimera GFP-CWBM7S como de la
lisozima Cpl-7S. En los experimentos de unión con la quimera fluorescente se obtu-
vo respuesta positiva con las 4 cepas Gram-negativas citadas anteriormente, mien-
−1
tras que cuando se añadió carvacrol y Cpl-7S, a una concentración de 5 µg ml , el
efecto bactericida fue la reducción de, al menos, una unidad logarítmica en el nú-
mero de células viables (Fig. 32 y Tabla 14). La efectividad lograda con el trata-
miento simultáneo de un aceite esencial como el carvacrol y la lisozima Cpl-7S, es
decir la disminución de hasta 4 unidades logarítmicas de unas bacterias patógenas
Gram-negativas como E. coli, es un dato muy relevante ya que, hasta la fecha, nin-
guna de las endolisinas estudiadas, incluso las que muestran un mayor espectro de
acción, se han mostrado eficaces contra patógenos Gram-negativos (Hojckova et
al., 2013).
Las endolisinas, como todas las proteínas codificadas por fagos, se han visto
sometidas a un proceso de optimización funcional a través de la evolución conjunta
con sus hospedadores obligados, las bacterias. El resultado final es que estas en-
zimas están diseñadas para causar la lisis rápida de la célula hospedadora desde el
interior, una vez que los viriones han terminado de formarse, asegurando así la
supervivencia de la progenie fágica. En este proceso evolutivo se ha generado una
gran diversidad de enzimas líticas de pared, como producto de la continua recombi-
nación entre los diferentes módulos de endolisinas, tanto fágicas como bacterianas,
y la consiguiente transferencia horizontal de genes (Hendrix, 2002; García et al.,
2005). Muchas de estas quimeras generadas en la naturaleza de forma espontánea
se han descrito y estudiado en profundidad; en el sistema de neumococo, un caso
típico es el de la amidasa Pal, codificada por el fago Dp-1 (Sheehan et al., 1997), o
la endolisina PlyPSA codificada por el fago PSA de Listeria (Zimmer et al., 2003).
Esta última enzima presenta un CWBM homólogo a los de otras lisinas de fagos de
Listeria, mientras que su dominio catalítico está relacionado con módulos de fagos
procedentes de Bacillus y Clostridium. Todos estos datos podrían hacer pensar que
las endolisinas naturales que puedan producir los fagos existentes en la naturaleza
son las enzimas óptimas para lisar y matar una determinada bacteria. No obstante,
también es plausible considerar que haya margen de mejora en lo que respecta a
su actividad bactericida, al menos en su aplicación externa como enzibiótico.
Como se ha comentado, hay varios ejemplos de endolisinas modulares bien es-
tudiadas donde se ha sugerido el posible origen de cada módulo y se han construi-
do diferentes fusiones o deleciones para determinar sus actividades específicas
sobre distintas cepas bacterianas. Así, la fusión del gen de la lisostafina de Staphy-
lococcus simulans al gen de la lisina B30 del bacteriófago B30 de S. agalactiae, o
sólo al dominio endopeptidasa de dicho gen, da lugar a unas enzimas quiméricas
que mostraron actividad lítica contra S. agalactiae, S. uberis, y S. aureus, los tres
principales patógenos causantes de mastitis en vacas (Donovan et al., 2006). Este
mismo grupo demostró que cada módulo dentro de una construcción de fusiones
heterólogas conservaba la función de las proteínas parentales de las que provie-
nen, lo que sugería que el diseño racional y la ingeniería modular podrían permitir la
construcción de nuevas quimeras con las propiedades predichas y deseadas para
la detección y el control de los patógenos.
A pesar de lo comentado anteriormente sobre las enzimas quiméricas, se cono-
cían pocos casos de enzimas de fusión diseñadas específicamente frente a cepas
de gran interés clínico y sobre todo frente a S. pneumoniae (Díaz et al., 1990; Croux
et al., 1993). Por ello, se decidió diseñar nuevas enzimas quiméricas para su uso
potencial como nuevas lisinas frente a neumococo, combinando los elementos es-
tructurales de las enzimas con las mejores propiedades en cuanto a sus efectos
bactericidas, es decir, la lisozima Cpl-1 y la variante sintética Cpl-7S. Dichas quime-
ras se construyeron sobre la base de la similitud que presentan los respectivos mó-
dulos catalíticos y los diferentes linkers y CWBMs, obteniéndose así cuatro enzimas
quiméricas denominadas Cpl-711, Cpl-771, Cpl-117S y Cpl-177S (Fig. 40). De es-
tas nuevas enzimas las que contenían el CWBM procedente de Cpl-1 presentaron
una actividad bacteriolítica y bactericida superior, frente a cepas de neumococo,
comparado con la que presentaban las quimeras con el CWBM procedente de Cpl-
7S. Cpl-711 mostró la mayor actividad bactericida de todas ellas y, además, mante-
nía el mismo comportamiento frente a cepas con diferente tamaño capsular y con
diferente grado de multirresistencia (Figs. 44 y 45).! Lo que resultó más notable e
inesperado fue que la capacidad bactericida de Cpl-711 era claramente mayor que
la mostrada por la lisozima natural Cpl-1, siendo ésta, hasta el momento de realizar
la Tesis, la enzima más potente que se conocía frente a neumococo.
A la hora de explicar las diferencias de actividad enzibiótica entre las cuatro
quimeras construidas en esta Tesis y las dos enzimas parentales, Cpl-1 y Cpl-7S,
hay que tener en cuenta el concepto de modularidad y las diferentes contribuciones
que los módulos por separado pueden aportar a la actividad de la enzima completa,
así como las interacciones que se puedan establecer entre ambos módulos, sepa-
rados por los correspondientes linkers optimizados. En este sentido, la información
aportada por las proteínas cristalizadas viene por la de Cpl-1 completa (Hermoso et
al., 2003) pero no se dispone de la correspondiente a Cpl-7. En este último caso
sólo están resueltas las estructuras tridimensionales de los módulos por separado
(Silva-Martín et al., 2010; J. Hermoso, comunicación personal), aunque se ha publi-
cado un modelo de la envolvente molecular de Cpl-7 completa basado en SAXS
(Bustamante et al., 2010). El resultado más inesperado entre estas nuevas quime-
ras ha sido, sin duda, la importante ganancia de actividad bactericida mostrada por
Cpl-711 en comparación con Cpl-1. Este hecho es muy reseñable en sí mismo,
dado que no se han publicado otros ejemplos de quimeras de endolisinas que ha-
yan demostrado tener mayor efecto bactericida que las enzimas parentales, al me-
nos según la búsqueda realizada en la literatura científica. Como la única diferencia
que hay entre Cpl-711 y Cpl-1 es el módulo catalítico, la primera pista para buscar
una explicación estaría entre los 27 residuos diferentes que existen entre ambos
módulos. Estas diferencias no afectan a los residuos implicados en la catálisis, ya
que éstos se encuentran secuencial y estructuralmente conservados. Las sustitu-
ciones no conservativas del módulo catalítico de Cpl-7 con respecto al de Cpl-1 se
sitúan, mayoritariamente, al comienzo de las hélices tercera y cuarta y no afectarían
a la interacción con el sustrato, de acuerdo con el modelo propuesto para la estruc-
tura completa de Cpl-7 y el fragmento de muropéptido que contiene el disacárido
pentapéptido (Bustamante, 2009). Por otra parte, la carga neta total de Cpl-711
(−15.82) es algo más negativa que la de Cpl-1 (−14.82) por lo que este factor que
tan importante se ha demostrado en el caso de Cpl-7S y otras endolisinas actuaría,
en todo caso, en contra de la actividad lítica de la quimera respecto a la enzima
natural. Por tanto, no es posible en estos momentos dar una explicación rigurosa
del mayor efecto bactericida de Cpl-711 en comparación con Cpl-1 y se necesitarán
estudios adicionales para poder resolver esta incógnita. Probablemente, la resolu-
ción de las estructuras tridimensionales completas de todas las enzimas implicadas
en estas comparaciones, es decir las cuatro quimeras junto con la de Cpl-7S, po-
dría aportar interesantes pistas sobre las diferencias de actividad catalítica y/o de
unión a sustrato de esta colección de lisozimas.
La experimentación con modelos animales es una herramienta esencial para es-
tudiar la patogénesis de las enfermedades infecciosas y ensayar nuevas terapias.
La clara ventaja de los modelos in vivo sobre los modelos in vitro es la interacción
dinámica entre hospedador, fármacos y patógeno, lo que conlleva una gran utilidad
en la evaluación de nuevos candidatos antimicrobianos. Los ratones se han utiliza-
do con éxito como modelos de infección de diferentes patógenos bacterianos; sin
embargo, el uso de estos animales acarrea diferentes complicaciones prácticas,
éticas y experimentales. Por ello, numerosos grupos han enfocado sus investiga-
ciones en la puesta a punto de nuevos modelos de infección in vivo alternativos al
murino. Hasta la fecha, varios organismos modelo se han utilizado para estudiar
infecciones bacterianas, desde organismos invertebrados como la larva de la polilla
de la cera (Galleria mellonella), el gusano de seda (Bombyx mori) o nemátodos
(Caenorhabditis elegans), hasta vertebrados como el pez cebra (Danio rerio) o el
pez-arroz japonés también denominado medaka común (Oryzias latipes). Una ca-
racterística común a todos ellos y que los hace ser un buen modelo de estudio en
patogénesis es su fácil manejo así como el alto número de animales que pueden
estudiarse, lo que se traduce en una elevada significación estadística. Dentro de
estos nuevos modelos, en los últimos años las investigaciones se han centrado en
el pez cebra ya que es evolutivamente más cercano a los seres humanos que los
insectos o los nemátodos, además de resultar más fáciles a la hora de trabajar y
estudiar que los ratones. Otra gran ventaja del pez cebra es su sistema inmunológi-
co, ya que tanto los embriones como los adultos presentan una respuesta inmune
tanto innata como adaptativa (Kasahara et al., 2004) frente a un sistema innato
primitivo en C. elegans y G. mellonella, lo que hace que la interacción hospedador-
patógeno sea más próxima al modelo murino e incluso al humano. Además, compa-
rado con otros modelos de infección de vertebrados, tales como ratones y ratas, los
embriones de pez cebra tienen la ventaja de no estar sujetos a la normativa vigente
relacionada con la realización de procedimientos científicos en animales de experi-
mentación ya que no son considerados como tales hasta cumplir el séptimo dpf, lo
que se suma a otras implicaciones bioéticas que podría conllevar el empleo de ani-
males adultos. Otra de las ventajas importantes de este modelo es la visualización
de los resultados en tiempo real, debido a la transparencia de dichos embriones. De
este modo, se ha podido analizar la infección letal de los embriones provocada por
Salmonella typhimurium, comprobándose por fluorescencia que esta bacteria se
reproducía tanto de forma intracelular como extracelular (van der Sar et al., 2003).
La utilización de embriones de pez cebra para el estudio de la patogénesis pro-
vocada por S. pneumoniae era desconocida al inicio de esta Tesis, aunque durante
el desarrollo de la misma Rounioja y cols. (2012) emplearon este modelo para el
estudio de la respuesta inmune innata frente a una infección neumocócica. En cual-
quier caso, la puesta a punto y el desarrollo del modelo de embriones de pez cebra
para el estudio del papel protector de enzibióticos frente a infecciones provocadas
por estreptococos ha sido la primera vez que se describe en la literatura. Para ello,
se probaron en primer lugar las diferentes estrategias de infección de los embrio-
nes. En condiciones normales, se cree que los agentes patógenos infectan al pez
cebra a través del tracto gastrointestinal, las branquias o de zonas dañadas de la
superficie corporal (O’Toole et al., 2004), además de la existencia de otras vías de
infección naturales como la de los parásitos. En lo que respecta al protocolo expe-
rimental la infección de los embriones de pez cebra se ha realizado generalmente
por microinyección IP del embrión anestesiado a las 28 o 30 hpf (Veneman et al.,
2013; Brudal et al., 2014) permitiendo un ajuste preciso de la dosis bacteriana. Sin
embargo, esta técnica requiere un importante entrenamiento y dado que en la natu-
raleza la mayoría de patógenos se encuentran en el hábitat de forma natural, se
han desarrollado otras técnicas de infección más sencillas como la incubación de
los embriones en medios que contienen las bacterias, lo que se conoce como técni-
ca de inmersión (Davis et al., 2002; Pressley et al., 2005). Este último método es el
que se ha seguido en esta Tesis, en la que se ha descrito la infección de embriones
con dos importantes patógenos humanos como son S. pneumoniae y S. pyogenes y
su tratamiento con la lisozima sintética Cpl-7S.
A la hora de poner a punto esta técnica hay que tener en cuenta que uno de los
problemas que hubo que abordar fue la temperatura de incubación de las bacterias,
así como la viabilidad de las mismas en el medio específico de los embriones (me-
dio E3). Estos embriones se mantienen normalmente a temperaturas entre 25 y
30°C, siendo su temperatura óptima 28.5°C ya que a temperaturas más altas se
produce una disminución significativa de la viabilidad. Por el contrario, los agentes
patógenos de mamíferos están adaptados a la temperatura de su hospedador
(normalmente 37°C) y muchos de ellos muestran sólo la expresión de factores de
virulencia a esta temperatura, lo que podría afectar a su interacción con el pez ce-
bra. Por ello, se realizó un estudio de la viabilidad de los dos patógenos, S. pneu-
moniae D39 y la cepa tipo de S. pyogenes, para determinar si ambas bacterias eran
capaces de sobrevivir en el medio E3 en un rango de temperaturas que oscilaba
entre 25 y 30°C. Este punto se resolvió positivamente pues, en efecto, las bacterias
eran capaces de sobrevivir durante horas en dicho medio (datos no mostrados).
Los datos experimentales han demostrado que dos importantes patógenos hu-
manos eran capaces de causar la muerte en embriones de pez cebra mediante
técnicas de inmersión. Las tasas de mortalidad provocadas por S. pneumoniae D39
y S. pyogenes alcanzaron el 28.7% y el 35%, respectivamente, datos que concuer-
dan con una tasa del 31% en el caso de la mortalidad de embriones infectados con
Edwardsiella tarda mediante la misma técnica (Pressley et al., 2005). Cuando los
embriones infectados se trataron con Cpl-7S, la tasa de mortalidad se redujo hasta
prácticamente recuperarse el 100% de la viabilidad, ya que sólo se encontró el 1%
de muerte para S. pneumoniae D39 y el 3.7% para S. pyogenes (Fig. 35). Hay que
resaltar que los embriones expuestos a los neumococos mostraron una inflamación
en diferentes partes del cuerpo (principalmente el corazón y el hígado), mientras
que los tratados con S. pyogenes sí mostraron una necrotización aparente sin nin-
guna deformación visible. No obstante, y dado que se han descrito diferentes vías
de infección, se empleó una técnica inmunohistoquímica para determinar la posible
presencia de uno de los patógenos (en este caso S. pneumoniae) en las zonas
alteradas. En estas condiciones de infección se demostró claramente la presencia
de neumococo alrededor de las branquias (Fig. 36).
En la infección de alevines de pez cebra por el hongo Lecythophora mutabilis se
observó la formación de un tipo de biofilm mixto con las bacterias y los protozoos,
que provocó la mortandad de los alevines jóvenes mediante la oclusión de sus
branquias (Dykstra et al., 2001). Este fenómeno podría darse también en la infec-
ción provocada por S. pyogenes, ya que esta bacteria es capaz de formar biofilmes
en peces cebra adultos, tanto en la cavidad oral como en las válvulas cardiacas
(Fux et al., 2003) así como en sus tejidos blandos (Cho y Caparon, 2005). Se po-
dría pensar en una hipótesis similar en el caso de los embriones infectados por
neumococo o S. pyogenes y su presunta implicación en la muerte de estos embrio-
nes, aunque no hay datos concluyentes al respecto y se requerirán estudios adicio-
nales para demostrarla. Todos estos resultados permiten concluir que Cpl-7S tiene
un efecto bactericida similar sobre las bacterias susceptibles tanto en un modelo
animal in vivo como en un cultivo planctónico. Este trabajo puede facilitar el estudio
de las interacciones patógeno-hospedador en procesos de infecciones mixtas en un
modelo tan rápido y cómodo como los embriones de pez cebra.
Aprovechando mi estancia en la Universidad Rockefeller, en el laboratorio del
Prof. Fischetti, se pusieron a punto dos modelos murinos, uno de sepsis y otro de
colonización IN para ensayar el posible poder protector de Cpl-711 y Cpl-7S como
enzibióticos. Los resultados obtenidos en el modelo de sepsis confirmaron que Cpl-
711 también presentaba una mejor actividad que Cpl-1 frente a una infección pro-
vocada por la cepa D39_IU de S. pneumoniae. Esta observación es relevante dado
que, hasta la fecha, las dos enzimas que tenían un mayor efecto frente a una infec-
ción por neumococo provocada por una infección IP eran Cpl-1 y Pal (Loeffler y
Fischetti, 2003a; Jado et al., 2003). En ensayos llevados a cabo en nuestro labora-
torio, se demostró que una única dosis (200 µg ) de Cpl-1 o Pal era capaz de prote-
ger a ratones infectados por S. pneumoniae, aunque dependiendo del momento de
administración del enzibiótico. Si se administraba 4 hpi la bacteriemia era demasia-
do alta y el efecto protector de cada enzibiótico se limitaba a prolongar la vida du-
rante algunos días a los ratones enfermos. La quimera Cpl-711 mejoró estos resul-
tados al ser capaz de proteger un 70% de los ratones infectados con la cepa
D39_IU, que además es más virulenta que la cepa multirresistente 541 empleada
en los ensayos citados anteriormente (datos no mostrados). También se comprobó
que cantidades tan bajas de enzibiótico como 25 o 50 µg protegían al 45% o 50%
de los ratones, respectivamente (Figs. 46 y 47).
En cuanto a los resultados obtenidos en el modelo de colonización IN, en esta
Tesis hemos demostrado que Cpl-7S es capaz de ejercer efecto bactericida en una
infección mixta provocada por dos importantes patógenos. En este sentido tanto la
cepa de S. pneumoniae D39_IU como S. pyogenes MGAS5005, vieron reducido el
número de bacterias viables en 3 y 1.5 unidades logarítmicas, respectivamente (Fig.
38A y B), mientras que, en una infección mixta, únicamente se observó mayor efi-
cacia sobre S. pyogenes (Fig. 38C), indicando que esta enzima presenta mayor
afinidad por S. pyogenes que por S. pneumoniae en estas condiciones (Fig. 39A).
Además, cuando la concentración de la enzima se redujo (Figs. 39B y C), el patrón
de comportamiento se mantuvo.
Sería de especial interés profundizar en el posible efecto sinérgico entre alguna
de las endolisinas estudiadas en este trabajo y otras enzimas líticas, de forma que
se pudiera potenciar el efecto destructivo sobre la red tridimensional formada por el
peptidoglicano a causa de la hidrólisis simultánea de dos enlaces diferentes. A este
respecto ya existen precedentes como en el que una combinación de Cpl-1 y Pal, a
menores concentraciones de las efectivas cuando se inyectaban en solitario, era
capaz de proteger a ratones frente a una infección neumocócica (Jado et al., 2003);
o el caso descrito de la endolisina LysK y la lisostafina actuando sinérgicamente
para matar a S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) (Becker et al., 2008). Otra
interesante alternativa a tener en cuenta en estudios futuros sería la combinación
de endolisinas con diferentes antibióticos, con resultados también sinérgicos en
cuanto al aumento del poder bactericida de los enzibióticos por sí solos, como ya se
ha demostrado con la combinación de Cpl-1 y gentamicina o penicilina (Djurkovic et
al., 2005), daptomicina (Vouillamoz et al., 2013) o la proteína quimérica ClyS junto a
oxacilina (Daniel et al., 2010).
En los últimos años, la búsqueda de tratamientos efectivos contra infecciones
provocadas por más de un patógeno está siendo uno de los principales retos de
investigación en la práctica clínica. Durante muchos años, la única arma disponible
para combatir este tipo de infecciones la constituían los antibióticos. No obstante, y
como ya se ha detallado en la Introducción, tanto el empleo de fagos como de sus
endolisinas está adquiriendo una gran importancia en este área. Por ello, se decidió
diseñar quimeras con las que poder tratar infecciones mixtas, aprovechando el am-
plio rango de hospedador que le otorga a Cpl-7S la presencia de repeticiones
CW_7 en su CWBM. De esta manera, se construyó una primera quimera, Cpl7S-
LasA, fusionando la enzima sintética Cpl-7S con el módulo catalítico de la endopep-
tidasa LasA, éste último en posición C-terminal. LasA se ha descrito que se secreta
por P. aeruginosa (Barequett et al., 2004) y es capaz de eliminar MRSA con mayor
eficacia que la vancomicina o, incluso, en proporción similar a la de la lisostafina
(Dajcs et al., 2002) en el tratamiento de la queratitis provocada por dicha bacteria.
Desgraciadamente, la actividad que mostró esta quimera fue considerablemente
menor que la de Cpl-7S (datos no mostrados). Se podría pensar que la disminución
en la actividad lítica era debida a la carga neta de la proteína completa. Sin embar-
go, esta quimera posee una carga de −7.58 frente a −11.84 de Cpl-7S, por lo que la
carga por sí sola no explicaría este comportamiento. Se pensó entonces que, tal
vez, la presencia de otro módulo catalítico en posición C-terminal pudiera estar
afectando a la unión del CWBM a su ligando y, por tanto, a la actividad enzimática
de la proteína. No obstante, esta hipótesis no parece ser de aplicación general ya
que se ha observado que, por ejemplo, la endolisina PlyBt33 del fago BtCS33 de B.
thuringiensis, con dos dominios catalíticos (lisozima y amidasa), es mucho más
activa que cuando uno de ellos es eliminado (Yuan et al., 2012). En consecuencia,
se requieren experimentos adicionales para poder confirmar o rebatir completamen-
te esta hipótesis.
Se construyó también una segunda quimera, CWBM7S-Cpl711, fusionando el
CWBM de Cpl-7S (en posición N-terminal) con Cpl-711. Esta nueva proteína se
ideó con la finalidad de aunar el amplio rango de hospedador que confiere
CWBM7S a la lisozima Cpl-7S y la gran potencia bactericida de Cpl-711 frente a S.
pneumoniae. No obstante, tampoco en este caso la actividad de la quimera resultó
superior a la de sus enzimas parentales. Por el contrario, el efecto bactericida de la
nueva quimera fue notablemente inferior en comparación con el de Cpl-711 tanto
frente a S. pneumoniae como a S. pyogenes comparado con el de Cpl-7S (datos no
mostrados). Los resultados poco satisfactorios de estas dos quimeras parecen indi-
car que el diseño in silico de nuevas proteínas de fusión no garantiza que las qui-
meras resultantes tengan las características enzimáticas deseadas. También pare-
ce evidente que en el plegamiento de cualquier nueva proteína existen muchos
factores a tener en cuenta que condicionan sus propiedades funcionales y, a veces,
no basta ni siquiera disponer de las estructuras tridimensionales de cada compo-
nente de la quimera para asegurar el éxito.
La posibilidad de utilizar los bacteriófagos de forma terapéutica, conocido gené-
ricamente como “terapia fágica”, ha recibido un renovado interés en los últimos
años debido principalmente a las dificultades en el tratamiento de bacterias multi-
rresistentes. La terapia fágica supone tanto el uso de fagos naturales intactos (virio-
nes) como productos derivados de los mismos. Dentro de los posibles fagos a em-
plear existen dos tipos, los fagos líticos y los atemperados, siendo sólo los primeros
buenos candidatos para su uso como agentes terapéuticos. Hay mucha literatura
científica sobre el empleo de los viriones como herramienta de control sobre bacte-
rias patógenas causantes de infecciones en las más variadas localizaciones (Lu y
Koeris, 2011). Entre otros ejemplos, además de la práctica clínica, se puede citar el
uso de los fagos en la industria alimentaria, donde se busca evitar la contaminación
de los alimentos (Mahony et al., 2011). El auge de las investigaciones centradas en
este tipo de terapia ha hecho que, en la actualidad, sean varias las empresas que
específicamente tengan como objetivo la comercialización de diferentes productos
derivados de fagos y focalizados en la lucha contra diferentes patógenos en diferen-
tes campos como la alimentación, salud, industria ganadera y piscícola, etc. En este
sentido, se ha creado recientemente una página web que resume los enzibióticos
que se han demostrado eficaces en experimentos in vitro e in vivo, y que, además,
recopila los enlaces a las diferentes empresas relacionadas con la terapia fágica
(http://www.phibiotics.org/index.php). En esta página se detalla que dichas empre-
sas están localizadas en Australia, Canadá, EE.UU., India, Israel y varios países de
Europa (Francia, Holanda, Portugal y Reino Unido). De las informaciones recogidas
en las respectivas páginas web se puede deducir que el interés de la mayoría de
dichas empresas se focaliza en los fagos y no tanto en sus productos. Además,
actualmente parece que sólo tres empresas: Novolytics Limited (Reino Unido), Phi-
co Therapeutics (Reino Unido) y Biophage Pharma Inc. (Canadá) se encuentran
próximas a la realización de los primeros ensayos clínicos.
En paralelo a la investigación con los viriones, en los últimos años se están
desarrollando otras estrategias que emplean también algunos productos codificados
por fagos que son capaces de matar específicamente las células bacterianas. Entre
estos productos fágicos destacan claramente las mureín-hidrolasas que pueden
dividirse en las endolisinas ya comentadas, producidas en el citoplasma de las célu-
las infectadas al final del ciclo lítico, y en las enzimas que ciertos fagos llevan aso-
ciadas a la cola del virión (Rodríguez-Rubio et al., 2013). Estas últimas también
hidrolizan enlaces de la pared celular, una vez que se produce la adsorción del fago
a la bacteria hospedadora, para ayudar en el proceso de inyección del DNA fágico.
Algunos ejemplos estudiados con este tipo de enzimas líticas son la proteína Tal2009
del fago Tuc2009 de L. lactis (Kenny et al., 2004), la proteína 17 del fago P68 de S.
aureus (Takác y Bläsi, 2005), y la proteína GP61 del fago φMR11 también de S.
aureus (Rashel et al., 2008). No obstante, la tendencia en los últimos años está
siendo hacia el empleo de las endolisinas no estructurales, probablemente por su
mayor capacidad bactericida cuando se añaden exógenamente sobre un cultivo
bacteriano. Son estas enzimas las que más apropiadamente se conocen como en-
zibióticos y su uso se está diversificando con resultados satisfactorios.
Una de las propiedades más interesantes que parecen mostrar todas estas en-
zimas fágicas, además de sus efectos bactericidas, es su gran robustez bioquímica
que se manifiesta por una notable estabilidad térmica (Resch et al., 2011; Busta-
mante et al., 2012), como se ha demostrado en esta Tesis en los casos de Cpl-7S y
Cpl-711 (Figs. 28 y 43). Esta característica podría contribuir a facilitar diferentes
tipos de formulaciones aceptables para este tipo de compuestos, como aerosoles,
cremas, etc. En este sentido, un ejemplo interesante fue el empleo de la lisina PlyC
del bacteriófago C1 de estreptococos como desinfectante en forma de aerosol para
erradicar o, al menos, reducir la carga de un patógeno como S. equi subsp. zooepi-
demicus en una gran variedad de materiales y equipos empleados en establos
(Hoopes et al., 2009). De hecho, el Prof. Fischetti ya había propuesto en el año
2004 el empleo de las enzimas fágicas en la clínica, no sólo como tratamiento tera-
péutico sino también como prevención, por ejemplo en los hospitales donde las
enfermedades nosocomiales constituyen un gran problema. En este hipotético ca-
so, las personas más expuestas al riesgo de determinadas infecciones bacterianas
podrían tratarse con sprays con un cóctel apropiado de enzimas para eliminar los
patógenos que pudieran portar en la nasofaringe (Fischetti, 2004). Éste es un esce-
nario al que, afortunadamente, todavía no se ha llegado pero que muchos están
viendo como un futuro cercano e inevitable dado el panorama de los llamados “su-
perbugs” o supergérmenes resistentes a la gran mayoría de los antibióticos dispo-
nibles en la actualidad. Una de las empresas más activas en este campo de investi-
gación es ContraFect Corporation (Nuevo York, EE.UU.), focalizada en el ensayo y
comercialización de productos derivados de fagos. Concretamente, esta empresa
está tratando de desarrollar enzibióticos eficaces contra algunos patógenos Gram-
positivos entre los que se incluyen las cepas MRSA.
En resumen, el conocimiento adquirido sobre las características físico-químicas
de la lisozima Cpl-7 y su variante mejorada apuntan hacia un método general que
podría seguirse para conseguir la máxima actividad de los enzibióticos frente a los
patógenos susceptibles. Dado que este tipo de enzimas son modulares cabe la
posibilidad de fusionar adecuadamente sus elementos estructurales y conseguir
una nueva quimera que mejore las propiedades antibacterianas de las proteínas
parentales, como en el caso de Cpl-711. La gran abundancia de posibles enzibióti-
cos ligada al enorme número de fagos en la naturaleza, junto con la combinación de
propiedades ventajosas de estas proteínas, como son la especificidad de sustrato,
modularidad y robustez enzimática hacen previsible que, en un futuro próximo, se
pueda pensar en diseñar enzimas a la carta frente a diferentes patógenos, espe-
cialmente los que se muestren muy refractarios contra el arsenal de antibióticos
existentes en el mercado. Este escenario futuro pasaría por conseguir el conoci-
miento detallado de las estructuras cristalinas de las mureín-hidrolasas naturales o
sintéticas y las interacciones clave entre módulos y entre la enzima y el correspon-
diente sustrato. De esta forma, no es atrevido pensar que, en pocos años, se po-
drían combinar los módulos adecuados para crear nuevas y mejores enzimas efica-
ces únicamente frente al patógeno, o grupo de patógenos, implicados en una infec-
ción localizada sin afectar la viabilidad de la microbiota circundante.
 VI. CONCLUSIONES
!
1. Se ha secuenciado completamente el DNA del bacteriófago Cp-7 de neumoco-
co, analizándose su comparación con la del genoma de Cp-1.

2. La modificación de la carga neta de la lisozima Cpl-7 ha dado lugar a otra varian-

te de la proteína, Cpl-7S, con un incremento notable del efecto bactericida res-
pecto a su enzima parental, frente a cepas neumocócicas.

3. Se ha fusionado la proteína verde fluorescente al módulo de unión al sustrato de

Cpl-7S. Esta proteína de fusión ha permitido demostrar que las repeticiones
CW_7 permiten la unión a una variedad de bacterias Gram-positivas.

4. La lisozima Cpl-7S tiene un efecto letal muy importante no sólo frente a cepas de
neumococo, incluyendo las multirresistentes, sino también frente a otros patóge-
nos.

5. El tratamiento combinado de Cpl-7S y carvacrol, un aceite esencial, es capaz de

desestabilizar la membrana externa de bacterias Gram-negativas y hacer que
esta enzima tenga también efecto bactericida sobre este tipo de bacterias.

6. Se han construido nuevas enzimas quiméricas intercambiando elementos es-

tructurales de las lisozimas Cpl-1 y Cpl-7S. Una de ellas, Cpl-711, ha demostra-
do poseer mayor efecto lítico que sus enzimas parentales.

7. Se ha demostrado por primera vez la utilidad del modelo de embriones de pez

cebra infectados para ensayar compuestos antibacterianos. Así, Cpl-7S protegió
eficazmente a los embriones infectados por neumococo y S. pyogenes.

8. El efecto bactericida de Cpl-711 se ha validado en un modelo murino de sepsis

provocada por una cepa patógena de neumococo. De igual manera, Cpl-7S
también se ha ensayado en otro modelo murino, esta vez de colonización nasal,
comprobándose que Cpl-7S protege frente a la infección mixta provocada por S.
pneumoniae y S. pyogenes.

9. Se han aportado datos para avanzar en el diseño racional de enzimas quiméri-

cas, mediante la combinación de diferentes módulos, que permita obtener endo-
lisinas con nuevas y mejores propiedades líticas dirigidas específicamente frente
a infecciones bacterianas.
 VII. BIBLIOGRAFÍA
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 ANEXO

PUBLICACIONES Y PATENTES, HASTA LA FECHA, DURANTE LA

REALIZACIÓN DE ESTA TESIS

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