Manual de Microbiología General 2021

MANUAL DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA GENERAL
Un agradecimiento especial a todas las personas que han colaborado en la edición y

revisión de éste manual.
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
ESCUELA DE QUÍMICA BIOLÓGICA
MANUAL DE PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2021
EDITORES
Lic. Gustavo Gini
Licda. Floridalma Cano
Licda. María Luisa García
Licda. María del Carmen Bran
Dra. Karin Herrera
Lic. Roberto Cáceres
COLABORADORES
Br. Alison Pérez
Br. Edelwaiz Morataya
Br. Angie Rodríguez
Br. Pamela Palacios
Br. Hans Roche
GUATEMALA, 2021
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
ESCUELA DE QUÍMICA BIOLÓGICA
MANUAL DE PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA GENERAL 2021
Nombre: ______________________________________ Carnet: __________________
Carrera: _______________________________________Laboratorio:_____________
ÍNDICE
NO. PRÁCTICA PÁGINA
Reglamento interno............................................................................................... 0
Normas básicas de bioseguridad microbiológica .................................................. 2
Lavado de manos ................................................................................................. 4
1. Omnipresencia de los microorganismos ............................................................... 6
2. El microscopio ...................................................................................................... 8
3. Tinción simple ..................................................................................................... 13
4. Tinción diferencial de gram ................................................................................. 21
5. Tinción ácido alcohol resistente .......................................................................... 27
6. Demostración de cápsula ................................................................................... 30
7. Coloración de esporas ........................................................................................ 38
8. Gránulos metacromáticos ................................................................................... 33
9. Tinción de flagelos .............................................................................................. 36
10. Determinación de movilidad bacteriana .............................................................. 37
11. Obtención de cultivos puros ................................................................................ 39
12. Características morfológicas de las colonias bacterianas.................................. 45
13. Determinación de los requerimientos de oxígenos de las bacterias ................... 48
14. Prueba de catalasa ............................................................................................. 53
15. Conteo de poblaciones bacterianas .................................................................... 55
16. Acción sobre carbohidratos ................................................................................ 57
17. Acción sobre nitratos .......................................................................................... 60
18. Prueba de IMVIC ................................................................................................ 63
19. Hongos levaduriformes ....................................................................................... 68
20. Hongos saprobios ............................................................................................... 71
21. Cultivo en lámina ................................................................................................ 88
22. Morfología de algas ............................................................................................ 93
23. Protozoos............................................................................................................ 95
24. Análisis microbiológico de agua ........................................................................ 102
25. Recuento microbiológico de alimentos ............................................................. 107
26. Métodos y equipo utilizado para control de microorganismos .......................... 114
27. Bacterias fijadoras de nitrógeno ....................................................................... 119
28. Amonificacion del suelo .................................................................................... 123
Apéndice A ....................................................................................................... 125
Apéndice B ....................................................................................................... 130
Referencias....................................................................................................... 132
NORMAS BÁSICAS DE BIOSEGURIDAD MICROBIOLÓGICA
Al estudiar bacterias, virus, parásitos, hongos y otros agentes infecciosos que pueden ser
patógenos para el hombre y los animales, debemos conocer las normas de seguridad biológica que
pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso,
siendo más estrictos para agentes muy peligrosos y menos para los agentes menos peligrosos.
Deben ser pensadas como procedimientos a seguir para conseguir que las personas que trabajan
con agentes infecciosos en el Laboratorio de Microbiología estén expuestas al mínimo riesgo
posible.
Por otra parte, el personal del Laboratorio de Microbiología está expuesto a riesgos no biológicos
(químicos, físicos, eléctricos, etc.) comunes en otros laboratorios.
Actualmente, el modo de proceder de los trabajadores de un Laboratorio de Microbiología

determina su seguridad la de las demás personas. El equipamiento y el diseño del Laboratorio de
Microbiología contribuyen a ésta, sólo si las personas que trabajan en él, están motivadas, conocen
las normas de seguridad y las aplican.
La formación en esta rama es importante para la eficacia de los programas de seguridad y ésta
debe ser facilitada a todas las personas que están expuestas a los riesgos del laboratorio: personal
del laboratorio, de mantenimiento, de limpieza, entre otros.
Entre las reglas más importantes se pueden mencionar:
La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación a la que

es sometido. Por ello es básico:
1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

2. Conocer la metodología de trabajo del laboratorio.
3. Conocer el equipamiento del laboratorio.
4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia.
5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biológica.
6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior.
En caso de producirse un accidente por agente biológico deben tomarse en cuenta cuatro
factores: un huésped susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una
ruta de transmisión apropiada. De todos ellos, el que mejor se puede controlar en el laboratorio es la
ruta de transmisión, la cual frecuentemente es inoculación directa.
2
Medidas generales
Deben cumplirse obligatoriamente en cualquier área del laboratorio.
1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.

2. Las puertas deben permanecer cerradas para mantener la adecuada contención biológica.
3. Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente y siempre que se
produzca un derrame.
4. El laboratorio debe permanecer limpio y ordenado.
5. El transporte de las muestras dentro o entre laboratorios se realizará de tal manera que, en caso
de caída, no se produzcan salpicaduras. Por ninguna circunstancia se pueden transportar las
muestras en las manos.
6. La bata de laboratorio, así como guantes, lentes de seguridad, etc. debe estar disponible en todo
momento.
7. Poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con materiales potencialmente
infecciosos. Con este fin deben usarse guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que
contengan posibles patógenos. Los guantes siempre serán desechados antes de salir del área
de trabajo. Jamás se saldrá de la misma con los guantes puestos, ni con ellos se cogerá el
teléfono, se tocarán los volantes, etc.
8. Después de quitarse los guantes, se realizará un lavado de manos.
9. Se usarán lentes de seguridad y mascarilla si existe riesgo de salpicaduras y/o aerosoles.
10. Se pondrá extremo cuidado en minimizar el riesgo de autoinoculación y de generación de
aerosoles.
11. Los derrames y accidentes deben ser informados inmediatamente al instructor de laboratorio.
12. Está rigurosamente prohibido pipetear con la boca. Se realizará pipeteo automático con material
adecuado y cada trabajador será instruido para manejarlo debidamente.
13. En la zona de trabajo no debe colocarse material de escritorio ni libros, ya que el papel
contaminado es de muy difícil esterilización.
14. No deberán usarse lentes de contacto.
Higiene
1. Si se tiene el cabello largo debe llevarlo recogido.

2. Comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos está prohibido en el área de trabajo del laboratorio,
así como el almacenamiento de comida o bebida.
3. Se deben lavar las manos frecuentemente durante las actividades rutinarias, tras acabar la
práctica y siempre antes de abandonar el laboratorio. Se usará un jabón antiséptico y el secado
se realizará con papel.
4. Las heridas y cortes en las manos deben ser convenientemente vendadas o cubiertas y es
imprescindible el uso de guantes. Las heridas y cortes producidas en el laboratorio deben ser
comunicadas de inmediato al responsable a cargo.
3
LAVADO DE MANOS
El lavado de manos es el factor fundamental en la prevención de enfermedades. Las manos son

el vehículo más frecuente de transmisión de enfermedades en los seres humanos. La mayoría de
las personas no está consciente de la necesidad de lavarse las manos, porque desconoce o
minimiza los riesgos a la salud que pueden provocar al no realizar esta práctica.
Es imprescindible que se entienda la importancia de lavarse las manos correctamente. Se

recomienda utilizar el lavadero más cercano a la entrada para el lavado de manos.
¿Por qué lavarse las manos?
• Las manos pueden ser reservorios de microorganismos dañinos, por lo tanto el lavado de
manos puede reducir las infecciones provocadas por bacterias, virus y parásitos, entre otras.
• Las rutinas de lavado reducen de manera significativa la transmisión de infecciones en más
de un 50%. El lavado de manos adecuado es esencial para:
• Eliminar microorganismos nocivos para la salud presentes en las manos.
• Disminuir el riesgo de padecer infecciones
• Garantizar una buena higiene personal
• Gozar de buena salud
¿Cuándo lavarse las manos?
• Al llegar y antes de salir del trabajo.

• Después de ir al servicio sanitario.
• Tocar desperdicios y basura.
• Antes de incorporarse al trabajo de laboratorio tras los descansos o interrupciones.
• Después de tocarse la nariz, oídos, ojos, boca y rascarse la cabeza.
• Antes y después de comer, beber y/o manipular alimentos.
• Después de manipular equipos o utensilios.
• Antes de ponerse guantes.
• Luego de haber tocado equipo de protección ya usado (mascarillas, guantes, entre otros).
• Cuando toque o manipule algún objeto que, por su naturaleza debe ser tocado
constantemente por varias personas (interruptores, perillas, sillas, teléfono, computadora y
lapiceros).
4
Procedimiento para lavarse las manos
1. Retirar de las manos reloj, pulseras y anillos. Abrir la llave del chorro con una servilleta de papel
para evitar contaminarla, mojar sus manos y tome solución de jabón del frasco dispensador.
2. Frótese las manos usando jabón, enjabonándolas bien y asegurándose de tocar toda superficie
de las manos. Frótese los dedos y los pulgares, entrelazándolos y moviéndolos primero en una
dirección y luego en la dirección contraria.
3. Enjuáguese las manos bajo un chorro de agua corriente limpia hasta que se quite todo el jabón.
4. Séquese las manos absorbiendo el agua con una toalla de papel limpia.
LAVADO DE MANOS
5
OMNIPRESENCIA DE LOS MICROORGANISMOS

TRABAJO PRÁCTICO No. 1
Los microorganismos están presentes en el ambiente, el aire, el suelo, las plantas, las
superficies, etc., observándose en mayor número cuando encuentran condiciones que favorecen su
crecimiento.
Debido a la ubicuidad de los microorganismos es inevitable su presencia en el medio ambiente

que nos rodea, se encuentran además en la piel, nariz, boca, vagina, heces, formando parte de la
microbiota normal de éstas áreas.
Es importante tener presente que al trabajar en un laboratorio de microbiología es necesario,

emplear técnicas asépticas para evitar contaminaciones en los cultivos que se manejan o bien
infectar a las personas que están trabajando dentro del laboratorio.
Uno de los principales objetivos del siguiente ejercicio práctico es demostrar la cantidad de
microorganismos que nos rodean dentro del área de trabajo que pueden estar presentes en la mesa,
el piso, el lavadero, la piel, la cabeza y en distintos lugares.
• MATERIAL
4 cajas de Petri con 20mL de agar tripticasa soya

2 hisopos estériles
• PROCEDIMIENTO
Utilice cualquiera de los siguientes procedimientos:

• Desinfecte adecuadamente el área de trabajo.
• Identificar las cajas con:
▪ Ambiente
▪ Cabeza
▪ Manos sucias y manos limpias
▪ Hisopo estéril e hisopo sucio
• Quitar la tapa de una de las cajas de agar tripticasa soya y exponerla al aire del laboratorio
durante 15 minutos y volver a tapar.
6
• Remover la tapa de otra caja con agar tripticasa soya, colocar la cabeza en posición inclinada
sobre la caja y sacudirse el cabello para que caigan partículas con microorganismos sobre el
medio de cultivo.
• En la tercera caja de agar, con marcador permanente trazar una línea divisoria sobre la parte
externa. Levantar la tapa y tocar la superficie de una mitad con la yema de los dedos sin lavar.
Después, lavarse bien las manos con agua y jabón y repetir la operación con la otra mitad de la
caja.
• En la cuarta caja de agar, con marcador permanente trazar una línea divisoria. En la primera
mitad pasar un hisopo estéril, cerca del mechero, en la otra mitad pasar un hisopo estéril
previamente frotado sobre la superficie de la mesa de trabajo, frotando masivamente el hisopo
sobre el agar.
• Incubar todas las cajas a 37°C para observar a las 48 horas.
RESULTADOS
CRECIMIENTO
TIPOS DE EXPOSICIÓN
PRESENTE AUSENTE
Ambiente
Cabeza
Sucias
Manos
Limpias
Estéril
Hisopo
Usado
MARQUE CON UNA CRUZ EN EL ESPACIO CORRESPONDIENTE EL RESULTADO OBTENIDO

+: Escaso
++: Regular cantidad
+++: Abundante
7
EL MICROSCOPIO
El microscopio es un dispositivo encargado de hacer visibles objetos muy pequeños; se puede

dividir en dos sistemas: óptico y mecánico. El Sistema óptico contiene oculares, objetivos,
condensador, diafragma y fuente de luz. El sistema mecánico está comprendido por soporte, platina,
cabezal, revólver y tornillos de enfoque.
PARTES DEL MICROSCÓPIO ÓPTICO
• Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador que amplía la imagen del objetivo.
• Objetivo: Lente situada cerca de la preparación que amplía la imagen de ésta.
• Condensador: Lente que condensa los rayos luminosos sobre la preparación.
• Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
• Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• Soporte: Mantiene la parte óptica y tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
• Platina: Lugar donde se deposita la preparación.
• Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares y puede ser monocular y binocular.
• Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos que al girar permite, cambiar los
objetivos.
• Tornillos de enfoque: Macrométrico es el que aproxima el enfoque (movimientos grandes) y
micrométrico es el que consigue el enfoque correcto (movimientos pequeños).
1. Soporte
2. Base
3. Fuente de luz
4. Espejo
5. Diafragma de campo.
6. Condensador
7. Tornillo de centrado del condensador
8. Tornillo para centrar el condensador
9. Lentes del condensador
10. Diafragma de apertura
11. Platina
12. Tornillo de la platina
13. Tornillo macrometrico
14. Tornillo micrometrtico
15. Brazo
16. Objetivos
17. Revolver
18. Tubo
19. Oculares
20. Ajuste de distancia
21. Ajuste interpupilar
22. Cabezal
8
INDICACIONES PARA EL BUEN USO DEL MICROSCOPIO
El microscopio es un aparato delicado y muy caro que merece el mejor de los tratos. Entre los
principales pasos adecuados a la buena microscopía están:
• Transporte: el microscopio debe transportarse firmemente, sujetándolo por el brazo; debe

mantenerse en posición erecta con el fin de evitar que se caigan y/o dañen los oculares.
• Iluminación: este paso se efectúa si el microscopio no cuenta con fuente de luz incorporada*.
Al tener el microscopio un sistema de iluminación incorporada, no hay que realizar ajuste alguno
en cuanto a la posición de la fuente de luz. Si el microscopio presenta lámpara separada y
espejo, se puede ajustar la iluminación como sigue: con el objetivo de menor aumento colocado
en posición de observación, coloque la lámpara encendida delante de la cara plana del espejo;
luego, con el condensador colocado cerca de la platina y el diafragma totalmente abierto
observe a través de los oculares, mueva el espejo (y de ser necesario, la lámpara) hasta que
observe el lente del objetivo uniformemente iluminado. Seguidamente, cierre el diafragma a dos
tercios de su diámetro, obteniendo así la iluminación correcta. La cara cóncava del espejo sólo
se utiliza en los microscopios desprovistos de condensador.
• Enfoque: con la preparación a observarse colocada en la platina y con el objetivo seco débil
(10X) en posición de observación, suba la platina del microscopio lentamente hasta que el
objetivo se encuentre a 1/2cm de la preparación. Seguidamente, y observando a través del
ocular, siga moviendo la platina hacia arriba lentamente con el tornillo macrométrico hasta que
observe la preparación, y luego con el ajuste micrométrico enfoque hasta obtener la claridad
deseada. Concluida la observación con este aumento se puede pasar a uno mayor, utilizando
otro de los objetivos secos de mayor poder. Si se desea observar con el lente de inmersión para
obtener aún mayor aumento, como lo requieren las preparaciones de microorganismos, todo lo
que se debe hacer es colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación, girar el
revólver hasta que el objetivo de inmersión se coloque en posición de observación y con el
ajuste micrométrico enfocar hasta obtener una imagen clara. Si al girar el objetivo de inmersión a
posición de enfoque se observa resistencia, o se ve que el lente golpea la preparación, es
posible que ésta haya sido colocada al revés y el grueso del vidrio del portaobjetos no deje que
se obtenga el foco con el objetivo de alta resolución.
9
Las siguientes reglas son importantes y deben observarse siempre:
• Mantenga ambos ojos abiertos aunque su microscopio sea monocular.

• En los microscopios que usted utiliza, el enfoque preliminar para colocar la preparación debe
hacerse siempre moviendo la platina hacia arriba.
• Utilice la luz a un ajuste intermedio de intensidad, no lo haga con toda la intensidad del
regulador.
• Las perillas de ajuste macro y micrométrico deben ser giradas suavemente. No las fuerce.
• Bajo ningún concepto intercambie piezas en los microscopios.
• Tenga cuidado de no dejar caer el aparato o parte de él, ya que es un instrumento delicado.
• Si en algunas de las operaciones que efectúa encuentra resistencia mecánica en el aparato,
no lo fuerce; trate de establecer la causa.
• Si tiene dudas, consulte a sus instructores.
• Siempre limpie los lentes con papel de seda antes de dar por terminada su práctica.
• Coloque el objetivo de bajo poder en posición de observación y baje la platina del
microscopio antes de guardarlo.
• No olvide apagar la luz de la lámpara del microscopio.
IMPORTANCIA DEL MICROSCOPIO
El microscopio es el elemento más importante en el laboratorio, ya que es la herramienta en la

que podemos observar células y microorganismos, invisibles a simple vista.
INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO
• OBJETIVOS
1. Que el estudiante aprenda a preparar las muestras bacteriológicas para su observación
microscópica.
2. Que el estudiante pueda enfocar las distintas preparaciones y se familiarice con el microscopio.
• MATERIAL
Suspensión de levaduras
Preparaciones permanentes coloreadas (Staphylococcus sp., Bacillus subtilis)
Láminas portaobjetos
Láminas cubreobjetos
Azul de lactofenol
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• PROCEDIMIENTO
MÉTODO DE PREPARACIÓN EN FRESCO:

Ponga una gota de azul de lactofenol en el centro de una lámina, agregue una gota de
suspensión de levaduras, luego cúbrala con la lámina cubreobjetos, procurando no dejar
burbujas de aire, observar con el objetivo seco fuerte.
Este tipo de preparación se utiliza para la observación de levaduras, protozoos, algas y la

movilidad de las bacterias. La ventaja de este método es que las células no necesitan la adición
de colorantes letales, por ello se pueden observar en estado vivo.
MÉTODO DE LA PREPARACIÓN FIJA:

Observar las preparaciones coloreadas empezando con el objetivo seco débil (10x),
siguiendo con el seco fuerte (40x) y por último con el objetivo de inmersión (100x). Colocando el
lado de la preparación fija hacia arriba. Para esto se debe enfocar primero con el objetivo seco
débil, agregar la gota de aceite, luego volver a enfocar con el mismo objetivo y después cambiar
al objetivo de inmersión SIN PASAR POR EL OBJETIVO SECO FUERTE.
DEBE TENER PRECAUCIÓN DE NO ROMPER LA LÁMINA PORTAOBJETOS CON EL LENTE

OBJETIVO.
11
12
TINCIÓN SIMPLE
Uno de los principales procedimientos para el estudio de los microorganismos consiste en la

preparación adecuada de frotis y posterior tinción de los organismos que allí se encuentren. Por ser
los microorganismos hialinos, la aplicación de colorantes hace más fácil su observación y el estudio
de características tales como: la forma y la agrupación que presentan. Con la aplicación de
coloraciones especiales es posible también poner de manifiesto algunas estructuras celulares como
los flagelos, esporas, etc. e incluso la estructura de las células.
Las bacterias presentan diversas morfologías, entre las que se pueden mencionar:
• Cocos: son bacterias con forma esférica u ovoide.
• Bacilos: son bacterias con forma cilíndrica.
• Espirilos: son bacilos encorvados en forma de espiral.
Los cocos pueden presentar agrupaciones, que son características de ciertas especies como son:
• Diplococos: agrupación en la cual se observan dos estructuras redondas o cocos.
Característico de especies pertenecientes al género Neisseria.
• Estreptococos: arreglo de cocos formando una cadena simulando un collar de perlas.
Característico de especies del género Streptococcus.
• Sarcinas: bacterias que se dividen en tres planos perpendiculares para producir paquetes
de ocho o más células. Característico del género sarcina.
• Tétradas: están formadas por 4 cocos simulando un cuadrado.
• Acúmulos: se presenta en agrupación de cocos formando una estructura similar a un
racimo de uvas. Característico del género Staphylococcus.
Al igual que los cocos, los bacilos también pueden agruparse en:
• Bacilos en cadena: Se observa un bacilo seguido de otro formando una cadena,
característica del género Bacillus.
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MORFOLOGÍA
Cocos
Diplococos Estafilococos Estreptococos
Sarcina Tetrada
Bacilos
En cadenas Esporoformadores En empalizada
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía

a color de cocos, bacilos, espirilos y
espiroquetas.
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MORFOLOGÍA
Otros
Espirilos Espiroquetas Bacterias con apéndice
Bacterias Filamentosas Bacterias en forma de coma
• MATERIAL
Cultivos de 24 horas de incubación en caldo tripticasa soya de:
o Escherichia coli
o Staphylococcus sp.
Cultivo de 24 horas de incubación en agar tripticasa soya de:
o Bacillus sp
o Sarcina sp
Solución de cristal violeta (Hucker)
15
• PROCEDIMIENTO
• MANEJO ASÉPTICO DE MICROORGANISMOS

El manejo aséptico de microorganismos es la parte más importante del procesamiento de las
muestras microbiológicas para evitar la contaminación de la persona que realiza el
procedimiento de forma adecuada.
• PREPARACIÓN DE FROTES
Antes de realizar una tinción, se debe hacer un frote o extendido de la muestra a observar.
Este procedimiento puede realizarse a partir de medios de cultivos líquidos o sólidos.
• MEDIO SÓLIDO
1. Coloque una pequeña gota de agua destilada sobre un portaobjetos limpio.
2. Esterilizar por incineración el asa bacteriológica desde la porción cercana al mango hacia la
punta o argolla hasta que se torne completamente roja y dejar enfriar.
3. Cerca del mechero, destapar la caja de Petri con el cultivo, se deberá trabajar detrás del
mechero y debe de colocarse la caja con la tapa hacia abajo.
4. Con el asa flameada tocar levemente la superficie del cultivo.
5. Tapar la caja de Petri con el cultivo.
6. Transferir el espécimen, mezclar suavemente con el agua y hacer un extendido de
aproximadamente 2/3 del portaobjetos. Tener cuidado de realizar frotes finos y delgados.
a) Forma del extendido en ovalo o círculo.
b) No tocar ningún borde.
c) Poca cantidad si es sólido, no grueso ni abundante.
7. Flamee nuevamente el asa desde la porción cercana al mango hacia la punta o argolla hasta
que se torne completamente roja, evitando que se produzcan aerosoles (chispas).
• MEDIO LÍQUIDO
1. Primero agitar el cultivo suavemente para mezclar el cultivo suavemente para mezclar lo que
esta sedimentado. Coloque dos asadas de cultivo sobre un portaobjetos limpio y seco.
2. Extienda la muestra haciendo un ligero movimiento circular, cubriendo aproximadamente 2/3 de
la superficie del portaobjetos.
16
Después de realizar los frotes realizar el siguiente procedimiento:

1. Secar el frote a temperatura ambiente. No flamear o secar com el mechero (debe secarse
completamente antes de ser fijado).
2. Fijar varias veces a la llama (para esto se debe colocar la parte de la lámina que tiene el
extendido sobre el mechero y sacarlo rápidamente).
3. Colocar los frotes sobre un soporte, agregar cristal violeta cubriendo todo el frote y dejar
reposar por 1 minuto, use el reloj del laboratorio, no usar celular.
4. Lavar suavemente con abundante agua de chorro y dejar secar al ambiente.
5. Observar al microscopio enfocando primero en objetivo seco débil (10x), seguido de
objetivo seco fuerte (40x), luego regresar el revolver entre los objetivos seco débil e
inmersión (100x), agregar una gota de aceite de inmersión sobre el frote y luego proceder
a enfocar con el objetivo de inmersión.
17
18
Se observa al microscopio enfocando, inicialmente el preparado con el lente de menor

aumento, hasta llegar al objetivo de inmersión. Se dibuja lo observado y registra la
forma de la célula y el tipo de agrupación que ésta presenta.
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
__________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
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TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

En la tinción diferencial se emplea más de un colorante, ya sean juntos o separados, con el

objeto de poner de manifiesto ciertas propiedades de la bacteria dependiendo del tipo de colorante
que se utilice.
Las dos coloraciones diferenciales de mayor importancia en la bacteriología son la de Gram y la

de ácido alcohol resistente (A.A.R.).
En la coloración de Gram se aplica a un frote una solución de cristal violeta o violeta genciana
(colorante primario), seguida de lugol (mordiente), se lava luego la preparación con alcohol acetona
o alcohol al 95% y finalmente se aplica safranina o fuchsina (colorante de contraste). Algunas
bacterias al ser lavadas con el alcohol acetona retienen el primer colorante quedando color morado,
a éstas se les llama gram positivo. Otras en cambio, pierden el primer colorante al ser lavadas con
alcohol acetona siendo luego teñidas con el segundo colorante mostrándose color rosa a rojo, a
éstas últimas se les denominan gram negativo.
La teoría actual sobre el Gram es que las diferencias tintoriales se deben principalmente a los
diferentes grados de permeabilidad de las paredes celulares de las distintas bacterias, durante el
tratamiento con alcohol al 95%, el alcohol acetona o solvente similar.
La pared celular de las bacterias gram negativo contiene un alto porcentaje de lípidos, un bajo
porcentaje de un complejo ácido murámico y de 10 al 20% de peptidoglucano y además es mucho
más delgada que la pared de las bacterias gram-positivo que poseen de 60 a 90% de
peptidoglucano.
Como resultado del tratamiento con el alcohol-acetona, la pared de las bacterias gram negativo
es disuelta o desorganizada, permitiendo que el complejo yodo–cristal violeta, escape de la célula.
En cambio, en las bacterias gram positivo por tener una composición diferente, en lugar de
disolverse o desorganizarse la pared celular, ésta disminuye la porosidad, reduciendo así su
permeabilidad y por consiguiente el complejo yodo-cristal violeta es difícil de extraerse. Existen
modificaciones de la coloración de Gram, como la de Kopeloff, la cual es usada para bacterias
anaeróbicas.
21
• MATERIALES
Cultivos de 24 horas de incubación en caldo tripticasa soya y agar tripticasa soya de:
o Escherichia coli
o Staphylococcus sp
Solución de cristal violeta (Hucker)
Solución de lugol
Alcohol al 95% o alcohol acetona
Solución de safranina (Hucker)
• PROCEDIMIENTO
o MÉTODO 1: MODIFICACIÓN DE HUCKER

1. Preparar un frotis mezclando dos gotas del cultivo de E. coli con dos gotas de
Staphylococcus sp sobre una lámina limpia y fijarlos a la llama.
2. Colocar el frote sobre el soporte y cubrirlo con solución de cristal violeta de Hucker
durante un minuto. Lavar muy breve y suavemente con agua corriente y eliminar el
exceso de agua (colocando la lámina sobre uno de sus lados y golpeando suavemente
sobre papel mayordomo).
3. Cubrirla con solución de lugol durante un minuto. Lavarla suavemente con agua corriente
y eliminar el exceso de agua.
4. Gotear alcohol acetona sobre la preparación y lavar inmediatamente con agua del
chorro.
5. Cubrir la lámina con solución de safranina durante un minuto. Lavar con agua del
chorro, escurrir y secar cuidadosamente con papel secante o al aire.
6. Examinar la preparación empleando el objetivo de inmersión y anotar a continuación los
resultados acompañándolos de ilustraciones esquemáticas.
RESULTADO
Bacterias gram positivo: color morado y bacterias Gram negativo: color rojo - rosa
o MÉTODO 2: MODIFICACIÓN DE KOPELOFF

1. Agregar la solución A (cristal violeta) sobre el frotis.
2. Agregar 5 gotas de la solución B (NaHCO3 5%) sobre la solución A.
3. Dejar en reposo un minuto y lavar con agua corriente.
4. Agregar la solución yodada (lugol) por un minuto.
5. Lavar la lámina con agua.
22
6. Decolore con la solución de alcohol acetona y lave inmediatamente con agua.

7. Adicionar el colorante safranina por un minuto y lavar con agua.
8. Secar la lámina.
RESULTADO
Bacterias gram positivo: color morado
Bacterias gram negativo: color rojo.
TINCIÓN DE GRAM
Cubrir el preparado con cristal violeta durante 1 min.
Lavar el preparado con agua
Cubrir el preparado con yodo de Gram durante 1 min.
23
Cubrir el preparado con alcohol al 95%
Cubrir el preparado con safranina durante 1 min.
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color de como se

observa en el microscopio las bacterias gram positivo y gram
negativo.
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TINCIÓN DE GRAM
25
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
26
TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE

Se ha demostrado que algunas bacterias contienen un alto porcentaje de sustancias lipídicas

o cerosas en aproximadamente el 60% y bajo contenido de peptidoglucano, que se tiñen con
dificultad por los procedimientos usuales, y que una vez teñidas retienen el colorante rojo aun
cuando se les lave con alcohol-ácido. De ahí que les llama bacterias ácido-resistentes (BAAR).
Después de la decoloración se adiciona azul de metileno como colorante de contraste y cualquier
material que no es ácido alcohol resistente se coloreará de color azul.
Esta es una excelente coloración diferencial que es utilizada principalmente para la

identificación de Mycobacterium tuberculosis (agente causal de tuberculosis) y M. leprae (agente
causal de lepra). Estas bacterias en su membrana poseen ácidos grasos, ceras y complejos de
lípidos, además de proteínas y una variedad de polisacáridos a los cuales se les atribuye su
especificidad antigénica.
Existen dos tipos de coloraciones para ácido-resistentes que utilizan carbolfucsina (ver
sección de preparación de reactivos):
- Ziehl-Neelsen (coloración en caliente)
- Kinyoun (coloración en frío)
Con carbolfucsina, las bacterias acidorresistentes se colorean de rojo brillante contra un

fondo azul (si se utiliza como colorante de contraste el azul de metileno de Löeffler). Las técnicas de
Ziehl Neelsen y de Kinyoun en teoría son las mismas, sin embargo, la primera es más sensible para
detectar microorganismos que se colorean débilmente. La propiedad de ácido resistencia se debe a
la capa gruesa, cérea, que rodea a las micobacterias. Para que la carbolfucsina acuosa penetre a
través de las ceras, la capa debe ser “ablandada”. Esto se logra por medio del calor en el
procedimiento de Ziehl-Neelsen. El colorante que penetra a través de la capa por el calor se une a
la pared celular; luego, cuando las células bacterianas se enfrían después de que se elimina el calor,
las ceras se endurecen nuevamente, y protegen al colorante unido de la acción decolorante del
alcohol ácido (“ácido resistente”). En la técnica de Kinyoun o “técnica fría” se utiliza una agente
tensioactivo para aumentar la permeabilidad de la capa cérea hacia el colorante, sin embargo, la re-
formación de las láminas de cera puede ser incompleta, lo que permite que la mayor parte del
colorante unido, sino todo, pueda ser extraída por el decolorante alcohol-ácido.
• MATERIALES
Frotes con un extendido de esputo previamente fijados (bacilos muertos).
Carbol-fuchsina de Ziehl Neelsen
Carbol-fuchsina de Kinyoun
Alcohol-ácido (95% de alcohol etílico 95% y 3% de HCl V/V)
Solución azul de metileno de Löeffler
Alambres con algodón
Alcohol de quemar
• PROCEDIMIENTO
o MÉTODO ZIEHL-NEELSEN
1. Tome el frote y fije a la llama varias veces.
27
2. Colocar la lámina sobre el soporte de alambre, cubrirla totalmente con el colorante de Ziehl
Neelsen y calentarla cuidadosamente durante 3-5 minutos, obteniendo una pequeña emisión
de vapor. NOTA: tener cuidado de no hervir la preparación. Agregar más colorante, si éste
se secara durante el calentamiento.
3. Lavar con agua del chorro y eliminar el exceso de agua
4. Decolorar con alcohol-ácido hasta decolorar completamente. Lavar nuevamente con agua.
5. Cubrir con azul de metileno de Löeffler durante un minuto.
6. Lavar con agua del chorro, escurrir, secar y observar la lámina con el objetivo de inmersión.
RESULTADO
Positivo: observación de pequeños bacilos de color rojo. El fondo se tiñe de color azul por el
colorante de contraste.
o MÉTODO KINYOUN
1. Haga un frotis, déjelo secar al aire y fíjelo con calor.
2. Agregue carbol-fuchsina (Kinyoun) déjelo reposar por dos minutos (no es necesario
calentar).
3. Lave con agua del chorro y decolore con alcohol-ácido gota a gota hasta que deje de
desteñir el colorante.
4. Lavar con agua del chorro y agregar sobre la lámina el azul de metileno (colorante de
contraste) y déjelo en reposo de 20 a 30 segundos.
5. Lavar de nuevo y secar.
6. Finalmente observar la lámina con el objetivo de inmersión.
RESULTADO
Positivo: observación de pequeños bacilos de color rojo
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color como se

observa en el microscopio una bacteria ácido alcohol-resistente.
28
TINCIÓN ÁCIDO RESISTENTE
1. 2. 3.
Tome el frote y fijar a la Colocar la lámina sobre el

Lavar con agua del chorro y
llama varias veces. soporte de alambre, cubrirla eliminar el exceso de agua
con colorante Ziehl-Neelsen
y calentarla durante 3-5
minutos. No hervir.
4. 5. 6.
Decolorar con alcohol-ácido

Cubrir con azul de metileno Lavar con agua del chorro,
durante 15-20 segundos y escurrir, secar y observar la
durante un minuto.
lavar nuevamente. lámina en el objetivo de
inmersión.
29
DEMOSTRACIÓN DE CÁPSULA
La cápsula de las bacterias está constituida por sustancias mucilaginosas que son
secretadas por las bacterias y permanecen adheridas al exterior de la pared celular, rodeando la
célula. Se cree que todas las bacterias pueden producir material capsular en mayor o menor
cantidad. Hay unas cuantas especies de bacterias que producen cápsulas muy prominentes, las
cuales son fáciles de demostrar cuando son teñidas en forma adecuada.
Químicamente el material capsular está constituido por polímeros de glucosa, galactosa,

fructosa, ácido urónico y aminoazúcares, ya sea solos o en combinación. Otras contienen
polipéptidos.
La cápsula bacteriana no tiene la misma afinidad para los colorantes corrientes como las
células bacterianas, sino requiere del uso de procedimientos especiales para su demostración.
Algunos de estos métodos tiñen las células y el fondo del frotis, pero no la cápsula. Otros
procedimientos utilizan una tinción diferencial, en los cuales la cápsula toma un colorante de
contraste.
La tinción en negativo es una variación de los métodos de tinción donde el fondo queda
oscuro por la tinta china que tiene carga negativa al igual que la cápsula, por lo que se repelen
evitando la coloración de la misma. Las bacterias se colorean luego con un colorante simple, como
el cristal violeta, dejando de esta manera la cápsula totalmente incolora dentro de un campo de
contraste negro y azul.
• MATERIALES
Cultivo de 48 horas de Klebsiella pneumoniae en agar TSI
Cultivo de Streptococcus pneumoniae en agar sangre
1 botella con 3 ml de tinta china (cada 4 estudiantes)
Portaobjetos limpios, libres de grasa, tratados con desgrasadores
Cristal violeta
30
• PROCEDIMIENTO
o MÉTODO COLORACIÓN CON TINTA CHINA
▪ FROTE FIJO
1. Colocar una gota de tinta china en el extremo de una lámina y con el asa mezclar una
pequeña cantidad del cultivo de Klebsiella sp Usando el borde de otra lámina,
extender la suspensión y dejarla secar al aire.
2. Fijar con calor.
3. Cubrir la preparación con cristal violeta 1% durante 5 minutos.
4. Lavar cuidadosamente con agua y dejar secar al aire.
5. Observar al microscopio y anotar los resultados.
RESULTADO: Positivo: la cápsula se observa como un espacio de color blanco entre la
tinta china y el cristal violeta que se encuentra dentro de la bacteria
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color como se

observa en el microscopio la tinción en negativo de una cápsula
bacteriana.
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
31
32
COLORACIÓN DE ESPORAS
Las esporas son cuerpos producidos dentro de la célula de algunas especies de bacilos y
gram positivo, ellas son más resistentes a las condiciones adversas que las células vegetativas de
origen. Se presentan casi exclusivamente en las bacterias de forma bacilar, y están compuestas por
sales de calcio de ácido dipicolínico.
La esporulación no es un mecanismo de multiplicación de la población bacteriana sino más

bien es de preservación o protección de la especie, en circunstancias adversas a la sobrevivencia
de la célula vegetativa. La formación de esporas tiene lugar bajo condiciones favorables de
crecimiento, inmediatamente después del período de multiplicación logarítmica.
Las bacterias más estudiadas pertenecen al género Bacillus y Clostridium, pero algunos del
orden Actinomycetales también pueden producir esporas, pero no son altamente resistentes.
Las esporas no se tiñen fácilmente. En procedimientos de rutina tales como la coloración de

Gram, pueden aparecer como cuerpos refráctiles sin teñir. Usualmente se requiere la aplicación de
calor, con un procedimiento especial, para promover la penetración del colorante dentro de las
esporas. Las esporas también pueden observarse por examen microscópico de campo oscuro.
También pueden teñirse en frío, con colorantes más concentrados.
• MATERIALES
Cultivo de Bacillus cereus de 48 horas en agar tripticasa soya

Colorantes verde de malaquita y safranina, según la técnica de Wirtz-Conklin.
Colorantes de Bartholomew y Mitmer
• PROCEDIMIENTO
• MÉTODO WIRTZ-CONKLIN
1. Preparar un frotis de B. cereus y fijarlo a la llama.

2. Cubrir toda la lámina con verde de malaquita y calentar hasta que haya emisión de
vapores, manteniéndola así durante 6 minutos. Evitar la ebullición y agregar colorante si
se deshidrata la lámina.
3. Lavar la lámina con agua del chorro y luego cubrirla con safranina por 1 minuto.
33
4. Lavar la lámina con agua del chorro, escurrirla, dejarla secar y observar con objetivo de
inmersión. Anote resultados.
RESULTADOS
Positivo: esporas de color verde y bacilos color rojo.
• MÉTODO FRÍO DE BARTHOLOMEW Y MITTMER
1. Secar el frotis al aire y fijarlo pasándolo por una llama 20 veces.

2. Teñir durante 10 minutos con solución acuosa saturada de verde de malaquita (aprox.
7.6%) sin calentar.
3. Enjuagar con agua del chorro durante unos 10 segundos.
4. Teñir durante 1 minuto con solución acuosa de safranina al 0.25%.
5. Enjuagar con agua del chorro y secar con papel absorbente.
RESULTADOS
Positivo: esporas de color verde y bacilos color rojo.
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
34
TINCIÓN DE ESPORAS
1. 2. 3.
Preparar frotis de B. cereus y Cubrir la lámina con verde de

Lavar la lámina con agua del
fijarlo a la llama. malaquita y calentar hasta la chorro durante medio
emisión de vapores, minuto.
manteniéndolas así durante 5-
10 minutos. No hervir.
4. 5.
Cubrirla con safranina por 30 Lavar con agua del chorro, escurrir, secar y observar la
segundos. lámina en el objetivo de inmersión.
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color como

se observa en el microscopio las esporas con la coloración
específica para su tinción.
35
GRÁNULOS METACROMÁTICOS
Los gránulos metacromáticos o de volutina se tiñen bien con los colorantes básicos, tales
como la fuchsina básica, cristal violeta o metilvioleta. En este sentido se comportan a semejanza de
la cromatina. Sin embargo, no tienen las mismas características que el material nuclear. Antes se
creía que los gránulos eran de ácido ribonucleico (ARN); sin embargo, ahora se sabe que son de
polimetafosfato, representando una reserva de fosfato inorgánico que la célula puede utilizar para
sintetizar ATP.
Generalmente se encuentran estos gránulos más pronunciados en las células adultas,

cuando el crecimiento ha terminado. Estos gránulos se presentan característicamente en los
espirilos, corinebacterias y en bacilos lácticos. Son útiles en la identificación y clasificación de estas
bacterias.
• MATERIALES
Cultivo de Corynebacterium spp en medio de Löeffler modificado para Corynebacterium

1 gotero con azul de metileno de Löeffler
1 frasco gotero con colorante de Albert (solución A)
1 frasco gotero con lugol de Albert (solución B)
• PROCEDIMIENTO
1. Preparar dos frotis de Corynebacterium spp. y fijarlos a la llama.
2. COLORACIÓN DE AZUL DE METILENO: cubrir una de las preparaciones con solución de azul
de metileno durante 5 minutos, lavarla con agua del chorro, secarla y observar bajo inmersión.
Los gránulos se observan de color azul intenso.
3. COLORACIÓN DE ALBERT: cubrir la otra preparación con colorante de Albert (solución A), por
un minuto. Escurrir la lámina (no lavarla). Cubrir por cinco minutos con lugol de Albert (solución
B). Lavar ligeramente en agua del chorro, secar y observar en inmersión. Los gránulos aparecen
de color azul verdoso y el citoplasma verde.
36
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color

como se observan en el microscopio los gránulos
metacromáticos con la coloración de Albert y la
coloración de azul de metileno.
37
TINCIÓN DE FLAGELOS
TRABAJO PRÁCTICO No. 9.
Las bacterias móviles presentan unas estructuras de locomoción llamadas flagelos, los
cuales son órganos sumamente delgados, con diámetro de 0.02 a 0.03 um, dimensiones que se
encuentran por debajo del poder de resolución del microscopio óptico. Otra característica de los
flagelos es que se desprenden fácilmente de las bacterias. Por estas razones, en la tinción de los
flagelos se aplican métodos especiales que agrandan el diámetro de los mismos, usando mordientes
que fijan y favorecen el depósito del colorante, aumentando así el tamaño de los flagelos al mismo
tiempo que los colorea. Los flagelos generalmente se presentan en bacterias de forma bacilar gram
negativo, encontrándose patrones específicos en cuanto al número y posición (polar o periférica),
hallazgo que se ha tomado en cuenta para la clasificación de las bacterias.
Las bacterias pueden presentar la siguiente distribución de los flagelos y tomar los siguientes
nombres:
a. Monótrica: un solo flagelo en el extremo.

b. Lofótrica: un penacho de flagelos en el extremo.
c. Anfítrica: flagelos en ambos polos.
d. Perítrica: flagelos distribuidos alrededor de la bacteria.
NOTA: los frotis deben realizarse a partir de cultivos jóvenes, sobre portaobjetos especialmente
tratados y con técnicas que aseguren que el flagelo no se desprenda.
• MATERIAL
Portaobjetos nuevos y libres de grasa, tratados con etanol al 95%
Pipetas Pasteur estériles
Cubreobjetos
Etanol al 95%
Agua destilada
Cultivos de 18-22 horas en caldo BHI incubados a 22 – 26 0C
Cepas control positivo de Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis y Escherichia coli
38
o TINCIÓN DE RYU
Solución I (mordiente)
10 ml de solución acuosa de fenol al 5%
2g de ácido tánico
10 ml de solución saturada de sulfato de aluminio y potasio -12- hidratado
Solución II (colorante)
Solución etanólica saturada de cristal violeta (12g de cristal violeta en 100 ml de etanol al
95%).
Mezclar 1 parte de la solución II con 10 partes de la solución I. Filtrar para remover el
precipitado.
• PROCEDIMIENTO
o PREPARACIÓN DE LOS PORTAOBJETOS

Utilice de preferencia portaobjetos nuevos y no los toque con los dedos. Lávelos con
agua y por último con etanol al 95%. Después pase los portaobjetos por unos minutos sobre
la llama del mechero. Someta los portaobjetos al calor lentamente y quítelos del calor de la
misma manera; deposítelos con pinzas en una caja cerrada.
o MANEJO DE LOS CULTIVOS

Use cultivos con 18-22 horas de incubación, antes de proseguir observe una preparación
al microscopio. Sólo efectúe la coloración si observa movilidad en las bacterias y si se nota
movimiento, proceda como sigue:
1. Preparar un portaobjetos limpio con una gota de cultivo joven.

2. Cubrir con un cubreobjetos y examinar si hay movilidad. Dejar que las bacterias se
adhieran al vidrio por un tiempo de 5-15 minutos
3. Colocar en una esquina del cubreobjetos, 2 gotas del colorante de RYU para que penetre
por capilaridad y se mezcle con la suspensión bacteriana
4. Dejar reposar de 5 a 15 minutos en cámara húmeda y luego examinar al microscopio y
buscar la presencia de flagelos.
RESULTADOS
Las bacterias y los flagelos se tiñen de azul oscuro a negro, con un fondo celeste.
34
o TINCIÓN ARGÉNTICA (preparación fija con ácido tánico y nitrato de plata)

1. Ponga una gota de agua destilada en un extremo de la lámina portaobjetos.
2. Con el asa de argolla, tocar suavemente el cultivo en agar BHI de la bacteria a estudiar y
colocar en la gota de agua.
3. Coloque en forma oblicua el portaobjetos con la gota más el cultivo y deje escurrir para
formar un frote.
4. Poner en posición horizontal y dejar secar al aire.
5. Cubrir el frote con reactivo “A” (Solución de ácido tánico, página 123), durante 2-4
minutos, luego lavar con agua destilada.
6. Cubrir el frote con el reactivo “B” (Solución amoniacal de nitrato de plata página 124),
durante 30 segundos e inmediatamente lave con agua destilada.
7. Seque al aire y observe con el objetivo de inmersión.
RESULTADOS
Las bacterias y los flagelos se tiñen de café oscuro a negro, con un fondo café dorado.
Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color como se observa

en el microscopio los flagelos.
35
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
TINCIÓN DE FLAGELOS
1. 2. 3.
Con una pipeta Pasteur, Colocar un cubreobjetos Colocar en una esquina del
colocar una gota del cultivo sobre la gota de caldo y cubreobjetos, dos gotas del
joven en el centro de la examinar si hay movilidad. colorante RYU para que
lámina. Dejar que las bacterias se penetre por capilaridad y se
adhieran al vidrio por un mezcle con la suspensión
tiempo de 5-15 minutos. bacteriana.
36
DETERMINACIÓN DE MOVILIDAD BACTERIANA

Las bacterias observadas en preparaciones en fresco pueden exhibir dos tipos de

movimiento: el movimiento verdadero o vital, y el movimiento “Browniano”.
El movimiento verdadero o vital se debe a la presencia de estructuras largas, en forma de

látigo, conocidas como flagelos. El movimiento “Browniano” no es traslatorio sino de oscilación o
vibración, es independiente de la presencia o ausencia de flagelos y se debe al bombardeo a que
están sometidas las células por parte de las moléculas del líquido en que están suspendidas las
bacterias.
La movilidad de una bacteria se puede determinar tanto por examen de “gota pendiente” de un
cultivo líquido fresco, como mediante inoculación “por picadura” en un medio semisólido y
observación del crecimiento a lo largo de la línea de inoculación. El medio semisólido no debe
contener más de 0.3% de agar.
• MATERIAL
Cultivos de 24 horas en agar tripticasa soya de:

o Bacillus subtilis
o Klebsiella sp.
o Escherichia coli
Tubos con medio SIM para determinar movilidad (para fines de esta práctica por ningún motivo debe
usarse MIO).
• PROCEDIMIENTO
• MOVILIDAD EN MEDIO SEMISÓLIDO
1. A partir de los cultivos de agar sembrar con la asa bacteriológica “por picadura” el medio
semisólido hasta 1 cm, antes del fondo, e incubar a 37°C por 24 horas (algunas bacterias
presentan movilidad únicamente a 22° C).
37
2. Observar el tipo de crecimiento presente a lo largo de la línea de inoculación. Las bacterias

móviles presenta un crecimiento difuso fuera y a lo largo de la línea de inoculación, en cambio
las inmóviles crecerán sólo a lo largo de la línea de inoculación.
• RESULTADOS
• MOVILIDAD EN MEDIO SEMISÓLIDO
1 2 3 4
No.
Microorganismo Resultado
Tubo
38
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

Al estudiar la microbiota del cuerpo, suelo o cualquier otro ambiente, descubrimos que los
microorganismos existen en poblaciones mixtas; en raras ocasiones como especies aisladas.
Para estudiar las características culturales, morfológicas y fisiológicas de una especie, es

necesario separarla de otros microorganismos que comparten su hábitat, en otras palabras,
debemos obtener un cultivo puro.
Entre los métodos frecuentemente utilizados para la obtención de un cultivo puro se encuentran
las técnicas de rayado y vaciado; ambas involucran la disminución en concentración de los
microorganismos para seleccionar la especie de interés.
• MÉTODOS
o MÉTODO POR VACIADO
Consiste en diluir la cantidad de bacterias contenidas en un volumen determinado.

Colocando un mililitro de la suspensión de bacterias en una caja de Petri y posteriormente
agregando agar tripticasa soya fundido y enfriado a 45°C. Con la finalidad de obtener
colonias aisladas para purificarse posteriormente.
o MÉTODO DE RAYADO
Este método es útil cuando se desea economizar tiempo y materiales, requiere de cierta
habilidad y destreza, las que se adquieren con la experiencia.
39
Punto de inoculación.
Sentido del rayado.
Otro factor importante para la obtención de cultivos puros es emplear diversos medios de cultivo,
con la finalidad de aislar e identificar microorganismos. Entre estos medios podemos mencionar:
o Medios de cultivo enriquecido: Cuya función es ayudar al crecimiento de los microorganismos,

entre los que se encuentran agar nutritivo, agar sangre, agar tipticasa soya y caldo BHI.
o Medios de cultivo selectivos: Permiten el crecimiento de ciertas bacterias, basándose en
condiciones en las cuales las demás no pueden crecer, como agar manitol sal y agar Mc
Conkey; en el primero se obtiene el crecimiento de microorganismos gram positivo como
Staphylococcus aureus y en el segundo se obtiene crecimiento de microorganismos gram
negativo, además en este medio de cultivo permite diferenciar las bacterias gram negativo que
utilizan o no la lactosa como Escherichia coli que presenta una colonia de color rosado o fucsia.
o Medios de cultivo diferenciales: Se utilizan para la determinación de la presencia de ciertas
enzimas, o la utilización de algunos compuestos, permitiendo con ello determinar cuál es la
característica que presenta la bacteria al unir varios de ellos.
40
• MATERIALES
Gradilla para tubos

Cajas de Petri estériles
Asas bacteriológicas
Marcador o crayón graso
Agar tripticasa soya
Agar sangre
Agar Manitol sal
Agar McConkey
Tubos con 20ml de agar tripticasa soya fundido
Cultivo mixto de 24 horas de incubación en caldo tripticasa soya de:
• Staphylococcus aureus
• Escherichia coli
• Serratia marcescens
Tarea:
Como complemento de la práctica y para interpretar los resultados de la misma, para
cada uno de los medios de cultivo inoculados, investigar:
a) Composición
b) Interpretación
c) Aplicación
Presentarlos en cuadro, se recomienda investigar imágenes a color.
• PROCEDIMIENTO
1. Preparar la mesa de trabajo, desinfectando la superficie

2. Etiquetar la superficie del fondo de una caja de Petri estéril con nombre, fecha y material
sembrado, etc.
o MÉTODO DE VACIADO
1. Realizar una dilución seriada de la siguiente manera:

o Tomar asada de la muestra madre y suspenderla a un tubo con 9.0ml de agua
destilada estéril (dilución 1:10).
41
o Tomar una asada de la dilución 1:10 y suspenderla en un tubo con 9.0ml de agua
o Tomar una asada de la dilución 1:100 y suspenderla en un tubo con 9.0ml de agua
2. Tomar 1.0ml de cada una de las diluciones agregar cada una caja de Petri (al final serán 3
cajas)
3. Licuar un tubo de agar tripticasa soya y enfriar a 40 - 45°C (que no queme el dorso de la
mano o la mejilla). Verter en una caja de Petri estéril en forma aséptica, rotando luego la
caja para que quede homogéneamente distribuida. Dejar reposar hasta que el agar
solidifique. Poner la caja cerca del mechero. No tapar totalmente la caja (para evitar agua de
condensación. Dejar reposar hasta que el agar endurezca e invertir la caja de Petri e incubar
a 37oC por 24-48 horas. Es necesario esperar que el agar enfríe a 45°C para evitar la
formación de vapor de condensación en la tapadero debido a que éste puede caer sobre la
superficie del medio provocando contaminación.
o MÉTODO DE RAYADO
1. Tomar una asada con el asa en argolla del cultivo.

2. Tomar una caja de agar tripticasa soya y rayar cerca del mechero, siguiendo uno de los
métodos detallados por su instructor.
3. Incubar la caja en posición invertida a 37°C por 24-48 horas.
4. Siguiendo los pasos anteriores, sembrando una caja de agar sangre, agar manitol sal, agar
McConkey.
• RESULTADOS
A. MÉTODO DE RAYADO
▪ AGAR SANGRE DE CARNERO

RESULTADOS:_____________________________________________________________
INTERPRETACIÓN:__________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
42
▪ AGAR NUTRITIVO
RESULTADOS:_____________________________________________________________
INTERPRETACIÓN:__________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ AGAR MANITOL SAL

RESULTADOS:_____________________________________________________________
INTERPRETACIÓN:__________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ AGAR McConkey
RESULTADOS:_____________________________________________________________
INTERPRETACIÓN:__________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
43
DIFERENTES TÉCNICAS DE RAYADO
44
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

Al hablar de las características morfológicas de un organismo, se refieren a sus características

macroscópicas en los diferentes tipos de medios de cultivo después que éstos se han sembrado e
incubado correctamente.
Es importante observar la apariencia de las colonias formadas, debido a que orienta en la

identificación de las bacterias y otros microorganismos.
En la observación de colonias debe tomarse en cuenta:
1. La cantidad de crecimiento: negativo, leve, moderado y abundante.

2. El color o pigmentación que se debe observar tanto en las colonias como dentro del medio
(difusión).
3. La opacidad: opacas, brillantes, translúcidas.
4. La forma de las colonias: configuración, bordes y elevación (Características morfológicas de las
colonias).
• MATERIAL
Cultivos en cajas de Petri con agar sangre, agar McConkey y agar tripticasa soya
Estereoscopio y lupas
Asas bacteriológicas
Colorante de Gram
Cultivo de 24-48 horas de incubación en caldo BHI de:
o Staphylococcus aureus
o Escherichia coli
o Serratia marcescens
o Bacillus sp
• PROCEDIMIENTO
Anotar la apariencia de las diferentes colonias crecidas en los diferentes medios de cultivo
tomando en cuenta las características descritas anteriormente y su coloración con la tinción de
Gram.
45
CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LAS COLONIAS
46
▪ COLONIA :___________________________________________________________
CARACTERÍSTICAS:_________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ COLONIA :___________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ COLONIA :___________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ COLONIA :___________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
47
DETERMINACIÓN DE LOS REQUERIMIENTOS DE OXÍGENO DE LAS BACTERIAS

Los requerimientos de oxígeno de los microorganismos, especialmente de las bacterias, varían

desde los llamados aerobios estrictos, que no pueden existir sin la presencia de oxígeno, hasta los
anaerobios estrictos, que mueren en su presencia. Entre estos extremos se encuentran los
facultativos, que son aquellos que debido a su sistema enzimático, se adaptan a la presencia o
ausencia de este gas y los microaerofílicos, que requieren de oxígeno libre en pequeñas
concentraciones.
Para poder cultivar los microorganismos anaerobios es necesario proveerles de un ambiente

totalmente exento de oxígeno. Para tal fin se han utilizado variedad de métodos, siendo el más
empleado, el de las jarras anaeróbicas que combinan el O2 del ambiente con el hidrógeno producido
artificialmente, ante la presencia de un catalítico a temperatura ambiente, formando como producto
final agua y a la vez proporcionando una atmósfera enriquecida de CO2. Para comprobar la
anaerobiosis se vale de un indicador con azul de metileno. Este sistema se le conoce como Gas
Pack (marca BBL). Consta de una jarra plástica de policarbonato, dentro de la cual se coloca un
sobre descartable, un generador de hidrógeno y CO2 por la adición de agua. Usa perlas de paladio
como catalítico y un sobrecito conteniendo azul de metileno como indicador de la reducción de
oxígeno.
Los microorganismos microaerofílicos crecen únicamente en presencia de aproximadamente el

5% de oxígeno y altos contenidos de dióxido de carbono, lo que se logra con una jarra con candela
(este sistema consiste en un frasco de vidrio con una candela). La candela se enciende y se tapa el
frasco, posteriormente la candela se apaga al consumirse el exceso de oxígeno, creando las
condiciones deseadas.
Existen otros métodos más sencillos para lograr el crecimiento de las bacterias anaerobias, sin
necesidad de un equipo y reactivos sofisticados. Estos son medios de cultivo conteniendo
compuestos reductores que permiten el crecimiento de bacterias aerobias estrictas, facultativas y
anaerobias estrictas.
El medio de tioglicolato contiene, además de sustancias nutritivas, tioglicolato de sodio (agente

reductor que en la profundidad de un tubo de ensayo permite tener un potencial de oxígeno bajo).
El medio puede o no tener incorporados indicadores de anaerobiosis como el azul de metileno y
rezasurina.
48
(a) Microaerofilia
(b) Sistema Gas Pack
Anaerocult®:
Es un sistema seguro y acreditado para el cultivo de microorganismos anaerobios y microaerófilos.
El sistema Anaerocult® está compuesto por bolsas de reactivos de distintos tamaños, que se
rellenan con una mezcla de reactivos que absorben oxígeno y generan dióxido de carbono. La
reacción se activa añadiendo agua. La reacción se basa en la oxidación muy fina del hierro y no
requiere catalizador. El sistema Anaerocult® permite distintos tipos de incubación.
Anaerocult® P: Contiene componentes que ligan químicamente el oxígeno de forma rápida y

completa, produciendo de esta manera un entorno exento de oxígeno (anaeróbico) y una atmósfera
de CO2. Su composición típica es: Diatomita (kieselguhr), polvo de hierro, ácido cítrico, carbonato
de sodio.
49
Procedimiento Experimental:
1. Poner el Anaerocult® P junto con la placa de Petri y un indicador de anaerobiosis Anaerotest® en
una bolsa especial de incubación.
2. Humedecer la zona de reacción de la tira Anaerotest® con agua.
3. Fijar la tira Anaerotest® en la tapa de la placa de Petri inoculada (la zona de reacción debe mirar
hacia abajo y quedar colgada libremente en el espacio abierto).
4. Poner el Anaerocult® P en una bolsa especial de incubación.
5. Humedecer el Anaerocult® P con 3,0 ml de agua.
6. Colocar la placa de Petri con el Anaeroclip® puesto o sellar con un soldador convencional de
plástico (se recomienda sellar con doble soldadura)*.
7. La bolsa ha de ser cerrada por soldadura a una distancia de aprox. 2 cm de la abertura.
Nota * La anaerobiosis es indicada por el cambio de color de la tira Anaerotest ® de azul a blanco
después de unas 4 horas.
50
• MATERIAL
Caldo de tioglicolato (Con 0.001 g/L de resazurina 0.75 g/L)

Cultivos en tubo con agar tripticasa soya o BHI (utilizar agar solo en condiciones anaeróbicas):
o Escherichia coli (agar triptica soya)
o Pseudomonas aeruginosa (agar tripticasa soya)
o Streptococcus pyogenes (BHI)
o Clostridium sp. (caldo de tioglicolato)
Equipo Gas Pack
Generador de gas H2 y CO2
Indicador anaeróbico
Pipetas de 10 ml estériles
Agua destilada estéril
• PROCEDIMIENTO
Siembra en tioglicolato:
1. Hervir en baño de María por unos minutos el medio de tioglicolato con el objeto de
desplazar el oxígeno disuelto.
2. Enfriar en agua. Evitar agitar los tubos para prevenir la reabsorción de oxígeno.
3. Sembrar a partir de los tubos distribuidos. Incubar por 48 horas a 37°C.
4. Anotar los resultados en los tubos.
Sistema Gas-Pack o siembra en anaerobiosis:
Este sistema proporciona un ambiente anaerobio, el cual se obtiene por la remoción de

O2 y su combinación con hidrógeno como se muestra a continuación:
……………………….. paladio
2H2 + O2 2H2O
El hidrógeno reacciona con el oxígeno formando agua, en presencia del catalítico.

Conforme se alcanza este ambiente, aparecerá agua en condensación en la pared interna de
la jarra, y el azul de metileno virará a incoloro.
51
1. Sembrar 3 cajas de agar tripticasa soya, haciendo una estría de cada uno de los
microorganismos distribuidos.
2. Incubar una de las cajas en aerobiosis, una en ambiente microaerofílico y la otra en
anaerobiosis (sistema Gas-Pack) por 48 horas a 37°C.
• RESULTADOS
1. Crecimiento en tioglicolato de sodio.
Escherichia coli Pseudomonas sp. Streptococcus sp. Clostridium sp.

Requerimiento
de oxígeno: ___________________ ___________________ ___________________ _________________
2. Crecimiento en cajas de agar sangre
Microorganismo
CONDICION Pseudomonas Streptococcus
Escherichia coli Clostridium sp
aeruginosa pyogenes
ANAEROBIOSIS
(GAS-PACK)
AEROBIOSIS
MICROAEROFILIA
52
PRUEBA DE CATALASA
La enzima catalasa está presente en bacterias aerobias y anaerobias facultativas que

contienen citocromos, excepto los Streptococcus. Generalmente las bacterias que carecen del
sistema citocromo, no poseen enzima catalasa.
El peróxido de hidrógeno se produce al final de la oxidación de azúcares por la vía aeróbica.

Si el peróxido de hidrógeno se acumula esto es tóxico para las bacterias por lo tanto ellas poseen
catalasa para convertirlo en agua y O2.
• REACCIÓN QUÍMICA
Gas liberado
H2O2 + H2O2 CATALASA 2H2O + O2 .............................
Sustrato Donador Sustrato Donador

reducido oxidado
2 moléculas de peróxido ……… .2 moléculas de agua

de hidrógeno
• MATERIALES
Peróxido de hidrógeno 30% (se almacena en recipiente oscuro evitando exposición a la luz y se
mantiene en refrigeración).
Cultivo puro en tubo agar tripticasa soya en slam de 24-48 horas de incubación de
o Staphylococcus aureus
o Streptococcus sp
• PROCEDIMIENTO
Sobre una lámina portaobjetos coloque una gota de H2O2 al 30% y luego con la punta de un
palillo o un asa en argolla previamente flameada recoja una colonia de la bacteria y póngala dentro
de la gota de agua oxigenada.
NOTA: Haga todo el procedimiento colocando control positivo y negativo.
RESULTADO: Inmediatamente aparecerán burbujas si la bacteria es catalasa positivo.

En caso de no aparecer burbujas entonces la bacteria es catalasa negativo.
53
• RESULTADOS
Positivo Negativo
Microorganismo: Microorganismo:
54
CONTEO DE POBLACIONES BACTERIANAS

Algunos de los estudios bacteriológicos requieren la determinación de la cantidad de organismos

presentes en un volumen dado. Existen varios métodos para este propósito, entre los que podemos
citar: conteo microscópico directo, turbidimetría (que demuestra la presencia de organismos vivos y
muertos); otro de los métodos conocidos es el de plaqueo cuantitativo el cual es bastante utilizado
para determinar el número de organismos en agua, alimentos, etc., y también en un cultivo,
informando únicamente organismos vivos.
Los métodos de cuantificación microbiana se basan en la medición exacta de volúmenes de

muestras a analizar. Estos se combinan con cantidades conocidas de diluyentes apropiados (agua
destilada estéril, solución salina normal estéril, etc.) lo cual da como resultado diluciones que
permiten obtener finalmente, concentraciones microbianas cuantificables. Dichas concentraciones
pueden calcularse aplicando los métodos ya enumerados.
• MATERIAL
Tubo con 20 ml de Agar tripticasa soya fundido.

Cajas de Petri estériles
Pipetas de 1 y 5 mL estériles
Cultivos en caldo Tripticasa soya de Serratia marcescens
Tubos con 3 mL de Tripticasa soya
Tubos de ensayo con 9 ml de agua desmineralizada estéril.
NOTA: El instructor deberá realizar diluciones previas a los cultivos de caldo TS con Serratia
marcescens. (diluir bastante).
• PROCEDIMIENTO
o MÉTODO DE PLAQUEO CUANTITATIVO
1. Realizar diluciones seriadas del organismo en un diluyente (agua destilada estéril), como
se indica en la figura de la hoja siguiente.
2. Tomar alícuotas de cada dilución previamente agitada y colocarlas en las cajas de Petri
estériles.
55
3. Vaciar 10-20mL de agar tripticasa soya fundido y llevado a 50°C sobre cada alícuota
sembrada y mezclar rotando suavemente la caja.
4. Incubar por 48 horas a 37°C.
5. Contar el número de colonias (UFC= Unidades Formadoras de Colonias) con ayuda de
la cámara de Quebec.
6. Reportar el número de UFC/mL
• RESULTADOS
DILUCIÓN UFC/mL
1.
2.
3.
56
ACCIÓN SOBRE CARBOHIDRATOS

METABOLISMO BACTERIANO
El término de fermentación se aplica ordinariamente a la degradación anaeróbica de los

carbohidratos por los microorganismos, aun cuando otros productos, además de los carbohidratos
pueden ser fermentados. La fermentación tiene como objetivo principal liberar la energía que se
encuentra almacenada en las moléculas de los carbohidratos, haciéndola así aprovechable para las
células vivas. La posibilidad que un carbohidrato sea fermentado o no por un microorganismo,
depende exclusivamente de que éste contenga la enzima específica.
Un gran número de carbohidratos pueden ser fermentados por los microorganismos y el patrón
de fermentación llega a ser característico para determinadas especies, géneros y otros grupos
taxonómicos, siendo la acción de los microorganismos sobre los carbohidratos la que determina esta
situación. Demostrando la presencia de algunos productos finales de las alteraciones que sufren los
medios con carbohidratos y la incorporación de indicadores, es como se puede determinar la
presencia de un microorganismo.
Existen microorganismos que actúan sobre los carbohidratos de manera oxidativa y otros en
forma fermentativa.
• MATERIAL
Cultivos de 24 horas de agar tripticasa soya en tubo de:

o Escherichia coli
o Pseudomonas sp
o Alcaligenes sp
Tubos con caldo rojo fenol con glucosa con una concentración de azúcar equivalente a la del OF y
campanilla de Durham. (Caldo glucosado).
Tubos con medio OF con glucosa
• PROCEDIMIENTO
o PRUEBA DE CALDO GLUCOSADO CON CAMPANILLA DE DURHAM.
1. Sembrar la bacteria en un tubo con caldo glucosado que contenga una campanilla de
Durham.
57
2. Dejar sin inocular un tubo de cada azúcar en caldo, para control.

3. Identificar los tubos convenientemente, poniendo el nombre del azúcar y del
microorganismo sembrado.
4. Incubar todos los tubos a 37°C durante 48 horas.
INTERPRETACIÓN
1. Determinar por comparación con cada control.

a) Crecimiento.
b) Cambio de color del indicador (producción de ácido), producción de gas, por el
aparecimiento de las burbujas atrapadas en la campanilla de Durham.
2. Reportar los resultados en un cuadro.
LAS PRUEBAS DE OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN.
En la diferenciación de los organismos que utilizan los carbohidratos de manera oxidativa en

vez de fermentativa, es necesario el uso del medio “OF” para la determinación de la acidez
producida por las bacterias. Esto es debido al bajo contenido de peptonas del medio OF que
permite una menor liberación de alcalinidad que neutralice la acidez.
• TÉCNICA
1. Inocule dos tubos del medio OF preparado. Puncione el medio de una sola vez hasta el
fondo con asa en punta. Cubra uno de los tubos con 5mm de aceite mineral estéril y
deje el otro sin aceite.
2. Incubar los tubos por 48 horas o más a 37°C.
3. Observar los cambios de pH.
4. Los tubos sin aceite nos permiten observar un proceso de oxidación y los tubos con
aceite el de fermentación del carbohidrato.
NOTA: Dejar algunos tubos sin sembrar para control.
58
o INTERPRETACIÓN
Tubo sin aceite Tubo con aceite

Oxidación Amarillo Verde(-)
Fermentación Amarillo Amarillo
No fermentación ni oxidación Azul o Verde(-) Verde(-)
• RESULTADOS
CALDO GLUCOSADO CON
MICOORGANISMO CAMPANILLA DE DURHAM
INTERPRETACIÓN
ÁCIDO GAS
Escherichia coli
Pseudomonas sp
Alcaligenes sp
MEDIO
“OF”
MICOORGANISMO
GLUCOSA
Tubo con Tubo sin
F O A
aceite aceite
Escherichia coli
Pseudomonas sp
Alcaligenes sp
F = Fermentación O = Oxidación A=Asacarolítico
59
ACCIÓN SOBRE NITRATOS

METABOLISMO BACTERIANO
Esta prueba determina la habilidad de un organismo de reducir los nitratos a nitritos o nitrógeno
gaseoso libre. Estas reacciones toman lugar bajo condiciones anaeróbicas. La respiración es un
proceso oxidativo por el cual las sustancias inorgánicas (Ej.: los nitratos) proveen oxígeno que sirve
como aceptor de electrones en la producción de energía.
Para la reducción de nitratos, la bacteria problema se hace desarrollar en un medio de cultivo al

cual se le ha agregado cierta cantidad de nitrato de potasio. La bacteria, si produce la enzima
“nitrasa”, cambiará activamente el hidrógeno liberado de otro substrato con el nitrato de potasio; este
último, al funcionar como aceptor de hidrógeno, quedará reducido a nitritos.
Reducción de Nitratos a Nitritos:
NO3- + 2e- + 2H+ NO2 + H2O
Reducción de Nitratos a Nitrógeno molécular:
2NO3- + 10e- + 12H+ N2 + 6H2O
• MATERIAL
Cultivo de 24 horas en agar tripticasa soya en tubo con slant:

o Pseudomonas aeruginosa
o Escherichia coli
o Alcaligenes sp
o Acinetobacter sp.
Cuatro tubos de caldo nitratado con campanilla de Durham.
Solución de ácido sulfanílico (Solución A) en goteros.
Solución de alfa-naftilamina (Solución B) en goteros.
Dos pipetas de 1 cc.
Zinc (polvo)
60
• PROCEDIMIENTO
1. Sembrar los tubos con caldo nitratado con cada una de las cepas.
2. Retener un quinto tubo como control.
3. Incubar todos los tubos a 37°C durante 48 horas.
4. Agregar a cada uno de los tubos, incluyendo al control 10 gotas de ácido sulfanílico y
posteriormente 10 gotas de alfa-naftilamina.
5. La presencia de nitritos se indica por la aparición de un color rosado o rojo. Comparar los
resultados obtenidos con el control.
6. A los tubos que resultaron negativos se les adiciona unos granitos de Zn2+ (agente reductor).
Tabla de Interpretación de Resultados
PRUEBA RESULTADO INTERPRETACIÓN

Adición solución A No hay presencia de
No cambia de color
yB Nitritos.
Adición solución A Nitrato reducido a Nitrito, por
COLOR ROSA O ROJO
yB acción de la bacteria.
Nitrito no presente; sin

Adición de Zn2+ No cambia de color embargo el NO3- presente
en el medio, fue reducido
por la bacteria a N2
Nitrato reducido a Nitrito por

el Zn2+, pero no por la
COLOR ROJO bacteria.
REACCIONES
No.1
NH2 N=N
+ HNO2 + + 2H2O
SO3H NH2 SO3H NH2
61
Ácido sulfanílico Alfa-naftilaminap p-sulfobenceno-azo-naftilaminasulfobenceno-

azo-naftilamina
No.2
N=N
+ CH3COOH Zn2+ C6H5NHNH3-OSO3H
SO3H NH2 Ácido acetico Arilhidrazina

p-sulfobenceno-azo-naftilamina
(Compuesto coloreado de diazonio) (Compuesto coloreado)
• RESULTADOS
MICROORGANISMO NITRITOS NITRÓGENO LIBRE INTERPRETACIÓN
P. aeruginosa
Escherichia coli
Alcaligenes sp
Acinetobacter sp
62
PRUEBA DE IMVIC
La prueba de IMVIC es una batería de reacciones que pone de manifiesto ciertas características
de las enterobacterias. Estas reacciones son las siguientes: (I) La producción de “indol” a partir de
un sustrato que contenga triptófano; (M) La prueba de Rojo de Metilo que pone de manifiesto la
cantidad de “ácido” que producen ciertas bacterias gram negativo a partir de determinada cantidad
de glucosa; (V) Es la prueba de Voges Proskauer que determina la producción de una sustancia
llamada “acetil-metil-carbinol” o “acetoína”, que algunas bacterias tienen la propiedad de darla como
producto final de la degradación de glucosa; y (C) La utilización de “citrato” como única fuente de
carbono.
De tal manera que la utilización de estas cuatro pruebas bioquímicas designadas con el nombre
de IMVIC, nos proporciona datos útiles para la identificación y clasificación de ciertas bacterias.
• MATERIAL
Cultivos en agar de tripticasa soya en tubo con slant

• Klebsiella pneumoniae
• Escherichia coli
Tres tubos de medio MR-VP
Tres tubos de medio SIM
Tres tubos conteniendo agar citrato de SIMMONS (inclinados)
Reactivo de Kovacs
Rojo de metilo
Solución de alfa-naftol (Solución A)
Solución de KOH (Solución B)
Tubos de ensayo
Pipetas de 1 cc
• PROCEDIMIENTO
Inoculación de los medios.

1. Sembrar cada una de las bacterias en los tres medios que le fueron proporcionados,
dejando siempre un tubo sin sembrar para utilizarlo como CONTROL. Luego incubarlos
durante 48 horas a 37°C.
63
Prueba de INDOL.
1. Agregar a los tubos con medio SIM previamente inoculados e incubados por 48 horas, 5
gotas de reactivo de KOVACS, agitar suavemente y dejar los tubos en reposo hasta que
el reactivo se separe y ocupe la parte superior del medio.
2. La presencia de Indol se pondrá de manifiesto si se observa el aparecimiento de un color
Rojo en la capa del reactivo.
La reacción bioquímica que se lleva a cabo está esquematizada como sigue:
Reacción Bioquímica
La enzima triptofanasa cataliza una reacción de desaminación atacando la molécula de
triptófano, en un lado de la cadena y dejando intacto el anillo aromático que recibe el nombre de
“Indol”.
O
CH2-CH-COOH
+ CH3--C—COOH + NH3
NH2
NH NH
Triptofanasa H2O (hidroliza) Indol Ácido pirúvico

Desaminación
CHO HCl alcohol
INDOL + CH = + (CH3)2
Condensación =N
N(CH3)2
p-dimetilaminobenzaldehído Compuesto coloreado quinoidal (rojo)
64
Reactivo de KOVACS
Alcohol Isoamilico
Prueba de VOGES PROSKAUER

La prueba de Voges-Proskauer se basa en la detección de acetoína producida por
fermentación a partir del ácido pirúvico (producto de la glucólisis). Esta prueba se utiliza
para diferenciar E. coli de Klebsiella sp y Enterobacter sp.
La familia Enterobacteriaceae utiliza un tipo de fermentación ácido mixta y se puede
dividir en dos grupos:
1. Los que producen ácido y no producen acetoína (Voges-Proskauer negativo) como E.
coli.
2. Los que producen 2,3-butanodiol como Klebsiella sp y Enterobacter sp (Voges-
Proskauer positivo).
A los tubos sembrados en MR-VP, tratarlos de la siguiente manera, para la

determinación de Acetil-metil-carbinol.
1. Decantar en un tubo de ensayo limpio 1 cc del caldo MR-VP (conservar el otro tubo,
solución “B”).
2. Agregar luego 12 gotas de la solución de Alfa-naftol (Solución A) y 4 gotas de la solución
de KOH al 40% (Solución B).
3. Agitar después de la adición de cada reactivo y dejar a temperatura ambiente durante 5
a 15 minutos el tubo sin taparlo para obtener una buena reacción.
4. La aparición de un color rosado a rojo indica la presencia de ACETIL-METIL-CARBINOL.
NOTA: Todos estos pasos incluyen el tubo control.
OH O O O
KOH 40%
+ CH3-C-CHOH CH3-C – C-CH3 + 2H2O
O2
CH3
Alfa-naftol Acetoína Diacetil
65
Diacetil + NH2—C—NH-R condensación Color rosado a rojo
NH
Prueba de Rojo de Metilo.

1. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo al tubo sobrante (Solución “B”) del caldo
MR-VP.
2. La aparición de un color rojo o rosado indica una prueba positiva. Un color amarillo
indica un resultado negativo.
Prueba de Citrato.
1. En los tubos sembrados en agar Citrato de SIMMONS, deberá observarse el
aparecimiento de un color azul para dar como positiva la prueba.
2. Si el medio queda del color inicial, la prueba se tomará como negativa.
• RESULTADOS
IMVIC
ROJO DE VOGES
MICROORGANISMO INDOL CITRATO
METILO PROSKAUER
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
66
• INTERPRETACIÓN
Microorganismo:
Prueba Resultado Interpretación
A Indol
B Rojo de Metilo
C Voges Prokauer
D Citrato
Microorganismo:
Prueba Resultado Interpretación
A Indol
B Rojo de Metilo
C Voges Prokauer
D Citrato
67
HONGOS LEVADURIFORMES
El término levaduriformes se refiere a un grupo de hongos que tienen características

morfológicas y fisiológicas de levaduras verdaderas. Todos producen colonias húmedas de
consistencia cremosa. Morfológicamente son esencialmente organismos unicelulares. Sin
embargo, algunos de los hongos de este grupo producen micelio además de las formas unicelulares,
por lo que se les conoce como hongos dimórficos. Los géneros incluidos en este grupo son:
Cryptococcus, Pityrosporum, Trichosporum, Candida y Geotrichum.
Género Candida: Las especies de este género producen además de las levaduras, pseudomicelio y
micelio verdadero. En frotes teñidos o preparaciones en fresco se observan levaduras pequeñas,
ovales, de pared delgada de 2-6 μm de diámetro. Las patógenas no se diferencian
microscópicamente de las no patógenas por lo que debe tenerse especial cuidado en la
identificación en los medios de cultivo.
Género Geotrichum: Este no es una levadura, se encuentra incluido dentro de los hongos
lavaduriformes, porque su morfología macroscópica y microscópica es similar a la que presentan los
hongos levaduriformes.
• MATERIAL
Cultivos de agar Sabouraud de los siguientes hongos:

o Rhodotorula sp
o Trichosporum sp
o Geotrichum sp
o Candida sp
Colorantes de Gram
Azul de lactofenol
Portaobjetos
Cubreobjetos
68
• PROCEDIMIENTO
1. Observar la morfología macroscópica de cada una de las colonias y describirla.

2. Hacer preparaciones con azul de lactofenol de cada una de las colonias, observarlas al
microscopio y hacer los dibujos correspondientes.
3. Hacer frotes y colorear con Gram y hacer los dibujos correspondientes.
• RESULTADOS
Características Macroscópicas
HONGO LEVADURIFORME CARACTERÍSTICAS
69
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
70
HONGOS SAPROBIOS
Los hongos saprobios se encuentran frecuentemente en material clínico y en el ambiente. Es

muy importante y necesario saber distinguir estos hongos contaminantes de los patógenos
verdaderos. En algunas ocasiones, estos hongos saprobios pueden causar patología, sobre todo en
pacientes debilitados, con respuesta inmunológica disminuida o terapia prolongada con hormonas o
antibióticos.
• PROCEDIMIENTO
Observación de cultivo de hongos.
1. Morfología Macroscópica
Se debe observar la morfología colonial por un período de una a tres semanas tomando
en cuenta lo siguiente:
o Velocidad de crecimiento
o Topografía (aplanada, elevada, irregular, lisa, etc.)
o Textura (cremosa, pulverulenta, granular, aterciopelada, algodonosa, etc.)
o Pigmentación en la superficie
o Pigmentación en el reverso
2. Morfología Microscópica
o Empleando una técnica estéril, remueva una pequeña porción de colonia con un asa en
“L”
o Coloque el material sobre un portaobjetos, trate de separar el micelio empleando el
cubreobjetos o con un asa en punta, adicione una gota de azul de lactofenol. Cubra
con un cubreobjetos y examínela al microscopio
o Si se observan esporas u otras estructuras diagnósticas, puede identificarse al hongo,
sino es así, deberá hacerse pruebas adicionales como cultivo en lámina, utilización de
medio para inducir esporulación, pruebas nutricionales, etc.
71
ALGUNOS HONGOS SAPROBIOS
Alternaria
La colonia de crecimiento rápido (40 mm de
diámetro en cuatro días) desarrolla su micelio
cerca de la superficie del agar, gris al principio,
c después negra con periferia grisácea. El reverso

de la colonia es negro. Al principio el micelio
aéreo no es abundante, pero después desarrolla
áreas de micelio aéreo algodonoso, liso, blanco,
que pronto se torna blanco mate a gris y que finalmente puede cubrir el micelio negro en
esporulación.
A partir de los extremos de los conidióforos (a) se producen los conidios muriformes típicos en
cadena (b), aunque a veces se forman de manera individual. Son de color pardo oscuro y con
tabicaciones longitudinales y transversales. Cualquier célula del conidio puede producir un tubo
germinal (c). Cada conidio, producido por gemación del inmediatamente inferior, es oval con “pico”
largo (generalmente) y posee una mancha oscura pronunciada en el punto de fijación.
Nigrospora
El hongo de crecimiento rápido

(70 mm de diámetro en 5 días)
forma un crecimiento aéreo blanco,
lanudo, compacto que toma color
gris debido al micelio negro en
trance de esporulación sobre la
superficie del agar. El reverso del
cultivo es negro.
Los conidios son negros, brillantes globulosos (b) y producidos por conidióforos dilatados o
ampuliformes (a). Cuando se producen estos conidios negros brillantes en gran número, la colonia
toma color grisáceo o gris oscuro y el reverso de la misma adquiere color negro. Algunas especies
de este género como N. sphaerica viven como saprobias en el suelo, pero también pueden atacar
una gran variedad de plantas en regiones tropicales.
72
Aspergillus
La colonia compacta de crecimiento lento (28 mm de diámetro en 8 días) es al principio

blanca, después verde, azulada, negra, con áreas amarillo azufre (dependiendo de la especie).
La estructura portadora de conidios es una hifa alargada, no

tabicada ni ramificada (a) que nace en una célula pie (b) en el
micelio. Se ensancha en su extremo, formando una vesícula
(c) productora de esterigmas o fiálides en forma de redoma
(d) que cubren total o parcialmente la superficie ensanchada.
Los conidios o fialosporas parten de los extremos de los
a esterigmas, formando cadenas no ramificadas (e) que dan
b
aspecto rugoso al conidióforo, ensanchado en su vértice.
Este género es de los que presentan una mayor distribución geográfica, encontrándose desde las
regiones árticas hasta el Ecuador. El aire y el suelo de casi cualquier parte del mundo contienen los
conidios de diferentes especies. Pueden crecer casi en cualquier sustancia, afectando el bienestar
del hombre en multitud de maneras. Hay especies que además de descomponer alimentos
producen sustancias tóxicas, llamadas micotoxinas, que ocasionan diversos trastornos, a veces
severos, en los animales y humanos que consumen alimentos contaminados. Unas de las
micotoxinas más conocidas son las aflatoxinas de A. flavus, con efectos carcinógenos, y las
ocratoxinas de A. ohcraceus, con efectos hepatotóxicos y nefrotóxicos.
Algunas especies pueden comportarse como patógenas del hombre y de los animales silvestres
y domesticados, ocasionando una serie de enfermedades denominadas colectivamente aspergilosis,
siendo la pulmonar la más seria. Puede haber aspergilosis del conducto auditivo o de la córnea en
el hombre, pero es de consecuencias más graves la pulmonar. Los síntomas de esta micosis son
muy parecidos a la tuberculosis. La infección es oportunista y se presenta cuando en el hospedero
hay una enfermedad debilitante u otros factores predisponentes que hacen que un hongo
normalmente saprobio se torne patógeno.
73
Causan problemas como contaminantes de cultivos en los laboratorios. Algunas especies crecen
en artículos de piel, telas, papel y otros productos manufacturados, provocando su deterioro e
impartiéndoles un característico olor a moho.
Varias especies son utilizadas en diversos procesos industriales para la elaboración comercial de
productos que abarcan desde ácidos orgánicos hasta enzimas, antibióticos y alimentos fermentados
de varias clases, estos últimos principalmente en países orientales. Por ejemplo, los ácidos cítrico y
glucónico son sintetizados en una escala industrial utilizando cultivos seleccionados de A. niger; la
salsa de soya y otros productos fermentados, como la salsa tamari, son elaborados con la
intervención de A. oryzae y A. tamarii.
Penicillium
La colonia crece rápidamente (50 mm de diámetro en 8 días) es

al principio blanca, pero después toma un color verde azulado y
aspecto muy polvoriento debido a la abundante producción de
esporas a partir del micelio aéreo.
Las hifas portadoras de esporas forman el “pincel” o cepillo

característico. Los conidios aparecen en cadenas no ramificadas
(e) y parten del extremo de los esterigmas en forma de redoma (d)
los cuales se hallan dispuestos en verticilio (espiras), en los
extremos de las pequeñas pirámides o “métulas” (c) que nacen de las ramas (b) del conidióforo.
Aunque las especies de Penicillium difieren en su aspecto macroscópico (tamaño de la colonia,

color, textura, etc.), puede identificarse el género por la estructura característica del conidióforo.
Las especies de este género, tan diversas o más que las del género Aspergillus, también son de los
hongos más abundantes y de mayor distribución geográfica que existen; sus esporas están en
todos lados en el aire y en el suelo. Tanto los aspergilos como los penicilios proliferan en multitud
de ambientes y se manifiestan en procesos biológicos que afectan la vida del hombre y de otros
muchos organismos, ya sea para beneficiarla o perjudicarla. Comúnmente se encuentran especies
de Penicillium deteriorando manzanas y cítricos; son tan efectivos como los aspergilos en el
deterioro de pieles y telas, además de muchos otros sustratos, e igualmente incluye especies que
ocasionan micosis en humanos y animales, aunque en este sentido los penicilios no son tan
importantes como los aspergilos.
78
En otros campos si lo son, ya que descomponen grandes cantidades de semillas y granos

almacenados, así como alimentos de todas clases, incluyendo los ensilados, que ya no pueden ser
utilizados como alimentos para animales o para el hombre, no solo por el grado de descomposición
que llegan a ocasionar, sino porque muchas veces también se desarrollan especies toxígenas,
productoras de diversas micotoxinas que afectan la salud de los consumidores. Otro aspecto en el
que los penicilios son muy importantes es, desde luego, la producción industrial de antibióticos.
Aunque hay varias especies de Penicillium capaces de sintetizar penicilina, el antibiótico más
famoso, ciertas cepas seleccionadas de P. notatum y P. chrysogenum son las que de manera
eficiente y controlada se utilizan para la producción industrial de este antibiótico. La griseofulvina es
un antibiótico importante, relativamente nuevo, producido por P. griseofulvum, que constituye una
droga efectiva para el tratamiento de varias dermatofitosis, como las tiñas de la cabeza, de las uñas
o de los pies (pie de atleta). P. camembertii es responsable de las características peculiares del
queso camembert y P. roquefortii de las del queso roquefort, que son madurados con estos hongos.
En otros campos de la micología industrial también son importantes los penicilios, ya que muchas
especies son cultivadas en gran escala para la producción de ácidos orgánicos como son cítrico,
oxálico, fumárico, glucónico y gálico.
Paecilomyces
La colonia de crecimiento rápido (70 mm de diámetro en 5 días) cubre
en capa delgada la superficie del agar y toma color pardo amarillento y
aspecto polvoriento debido a la abundante producción de conidios.
Las hifas portadoras de conidios se parecen superficialmente al “pincel”

de Penicillium. Los conidios elípticos (d) se presentan en cadenas no
ramificadas que parten del extremo de los esterigmas en forma de redoma
(c), los cuales no solo aparecen dispuestos en verticilio (espiras) sobre los
extremos de las hifas, sino que pueden encontrarse también en un solo esterigma a lo largo de una
hifa (a). El aspecto del esterigma que nace aisladamente de la hifa (a) su extremo característico que
termina en un largo tubo portador de conidios (b) que se incurva alejándose del eje principal del
esterigma y las células accesorias o “macrosporas” (e) localizadas en la superficie del agar o cerca
de la misma, permiten diferenciar este hongo de los pertenecientes al género Penicillium. P.
fumosoroseus vive comúnmente como saprobio en el suelo, aunque ha sido registrado como
patógeno de tortugas en cautiverio, ocasionando micosis pulmonar.
79
Scopulariopsis
La colonia de crecimiento lento (60 mm de diámetro en 18 días)
es al principio membranosa, rugosa y sin vellosidades, hasta que
aparecen hifas aéreas y conidios que dan al cultivo aspecto
polvoriento y color pardo claro.
Los esterigmas que sostienen cadenas no ramificadas de
a conidios de pared rugosa (c), pueden agruparse en las ramas de un
a
conidióforo corto (a) o aparecer aisladas a lo largo de las hifas aéreas
b
. Los conidios tienen forma característica de limón con vértice
b
puntiagudo y base truncada (b). S. brevicaulis es un habitante
común del suelo, que en ocasiones ha sido encontrado junto con hongos típicamente
queratinolíticos en casos de onicomicosis (tiña de las uñas de los pies en el hombre).
Fusarium
Hongo de crecimiento rápido (45 mm de diámetro en 5 días); es al
b principio blanco y algodonoso, pero rápidamente desarrolla un color rosa
intenso en el centro y rosado claro en la periferia.
b
Ramas cortas de hifas dan origen a conidióforos verticilados (a) de los
cuales parten conidios multitabicados, largos, en forma de uso o media
luna, terminados en punta (b). Existen especies de Fusarium que
parasitan diversas plantas tan importantes para el hombre como tomates,
plátanos, camotes, perales, maíz, lino y muchas más en las que
generalmente causan un marchitamiento. El micelio y los conidios del hongo invaden los tejidos
vasculares llegando a bloquear físicamente la translocación del agua y provocando el
marchitamiento cuando suficientes vasos son taponados. Además, algunas especies, producen
toxinas que afectan la permeabilidad de las membranas celulares, alteran el metabolismo y
contribuyen así a causar el marchitamiento
80
Mucor
Hongo de crecimiento rápido que llena la caja de Petri en cinco
b días, con micelio aéreo, velludo, abundante, al principio blanco,

b
después gris oscuro.
El micelio vegetativo no tabicado da origen a gran número de
esporangióforos (a) de longitud desigual. (por lo común los
esporangióforos son sencillos, aunque hay especies que los
tienen ramificados) portadores de esporangios globosos
a
terminales repletos de esporas (b). La pared del esporangio se
rompe fácilmente, y disemina esporas elípticas (e), dejando un
fragmento de la pared del esporangio llamado collarete (d) en la
base de la columnilla esférica.. Esta estructura es el extremo
dilatado del esporangióforo que se extiende en el interior del esporangio y que se observa tan solo
cuando se rompe la pared del mismo y se dispersa la masa de esporas (c).
Tiene enzimas proteolíticas y desintegra las grasas, por lo que ocasiona la descomposición de
muchos alimentos. M. rouxii produce abundante amilasa y cimasa, por lo que se usa
industrialmente en la elaboración de alcohol. En oriente se utiliza mucho en la elaboración de
bebidas alcohólicas a partir de arroz. Algunas otras especies se utilizan en la producción de
enzimas y otras son capaces de producir ácido cítrico, aunque para la obtención de este ácido se
emplean con mayor éxito diversas especies de Aspergillus.
Se diferencia del género Rhizopus porque su micelio no forma estolones ni rizoides y sus
esporangióforos nacen en cualquier sitio del micelio.
81
Rhizopus
Hongo de crecimiento rápido que llena la caja de Petri en
cinco días, con un micelio aéreo algodonoso denso, al principio
d blanco, después gris oscuro. En este micelio se distinguen
d
claramente tres tipos de hifas: los rizoides (a) los esporangióforos
(b) y los estolones (e). Los estolones crecen horizontalmente
c
b sobre el sustrato, se levantan un poco sobre el mismo y, a cierta
distancia, se inclinan y toman contacto con la superficie del medio;
c
son hifas anchas, de pared gruesa y protoplasma cenocítico, que
pueden alcanzar desde unos cuantos milímetros hasta 1-3 cm de
e
longitud. En los sitios donde los estolones tocan el sustrato, se
a e forman penachos de rizoides cortos, delgados y ramificados que
a
se introducen en el medio y se encargan de la fijación del micelio
y de absorber sustancias nutritivas. Los rizoides pueden ser medianos a grandes (1-4 mm o más de
largo) o pequeños (menos de 1 mm). A partir de cada grupo de rizoides se forman varios estolones
que se extienden en diversas direcciones, tocan la superficie del sustrato y constituyen otros grupos
de rizoides, y así sucesivamente, se forma una maraña de rizoides y estolones.
Los esporangióforos nacen arriba de los estolones, en los mismos sitios donde se originan, en
sentido opuesto, los rizoides; terminan en esporangios llenos de esporas globosas negras (d). El
extremo dilatado del esporangióforo, la columnela o columnilla, se extiende hacia el interior del
esporangio (c) y es claramente visible (f) cuando se rompe la pared esporangial. Este género se
diferencia de Mucor por la presencia de estolones, rizoides y esporangióforos no ramificados que
nacen en fascículos en un punto opuesto a los rizoides.
Este género tiene gran interés desde el punto de vista económico pues se encuentra
ampliamente distribuido y contamina numerosos alimentos del hombre y los animales, a los que
descompone e inutiliza con sus enzimas dando lugar a pérdidas considerables. Por otro lado,
muchas especies son utilizadas en la industria para la producción de ácido fumárico (Rh. nigricans
es el hongo más eficaz para su producción), ácido láctico, esteroles básicos en la síntesis de
cortisona, hormonas sexuales, anticonceptivos, pueden utilizarse también en la fermentación
alcohólica a partir de granos y en la producción de enzimas comerciales.
82
Syncephalastrum
Hongo de crecimiento rápido que llena la caja de Petri en cuatro

días con un micelio aéreo algodonoso, denso, al principio blanco,
después gris oscuro casi negro.
Los esporangióforos son ramas cortas de las hifas aéreas (a) con
extremo netamente ensanchado llamadas cabezuelas (b) portador de
esporangios (llamados merosporangios o esporangíolos) tubulares
largos, digitiformes (c) en los cuales se forman largas cadenas de
esporas (e y f). Estos esporangios tubulares que irradian desde el extremo del esporangióforo son
peculiares de este género y dan a las estructuras portadoras de esporangios el aspecto general de
Aspergillus, con gran aumento. En ocasiones se encuentran uno o dos esporangios esporulados
(d), pero la mayoría son alargados (f) y contienen buen número de esporas.
Es el único género de su familia y comprende una sola especie, S. racemosum.
Cladosporium
Hongo de crecimiento rápido (65 mm de diámetro en ocho días) que aparece como un
crecimiento grisáceo a verde claro, polvoriento; el reverso de la colonia es gris a negro. Por examen
macroscópico puede parecer Penicillium.
Las estructuras conidiales forman los racimos “arboriformes” característicos. Los conidióforos, de
longitudes diversas (a) sostienen cadenas ramificadas de conidios (b) alargados u ovales separados
por pequeños cuerpos oscuros de celulosa y formados por gemación continua (blastosporas).
Son unicelulares en cultivos jóvenes, pero más tarde se dividen por tabicación para formar
conidios de dos o más celdas. El micelio, los conidióforos y los conidios tienen color pardo oscuro.
La mayoría de especies viven como saprobias en el suelo, aunque alunas pueden parasitar diversas
plantas. C. resinae es notable por su capacidad de asimilar los hidrocarburos del combustible para
avión. Cuando hay algo de humedad, el hongo se puede desarrollar y el micelio y los conidios
llegan a bloquear los conductos del combustible; obviamente, esto resulta peligroso para las
aeronaves en vuelo, por lo que constantemente deben realizarse inspecciones cuidadosas. C.
83
carrionii es uno de los causantes de la cromomicosis en el hombre, una infección localizada en la

piel y de los tejidos subcutáneos.
Acremonium
Hongo de crecimiento rápido, madura en 5 días. Al inicio presenta
una colonia compacta, plegada y aterciopelada que se convierte en
una colonia algodonosa y suelta. Puede ser blanca, gris o rosada. El
reverso es sin color, amarillo suave o ligeramente rosada.
Presenta hifas septadas de las que surgen las fiálides rectas y

delgadas, no ramificadas. Las conidias son ovaladas, usualmente sin
tabiques, pero pueden presentar una división. Estas permanecen
unidas al final de la fiálide.
Se le denominaba con anterioridad Cephalosporium pero este nombre a quedado obsoleto.
Trichoderma
Hongo con conidióforos hialinos, muy ramificados, sin verticilios,
fiálides hialinas solitarias o en grupos, ovoides, que nacen en
pequeños grupos terminales. Colonia de crecimiento rápido, con
parches verdosos de conidios. Crece como saprobio en el suelo o
en maderas.
84
CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS DE HONGOS SAPROBIOS
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
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__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
▪ HONGO :__________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
OTROS:___________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
87
CULTIVO EN LÁMINA
En el estudio de los hongos, frecuentemente es necesario observar la reacción de las estructuras

reproductoras y el micelio. Esto puede lograrse haciendo crecer el hongo en láminas colocadas en
cámara húmeda.
• MATERIAL
Cajas de Petri de vidrio estériles conteniendo un triángulo de vidrio, un cubreobjetos y un
portaobjetos.
Agar Sabouraud glucosado o agar papa dextrosa
Cultivos de hongos saprobios
Pinzas
Pipetas de 10mL estériles
Agua destilada estéril
• PROCEDIMIENTO
1. A partir del agar Sabouraud contenido en las cajas de Petri, cortar círculos de 1 cm de diámetro.
2. Usando técnicas asépticas, colocar el portaobjetos sobre el triángulo de vidrio, luego colocar un
cuadrito de agar sobre el portaobjetos en la caja de Petri.
3. Con un asa en “L” tomar una porción del micelio e inocular el hongo a investigar en el centro de
cada uno de los cuatro lados del cuadrito de agar llevando el asa hasta el fondo. Cubrir el agar
inoculado con el cubreobjetos estéril.
4. Añadir 5mL de agua destilada estéril a la caja conteniendo el cultivo.
5. Incubar a 25°C hasta que haya esporulación.
6. Si hay esporulación, cuidadosamente levantar el cubreobjetos con una pinza y colocarlo sobre
una superficie blanca, teniendo cuidado de poner la cara con cultivo hacia arriba.
7. Descartar el trocito de agar con un asa en espátula y coloque el portaobjetos sobre una
superficie blanca con el cultivo hacia arriba.
8. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjetos limpio y encima colocar el
cubreobjetos con cultivo (el cultivo debe ir en este caso hacia abajo).
9. Sobre el portaobjetos con cultivo colocar otra gota de azul de lactofenol y cubrirlo con un
cubreobjetos limpio.
10. Remover el exceso de colorante y sellar la preparación con Etellán o esmalte de uñas
transparente.
• CUESTIONARIO
1. ¿En qué se diferencia el medio Mycosel de Saboraud?
2. ¿Qué medios se utilizan para facilitar la esporulación de los hongos?
3. ¿En qué casos se recomienda el cultivo en lámina?
88
CULTIVO EN LÁMINA PARA HONGOS
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
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___________________________________________
Observación de:
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Aumento:
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Características:
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___________________________________________
Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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___________________________________________
Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
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Aumento:
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Características:
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
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Características:
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92
MORFOLOGÍA DE ALGAS
Las algas son organismos acuáticos simples que carecen de tejido vascular, son organismos
fotosintéticos que se encuentran en diversos hábitats, presentando diversidad en cuanto al tamaño,
morfología, procesos reproductivos y otras características.
Los pigmentos que presentan las algas son color rojo y café, absorbiendo la luz verde, violeta y
azul que penetra con mayor facilidad en la profundidad del agua. La combinación de estos
pigmentos con clorofila da a las algas sus colores característicos, en los cuales están basados los
nombres de las divisiones: División Rhodophyta (algas rojas); División Phaeophyla (alqas cafés) y
División Chlorophyta (algas verdes). Las algas rojas se encuentran frecuentemente en el Océano
Pacífico en la costa de California; las algas cafés a lo largo de las costas rocosas expuestas a la
marea baja hacia mar adentro y las algas verdes se encuentran en océanos y hábitats de agua
dulce.
Las algas son de gran interés, debido a que obtienen sustancias químicas de utilidad como:
proteínas, yodo, potasio, etc. Abundan en agua dulce y además forman parte del plankton marino
que es uno de los alimentos principales de los animales acuáticos.
• MATERIAL
Agua de charco
Cultivos de algas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipetas Pasteur
Bulbos
• PROCEDIMIENTO
1. Realizar preparaciones en fresco del agua de charco y de los cultivos.

2. Observar al microscopio y dibujar la morfología de las algas encontradas.
93
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
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___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
94
PROTOZOOS
TRABAJO PRÁCTICO No.23
Los protozoos son microorganismos eucariotas unicelulares, que carecen de pared celular,
móviles, se distinguen de los procariotas por su tamaño, de las algas por carecer de clorofila y
cloroplastos, de las levaduras y hongos por ser móviles y de hongos mucosos por su incapacidad de
formar cuerpos fructíferos. Todos se reproducen asexualmente por división celular, sin embargo
algunos tienen diversos grados de reproducción sexual. Forman quistes como estados de
resistencia, los cuales les permiten soportar la desecación y el congelamiento. Existen alrededor de
15,000 especies clasificadas, pero se cree que aún quedan más de 85,000 especies sin nombrar.
Se encuentran en aguas dulces y saladas, algunos en suelo y en la corteza de los árboles. Se
subdividen en 4 phyla:
Mastigophora:
Poseen estructuras en forma de látigo llamadas flagelos, que les permite desplazarse. También se
denominan zooflagelados.
Sarcodina:
Se mueven por medio de proyecciones citoplasmáticas llamadas pseudópodos, comúnmente
denominado movimiento ameboide.
Ciliata:
Se mueven a través de estructuras cortas en forma de pelos que recubren toda la superficie de su
cuerpo, llamados cilios. Obtienen su alimento por medio de una especie de boca denominado
citostoma.
Sporozoa:
Los miembros de este grupo de protozoos carecen de órganos de locomoción, Todos son parásitos
internos y como su nombre lo indica, su ciclo de vida incluye estadíos de espora.
• MATERIAL
Agar manitol-extracto de suelo
Agua estancada o de charco
Laminas porta y cubreobjetos
Microscopio
Estereoscopio
Pipetas pasteur
Bulbos de hule
• PROCEDIMIENTO
1. Realizar preparaciones en fresco del agua de charco y de los cultivos.
2. Observar al microscopio y dibujar la morfología de los protozoos encontrados.
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
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___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
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Aumento:
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Características:
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___________________________________________
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Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
___________________________________________
Observación de:
___________________________________________
Aumento:
___________________________________________
Características:
___________________________________________
___________________________________________
__________________________________________
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97
98
99
100
101
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUA

Siendo el agua materia prima para la preparación de un sin número de productos

alimenticios y farmacéuticos, además utilizada universalmente por los seres vivos, es de vital
importancia determinar la carga microbiana así como el tipo de microorganismos presentes en ella,
ya que ello permite reconocer si ésta puede ser utilizada para su consumo sin ocasionar problemas
en las personas que la beben. Cuando el agua de consumo está libre de microorganismos
patógenos y sustancias químicas perjudiciales se llama “potable”.
Existen diversas técnicas para analizar microbiológicamente el agua. Básicamente todas

ellas utilizan un medio con nutrientes, con el objeto de poder determinar el conteo total bacteriano, y
se utiliza también uno o más medios selectivos para detectar la presencia de microorganismos
específicos, especialmente las enterobacterias.
La técnica del Número Más Probable (NMP) consiste en diluciones múltiples de la muestra
hasta la extinción y es muy útil sobretodo en muestras que tienen poca cantidad de
microorganismos. Cuando se utiliza para investigar enterobacterias se aprovechan las
características de éstas de producir gas a partir de la lactosa, el cual es atrapado en campanillas de
Durham presentes en los tubos de ensayo.
En esta practica se presentan dos metodologías para el análisis microbiológico de aguas:
• MATERIALES
Agua estéril
Agua contaminada con E. coli.
Tubos con caldo lactosado con campanilla de Durham de 20 ml
Caldo Bilis Verde Brillante (BVB)
Agar EMB
Serie de baterías para IMVIC
Pipetas estériles de 0.1 ml, 1 ml, y 10 ml.
a. PROCEDIMIENTO
Fase presuntiva de la presencia de coliformes totales
Tomar tres series de cinco tubos de caldo lactosado
Inocule cada serie de tubos de la siguiente forma:
Serie 1: 10.0 ml de la muestra
Serie 2: 1.0 ml de la muestra
Serie 3: 0.1ml de la muestra
Agitar vigorosamente 25 veces
Incubar a 35°C por 24 horas, examinando posteriormente el crecimiento y cambio de las
características del medio como lo es producción de gas.
En caso de no observar estos cambios incubar nuevamente por 3 horas a 48°, observar
crecimiento y producción de gas.
102
Reportar:
Negativo: no cambios en el medio después de haber sido incubado en las dos condiciones.
Positivo: presencia de crecimiento y gas en una de las dos condiciones utilizadas.
Fase confirmatoria de la presencia de coliformes fecales
Por cada tubo positivo del caldo lactosado inocular una asada en un tubo de caldo Bilis Verde
Brillante (BVB) e incubar por 24 horas a 44°C, posteriormente observar crecimiento y cambio de
las características del medio como lo es producción de gas.
Contar el número de tubos positivo.
A partir de los tubos positivos de caldo BVB sembrar 1 caja de agar EMB e incubar a 35°C por
24 horas.
1.3 Identificación de E. coli
Hacer un Gram de las colonias con brillo metálico, observando la presencia de bacilos Gram
negativo.
Inocular una batería para IMVIC (SIM, MR-VP, citrato) con una sola colonia tomada del agar
EMB, e incubar 24 horas a 35°C.
• RESULTADOS
1. Fase presuntiva de la presencia de coliformes totales
CARACTERÍSTICAS_________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. Fase confirmatoria de la presencia de coliformes fecales
CARACTERÍSTICAS_________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
103
3. Recuento por número más probable
Fase No. de tubos positivos NMP

10 ml 1 ml 0.1 ml
Presuntiva
Confirmatoria
4. Identificación de E. coli
IMVIC
ROJO DE VOGES
INDOL CITRATO
METILO PROSKAUER
NOTA: existen otros métodos a utilizar para el análisis microbiológico de agua. Los más
comunes, actualmente, utilizan sustratos cromógenos y fluorógenos para la
identificación de coliformes y Escherichia coli. El método de Número más probable con
Caldo LMX, mostrado a continuación, es otra técnica recomendada por instituciones de
renombre como la American Water Works Association (AWWA). Sin embargo, con esta
última no se descarta ni se le quita el valor al método de tubos múltiples con Caldo
Lactosado, Bilis Verde Brillante y EMB, ya que estos medios de cultivo mencionados
son más accesibles económicamente.
B. MÉTODO DEL NMP CON MEDIO LMX
• MATERIALES
100 ml de muestra de agua potable

Recipiente esterilizado que contenga 0,1 ml de tiosulfato de sodio al 0,01N
Pipeteadores
Pipetas de 10 ml
Pipetas de 1 ml
5 tubos con 10 ml de caldo LMX doble
10 tubos con 10 ml de caldo LMX simple
Reactivo de Kovacs
Lámpara UV
104
• PROCEDIMIENTO
Inactivación del cloro
Usar 0.1 ml de tiosulfato de sodio para un volumen de 100 ml de muestra.
Toma de muestra
Usar equipo de protección personal, limpiar con alcohol la boquilla y llave de agua,
posteriormente abrir y dejar correr agua durante 2 o 3 minutos, regular el grosor del agua
semejando el grosor de un lápiz, dejar que el agua tenga un flujo constante, luego destapar
el recipiente de colecta y llenarlo.
Importante: las muestras deben ser etiquetadas con los datos de origen, localidad, fuente,
punto del muestreo, fecha y hora de recolección y datos del transporte.
Procesamiento de la muestra
1. Agregar 10 ml de la muestra a cada uno de los 5 tubos de la serie de caldo LMX doble.
2. Agregar 1 ml de la muestra a cada uno de los 5 tubos de la serie de caldo LMX simple.
3. Agregar 0.1 ml de la muestra a cada uno de los 5 tubos de la otra serie de caldo LMX
simple.
4. Observar el color del medio y anotar.
5. Incubar a 36°C por 24 horas.
6. Luego de la incubación, observar la coloración de los tubos, un cambio de color a verde-
azul es indicativo de presencia de coliformes.
7. Los tubos con cambio de coloración a verde-azul deberán observarse con luz de lámpara
UV, si hay fluorescencia es indicativo de E. coli.
8. Los tubos positivos para E. coli pueden confirmarse con el reactivo de Kovacs. En este
caso agregar 4 a 5 gotas de éste reactivo. La formación de un anillo rojo es confirmativo
de presencia de E. coli.
Interpretación de resultados
El caldo LMX contiene un cromógeno, 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranosido (X-

GAL), el cual es hidrolizado por la enzima β-D-galactosidasa que es producida por las
bacterias coliformes totales, ocasionando un cambio de color en el caldo, de amarillo claro a
azul – verde que indica y confirma una prueba positiva para coliformes totales dentro de 24 -
48 horas.
Así mismo, el caldo contiene un fluorogéno, 4-metilumberiferil-β-D-glucoronido (MUG), el
cual es hidrolizado por la enzima β-D-glucoronidasa que es producida por la bacteria
Escherichia coli, ocasionando una fluorescencia en el caldo bajo la luz ultravioleta de onda
larga que indica la presencia de esta bacteria.
Para confirmar la presencia de E. coli debe comprobarse la producción de Indol en los tubos
que presentan fluorescencia, utilizando el reactivo de Kovacs indol (solución de p-
dimetilaminobenzaldehido en alcohol amílico); por medio del desarrollo de un anillo color
rosado que indica una reacción positiva.
Para reportar el resultado de presencia de coliformes totales y E. coli, se hace uso de una
tabla de probabilidades. Dicha tabla muestra la cantidad de unidades formadoras de colonia
(UFC) por mililitro que hay presentes en la muestra de agua, dependiendo de la cantidad de
tubos (del total de 5) de cada dilución, presenta las características descritas anteriormente.
105
▪ Resultados
Microorganismos No. de tubos positivos Combinación NMP

indicadores en las series de números
10 ml 1 ml 0.1 ml
Coliformes totales
Escherichia coli
106
RECUENTO MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

El recuento de bacterias aerobias mesófilas es un índice de la carga bacteriana total del alimento;
un bajo recuento mayor a lo especificado como aceptable, significa que el alimento fue preparado
bajo condiciones sanitarias inadecuadas; baja calidad de la materia prima, deficiente sanitización,
procesamiento y/o almacenamiento incorrecto. Un recuento elevado tiene como secuencia una vida
corta de anaquel del alimento.
El recuento aeróbico en placa, así como la prueba con tubos puede ser utilizado en alimentos,
leche y agua para determinar el total de microorganismos aérobicos y la presencia de coliformes.
El alimento es previamente diluido en un diluyente adecuado, tal como agua peptonada al 0.1% o
solución salina. Posteriormente, se realizan diluciones de dicho alimento y éstas se colocan en
cajas e Petri, a las cuales se les adiciona el agar PCA (Plate Count Agar) para realizar el conteo de
colonias bacterianas.
• MATERIAL
3 cajas de Petri estériles

Agar PCA
1 erlenmeyer con 90mL de agua peptonada al 0.1%
2 tubos con 9mL de agua peptonada al 0.1%
Pipetas de 1mL
Frascos Mason estériles
Licuadora
• PROCEDIMIENTO
o RECUENTO AERÓBICO EN PLACA POR VERTIDO
1. Pese asépticamente 10g del producto ó mida 10mL si su alimento es líquido.

2. Coloque los 10g o los 10mL del alimento en el frasco Mason estéril, luego adicione
90mL de agua peptonada estéril (dilución 1:10).
3. Lícuelos por 2 minutos aproximadamente.
107
4. A partir de esta dilución (1:10), prepare la dilución 1:100, adicionando 1mL de ésta al
tubo con 9mL de agua peptonada estéril.
5. Prepare la dilución 1:1000, adicionando 1mL de la dilución 1:100 a un tubo con 9mL de
agua peptonada estéril.
6. Coloque 1mL de cada una de las diluciones en dos cajas de Petri y añada
aproximadamente 15mL de agar PCA licuado a 50°C.
7. Homogenizar las cajas y dejar solidificar el medio cerca del mechero.
8. Incube por 24 horas a 37°C.
9. Cuente las colonias en la cámara de Quebec.
• INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Cálculo de Cuantificación
El cómputo se hace en base a cifras de 3 dígitos y se procede a redondear el segundo dígito

al número mediato superior si el tercer dígito es mayor a 5, reemplazar el tercer dígito con 0. Si el
tercer dígito es igual o menor de 5, se reemplaza con 0 y el segundo dígito se deja sin ningún
cambio.
Ejemplos:
Conteo Conteo Conteo Final (APC) Final (APC)
10,800 11,000
9,400 9,400
12,500 12,000
APC = Conteo Aeróbico en Placa
A. Todas las cajas sin crecimiento de colonias

El resultado se expresa como menor de la dilución más baja sembrada. Ejemplo:
1:10 1:100
0 0 = <10 UFC/g o mL
0 0
108
B. Cajas con menos de 25 colonias
Se toma la dilución menor y se reporta como recuento aeróbico en placa estimado o se toma
como 25 veces la dilución menor donde aparecen colonias. Ejemplo:
1:10 1:100
15 3 = 250*UFC/g o mL
11 0
C. Cajas entre 25-250 colonias

1. El conteo final se obtiene aplicando la siguiente fórmula:
UFC = Número de colonias por mililitro o gramo

Σ = Suma de todas las colonias de la cajas contadas
N1 = Número de cajas contadas de la dilución más baja
N2 = Número de cajas contadas de la dilución siguiente más alta
D = Factor de dilución
Ejemplo:
1:10 1:100 1:1000

MNPC 232 33
MNPC 224 28
2. Cuando los conteos de uno de los duplicados esta fuera de ambos límites (25-250), tome en
cuenta solamente los conteos que están dentro de los límites establecidos.
109
D. Todas las cajas tienen más de 250 colonias

Se seleccionan los duplicados de la dilución con el conteo más cercano a 250.
1. Si hay menos de 10 colonias por cuadro del contador de colonias (cada cuadro mide 1 cm 2).
Seleccione 12 cuadros (seis cuadrados horizontales y seis verticales). Si hay más de 10
colonias por cm2, entonces se cuentan solamente, cuatro cuadros. En ambos casos obtenga el
promedio de colonias por cm2. Este resultado se multiplica por el área total de la caja y por el
factor de dilución y se informa como “RECUENTO ESTIMADO”, el cual se indica con un
asterisco (*). Cada laboratorio debe determinar el área en cm2 de las cajas en uso (área =
Ф(3.1316)x2). El diámetro interno de las de tamaño estándar varía, por lo que el área puede ser:
65 cm2 (9.0 cm de diámetro interno)
57 cm2 (8.5 cm de diámetro interno)
A 1 B
7 6 8 9 10 11 12
1
0
C D
Números: menos de 10 colonias cm² contar 6 cuadros horizontales y 6 verticales

Letras: Mayor 10 colonias cm² se cuentan 4 cuadros. En ambos casos se debe obtener el promedio
de colonias por cm²
110
Ejemplo: más de 10 colonias/ cm2

Promedio = 15 + 16 + 18 + 15 = 64 = 16
4 4
N = 16 x 57ª x 100b = 91,200 UFC o Colonias/g o mL

a = área
b = Factor de dilución
E. Crecimiento Excesivo
El conteo excede de 100 colonias/ cm2. Se informa como recuento estimado y como mayor
de 5,700 o 6,500 veces la dilución mayor.
Ejemplo:
1:100 1:1000
MNPC MNPC
100ª x 57b x 1000c = >51700,000 UFC o colonias/g o mL
a = colonias
b = área de la caja
c = factor de dilución mayor
MNPC= muy numeroso para contar
RESULTADOS
DILUCIONES
MUESTRA UFC/g o mL
1:10 1:100 1:1000
111
CONTEO AERÓBICO EN PLACA
112
CONTEO DE COLIFORMES
113
MÉTODOS Y EQUIPO UTILIZADO PARA CONTROL DE MICROORGANISMOS

Debido a que el estudio in vivo de los microorganismos resulta no sólo muy difícil sino que poco
práctico, es el estudio in vitro el que reúne todas las condiciones para que éstos se desarrollen
plenamente y se puedan investigar, pero para ello se necesita de equipo especial para mantenerlos
viables en medios de cultivo y cuando ya no se necesita del espécimen, éste debe eliminarse ya que
se corre el riesgo de un contagio por agentes patógenos, por lo que generalmente se aplican altas
temperaturas para destruir los microorganismos utilizando aparatos como los siguientes.
A. AUTOCLAVE
Es un aparato que utiliza el vapor a presión (calor húmedo) que proporciona temperaturas altas
las que se obtienen por la ebullición. La alta temperatura desnaturaliza las proteínas coagulándolas.
El autoclave esencialmente es una cámara de vapor, con doble pared, equipada con dispositivos
que permiten que la cámara se llene a saturación de vapor y se mantenga a la temperatura y
presión deseadas durante cualquier período. Al manejar el autoclave es esencial que el aire de la
cámara sea reemplazado completamente por vapor. Si queda dentro, la temperatura es la cámara
se reducirá mucho más que sólo si hubiese vapor a la misma presión. No es la presión la que mata
a los microorganismos sino la temperatura elevada del vapor.
Muchos medios de cultivo, diluciones, soluciones y cultivos descartados, se esterilizan

rutinariamente con este aparato. Muchas veces aunque no siempre, el autoclave se opera a una
presión de 15 lb/pulgada2 a 121°C. El tiempo para alcanzar la esterilización dependerá de la
naturaleza del material por esterilizar, el tipo de recipiente y el volumen. Así los tubos de cultivo
líquidos se pueden esterilizar en 10 a 15 minutos a 121°C; el mismo medio en cantidades de 1 a 10
litros, necesitará una hora o más de la misma temperatura para alcanzar la esterilización.
Algunos materiales no se deben esterilizar en el autoclave. Sustancias que no se mezclan con el

agua, como grasas y aceites, no pueden ser alcanzadas por el vapor y así los organismos que
contienen sobrevivirán. También algunas sustancias, evidentemente, se alteran o son destruidas por
tratamientos prolongados de calor.
El autoclave tiene una cámara donde se esteriliza todo el material y una camisa de vapor que
contiene el vapor que luego se libera a la cámara. Tiene un manómetro de la cámara y de la camisa
para controlar la presión y tiene un termómetro que indica la temperatura de esterilización, además
posee una válvula que suelta el vapor de la camisa hacia la cámara.
114
B. HORNO
El horno es un aparato de esterilización que destruye a los microorganismos mediante calor seco
o aire caliente y se recomienda cuando se desea o no se quiere que el vapor a presión tenga
contacto completo y directo con el material a esterilizar, como artículos de vidrio de laboratorio, cajas
de Petri, pipetas, aceite, polvos y sustancias similares. El horno puede ser un horno especial de gas,
eléctrico o doméstico de cocina. Para material de vidrio de laboratorio, para esterilizar este tipo de
material se requiere de mayor tiempo que el usado por el autoclave, por ejemplo 2 horas de
exposición a una temperatura de 160°C a 180°C.
115
C. INCINERACIÓN
La incineración es el mejor método de eliminación de

los microorganismos. Éste método se emplea para
destruir esqueletos, animales de laboratorio infectados y
otros materiales de desecho infectados. La destrucción
de microorganismos por incineración, también se
práctica rutinariamente en los laboratorios cuando se
introduce a la llama de un mechero el asa de siembra
(figura A), pero hay que tener cuidado de no producir
chisporroteo pues de lo contrario se esparcirán gotitas
que lleven microorganismos viables, por lo que también
existen incineradores que se usan en vez de mecheros
(figura B) que evitan el chisporroteo, y en los hospitales
se cuenta con grandes incineradores que destruyen
todos los desechos biológicos producidos en el hospital.
D. FILTRACION
Algunos materiales, particularmente líquidos

biológicos como el suero de los animales o las
soluciones de sustancias como las enzimas y algunas
vitaminas o antibióticos, son termolábiles, o sea, se
destruyen por el calor. Asimismo, otros agentes físicos
como las radiaciones son perjudiciales para estos
materiales e imprácticos para esterilizarlos. En
consecuencia, queda la opción de hacerlo por filtración.
Los filtros se hacen de distintos materiales pero actualmente los filtros usados son los de
membrana que están compuestos por ésteres biológicos inertes de celulosa. Se preparan como
membranas circulares de aproximadamente 150 micras de grueso y contienen millones de poros
microscópicos de diámetro muy uniforme. Los filtros de este tipo se pueden producir de porosidades
que varían de aproximadamente 0.01 a 10 μm.
Los filtros de membrana se usan mucho en los laboratorios y en la industria para esterilizar
materiales líquidos. También se han adaptado a procedimientos microbiológicos para identificar y
116
enumerar microorganismos en muestras de agua y otros materiales. Es costumbre forzar el paso

del líquido a través del filtro aplicando presión mediante una bomba de vacío o aplicando presión
positiva al líquido (figura A).
El desarrollo de filtros para Partículas de Aire de Gran Eficiencia (HEPA), ha hecho posible
obtener aire limpio en lugares cerrados o cuartos. Este tipo de filtración y el sistema de flujo laminar,
se usan para obtener aire libre de polvo y bacterias.
F. CABINAS DE SEGURIDAD BIOLÓGICA
En microbiología la bioseguridad es realmente

importante ya que casi siempre se trabaja con
microorganismos potencialmente patógenos que
pueden contagiar al microbiólogo o bien contaminar
los recipientes o medios de cultivo que se hacen.
Por lo tanto se necesita de un ambiente estéril para
poder trabajar sin peligro.
La solución es la cabina microbiológica, que se encarga de proporcionar un ambiente estéril. Las

campanas pueden ser simples que consisten de una cámara (campana) donde se desinfecta
previamente y se coloca la llama de un mechero para dar un ambiente aséptico, hasta las más
modernas que contienen lámparas de luz ultravioleta que emiten elevados porcentajes de
radiaciones en la región de 250 a 260 nm, que es la zona bactericida más efectiva. Se debe
reconocer sin embargo que tales radiaciones tienen muy poco poder de penetración: son eficaces
sólo cuando hacen contacto directo con las partículas que transportan a los microorganismos.
Una nueva clase de tecnología para controlar la microbiota en espacios cerrados se conoce
como Sistema de Flujo Laminar. En este sistema el aire pasa a través de filtros particulados muy
eficientes (HEPA) de acetato de celulosa (el filtro), en forma de placas rodeadas de arillo de
aluminio. Este sistema es bastante útil para quitar partículas tan pequeñas como de 0.3 μm. El aire
se hace pasar a través de varios de estos filtros al espacio cerrado, de manera que toda la masa de
aire se mueve con velocidad de diseño tanto verticales como horizontales, para limpiar habitaciones,
cabinas y campanas para siembras estériles o de seguridad.
117
Las cabinas de bioseguridad pueden ser desde el nivel 1 al 4, dependiendo de las necesidades
de cada laboratorio. También en ocasiones se necesita trabajar con virus o con bacterias anaerobias
que necesariamente deben estas en ausencia de oxígeno por lo que también existen campanas que
cuentan con un sistema de producción de anaerobiosis mediante la adición de CO2 ó de nitrógeno
para poder trabajar estas bacterias.
118
BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO

PRÁCTICA No. 27
Entre los microorganismos beneficiosos del suelo se encuentran aquellos capaces de convertir el
nitrógeno gaseoso del aire en "formas fijas de nitrógeno" utilizable para otras bacterias y plantas.
Sin este nitrógeno fijado muchas de las formas de nuestro planeta desaparecerían en un período de
tiempo relativamente corto.
Sin embargo el nitrógeno gaseoso solamente puede ser usado por un pequeño grupo de
microorganismos, siendo los más importantes Azotobacter un género de vida libre en el suelo y
Rhizobium que vive en simbiosis en los nódulos de algunas plantas.
Otros microorganismos semejantes a algas verde azul, bacterias fotosintéticas y algunas

especies de Clostridium poseen estas habilidades, pero contribuyen en forma insignificante a la
fijación del N2.
En este ejercicio se llevará a cabo la demostración de Rhizobium en los nódulos de las raíces de
leguminosas disponibles.
• Aislamiento y caracterización del genero Rhizobium sp.
Las bacterias del género Rhizobium se encuentran clasificadas dentro de la familia

Rhizobiaceas, orden Spirochaetales y comprende bacilos aerobios no esporulados, gram negativo,
de los cuales se han identificado seis especies: R. leguminosarium, variedad. phaseoli, R. trifolii, R.
meliloti, R. japonicum y R. lupini son fijadoras simbióticas de N2. En la última edición del Manual
de Bergey's 1984, del género Rhizobium se subdividió en dos grupos: Se ubicaron las bacterias de
crecimiento rápido (4-5 días) que producen acidez en el medio levadura-manitol, dentro del género
Rhizobium (R. phaseoli, T. trifoli, R. meliloti, R. leguminosarium) y las bacterias de crecimiento lento
(10 días) que producen alcalinidad en el mismo medio (R. japonicum y R. lupini). Sus dimensiones
oscilan entre 0.5-0.9 um, son organismos móviles, poseen flagelos de número y localización
variables, de acuerdo con la especie de que se trate. No utilizan el citrato. Se han dividido en dos
grupos diferentes según su origen bacteroides, término utilizado para referirse a la forma simbiótica
de la bacteria, la cual se encuentra dentro de los nódulos radicícolas. A las bacterias obtenidas por
cultivo in vitro se les designa simplemente como bacterias. Los bacteroides y las células
cultivadas presentan gránulos de polifosfato, mientras que estas últimas presentan únicamente
gránulos de poli-B-hidroxibutirato. En cultivos viejos son pleomórficas.
119
Las primeras cuatro especies mencionadas de Rhizobium crecen lentamente, en tiempos de

generación que van de 2-4 horas, formando colonias blancas de 2-3 mm de diámetro en 3-5 días en
medios conteniendo carbohidratos y forman material mucilaginoso. El resto de las especies crece
más lentamente dando colonias de más o menos 1mm de diámetro, más densas y pegajosas pero
menos mucilaginosas, entre 7 y 10 días a 28°C.
• MATERIALES
Cepas de Rhizobium sp.
Nódulos de planta leguminosa
Etanol al 95%
Agua estéril
Bisturí
Tubos de ensayo estériles
Agar ELMA (Extracto de Levadura Manitol Agar) con rojo congo.
Agar Citrato
Agar SIM
Negro Sudán B
Azul de metileno alcalino de Löeffer
Colorantes de Gram.
Varillas de vidrio estériles
• PROCEDIMIENTO
1. Seleccionar nódulos pequeños de la raíz, lavarlos con agua del chorro.
2. Esterilizar los nódulos introduciéndolos en etanol al 70% y agua estéril sucesivamente.
Repetir dos veces.
3. Con bisturí y pinzas estériles, en forma aséptica, corte los nódulos y seleccione para trabajar
aquellos que tengan una coloración rojiza o rosado, pues en ellos está activada la fijación del
nitrógeno.
4. Macere los nódulos en un tubo de ensayo estéril, con una varilla de vidrio también estéril,
hasta obtener un líquido lechoso.
5. Tome una asada del líquido anterior y siembre por estrías en cajas de Petri con agar ELMA.
6. Incube las cajas inoculadas de 26 a 28°C durante 3 a 10 días.
7. Observación y caracterización de los rizobios nodulares conocidos como ”bacteroides”:
a. Mezclar el líquido lechoso extraído de los nódulos con algunas gotas de agua destilada
estéril. Coloque una gota sobre un cubreobjetos y examinar en gota pendiente al
microscopio.
120
b. Prepare un frote, fije con etanol al 95% y tiña por Gram, observe al microscopio.
c. Prepare un frote, fije con etanol al 95% y tiña con azul de metileno alcalino de Loeffler
(de 5 a 10 minutos).
8. Después de la incubación seleccione colonias típicas, que serán acuosas, translúcidas u
opacas y blanquecinas o ligeramente rosadas (los contaminantes generalemente, toman
fuertemente el rojo congo).
9. A cada colonia sugestiva de Rhizobium sp. hacerle una tinción de Gram y gránulos de poli-
hidroxibutirato.
10. Observe al microscopio en busca de bacilos gram negativo.
11. Resiembre de una colonia aislada y pura en tubos en slant con el medio de agar ELMA-rojo
congo.
12. Inocule en medio citrato que se espera sea negativo para Rhizobium sp. y positivo para
Agrobacterium sp.
13. Inocule en agar SIM para observar movilidad, que es positivo para Rhizobium sp.
14. Observe y anote sus resultados.
NOTA: La presencia de coloración amarilla se debe a la producción de ácido de
Rhizobium en el crecimiento rápido.
• RESULTADOS
MORFOLOGÍA COLONIAL:_________________________________________________________-
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO:__________________________________________________________
REACCIÓN AL GRAM:_____________________________________________________________
MOVILIDAD:______________________________________________________________________
TINCIÓN DE GRÁNULOS METACROMÁTICOS:_________________________________________
PRUEBA DE CITRATO:_____________________________________________________________
CUESTIONARIO
1. Esquematice el Ciclo del N2 e incluya los procesos clave para procariotas del ciclo. (Cáp. 19,
Brock pág 655)
2. ¿Qué es la fijación del N2 y por qué es tan importante en la agricultura?
3. ¿Cómo se llama el proceso de NO3 →N2?
4. ¿En qué se diferencia la nitrificación de la desnitrificación?
5. Mencione las 6 etapas de la formación de nódulos (cáp. 19, pág 677, Brock)
6. ¿Cuál es la función de la Leghemoglobina?
121
7. ¿Qué porcentaje de las especies de plantas leguminosas pueden formar nódulos?

8. Realice un esquema de la bioquímica de la fijación del N2 en los nódulos?
9. ¿Cuál es la función de la nitrogenasa?
10. ¿Cuál es el primer producto que se forma en la fijación del N2?
122
AMONIFICACION DEL SUELO

PRACTICA No. 28
El nitrógeno en muchas plantas y animales existe en la forma de proteína. Cuando estos mueren
la proteína es degradada a aminoácidos, los que a su vez son desaminados liberando amonio. A
este proceso se le llama "amonificación". Muchas bacterias y plantas pueden asimilar amonio, lo que
constituye un importante paso en el ciclo del nitrógeno. La amonificación puede ser realizada por la
mayoría de plantas que se encuentra en el suelo, así como bacterias del género Nitrosomonas,
Nitrobacter, Pseudomonas, Proteus y Bacillus.
En esta práctica serán inoculadas suspensiones de suelo en agua peptonada, incubadas por
algunos días y luego examinadas para detectar la producción de amonio.
MATERIALES
Reactivo de Nessler's
Azul de Bromotimol
Portaobjetos limpio
Tubos con caldo o agua peptonada al 4%
Suelo rico de Jardín
Cultivos de 24 horas de Bacillus cereus, Pseudomona fluorescens y Proteus vulgaris
• PROCEDIMIENTO
1. Inocule 5 tubos de agua peptonada al 4% de la siguiente manera:
a. Uno con unas gotas de la suspensión de suelo al 20%.
b. Una asada de B. cereus.
c. Una asada de P. fluorescens.
d. Una asada de P. vulgaris.
e. El último agregue unas gotas de agua estéril (control).
2. Incube los tubos a temperatura ambiente durante 3 a 7 días.
3. Después de la incubación realice la prueba de amonio.
4. Deposite una gota del Reactivo de Nessler's en 5 portaobjetos diferentes.
5. Adicione una asada de los caldos inoculados:
a. Uno con unas gotas de la suspensión de suelo al 20% (crecimiento del suelo o
bien tubo inoculado con suelo de jardín).
b. Una asada de B. cereus.
c. Una asada de P. fluorescens.
123
d. Una asada de P. vulgaris.

e. El último agregue unas gotas de agua estéril (control).
INTERPRETACION: Una coloración amarillo pálido indica una pequeña cantidad de
amonio, un amarillo intenso indica una cantidad moderada de amonio y un precipitado café
indica una cantidad elevada de amonio.
Chequear el pH de los tubos tomando algunas asadas y depositándolas en portaobjetos

separados, adicione una gota de azul de bromotimol a cada uno y observe el viraje de color.
REPORTE:
A. Tabulación de resultados:
+ Amarillo pálido = presencia de amonio
++ Amarillo intenso = cantidad moderada de amonio
+++ Precipitado café = cantidad elevada de amonio
― No amonificación
CANTIDAD DE
pH
TIEMPO DE AMONIO
INCUBACIÓN Caldo Peptonado Caldo Peptonado
SUELO A B C D SUELO A B C D
3 días
4 días
7 días
A = Bacillus cereus; B = Pseudomonas fluorescens; C = Proteus
vulgarisD = Control
Interpretación de resultados:
124
APÉNDICE A
COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE MANUAL
ALBET (GRÁNULOS METACROMÁTICOS)

Solución A
Azul de toluidina ................................................................................ 0.15 g.

Verde de malaquita............................................................................. 0.20 g.
Ácido acético glacial............................................................................ 1.0 mL
Alcohol etílico al 95%......................................................................... 2.0 mL
Agua destilada.............................................................................. 100.00mL
1. Agregar 1mL de Ácido acético glacial a 100mL de agua destilada.
2. Disolver 0.15 g de Azul de toluidina y 0.20 g de verde de malaquita en 2mL de Alcohol al 75%,
triturando con un mortero.
3. Agregue la solución de ácido acético y mezcle.
Solución B
Yoduro de potasio........................................................................... 3.00 g.
Yodo.................................................................................................... 2.00 g.
Agua destilada.................................................................................... 300mL
1. Disuelva el yoduro de potasio en 5mL de agua destilada.
2. A la solución de yoduro agregue el yodo y disuélvalo por agitación.
3. Agregue el excedente de agua destilada y agite vigorosamente.
AZUL DE ALGODÓN (AZUL DE LACTOFENOL O ALGODÓN)

Azul de algodón.................................................................................. 0.05 g
Fenol................................................................................................... 20.0 g
Ácido láctico........................................................................................ 20 mL
Glicerina............................................................................................. 40 mL
Agua destilada.................................................................................... 40 mL
Disolver por calentamiento suave bajo chorro de agua caliente y añadir 0.05 g de azul de
lactofenol o azul de algodón.
125
AZUL DE METILENO (AAR)

Azul de Metileno.................................................................................0.30 mg
Agua destilada....................................................................................100 mL
1. Guarde en un frasco de vidrio tapado.
2. Filtre después de 24 horas.
AZUL DE METILENO (LOEFFLER)

Azul de metileno certificado.................................................................0.3 g
Alcohol etílico al 95%...........................................................................30 mL
Solución de Hidróxido de potasio al 10%............................................100 mL
Agua destilada ....................................................................................100 mL
1. Triture el azul de metileno con alcohol en un mortero.
2. Transfiéralo a un frasco.
3. Agregue el hidróxido de potasio al agua destilada y lave el mortero con la mezcla.
4. Ponga los lavados dentro del frasco, usando toda la mezcla.
5. Filtre con papel filtro después de 24 horas.
CARBOLFUCHSINA (KINYOUN)
Fuchsina básica........................................................................................ 4 g
Alcohol etílico al 95%............................................................................ 20 mL
Fenol........................................................................................................0.8 g
Agua destilada..................................................................................... 100 mL
1. Disuelva la fuchsina en alcohol etílico al 95%.
2. Disuelva el fenol en agua destilada.
3. Mezcle las dos soluciones.
CARBOLFUCHSINA (ZIEHL NEELSEN)
Solución A (Fuchsina básica alcohólica, solución saturada)

Fuchsina básica........................................................................................ 3 g
Alcohol etílico al 95%..........................................................................100 mL
Solución B (Fenol al 5%)

Fenol......................................................................................................... 3 g
Agua destilada.......................................................................................95 mL
1. Disuelva la fuchsina en alcohol por trituración dentro de un mortero (Solución A).
126
2. Disuelva el fenol en agua destilada (Solución B).

3. Para preparar CARBOLFUCHSINA, mezcle 10mL de Solución “A” con 90mL de Solución “B”.
CRISTAL VIOLETA (HUCKER)

Solución A
Cristal violeta............................................................................................ 2 g
Alcohol etílico al 95%................ ......................................... .................20 mL
Solución B
Oxalato de amonio................................................................................. 0.8 g
Agua destilada....................................................................... ...............80 mL
1. Disuelva el cristal violeta en el alcoholo etílico al 95% (Solución A).
2. Disuelva el oxalato de amonio en agua destilada (Solución B).
3. Mezcle la solución “A” y “B”, filtre en papel filtro después de 24 horas.
CRISTAL VIOLETA ALCALINO (KOPELOFF)

Solución A
Cristal violeta........................................................................................... 10 g
Alcohol etílico al 95%............................................................. ...........1000 mL
Solución B
NaHCO3................................................................................................. 0.8 g
Agua destilada...................................................................................1000 mL
1. Disuelva el cristal violeta en el alcoholo etílico al 95% (Solución A).
2. Disuelva el oxalato de amonio en agua destilada (Solución B).
3. Mezcle la solución “A” y “B”, filtre en papel filtro después de 24 horas.
TINCIÓN ARGÉNTICA (Coloración de Flagelos)

Reactivo “A” (Solución de Ácido Tánico)
Ácido tánico............................................................................................5.0 g
Cloruro férrico..........................................................................................1.5 g
Formalina al 15%..................................................................... ...........2.0 mL
Hidróxido de sodio al 1%........................................................... ..........1.0 mL
Agua destilada
Mezcle en un balón de 100mL los reactivos y afore hasta 100 mL con agua destilada.
127
Reactivo “B” (Solución Amoniacal de Nitrato de Plata)

Nitrato de Plata al 2%..........................................................................100 mL
NH4OH
1. De los 100mL de nitrato de plata separe y guarde 10mL.
2. A los 90mL restantes agregue Hidróxido de amonio hasta que se forme un precipitado pesado.
3. Con los 10mL de nitrato de plata guardados, titule hasta que persista un leve precipitado
nubloso.
4. Ajuste el pH a 10.0 con hidróxido de amonio y nitrato de plata.
5. NO USE DESPUÉS DE 4 HORAS DE PREPARACIÓN
SAFRANINA (GRAM: HUCKER)

Solución Stock
Safranina ...............................................................................................0.5 g
Alcohol etílico al 95%.........................................................................100 mL
SOLUCIÓN DE TRABAJO
Solución Stock.......................................................................................10 mL
Agua destilada 90mL
SAFRANINA (KOPELOFF)
Safranina ............................................................................................20 mL
Agua destilada.....................................................................................100 mL
1. Disuelva la safranina.
2. Adiciones el agua destilada.
3. Filtrar después de 24 horas de reposo.
VERDE DE MALAQUITA (BARTOLOMÉ Y MITTMER)

Verde de malaquita............................................................................... 7.6 g
Agua destilada.....................................................................................100 mL
1. Disolver los 7.6 g de Verde de malaquita en 100mL de agua destilada.

2. Filtra después de 24 horas de reposo.
VERDE DE MALAQUITA AL 5% (WIRTZ-CONKILN)

Verde de malaquita............................................................................... 5.0 g
Agua destilada ...............................................................................100 mL
128
1. Disolver los 5.0 g de Verde de malaquita en 100mL de agua destilada.

2. Filtra después de 24 horas de reposo.
COLORANTE AZUL DE BROMOTIMOL

Solución Stock
Azul de bromotimol 5.0g
Etanol 100ml
AGAR EXTRACTO DE LEVADURA Y MANITOL CON AZUL DE BROMOTIMOL.

Caldo manitol-levadura 1lt
Agar Agar 15g
Azul de bromotimol 5ml
Agregar 5ml de azul de bromotimol a 1 lt de agar manitol-levadura.
129
APÉNDICE B
❖ ALCOHOL ACETONA (HUCKER)

Acetona..................................................................................................10ml
Alcohol etílico al 95% ...........................................................................20 mL
❖ ALCOHOL ACETONA (KOPELOFF)

Acetona...............................................................................................300 mL
❖ ALCOHOL ACIDO (ZIEHL NEELSEN)

Ácido clorhídrico concentrado................................................................ 3 mL
❖ LUGOL (GRAM)
Yodo cristalizado....................................................................................... 1 g
Yoduro de potasio .................................................................................... 2 g
Agua destila........................................................................................300 mL
❖ REACTIVOS PARA REDUCCIÓN DE NITRATOS

Solución A
Ácido Sulfanílico........................................................................................ 8 g
Ácido acético 5N* .............................................................................1000 mL
* Ácido acético 5N: 1 parte de ácido acético glacial para 2.5 partes de agua destilada
Solución B
Naftilamina............................................................................................... 6 g
Ácido acético 5N*..............................................................................1000 mL
❖ REACTIVOS DE KOVACS
Alcohol amílico o isoamílico ...............................................................150 mL
p-dimetilaminobenzaldehído....................................................................10 g
HCl concentrado...................................................................................50 mL
1. Disuelva el p-dimetilamniobenzaldehído en el alcohol amílico o isoamílico.
2. Luego despacio agregue el ácido clorhídrico.
3. Cuando prepare grandes cantidades guárdelo en el refrigerador.
130
❖ REACTIVOS PARA ROJO DE METILO

Rojo de metilo....................................................................................... 0.1 g
Alcohol etílico al 95%.........................................................................300 mL
Agua destilada
1. Disolver en un balón de 500 mL el Rojo de metilo con el alcohol etílico al 95%.

2. Aforar con agua destilada.
❖ REACTIVOS PARA VOGES-PROSKAUER (MÉTODO DE BARRIT)

Solución A
Alfa-naftol..................................................................................................5 g
Alcohol etílico absoluto.......................................................................100 mL
Solución B
KOH........................................................................................................ 40 g
Agua destilada....................................................................................100 mL
❖ MEDIO Pai PARA EL GENERO Corinebacterium

Huevo 1000 mL
Agua destilada 500 mL
Glicerol 120 mL
Dextrosa (optativa) 5 gr
Mezclar los huevos con el agua. Filtrar con un trozo de gaza. Agregar el glicerol y la dextrosa.
Mezclar bien. Verter en los tubos aproximadamente 10mL. Autoclavear.
Nota: colocar en slant los tubos al momento de autoclavear.
131
REFERENCIAS
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leguminosarum biovar phaseoli en frijol común (Phaseolus vulfaris) cultivados en los
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28. Stainer, R. e al. (1970). The Microbial World. New Jersey: Englewood Cliffs Prentice Hall.
133

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MANUAL DE LABORATORIO MICROBIOLOGIA GENERAL

Un agradecimiento especial a todas las personas que han colaborado en la edición y

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

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Nombre: ______________________________________ Carnet: __________________

NORMAS BÁSICAS DE BIOSEGURIDAD MICROBIOLÓGICA

Actualmente, el modo de proceder de los trabajadores de un Laboratorio de Microbiología

Entre las reglas más importantes se pueden mencionar:

La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de manipulación a la que

1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

Deben cumplirse obligatoriamente en cualquier área del laboratorio.

1. El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado.

1. Si se tiene el cabello largo debe llevarlo recogido.

El lavado de manos es el factor fundamental en la prevención de enfermedades. Las manos son

Es imprescindible que se entienda la importancia de lavarse las manos correctamente. Se

¿Por qué lavarse las manos?

¿Cuándo lavarse las manos?

• Al llegar y antes de salir del trabajo.

Procedimiento para lavarse las manos

OMNIPRESENCIA DE LOS MICROORGANISMOS

Debido a la ubicuidad de los microorganismos es inevitable su presencia en el medio ambiente

Es importante tener presente que al trabajar en un laboratorio de microbiología es necesario,

4 cajas de Petri con 20mL de agar tripticasa soya

Utilice cualquiera de los siguientes procedimientos:

MARQUE CON UNA CRUZ EN EL ESPACIO CORRESPONDIENTE EL RESULTADO OBTENIDO

El microscopio es un dispositivo encargado de hacer visibles objetos muy pequeños; se puede

PARTES DEL MICROSCÓPIO ÓPTICO

INDICACIONES PARA EL BUEN USO DEL MICROSCOPIO

• Transporte: el microscopio debe transportarse firmemente, sujetándolo por el brazo; debe

Las siguientes reglas son importantes y deben observarse siempre:

• Mantenga ambos ojos abiertos aunque su microscopio sea monocular.

IMPORTANCIA DEL MICROSCOPIO

El microscopio es el elemento más importante en el laboratorio, ya que es la herramienta en la

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL MICROSCOPIO

MÉTODO DE PREPARACIÓN EN FRESCO:

Este tipo de preparación se utiliza para la observación de levaduras, protozoos, algas y la

MÉTODO DE LA PREPARACIÓN FIJA:

DEBE TENER PRECAUCIÓN DE NO ROMPER LA LÁMINA PORTAOBJETOS CON EL LENTE

Uno de los principales procedimientos para el estudio de los microorganismos consiste en la

Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía

Espirilos Espiroquetas Bacterias con apéndice

Bacterias Filamentosas Bacterias en forma de coma

• MANEJO ASÉPTICO DE MICROORGANISMOS

Después de realizar los frotes realizar el siguiente procedimiento:

Se observa al microscopio enfocando, inicialmente el preparado con el lente de menor

TINCIÓN DIFERENCIAL DE GRAM

En la tinción diferencial se emplea más de un colorante, ya sean juntos o separados, con el

Las dos coloraciones diferenciales de mayor importancia en la bacteriología son la de Gram y la

o MÉTODO 1: MODIFICACIÓN DE HUCKER

o MÉTODO 2: MODIFICACIÓN DE KOPELOFF

6. Decolore con la solución de alcohol acetona y lave inmediatamente con agua.

Cubrir el preparado con cristal violeta durante 1 min.

Lavar el preparado con agua

Cubrir el preparado con yodo de Gram durante 1 min.

Lavar el preparado con agua

Cubrir el preparado con alcohol al 95%

Lavar el preparado con agua

Cubrir el preparado con safranina durante 1 min.

Lavar el preparado con agua

Tarea: Traer el día de la práctica una fotografía a color de como se

TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE

Se ha demostrado que algunas bacterias contienen un alto porcentaje de sustancias lipídicas

Esta es una excelente coloración diferencial que es utilizada principalmente para la

Con carbolfucsina, las bacterias acidorresistentes se colorean de rojo brillante contra un

Nombre: ____________________ Carnet:

de oxígeno: _________ _ _ _______