Bioquímica de Procesos 39 (2004) 547–555

Optimización de las condiciones de inmovilización para la producción de

vinagre. Siran, astillas de madera y espuma de poliuretano como
portadores de Acetobacter aceti
Ignacio de Ory∗, Luis E. Romero, Domingo Cantero
Departamento de Ingeniería Química, Tecnología de los Alimentos y Tecnologías Ambientales,
Universidad de Cádiz, Pol. R'ıo S. Pedro, S/N, 11.510 Puerto Real, Cádiz, España
Recibido el 25 de julio de 2002; recibida en forma revisada el 15 de febrero de 2003; aceptado el 5 de abril de 2003

Abstracto

Se ha desarrollado un diseño experimental completo para estudiar las propiedades de tres portadores sólidos diferentes (Siran, astillas de
madera y espuma de poliuretano) en la inmovilización de bacterias del ácido acético. Se emplearon reactores de temperatura controlada de
450 ml de volumen para comparar un procedimiento de inmovilización estándar que consistía en fermentaciones consecutivas discontinuas
de ácido acético en presencia del portador. Al llegar a la condición de saturación final, los diferentes portadores inmovilizados fueron
retirados e introducidos en reactores esterilizados idénticos. Estos fueron sometidos a varios ciclos de fermentación semicontinuos con el
objetivo de caracterizar y comparar sus propiedades de acetificación. Los datos de inmovilización y acetificación obtenidos en este estudio
han sido evaluados con el fin de determinar el mejor material portador sobre la base de varios criterios técnicos. La espuma de poliuretano
fue la más exitosa porque permite una gran cantidad de células inmovilizadas en el menor tiempo posible y conduce a la tasa de
acetificación más alta de los tres portadores ensayados. © 2003 Elsevier Ltd. All derechos reservados.

Palabras clave: Inmovilización; Acetobacter aceti; Fermentación del ácido acético; Siran; Astillas de madera; Espuma de poliuretano

1. Introducción físicos y químicos, o el atrapamiento físico de células

En los últimos años, las técnicas de inmovilización
celular se han vuelto cada vez más importantes y se están
aplicando con éxito en procesos industriales como la
producción de alcoholes (etanol, butanol e isopropanol),
ácidos orgánicos (incluidos los ácidos málico, cítrico,
láctico y glucónico), enzimas (celulasa, amilasa, lipasa y
otros) y la biotransformación de esteroides para la
producción de hormonas, el tratamiento de aguas residuales
y las aplicaciones alimentarias (cerveza, vino, carne,
azúcares) [1]. En términos generales, la libertad en el
movimiento celular puede restringirse de dos maneras
principales: la adsorción de células (ya sea entre las propias
células o a una superficie portadora sólida) con enlaces
dentro de los portadores [2].
Se ha realizado muy poco trabajo de desarrollo utilizando
estas técnicas en la industria del vinagre y, en este sentido,
hay grandes expectativas para el futuro cercano. Además,
sólo se han publicado unos pocos artículos que describen la
aplicación de estas técnicas a los procesos de fermentación
que
∗ Autor para correspondencia. Tel.: +34-95-601-
6300x6831; fax: +34-95-601-6411.
Dirección de correo electrónico: ignacio.deory@uca.es (I. de Ory).
0032-9592/$ – ver portada © 2003 Elsevier Ltd. Todos los derechos
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reservados. inconvenientes de escalabilidad experimentada con las
doi:10.1016/S0032-9592(03)00136-5
matrices de encapsulación.
implican el uso de bacterias de ácido acético. En este
El trabajo descrito aquí implicó la inmovilización de la
caso, el microorganismo es estrictamente aeróbico y, por
bacteria Acetobacter aceti por adsorción en tres
lo tanto, es muy importante considerar la resistencia
portadores sólidos diferentes: Siran, astillas de madera y
mecánica de los soportes a la transferencia de oxígeno,
espuma de poliuretano. Estos portadores se eligieron
una propiedad que se convierte en el factor más limitante
teniendo en cuenta las posibilidades de ampliar el
[3,4]. En cualquier caso, se ha informado ampliamente en
procedimiento de aplicación en procesos de vinagre
la literatura que la inmovilización imparte una estabilidad
industrial. El objetivo del trabajo fue analizar las
especial a las bacterias contra los efectos negativos de las
propiedades de adhesión celular en cada caso y valorar
concentraciones de temperatura, pH, etanol y ácido
las propiedades de fermentación de los portadores
acético [5], así como evitar el lavado de la población de
inmovilizados obtenidos.
células al utilizar altas tasas de dilución en el modo de
De los tres soportes sólidos propuestos, sólo se han
operación continua.
ensayado previamente astillas de madera para la
La adsorción a superficies y la encapsulación dentro de
inmovilización de bacterias del ácido acético [9,10] y se
geles o materiales porosos (un tipo particular de
obtuvieron buenos resultados en estos estudios (≈108
atrapamiento físico) han sido los métodos más
células inmovilizadas/g de portador; ≈1◦/día de tasa de
ampliamente estudiados para la inmovilización de
acetificación).
bacterias del ácido acético (Tabla 1). Estas técnicas
representan una forma particular de adhesión celular
basada en la capacidad de ciertos microorganismos para 2. Materiales y métodos
fijarse a superficies sólidas mediante la secreción de
polimucosacáridos [20].. Cuando el tamaño de poro de la 2.1. Medio, microorganismo y portadores
matriz es pequeño, teniendo en cuenta las dimensiones de
la célula, la adsorción se produce solo en la superficie, Como medio inicial se utilizó un vino joven de la zona
como en el caso de la tierra de diatomeas, arcillas. de Jerez-Xèrés-Sherry. La concentración de etanol osciló
y otros materiales relacionados. Sin embargo, cuando el entre 71 y 79 g/l y la acidez total estuvo en el rango de
portador tiene poros que son grandes en relación con las 2,5-5 g/l, expresada como concentración de ácido acético.
dimensiones de la célula, es posible encontrar adhesión La cepa responsable de las fermentaciones aquí descritas
dentro de los poros. Esta situación se produce
Cuadro 1
Varios de los principales artículos publicados sobre la inmovilización de Acetobacter aceti
Autor Año Portador Método Biorreactor

Kennedy et al. [6] 80 Titanio hidratado (IV) Adsorción/agregación Fermentador de torre

Ghommidh et al. [3] 81 Monolito cerámico Adsorción Columna empaquetada
Okuhara [7] 85 Fibras de polipropileno Adsorción Columna empaquetada
Nanba et al. [8] 85 Fibras de polipropileno Adsorción Columna empaquetada
Adams y Twiddy [9] 87 Astillas de madera Adsorción Columna empaquetada
Garg et al. [10] 95 Astillas de madera Adsorción Matraz Erlenmeyer
Gel de alginato de calcio Atrapamiento Matraz Erlenmeyer

Lotong et al. [5] 89 Paño de toalla de algodón Adsorción Reactor de disco

giratorio
Sueki et al. [11] 91 Cerámica de afrocélula Adsorción Columna empaquetada
Horiuchi et al. [12,13] 00, 01 Pellets de carbón vegetal Adsorción Columna empaquetada
Krisch y Szajani' [14,15] 96, 97 Lechos de celulosa Adsorción Erlenmeyer
Gel de alginato de calcio Atrapamiento Erlenmeyer

Osuga et al. [4] 84 -gel de carragenina Atrapamiento Lecho fluidizado

Mori [16] 85 -gel de carragenina Atrapamiento Lecho fluidizado
de Araujo y Santana [17] 96 Gel de alginato de calcio Atrapamiento Tanque agitado
Levitsky et al. [18] 98 Gel de alginato de calcio Atrapamiento Columna de burbujas
Ikeda et al. [19] 97 Membrana de diálisis Separación de membranas Reactor
electrocatalítico
en materiales como carbón activo, espuma de poliuretano y fue un cultivo mixto totalmente adaptado a las
vidrio sinterizado. condiciones de fermentación industrial, siendo la
Las técnicas de adsorción reducen los problemas principal proporción predominante Acetobacter aceti
asociados con la difusión de oxígeno y no sufren los (ATCC15973).
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Cuadro 2
Resumen de las principales características de los portadores ensayados
Siran Astillas de madera Espuma de
poliuretano
Marca SCHOTT-Sikug (012/02/300/A)

Material Vidrio sinterizado Chips de roble PUF comercial

Forma Esferas Ligeramente curvado Cubos
Tamaño 1–2 mm 1,5 mm de longitud; 1 mm de ancho 1 cm de longitud
Densidad 0,7–1,2 g/ml 1,092 g/ml 0,02 g/ml
Porosidad 60% 96.7% 97%
Tamaño promedio de los poros Poros pequeños: 10–20 m 15 metros 400 metros
Poros grandes: 60–300 m
Aplicación/referencia Bacterias nitrificantes [21] Bacterias del ácido acético [9,10] Pseudomonas sp. [22]
Micrografías electrónicas de barrido Figura 2 Figura 3 Figura 4

Los portadores utilizados fueron unidades de Siran,

astillas de madera y espuma de poliuretano. Sus
principales características se resumen en la Tabla 2.
2.2. Reactor

El equipo utilizado para la inmovilización y posterior

fermentación está representado en la Fig. 1 y consta de
unidades de reactor de 6×500 ml (disponibles
comercialmente en Schott) (1): son recipientes cilíndricos
de vidrio con una cubierta de cierre superior. Cada reactor
estaba equipado con una entrada de gas (2) conectada, a
través de una varilla interna sumergida en el líquido, a un
difusor de aire de vidrio sinterizado (tamaño de poro medio:
100 m). Este último dispositivo permite la dispersión del
aire en forma de pequeñas burbujas y también evita la
coalescencia de burbujas. El reactor también incorporó una
salida de flujo de gas superior (3).

Figura 1. Equipo de fermentación de ácido acético a escala de laboratorio

(volumen de trabajo 450 ml).
Figura 2. Fotomicrografía (×150) de distribución de poros en una
partícula SIRAN, mostrando macro y microporos.

La agitación y el calentamiento se facilitaron

colocando los reactores en un agitador termostático
orbital (4). Este aparato tiene la capacidad de mantener
550 I. de Ory et al./Process Biochemistry 39 (2004) 547–555
una temperatura constante de 30◦C, recomendada en Ref.
[23], y un régimen de agitación orbital de 200 rpm.
Las condiciones de saturación de O2 estaban garantizadas
por una bomba de aire que suministraba un caudal de aire
volumétrico constante de 0,2 vvm
Figura 3. Longitudinal (×130) y transversal
Figura 4. Estructura interna de ESPUMA DE
POLIURETANO (×50).
[24] . La bomba de aire (5) se conectó a la entrada del
reactor a través de una tubería que contenía un filtro
de gas amicróbico insertado de 0,22 m de tamaño de
poro (6). También se insertó un filtro similar en la
tubería de salida de gas.
El muestreo, la carga media y la descarga, el cargo
del portador de inmovilización, los trabajos de
mantenimiento y limpieza fueron posibles al
desacoplar la cubierta superior.
(×200) cortes en unidades de WOOD CHIPS ensayadas.
2.3. Inmovilización
En una primera etapa, se utilizó el mismo peso (4 g) de
portador en todos los experimentos para obtener
resultados comparables. Inicialmente, el reactor que
contenía 4 g de portador se esterilizó utilizando calor
húmedo a 120 ° C durante 20 minutos en un sistema de
esterilización convencional. El vino (el sustrato) se filtró
y, en consecuencia, se esterilizó a través de una
membrana de 0,22 m de tamaño de poro. El uso de este
método evita el calentamiento involucrado en el proceso
de esterilización convencional, cuyo efecto podría
conducir a efectos indeseables en el sustrato.
En una segunda etapa, se insertó inóculo (450 ml) en
cada reactor. El inóculo fue un cultivo seleccionado con
características uniformes: un medio de fermentación
natural (vinagre) con un rango de concentración de etanol
de 23-32 g/l, una concentración de ácido acético entre 40
y 50 g/l y una gran población celular de Acetobacter
aceti en su fase de crecimiento exponencial (>500×106
células/ml). En términos generales, la inoculación y
puesta en marcha del reactor de acetificación se basó en
un protocolo publicado anteriormente [25]..
El proceso de inmovilización fue finalmente
desarrollado por sucesivos ciclos de fermentación del
ácido acético. Un ciclo de fermentación varió de 40 a 80
g / l (en concentración de ácido acético) de principio a
fin. Todo el proceso se desarrolló con el portador dentro
del reactor.
Inicialmente, el reactor contenía 450 ml de medio con
una acidez total de 40-50 g/l y la capacidad de producir
otros 40 g/l. En estas condiciones (velocidad de
agitación: 200 rpm; aireación: 0,2 vvm; temperatura:
30◦C) la fermentación se desarrolló rápidamente y el
medio alcanzó los 80 g/l de acidez total en 72-96 h. En
este punto, se tomó el primer ciclo de inmovilización para
estar terminado.
El segundo ciclo comenzó con la eliminación de cada
reactor de un volumen calculado del producto de tal
manera que, después de la sustitución por vino fresco
estéril, se registró una disminución de la concentración de
ácido acético (hasta 50 g/l de acidez total); en este caso,
aproximadamente 170 ml. Este proceso representa el
inicio de un nuevo ciclo de fermentación semicontinuo en
el que se produce una mayor inmovilización de la
biomasa. Todo el proceso de inmovilización implicó
sucesivos ciclos semicontinuos, con valores de
concentración de ácido acético en el rango de 50-80 g/l,
hasta que el análisis de biomasa adherida mostró que se
había logrado la saturación del portador (estabilización
del número de células inmovilizadas).
2.4. Fermentación
Una vez alcanzado el punto de saturación final, todas
las partículas portadoras se retiraron de sus reactores de
inmovilización y se introdujeron en los reactores de
fermentación. Estos reactores eran idénticos a los
utilizados para la etapa de inmovilización. Los reactores
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de fermentación eran completamente estériles y contenían
450 ml de vinagre filtrado (concentración de ácido
acético de 50 g/l y concentración de etanol de 32 g/l).
Así, la fermentación del ácido acético (velocidad de
agitación: 200 rpm; aireación: 0,2 vvm; temperatura:
30◦C) se considera realizada exclusivamente por las
bacterias adsorbidas, sin ningún aporte inicial de la
biomasa sumergida.
Una vez finalizado el ciclo de acetificación
(concentración de ácido acético: 80 g/l; concentración de
etanol ≤8 g/l) se extrajo todo el portador de cada reactor y
se introdujo en nuevos reactores estériles. Posteriormente,
se inició un nuevo ciclo de fermentación del ácido acético.
551
3. Resultados y discusión
3.1. Proceso de inmovilización
Las Figs. 5-7 muestran datos para los ciclos de
inmovilización bacteriana para cada uno de los seis
reactores (experimentos por duplicado), utilizando
condiciones idénticas para los tres portadores: Siran, astillas
de madera y espuma de poliuretano. Las concentraciones
de ácido acético y biomasa sumergida se midieron durante
el

2.5. Análisis

El etanol se analizó mediante un cromatógrafo de gases

HEWLETT PACKARD 5890 Serie II con columna capilar
(Carbowax 20M sobre cromosorb 0,2 m) y un detector FID.
El ácido acético se midió teniendo en cuenta que otros
ácidos orgánicos están presentes en el vinagre en cantidades
insignificantes [26],por lo que es razonable suponer que la
acidez total es un buen indicador de la concentración real de
ácido acético. Esta concentración se determinó por Figura 5. Datos experimentales de concentración de ácido acético vs.
titulación con NaOH con fenolftaleína como indicador. tiempo durante los ciclos de inmovilización (I-VIII) en los reactores de
La biomasa total se determinó mediante recuento laboratorio (SIRAN). Los puntos negros representan los puntos de
estadístico con una cámara de Neubauer y mediante muestreo para la desorción y el recuento.
microscopía óptica.
La concentración de biomasa inmovilizada se midió
utilizando una técnica desarrollada específicamente para el
trabajo aquí descrito. En la primera etapa, se retiraron 100
mg de portador colonizado del reactor y se sumergieron en
un matraz Erlenmeyer que contenía 25 ml de solución
tampón de acetato de sodio (pH 4.6). En el segundo paso, el
matraz se colocó en un baño ultrasónico a temperatura
ambiente durante 15 minutos. Estas condiciones condujeron
a la desorción total de las células adheridas. En la última
etapa, el método de recuento de la cámara de Neubauer para
las células sumergidas se llevó a cabo en la fase líquida.
Posteriormente, el soporte se retiró del matraz y se secó en Figura 6. Datos experimentales de concentración de ácido acético vs.
un horno a 80 ° C durante 24 h. Entonces fue posible tiempo durante los ciclos de inmovilización (I-VIII) en los reactores de
laboratorio (WOOD CHIPS). Los puntos negros representan los puntos de
calcular el número de células inmovilizadas por miligramo
muestreo para la desorción y el recuento.
de portador (célula/mg). Esta técnica ha sido validada
previamente mediante el desarrollo de experimentos
relacionados con la resistencia celular al tratamiento
ultrasónico y el estudio de la eficiencia de desorción.
Todas las fotomicrografías presentadas en este trabajo se
tomaron utilizando un microscopio electrónico de barrido
Jeol JSM-820, siguiendo un tratamiento fisicoquímico
previamente estandarizado de las muestras: fijación con
glutaraldehído (2,5%) a 4◦C durante 2 h, sal de cacodilato
(0,1 M, pH 7,0) durante 30 min, tetróxido de osmio (1%)
durante 1 h, deshidratación con acetona y secado, y
metalización con oro.
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ciclos semicontinuos para cada reactor, junto con la (agitación, aireación, cantidad de portador, etc.). El
cantidad de biomasa adsorbida en los portadores mediante desarrollo de la cantidad de biomasa inmovilizada en
recuentos al final de cada ciclo. Sin embargo, solo los datos cada portador en función del tiempo se representa en la
de concentración de ácido acético se muestran en las figuras Fig. 8.
y los datos que corresponden a cualquier recuento de Se puede ver en las Figs. 5-7 que se llevaron a cabo
bacterias inmovilizadas se representan como puntos negros. ocho ciclos de acetificación semicontinuos para cada

El numérico reactor. Las concentraciones de ácido acético en el medio

se controlaron entre 50 g/l (al inicio de cada tirada) y 70-
80 g/l (al final) con un tiempo promedio de casi 110 h
(4,6 días). Un alto grado de reproducibilidad en los
resultados es evidente para cada reactor y, como
consecuencia, los ciclos desarrollados en los seis
reactores diferentes muestran esencialmente el mismo
comportamiento independientemente del portador
utilizado.
Cada ciclo comienza con una fase de retraso corto en la
que el crecimiento y la producción son bajos como
consecuencia del cambio en las condiciones medias y la
dilución de la biomasa sumergida. La duración de esta
fase generalmente depende de las concentraciones
Figura 7. Datos experimentales de concentración de ácido acético vs. iniciales de etanol y ácido acético y está en el rango de 40
tiempo durante los ciclos de inmovilización (I-VIII) en los reactores de a 100 h. Una vez finalizada esta fase de rezago, el cultivo
laboratorio (ESPUMA DE POLIURETANO). Los puntos negros inicia una fase de crecimiento exponencial.
representan los puntos de muestreo para la desorción y el recuento.
Cuadro 3
Concentración media de biomasa inmovilizada en cada portador Figura 8. Datos experimentales de biomasa inmovilizada en Mcel/mg
ensayado (Siran, astillas de madera y espuma de poliuretano), en (millones de células por miligramo de portador) vs. tiempo de proceso
Mcel/mg (millones de células/mg de portador) en función del tiempo (h), para los tres portadores ensayados.
Ciclos semicontinuos Hora Siran Astillas de Poliuretano y se produce una producción máxima, que alcanza los 70-
(h) Mcel/mg madera Mcel/mg 80 g/l. Esta es la fase más interesante desde el punto de
Mcel/mg
0 0 0 0 0
vista de la multiplicación celular y, por supuesto, en
1 94 1.35 3.06 0.50
términos de inmovilización de la biomasa en los
3 311 2.12 5.97 10.42 portadores. Las tasas de acetificación encontradas en cada
5 505 4.40 8.27 12.44 ciclo varían y oscilan entre 4,6 y 5,0 g/l día. Esta tasa no
6 689 1.45 7.05 9.30 depende del tipo de portador sumergido en el líquido,
7 854 16.39 6.26 10.99 sino del estado de actividad de la biomasa sumergida. Por
8 950 13.00 10.00 10.25
lo tanto, antes de la inmovilización, la acetificación en
los resultados de dichos recuentos, expresados en relación esta fase se produce principalmente por la biomasa
con el número de miligramos de portador y promediados sumergida y la adsorción de la biomasa en el portador no
para los ensayos por duplicado, se muestran en la Tabla 3. afecta notablemente los ciclos de desarrollo.
De los datos dados en la Tabla 3 se puede observar que Como se puede ver en los datos relevantes de la Tabla
dado que el proceso ya duraba 800 h, se alcanzó la 3, la reproducibilidad obtenida en los datos de recuento
saturación de los portadores en las condiciones utilizadas
 I. de Ory et al./Process Biochemistry 39 (2004) 547–555 553
para cada par de reactores es satisfactoria para un
portador dado. Se puede observar una disparidad no
sensible debido a las circunstancias únicas de cada
fermentación y los errores analíticos inherentes al uso de
la microscopía. En términos gráficos, se ha obtenido una
media aritmética de cada par de valores para describir la
cantidad de inmovilización total frente al tiempo. Dado
que el proceso ya había estado en funcionamiento durante
800 h, se observaría cualquier variación en la tendencia
de la biomasa inmovilizada, y esto se vio que no
cambiaba durante las últimas 200 h de operación. Es
necesario tener en cuenta la influencia que la alta
velocidad de agitación tiene en el límite máximo de
inmovilización. Para el reactor descrito anteriormente, la
velocidad de agitación (200 rpm) se consideró la más
Figura 9. Fotomicrografía (SEM ×3000) de una estructura de microporos
adecuada para establecer un equilibrio satisfactorio entre
dos efectos; por un lado, la agitación vigorosa mejora las en una unidad de SIRAN con bacterias de ácido acético inmovilizadas.
condiciones generales para la transferencia de masa a la
biomasa sumergida y, como consecuencia, aumenta la que puede ser inmovilizado por el portador es de
población total de biomasa y el número de células aproximadamente 13 Mcel/mg (millones de células por
adsorbidas en el portador. Por otro lado, los efectos de miligramo de portador) y se requeriría un tiempo de
erosión, las tensiones de colisión y otros fenómenos operación de 800 h (34 días) para garantizar la máxima
pueden ser producidos por agitación turbulenta, adsorción celular. La Fig. 9 muestra una micrografía
posibilidades que pueden dificultar seriamente los electrónica de barrido (SEM ×3000) de una unidad de Siran
procesos de adsorción de células superficiales [16] Tales y se puede observar claramente una estructura de
propiedades podrían incluso conducir a la desorción microporos que contiene bacterias de ácido acético
parcial de la población inmovilizada [27], así como a un adheridas (bacilo de 2 a 3 m de longitud).
aumento en las pérdidas totales por evaporación del El progreso de la biomasa inmovilizada en astillas de
sistema abierto. madera frente al tiempo (ver Fig. 8) es perceptiblemente
Es necesario un análisis exhaustivo de la diferente del registrado para Siran. El número de células en
inmovilización para cada portador con el fin de establecer este portador aumenta progresivamente con el tiempo,
sus propiedades características. El proceso de ajustándose a una tendencia logarítmica de acuerdo con los
inmovilización de la biomasa en el Siran vs. tiempo se perfiles de adsorción típicos. Esta situación es característica
ajusta a una curva sinusoidal en la que se pueden de las superficies regulares en las que las estructuras de los
distinguir claramente dos fases (ver Fig. 8). Se puede poros no varían significativamente en tamaño, pero todos
observar que la biomasa se adhiere a Siran de forma los poros en el portador tienen una accesibilidad similar. En
progresiva (pero lenta) hasta un tiempo de proceso de 500 este caso, la saturación del portador es el factor clave y
h. Esta zona bien puede corresponder a una adhesión apunta al límite asintótico de la capacidad máxima de
superficial de bacterias a la superficie externa, es decir, inmovilización. En las condiciones experimentales
macroporos (60-300 m), que son las zonas más accesibles utilizadas en este estudio, la cantidad máxima de biomasa
del portador. Una vez alcanzada la máxima capacidad de que las astillas de madera pueden inmovilizar es de
inmovilización en los macroporos, los grandes aproximadamente 8,25 Mcel/mg después de 500 h de
microporos comienzan a colonizarse (10-20 m de funcionamiento (21 días). La Fig. 10 muestra un SEM
diámetro). La capacidad de adhesión total de los (×3500) de una de las unidades.
microporos supera a la de los macroporos. La aparición
de una zona de inflexión en la tendencia de la curva es
fundamental para garantizar una máxima adsorción del
portador. Si el proceso se hubiera detenido antes de este
tiempo, el potencial real del transportista se habría
desperdiciado. En las condiciones experimentales
utilizadas en este estudio, la cantidad máxima de biomasa
 554 I. de Ory et al./Process Biochemistry 39 (2004) 547–555

Figura 10. Fotomicrografía (SEM ×3500) de una superficie WOOD CHIP Figura 11. Fotomicrografía (SEM ×3000) de la superficie de ESPUMA DE
con bacterias inmovilizadas de ácido acético. POLIURETANO con bacterias de ácido acético inmovilizadas.

La estructura interna de la espuma de poliuretano podría

explicar la forma característica de los datos experimentales
de biomasa inmovilizada (Fig. 8). Tras una etapa inicial de
100 h sin ninguna inmovilización apreciable, se observa un
aumento repentino de la biomasa adherida y, a las pocas
horas, se alcanza la colonización máxima del portador. A
partir de este momento, no se registra una mayor adsorción.
Esta situación podría estar directamente relacionada con el
comportamiento hidrodinámico de la espuma de
poliuretano sumergida en la fase líquida. Durante los
primeros ciclos las partículas de portador permanecen
secas, pero a medida que el proceso continúa se vuelven

Figura 12. Datos experimentales de concentración de ácido acético () y biomasa sumergida () vs. tiempo durante los ciclos de fermentación con bacterias de
ácido acético inmovilizadas en SIRAN.

Figura 13. Datos experimentales de concentración de ácido acético () y biomasa sumergida () vs. tiempo durante los ciclos de fermentación con bacterias de
ácido acético inmovilizadas en WOOD CHIPS.
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gradualmente completamente húmedas por acción capilar.
Después de este punto, la colonización celular del portador
comienza a un ritmo alto (pendiente de la curva ≈0,06
Mcel/mg h). Es factible que esta colonización hubiera sido
aún más rápida si se hubiera empleado un dispositivo para
el remojo de espumas desde el inicio del proceso. Casi
todas las inmovilizaciones se producen en un tiempo de
operación de 215 h (de 94 a 311 h), un hecho que es clave
para el éxito del proceso global. La estructura altamente
porosa de este portador (más del 97%) facilita la exposición
total de la superficie y evita problemas asociados con la
accesibilidad para las células después del remojo. Como
consecuencia, se observa una alta homogeneidad para la
adhesión bacteriana con este material. La capacidad
máxima de inmovilización se alcanza (alrededor de 10,5
Mcel/mg) después de un tiempo de proceso de
aproximadamente 300 h (13 días) y más allá de este punto
no hay un aumento significativo. La Fig. 11 muestra un
SEM (×3000) de un portador de espuma de poliuretano,
que fue retirado del reactor. La aparición de
556 I. de Ory et al./Process Biochemistry 39 (2004) 547–555
Las bacterias del ácido acético adheridas a la superficie
de la partícula se pueden ver claramente.
3.2. Fermentación con biomasa inmovilizada
En esta sección se discuten los datos experimentales de
las concentraciones de ácido acético y biomasa
sumergida. Estos datos corresponden a ciclos de
fermentación desarrollados mediante el uso de biomasa
inmovilizada en los tres portadores ensayados (Figs. 12-
14). De los datos obtenidos en estos experimentos se
pueden extraer una serie de conclusiones importantes:
Los datos experimentales muestran que es posible
obtener un conjunto completo de ciclos de fermentación
reproducibles para cada uno de los portadores estudiados.
La actividad de la biomasa inmovilizada se mantiene
estable con tasas de acetificación constantes observadas.
La espuma de poliuretano se destaca de los otros dos
soportes ensayados en que conduce a la tasa máxima de
acetificación (más de 5 g / l día). Sin embargo, es
importante tener en cuenta la disminución general en el
rendimiento de fermentación a medida que avanzan estos
ciclos, una disminución que se debe a las pérdidas por
evaporación (que van del 5 al 15% en cada ciclo).
Se puede ver en las Figs. 12-14 que, al comienzo de
cada ciclo, no se observa la aparición de biomasa
sumergida. Este fenómeno se debe a la esterilización
previa del reactor, hecho que significa que cualquier
bacteria en el reactor debe estar presente como biomasa
inmovilizada. Después de la puesta en marcha del reactor,
el contacto entre el portador y el líquido y la agitación
intensa conducen a la desorción progresiva de la
biopelícula. Como consecuencia, se observa la presencia
de células suspendidas en el medio. Esta nueva población
tiene una capacidad reproductiva y fermentativa
completa. La proporción de células sumergidas en el total
de células (es decir, células sumergidas + adheridas)
aumenta de cero a 20% en 75 h, y a 100% (la misma
cantidad de células sumergidas y adheridas) al final de
cada ciclo. De hecho, es posible encontrar un mayor
número de células sumergidas que la biomasa
inmovilizada. Es el caso de la espuma de poliuretano, que
aporta una población de biomasa adicional derivada del
líquido que queda dentro de su estructura intersticial. Por
lo tanto, es de gran interés evaluar la contribución al
Figura 14. Datos experimentales de concentración de ácido acético () y biomasa sumergida () vs. tiempo durante los ciclos de fermentación con bacterias de
ácido acético inmovilizadas sobre ESPUMA DE POLIURETANO.
proceso de acetificación de cada fracción de biomasa
(inmovilizada y sumergida). Se puede concluir que la
biomasa sumergida es la responsable del aporte principal
porque no sufre los problemas de difusión típicamente
asociados a los portadores sólidos y, además, tiene una
mejor disponibilidad de los nutrientes necesarios para su
metabolismo celular. Como consecuencia, esta doble
contribución puede verse como un punto positivo en el
sentido de que el papel principal de la biopelícula sería
proporcionar una fuente constante de biomasa para el
medio a través del equilibrio dinámico continuo de
adsorción-desorción en la interfaz.
3.3. Selección del mejor transportista para
inmovilización y fermentación
Cuatro criterios son los más relevantes para establecer las
comparaciones adecuadas entre los diferentes portadores
ensayados: capacidad de inmovilización, tiempo para el
proceso de inmovilización, tasa de acetificación con
biomasa inmovilizada y, finalmente, estabilidad mecánica
del portador. Además, se tendrá en cuenta una quinta
característica importante: el coste económico de cada
transportista. El análisis de los criterios antes mencionados
aplicados al sólido ensayado respalda los resultados:
Si solo se considera la capacidad de inmovilización, está
claro que Siran sería el portador más adecuado porque
permite la inmovilización de un mayor número de células
por miligramo de sólido. Sin embargo, los otros dos
materiales también son más que aceptables para la
inmovilización, ya que sus valores también pueden
considerarse altos. Además de los valores comentados
anteriormente es muy importante tener en cuenta el tiempo
necesario para alcanzar la máxima capacidad de
inmovilización. En este sentido, la espuma de poliuretano
tiene la capacidad de alcanzar una cantidad aceptable de
biomasa adherida en un tiempo sustancialmente menor que
los otros dos sólidos. La estructura porosa es altamente
uniforme en la espuma, un hecho que facilita la rápida
adhesión celular. Así, aunque la cantidad de bacterias
inmovilizadas en la espuma es un 20% menor que la
inmovilizada en Siran, la espuma da un tiempo un 70% más
rápido que Siran, haciendo que la operación sea más
rentable. Este equilibrio entre las propiedades es aún más
favorable si se comparan los datos apropiados para las
 I. de Ory et al./Process Biochemistry 39 (2004) 547–555
astillas de madera. Los datos obtenidos para las tasas de
acetificación en el proceso con biomasa inmovilizada son
claramente los mejores para la espuma de poliuretano. Por
último, también hay que tener en cuenta otros aspectos
económicos. La espuma de poliuretano es, sin lugar a
dudas, el material más barato de los tres ensayados y
también está fácil y ampliamente disponible. Las astillas de
madera se pueden obtener ya sea a partir de barricas de
envejecimiento antiguo o por adquisición directa, pero en
ambos casos las virutas requieren tratamiento químico
previo a la inmovilización, hecho que aumenta el coste de
esta opción. Finalmente, Siran es un material sintético
costoso y quizás se usa mejor a escala de laboratorio. Siran,
sin embargo, no parece ser una alternativa viable para las
fermentaciones industriales de ácido acético en este
momento.
4. Conclusiones
De los tres portadores ensayados, el mejor para la
inmovilización de bacterias del ácido acético y la posterior
etapa de acetificación con biomasa adherida a escala de
laboratorio es la espuma de poliuretano. La espuma de
poliuretano permite la inmovilización de un gran número de
células (unos 10,5 millones/mg) en poco tiempo (300 h).
Además, conduce a la tasa de acetificación más alta de los
tres portadores ensayados (4,74 g / l día), lo que hace que
los rendimientos generales sean más altos. Además, es un
material inerte y es muy barato, lo que hace que el proceso
sea potencialmente adecuado para la ampliación industrial.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a primitivo Collantes Wine
and Vinagre Cellar por el suministro de materias primas.
Este trabajo fue posible gracias al apoyo económico del
CICYT-FEDER (Ref. 1FD97-0796-c02-02).
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