DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

El microbioma regula el recuerdo del miedo dependiente de la amígdala

AE Hoban ,RM Stilling , G Moloney , F Shanahan , TG Dinan , G Clarke y JF Cryan
Psiquiatría molecular volumen 23, paginas1134 - 1144 ( 2018 ).

RESUMEN
La amígdala es una región clave del cerebro que participa de manera crítica en el procesamiento y la expresión de las señales
relacionadas con la ansiedad y el miedo. Paralelamente, un número creciente de estudios preclínicos y humanos han
implicado al microbioma-intestino-cerebro en la regulación de la ansiedad y las respuestas relacionadas con el estrés. Sin
embargo, el papel del microbioma en los comportamientos relacionados con el miedo no está claro. Con este fin,
investigamos la importancia del microbioma del huésped en las lecturas del comportamiento dependiente de la amígdala
utilizando el paradigma de condicionamiento del miedo indicado. También evaluamos los cambios en la transcripción
neuronal y la regulación postranscripcional en la amígdala de ratones libres de gérmenes (GF) ingenuos y estimulados,
utilizando un enfoque de perfil de transcriptoma en todo el genoma. Nuestros resultados revelan que los ratones GF muestran
una congelación reducida durante la prueba de retención de memoria con claves. Además,Fos , Egr2 , Fosb , Arco) así como
genes implicados en la actividad neuronal, la transmisión sináptica y el desarrollo del sistema nervioso. También encontramos
una interacción prevista entre el ARNm y los microARN específicos que están regulados diferencialmente en ratones
GF. Curiosamente, los ratones colonizados GF (ex-GF) eran comparables en comportamiento a los ratones criados
convencionalmente (CON). Juntos, nuestros datos demuestran una respuesta transcripcional única en animales GF,
probablemente debido a los niveles ya elevados de expresión génica temprana inmediata y la hiperactividad neuronal
potencialmente subyacente que a su vez prepara la amígdala para una respuesta transcripcional diferente. Por lo tanto,
demostramos lo que sabemos por primera vez que la presencia del microbioma del huésped es crucial para la respuesta
conductual adecuada durante la retención de la memoria dependiente de la amígdala.

INTRODUCCIÓN
La neurobiología del miedo implica críticamente a la amígdala como la estructura cerebral clave en los trastornos de
ansiedad. 1 , 2 , 3 , 4 Actualmente, nuestra comprensión de la fisiopatología molecular subyacente de tales trastornos no se
comprende bien, aunque se aprecia bien que la amígdala juega un papel clave en la adquisición y expresión de conductas
relacionadas con el miedo y la ansiedad. 5 , 6 Durante la última década, ha quedado claro que la microbiota intestinal del
huésped tiene la capacidad de alterar comportamientos relevantes para las respuestas de ansiedad y estrés 7 , 8 y de regular
cambios moleculares relevantes del sistema nervioso central a nivel transcripcional.9 , 10 Además, el uso de modelos
animales microbiota deficientes, tales como (GF) ratones o intestinales animales microbiota-agotado libres de gérmenes, ha
permitido una evaluación en profundidad del impacto de una ausencia de las bacterias intestinales en varios aspectos de la
fisiología del huésped 11 , 12 , incluido el cerebro y la conducta. 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 Se sabe que estos comportamientos
están controlados, al menos en parte, por la amígdala, una región del cerebro que participa de manera crítica en el
aprendizaje del miedo. 4 , 19 , 20. Recientemente, hemos demostrado que el transcriptoma de la amígdala en ratones GF
está ampliamente desregulado y muestra características de hiperactividad neuronal a nivel de expresión
génica. 21 Coincidiendo con estos hallazgos, los animales GF muestran un mayor volumen amigdalar con un aumento de la
densidad de la columna excitadora en los núcleos basolaterales, 22 lo que demuestra que la presencia del microbioma del
huésped regula de manera crítica la morfología y la programación transcripcional dentro de la amígdala. Los intentos por
comprender los mecanismos moleculares subyacentes de muchos trastornos psiquiátricos han centrado la atención en el
papel de los microARN (miARN) 23 que actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica. 24 , 25Se ha
demostrado que los candidatos a miARN específicos del cerebro dentro de la amígdala regulan los comportamientos
relacionados con la ansiedad y el miedo en ratones. 26 , 27 , 28 Sin embargo, hay escasez de información sobre si el
microbioma podría regular los comportamientos de miedo dependientes de la amígdala o modificar la expresión de miARN
en el sistema nervioso central. Con este fin, investigamos la memoria del miedo dependiente de la amígdala en GF y un
grupo adicional de ratones colonizados por GF (ex-GF). La manipulación del momento de la colonización en los animales
GF respalda aún más la importancia que tiene el microbioma durante las ventanas de tiempo del neurodesarrollo que son
cruciales para establecer respuestas de comportamiento normales en estos ratones. 14 , 29Usamos un paradigma modificado
de condicionamiento del miedo con claves en un entorno de 1 día para probar la hipótesis de que el microbioma regula los
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

comportamientos relacionados con el miedo de una manera dependiente de la amígdala. Para complementar esto,
investigamos, utilizando la secuenciación imparcial de ARN de todo el genoma del paisaje transcripcional y postranscripcional
en la amígdala de ratones GF ingenuos y después de la estimulación mediante un desafío de memoria basado en la
memoria. Nuestros datos descubrieron un papel no descrito hasta ahora del microbioma en la regulación de la memoria del
miedo en ratones GF.

MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se obtuvieron parejas reproductoras C57BL / 6J GF y criadas convencionalmente (CON) de Taconic (Germantown, NY, EE.
UU.) Con descendientes de la generación F 1 utilizados en todos los experimentos. Los ratones macho GF se alojaron en
aisladores de película flexible gnotobióticos (2-4 ratones por jaula) mantenidos en un estricto ciclo de luz / oscuridad de 12
h. Los ratones ex-GF se criaron inicialmente dentro de los aisladores GF hasta el día 21 después del nacimiento, cuando se
retiraron y se alojaron en una unidad animal estándar junto a los ratones CON para permitir una colonización eficiente por
microbios ambientales. 30 , 31Los ratones ex-GF se pusieron inicialmente en jaulas limpias con ropa de cama sucia de CON,
ya que los ratones son coprofágicos, esto permitirá una colonización eficiente. Los ratones CON macho se alojaron en
condiciones controladas con temperatura regulada (20-21 ° C) y humedad (55-60%) con ratones 2-4 por jaula en el mismo
ciclo de luz / oscuridad de 12 h que los ratones GF y en la misma jaula tipo. Todos los ratones, CON, GF y ex-GF recibieron
la misma dieta granulada esterilizada en autoclave (Special Diet Services, código de producto 801010, Essex, Reino Unido)
hasta ∼10 semanas de vida cuando se extrajo el tejido. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Directiva
Europea 86/609 / EEC. Se obtuvo la aprobación del Comité de Ética de Experimentación Animal de la Autoridad Reguladora
de Productos Sanitarios y de Corcho (HPRA) del University College antes del comienzo de todos los experimentos
relacionados con animales. Tanto la instalación convencional como la libre de gérmenes se adhieren a las mismas pautas
de cuidado animal en términos de temperatura, humedad y niveles de ruido.

Diseño experimental
En este estudio se utilizaron dos cohortes de ratones machos CON, GF y ex-GF. La cohorte 1 se utilizó para investigar el
impacto del estado de GF en los comportamientos dependientes de la amígdala utilizando un paradigma modificado de
condicionamiento de miedo con claves de 1 día ( n = 13-15 / grupo; Figura 1a ). Además, investigamos el impacto de la
colonización de la microbiota en las primeras etapas de la vida en los comportamientos relacionados con el miedo. La cohorte
2 se utilizó para confirmar el déficit de retención de la memoria y evaluar el cebado y los cambios de la expresión génica
utilizando animales CON y GF condicionados por miedo e ingenuos 1 h después de un estímulo de miedo indicado 26 , 32 ( n =
5-12 / grupo; Figura 2 ). Los ratones de la cohorte 2 CON y GF se sacrificaron 1 h después del estímulo de retención del
miedo.

Acondicionamiento de miedo indicado

Para completar el protocolo de prueba lo más rápido posible, una vez que se retiraron los animales de los aisladores, se
utilizó un condicionamiento de miedo modificado de 1 día. Este fue adaptado del protocolo de Izquierdo et
al. 33 Consulte Materiales y métodos suplementarios para obtener detalles completos del protocolo adaptado de
condicionamiento del miedo con claves.

Extracción de amígdala y ARN

Se congelaron instantáneamente mitades enteras de cerebro de ratón en isopentano sobre hielo seco y se almacenaron a -
80ºC. El tejido se colocó en un criostato y se dejó que alcanzara -20ºC. Se utilizó una matriz de cerebro de ratón adulto
estándar y se tomaron cortes de cerebro de 1 mm de grosor. Uso de la técnica del puñetazo de Palkovits 34y un atlas de
ratón estándar como guía, se tomaron punciones de tejido de amígdala completo (1 punción por ratón, aproximadamente
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

bregma 1,82 mm). Los punzones de amígdala se almacenaron en RNAlater (Sigma-Aldrich, Wicklow, Irlanda) durante 24 h,
se retiraron y el tejido se almacenó nuevamente a -80 ° C hasta la extracción. Siguiendo el protocolo del fabricante, se utilizó
un kit de miARN mirVana (Ambion / Life Technologies, Dublín, Irlanda) para extraer el ARN total de todos los animales. Se
utilizó un Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, Reino Unido) para determinar la concentración de ARN. Solo se enviaron
muestras libres de gérmenes y convencionales, tanto ingenuas como condicionadas por miedo, para la secuenciación de
próxima generación de Illumina (Exiqon, Vedbæk, Dinamarca). Se combinó el ARN (excepto para GF-n, n= 5 después de la
extracción de ARN) dentro de cada grupo mediante la combinación de cantidades iguales de ARN de dos animales, lo que
da como resultado un grupo de muestra final de cuatro (excepto CON-n, n = 3 y GF-n, GF-fc y CON-fc, n = 4 / grupo después
de la puesta en común). La Figura 2 muestra grupos experimentales y describe la combinación de ARN antes de la
secuenciación.

Secuenciación de ARNm
La secuenciación fue realizada por Exiqon en NextSeq500 con un promedio de 50 millones de lecturas con una longitud de
lectura de un solo extremo de 50 pb. El genoma de referencia de las secuencias obtenidas se realizó utilizando la anotación
de referencia: Mus musculus (organismo), GRCm38, UCSC (Universidad de California, Santa Cruz) Navegador del genoma
(genoma de referencia) y Ensemble (Anotación de referencia). Para obtener detalles completos, consulte Materiales y
métodos complementarios .

Expresión diferencial de genes y análisis de enriquecimiento de términos GO

El análisis de datos realizado por Exiqon es el siguiente
El proceso de análisis de datos se basa en el paquete de software Tuxedo que combina software de código abierto e
implementa métodos estadísticos revisados por pares. Como complemento a esto, Exiqon emplea software especializado
desarrollado internamente para interpretar y mejorar la legibilidad de los resultados finales. Los componentes de la próxima
generación de tubería de ARN-secuenciación incluyen Bowtie2 (v.2.2.2), Tophat (v2.0.11)
y Gemelos (v2.2.1). Brevemente, Tophat se usa para alinear las lecturas de secuenciación con el genoma de referencia
(GRCm38, navegador UCSC Genome y Ensemble (referencia de anotación)). Gemelos toma los resultados de la alineación
para ensamblar la secuencia alineada en transcripciones, construyendo un mapa del transcriptoma.Gemelos ensambla
lecturas alineadas en diferentes isoformas de transcripción según el uso del exón y también determina los sitios de inicio de
la transcripción. Para la comparación de grupos, Cufflinks se usa para calcular el FPKM (número de fragmentos por kilobase
por millón de fragmentos mapeados) y pruebas de expresión diferencial y regulación entre las transcripciones ensambladas
en las muestras enviadas utilizando la salida de Cufflinks . El análisis de expresión diferencial se realiza en el paquete de
software estadístico EdgeR (Bioconductor, http://www.bioconductor.org/ ). Un valor P ajustado de ⩽ 0,1 (método de
Benjamini-Hochberg) 21 , 35se consideró significativamente regulado diferencialmente. Los genes expresados
diferencialmente se analizaron luego para el enriquecimiento de términos de Ontología Genética (GO) utilizando DAVID
Bioinformatics Resources (v6.8). 36

Secuenciación de microARN
Para obtener detalles completos de la secuenciación de miARN en ratones CON y GF y la interacción predicha con ARNm
desregulado, consulte Materiales y métodos suplementarios .

Estadísticas
Acondicionamiento del miedo
Se analizaron los efectos del estado de GF sobre la congelación durante el comportamiento de condicionamiento de miedo
indicado mediante el análisis de varianza de medidas repetidas de dos vías para el bloqueo de prueba en el caso de extinción
y las respectivas comparaciones post hoc . El bloque de prueba 1 también se separó y se analizó para detectar déficits en la
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

retención. Se realizó un análisis de varianza unidireccional con el post hoc de Tukey sobre los datos de retención del
miedo. Se realizó una comparación de los bloques de prueba 1 y 2 y 1 y 3 para determinar la presencia de aprendizaje de
extinción.

secuenciación de ARNm
El análisis de expresión diferencial para la secuenciación de ARN se realiza en el paquete de software estadístico EdgeR
(Bioconductor, http://www.bioconductor.org/ ). Un valor de P ajustado de ⩽ 0,1 ( P adj , método de Benjamini-Hochberg) se
consideró regulado de manera significativamente diferencial según los datos de secuenciación publicados
anteriormente. 21 , 37 Un límite de tasa de descubrimiento falso de P adj <0,1 se usa comúnmente en estudios de
transcriptoma completo; utilizando el paquete DESeq2, es la configuración predeterminada en esta canalización de
análisis. 35Para resaltar aún más la consistencia de nuestros datos y probar la posible confusión estadística, también hemos
analizado nuestros datos utilizando un límite aún más estricto de P adj <0,05 ( Figura complementaria 3 ).

RESULTADOS

Acondicionamiento de miedo con señales de un día en ratones CON

Establecimos con éxito un protocolo de acondicionamiento del miedo de 1 día adaptado de Izquierdo et al. 33 Esto fue
necesario debido a las limitaciones logísticas y prácticas de las instalaciones de GF y para reducir el potencial de
colonización. Sometimos ratones CON a condicionamiento de miedo con señales, ya sea 2 o 3 pares de estímulo
condicionado / estímulo no condicionado ( Figura suplementaria 1a ). Después de un retraso de 6 h, todos los ratones fueron
sometidos a ensayos de retención / extinción del miedo. Ambos grupos de ratones pudieron aprender la asociación entre el
estímulo condicionado y el estímulo no condicionado y mostrar la retención de la memoria a las presentaciones de tono en
un entorno de 1 día. La respuesta de congelación fue cuantitativamente algo menor en nuestros ratones CON en comparación
con estudios previos en esta cepa; 33sin embargo, el retraso de 6 h fue suficiente para permitir la consolidación de la memoria
y la posterior expresión del condicionamiento al tono ( Figuras complementarias 1b yc ). Examinando los bloques de prueba
individuales (cada bloque compuesto por 5 tonos en ausencia de choque en el pie), mostraron una congelación reducida
(extinción) de los bloques de prueba 1 a 2 ( Figura complementaria 1d ).

Los ratones GF muestran una congelación reducida en la prueba de retención y extinción

No se observaron diferencias en la adquisición entre los tres grupos experimentales durante el acondicionamiento al tono
( Figura 1b ). Cuando se desafió 6 h después de la adquisición, los ratones GF mostraron un porcentaje reducido de
congelación durante la retención (F (2,42) = 1.3028, P <0,0001) y las pruebas de extinción (bloques de prueba 1-5)
(alojamiento, F (2,32) = 34.08 , P <0,0001 y bloques de prueba, F (7,32) = 3,222, P <0,01) en comparación con ratones CON
( Figuras 1c yd ). Los ratones ex-GF durante el primer bloque de prueba inicial (retención de miedo) fueron indistinguibles de
los ratones CON (69,30 ± 2,957 frente a 59,76 ± 4,021, media ± sem; Figura 1c ). Sin embargo, al igual que los ratones GF,
mostraron un porcentaje reducido de congelación durante los bloques de prueba 5 y 8 ( Figura 1d). Cuando los ratones se
volvieron a colocar en el contexto de la condición inicial, mostraron un porcentaje mínimo de congelación en el contexto sin
diferencias observadas entre los grupos ( Figura 1e ). La cohorte 2 replicó nuevamente nuestro hallazgo con animales GF
que mostraron un porcentaje reducido de congelación al tono durante la prueba de retención (F (2,26) = 4.913, P = 0.0163)
sin diferencias estadísticamente significativas en la adquisición entre los grupos (Interacción, F (4,66 ) = 1.0941, P = 0.1139)
( Figuras complementarias 2a yb ). Nuevamente, los ratones ex-GF mostraron una congelación comparable a los ratones
CON tanto durante las pruebas de adquisición como de retención ( Figuras complementarias 2a yb). Además, los ratones
CON y ex-GF mostraron una congelación reducida de los bloques de prueba 1 a 3, lo que indica la extinción de la asociación
de estímulo condicionado / estímulo incondicionado; sin embargo, este efecto no estuvo presente en ratones
GF. Curiosamente, en nuestra cohorte de validación de condicionamiento de miedo de 1 día ( Figura suplementaria 1c ) hubo
una extinción más rápida en ratones CON que en la cohorte de prueba ( Figura 1 ), pero ambas cohortes de ratones CON
muestran una congelación reducida por el bloque de prueba 3 durante la prueba de extinción.
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

Enriquecimiento de genes relacionados con la transmisión neuronal y el desarrollo del sistema nervioso en la
amígdala de ratones no tratados previamente con GF
Realizamos una secuenciación profunda imparcial de ARNm en la amígdala de ratones GF y CON ingenuos y condicionados
por miedo. Al analizar la expresión génica entre los cuatro grupos mediante comparaciones por pares, encontramos una
serie de genes regulados diferencialmente en todos los grupos al comparar ratones ingenuos con ratones estimulados (CON-
n vs CON-fc (270) y GF-n vs GF-fc (93) ; Figura 3a y Tabla complementaria 1 ). Primero, en comparación entre ratones CON-
n y GF-n ingenuos, vemos un total de 133 genes que se alterarán debido al estado libre de gérmenes que se pueden
descomponer aún más en 85 genes regulados positivamente y 48 regulados negativamente ( Figuras 3a y b y la Tabla
suplementaria 1). A continuación, investigamos las funciones biológicas vinculadas a los genes expresados
diferencialmente. El análisis GO de genes regulados al alza (CON-n frente a GF-n) muestra una sobrerrepresentación
significativa de genes tanto para procesos biológicos como para categorías de compartimentos celulares ( Figuras 3c
yd ). Específicamente, encontramos enriquecimiento en términos de GO como transmisión sináptica, transmisión colinérgica,
desarrollo del sistema nervioso y neurogénesis ( Figura 3c ). Además, vemos una serie de genes de respuesta temprana
inmediata ( Fos , Fosb , Egr2 , Arc y Nr4a1 ) y genes implicados en la neurotransmisión ( Drd2 , Syt2 , Chaty Adora2a ) para
ser regulado positivamente en ratones GF sin tratamiento previo, en línea con nuestro hallazgo anterior que indica
hiperactividad en la amígdala de ratones sin tratamiento previo con GF. 21 Para investigar más a fondo este posible estado
hiperactivo presente en la amígdala GF ingenua, comparamos genes regulados diferencialmente en condiciones ingenuas
(CON-n vs GF-n) con genes que están regulados diferencialmente en la prueba de retención del miedo en condiciones de
control (CON-n vs CON-fc) ( Figura 3e ). Observamos la regulación positiva o negativa común de 11 genes y 21 genes,
respectivamente, en ambas comparaciones. Curiosamente, los genes superpuestos que se superponen también incluyen
varios genes tempranos inmediatos como Fos , Fosb y Egr2. Por lo tanto, una proporción significativa de genes ( P < 1,6-
13 para genes regulados positivamente, P < 2,3-27 para genes regulados negativamente) regulados diferencialmente entre

ratones CON y GF son genes que se inducen necesariamente durante la retención de la memoria del miedo. Esto sugiere
además una actividad neuronal elevada en la amígdala en animales GF vírgenes, mientras que no se observó un
enriquecimiento significativo en términos de GO entre los genes regulados negativamente en ratones GF-n.

Respuesta transcripcional única al estímulo de retención de miedo en ratones CON y GF

Encontramos varios genes regulados diferencialmente tanto en CON-fc como en GF-fc 1 h después de la prueba de retención
en comparación con sus contrapartes no condicionadas ( Figuras 4a yc ). Hubo muy poca superposición entre los ratones
CON-fc y GF-fc (11 regulados por disminución y 1 regulado por aumento) después de la retención del miedo
( Col8a2 , Lbp , Thbs4 , Capn11 , Rp17a , Foxj1 , Dnahc6 , Aqp1 , Hbb-1b , Dynlrb2 y Ccdc135 ; Figura 4c). Los 185 genes
regulados positivamente y 68 genes regulados negativamente fueron exclusivos de los ratones CON-fc después de la
retención del miedo, con 58 y 15 genes regulados positivamente y disminuyendo únicos en ratones acondicionados con GF-
fc respectivamente ( Figuras 4a-c ). En general, observamos que los ratones CON-fc y GF-fc responden de manera diferente
a las pruebas de retención en el nivel de expresión génica en la amígdala. A continuación, para investigar la respuesta celular
que estaba ocurriendo en ratones CON-fc, realizamos un análisis de GO en los 185 genes regulados a la baja que eran
exclusivos de los ratones CON-fc que no estaban alterados en los ratones GF-fc después de las pruebas de
retención. Encontramos una sobrerrepresentación significativa de genes asociados con términos GO como desarrollo de
oligodendrocitos, desarrollo de células gliales y mielinización ( Sox10 , Sox9 , Aspa, Plp1 , Tlr4 , Id4, Trp73 , Fa2h ; Figura
4d ). Sin embargo, algunos de estos genes también se asociaron con procesos biológicos como el desarrollo de las glándulas
( Sox10 , Sox9 , Id4 y Fa2h ). No encontramos ningún enriquecimiento significativo en genes regulados por incremento
exclusivo de ratones condicionados por miedo CON-fc. El enriquecimiento en los 58 genes regulados por disminución
exclusivos de los ratones GF-fc mostró un enriquecimiento significativo en muchos términos de GO en respuesta a las
hormonas esteroides, la falta de nutrientes, la estimulación hormonal y la señalización mediada por hormonas ( Figura
4e). Además, varios genes (22, no se muestra la superposición) que estaban regulados al alza en CON-n vsGF-n ahora
estaban regulados a la baja en GF-n frente a GF-fc (por ejemplo, Nr4a1 , Crh , Fosl2 , Gabre y Chrna2 ).
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

Enriquecimiento funcional e interacción prevista con miARN y ARNm desregulados en ratones GF-n
Encontramos mediante comparación por pares un total de 13 miARN, 7 regulados por incremento y 6 regulados por
disminución, en ratones GF-n en comparación con CON-n ( Figura 5a ). El perfil de expresión de los miARN en GF-n en
comparación con CON-n se representa en la Tabla complementaria 2 . Todos los miARN regulados positivamente tienen un
cambio de veces> 1,4 con una fuerte reducción de los miARN regulados negativamente ( Tabla complementaria 2 ). Cuadro
complementario 3muestra la interacción predicha de miRNA / mRNA alterada (tanto regulada hacia arriba como hacia abajo)
con mRNA desregulados en ratones GF-n. A medida que nuestra secuenciación de ARNm reveló entre el gen regulado
positivamente un enriquecimiento orquestado para los términos de GO para la transmisión sináptica, la cognición, la
transmisión colinérgica, el desarrollo del sistema nervioso y la neurogénesis, investigamos si alguno de nuestros miARN ha
predicho objetivos que están enriquecidos para dichos términos de GO. Como solo nuestros ARNm regulados al alza
mostraron un enriquecimiento significativo, enumeramos todos los objetivos predicados (presentes en 3 algoritmos de
predicción) de miARN regulados a la baja en ratones GF-n ( Figura 5b) y realizó un análisis de enriquecimiento de GO. Luego
superpusimos términos GO significativos de nuestra secuenciación de ARNm con términos GO significativos de nuestro
enriquecimiento previsto de miARN objetivo. Encontramos que miR-211-5p, miR-204-5p y miR-200b-3p mostraban un
enriquecimiento significativo para los términos GO seleccionados que se solapaban con los de la secuenciación de ARNm
( Figuras 5c yd ). La Tabla complementaria 3 indica a cuál de nuestros ARNm desregulados observados en ratones GF-n se
prevé que se dirijan estos miARN.

Respuesta de miARN única al estímulo de retención de miedo en ratones CON y GF con interacción prevista con
ARNm desregulados
Encontramos una serie de miARN regulados diferencialmente después de la prueba de retención tanto en GF-fc como en
CON-fc en comparación con las contrapartes no condicionadas respectivamente ( Tablas complementarias 4 y 5 ). Los
ratones CON-fc después de la prueba de retención del miedo habían alterado la expresión de 25 miARN (7 regulados al alza
y 18 regulados a la baja; Figura 5e y Tabla complementaria 4 ). Después de la retención, los ratones GF-fc tenían 7 miARN
alterados en la amígdala (2 regulados hacia arriba y 5 regulados hacia abajo; Figura 5e y Tabla complementaria 5 ). miR-
34b-5p, miR-34c-5p y miR-34b-3p fueron regulados negativamente en ratones CON-fc y GF-fc ( Figura 5e). Los restantes
miARN regulados diferencialmente eran exclusivos de CON-fc y GF-fc. Nuevamente, enumeramos los objetivos de ARNm
predichos de miARN regulados diferencialmente entre CON-n y CON-fc y GF-n y GF-fc y los superpusimos con ARNm
regulados hacia arriba o hacia abajo para identificar los posibles objetivos relevantes de estos miARN ( Tablas
complementarias 6 y 7 ).

DISCUSIÓN

Un creciente cuerpo de literatura implicaba al microbioma huésped en el cerebro y el comportamiento. Aquí mostramos, por
lo que sabemos por primera vez, que el microbioma regula el condicionamiento del miedo dependiente de la amígdala en
ratones GF. Descubrimos que después del entrenamiento, los animales GF mostraron una congelación reducida al estímulo
condicionado indicativo de un recuerdo de la memoria con claves deteriorada. Por lo tanto, parece que los animales GF
fueron incapaces de retener la asociación entre tono y choque en el mismo grado que los ratones CON. La exposición a
microbios ambientales pareció revertir el déficit en la retención de memoria que muestran los ratones GF. Estudios de
colonización previos han demostrado la normalización de los fenotipos conductuales relacionados con la reducción de la
ansiedad, 14 déficits sociales 29 y la actividad del eje hipotalámico-pituitario-adrenal. 38Con respecto a la extinción, hay
evidencia de una congelación reducida durante los 3 bloques iniciales de prueba en ratones CON, pero esto no fue evidente
en los animales GF. La falta de extinción no se puede desenredar fácilmente de los déficits en la retención en ratones GF y
puede ser una consecuencia de la respuesta de congelación inducida por memoria reducida en estos ratones. Además, vale
la pena señalar que los ratones GF muestran comportamientos reducidos relacionados con la ansiedad en una variedad de
tareas de acercamiento-evitación. 13 , 14 , 39 Por lo tanto, la contribución relativa de esta respuesta de ansiedad reducida a
las diferencias observadas en el condicionamiento del miedo indicado no está clara, aunque vale la pena señalar que la base
neurobiológica del miedo aprendido y las respuestas de ansiedad etológica en tales paradigmas de roedores son bastante
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

distintas.40 , 41 , 42 Además, no vimos una diferencia en la respuesta de congelación durante el entrenamiento de adquisición
entre los grupos. Además, los estudios futuros deberían investigar el papel del eje disfuncional hipotalámico-pituitario-
suprarrenal evidente en los animales GF 38 en potencialmente impulsar la respuesta alterada al condicionamiento del miedo
dada la relación entre las hormonas del estrés como los glucocorticoides y la formación de la memoria. 43 , 44

Acompañando a este deterioro en el recuerdo de la memoria del miedo hubo una remodelación marcada del paisaje
transcripcional en la amígdala de los ratones GF-n en comparación con los ratones CON-n. El análisis en profundidad de los
genes regulados diferencialmente en la amígdala demuestra un marcado aumento en la expresión de genes inmediatos-
tempranos y genes implicados en la transmisión sináptica con enriquecimiento específico para genes implicados en la
transmisión colinérgica. Entre otros, encontramos un aumento en Fos , Fosb , Egr2 y Arc en ratones GF-n, en línea con
nuestro hallazgo anterior que indica una regulación positiva orquestada de estos genes en la amígdala de ratones GF
ingenuos. 21Vale la pena señalar que estos hallazgos son consistentemente independientes de la genética / cepa del
huésped y el método de aislamiento de tejidos y están más relacionados con el modelo animal deficiente en microbiota
utilizado en ambos estudios. La activación de los genes de respuesta temprana inmediata y la activación de CREB, que es
esencial para la expresión de genes neuronales impulsada por la actividad, están marcadamente reguladas en la amígdala
después de la novedad social y la recuperación de la memoria del miedo. 21 , 45 Nuestros datos confirman esta observación
típica ya que los ratones CON-fc muestran una mayor expresión de genes inmediatos-tempranos, por
ejemplo, Fos , Fosb y Erg2, lo que indica que el recuerdo de la memoria de miedo inducido induce la activación de estos
genes de respuesta temprana en la amígdala de ratones CON. De hecho, se ha demostrado previamente que
la regulación positiva de estos genes típicos (por ejemplo, Fos , Nr4a1 , Egr1 ) sigue la recuperación de la memoria con
claves. 46

El aumento de la actividad neuronal de la amígdala en ratones GF-n se sugiere además por la regulación positiva específica
de genes relacionados con la neurotransmisión colinérgica y dopaminérgica ( Drd2 , Adora2a , Tac1 , Chrnra2 y Chat ) que
se ha demostrado que son fundamentales para muchos aspectos de la amígdala. -aprendizaje condicionado dependiente y
extinción. 47 , 48 Muchos de estos genes contribuyen adicionalmente al enriquecimiento de términos GO como desarrollo del
sistema nervioso, neurogénesis y desarrollo celular con aumentos específicos en genes como el receptor del factor de
crecimiento nervioso ( Ngfr ) y el factor de crecimiento temprano 1 y 2 ( Egr1 , Egr2), con este último previamente demostrado
para regular el condicionamiento de la memoria del miedo. 49 , 50 Juntos, estos datos sugieren que el circuito amigdalar de
los ratones GF al inicio del estudio se encuentra en un estado hiperactivo, que se origina potencialmente a partir de la
señalización microglial alterada durante las fases críticas del neurodesarrollo. 51 , 52 Curiosamente, no encontramos
superposición en genes regulados diferencialmente cuando comparamos nuestros hallazgos actuales con los de un estudio
anterior que investigó cambios en la expresión génica en otras regiones del cerebro (hipocampo, cuerpo estriado y corteza
frontal) de ratones GF utilizando microarrays basados en hibridación. tecnología. dieciséisA pesar del uso de diferentes
regiones del cerebro, muchos de los genes observados en ambos estudios están asociados con varios procesos neuronales
comunes, como la transmisión sináptica y el desarrollo del sistema nervioso. Sin embargo, no vemos similitudes a nivel de
genes individuales, lo que sugiere que la expresión de genes en diferentes regiones del cerebro se ve afectada de manera
diferencial por la microbiota. A continuación, probamos si este cebado diferencial de la línea base de la amígdala en ratones
GF se traduciría en patrones de expresión génica diferencial en respuesta a un estímulo de recuerdo. Sorprendentemente,
existió una superposición mínima entre las comparaciones y se presentaron grandes diferencias en la expresión génica en
respuesta a la prueba de retención entre los ratones CON-fc y GF-fc en comparación con sus contrapartes ingenuas y no
condicionadas (CON-n y GF-n; Figura 4c ). Aunque vimos el aumento esperado en la expresión de los genes tempranos
inmediatos Fos , Fosb y Egr2, que indica la activación de la amígdala después de la retención del miedo en ratones CON-fc,
no se observó un aumento comparable en la expresión de estos genes en los animales GF-fc. Esto sugiere que las vías de
señalización celular alteradas están asociadas con una retención de memoria deteriorada en los animales GF. Este patrón
de respuesta único se debe probablemente a los niveles ya elevados de expresión génica inmediata-temprana en animales
GF sin experiencia y a la hiperactividad neuronal potencialmente subyacente que a su vez prepara la amígdala para una
respuesta transcripcional diferente. De hecho, varios genes que estaban regulados positivamente en ratones GF-n en
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

comparación con CON-n (por ejemplo, Nr4a1 , Crh , Gabre y Fosl2) y que contribuyeron al enriquecimiento en el aumento
de genes relacionados con la transmisión sináptica fueron regulados a la baja después de la retención del miedo. Los ratones
GF-fc tenían una expresión disminuida de Nr4a1 y Nr4a3, que son una clase de factores de transcripción de receptores
nucleares que son importantes para la formación de la memoria duradera, ya que el bloqueo de estos receptores afecta la
memoria a largo plazo pero no a corto plazo en el hipocampo 53 y se regulan positivamente siguiendo un condicionamiento
de miedo contextual y con indicaciones. 46 , 53 El escrutinio adicional de genes regulados por disminución exclusivos de los
ratones GF-fc muestra una disminución en muchas vías relacionadas con la actividad y factores de transcripción que
respaldan aún más que la amígdala GF-n está preparada para una respuesta transcripcional diferente a la retención del
miedo. La investigación de nuestro grupo ha demostrado previamente que existe una marcada expansión volumétrica en la
amígdala de los ratones GF. 22 Además, los animales GF del núcleo de la amígdala basolateral mostraron una mayor
densidad de la columna, específicamente en las espinas de los hongos, que son críticas para la formación de sinapsis
glutamatérgicas. 54 Esto sugiere que estas células reciben más estímulos excitadores. 22Aunque nuestro estudio
transcriptómico no es exclusivo de la amígdala basolateral, la hiperactividad en este núcleo específico puede ser la base de
la incapacidad para regular la retención de la memoria del miedo o en muchas respuestas conductuales que dependen de
esta región del cerebro. La alteración de la memoria del miedo con señales está menos caracterizada en modelos animales
de trastorno del espectro autista. Los déficits en el comportamiento social se observan con mayor frecuencia en los modelos
de trastornos del espectro autista, y esto también es una característica del fenotipo GF. 29 , 55 , 56 El modelo de ácido
valproico del trastorno del espectro autista también mostró un aumento del volumen de la amígdala 57 con evidencia de
hiperactividad. 58En este modelo, la descendencia de madres expuestas al ácido valproico durante la gestación muestra una
mayor retención de la memoria con evidencia de un mayor miedo, ya que las ratas expuestas al ácido valproico no pudieron
extinguir la memoria del miedo con señales. 58 Esto podría estar relacionado con el aumento de ansiedad que muestran
estos animales, aunque este modelo también se asocia con alteraciones del microbioma. 59 Claramente, la hiperactividad
de la amígdala y la remodelación dramática del paisaje dendrítico pueden tener efectos perjudiciales sobre la memoria
dependiente de la amígdala.

El hallazgo más singular y sorprendente en nuestra secuenciación de ARN fue en relación con el impacto de la prueba de
retención en el gen regulado negativamente en la amígdala de ratones CON-fc. Encontramos un enriquecimiento significativo
de genes relacionados con la diferenciación y mielinización de oligodendrocitos y disminuciones específicas de factores de
transcripción críticos ( Sox9 y Sox10 ), enzimas codificadoras de genes responsables de la biosíntesis de esfinogolípidos de
la vaina de mielina ( Ugt8a ). Sin embargo, solo encontramos cambios en una estructura de mielina, Plp1 . 60 , 61 Existe una
creciente evidencia de una relación entre el microbioma y los patrones de mielinización cerebral. 37 , 58 , 62Se requiere más
trabajo para investigar si este tipo de estímulo podría corresponder con la desmielinización en la amígdala, pero debe tenerse
en cuenta que esto fue exclusivo de los ratones CON-fc. No se observó la misma regulación descendente orquestada de
genes relacionados con la mielina en ratones GF-fc después del estímulo de retención. Aunque otras estrategias de
manipulación mediadas por la microbiota han investigado el condicionamiento del miedo indicado en roedores, hasta donde
sabemos, esta es la primera demostración de tal déficit de comportamiento en ratones GF. De acuerdo con esto, la
administración crónica de probióticos de L. actobacillus rhamnosus resultó en un aumento de la congelación durante el
recuerdo de la memoria con claves. 63El trasplante de microbiota fecal de ratones con una dieta alta en grasas a donantes
con microbiota agotada muestra una disminución significativa en los comportamientos de congelación cuando se evaluó la
retención de memoria indicada en comparación con los ratones que recibieron microbiota en forma de donantes de alimentos
de dieta de control. Los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tuvieron alteraciones significativas en la
composición de su microbiota, y cuando se transfirió a un ratón donante, resultó en un deterioro de la memoria dependiente
de la amígdala. 64 Juntos, estos datos demuestran que los cambios a nivel de la composición de la microbiota intestinal
pueden afectar drásticamente el aprendizaje dependiente de la amígdala. Como estudios anteriores han demostrado la
participación de los miARN en el estrés dependiente de la amígdala y las salidas relacionadas con el miedo, 21 , 65 , 66A
continuación, investigamos si la regulación postranscripcional a través de miARN puede ser un factor que contribuya a las
deficiencias subyacentes en el aprendizaje de la memoria del miedo y la red transcripcional alterada observada. De hecho,
de acuerdo con nuestra secuenciación de ARNm, investigamos la expresión de miARN en la amígdala de ratones CON y GF
ingenuos y 1 h después de la retención del miedo que está en línea con estudios previos que expanden la expresión de
 DIPLOMADO: “PSICONUTRICIÓN” DSc. Santiago-Jiménez J.C.

miARN de 30 min a 1 h después del acondicionamiento. El análisis mediante comparaciones por pares reveló una serie de
miARN regulados diferencialmente. Descubrimos que 3 miRNA, miR-211-5p, miR-204-5p y miR-200-3p, habían predicho
objetivos que eran enriquecimiento para los términos GO que se superponían con nuestro análisis de secuenciación de ARN
y, por lo tanto, podrían estar contribuyendo al enriquecimiento a nivel de ARNm. . Como tal, encontramos enriquecimiento
en términos de GO como transmisión sináptica,Chrna2 , Arc , Egr2 , Crh , Fosb ). Curiosamente, miR-204-5p y miR-211-5p
pertenecen a la misma familia de miARN y, por lo tanto, tienen alineaciones de secuencia muy similares que se refleja en la
similitud en los ARNm a los que se prevé que se dirijan ( Tabla complementaria 3 ). Actualmente, hasta donde sabemos, no
existen estudios que investiguen la importancia de estos miARN en la función neuronal dentro de la amígdala; sin embargo,
los estudios han demostrado la importancia de la familia miR-204 en el desarrollo del cristalino y la retina. 67Se necesita más
trabajo para determinar si la microbiota recluta estos miARN en la regulación de estas redes transcripcionales
alteradas. Además, encontramos una serie de miARN que se alteran después de las pruebas de retención del miedo y que
son exclusivos de CON-fc y GF-fc que muestran una interacción predicha con muchos ARNm alterados de esas
comparaciones ( Tablas complementarias 5 y 7 ). Solo tres miARN fueron comúnmente regulados a la baja después de la
retención del miedo en ratones CON y GF (miR-34b-5p, miR-34c-5p y miR-34b-3p). Un estudio reciente demostró que la
eliminación dirigida de esta familia de miARN da como resultado la resistencia a la ansiedad inducida por el estrés y mostró
una congelación reducida durante las pruebas de retención / extinción. 68Por el contrario, también se ha demostrado que
miR-34c está regulado a la baja en la amígdala central 30 minutos después de un estrés de restricción agudo y la
sobreexpresión lentiviral en este núcleo tiene un efecto ansiolítico. 69 A pesar del impacto conductual divergente de este
miARN siguiendo diferentes enfoques experimentales junto con factores estresantes agudos, estos estudios destacan la
importancia potencial de este objetivo en la regulación de comportamientos similares a la ansiedad.

CONCLUSIÓN

En conclusión, el presente estudio indica que la retención de la memoria del miedo con señales se basa en la presencia de
una microbiota funcional durante las ventanas críticas del neurodesarrollo. El análisis en profundidad de los datos del
transcriptoma confirma una hiperactividad funcional en la amígdala GF. Aquí demostramos una respuesta transcripcional
única a las pruebas de retención de miedo con señales que puede, al menos en parte, subyacer al deterioro observado en
la retención de la memoria de miedo con señales. El aparente inicio hiperactivo de la amígdala en la línea de base puede,
en última instancia, preparar a los animales GF para responder de manera diferente a los estímulos externos. La evidencia
convergente de la interacción prevista entre los miARN y sus genes diana indica que los enriquecimientos de GO orquestados
observados en ratones GF ingenuos pueden estar regulados por miARN. Los estudios futuros deben centrarse en investigar
los cambios en la expresión génica en múltiples puntos de tiempo para evaluar mejor una respuesta temporal en la amígdala
de los ratones GF después de recordar el miedo. Además, este perfil de comportamiento aberrante puede normalizarse
(parcialmente) mediante la introducción de un microbioma después del destete. Será interesante investigar los mecanismos
moleculares que impulsan esta reversión parcial en estudios futuros, ya que puede desenmascarar genes diana específicos
que pueden estar bajo la influencia de la microbiota intestinal. Además, dado que el microbioma ahora se ha visto implicado
en una amplia variedad de procesos cerebrales como la mielinización, este perfil de comportamiento aberrante puede
normalizarse (parcialmente) mediante la introducción de un microbioma después del destete. Será interesante investigar los
mecanismos moleculares que impulsan esta reversión parcial en estudios futuros, ya que puede desenmascarar genes diana
específicos que pueden estar bajo la influencia de la microbiota intestinal. Además, dado que el microbioma ahora se ha
visto implicado en una amplia variedad de procesos cerebrales como la mielinización, este perfil de comportamiento aberrante
puede normalizarse (parcialmente) mediante la introducción de un microbioma después del destete. Será de interés
investigar los mecanismos moleculares que impulsan esta reversión parcial en estudios futuros, ya que puede
desenmascarar genes diana específicos que pueden estar bajo la influencia de la microbiota intestinal. Además, dado que
el microbioma ahora se ha visto implicado en una amplia variedad de procesos cerebrales como la mielinización,37 activación
de la microglía / función neuroinmune, 52 , 70 , 71 función de la barrera hematoencefálica 72 y morfología dendrítica, 22 será
de interés investigar la relación entre estos procesos y la regulación microbiana del recuerdo del miedo en el futuro. Tomados
en conjunto, nuestros datos indican que el microbioma puede ser un nuevo objetivo terapéutico prometedor para desarrollar
enfoques psicobióticos 73 para los trastornos relacionados con el miedo.