Equipo

Nombres
Flor Cecilia Caraveo Cota
Jesús Armando Valenzuela Escalante

ID
00000212929
00000182414

Asignación
13. Proyecto de investigación, parte 3.

Nombre del proyecto

Genero Lactobacillus y Litopenaus vannamei, organismos codificantes
de la lactatodeshidrogenasa.

Materia
Biología Molecular

Fecha
27/11/21

Profesor
Alejandro Miguel Figueroa López
 ÍNDICE

Resumen ----------------------------------------------------------------------------------- Pág. 3

Palabras clave ---------------------------------------------------------------------------- Pág. 3

Introducción ------------------------------------------------------------------------------- Pág. 4

Objetivos ----------------------------------------------------------------------------------- Pág. 6

Marco teórico------------------------------------------------------------------------------ Pág. 7

Industria láctea----------------------------------------------------------------------------- Pág. 7

Lactosueros (LS) -------------------------------------------------------------------------- Pág. 7

Composición y tipos de lactosuero ---------------------------------------------------- Pág. 8

Bacteria ácidos lácticas----------------------------------------------------------------- Pág. 10

Lactobacillus casei ----------------------------------------------------------------------- Pág. 11

Inmovilización celular ------------------------------------------------------------------- Pág. 13

Métodos más utilizada ------------------------------------------------------------------ Pág. 13

Camarón blanco (Litopenaus vannamei) ------------------------------------------ Pág. 14

Ciclo de vida y reproducción ---------------------------------------------------------- Pág. 14

Características bioquímicas ----------------------------------------------------------- Pág. 15

Lactatodeshidrogenasa ----------------------------------------------------------------- Pág. 15

Gen LvanLDH ----------------------------------------------------------------------------- Pág. 16

Sobreexpresión y Purificación de la Subunidad LDH-2 Recombinante ---- Pág. 17

Metodología para Lactobacillus casei------------------------------------------ Pág. 18

Metodología para Litopenaus vannamei --------------------------------------- Pág. 24

Conclusión ------------------------------------------------------------------------------- Pág. 28

Bibliografía ------------------------------------------------------------------------------- Pág. 29

2
 RESUMEN

El ácido láctico es producido a través de la fermentación de azúcar, una de sus

funciones de mayor importancia en México, es que es utilizado para conservar y dar
sabor a los alimentos, es un producto mayormente utilizado en distintas áreas a nivel
industrial, tales como la industria alimentaria, utilizada como un endulzante,
neutralizante del pH y es un inhibidor bacteriano en una gran variedad de alimentos.
En la industria química es utilizado a pequeña escala para poder ajustar el pH en
celofanes, resina de fenol formaldehído, reveladores de impresión litográfica y textil.
y en la industria farmacéutica, es utilizado para la elaboración de lociones,
humectantes, agente anticaries y algunas soluciones para el acné. Las bacterias
ácido lácticas son esenciales para la producción de ácido láctico debidos a sus
propiedades metabólicas que estas presentan, por ejemplo, un gran potencial como
materia prima para así poder producir polímeros biodegradables. El grupo de
bacterias que abarcan este campo, son tales como, Lactococcus, Lactobacilos,
Streptococcus, Leuconostoc, Enterococcus y Pediococcus, ya que estos producen
metabolitos, algunos son, polisacáridos, vitaminas, algunos ácidos orgánicos,
sustancias preservantes, endulzantes, entre otros debido a la presencia de genes
LDH que son codificantes de enzimas lactato-deshidrogenasas que cumplen una
función muy importante durante ruta de fermentación láctica.
Así como también se ha estudiado la presencia de genes LDH en organismos
invertebrados como Litopenaus vannamei, por ello se pretende revisar las distintas
metodologías biotecnológicas para la producción de ácido láctico, debido a que en
décadas recientes las investigaciones solamente se han enfocado en el rendimiento,
productividad y bajo costo de ello, por lo que es necesario buscar otros
procedimientos que se puedan llevar a cabo para la producción de ácido láctico a
nivel industrial, tales como, parámetros de bioproceso, que abarca
microorganismos, biorreactores, sistemas de producción, composición de nutrientes
y metodologías de análisis.

PALABRAS CLAVE

ácido láctico, bacterias ácido lácticas, gen LDH, bioproceso, fermentación, lactato
deshidrogenasa.

3
 INTRODUCCIÓN

El ácido láctico es un metabolito obtenido tras la ruta fermentativa láctica, el cual es

muy utilizado por la industria alimenticia ya que sirve como endulzante, regulador de
Ph de los productos, inhibidor bacteriano e influye demasiado en la obtención de un
mejor sabor y calidad de los alimentos. El proceso de obtención de este ácido láctico
ha sido principalmente el manejo y control de microorganismos BAL o bacterias
lácticas, que son un conjunto de bacterias del género Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc y Oenococcus por mencionar algunos. Este grupo de bacterias tiene la
característica de ser Gram positivas, no productoras de esporas, son buenas
iniciadoras de la fermentación y se subdividen a dependencia de su tipo de
metabolismo en heterofermentativas y homofermentativas, donde las del tipo
homofermentativo producen como único producto al ácido láctico y las
heterofermentadoras son capaces de producir otros metabolitos aparte del lactato
como dióxido de carbono y etanol.

Existen otros métodos de obtención de ácido láctico que van más por el lado
químico. Consisten en la generación de lactonitrilo mediante la combinación de
acetaldehído y ácido cianhídrico, el cual posteriormente es hidrolizado a ácido
láctico, aunque el nivel de eficacia de este tipo de métodos es muy bajo por lo que
no son muy utilizados por la industria.

Específicamente, las bacterias del género Lactobacillus han sido estudiadas durante
los últimos años debido a su amplia funcionalidad en la obtención de este producto
de interés, ya que dentro del genoma de cepas como la Lactobacillus plantarum se
encuentra genes como el LDHL el cual es codificante de la enzima lactato
deshidrogenasa la cual es la protagonista en la ruta fermentativa del ácido láctico.
Esta enzima es la precursora de este proceso cuando se encuentra con el pirúvico
el cual ya ha sido obtenido por la ruta metabólica Emnden-Meyerhof Pathway o
también llamada glucolisis, la cual convierte a la glucosa en 2 moléculas de piruvato,
2 de ATP, 2 NADH y 2 de H2O.

En este trabajo desarrollaremos una investigación hacia las diferentes cepas

productoras del ácido láctico pertenecientes al grupo Lactobacillus y analizaremos
los genes participantes en la codificación de la enzima lactato-deshidrogenasa en
4
este tipo de microorganismos. Además, se analizarán algunos otros organismos de
tipo eucariontes participantes en esta ruta fermentación láctica, como el crustáceo
Litopenaus vannamei, mejor conocido como camarón blanco en las regiones del
norte de México, abundante en las zonas del Golfo de California y el Mar de Cortés,
el cual representa una fuente económica de gran importancia para todo el país.
Recientemente se han encontrado dos subunidades de la enzima
lactatodeshidrogenasa en L. vannamei pertenecientes a las branquias del animal y
su músculo, LDH-1 y LDH-2 respectivamente, siendo el gen LvanLDH el responsable
de la codificación de ambas enzimas.

5
 OBJETIVOS

Como objetivos de este proyecto tenemos:

 Identificar los posibles genes participantes en la codificación de la enzima

lactato-deshidrogenasa en organismos procariotes como bacterias del género
Lactobacillus y eucariotes como Litopenaus vannamei.
 Analizar otras cepas del genero Lactobacillus en su participación como
bacterias ácido lácticas con presencia de genes LDH.
 Describir la metodología de purificación de la enzima lactato-deshidrogenasa
en ambos tipos de organismos.
 Encontrar cuales son los métodos más eficaces en la producción del ácido
láctica de modo que su fabricación sea más ejecutada en nuestro país.

6
 MARCO TEÓRICO

Industria láctea
La industria láctea es uno de los países industrializados y en desarrollo de
importancia económica, ya que el 90% de la leche total utilizada por la industria
del queso se elimina como suero, es decir, retiene el 55% de composición de la
leche, por ejemplo, lactosa, proteínas solubles, lípidos y minerales. Se han visto
algunas propuestas para que se logre utilizar este residuo, pero estadísticamente
se ha indicado que gran parte se descarta como efluente, Como resultado, se ha
creado un gran problema ambiental que afecta la estructura del suelo física y
químicamente (Auder, Halleux y Melnikova, 2009).

Lactosuero (LS)

El suero de leche es un líquido remanente Esto ocurre debido a la coagulación de

la proteína casera de la leche durante el proceso de elaboración del queso. El
suero ocupa un volumen total de 90 litros en la leche y contiene la mayoría de los
componentes solubles en agua como minerales, carbohidratos, vitaminas solubles
en agua y proteínas solubles (Hernández Ledesma et al., 2008).
En la producción mundial de suero, esto es directamente proporcional a la tasa de
crecimiento de la industria del queso. En México el 85% del lactosuero se desecha
(Panesar et al.,2007). anualmente se estima que es generado mundialmente
118x106t de lactosuero, equivalente a 7 x 106 toneladas de sólidos (Cruz et al.,
2009), gracias a los avances tecnológicos, es posible utilizar 50% del suero
producido, que primero se convierte en suero en polvo, aislado de proteína de
suero, bioetanol, hidrógeno, biopolímeros, metano, electricidad y probióticos
(Yada Et al.2015). Dado que esta condición ha hecho que el suero sea
considerado uno de los desechos más importantes en los países en desarrollo,
como México (Bainotti et al. 1987).

Composición y tipos de lactosuero

LS contiene principalmente lactosa, proteínas como sustancias de gran valor
nutricional, minerales, vitaminas y grasas. El tipo y composición de LS varía según
el tipo de leche, el tipo de queso elaborado y el proceso tecnológico utilizado. La
lactosa es el principal componente nutricional (5% p / v), lípido (0,5%) (párrafo
7
2009).
Existen varios tipos de sueros de ácido láctico que dependen principalmente de la
eliminación de la denominada caseína blanda, basándose en la coagulación por
la renina a pH 6,5. El otro se denomina ácido, que deriva del resultado de la
fermentación o a la adición de algún ácido orgánico o mineral para coagular la
caseína, como en la producción de queso (Jelen, 2003).
La siguiente tabla muestra la composición nutricional del suero agridulce, donde
se ha observado que los dulces tienen una mayor cantidad de lactosa y una mayor
cantidad de proteína que de ácido.
Tabla 1. Composición general del suero fresco.

COMPONENTES SUERO DE LECHE SUERO DE LECHE

DULCE(g/l) ÁCIDA (g/l)

Sólidos totales 63---70 63---70

Lactosa 46---52 44---66

Grasa 0---5 0---5

Proteína 6---10 6---8

Calcio 0.4---0.6 1.2---1.6

Fósforo 0.4---0.7 0.5---0.8

Potasio 1.4---1.6 1.4---1.6

Cloruros 2---2.2 2---2.2

(Jelen, 2003).

8
Cómo se logra observar que en cualquiera de los dos lactosueros que se
obtuvieron, Se estima que, por cada kilogramo de queso producido, hay 9
kilogramos de suero, así que este representa más o menos el 85-90% del volumen
total de la leche y en este están contenidos el 55% de los nutrientes, entre los
nutrientes más abundantes se encuentra la lactosa, proteínas solubles, lípidos y
sales minerales (Muñi, Paez, Ferrer y Ramones, 2005). La Tabla 2 enumera los
requisitos fisicoquímicos que debe cumplir el suero agridulce (INEN, 2011).
Tabla 2. Requisitos físico-químicos del lactosuero líquido.

Requisitos LS LS LS LS Método de
dulce dulce ácido ácido ensayo
mínimo máxi mínimo máxim
mo o

Lactosa %(m/m/) - 5.0 - 4.3 AOAC 984 15

Proteína láctea % (m/m/) 0.8 - 0.8 - NTE INEN 16

Grasa láctea %(m/m) - 0.3 - 0.3 NTE INEN 12

Ceniza % (m/m) - 0.7 - 0-7 NTE INEN 14

Acidez titulables % - 0.16 0.35 - NTE INEN 13

(calculada como ácido
láctico)

pH 6.8 6.4 5.5 4.8 AOAC 973 41

El contenido de proteínas láctea es igual a 6.38 por el % de nitrógeno total

determinado.

Bacterias del ácido láctico

Estas son generalmente bacterias del ácido láctico (LAB) reconocidas como GRAS,
la mayoría de las cuales se utilizan como conservantes de alimentos y fermentadores
(Roldana et al., 2011). Son bacilos que producen ácido láctico por fermentación, su

9
crecimiento se produce bajo condiciones anaeróbicas condiciones, pero se
consideran tolerantes a las condiciones anaeróbicas: ya que algunas de estas cepas
usan dióxido en combinación con flavoproteína oxidasa y, por lo tanto, producen
H₂O₂ y, por lo tanto, estimulan la producción de fosfato de alta energía, ya que estas
bacterias obtienen su energía fosforilando sustratos ricos en azúcar como los que
se encuentran en el suero de leche (Galarza, 2012).
Las bacterias del ácido láctico tienen la capacidad de prosperar en el suero y la
permeación del suero y son capaces de producir ácido láctico, que es el producto
principal de la fermentación del ácido láctico, que produce ácido láctico producido
por especies como Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp.
Bulgaricus, Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus con el uso de ácido láctico
como sustrato para su crecimiento. En el Cuadro 3 se pueden observar sus vías
homólogas y heterólogas, ya que estas bacterias son congéneres obligados y
naturales, conduciendo a la producción de ácido láctico, en el que destaca L. casei,
productora de ácido láctico. Ácido L-láctico (García, Paternina y Villadiego, 2010)

Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homo y heterofermentativas y su configuración.

Género y Homofermentativa Heterofermentativa Configuración

especie ácido láctico

Lactobacillus
spp.

L. delbrueckii + - D(-)

L. lactis + - D(-)

L. bulgaricus + - D(-)

L. casei + - L(+)

L. plantarum + - DL

L. curvatus + - DL

L. brevis - + DL

L. fermentum - + DL

10
Figura 1. fermentación de glucosa por bacterias homofermentativas y
heterofermentativas.
fuente: Yang, El Enshasy y Thongchul (2013).

Lactobacillus casei.
Son bacterias Gram positivas, en catalasa negativa, son aeróbicas, anaerobias,
son homólogas, tienen forma de bastoncillos, no son móviles y no forman esporas
(Fernandez y Castillo)., 2007). principalmente lo encontramos en los vegetales
fermentados, carnes, leches y muchos de sus derivados, en nuestro cuerpo, se
encuentra en nuestros intestinos y boca y se puede encontrar en el medio
ambiente (Panesso, Pardo y Sepúlveda, 2015).
Los requerimientos que se requieren para el Lactobacillus casei es que esté a la
temperatura entre 15 y 45 ° C es la temperatura óptima de 37 ° C, su pH óptimo
es 5.5, sus necesidades nutricionales incluyen ácido fólico, pantotenato de calcio,
tween 80, entre muchos otros compuestos que necesita, y muchos de estos
compuestos se pueden encontrar en los cultivos MRS que se muestran en la Tabla
(Panesar et al., 2010).

11
Tabla 4. composición del medio de cultivo MRS

COMPOSICIÓN CONCENTRACIÓN DEL MEDIO

● Mezcla de peptona ● 18 g/l

● Extracto de levadura ● 4 g/l

● Glucosa ● 20 g/l

● Tween 80 ● 1 ml/l

● Fosfato dipotásico de hidrógeno ● 2 g/l

● Acetato de sodio anhidro ● 3 g/l

● Sulfato de magnesio 7H₂O ● 0.2 g/l

● Citrato triamónico ● 2 g/l

● Sulfato de magnesio anhidro ● 0.034 g/l

● Agar ● 12 g/l

Los microorganismos que producen ácido láctico principalmente en forma L,

incapaces de metabolizar sustratos e incapaces de producir diacetilo, se utilizan
para la producción de probióticos en la industria láctea y se pueden utilizar para
combinar con otras bacterias del ácido láctico o simplemente capaces de conferir
propiedades organolépticas. Esta bacteria es muy estable en un amplio rango de
pH, tanto en términos de temperatura como de fermentación con altas
concentraciones de lactosa o glucosa, y como principal producto obtenemos ácido
láctico, en cambio cuando tenemos concentraciones muy bajas de lactosa o
glucosa se obtienen otros productos (Arellano, 2013).

12
Inmovilización Celular
“Es una técnica que se utiliza para incrementar la viabilidad de las bacterias” (Cruz,
2007). Los métodos utilizados para la inmovilización celular se dividen en dos
categorías o dos categorías: un conjugado químico dentro de esta categoría se
puede encontrar la conjugación de ayudas, ya sean orgánicas, inorgánicas y
sintéticas. En combinación, el toro se mantiene físicamente en esta categoría,
podemos encontrar el sobre de la celda y la celda Trap.
Metodología más utilizada
1. Trampa de células en perlas de gel de alginato de calcio
La trampa de células en perlas de gel de alginato de calcio es el método más utilizado
para la inmovilización de bacterias del ácido láctico debido a su simplicidad, no
toxicidad, condición de gel suave y facilidad de uso. , 1980).
Hacer una suspensión de 15 ml de células de L. casei, L. lactis o una mezcla de las
dos cepas, y luego mezclarlas con 10 ml de solución estéril de alginato de sodio. La
mezcla se extrajo gota a gota mediante una bomba peristáltica en una solución
estéril de CaCl2 al 2% a temperatura ambiente, con agitación continua. Las fibras
(diámetro 23 mm) se curaron en una solución de CaCl2 durante 2 h. Las perlas se
lavaron con solución salina estéril para eliminar el exceso de iones de calcio y las
células atrapadas (Tuli et al., 1985).

2. Fijación celular sobre carragenina y agar

Diez mililitros de carragenina al 3% (Sigma, C1013) o agar 2,5 disueltos en suero
fisiológico esterilizado a 121 ° C durante 15 min. Después de enfriar a 550 ° C, se
añadieron 5 ml de suspensión celular de L. casei, L. lactis o mezcla, a 35 - 40 ° C,
y la mezcla resultante se dejó solidificar durante 30 min a temperatura ambiente.
Después de este tratamiento, el gel se cortó en partículas de tamaño adecuado (4 x
4 x 2 mm). En el caso de la inmovilización celular en -carragenano, las perlas se
endurecieron en una solución estéril de KCl al 2% durante 2 h. Las perlas se lavaron
con una solución estéril de 0,7 KCl para eliminar las células atrapadas (Boyaval y
Goulet, 1988).

13
3. Inmovilización celular en poliacrilamida
Se añadieron cinco ml de suspensión celular de L. casei, L. lactis o mezcla celular a
10 ml de suero fisiológico estéril que contenía 2 g de acrilamida como sustancia
única., 0,11 g NN «Metilenbisacrilamida, 0,03 g de potasio y 0,1 ml de
dimetilaminopropionitrilo al 87%. Deje que la mezcla solidifique durante 30 min a
temperatura ambiente y luego el gel se cortó en partículas de 4 x 4 x 2 μm (Boyaval
y Goulet, 1988).

Camarón blanco (Litopenaus vannamei)

En el norte de México una de las principales fuentes de trabajo es la acuacultura,
debido a la abundante fauna y diversas especies marinas que habitan mayormente
en el golfo de California y el Mar de Cortés. Específicamente en Sonora y la mayor
parte de las costas de Sinaloa el camarón blanco representa una gran importancia
pesquera debido a su alta presencia en estas zonas en ciertas temporadas del año.
Aunque, los pesqueros locales han reportado un declive de la producción de dicha
especie durante los últimos años por lo que ya se han implementado estrategias de
crecimientos de larvas en laboratorio y su liberación en cautiverio lo cual ha
implementado un gran impacto positivo en la reproducción del camarón. A pesar de
esto en el periodo de 2006 al 2016 se reportó una producción de 50 mil toneladas
(CONAPESCA, 2016) y en 2014 solo en Sonora y Sinaloa se produjeron 73,373
toneladas de camarón blanco, lo que significó un 86.27% de la producción total en
el país (SAGARPA, 2015).
L. vannamei es una especie con gran tolerancia de salinidad por lo que es una
especie muy cultivada en nuestro país. Puede crecer en condiciones de agua dulce
(0.5g/L) y de agua salada (60 g/L)

Ciclo de vida y reproducción

A comparación con las bacterias los organismos eucariotes tienen ciclos de vida un
poco más complejos y más largos. En el caso de L. vannamei las hembras pueden
reproducirse hasta los 8 meses de vida, en el caso de los machos su mejor etapa
reproductiva es hasta los 10 meses de edad. Posteriormente las hembras desovan

14
en estanques comunales y las crías se lavan en agua de mar y se pasan a los
estanques de cría para ser alimentados.

Características bioquímicas
La mayoría de los seres vivos requerimos de oxígeno para sobrevivir, el oxígeno es
utilizado en muchas de nuestras rutas metabólicas y como consecuencias de estas
reacciones producimos metabolitos que son necesarias para nuestro desarrollo.
El camarón blanco tiene la capacidad de retener y manipular oxigeno por diferentes
métodos para realizar de manera correcta su metabolismo. Por lo que los niveles de
oxígenos estables son de gran importancia para su buen desarrollo, un mínimo
decremento podría representar una mala optimización de la energía empleada en
las diferentes acciones del organismo. Sin embargo, este crustáceo ha presentado
una alta tolerancia a condiciones de hipoxia, es decir, ausencia o disminución
significativa de los niveles de oxígeno disueltos en agua, siendo capaz de alterar la
mayoría de sus rutas metabólicas para la mejor obtención y utilización de la energía,
como es el caso de la realización de la glucolisis, llevándola a cabo de forma
anaerobia. En el caso de organismos anaerobios el glucolisis da como resultado al
piruvato, al igual que en la glucolisis aerobia, sin embargo el destino del ácido
pirúvico es un poco diferente. En lugar de pasar al ciclo de Krebs, en este caso viaja
a una de las diferentes rutas de fermentación: alcohólica, láctica, butírica, ABE, entre
otras.
En L. vannamei se han encontrado genes codificantes de la enzima lactato-
deshidrogenasa que es la principal precursora de la ruta de fermentación láctica.
Existen dos zonas en la fisionomía del camarón blanco donde se encuentran estos
genes: branquias y el músculo. De este modo a partir del lactato se puede producir
nuevamente glucosa como fuente de energía en condiciones anaerobias.

Lactatodeshidrogenasa
La lactatodeshidrogenasa es una enzima que cataliza las reacciones llevan al
piruvato a convertirse a lactato, se encuentra pricnipalmente en el citosol de las
células y también la hay mitocondrial. En organismos invertebrados, esta enzima ha
sido poco estudiada, aunque recientemente se han presentado investigaciones que
15
pueden constatar que se puede presentar en forma dimérica y tetrámica la cual tiene
un peso de 140 kDa. Por lo general su temperatura optima oscila entre los 40 °C y
los 45 °C, pero esto puede variar dependiendo el tipo de crustáceo.
Las isoenzimas presentes en L. vannamei son LDH-1 y LDH-2 las cuales tienen
algunas similutudes con la LDH-A en humanos, aunque LDH-1 y LDH-2 han
presentado una identidad entre sí de 95%.
Gen LvanLDH
El gen codificante de la enzima lactato deshidrogenasa en L. vannamei (LvanLDH)
fue caracterizado y se encontró que tiene na secuencia de 7571 pb y está formado
por ocho exones, siendo E5 el responsable de codificar a LDH-1 presente en
branquias y E6 que codifica LDH-2 que se encontró con mayor presencia en el
músculo del camarón blanco. Estos exones dan como resultado uan secuencia de
42 aminoácidos y unidad proteica de 36 kDa teniendo una diferencia de únicamente
15 aminoácidos.
Tabla 5. Posiciones de los exones, codones divididos y regiones de unión a ligados
en la LDH (B. Leal, 2010).
Exones Posición Tamaño Codón Región específica y
(nt) dividido/aminoácido aminoácidos
1 1-218 218 AG_G/R NAD M33 al K57
(unión a)
2 449-648 200 G_TG/V R99 y N138
3 848-1021 174 G_TA/V
4 1229-1346 118 AG_T/S Piruvato R106, R169,
T248
5 4216-4339 124

6 4497-4622 126 Sitio activo H193

7 6821-7025 165
8 7249-7571 322 UTR-3’

16
Sobreexpresión y Purificación de la Subunidad LDH-2 Recombinante
Como hemos mencionado, la obtención de la enzima lactatodeshidrogenasa
también se puede realizar haciendo usos de organismos eucariontes, ya que
también son capaces de producir el lactato por la ruta fermentativa láctica. En el caso
del camarón blanco (Litopenaus vannamei), el cual ha sido estudiado recientemente
como objeto de producción de esta enzima, en él se han encontrado las dos
isoenzimas LDH-1 y LDH-2. Aunque la metodología para la extracción y purificación
de la enzima en este crustáceo no había sido completamente analizada ni llevada a
cabo, aunque recientemente se han presentado investigaciones con el fin de obtener
estas enzimas, por ejemplo, el Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo
en Hermosillo, Sonora pudo obtener la purificación de la LDH-2 en L. vannamei por
medio de la sobreexpresión y purificación de LDH-2 recombinante.
Este método ha sido muy utilizado en ensayos de laboratorio en diferentes
investigaciones debido a su alta efectividad en la purificación de proteínas. Además,
este método presenta una alta pureza de la muestra, proteínas libres de tags como
resultado y permite purificar proteínas de altos pesos moleculares, incluso favorece
la solubilización de proteínas.
Este procedimiento consta de las siguientes étapas:
1. Síntesis de la secuencia de ADN codificante para la proteína de interés
2. Transformación de bacterias E. coli y/o expresión en sistema eucariota P.
pastoris, selección y análisis de clones estables.
3. Escalado y producción.
4. Purificación por afinidad.
En la experimentación que se llevó a cabo para la purificación de LDH-2 se utilizó el
Kit IMPACT ™, el cual es un sistema de expresión y purificación de proteínas
caracterizado por la implementación de la auto-escisión de los elementos de
empalme de proteínas (inteínas) separando completamente la proteína objetivo de
la etiqueta de afinidad utilizada. Este método se distingue también por realizar la
purificación en un solo paso cromatográfico, este sistema es impulsado por el
promotor T7 para lograr altos niveles de expresión y un control transcripcional
estricto en E. coli.

17
 METODOLOGÍA PARA Lactobacillus casei

Primera metodología

● LA LOCALIZACIÓN DEL EXPERIMENTO

Las pruebas preliminares y el desarrollo experimental se realizarán en las

instalaciones experimentales de la Facultad de Ciencias Agrarias y Ambientales.
Los análisis se realizaron en el laboratorio de análisis fisicoquímico y
microbiológico de la Facultad de Mecánica Agrícola y Ambiental de la Universidad
Técnica del Norte. Los datos cromatográficos se detallan en la Tabla 8 a
continuación:

MATERIALES Y EQUIPOS

Materias primas y suministros

- Dulce
- Cepas bacterianas Lactobacillus casei
- Agar MRS
- Caldo MRS
- Alginato de sodio
- Cloruro de calcio, CaCl2

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 - Agua esterilizada, H2O

EQUIPO

- Smart Gx
- Incubadora de biorreactores
- Microscopio
- Autoclave
- Contador de centrífugas
- Contador de centrifugadoras
- Báscula
- pH metro
- Mezclador vórtex
- Bomba peristáltica

MATERIAL

- Altavoz
- Tubos de ensayo
- Pipetas y micropipetas
- Varillas deslizantes y tapa
- Placa de Petri
- Mechero Bunsen
- Matraz graduado
- Tubo Falcon
- Gradientes
- Tubo
- Gradientes
- Tubo de ensayo
- Pinzas

● Condiciones de la Materia prima

En la presente investigación se utilizará suero fresco, de acuerdo con las
características descritas en la Tabla 9, se recibirá de la industria Floralp, debe ser
pretratado, incluyendo pasteurización a 60 ° C por 15 minutos

19
Fundamento de los métodos usados:
● Sólidos Totales: Según el método de sólidos totales AOAC 98.15, que se
basa en la determinación de la diferencia entre el peso fresco de un alimento
y su contenido de humedad, denominado contenido de materia seca, se
realiza en la cocina y los resultados se suelen expresar como expresados. en
gramos por kilogramo (g / kg) o como porcentaje (%).
● Proteína: Según el método de determinación de proteínas Kjeldahl por AOAC
960.52, basado en la destrucción de materia orgánica por ácido sulfúrico
concentrado, la formación de sulfato de amonio libera amoniaco en exceso
relativo a la sosa, que se cuantifica por titulación. El coeficiente de la leche es
6,38.
● Grasa de la leche: Según el método de determinación de grasa de Gerber
según AOAC 920.85, consiste en separar la grasa dentro de un recipiente
medidor, llamado butirómetro, de tamaño estándar (DIN 12836), midiendo el
volumen y mostrándolo como porcentaje de masa.
● Ceniza: Según el método de combustión de NTE INEN 786, se basa en la
determinación de sustancias inorgánicas residuales después de calentar
materiales orgánicos con un bozal.

20
 ● Acidez titulada: De acuerdo con el método de titulación de acidez AOAC
95.07, se basa en la determinación del volumen de NaOH estándar requerido
para neutralizar el ácido presente en la porción titulada, determinando el punto
final por el método de cambio de color que ocurre. en presencia del indicador
ácido-base utilizado
La acidez titulable se calcula mediante la siguiente ecuación:

Dónde:
A = Es acidez titulada (en ácido láctico)
V = Volumen de solución de hidróxido de sodio durante la titulación
N = Titulante de solución de hidróxido de sodio
M = Masa del matraz Erlenmeyer vacío en gramos
M1 = Masa en matraz Erlenmeyer con muestra en gramos
pH: Según el método potenciométrico para determinar el pH de NTE INEN 786, se
basa en establecer la diferencia de potencial entre dos soluciones de [H] diferentes
(pH de muestra con pH de solución estándar de pH conocido).

Determinación de los parámetros del proceso de flujo de alimentación y

temperatura para la obtención de ácido láctico a partir de células inmovilizadas
de Lactobacillus casei.
En este estudio, se utilizará la metodología de superficie de reacción, en un diseño
de dos factores y tres pasos para encontrar el punto de congelación y la temperatura
óptimos, para obtener ácido láctico por citometría, Lactobacillus casei permanente.
Para el análisis estadístico se utilizó el paquete de software Statistical Design Expert
10.0.
● Factores de estudio
Los factores estudiados son la temperatura y la proporción de alimentación, que
determinan la mejor combinación para las propiedades del ácido láctico:

21
Nota: Para la comparación con otros autores se toma como referencia el factor de
dilución (D), calculado según la siguiente fórmula:

Donde:
● D = es la Dilución
● F = es el Flujo de alimentación
● V = es el Volumen de perlas

22
Tratamientos para el estudio
El diseño experimental de este estudio evaluará 13 tratamientos; de las cuales, se
sugieren, cinco repeticiones en el punto central, como se muestra en la figura 5

Características de la unidad experimental:

Cada unidad experimental tendrá un volumen de 2 litros de suero dulce
REALIZANDO UNA INVESTIGACIÓN CINÉTICA DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO
LÁCTICO
Para lograr este objetivo, trazaremos la relación entre la producción total de ácido
láctico (PA) de y la masa de suero que pasa por la corriente de alimentación. un
mayor rendimiento de dicho ácido.
● CARACTERÍSTICAS DEL ÁCIDO LÁCTICO EN PROCESO
Para la caracterización es necesario verificar la pureza del ácido láctico
para poder identificar el uso de dicho ácido y asignarlo a la industria, que es la de
alimentos. , farmacéuticos o plásticos, donde se van a realizar análisis fisicoquímicos
diferentes, los mismos análisis detallados en tabla 13.

23
 ● TRATAMIENTO ESPECÍFICO DE LA EXPERIENCIA
El proceso de obtención de ácido láctico a escala de laboratorio se explica a
continuación en la operación específica del experimento (Figura 6).

METODOLOGÍA EN Litopenaus vannamei

Para la extracción de la enzima LDH-2 recombinante a partir de L. vanamei por el
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo en Hermosillo, se hicieron uso
de diferentes técnicas y métodos de la biología molecular, estas ayudaron a crear el
procedimiento correcto para la purificación de esta enzima de interés.

24
Para la sobreexpresión de la enzima se utilizó una cepa de E. coli, específicamente
ellos utilizaron ER2566 (New England Biolabs), en la que se introdujo un plásmido
codificante de LDH-2 el cual fue previamente clonado.
La técnica de clonación consiste en la generación de muchas copias de un mismo
gen, para esto es necesario hacer uso de un vector de clonación el cual comúnmente
se presenta en una molécula circular o en forma de anillo de ADN llamado plásmido.
Los plásmidos se encuentran principalmente en genomas bacterianos, estos se
encuentran fuera de los cromosomas de la bacteria y poseen un grupo muy pequeño
de genes lo que hace que, al ser introducidos en otras células sean muy fáciles de
copiar o clonar.
A estos plásmidos se les introduce el gen que se piensa clonar, esto se hace con la
ayuda de las enzimas de restricción las cuales se encuentran únicamente en
bacterias o en algunos otros organismos procariontes, se piensa que esto es así ya
que este podría ser un modo que tienen las bacterias de protegerse de virus y otros
microorganismos dañinos, ya que con las enzimas de restricción pueden fragmentar
el ADN de estos en trozos muy pequeños que ya no representan un daño para la
célula de la bacteria.
Como se mencionó las enzimas de restricción pueden fragmentar cadenas de ADN
bacteriano. Aunque estas lo hacen únicamente en ciertos sitios de la molécula, ella
puede reconocer los sitios, o el único sitio de restricción de un plásmido y realizar el
corte generando fragmentos complementarios. Por ejemplo, la enzima EcoRI
presente en E. coli que genera cortes de cadenas simples de ADN que pueden
unirse por complementariedad de bases, esta reconoce el sitio de restricción de las
dos cadenas que se van a unir y corta dejando extremos cohesivos entre ambas.
Después, estos dos fragmentos de ADN se unen mediante una enzima ADN ligasa
la cual sella los huecos que quedaron cuando se unieron los fragmentos
complementarios de las dos cadenas de ADN que se recombinaron.
Una vez que se ha unido el gen al plásmido, a este también se le debe añadir un
gen resistente a un antibiótico, este va actuar como un marcador para comprobar
que el gen se introdujo a la bacteria. Y para integrar el plásmido a la célula bacteriana
se debe someter a un shock de temperatura, para esto se debe aumentar la
temperatura hasta un punto que no afecte a la bacteria, y después rápidamente se
25
baja la temperatura para crear un golpe de calor, de este modo se le induce a la
célula bacteriana a que acepte más fácil el plásmido recombinante.
Una vez que se realizó esto, se deben identificar aquellas bacterias que fueron
transformadas, para esto se somete la nueva cepa a un medio con el antibiótico que
se utilizó como marcador, y de este modo únicamente sobreviven aquellas que
fueron correctamente transformadas con el gen con resistencia este antibiótico y así
se descartan las que no aceptaron el plásmido.
De este modo, cuando obtenemos las cepas con el ADN recombinante, estas se
cultivan y se dejan crecer y reproducirse para que estas hagan su trabajo y clonen
en su interior el plásmido recombinante que posee los genes que se buscan
expresar. Así mismo fue como el equipo de CIAD pudo transformar las cepas de E.
coli las cuales dejaron crecer en las condiciones óptimas para este tipo de
microorganismo para inducirlas posteriormente a la sobreexpresión del gen
codificante de LDH-2 recombinante.
Posteriormente se tuvo que purificar las enzimas expresadas por el gen. Para esto
se hizo uso del método de purificación de proteínas por cromatografía de afinidad.
El cual es un método que consiste en separar moléculas biológicas como proteínas,
enzimas o proteínas recombinantes que se encuentran en una mezcla bioquímica.
Para esto se pasa una solución a través de la mezcla que contiene las proteínas que
se buscan purificar, dicha mezcla posee otras moléculas que son en cierto modo
atractivas para la molécula de proteína, estas en la mayoría de los casos suelen ser
ligandos, que son moléculas que forman complejos con las proteínas las cuales
mandan señales a estas para que se unan a su sitio activo y de este modo “atrapan”
a la proteína que se va purificar sacándolas de la mezcla en la que se encontraban.
Este proceso consta de dos fases, la primera llamada fase estacionaria y la segunda
fase móvil.
En la fase estacionaria se suelen utilizar sustancias sólidas, liquidas o geles como
soportes porosos, que podrían ser agarosa o celulosa las cueles presentan
diferentes tamaños de poro. Las cuales sirven como un medio para depositar la
muestra en una placa de vidrio o de plástico la cual se pasará posteriormente a una
cubeta cromatográfica. La cual se sumerge en un líquido que consiste en la fase
móvil, este líquido posee los llamados ligandos que pueden ser secuencias de ADN,
26
que se puede utilizar para purificar enzimas de restricción, polimerasas o proteínas
con unión al ADN. También se pueden utilizar moléculas aromáticas polisulfanadas
de clorotriazina las cuales sirven para atraer otro tipo de enzimas como liasas,
oxidorreductasas o hidrolasas. Este líquido se pasa a través de la muestra en una
dirección determinada para que con ayuda de los ligando presentes en la solución
de la fase móvil puedan atrapar las enzimas que se buscan purificar.
Por ultimo para cuantificar las enzimas LDH-2 ya purificadas se utilizó el método
Badford el cual consiste en cuantificar las moléculas de proteínas que fueron unidas
al colorante Azul Coomassie G-250 midiendo la absorbancia a 595 nm de una
muestra con las proteínas unidas al colorante por espectroscopia y se compara con
una muestra estándar de la proteína que se purifico. Después se realiza una curva
de calibración con los resultados del análisis espectroscópico para ambas muestras
y se realiza la cuantificación de proteínas purificadas.

27
 CONLCUSIÓN

Con la realización de este proyecto de investigación se pudieron comparar los

procedimientos y técnicas que se utilizan para extracción de la enzima
lactatodeshidrogenasa en organismos procariontes y eucariontes. En México la
producción de manera industrial de esta enzima es muy escasa, pero a pesar de ello
son muy utilizadas en el sector alimenticio debido a su producción de lactato el cual
se emplea para la obtención de colorantes, edulcorantes, como controlador de pH,
como inhibidor bacteriano y para otros métodos de control de calidad en la industria
alimentaria. Es por esto que se busca implementar las técnicas que se investigaron
en este proyecto para que con ayuda de la comunidad científica y la industria
biotecnológica se pueda desarrollar en nuestro país la extracción y reproducción
masiva de estas enzimas y dejar de comprarlas a países extranjeros.
Además, en este trabajo se analizaron diferentes técnicas de la biología molecular
las cuales han demostrado ser muy aplicados en muchos campos de estudio, como
en la biotecnología. Pensamos que el estudio de los métodos de clonación, del ADN
recombinante, sobreexpresión de genes y las técnicas de purificación de enzimas o
proteínas son algunas de las herramientas más importantes que la biología
molecular nos ofrece a nosotros como biotecnólogos y que en algún momento de
nuestra carrera o en nuestra vida profesional podremos utilizar para la solución de
problemas que más afectan a nuestra región.

28
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