Universidad Autónoma del Estado de Morelos

Facultad de Ciencias Biológicas

Biología Molecular Avanzada BE-52

Profesora: Dra. María Luisa Barroso García

Alumna: Mariela Saucedo Reyes

“Investigación de protocolo para la purificación

DNA”
Protocolo por realizar
Purificación de DNA plasmídico
El genoma bacteriano se organiza en un solo cromosoma circular con un solo origen
de replicación, las bacterias pueden contener información genética adicional que
son los plásmidos. Los plásmidos son moléculas circulares de DNA
extracromosómico que se replica de forma independiente, la información de los
plásmidos por lo general no es importante para la supervivencia sin embargo la
información que contienen puede que sea indispensable en determinadas
situaciones; por ejemplo, los plásmidos portadores de genes de resistencia a
antibióticos.
Existen distintos procedimientos para la purificación de DNA plasmídico, aunque
todos cuenta con 3 pasos esenciales: (i) Crecimiento de las bacterias en un medio
determinado de aquellas que llevan el plásmido. (ii) Lisis de las bacterias que va a
permitir la liberación del plásmido. (iii) Purificación del DNA plasmídico.

Recolección de bacterias

1. Se toman 1,5 mL de un cultivo estacionario de

una bacteria que contiene un plásmido con un gen de
resistencia a un antibiótico.

2. El cultivo creció durante toda la noche a una

temperatura de 37 °C en medio con el antibiótico.

3. Con una micropipeta tomamos la muestra de 1,5 mL y lo colocamos en

un tubo eppendorf.

4. Se centrifuga a temperatura ambiente, durante 3

minutos a 12,000 rpm. La centrifuga ayudará a
separar el medio sólido y lo depositará en el
fondo del tubo, es decir, se dividirá en dos fases

Mariela Saucedo Reyes

Biología Molecular Avanzada
 la acuosa (la que contiene el DNA) y otra orgánica.

5. Se retira el sobrenadante con mucho cuidado con ayuda de una

micropipeta y se TIRA.

6. Se da un pulso de centrifuga, retiramos el sobrenadante que aún

quede y se TIRA. Se conserva el precipitado de las bacterias.

Lisis alcalina: Lo que se hará con este método es que al ser

alcalino el NaOH en presencia de un detergente iónico que es el SDS,
provoca una lisis celular, el DNA cromosómico se desnaturalizará, al igual
que las proteínas y liberará los plásmidos. Los plásmidos por su pequeño
tamaño y su estructura superenrollada se ven menos afectados.

7. Se resuspende y agitamos las bacterias en solución GTE (GTE: Glucosa, Tris

y EDTA La glucosa mantiene la presión osmótica, mientras que el Tris
amortigua a las células a pH8.0. El EDTA une los cationes divalentes en la
bicapa lipídica, debilitando la cubierta celular. Siguiendo la lisis celular, el
EDTA limita la degradación de DNA por la unión de iones MG ++ que son un
cofactor necesario para las nucleasas bacterianas) a 4°C. Se deja a
temperatura ambiente durante 5 minutos.

8. Se añade al mismo tubo , 200 µl de la solución de lisis NaOH,

SDS (Sodio Dodecilo Sulfato que es un detergente iónico y
tiene como función capturar los lípidos y proteínas que se
encuentran en la membrana ,esto para que el DNA no quede
atorado en los restos de las células) que se encuentra a
temperatura ambiente y es recién preparada.

9. Se agita con la mano de manera suave por inversión del tubo, unas 10 veces
y después se incuba 5 minutos a 4 °C.

Neutralización: La neutralización del medio en presencia de una

concentración alta de sal, que es el acetato de potasio, causa la precipitación
de las proteínas (por el tratamiento con el detergente y la insolubilidad de la
sal potásica del dodecil sulfato) y la del DNA cromosómico (por
reasociaciones aleatorias intracatenarias). Los agregados insolubles de
proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA
plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva su estructura nativa.
10. En el mismo tubo, se añaden 150 µl de la solución de neutralización, que es
el acetato potásico 3M con un pH 4,8 y se agita con la mano por inversión
del tubo, unas 10 veces. Y posteriormente se incuba 5 min a 4°C.
 Aislamiento de los plásmidos
11. Los agregados macromoleculares se precipitan por centrifugación, en 15
minutos a 12000 rpm y 4°C, se forma un sedimento blanco que tiene aspecto
lechoso. Se traslada el tubo a un área de trabajo.
12. Se retira con cuidado el sobrenadante con el DNA plasmídico y se coloca en
un tubo esterilizado.
13. Se añade 1 ml de etanol (4°C) al tubo en donde está la solución con el DNA
plasmídico. Se agita con la mano por inversión unas 10 veces y se incuba 15
minutos a 4 °C.
14. Se precipitan los plásmidos debido a la centrifugación (15 minutos a 12000
rpm y 4°C) se retira con cuidado el sobrenadante y se tira.
15. Se da un pulso de centrifuga, se retira de nueva el sobrenadante que aún
queda y se tira; de manera que solo queden los plásmidos.
16. Se disuelven los plásmidos en 50 µl de tampón TE con un pH 8,0 (TE: Tris,
un tampón de pH común, y EDTA, una molécula que quelante cationes como
el Mg2 + y tiene como propósito solubilizar el ADN o ARN, mientras lo protege
de la degradación.), con ribonucleasa A (Ribonucleasa A es usada para
aislar DNA y quede libre de RNA).
17. Se incuba a temperatura ambiente 5 minutos
18. Se almacena la muestra a 4°C.

• Prieto, M., López, J., & Pueyo, C. (2014, septiembre). Purificación de ácidos
nucleicos (N.o 37). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Universitario de Rabanales. https://www.uco.es/dptos/bioquimica-
biol-mol/pdfs/37%20PURIFICACION%20ACS%20NUCLEICOS.pdf