UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

LA MOLINA
FACULTAD DE ZOOTECNIA
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE PRODUCCIÓN
ANIMAL
MEJORAMIENTO GENÉTICO DEL GANADO

INFORME “Frecuencias Alélicas en Vacunos de Carne”

INTEGRANTES:
● Bejar Loo, Jose Alberto 20180351
● Ñiquen Loayza, Alessandra Isabel 20160361
● Caballero Erazo, Mishel Belen 2018355
● Loarte Melgarejo, Kelly Grealdine 20170461

Enero-2022
1. Estimación de las frecuencias alélicas y genotípicas de los genes CAPN1 Y CAST
asociados a la calidad de la carne en bovinos de la Cuenca del Papaloapan
1.1. RESUMEN
1.2. El ganado de doble propósito es aquel utilizado para producir carne y leche.
Generalmente es el producto del cruce de razas de origen Cebú x europeas y/o
Criollo. Este grupo genético se ha adaptado a las condiciones climáticas de
temperatura, humedad, baja calidad de pastos y clases de parásitos que prevalecen en
las regiones tropicales. En este trabajo, se realizó un escrutinio molecular para
observar la frecuencia de dos polimorfismos del gen de la μ-calpaína (CAPN1- 316,
CAPN1-530) y uno del gen de la calpastatina (CAST), asociados a la suavidad de la
carne en ganado bovino de doble propósito de la Cuenca del Papaloapan. Las pruebas
se basaron en Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y Polimorfismos de la
Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLPs) con las enzimas de restricción Btg I,
Ava II y Rsa I para los alelos C-G, A-G y C-G, respectivamente (n=331). Para
CAPN1-316 las frecuencias genotípicas obtenidas fueron de 0.03 (AA), 0.86 (GG) y
0.11 (GA) y las frecuencias alélicas fueron 0.86 (G) y 0.14 (A). Para el marcador
CAPN1-530 las frecuencias genotípicas fueron de 0.02 (CC), 0.85 (GG) y 0.13 (GC),
con una frecuencia alélica de 0.85 para G y 0.15 para C. Las frecuencias genotípicas
para el marcador CAST fueron de 0.32 (CC), 0.28 (GG) y 0.4 (GC), con una
frecuencia alélica de 0.68 para el alelo G y 0.32 para el alelo C. La población en
estudio no se encontró en equilibrio Hardy Weinberg y los valores de χ2P con dos
grados de libertad fueron de 0.964, 0.985 y 0.9803 para CAPN1-316, CAPN1-530 y
CAST, respectivamente. De acuerdo con el porcentaje de la genotipificación de los
marcadores en los genes CAPN1 y CAST se concluye que la población analizada
tiene bajos índices de marcadores para la suavidad o terneza de la carne,
probablemente por las cruzas no dirigidas que se realizan habitualmente, de esta
forma se propone, mejorar la calidad de la carne en base a programas de
mejoramiento genético dirigido utilizando los animales genéticamente superiores
resultantes de este estudio.

1.3. MÉTODOS
Extracción del ADN y amplificación de los productos de PCR
El ADN se extrajo mediante el Kit de Extracción de ADN Sanguíneo GF-1
(Vivantis)Los productos de PCR (10 μL) se sometieron a un análisis de electroforesis
en gel de agarosa (2 %) en amortiguador TAE 1X a 80 V por 40 min. Las
amplificaciones se observaron en un sistema de fotodocumentación (Ingenius,
Syngenne).

Genotipificación
Se realizaron pruebas de RFLP para detectar a los marcadores . CAPN1-316 se
detectó con la enzima de restricción Btg I (CATALOGO, Fermentas), para el
diagnóstico de los alelos C y G; CAPN1-530 con la enzima de restricción Ava II
(CATALGO, Fermentas), para el diagnóstico de los alelos A y G; y CAST con la
enzima de restricción Rsa I (Fermentas), para el diagnóstico de los alelos C y G.

Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de la variabilidad genética de CAPN1 y CAST se
calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas, y el equilibrio Hardy Weimberg con
la prueba de χ2 (Ji cuadrada) con el programa estadístico SAS Versión 9.0 (2002)
usando la ecuación p²+2pq+q², donde:
 p² = alelos en individuos homocigotos con un polimorfismo n
2pq = frecuencia predicha para heterocigotos
q² = alelos en individuos homocigotos con un polimorfismo m

2. DIVERSIDAD ALÉLICA Y EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL GEN TBX20 SOBRE

EL TEMPERAMENTO EN BOVINOS DE CARNE

2.1. RESUMEN
El temperamento en el ganado bovino se define como la respuesta conductual de los
animales al manejo por el hombre, la cual se ve influenciada por elementos del tipo
de manejo, el contexto social, los estímulos novedosos y el entorno físico. La
expresión del temperamento bovino depende de factores ambientales y genéticos. La
edad, raza, peso, estación del año, grupo de estudio, el peso a los 18 meses (edad que
permite a los sistemas de crianza alcanzar tasas más rápidas de mejoramiento
genético) y la edad de la vaca al parto son considerados factores ambientales,
mientras que dentro de los efectos genéticos, se incluyen las variaciones en el genoma
del animal. Algunos genes han sido asociados con el temperamento bovino. De ellos,
el gen TBX20 es un gen candidato con un polimorfismo de un solo nucleótido
(TBX20-191081), localizado en una región no codificante del gen, que tiene un
efecto significativo en la expresión del temperamento. El objetivo de este trabajo fue
determinar la variabilidad genética de tres razas de bovinos de carne (Angus,
Brangus, Charolais), con el fin de confirmar el efecto de TBX20-191081 en ganado
de carne. Se encontró que el SNP TBX20- 191081 muestra una amplia variabilidad
genética en las razas analizadas. El análisis de asociación mostró relación del alelo G,
que disminuye los parámetros de temperamento evaluados, por lo que se evidencia su
asociación con la docilidad del ganado bovino de carne.
2.2. MÉTODOS
Evaluación de temperamento
a).Comportamiento en corral o pen score, (por sus siglas en inglés, PS), que es una
técnica no restrictiva, en la cual el ganado es separado en un corral en grupos
pequeños (de tres a cinco animales), y ahí se observa la reacción de estos al ser
abordados por un evaluador dentro del corral.
b)La velocidad de salida (VS), es considerada como una medida objetiva, debido a
que es calculada por un aparato electrónico (Schmidt et al., 2014), está definida como
el tiempo necesario de un animal para atravesar 1.83 m (6 pies) de distancia al ser
liberado de la prensa de manejo. Es medida con 2 sensores infrarrojos (Farmtek Inc.,
North Wylie, TX), que se accionan al salir el animal de la prensa.

Genotipificación
Se empleó el sistema MiniSeq (Illumina, Inc., San Diego, California, EUA) para
realizar la amplificación de secuencias que tienen como objetivo regiones del
genoma, sitios llamados locus específicos.

Frecuencias alélicas y genotípicas

Las frecuencias alélicas por población de raza fueron calculadas con el programa
GENEPOP en línea versión 4.0. Las frecuencias alélicas de la población en total se
determinaron utilizando el programa Cervus versión 3.0.

Análisis estadístico
Los datos obtenidos de la evaluación de temperamento del ganado fueron analizados
mediante el programa SPSS (versión 17.0 Inc. Chicago, IL.), utilizando estadística
 descriptiva a través de un análisis simple de frecuencias, así como de un análisis de
varianza y Tukey para evaluar las diferencias en las variables del temperamento.
Para determinar el efecto del marcador 191081 en el gen TBX20 sobre las
características de temperamento estudiadas (VS, PS y TS), se ajustó un modelo
mixto, considerando los efectos fijos del genotipo (AA, GA, GG), sexo del animal
(macho, hembra) y raza (Angus, Brangus y Charolais). Debido a que los animales
provenían de 26 hatos, este efecto fue considerado como aleatorio.
La medias de mínimos cuadrados de raza, sexo y genotipo fueron estimadas para cada
variable y se compararon con la prueba de mínima diferencia significativa.
Adicionalmente, se estimó el efecto de sustitución alélica para el marcador,
considerando los genotipos como covariables en el modelo antes descrito. El análisis
de asociación se realizó utilizando el software estadístico SAS on demand for
Academics (SAS Institute Inc., Cary NC, EUA)

3. Marcadores moleculares asociados al veteado de la carne en bovinos criollos uruguayos

3.1. RESUMEN
En Uruguay existe una reserva genética de bovinos Criollos ubicada en el
Departamento de Rocha. Estudios previos basados en marcadores moleculares
altamente polimórficos mostraron que dicha población presenta una alta diversidad
genética. En la década del 60 se produjo una migración de bovinos Criollos de la
reserva a establecimientos ganaderos del norte del país. Este ganado fue utilizado en
cruzamientos comerciales con las razas Aberdeen Angus, Hereford, Caracú y
cebuinas, estando sus productos introducidos en el mercado cárnico uruguayo. Se
presentan datos de la caracterización genética de la reserva y de dos poblaciones
cruza (Rivera y Cerro Largo) para tres marcadores moleculares asociados al veteado
de la carne: diacilglicerol acetil-transferasa (DGAT1), tiroglobulina (TG) y leptina
(LEP), así como una metodología de genotipado novedosa y eficaz para el
polimorfismo del gen LEP mediante TETRA-ARMS PCR. La reserva de Criollos
mostró una predominancia de los alelos y genotipos asociados a carne de bajo tenor
graso en todos los marcadores. Las dos poblaciones cruza de Criollo con razas
comerciales mostraron la misma tendencia para el gen DGAT1, pero mayores
frecuencias de los alelos y genotipos que generan un incremento del veteado para TG
y LEP. Los índices de diversidad genética resultaron de bajos a moderados (He
mínima= 0,000 para DGAT1 en la población cruza de Rivera; He máxima= 0,632
para TG en la población cruza de Cerro Largo).
No se observan diferencias significativas de los valores esperados para los parámetros
poblacionales, según índices FIS y prueba de equilibrio HardyWeinberg, salvo en un
caso (TG en el rodeo de Cerro Largo). Los valores de FST muestran la similitud
genética entre las dos poblaciones cruza y su diferenciación con respecto a la reserva
de Criollos Uruguayos puros. La introgresión de razas comerciales y los objetivos de
selección en pos de una mayor productividad afectaron las frecuencias de los
marcadores analizados en los rodeos cruza. Por otro lado, el aislamiento reproductivo,
la ausencia de selección artificial y la incidencia de la deriva y la selección natural
han moldeado los parámetros genéticos de la reserva de Criollos Uruguayos.

3.2. MÉTODOS
Se analizaron muestras de bovinos Criollos Uruguayos puros provenientes de la
reserva genética de Rocha (población total: 575 animales) y de dos poblaciones de
bovinos comerciales con introgresión de Criollo: Cerro Largo (Establecimiento San
Joaquín, población total: 661 animales) y Rivera (Establecimiento Guaviyú,
población total: 98 animales). El número de muestras analizadas por población es
variable para cada gen.
 Las muestras fueron extraídas al azar y se obtuvo ADN a partir de sangre y folículo
piloso con protocolos estándar. Los genes DGAT1 y TG se analizaron mediante
PCRRFLP, utilizando las enzimas de restricción Mwo I (Rincón et al., 2006) y Psu I
(Thaller et al., 2003), respectivamente. El protocolo de amplificación utilizado
incluye 2,5 µl de buffer de PCR 10X, 1,5 µl de MgCl2 25 mM, 1,3 µl de DMSO, 1,0
µl de dNTPs 10 mM, 1,0 µl de cada cebador 10 pmol, 0,2 µl de Taq polimerasa 5 UI,
más 10 µl de ADN genómico, en un volumen final de 25 µl. Los cebadores utilizados
se presentan en la tabla I. El ciclado incluye un ciclo de desnaturalización inicial a
95°C durante 5 minutos, luego 35 ciclos de amplificación (fase de desnaturalización a
94°C por 30 segundos, fase de hibridación a 60°C por 30 segundos y fase de
extensión a 72°C por 30 segundos) y un ciclo final de extensión a 72°C por 30
minutos. Para la posterior digestión con la enzima de restricción se utilizaron 5 µl del
producto de PCR, 1,0 µl de buffer 10X, 1,0 µl de enzima de restricción 10 U/µl y 8,0
µl de agua esterilizada. El volumen final de 15 µl fue incubado a 37°C por espacio de
16 horas o toda la noche en el caso de la enzima Psu I (gen TG) y a 60°C por 2 horas
en el caso de Mwo I (gen DGAT1).
Para el análisis del SNP mencionado del exón 2 del gen LEP se utilizó la técnica de
TETRA–ARMS PCR (Tetra-primer Amplification Refractory Mutation System PCR)
mediante un protocolo diseñado y puesto a punto en nuestro laboratorio. Este sistema
se basa en la utilización de cuatro cebadores, dos externos que circunscriben la
amplificación a la región génica donde se encuentra la mutación y dos internos que
generan un segundo amplicón de tamaño variable según con cuál alelo, C o T, haya
hibridado su extremo 3'. Para aumentar la especificidad de la reacción se introduce un
cambio de base (mismatch) entre la primera y la tercera posición previas al extremo 3'
de los cebadores internos. Ambos alelos se amplifican simultáneamente y son luego
identificados por sus tamaños en electroforesis en gel (Ye et al., 2001). Las
condiciones de PCR fueron las siguientes: 2,5 µl de buffer 10X, 3,0 µl de MgCl2
25mM, 1,0 µl de solución de DNTP's 10 mM, 1,3 µl de DMSO, 1,0 µl de solución 10
pmol de cada cebador interno, 0,5 µl de solución 10 pmol de cada cebador externo,
0,2 µl de Taq 5U/µl, 1 µl de DNA 50 ng/µl, en un volumen final de 25 µl. El ciclado
es un touchdown con una temperatura de hibridación de 64°C para el primer ciclo,
disminuyendo 1°C cada dos ciclos hasta 60°C, seguidos por 27 ciclos a 60ºC. Los
cebadores externos e internos utilizados fueron diseñados en base a la secuencia del
gen de la leptina bovina (número de acceso Ensembl: ENSBTAG00000014911) y se
presentan en la tabla I. La exactitud de los genotipos detectados fue confirmada
mediante secuenciación automática de tres animales correspondientes a los tres
genotipos posibles (CC, CT y TT), que habían sido genotipados previamente con el
método que aquí se describe.
Las variantes alélicas fueron identificadas mediante corridas electroforéticas en geles
de agarosa al 3% teñidos con bromuro de etidio y visualizados mediante luz UV.
Se calcularon frecuencias alélicas y genotípicas, heterocigosidad observada y
esperada, estadísticos F (Weir y Cockerham, 1984) y prueba de equilibrio
HardyWeinberg utilizando los programas Convert (Glaubitz, 2004) y Genepop v4
(Rousset,2008)

4. Frecuencias alélicas de beta-lactoglobulina en ganado criollo limonero

4.1. RESUMEN
Con el objeto de caracterizar el gen de la beta-lactoglobulina (BLG) en la raza Criollo
Limonero, se utilizó la técnica PCR-RFLP en 163 animales puros de la estación local
Carrasquero. Los genotipos fueron determinados a través de electroforesis en geles de
agarosa. Las frecuencias obtenidas del locus de la BLG fueron A (0,22) y B (0,78) y
las frecuencias genotípicas fueron AA (0,07 ); AB (0,29) y BB (0,64), la población
estudiada se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg (P<0,05), los resultados
indican que la frecuencia alélica del alelo B fue más alta que la de A, siendo esto
 importante, ya que se han determinado los efectos de esta variante alélica de la BLG
sobre la cantidad de grasa y proteínas en la leche, la selección a favor del alelo B en la
población traerá una mejora en la calidad y rendimiento en la producción de queso,
representando así un valioso aporte al conocimiento de esta raza y de su importancia,
ya que nos muestra una alternativa para sistemas dirigidos a la producción de queso.

4.2. MÉTODOS

El ADN se extrajo de muestras de sangre de 163 animales de la raza Criollo

Limonero, las cuales fueron tomadas de la vena yugular . Los animales provinieron de
un rebaño de 350 animales puros localizado en la estación local Carrasquero adscrita
al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA-Zulia).El fragmento
amplificado constó de 262 pares de base (pb) y se obtuvo utilizando los
oligonucleotidos BLGP3: 5-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3 y BLGP4: 5-
CAGGACACCGGCTCCCGGTATATGA-3( Ludén et al., 1997). Para la reacción de
PCR se utilizó 2.5 µL de buffer, 2 mM MgCl 2, 0,1 mM dntps, 0,6 pmol primers, 0,63
U de Taq polimerasa y ADN 50 ng., se usó un termociclador (Mastercycler ep-
gradient (S), Eppendorf, North America), la amplificación se realizó en tres fases: una
primera fase de separación de las dos hebras del ADN a 95°C por 5 min, la segunda
fase de 30 ciclos que oscilan en series de 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 58°C y
45 segundos a 72°C, y una tercera fase de finalización para una extensión a 72°C
durante 5 min. Para determinar los genotipos de la BLG, las variantes alélicas se
obtuvieron a partir de la digestión del producto amplificado a través de la técnica PCR
-RFLP utilizando la enzima Hae III (Promega). La mezcla constó de 0,5 µL (5U) de
la enzima, 6,5 µL de agua, 2 µL de Buffer B, 1 µL de BSA y 10 µL de producto
amplificado (Medrano et al., 1990). Tanto la visualización del producto amplificado
como las variantes alélicas fueron identificadas a través de geles de agarosa
preparados con solución tampón TAE 1x (Tris-EDTA-Ácido Acético, pH 8,1) al
1,5% para observar el producto de amplificación y al 3% para observar el producto de
la digestión. La electroforesis se realizó en una cámara horizontal (Fisher Scientific
Electrophoresis Systems, Illinois, EUA) modelo FB-SB-1316 a 50V durante 5 min y
100V durante 45 min, luego los geles fueron teñidos con bromuro de etidio para la
posterior visualización de las bandas en un transiluminador UV (UVP, High
performance 302 nm, Canadá). Finalmente el cálculo de las frecuencias génicas y
alélicas se realizó por conteo directo, y el equilibrio de Hardy Weinberg se determinó
mediante la prueba Chi-cuadrado utilizando el programa GENEPOP 3.1 (Raymond et
al., 1995).

5. COMPARACIÓN DE FRECUENCIAS ALÉLICAS Y GENOTÍPICAS DE LOS

POLIMORFISMOS CAPN1-316 Y CAPN1-4751 DEL GEN DE LA CALPAINA EN
TRES POBLACIONES DE GANADO CRIOLLO BOLIVIANO

5.1. RESUMEN

La terneza de la carne está en parte determinada por el sistema proteico calpaína

(CAPN1) / calpastatina (CAST). Bolivia posee en los llanos tres biotipos de ganado
Criollo: los Yacumeños, los Chaqueños y los Saavedreños. El objetivo del presente
trabajo fue determinar la frecuencia alélica y genotípica del gen de la CAPN1 en tres
poblaciones de ganado Criollo de Bolivia. Se obtuvieron muestras de sangre de 28
Criollos del Chaco (CCH), 85 Criollos Yacumeños (CYA) y 30 Criollos Saavedreños
(CSV). El ADN se extrajo utilizando el kit comercial Wizard® Genomic Purification,
y posteriormente se tipificaron dos polimorfismos (CAPN1-316 y CAPN1-4751) del
gen CAPN1 mediante el método ARMS-PCR. La frecuencias alélicas y genotípicas,
las heterocigosidades esperadas y observadas, así como, el índice FIS y el
desequilibrio de ligamiento (LD) fueron calculadas mediante los programas MS-
 Tools y Genepop. Las frecuencias de los alelos asociados a mayor terneza para las
poblaciones de CCH, CYA y CSV fueron: 23%, 22% y 33 % para el alelo C del SNP
CAPN1-316 y 75%, 76% y 60% para el alelo C del CAPN1-4751. La heterocigocidad
observada en las tres poblaciones se hallan en un rango de 0,30 a 0,46 para el
marcador CAPN1-316 y de 0,21 a 0,60 para el polimorfismo CAPN1-4751. Los
resultados demuestran que los bovinos criollos en las poblaciones analizadas poseen
altas frecuencias alélicas para las variantes asociadas a mayor terneza de la carne. Por
otra parte, no se observaron valores significativos de LD (P>0,01) entre los dos
polimorfismos tipificados en las poblaciones estudiadas. Sería necesario tipificar
ambos polimorfismos en futuros programas de selección asistida por marcadores
genéticos.

5.2. MÉTODO

Se obtuvieron muestras de sangre de 28 Criollos del chaco (CCH), 85 Criollos

Yacumeños (CYA) y 30 Criollos Saavedreños (CSV). Estas tres poblaciones son
consideradas como las predominantes en las zonas bajas de Bolivia. Se extrajo ADN
utilizando el kit comercial Wizard® Genomic Purification Promega, WI, USA. Dos
polimorfismos nucleótidos sencillos (SNPs) del gen calpaína: CAPN1- 316
(AF252504: g.5709 C>G) y CAPN1-4751 (AF248054: g.6545 C>T), fueron
tipificados para el presente estudio mediante el método ARMS-PCR diseñado por
Rincón y Medrano (2006). Esta técnica utiliza un juego de cuatro primers en un único
tubo de reacción. Dos de estos oligonucleótidos son alelo específico y amplifican en
direcciones opuestas con cada uno de los restantes primers externos. Los genotipos
pueden ser detectados directamente en un gel de electroforesis por presencia o
ausencia de los productos de amplificación alelo específico. En lo que respecta a los
SNPs el CAPN1-316 se halla en el exón 9 y produce un cambio nosinónimo de
glycina por alanina, mientras que el CAPN1-4751 se halla en el intrón 17. Las
frecuencias alélicas y genotípicas, las heterocigosidades esperadas y observadas, así
como, el índice FIS y el desequilibrio de ligamiento (LD) fueron calculadas mediante
los programas MS-Tools y Genepop.

6. BIBLIOGRAFÍA

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Castro, J.M., & Zárate-Martínez, J.P., & Abad-Zavaleta, J. (2017). Estimación de las
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https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=203353519013
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Iberoamericanas de Conservación Animal, 6 (2015) 156-164. Disponible en:
http://sedici.unlp.edu.ar/handle/10915/100082