UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MACHALA

Facultad de Ciencias Químicas y de la Salud

ALIMENTOS

BIOLOGÍA MOLECULAR

Proyecto Final

Viernes , 11 de Febrero del 2022

Tema

Lechuga transgénica resiste contra insectos mediante la aplicación del método

Agrobacterium tumefaciens

Estudiantes:

Leonardo Magallanes Villamar, Johely Valentina Romero Neira , Maria Belen Viejo
Villegas, Nathaly Gissela Mejia Bermeo, Jislayner Feijóo

Docente:

ING. ESTEFANIA CHERREZ

Ciclo/Nivel

Cuarto Semestre ‘‘A’’

Período académico

2020-D2
2. Objetivos del trabajo (¿Qué?, ¿Cómo?, ¿Para qué? )

Implementación de un organismo genéticamente modificado mediante el método de

Agrobacterium tumefaciens(vector) en lechuga para la resistencia contra insectos
fitófagos.
3. Desarrollo

3.1 Introducción (¿Qué es un organismo transgénico? ¿Cómo se

desarrolla?, describir específicamente la problemática de su temática (¿Qué
quiero solucionar?)

En los tradicionales programas de reproducción, sólo las especies directamente

relacionadas podían ser cruzadas, pero las técnicas transgénicas permiten transferir
material genético de organismos completamente no relacionados, por lo que los
criadores pueden incorporar características que normalmente no están disponibles
para ellos. Los organismos actualmente modificados, exhiben propiedades, que
serían imposibles de obtener por técnicas convencionales de reproducción.
La más reciente aplicación de la biotecnología en alimentos es la modificación
genética (GM), también conocida como ingeniería genética, manipulación genética,
tecnología genética y/o tecnología recombinante de ADN.
La ingeniería genética es esta nueva ciencia que permite transferir la información
genética de un organismo a otro. Se denomina transgénico al organismo portador
de material genético perteneciente a especies no emparentadas transferido a él
mediante ingeniería genética.
Se desarrolla mediante ADN uno o más genes que originalmente pertenecían a
otra especie. Estos genes pueden provenir de especies muy cercanas, por
ejemplo de la cebada o de la papa, o de organismos muy distantes como las
algas o las bacterias. Estos genes son introducidos en el genoma utilizando la
llamada tecnología del ADN recombinante, que no es otra cosa sino la
combinación del ADN de dos células distintas usando herramientas moleculares
para cortarlo y pegarlo y para introducir la nueva molécula a una célula o
grupo de células específicas.

La gran problemática presente en el cultivo de lechuga está azotada por numerosos

insectos, hongos y bacterias que deterioran y alteran las hojas de esta hortaliza
provocando amarillamiento de estas y su posterior debilitamiento. Al mismo tiempo
producen melaza y atraen la infección por el hongo «negrilla».

Aunque tienen sus propios medios de defensa, el ser humano ha desarrollado una
medida de actuación para controlar y proteger nuestros cultivos.

Para ello se ha creado una nueva técnica para hacerle frente a este problema en la
cual se ha utilizado como gen de Bacillus thuringiensis ya que es una bacteria
grampositiva del suelo que en los estadios de esporulación produce unos cristales de
proteínas de propiedades insecticidas. implementando como vector el Agrobacterium
tumefaciens introduciendo el gen de su plásmido en las células de la planta infectada.
Recordemos que un plásmido es un fragmento de ADN circular y extracromosómico
que suele contener información no vital para la bacteria y cuyo tamaño es del orden
del 1 al 3% del cromosoma bacteriano.

Las células afectadas contienen unas sustancias, las opinas (sustancias

nitrocarbonadas), que no se encuentran en las células normales, ya que las cepas de
Agrobacterium tumefasciens de un plásmido llamado Ti (del inglés c) es portador del
carácter patógeno, donde células de las agallas son portadoras de un fragmento del
plásmido Ti que se denominó ADN-T (ADN transferido) obteniéndo varias funciones
en el plásmido como la función de virulencia (Vir), responsable de la transferencia
del ADN-T, la oncógena (Onc), responsable del tumor (consecuencia de la síntesis de
auxina y citoquinina), la función que especifica la síntesis de opinas (Ops), moléculas
que sirven de alimento a la propia bacteria, y la función catabólica (Opc, opina
catabolismo).

encontrando varios segmentos Opc1, Opc2, que permiten la degradación de las

opinas producidas por el tumor. en donde se distinguen dos tipos de funciones: las
funciones situadas fuera del segmento ADN-T (Vir, Opc1,Opc2) que se expresan en la
bacteria y las funciones controladas por el segmento ADN-T (Onc, Ops) que se
expresan en la célula vegetal después de la transferencia de este segmento.

En la cual La supresión en el plásmido del segmento transferido hace que la bacteria

sea inofensiva sin que ello se la prive de la capacidad de transferir ADN a una célula
vegetal. Por tanto se puede plantear su sustitución por un fragmento de ADN
extraño.
El segmento ADN-T está delimitado en ambos extremos por unas secuencias
determinadas de nucleótidos que actúan a modo de señales. La señal "promotor" al
principio y la "terminador" al final. La región transferida y que se integra en el
genoma de la planta es la comprendida entre estas dos señales.

3.2 Descripción de la propuesta alimento transgénico (Organismo

donante del gen (nombre del gen, longitud), organismo hospedero,
características que deseo que se manifiesten, describir la proteína de
interés)

La propuesta del alimento transgénico a desarrollar es una bacteriocina

Agrobacterium tumefaciens para la inoculación en lechuga, en donde la bacteria es
proveniente de un organismo donante Bacillus thuringiensis en la cual se extrae el
gen Cry a un organismos receptor, manifestándose en el núcleo de la planta.
El gen Cry Secuencias de ADN del genoma de Bacillus thuringiensis que codifica las
proteínas insecticidas llamadas Cry. En donde este gen cry1s cry1A (a,b,c) es de 272
- 290 pb.
La integración del ADN-T dentro del cromosoma de la planta esta mediada por la
proteína VirD2 que contiene dominios con actividad para la recombinación y
ligación.
3.3 Materiales utilizados en la elaboración del alimento transgénico

MATERIALES Y MÉTODOS

Se puede tomar 75 muestras de suelo las cuales presentaron una textura

arcillo-arenosa y un pH entre 4.3 y 9.8. A partir de las muestras de suelo se aislaron
236 colonias que mostraron características morfológicas correspondientes a B.
thuringiensis: colonias circulares de 6 a 8 mm de diámetro, aplanadas, de borde
irregular lobulado y arborescente, consistencia blanda, aspecto opaco/mate,
pigmentación blanco cremoso y bacterias con morfología perteneciente a bacilos
rectos de extremos redondos o romos.
Para asilar la bacteria se adicionaron 500 mg de suelo en 10 mL de agua destilada
estéril y se incubaron a 65 °C por 30 min con agitación vigorosa. Posteriormente, se
inocularon 100 μL de cada muestra en medio LB sólido (10 g de triptona, 10 g de
NaCl, 5 g de extracto de levadura y 15 g de agar por litro) y se incubaron a 28-30 °C
durante 24 h.
El ADN de los aislados y el control positivo se obtuvo con el kit UltraClean ®
Microbial DNA Isolation de la casa comercial MoBio. Para la identificación
molecular de genes Cry1 por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR,
por sus siglas en inglés) se emplearon los cebadores propuestos por Un1(f)
CATGATTCATGCGGCAGATAAAC y Un1(r) TTGTGACACTTCTGCTTCCCATT. El
volumen final de la mezcla para la PCR fue de 50 µL, y contenía 1X de buffer de la
ADN polimerasa, 200 µM de dNTP, 1 U de ADN polimerasa, 1 µM de cada cebador
y 2 µL de ADN. Las condiciones de amplificación fueron: 95 °C por 5 min para la
desnaturalización inicial, seguida de 30 ciclos de 95 °C por 1 min, 60 °C por 30 s y
72 °C por 1 min, y una extensión final a 72 °C por 7 min. Los productos de la PCR se
visualizaron en geles de agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio.
Para la obtención del complejo espora-cristal se emplearon los aislados
identificados por la PCR de los genes Cry1 y el control B. thuringiensis var
Kurstakii, los cuales se inocularon en 100 mL de medio T3.
y se colocaron en agitación durante 10 días a 30 °C. Posteriormente, el cultivo se
centrifugó a 3,500 g durante 15 min y se realizaron tres lavados consecutivos con
NaCl a 1.5 M, eliminándose el sobrenadante en cada oportunidad. El precipitado
final se congeló y liofilizó. Para llevar a cabo los bioensayos, el liofilizado se
resuspendió en agua destilada estéril hasta alcanzar una concentración de 500
μg∙mL-1
3.4 Proceso de obtención del alimento transgénico ¿Cómo se lo realizó?

* Describir el Gen

El gen que se desea insertar es el Bacillus thuringiensis es un bacilo Gram positivo

que durante su fase de esporulación produce una inclusión parasporal, conformada
por proteínas Cry por su acumulación en el interior de las bacterias y su carácter
tóxico con actividad biológica contra insectos-plaga. Gracias a estas proteínas
Bacillus thuringiensis presenta toxicidad contra larvas de insectos-plaga de los
órdenes Lepidoptera, Coleóptera y Díptera, entre otros.
* Tipo de vector a utilizar (describir el proceso de introducción del gen
foráneo en el plásmido, diseño del plásmido, enzimas de restricción
En este sistema la cepa de Agrobacterium contiene un plásmido que codifica para
una recombinasa, una secuencia para el control de su expresión, genes vir y un sitio
de recombinación. Este plásmido se recombina con otro plásmido, que contiene el
 gen de interés flanqueado por el borde derecho, generando un plásmido
co-integrado sitio específico.
Posteriormente se hizo un análisis de restricción obtenidas usando las enzimas
EcoRI, EcoRV, HindIII, BamHI, y AluI para identificar diferentes secuencias cry.

Principales Plásmidos utilizados en la transformación genética de plantas; A)

Sistema cointegrado; El gen de interés y la región vir se encuentran en el
mismo plásmido, para introducir el gen de interés al plásmido Ti es necesario
realizar una recombinación previa con un vector de recombinación. B) Sistema
binario; El gen de interés y la región vir se encuentran en plásmidos
independientes. No se requieren recombinaciones adicionales

HindIII es una enzima de restricción de tipo II ​ producida por el microorganismo

Haemophilus influenzae que posee una diana de restricción en el ADN de cadena
doble dependiente de una secuencia metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la
cual su actividad catalítica hidrolasa genera extremos cohesivos.

Los extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la

enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada
recombinante

4. ¿Qué análisis posteriores se deben realizar una vez generado el

transgénico? (Análisis de inocuidad, aspectos sociales y económicos)

ANALISIS DE INOCUIDAD

Los alimentos e ingredientes alimenticios no deben de presentar un peligro al

consumidor (Ballabriga & Moya, 1999) para ello se debe de evaluar los siguientes
aspectos:

➢ EQUIVALENCIA SUBSTANCIAL

Si un alimento modificado o un componente alimenticio puede ser comparado a su

homólogo existente en el mercado y ser encontrado substancialmente equivalente,
puede ser tratado de la misma forma con lo que respecta a seguridad. En caso de no
cumplirse se debe destacar sus principales diferencias.
➢ EVALUACION DE SEGURIDAD

- Análisis de composición

- Análisis de nutrición e ingestión

- Alergenicidad

- Estabilidad

- Ecología de microrganismos

En cada uno de ellos se somete al alimento a condiciones similares o evaluaciones

rigurosas que determinan su grado de seguridad alimentaria, como, por ejemplo; la
toxicidad y alergenicidad se la prueba en ratones evaluando la resistencia a la
digestión, la prevalencia en el alimento, la similitud con otras proteínas alergénicas a
través de la bioinformática, es decir, que se evalúa tanto la lechuga no modificada
como la modificada y a partir de análisis de proteínas especificas se determina su
grado de seguridad.

Para la digestibilidad se someten a sistemas simulados, para verificar su

degradabilidad, resistencia degradación estomacal o intestinal, aumenta grado
exposición a la proteína (Agromatica, 2009)

➢ EVALUACIÓN DEL CULTIVO

Una de las evaluaciones que se debe de llevar a cabo es la siembra del alimento
modificado a la par de su tradicional, el objetivo de estas evaluaciones es demostrar
que el cultivo o alimento genéticamente modificado es igual de seguro como el
alimento tradicional conocido. Algunos aspectos que se evalúan dentro de este
proceso son:

- Morfología

- Rendimiento

- Reproducción

ASPECTOS SOCIALES A CONSIDERAR

La comercialización y distribución de alimentos genéticamente modificados pueden
verse retrasados debido a problemas de índole no técnica, como la preocupación de
los consumidores por la seguridad de los alimentos y el impacto ambiental (Robledo
Arratia, 2014)

Sin embargo, estos productos incrementan la producción de alimentos siendo este un

beneficio debido a la creciente población de habitantes de estos últimos años, para
ello se debe considerar y evaluar los riesgos sobre los beneficios que conlleva al
consumir Alimentos genéticamente modificados.

Beneficios del uso de lechuga transgénica:

- Disminución del uso de plaguicidas químicos al disponer de cultivos que no

requieran estas sustancias para detener las plagas

- Incrementos en la producción.

Aspectos negativos del uso de lechuga transgénica:

- Podría favorecer la aparición de razas de insectos resistentes a dicha toxina.

- Contaminación del suelo, debido a que podrían transmitir el transgén a otros

microorganismos del suelo o a otras plantas.

Aspectos Económicos

Existen intereses económicos de las empresas que explotan la ingeniería genética que
son tan importantes que no se respeta el tiempo necesario para una evaluación
científica de los riesgos sobre los beneficios, involucrando así intereses políticos,
sociales y por su puesto económicos y por lo cual existe especulación sobre las
patentes de plantas transgénicas (Delgado & Escorihuela, 2020).

La implementación de alimentos transgénicos es analizada por cada país, por lo cual

al implementar una lechuga transgénica se deben de consideran ciertos criterios
como:

- Generación de beneficios comerciales

- Elevados rendimientos por aumentos en la productividad de las cosechas

- Menor presión sobre los recursos naturales acompañada de menor uso de
insecticidas y herbicidas químicos

5. Resultados (Detallar los posibles beneficios de su propuesta de

transgénicos en el sector alimentario)

Al llevar a cabo lo propuesto en nuestro proyecto, como la disminución del uso de los
plaguicidas químicos para el cultivo de lechuga contra los insectos fitofagos, se ha
realizado la implemetacion de un transgénico el cual permite a esta planta herbácea
resistir ante estos daños provocados, el mismo que favorece a los agricultores en sus
sembríos.

generando de esta manera una inocuidad, en la cual genera un aumento en el

suministro de alimentos a un costo reducido y con una vida útil mayor,
consumiéndose de manera apetitosa.

6. Conclusiones

La concentración de 250 µg/ml de Timentín es adecuada, para la desinfección

de Agrobacterium en los callos de crisantemo transformados. , ya que puede
inhibir por completo el crecimiento de Agrobacterium sin tener un efecto
negativo, estadísticamente significativo sobre el callo.

Los resultados muestran la existencia de impactos significativos de contaminación,

así como el potencial de riesgos diversos sobre la salud humana y los
agro-ecosistemas mundiales; los cuales por la fuerza de la inercia comercial, social y
tendencia, muestran una significativa vulnerabilidad global.

En la actualidad, el avance de las técnicas de análisis químicos y de los equipos

analíticos precisos permite detectar concentraciones muy bajas de plaguicidas o de
sus metabolitos, lo que hace posible en cierto grado asegurar un suministro
constante de alimentos de calidad
7. Recomendaciones

- se recomienda la utilización del agrobacterium tumefaciens para la resistencia

de los cultivos de lechuga, la misma que generará un gran impacto socio
economico a los agricultores.
8. Bibliografía con normas APA

- García, C. O. R., & González, L. C. (2021). EMPLEO DE Trichoderma spp.

PARA EL CONTROL DE ENFERMEDADES Y PRODUCCIÓN MÁS LIMPIA
EN LECHUGA. REVISTA AMBIENTAL AGUA, AIRE Y SUELO, 11(2).
- Valderrama Fonseca, A. M., Arango Isaza, R., & Afanador Kafuri, L. (2005).
Transformación de plantas mediada por Agrobacterium:" ingeniería genética
natural aplicada". Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín, 58(1),
2569-2585.
- Robledo-Arratia, L. (2014). Transgénicos,¿ y eso con qué se come?.
- Portela, D., Giraldo, A & Lopez, S. (2013). La biotecnología de Bacillus
Thuringiensis en la agricultura. Grupo de Ingeniería Genética de Plantas,
Departamento de Biología, Universidad Nacional de Colombia, A.A 14-490,
Bogotá D.C., Colombia.
- Pérez, A., Navarro, H., & Miranda, E. (2013, agosto). RESIDUOS DE
PLAGUICIDAS EN HORTALIZAS: PROBLEMÁTICA Y RIESGO EN
MÉXICO.
file:///C:/Users/USUARIO/Downloads/41423-Texto%20del%20art%C3%AD
culo-111802-1-10-20131113.pdf
- Agromatica. (2009). Plagas y enfermedades de la lechuga.
- Ballabriga, A., & Moya, M. (1999). Alimentos transgénicos. Anales Espanoles
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- Delgado, J. I., & Escorihuela, U. N. E. (2020). El comercio de los productos
transgénicos: el estado del debate internacional. La Economía Aplicada,
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- Robledo Arratia, L. (2014). Transgénicos , ¿ y eso con qué se come ?
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