PREPARACIÓN DE UN BIOINSECTICIDA A PARTIR DE LA

OBTENCIÓN DE LIMONENO DE LA CASCARA DE LIMÓN

Carolina Marín S, Esteffani Tatiana Pareja y Harold Felipe Lemus

Universidad Libre - Seccional Pereira

Facultad de ciencias de la salud

Programa de microbiología

Sexto semestre

Pereira, Colombia

2021

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 Resumen
Para la realización de la practica primero se rallo la parte superior de la cascara de 3
limones, el material obtenido fue mezclado con 100 ml de alcohol etílico al 70%, la
solución obtenida fue tapada y guardada en un lugar oscuro durante 3 días para que
fermentara.
Pasados los 3 días de fermentación, se filtró la solución para obtener únicamente el líquido,
de dicho filtrado se añadieron 25 ml en 500 ml de agua destilada para bajarle la
concentración. La solución final de 25 ml del filtrado en 500 ml de agua destilada es el
resultado final de nuestro insecticida a partir de la obtención de Limoneno, pero para
comprobar si hay o no presencia de Limoneno se realizó el sembrado de del insecticida en
cajas de Petri con medios Macconkey y PDA y se sembraron dos controles positivos, uno
de E. Coli en medio Macconkey y uno de Saccharomyces cerevisiae en agar PDA, en
dichos controles se realizó antibiograma añadiendo dos discos sumergidos en el insecticida
para comprobar si formaban halo de inhibición: Posteriormente dichos medios fueron
incubados a 36 ºC durante 5 días.
Al haber pasado los 5 días se tomaron los medios y se observó el crecimiento que hubo en
ellos y se realizó la tinción de Gram para comprobar si hubo o no crecimiento de E. Coli y
Saccharomyces cerevisiae en los medios comparándolo con los controles positivos.
Palabras clave: Limoneno, bioinsecticida, aceite esencial.

Abstract
To carry out the practice, the upper part of the peel of 3 lemons was first grated, the
material obtained was mixed with 100 ml of 70% ethyl alcohol, the solution obtained was
covered and stored in a dark place for 3 days so that ferment.
After 3 days of fermentation, the solution was filtered to obtain only the liquid, of said
filtrate 25 ml was added in 500 ml of distilled water to lower the concentration. The final
solution of 25 ml of the filtrate in 500 ml of distilled water is the final result of our
insecticide from obtaining Limonene, but to check whether or not there is presence of
Limonene, the insecticide was sown in Petri dishes. With Macconkey and PDA media and
two positive controls were seeded, one of E. Coli in Macconkey medium and one of
Saccharomyces cerevisiae on PDA agar. In these controls, antibiogram was carried out by
adding two disks immersed in the insecticide to check if they formed an inhibition halo.
These media were subsequently incubated at 36 ºC for 5 days.
After 5 days the media were taken and the growth that was in them was run and the Gram
stain had been performed to check whether or not there was growth of E. Coli and
Saccharomyces cerevisiae in the media, comparing it with the positive controls.
Keywords: Limonene, bioinsecticide, essential oil.

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 enlaces, y por lo tanto encuentra
aplicación como componente básico para
Introducción
varios productos químicos y
El limoneno es un monoterpeno cíclico farmacéuticos básicos. Los derivados
que se utiliza ampliamente en las oxigenados de limoneno muestran
industrias alimentaria, cosmética y en la potentes actividades farmacéuticas. Como
agricultura. Los monoterpenos, como el ejemplo, el alcohol perilílico, que puede
limoneno cíclico, son productos naturales obtenerse mediante la oxigenación regio
importantes que son utilizados específica del limoneno a través de la
frecuentemente en alimentos, cosméticos, biotransformación de células completas,
productos químicos domésticos y ha demostrado tener propiedades
aplicaciones farmacéuticas (1) (2). anticancerígenas. La aplicación de
monoterpenos como materias primas para
compuestos de relevancia industrial o
farmacéutica requiere rutas de síntesis
eficientes. Hoy en día, el limoneno se
produce principalmente como
subproducto de la producción de jugo de
naranja. Sin embargo, el establecimiento
de nuevas aplicaciones conducirá a un
mercado global en rápido crecimiento2.
Objetivo:
El principal objetivo de esta práctica es
Figura 1: Estructura química del producir un insecticida contra pulgones,
limoneno mosca blanca, ácaros como la araña roja,
entre otros, a base de un aceite esencial
Los monoterpenos son compuestos
cítrico llamado limoneno. Y
lipofílicos volátiles en los aceites
posteriormente comprobar si en dicho
esenciales de las plantas, que a menudo
insecticida inhibición de crecimiento
encuentran aplicación como sabores y
bacteriano (3).
fragancias en alimentos, cosméticos y
productos químicos domésticos. El
limoneno es el monoterpeno
predominante en los aceites esenciales de Materiales y reactivos
frutas cítricas y también se puede 1. Agar Macconkey.
encontrar en robles, pinos y 2. Agar PDA.
hierbabuena. Recientemente, se ha 3. 2 Erlenmeyer.
investigado el limoneno como una 4. 1 pesa.
alternativa o aditivo prometedor para 5. 1 vidrio reloj.
disolventes y combustibles de aviación. 6. 1 plancha de calentamiento.
El limoneno también muestra propiedades 7. Autoclave.
antimicrobianas, se puede funcionalizar 8. 3 limones.
fácilmente debido a sus dos dobles 9. 1 rallador.
3
 10. 1 recipiente plástico.
11. Alcohol etílico al 70%.
12. 3 recipientes con tapa.
13. 1 embudo.
14. 1 papel filtro.
15. 1 beaker de 500 ml.
16. 500 ml de agua destilada.
17. 8 cajas Petri.
18. Pinzas metálicas.
19. Sensidiscos.
20. Incubadora.
21. 1 asa de Drigalsky.
22. 1 asa microbiológica.
23. 1 micropipeta.
24. Mechero.
25. Azul cristal violeta.
26. Alcohol / cetona.
27. Lugol.
28. Safranina.
29. 4 placas porta objetos. Figura 2: Preparación de los medios
30. 1 microscopio. Macconkey y PDA.
Lo segundo que se hizo fue tomar los tres
Metodología limones y con la ayuda de un rallador,
El primer paso para comenzar con la rallar la parte externa de la cascara, sin
práctica fue la preparación de los medios llegar a extraer la parte interior blanca.
de Macconkey y PDA, preparamos cuatro
cajas de cada medio, para ello realizamos
los cálculos necesarios para preparar 100
ml de cada uno de los medios.
En el caso de Macconkey se necesitaron
5,15 g para los 100 ml de agua y en el
caso de PDA se necesitaron 3,9 g para los
100 ml de agua. Se añadieron los 100 ml
de agua destilada en dos Erlenmeyer y se
les agregaron las cantidades de agar
anteriormente mencionadas para cada
medio. Se calentaron en la plancha de
calentamiento, se agitaron ambos medios
hasta homogenizarlos y se llevaron al
autoclave durante 25 minutos. Una vez
sacados del autoclave se sirvieron en las
cajas de Petri y se dejaron solidificar.

4

Figuras 3.1 y 3.2: Obtención de la
cascara de limón.
Posteriormente se introdujo el material
extraído a un recipiente con 100 ml de
alcohol etílico al 70%, se taparo y se dejó
en un lugar sin iluminación y sin
humedad durante 3 días.
Figura 4: Preparación de la solución con
la muestra obtenida y 100 ml de alcohol
etílico al 70%.
Figura 5: Obtención de la solución para
poner a fermentar.
Pasados los 3 días que se dejó tapado, se
filtró la solución para obtener el
concentrado.
Figura 6: Filtrado de la solución para
obtener el concentrado.
Posteriormente se diluyo el concentrado,
para ello se adicionaron 25 ml del
concentrado a 500 mililitros de agua
destilada. La obtención de dicha solución
es el insecticida producido a base de
limoneno.
5
 Figura 9: Siembra del control positivo de
Figura 7: Dilución del concentrado en Saccharomyces cerevisiae en PD.
500 ml de agua destilada.
El paso a seguir fue añadir 100 μL de la
dilución en las 3 cajas de agar PDA y
agar MacConkey respectivamente, y
utilizando un medio para sembrar los
controles positivos de E. Coli en
MacConkey y de Saccharomyces
cerevisiae en PDA, esparciéndolo por
todo el medio utilizando el asa de
Drigalsky. En los controles positivos se
pusieron dos sensidiscos que fueron Figura 10: Antibiograma en controles
sumergidos en el insecticida para positivos de E. Coli y Saccharomyces
comprobar si formaban halo de inhibición cerevisiae.
Para terminar, se rotularon las cajas y se
llevaron a incubar durante 5 días a 36 ºC.

Figura 8: Siembra del control positivo de Figura 11: Siembra del insecticida en
E. Coli en Macconkey. Macconkey.

6
 2. Solución inicial de la muestra de
cascara de limón en 50 ml de alcohol
etílico al 70%.

Figura 12: Siembre del insecticida en

PDA.
Por último, tomar las respectivas
muestras del crecimiento presente en cada Figura 14: Solución inicial para
uno de los medios e identificar en el fermentar.
microscopio si hay presencia de E. Coli o
de Saccharomyces cerevisiae realizando 3. Fermentación de la solución inicial
la tinción de Gram. pasados los 3 días.

Resultados
1. Preparación de los medios Macconkey
y PDA.

Figura 15: Solución fermentada.

Figura 13: Cajas Petri obtenidas de agar
Macconkey y PDA.

7
4. Filtrado de la solución inicial después
de la fermentación durante 3 días.
Figura 16: Filtración de la solución
inicial.
5. Dilución del filtrado en agua destilada,
se añadieron 25 ml del filtrado en 500 ml
de agua destilada para bajar su
concentración.
Figura 17: Bioinsecticida obtenido a
partir de la obtención de Limoneno.
6. Observación microscópica del control
positivo de E. Coli en medio Macconkey.
Figura 18: Microscopia de E. Coli en
objetivo 100x - Agar Macconkey.
7. Observación microscópica del control
positivo de Saccharomyces cerevisiae en
medio PDA.
Figura 19: Microscopia de
Saccharomyces cerevisiae en objetivo
100x – Agar PDA.
8
8. Observación microscópica del Discusión y conclusiones
insecticida en medio Macconkey.
1. La solución inicial fue guardada en un
cajón para que quedara oscura y
fermentara, pasados los 3 días presento un
cambio en su coloración quedando más
oscura que en su estado inicial y tomo un
aroma fuerte y concentrado, lo que da a
entender que si fermento correctamente.
2. Después de filtrar la solución inicial y
diluir 25 ml en los 500 ml de agua
destilada se sembraron las muestras
correspondientes, pero se cometió el error
de no tomar las fotos del crecimiento
presentado en las cajas Petri, por tal
motivo no se puede demostrar que en los
controles positivos los sensidiscos no
generaron halo de inhibición y que si
hubo crecimiento microbiano en todas las
Figura 20: Microscopia de la muestra cajas Petri, incluidas las muestras del
del insecticida en objetivo 100x – Agar insecticida.
Macconkey.
3. Al realizar la tinción de Gram se
7. Observación microscópica del observó en el microscopio las muestras de
insecticida en medio PDA. os controles positivos y una muestra de
agar Macconkey y PDA respectivamente,
el resultado fue confuso ya que en el caso
del control positivo de E. Coli se
evidencio crecimiento de bacilos Gram
negativos como se esperaba, sin embargo
en el caso del control positivo de
Saccharomyces cerevisiae crecieron
bacilos Gram negativos y se esperaban
cocos Gram positivos, dicho error se debe
a que al sembrar los controles no se
realizó el cambio de la muestra y se
sembró E. Coli en ambos agares, por lo
que realmente no se obtuvo un control
positivo de Saccharomyces cerevisiae.
4. En las dos muestras observadas de
Figura 21: Microscopia de la muestra Macconkey y PDA, de la dilución final,
del insecticida en objetivo 100x – Agar es decir, el bioinsecticida, se observó
PDA. crecimiento de bacilos Gram negativos lo

9
cual demuestra que no hubo inhibición de
crecimiento bacteriano, debido a que la
fermentación de la solución si se dio, el
resultado fallido pudo deberse a la
dilución realizada, ya que aunque fue la
cantidad recomendada para la práctica,
pudo ser el factor determinante en que la
concentración de Limoneno haya sido
muy baja para demostrar capacidad
inhibitoria.

Bibliografía
1. Wu, J., Cheng, S., Cao, J., Qiao, J.
& Zhao, G.-R. Systematic
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Escherichia coli. J. Agric. Food
Chem. 67, 7087–7097 (2019).

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Limonene Production Process with
Engineered Escherichia coli.
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Biotechnological production of
limonene in microorganisms. Appl.
Microbiol. Biotechnol. 100, 2927–
2938 (2016).

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