PCR en tiempo real

Las proteínas son las involucradas son de función celular, modular la síntesis de una proteína se
puede lograr modelando la expresión del gen que codifica a esa proteína.

hay genes que son solamente regulados, bajo ciertas condiciones van a ser expresados, muchos de
estos genes son dianas farmacológicas, todo comienza con una señal del ambiente donde está la
célula u organismo, esta señal activa a otras proteínas.

Unas proteínas que se llaman receptores reciben esa señal y esa señal es amplificada por ejemplo
con cinasas, la activación de esas finanzas involucra la fosforilación de otras proteínas.

Por ejemplo, aquí podemos ver la fosforilación de un factor de transcripción entonces cuando este
factor de transcripción es fosforilado se vuelve en su forma activa y en su forma activa se une a
secuencias regulatorias en el ADN que van a llevar a cabo o van a favorecer la expresión de ciertos
genes que se van a expresar bajo esas condiciones para responder bajo un estímulo físico químico.

Todas nuestras células de nuestros diferentes tejidos, aunque fenotípicamente son muy diferentes
tienen el mismo genoma, pero ¿que las hace diferentes? Pues la expresión de ciertos genes.

La expresión de ciertos genes en ciertas zonas inicia distintas proteínas o tejidos, va a haber una
expresion localizada.
¿Porque sólo cierto tipo de células del páncreas pueden producir insulina? ¿y porque los otros
tejidos no?

Esto es por una cuestión de epigenética, cuando ciertas regiones Del ADN no están metiladas,
factores de transcripción se pueden unir a esa zona y pueden favorecer la expresión de un gen,
pero cuando el ADN está ventilado lo que a la Unión de ciertos factores de transcripción y
entonces tenemos un gen silenciado o inactivo o sea que no se expresa.
Flujo de que la información genética es el ADN, transcripción, ARN, traducción, síntesis de una
proteína y añadiremos uno nuevo que sería la transcripción reversa mediada por la enzima
transcriptasa reversa, a partir DRNA tomándolo como molde podemos sintetizar un DNA cuando
sucede esto recibe el nombre de cDNA o DNA complementario.

Qué necesitamos para la síntesis de ADN y esto es gracias a varias proteínas y varias enzimas:
Hay que recordar que algunos tienen degradación ósea actividad exonucleasa de 5’ a 3’ y
degradación 3’ a 5’, esto es muy importante ya que cuando fuimos la PCR en tiempo real vimos la
hidrólisis de sondas.

Podemos hacer algo similar a lo que hace la célula, aplicar ciertos fragmentos de ADN, fragmentos
muy pequeños, pero también ahora gracias al desarrollo de nuevas técnicas de clonación, el
desarrollo fue el mejoramiento de las polimerasas podemos aplicar varias kilos bases de ADN, esto
se lleva a cabo mediante la PCR la reacción en cadena de la polimerasa.

Lo que se necesita para amplificar un fragmento de ADN son:

1. DNA polimerasa-son las 2 enzimas más empleadas para la PCR

2. DNA molde es lo que vamos a amplificar
 3. Primers-nos van a determinar la parte central de la reacción en cadena, bueno delimitar la
secuencia y el tamaño del fragmento
4. dNTPs nucleótidos
5. Mg
6. pH controlado
7. Ciclos térmicos

Y nosotros podemos utilizar varias enzimas para la PCR, las más usadas son Taq Pol y Pfu Pol y sus
diferencias es que Taq Pol comete más errores que Pfu Pol, por errores se refiere a la
incorporación de nucleótidos erróneos en la secuencia de ADN, ambas enzimas tienen actividad
exonucleasa, pero no es la misma actividad exonucleasa.

Taq Pol tiene actividad exonucleasa de 5’ a 3’ De hecho es lo que nosotros utilizamos para la PCR
en tiempo real, pero no posee actividad exonucleasa de 3’ a 5’ y esto es que cuando va
sintetizando ADN no puede regresarse hay de realizar algún nucleótido erróneo en la secuencia, se
queda el error. a diferencia de Pfu Pol si tiene la capacidad de hidrólisis 3 a 5, o sea que si comete
un error durante la hidrólisis e identifica el error se regresa, hidroliza ese nucleótido e incorpora el
correcto.

Tenemos que elegir bien la polimerasa dependiendo del análisis que deseamos hacer, por
ejemplo, para pequeños fragmentos para identificar presencia o ausencia de un gen Taq nos
puede funcionar muy bien. Pero si queremos clonar toda una proteína no Sería viable usar Tac ya
que no corrige sus errores e integre ciertas mutaciones a diferencia de Pfu.

Para la PCR no podemos contar con la ADN helicasa, tampoco contamos con la primasa ni con las
proteínas SSBD, solar tanto necesitamos de otros factores para poder sustituir estas proteínas.

Para simular la función de la ADN helicasa lo que haremos es que con aumentos de temperatura a
estos cambios de temperatura nosotros lo llamaremos ciclos térmicos:

1. En el primer ciclo aumentaremos la temperatura para desnaturalizar el ADN

2. en el segundo paso bajamos la temperatura y ahí se alinean los primers
3. Una vez alineados los primers, elevamos ligeramente la temperatura y ahora la ADN
polimerasa reconoce los extremos y puede sintetizar la nueva cadena.
Existen varios tipos de fluoróforos, entonces tienen un nombre muy particular ya que éstas son
sintetizadas por diversas empresas, compañías o universidades.

Los equipos de PCR en tiempo real tienen 5 canales de emisión para 5 diferentes longitudes de
onda, los fluoróforos emiten a cierta longitud ¿cuántos genes podríamos estar detectando
simultáneamente en una muestra?

Podríamos detectar 5, tenemos que usar 5 sondas diferentes con 5 diferentes reporteros o
fluoróforos.

El análisis de PCR en tiempo normal lo podemos hacer de 2 diferentes formas:

1. Utilizando sondas específicas o sondas de hidrólisis

2. Y la otra es utilizar fluoróforos de afinidad (son fluoróforos que se unen a un dúplex de
ADN, no son selectivos, estos van a emitir fluorescencia únicamente cuando se una al
ADN, cómo vamos sintetizando en cada ciclo más ADN entonces más moléculas Inter
calientes o de afinidad se van uniendo a estas cadenas, la intensidad de fluorescencia va a
ser directamente proporcional a la cantidad de ácido nucleico en nuestra muestra).
No usamos bromuro de etidio en la PCR en tiempo real porque puede tener cierta indivisión en la
reacción de PCR además de que la sensibilidad es mucho menor por parte del bromuro de etidio,
si tenemos un gen de bajo número de copias con bromuro de tedio nunca lo vamos a visualizar,
pero con SYBR Green sí.

Una de sus ventajas es que es muchísimo más económico que usar sondas específicas, pero tiene
una desventaja:
Entonces cada que usamos SYBR GREEN tenemos que hacer un análisis de melting que se conoce
como una curva melt. Sí nuestro procedimiento no forma ningún producto en específico y los
primers no forman dímeros pues el SYBR GREEN sólo se va a unir a ese producto deseado, no hay
inespecificidades por lo tanto vamos a obtener una curva melt con un pico, pero sí tenemos
algunas inespecificidad o se están formando dímeros de primers el SYBR GREEN también se va a
venir ahí, entonces obtendremos un pico para el amplificador deseado pero también un pequeño
pico que nos estará diciendo que habrá pasado algo de lo mencionado anteriormente.
Las sondas de hidrólisis fueron patentadas en un inicio por una compañía que se llama sí Play
BioSystems Llamaron sondas TAQMAN.
Si la TM de la sonda es mucho más baja que la de los primers lo que puede pasar es que no
tengamos una buena Unión de la sonda al primers.

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