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ISSN: 0185-5751
publicacionesbioquimia@prodigy.net.mx
Sociedad Mexicana de Bioquímica A. C.
México
RESUMEN ABSTRACT
La lucha contra los microorganismos patógenos, causantes Struggle against food-borne pathogenic microorganisms
de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) requiere is based on plausible policies for sanitary inspection, thus
de procedimientos adecuados de inspección sanitaria, lo que leading to the development of faster and more effective
ha llevado al desarrollo de métodos cada vez más rápidos y methods for detecting and identifying hazardous bacteria
efectivos para la detección e identificación de bacterias noci- in those areas where biological hazard pose a security
vas en las áreas en las que la seguridad biológica es de mu- problem. Identification techniques based on culture me-
cha importancia. Las técnicas de identificación basadas en thods and phenotypic characteristics of bacteria are tedious
el cultivo y las características fenotípicas de las bacterias and can overtake weeks, making them unpractical for ana-
son laboriosas y pueden requerir varias semanas para obte- lyzing perishable foodstuff such as dairy, meat, poultry
ner resultados, lo cual no resulta viable cuando se analizan and fish. The application of culture-independent methods
alimentos perecederos como los lácteos y la carne fresca. La such as the polymerase chain reaction (PCR) can help to
aplicación de métodos de detección independientes de culti- solve this problem. Current efforts are aimed to the esta-
vo, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) pue- blishment of international standards for the application of
de ayudar a resolver los problemas antes mencionados, aún PCR-based methods for the detection of pathogenic bacte-
cuando es necesario que estos métodos cuenten con una va- ria in foods. In this paper, the usefulness and advantages/
lidación internacional. En el presente trabajo se revisa la disadvantages of PCR as a tool for the identification of
utilidad, ventajas y desventajas de la PCR como herramien- pathogenic bacteria in foodstuff, as well as the new trends
ta para la detección e identificación de bacterias patógenas of its application and current efforts toward international
en muestras de alimentos, así como las nuevas tendencias standardization of protocols are reviewed.
en el uso de estas herramientas moleculares de diagnóstico
y los esfuerzos actuales tendientes a su estandarización in-
ternacional.
Palabras clave: PCR, detección, bacterias patógenas, ali- Key words: PCR, detection, pathogenic bacteria, food.
mentos.
* Unidad Sureste. Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, A. C. Av. Normalistas 800 S.H.
Colinas de la Normal. Guadalajara, Jalisco, México.
Correspondencia:
Dr. Rafael Antonio Rojas-Herrera. Unidad Sureste. Calle 30 N0. 151 x 7 y 7-A. Colonia García Ginerés. Mérida, Yucatán, México.
97070. e-mail: rrojas@ciatej.net.mx
Recibido: 02-06-2005
Aceptado: 07-02-2006
nados, entre los que se pueden mencionar pescados y ca, fue descubierta a finales de los años 70 en Cana-
mariscos,1-4 productos cárnicos y avícolas, productos dá. Por otra parte, la cepa enterohemorrágica (EHEC)
lácteos, vegetales,5 huevos frescos6 e incluso la miel de O157:H7 se aisló por primera vez en 1975 y se identi-
abeja.7 Se ha demostrado que los alimentos se pueden ficó en 1982 como un patógeno importante presente
contaminar durante su procesamiento o por el empleo en los alimentos.9 Estas bacterias, además de las cito-
de materia prima contaminada pues algunas de estas toxinas, pueden producir otros factores virulentos
bacterias constituyen parte de la flora normal de aves, como la intimina, la hemolisina y proteínas asocia-
cerdos y ganado. También se ha sugerido la posibili- das a la virulencia.10,11
dad de contaminación en alimentos deshidratados, de- De acuerdo al Servicio de Inspección y Seguridad
bido a un manejo doméstico inadecuado.8 Alimenticia (FSIS: Food Safety Inspection Service)
Las enfermedades trasmitidas por alimentos (ETA) del Departamento de Agricultura de los Estados Uni-
continúan siendo una amenaza a la salud pública en dos (USDA), la presencia de al menos 1 unidad for-
todo el mundo y son una causa importante de morbi- madora de colonias (UFC) de E. coli O157:H7 en la
lidad. Aunque la mayoría son leves y se asocian a sín- carne molida de res constituye un factor de riesgo
tomas gastrointestinales agudos tales como diarrea y para el consumidor,12 lo que implica entonces dispo-
vómito en algunas ocasiones la ETA es mucho más ner de métodos con niveles de sensibilidad adecuados
severa y peligrosa para la vida, especialmente en ni- a estas exigencias.
ños, y la infección puede ocasionar enfermedades cró- Por otra parte, este microorganismo continúa
nicas.5 siendo un desafío a la seguridad alimenticia debido a
En el presente trabajo se revisa la utilidad, venta- la amplia diversidad de tipos dentro de la especie, que
jas y desventajas de la PCR como herramienta para van desde comensales inofensivos hasta patógenos
la detección e identificación de bacterias patógenas humanos. Esta misma situación se observa entre las
en muestras de alimentos, así como las nuevas ten- especies del género Vibrio con algunas cepas que son
dencias en el uso de estas herramientas moleculares utilizadas como probióticos en la alimentación de ca-
de diagnóstico y los esfuerzos actuales tendientes a marones,13 mientras que Vibrio cholerae es el agente
su estandarización internacional. causal del cólera que puede trasmitirse a los huma-
nos por el consumo de pescado o mariscos contami-
ETIOLOGÍA DE LAS ETA nados. En otros géneros, como Bacillus14 y Enteroc-
cocus,15 también se incluyen bacterias útiles en la
En años recientes, la etiología de las ETA ha cam- producción de alimentos y patogénicas para los seres
biando, a la vez han surgido patógenos nuevos o cepas humanos.
mas agresivas y resistentes a los antibióticos. Entre
las enfermedades que son catalogadas como emergen- DETECCIÓN DE PATÓGENOS
tes se incluyen la ocasionada por Escherichia coli en- EN ALIMENTOS
terohemorrágica (particularmente el serovar
O157:H7), Campylobacter jejuni y Salmonella typhi- La detección y la enumeración de microorganismos en
murium del tipo definitivo (DT) 104.5 Las bacterias alimentos o en superficies que tienen contacto con ali-
más frecuentemente asociadas a casos de infecciones mentos constituyen una parte importante de cualquier
por consumo de alimentos contaminados aparecen esquema de control de calidad. Debido a esto es nece-
enlistadas en el cuadro I. La participación de E. coli sario implementar técnicas de detección para efectuar
en las enfermedades humanas ha sido reconocida la vigilancia y el control de dichos microorganismos y
prácticamente desde su descubrimiento. En años re- prevenir las enfermedades que estos producen. El esta-
cientes la industria de alimentos ha reenfocado su blecimiento de medidas de control apropiadas requiere
atención sobre este microorganismo como una causa de métodos confiables de diferenciación entre bacterias
de morbilidad y mortalidad significativa y reconoce patógenas y no patógenas, así como de bacterias ubi-
su valor como un indicador del estado higiénico de cuas presentes en el suelo, el agua y el tracto gastro-
muchos tipos de alimentos. Por esa razón, E. coli es intestinal,16 lo cual implica que deben ser rápidos y
uno de los patógenos que mayor atención han recibi- sensibles pero sobre todo altamente específicos.
do y hacia las cuales se ha dirigido la mayor parte de El interés general en los métodos alternativos de
las investigaciones. detección y/o cuantificación de microorganismos ha
La cepa de E. coli productora de la toxina Shiga sido estimulado en parte por el incremento en la pro-
(STEC), también conocida como E. coli verotoxigéni- ducción de alimentos y por la aplicación de procedi-
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Detección e identificación de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
Cuadro I. Algunos protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa desarrollados para la detección e identificación
de bacterias patógenas en alimentos.
Abreviaturas:
ERIC = Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus
PCR-TR = PCR en tiempo real
RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA
H-CM-PCR = Hibridación-captura magnética-PCR
QC-PCR = PCR competitivo cuantitativo
RT-PCR = PCR transcriptasa reversa
DGGE = Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa blancos para el diseño de cebadores específicos de los
que es capaz de sintetizar una cadena de ADN com- serotipos O11128 y O157,29-31 por mencionar algunos
plementaria a otra ya existente. El método de PCR ejemplos. Los genes del operón rfb también son útiles
utiliza dos secuencias cortas de oligonucleótidos lla- para la identificación y diferenciación de los serogru-
madas iniciadores o cebadores que son complementa- pos A, B, C2 y D de Salmonella.31
rios a los extremos de la región de ADN que se pre-
tende amplificar. Dado que en cada reacción ambas VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA PCR
cadenas de ADN pueden servir de molde para la sín-
tesis de su cadena complementaria, el número de Las principales ventajas del uso de la PCR en la de-
eventos de replicación está dado por la expresión 2n, tección e identificación de bacterias causantes de
donde n es el número de ciclos de amplificación. Pue- ETA radica en tres aspectos fundamentales: su sensi-
de notarse que después de 20 ciclos se tendrán más de bilidad, su especificidad y su capacidad de procesa-
un millón de copias del ADN original. Una explica- miento de grandes cantidades de muestras.
ción amena y detallada de la PCR se puede encontrar Actualmente existen métodos de PCR establecidos
en Müllis (1999).19 para la detección de bacterias específicas que logran
Uno de los factores que llevan al éxito en la imple- detectar niveles muy bajos de microorganismos, por
mentación de la PCR para la identificación de micro- ejemplo, para E. coli se ha reportado la utilización de
organismos patógenos es la elección correcta de la se- medios de enriquecimiento seguidos de PCR para la
cuencia blanco. Esta secuencia debe permitir la detección de 1 UFC/g de carne de res (15 h de enrique-
identificación del microorganismo de interés indepen- cimiento)9 y de hasta 3 UFC/25 g de carne molida des-
dientemente de la presencia de otras fuentes de ADN pués de un enriquecimiento de 12 h.10 Adicionalmente
(de microorganismos concomitantes o de la muestra estos métodos identifican microorganismos que no
misma). Las diferencias en la secuencia de genes or- pueden ser estudiados por técnicas convencionales o
tólogos pueden servir como herramienta útil en la ti- que no pueden cultivarse en substratos artificiales.32
pificación de diferentes cepas y serotipos de una mis- Por otra parte, la PCR múltiple desarrollada por
ma especie o de especies cercanas filogenéticamente. Chamberlain y cols. (1988),33 permite la detección si-
multánea de diferentes toxinas y/o factores de viru-
SELECCIÓN DE SECUENCIAS BLANCOS lencia en una sola reacción. Paton y Paton (1998)21
Y DISEÑO DE CEBADORES desarrollaron dos estrategias de PCR múltiple para la
detección de stx1, stx2, eaeA y hlyA en un caso y para
Las secuencias más empleadas para el diseño de ceba- regiones del operón rfb de E. coli O111 y O157 en el
dores han sido las relacionadas con los genes que co- otro. Ambos ensayos fueron efectivos para la detec-
difican para toxinas y proteínas antigénicas específi- ción directa y caracterización de 52 cepas de STEC
cas (Cuadro I). (serotipos O), aislados de heces humanas, animales
Para la detección y diagnóstico de E. coli, las se- domésticos y alimentos. La sensibilidad de ambos en-
cuencias blanco por excelencia han sido los genes stx1 sayos fue de 103 UFC.
y stx2 que codifican para las dos variantes de la toxi- El descubrimiento de las ADN polimerasas ter-
na Shiga, STX1 y STX2 respectivamente. La STX1 de moestables34 permitió la automatización del proceso a
E. coli es idéntica a la que produce Shigella dysente- la vez que redujo el tiempo de ejecución y permitió un
riae mientras que la homología entre STX1 y STX2 es aumento significativo en el número de muestras que
de 56%.20 Numerosos autores reportan el uso de es- se pueden procesar.
tas secuencias para el diseño de cebadores específicos El desarrollo de métodos de detección que no re-
para la detección y diagnóstico de STEC, así como de quieren de la separación de los fragmentos mediante
otros genes que codifican para proteínas de virulen- electroforesis ha permitido un aumento considerable
cia accesorias como la eaeA (intimina) y la hlyA (he- en la capacidad de procesamiento de muestras de los
molisina). 11,21-25 protocolos de PCR. Entre estos métodos se pueden
El gen wzy (polimerasa) también puede ser un mencionar aquéllos acoplados a detección con anti-
buen blanco para el diagnóstico de serotipos O de E. cuerpos (ELISA-PCR) y el PCR en tiempo real.
coli, pues posee muy baja homología con las secuen- Entre los factores que limitan la aplicación de la
cias depositadas en las bases de datos, pudiéndose así PCR en la identificación de microorganismos patóge-
diferenciar los serotipos O111, O157 y O113. 26,27 nos en muestras de alimentos destaca la presencia de
Otras regiones del operón rfb han sido usadas como sustancias que pueden ejercer un efecto inhibitorio
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Detección e identificación de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
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Detección e identificación de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
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