Pw eco microbiana

coloración GraM
La tinción de Gram es una prueba que detecta bacterias en el lugar
donde se sospecha estén en el ambiente o en infecciónes, de garganta,
los pulmones, los genitales o las lesiones en la piel. Las tinciones de
Gram también se pueden usar para detectar bacterias en ciertos fluidos
corporales, como la sangre o la orina.

Grampositivas y Gramnegativas.

Si se mantienen azul púrpura, son grampositivas

Si se vuelven rosadas o rojas, son gramnegativas. :
Objetivos •Mecheros bunsen con gas
Realizar una tinción de gram sobre una centralizado.
muestra problema. •Papel de filtro.
Aprender a diferenciar entre •Portaobjetos.
microorganismos gram+ y gram-. •Placas de petri con microorganismos
Materiales sembrados sobre un medio de
frotis bacteriano a partir de una cultivo.
muestra cultivada o un sustrato •Asa de siembra de platino.
se utilizan dos colorantes.: •Cubeta con agua.
Uno de carácter primario, como es •Puentes de tinción.
el cristal violeta, y •Pipetas pasteur.
otro de contraste, como la •Agua destilada.
safranina. •Lugol.
También se utiliza un mordiente •Alcohol/Acetona 1:1
para la safranina, como es el Lugol •Safranina.
de Gran, •Cristal Violeta.
y un decolorante como el •Microscopio óptico.de campo claro
alcohol/acetona.
 La pared bacteriana, corresponde a la estructura que da forma a la célula y la protege de lisis
osmótica, acción de sustancias tóxicas y es el lugar sobre el cual actúan varios antibióticos

80nm

no cuentan con membrana celular fina de péptidoglicano

externa.
Fundamento
Los microorganismos Gran +se tienen
más mureína, una pared celular
monoestratificada y presencia de ácidos
teitoicos.
Los gram- tienen menos mureína, una
pared celular biestratificada y no tienen
ácidos teitoicos.
TÉCNICA
Preparar un frotis bacteriano.
Teñir el frotis de cristal violeta (colorante catiónico) tiene afinidad por el péptidoglicano,
durante 1 minuto.
Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
Cubrir la preparación con lugol mordiente, (haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana )durante 1 minuto.
Se lava con agua destilada hasta eliminar el exceso de lugol.
Lavar con alcohol/acetona la preparación para eliminar el primer colorante. 30 segundos
deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros, También destruye la membrana externa de
las bacterias Gram negativas, debido a que esta es soluble a la acción de solventes orgánicos.
Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de alcohol/acetona.
Teñir la preparación con safranina durante 1 minuto, colorante de contraste tiñe las bacterias
que no logran retener el complejo cristal violeta-yodo.
Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
Secar la preparación al aire. Observar al microscopio óptico a 100x y finalmente identificar los
microorganismos como grampositivos o gramnegativos.
 •Bacilo grampositivo en
cadenas.
•Coco grampositivo en
tétradas.
•Coco grampositivo en
racimos.
•Bacilo grampositivo
aislado o en parejas.
•: Bacilo gramnegativo
Cocobacilos

Cocos gramnegativos en Bacilos grampositivos

racimo observados con el (estreptobacilos)
objetivo de 40X observados con el
objetivo de 40X
grampositiva de Bacillus anthracis Clostridium
perfringens (grampositivas.
1.cristal violeta (tinción): de naturaleza básica con afinidad a sustancias cargadas
negativamente como las paredes celulares bacterianas, así se tiñen de morado las
bacterias Gram positivas y Gram negativas inicialmente.Enjuague con agua.
2.Lugol (mordiente): aumenta la fijación del cristal violeta sobre la pared celular, creando
un complejo insoluble en agua (no se pierde durante el enjuague con agua). Las bacterias
Gram positivas tienen gran cantidad de ácidos teicoicos tienen gran afinidad por agentes
oxidantes como el Lugol.Enjuague
3.Alcohol acetona (disolvente orgánico): este decolora la pared bacteriana al disolver el
complejo cristal violeta-lugol, afectando a las bacterias Gram negativas pero no a las Gram
positivas (debido a la estructura de la pared de las Gram positivas que es más
gruesapropiciando una barrera a la salida del colorante cristal violeta).Enjuague
4.Safranina (contratinción):al ser catiónico tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen
cargas negativas, donde las Gram negativas se tiñen de color rosa, pero las bacterias Gram
positivas no se tiñen porque su pared celularestá saturada decristal violeta impidiendo la
entrada de la safranina.
Bacterias Gram positivas
G + pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de
peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la
responsable de retener el tinte durante la tinción
Gram negativas presentan una segunda membrana lipídica externa a la
pared celular. Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como
inmóviles con forma de bacilo
(Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco
(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin
ellas (Mycoplasma).
 •Membrana celular
No
externa

•Peptidoglicanos
capa fina)

membrana
citoplasmática
.
NO OLVIDAR

Es imprescindible uso de bata de laboratorio y guantes desechables.

2. Lavarse las manos con agua y jabón cada vez que iniciemos y finalicemos las prácticas.
3. La zona de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Desinfectar la superficie de trabajo
antes y después de realizar el trabajo con lejía o alcohol (etanol 96°).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del mechero
5. Durante las prácticas está prohibido comer, beber y fumar
6. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos,
etc, por nuestra propio seguridad.
7. Desechar el material contaminado en los recipientes adecuados, que serán esterilizados
posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por el fregador o en la basura común.
8. Prohibido sacar muestras contaminadas del laboratorio.
9. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre PROPIPETAS.
10. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se
comunicará inmediatamente al profesor O TUTOR
11. Extremar la precaución con el encendido del mechero Bunsen y su manipulación. Abrir las
ventanas por si se produce un escape de gas del mechero Bunsen.