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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE MEDICINA

Tesis de Doctorado

Alteraciones del desarrollo cerebral


en el alcoholismo materno-fetal:
rol del sistema serotoninérgico y de la astroglía

SERGIO GUSTAVO EVRARD

Directora del Trabajo de Investigación y Plan de Tesis:


Prof. Dra. HERMINIA ALICIA BRUSCO

Año 2008

1ª UNIDAD ACADÉMICA del DEPARTAMENTO DE


BIOLOGÍA CELULAR, HISTOLOGÍA, EMBRIOLOGÍA Y GENÉTICA

INSTITUTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y NEUROCIENCIAS


“Prof. EDUARDO DE ROBERTIS”
A Florencia, la personita más tierna del universo, mi solcito en el cielo. Te amo.

A Graciela. Mi mujer. Mi compañera. Te amo.

A Neva y Carlos (in memoriam) que hicieron de mí todo lo que soy y que, desde mi
corazón, observan los frutos de su gigantesco esfuerzo y enorme amor. Los amo.
Mi eterno agradecimiento a:

Mis amigos de toda la vida (Luis, M arcelo, Nacho, César, Andrés, Fernando, Ezequiel) que me alegran
la vida mucho más de lo que ellos, probablemente, se imaginan. A lo largo de ya muchos años (¡34!) me han
ayudado y me ayudan a vivir. Y permiten que yo haga lo propio por ellos. Mis hermanos del alma.

Patricia Tagliaferro (Patri), excelente profesional e, infinitamente, mejor amiga. Fuente de toda tranquilidad
y paciencia para con este médico inexperto en las lides de la mesada. Amiga ahora a la distancia, baltimorense
y “newjerseyense” perdida para la Argentina y ganada para Nigeria, fuente subversiva de innúmera bibliografía
hurtada hábil y legalmente al Imperio. Siempre una voz mesurada, tranquilizadora, equilibrada.

Javier Ramos (Javi), excelente investigador y gran compañero; ¡pobre hombre! me ha enseñado con infinita
paciencia todo lo que se debe saber en un laboratorio (poco he aprendido, vano esfuerzo el tuyo); más
importante que todo, consejero y amigo, no sólo él, sino su propia tesis me ha servido de enorme ayuda en la
confección de esta, la mía; benavidense por adopción y colegial renegado (sabiamente). Flamante padre, la
vida tiene otras caras. ¡Sí, ya vamos a hacer la stand-up comedy!

M aite Duhalde Vega (M ai) y Alejandro Ferrari (Ale), con quienes tanto hemos trabajado y nos hemos
divertido, con quienes nos hemos hartado de tomar mate, reírnos, cortar cerebros y hacer “inmunos”. A Maite
le debo la toma de algunas de las muy buenas fotos de este trabajo.

Javier Lujilde, chubutense conspirador devenido esquelense aspira-cenizas, hacker, cracker, aprendiz de brujo
y anestesiólogo, excelente médico que conserva intacta su consciencia, comedor de paredes celulares,
excelente compañero y mejor amigo. ¡Zonzo...!

Laura Caltana, que, además de colaborar y ayudarme, es una lúcida mujer, que siempre está alerta a todo y
le pone un toque de frescor al laboratorio.

Paula Fontanet, estudiante de biología, inteligente mujer y mejor cocinera de tortas de chocolate, simpática
y divertida, disgráfica escritora de correos electrónicos, que me ha ayudado con infinitas mediciones (mientras
miraba videos de lo más aburridos); espero que no le hayan quedado daños cerebrales persistentes.

Paula Aronne, nuestra biológa marplatense, que ha realizado y realiza un intensivo curso de deformación
científica bajo mis certeros consejos (¡Dios se apiade de ti, hija mía!), y que tanto me ha ayudado con los
experimentos y mediciones, inmunos y cesáreas. Una gran amiga, lamentablemente iniciada en los misterios
dolorosos y fecundos de la vida.

Alicia Rossi, sufrida rosarina en la gran urbe, luchadora incansable contra vientos y mareas, el ejemplo vivo
de lo que es una buena persona. También ella vió videos hasta el cansancio (¡más aún!); espero que no le hayan
quedado daños cerebrales por los infinitos videos.

Trinidad Saez, nuestro misterio en forma de biológa. Sin embargo, yo te conozco, je...

Tamara Guadagnoli, el ejemplo vivo de la persona feliz si las hay, (ya) futura esposa, bióloga, sahumerista
y descontaminadora de los malos espíritus que se cuelan en nuestro laboratorio.

Emérita (jeje) Jorge Vilela de Banchieri, M eri, nuestra queridísima Meri (y ahora, ¡la nonna!), excelente
técnica de microscopía electrónica y, casi, casi, una mamá más. Gracias, Meri. ¡No te imaginás cuánto te debo!
¡Ojalá hubiera en el mundo más mujeres como vos!

Dorita Tello y Gladys M oreira, que han cuidado de todas mis ratas con esmero y profesionalismo y han
tolerado todos mis pedidos con buen humor y solicitud, y siempre me han ayudado, incluso más allá de lo que
les correspondía.

Pablo Corazza, quien con cuidado y habilidad ha revelado todos y cada uno de los negativos y los positivos
de las fotografías de microscopía electrónica.

Todo el personal técnico y no docente, presente y pasado, de la Cátedra y el Instituto (Antonia Aloisio,
Patricia Altieri, Carolina Barraza, Nilda Buscaglia, Alejandro Butti, M aría Ester Céceres, Rita

iii
Corvalán, Susana Cuneo, M argarita López, M ariana López Ravasio, Silvia M auro, Norma Olives†,
Daniel Otero, Pablo Oviedo, Ángel Pablo Henríquez, Carmen Ramos, Valentina Sorzoni, Christian
Tello, Silvia Trejo) sin quienes, simplemente, ninguno de nosotros podría trabajar y yo no hubiera podido
llegar a esto.

La Lic. M aría Teresa Di Vietro y todo el personal a su cargo en la Biblioteca Central “M ontes de Oca”
de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires (entre todos ellos, especialmente Patricia
Carrizo, M aría Rosa Saracino, Carina Zabala, Sebastián Aranega, Diego Palermo, Alejandro Delgado),
que han atendido con profesionalismo y excelente predisposición a todos mis pedidos (muchos de ellos,
extensos y/o extraños) en mis numerosas consultas y búsquedas bibliográficas; fieles guardianes del
invalorable y desconocido tesoro bibliográfico de nuestra querida Facultad.

Mis muchos y muy buenos compañeros del Hospital Neuropsiquiátrico de M ujeres “Dr. Braulio A.
M oyano” (el antiguo y más romántico Hospital Nacional de Alienadas) a quienes debo tanto, pero tanto, en
muchos sentidos (profesional y personal): Fabián M olina (¡papá!); Cristina Olivieri, Laura Belfiore, Elisa
Cortese, Luis M azzarella, Alberto Andrieu, Cecilia Gasque Justo, Adrián Fantini y Florencia Esteban.
Álvaro Beccio. Irene Romero, Viviana Pezoa, Norma Noto , y Hugo Alcalá. Carlos Paz, M ariano Outes,
Guillermo Núñez, Susana Vallejo, Cristina Jorrat, Patricia Presas, M artina Polach, Lucía Seré,
Carolina Singer y M atías M artínez. Rosalía Pereyra (¡mamá!), M aría Zapana, Luis Cubillas, Lorena
Albamonte, M ónica Rodríguez, M ónica Ibarra, Dionisio Barros y Gabriela Valentino. M irta Ricci.
Pablo Berretoni. A Dante, gracias por toda la compañía silenciosa pero eficaz; hasta el último momento.

Norberto M uzzoppappa, excelente psicólogo, colega y amigo gracias a quién, en parte, pude continuar con
esta tesis (y no sólo eso).

El Dr. Juan Carlos Goldar quien (no lo sabe, por supuesto) me ha servido (y sirve) de guía e inspiración
silenciosa en el arduo e ingrato camino por la diferencia entre CIENCIA y deporte tecnológico, entre
investigación científica y CIENCIA. Sin quererlo, contribuyó en gran medida a que me diera cuenta y
confirmara que la claridad mental, los conocimientos y la sabiduría no se alcanzan acumulando títulos y
honores, diplomas y distinciones, publicaciones y conferencias, o corriendo tras innúmeros cursos. Sino por
el simple expediente de sentarse tranquilo a leer, a observar, a registrar, a reflexionar y pensar.
Independientemente para con la opinión de los numerosos “iluminados” que pululan por doquier.

Fabián Loidl, por su amistad, simplemente. Aún quedan espíritus decimonónicos en nuestro mundo.

Juan José López, otro espíritu del XIX, que siempre ha estado ahí para brindarme un consejo.

M aría Jimena Ricatti, mi gran amiga (¡gracias por todo! y yo sé por qué), a quien me une no sólo el amor
sino también el espanto. Gracias.

* * *

Finalmente (last, but not least), a la Prof. Dra. Alicia Brusco, mi directora de tesis, que me dió la gigantezca
oportunidad de hacer lo que toda la vida quise: CIENCIA. Y que casi estoicamente soportó mi lentitud en el
trabajo, mis desvaríos y desvíos, mi minuciosidad y preciosismo permitiéndome, a la vez, innovar, crear y
experimentar con inusual libertad y confianza hacia mí (algo que es muy poco frecuente hoy en día). A ella,
mi enorme y eterna gratitud. Gracias, Alicia, por aguantarme. Espero que haya valido la pena tanta
“malasangre”.

iv
“Conviene que la gente sepa que nuestros placeres, gozos, risas y juegos no proceden de otro
lugar sino de ahí [del cerebro], y lo mismo las penas y amarguras, sinsabores y llantos. Y por
él precisamente, razonamos e intuimos, y vemos y oímos y distinguimos lo feo, lo bello, lo
bueno, lo malo, lo agradable y lo desagradable, distinguiendo unas cosas de acuerdo con la
norma acostumbrada, y percibiendo otras de acuerdo con la conveniencia; y por eso al
distinguir los placeres y los desagrados según los momentos oportunos no nos gusta (siempre)
las mismas cosas.
“También por su causa enloquecemos y deliramos, y se nos presentan espantos y terrores, unos
de noche y otros por el día, e insomnios e inoportunos desvaríos, preocupaciones inmotivadas y
estados de ignorancia de las circunstancias reales y extrañezas. Y todas esas cosas las
padecemos a partir del cerebro, cuando este no está sano,...”
Hipócrates (siglo V a.C.; Sobre la enfermedad sagrada, Corpus Hippocraticum)

“...el aprender no es realmente otra cosa sino recordar...”


Platón (siglo IV a.C.; Fedón, 72 e).

“...el que se plantea un problema o se admira, reconoce su ignorancia...”


Aristóteles (siglo IV a.C.; Metafísica, I, 2, 982b 15-20)

“In plicas cerebri, memoria et reminiscentia.”


Thomas W illis (1664; Cerebri Anatome) 1

“La Psicología, a pesar de numerosos esfuerzos e intentos, no ha podido ser llevada finalmente
al rango de una ciencia exacta porque sus conceptos básicos fueron edificados forzada e
independientemente de los conocimientos cerebrales. La ingenua presuposición de que sin
conocer un órgano como el cerebro puede desarrollarse su fisiología ha convertido a esta en un
campo de acción para las más extrañas ocurrencias de las cuales poco queda como valedero.
“También la Psiquiatría, por falta de claros conceptos sobre el órgano de la Psiquis, ha sufrido
sensiblemente y no ha podido remontarse al mismo plano que el resto de las disciplinas
médicas” [...] “Todavía en los últimos tiempos autores de difundidos textos psiquiátricos se
ufanan en el desprecio a la anatomía cerebral considerándola casi como un requisito para
entender la psicopatología y como prueba de una madura experiencia psiquiátrica. Yo espero
que este orgullo de los ignorantes próximamente llegue a su fin.”
Paul Emil Flechsig (1896; Gehirn und Seele) 2

1
Citado en Outes y Estevez, 1987.
2
Citado en Outes y González, 1988.

v
Los resultados del presente trabajo han sido parcial y previamente publicados en:

Experimental Neurology (2006); 200: 438-459.


Developmental Brain Research (2003); 147: 119-133.
Annals of the New York Academy of Sciences (2002); 965: 343-353.
Annals of the New York Academy of Sciences (2002); 965: 334-342.

vi
Índice
“Hasta el viaje más largo comienza por el primer paso.”
Proverbio chino.

Agradecimientos. iii
Lista de abreviaturas. xiii
Resumen. 1
I. Introducción: 6
1. Un caso clínico ilustrativo (a modo de prólogo). 7
2. El alcoholismo materno-fetal (AMF) (el morbo): 11
I.2.1. Los trastornos del espectro del alcoholismo fetal (FASD). 14
I.2.1.1. El síndrome alcohólico fetal (FAS). 19
I.2.1.2. Los efectos del alcoholismo fetal (FAE): 22
I.2.1.2.1. Los trastornos congénitos relacionados con el alcohol
(ARBD). 23
I.2.1.2.2. Los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el
alcohol (ARND). 23
3. El etanol (el agente etiológico): 26
I.3.1. Farmacocinética. 27
I.3.2. Farmacocinética del etanol en la mujer. Características particulares. 32
I.3.3. Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido. 33
I.3.4. Farmacodinamia. 35
I.3.5. Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones
cognitivo-conductuales en la intoxicación aguda. 36
4. Desarrollo normal del sistema nervioso central (el período de acción de
la noxa). 38
I.4.1. La inducción de la placa neural y la neurulación. 40
I.4.2. Formación de las vesículas encefálicas. 41
I.4.3. Desarrollo de las vesículas telencefálicas y corticogénesis. 43
I.4.3.1. Formación del neuroepitelio. 43
I.4.3.2. Cinética proliferativa de las células neuroepiteliales. 44
I.4.3.3. Ritmo proliferativo de las zonas ventricular y subventricu-
lar del neuroepitelio. 46
I.4.3.4. La glía radial. 49
I.4.3.5. Evolución posterior del neuroepitelio en las vesículas telence-
fálicas. 52
5. Las relaciones neurogliales (el mecanismo etiopatogénico): 55
I.5.1. La serotonina: 55
I.5.1.1. Síntesis, almacenamiento, liberación y degradación. 56
I.5.1.2. El sistema serotoninérgico. 58
I.5.1.3. Los receptores 5-HT1A. 62
I.5.1.4. Funciones de la serotonina en el SNC adulto y en el desarrollo. 64
I.5.2. Los astrocitos: 67
I.5.2.1. Morfología y funciones. 68
I.5.2.2. La proteína S100B. 73
I.5.3. El citoesqueleto neuronal y astrocitario: 77

viii
I.5.3.1. Los filamentos intermedios (FI). 77
I.5.3.2. La proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2). 81
I.5.4. El óxido nítrico y el sistema nitrérgico. 83
II. Hipótesis y Objetivos. 87
1. Consideraciones generales acerca del alcoholismo materno-fetal, el sis-
tema serotoninérgico, los astrocitos y la proteína S100B y el sistema ni-
trérgico. 88
2. Hipótesis. 91
3. Objetivos: 93
II.3.1. Generales. 93
II.3.2. Específicos. 95
III. Materiales y Métodos: 97
1. Materiales. 98
2. Métodos: 99
III.2.1. Método utilizado de administración de etanol. 99
III.2.2. Metodología general del tratamiento de los animales: 101
III.2.2.1. Origen, alojamiento. 101
III.2.2.2. Apareamiento, diagnóstico de preñez y cría. 102
III.2.2.3. Alimentación apareada. 103
III.2.2.4. Bebida. 104
III.2.3. Protocolos experimentales: 105
III.2.3.1. Exposición prenatal al etanol, sin prevención del daño. 105
III.2.3.2. Exposición prenatal al etanol, con prevención del daño
por administración de buspirona. 106
III.2.3.3. Exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia
posterior. 108
III.2.3.4. Exposición al etanol durante la adultez. 109
III.2.4. Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia. 110
III.2.5. Determinación de la alcoholemia. 111
III.2.6. Estudios de microscopía: 112
III.2.6.1. Fijación de los animales y procesamiento de los cerebros. 112
III.2.6.2. Selección de los cortes de tejido. Áreas cerebrales evaluadas. 113
III.2.6.3. Microscopía óptica: 114
III.2.6.3.1. Coloración de Nissl. 114
III.2.6.3.2. Inmunocitoquímica (ICQ). 115
III.2.6.3.3. Análisis de imágenes digitales asistido por computadora.
Morfometría. 117
III.2.6.4. Microscopía electrónica. 119
III.2.7. Estudios conductuales. 120
3. Análisis estadístico de los datos. 121
IV. Resultados: 123
1. Protocolo de exposición prenatal al etanol sin prevención del daño: 124
IV.1.1. Resultados generales del tratamiento: 124
IV.1.1.1. Consumo de alimento. 124
IV.1.1.2. Consumo de bebida. 125
IV.1.1.3. Consumo de etanol. 127
IV.1.1.4. Ingreso calórico total . 128
IV.1.1.5. Evolución ponderal de las hembras. 130
IV.1.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías

ix
al nacer y su evolución ponderal hasta P21. 133
IV.1.1.7. Alcoholemia en madres y crías. 134
IV.1.2. Observación de los cortes de los cerebros de crías P21 teñidos
con la coloración de Nissl. 136
IV.1.3. Experimentos de inmunocitoquímica en P21: 141
IV.1.3.1. Triptófano hidroxilasa (TPH). 141
IV.1.3.2. Serotonina (5-HT). 143
IV.1.3.3. Transportador de serotonina (5-HTT). 144
IV.1.3.4. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP). 146
IV.1.3.5. Proteína S100B (S100B). 148
IV.1.3.6. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200). 151
IV.1.3.7. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS). 154
IV.1.4. Microscopía electrónica del cerebro de las crías en P5 y P21. 157
2. Protocolo de exposición prenatal al etanol con prevención del daño por ad-
ministración de buspirona: 161
IV.2.1. Resultados generales del tratamiento: 161
IV.2.1.1. Consumo de alimento. 161
IV.2.1.2. Consumo de bebida. 162
IV.2.1.3. Consumo de etanol. 163
IV.2.1.4. Ingreso calórico total. 165
IV.2.1.5. Evolución ponderal de las hembras. 166
IV.2.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías
al nacer y su evolución ponderal hasta P88. 169
IV.2.1.7. Alcoholemia en madres y crías. 171
IV.2.2. Experimentos de inmunocitoquímica: 171
IV.2.2.1. Serotonina (5-HT). 171
IV.2.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP). 174
IV.2.2.3. Proteína S100B (S100B). 178
IV.2.2.4. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2). 180
IV.2.3. Experimentos conductuales en P90. 185
3. Protocolo de exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia
posterior. 186
IV.3.1. Resultados generales del tratamiento (consumo de alimento y lí-
quido, alcoholemias y peso de las ratas). 186
IV.3.2. Experimentos de inmunocitoquímica: 189
IV.3.2.1. Serotonina (5-HT). 189
IV.3.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP). 191
IV.3.2.3. Proteína S100B (S100B). 194
IV.3.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200). 196
IV.3.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2). 199
IV.3.2.6. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS). 202
IV.3.2.7. Descripción de los cambios morfológicos observados en el
citoesqueleto neuronal. 206
4. Procolo de exposición al etanol durante la adultez: 208
IV.4.1. Resultados generales del tratamiento. 208
IV.4.2. Experimentos de inmunocitoquímica: 208
IV.4.2.1. Transportador de serotonina (5-HTT). 208
IV.4.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP). 210
IV.4.2.3. Proteína S100B (S100B). 212

x
IV.4.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200). 214
IV.4.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2). 216
V. Discusión: 220
1. Parámetros generales de los tratamientos en los distintos protocolos: 221
V.1.1. Consumo de alimento, bebida y calorías. 221
V.1.2. Consumo de etanol y alcoholemias. 226
V.1.3. Variaciones de peso. 231
V.1.4. Efectos generales de la exposición prenatal al etanol sobre la des-
cendencia. 233
2. Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung: 236
V.2.1. Hallazgos en la corteza frontal con el Nissl. 236
V.2.2. Hallazgos en el cuerpo estriado y en la corteza frontal con la mi-
croscopía electrónica. 252
3. La exposición prenatal al etanol. 256
4. La prevención del daño con buspirona. 265
5. Los adolescentes: 271
V.5.1. El problema de definir y delimitar la adolescencia en humanos y
en ratas. 271
V.5.2. Cambios nerviosos y conductuales normales durante la adoles-
cencia. 272
V.5.3. Cambios morfológicos prolongados tras la exposición durante
la adolescencia y la abstinencia. 273
6. Los adultos. 284
7. Comparación de los hallazgos entre las distintas edades. 286
VI. Conclusiones y comentarios finales. 289
1. Conclusiones. 290
2. Comentarios finales. 292
VII. Anexos: 296
1. Anexo I. Síndrome alcohólico fetal y trastornos asociados. Criterios diag-
nósticos: 297
VII.1.1. Elementos diagnósticos de Jaqueline Rouquette. 297
VII.1.2. Criterios diagnósticos del Institute of Medicine (IoM). 297
VII.1.3. Propuesta de revisión de los criterios diagnósticos del Institute of
Medicine (IoM) para los FASD. 299
VII.1.4. Criterios diagnósticos para el Centro para el Control de Enferme-
dades (CDC) para los FASD. 302
VII.1.5. Código diagnóstico de 4-Dígitos. 303
VII.1.6. Lineamientos canadienses para el diagnóstico del FAS, FAS par-
cial y los ARND. 304
2. Anexo II. Manifestaciones fenotípicas físicas en el síndrome alcohólico
fetal. 307
3. Anexo III. Receptores serotoninérgicos. 308
4. Anexo IV. Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo: 310
VII.4.1. Estructura de la proteína S100B. 310
VII.4.2. Estructura del receptor para los productos finales de la glucosila-
ción avanzada (RAGE). 312
VII.4.3. Estructura de los filamentos intermedios (FI). 313
VII.4.4. Estrucutra de la proteína asociada a microtúbulos de tipo 2
(MAP-2). 315

xi
5. Anexo V. Métodos experimentales de exposición de animales al etanol.
Ventajas y desventajas de cada uno: 318
VII.5.1. Administración en el agua de bebida. 320
VII.5.2. Administración por inyección intraperitoneal. 321
VII.5.3. Administración intragástrica. 322
VII.5.4. Administración inhalatoria. 324
VII.5.5. Administración por dieta líquida. 324
6. Anexo VI.Tablas de datos de los parámetros nutricionales evaluados en los
protocolos de exposición prenatal al etanol (EPE). 327
7. Anexo VII. Tablas de datos de los parámetros morfométricos evaluados en
los experimentos de inmunocitoquímica. 329
VIII. Bibliografía. 334

xii
Lista de Abreviaturas:

5-HT serotonina :M micromolar


5-HT 1A receptor serotoninérgico tipo 1A MAP proteína asociada a microtúbulos
5-HTT transportador de serotonina MAP-2 proteína asociada a microtúbulos
Ach acetilcolina tipo 2
ADH alcohol deshidrogenasa MCP muerte celular programada
ALDH aldehído deshidrogenasa MET microscopía/io electrónica/o de
AMF alcoholismo materno-fetal transmisión
AMPc adenosín monofosfato cíclico MF microfilamentos
ARBD defectos congénitos relacionados MGP matriz germinativa primaria
con el alcohol MGS matriz germinativa secundaria
ARND trastornos del neurodesarrollo rela- MLE membrana limitante externa
cionados con el alcohol MLI membrana limitante interna
BHE barrera hematoencefálica mM milimolar
CA1 Hipp área CA1 del hipocampo MT microtúbulos
CC corteza cerebral nM nanomolar
CCGT-C crisis convulsivas generalizadas tó- Nb neuroblastos postmitóticos migrato-
nico-clónicas rios
cC-R células de Cajal-Retzius Nf-68 neurofilamentos de 68 kDa de PM
cGR células de la glía radial Nf-160 neurofilamentos de 160 kDa de PM
cNEp células neuroepiteliales Nf-200 neurofilamentos de 200 kDa de PM
CxF corteza frontal nm nanometro
* densidad nM nanomolar
DA dopamina NDR núcleo dorsal del rafe
DL 50 dosis letal 50 NMDA receptores glutamatérgicos de tipo
DOR densidad óptica relativa n-metil-d-aspartato
E día embrionario o gestacional NMR núcleo medial del rafe
EEG electroencefalograma/fico nNOS óxido nítrico sintetasa, isoenzima
EMCE exposición materna crónica al eta- neuronal, o tipo I
nol NO óxido nítrico
eNOS óxido nítrico sintetasa, isoenzima NOS óxido nítrico sintetasa
endotelial, o tipo III NT neurotúbulos
EEG electroencefalograma P día postnatal
EGL eminencia gangliónica lateral PC placa cortical
EPE exposición prenatal al etanol PE potenciales evocados
EtOH etanol PM peso molecular
FAE efectos del alcoholismo fetal pM picomolar
FAS síndrome alcohólico fetal PP preplaca
FASD trastornos del espectro del alcoho- p/v peso en volumen
lismo fetal RMN resonancia magnética nuclear
FI filamentos intermedios S100B proteína S100B
GABA ácido (-aminobutírico sc subcutáneo
GFAP proteína gliofibrilar ácida SNC sistema nervioso central
GMPc guanilato monofosfato cíclico sP subplaca
Hipp hipocampo Strt cuerpo estriado
hpm haz prosencefálico medial TDAH trastorno por déficit de atención con
ICQ inmunocitoquímica o sin hiperactividad
iNOS óxido nítrico sintetasa, isoenzima VRN núcleo ventral del rafe
inducible, o tipo II v/v volumen en volumen
ip intraperitoneal ZG zona germinativa
-ir inmunoreactivo/idad ZI zona intermedia
iv intravenoso ZM zona marginal
kCal kilocalorías ZSV zona subventricular
kDa kilodaltons ZV zona ventricular
:m micrometro
:m 2 micrometro cuadrado

xiii
Resumen
“Sé breve en tus razonamientos, que ninguno hay gustoso si es largo.”
M iguel de Cervantes Saavedra.

El desarrollo del sistema nervioso central (SNC) es un proceso muy complejo,


determinado por múltiples factores que entran en juego simultánea y/o secuencialmente.
Este desarrollo tiene, en el ser humano, un claro período crítico prenatal y otro postnatal
hasta los 20 a 25 años aproximadamente. No obstante, se prolonga, posiblemente, durante
toda la vida del individuo. Muchos son los factores que pueden alterar este complejo y
prolongado proceso de desarrollo.
El alcoholismo materno-fetal (AMF), en nuestro país, es una causa poco reconocida de
enfermedades neuropsiquiátricas de la niñez, la adolescencia y la adultez. El consumo de
etanol (EtOH) por parte de la embarazada puede provocar una amplia gama de trastornos
en su descendencia, denominados en conjunto Trastornos del Espectro del Alcoholismo
Fetal (FASD). No todas, pero sí algunas de las mujeres alcohólicas crónicas que se
embarazan paren niños que presentan al nacer el denominado Síndrome Alcohólico Fetal
(SAF), el grado máximo de afectación en el espectro de los FASD. Aquellos hijos de
madres alcohólicas que tienen la fortuna de verse menos afectados son fenotípica y
conductualmente normales, o caen en la categoría de lo que en un principio se denominó
Efectos del Alcoholismo Fetal (FAE) y que hoy comprende a los Trastornos del
Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND) y los Trastornos Congénitos
Relaiconados con el Alcohol (ARBD).
Las displasias corticales se cuentan entre los múltiples daños provocados al cerebro por
el AMF; estas sustentan especialmente, desde el punto de vista histopatológico, el
diagnóstico de ARND. Estas malformaciones cerebrales son, en última instancia,
responsables de muchas de las discapacidades neuropsiquiátricas que padecen lo hijos de
madres alcohólicas. En la concurrencia de factores para la producción de las displasias
corticales intervienen, entre muchos: las alteraciones del desarrollo del sistema
serotoninérgico (un sistema de neurotransmisores que se halla alterado en muchas
enfermedades neuropsiquiátricas y que, durante el desarrollo, tiene importantes funciones
en la diferenciación del SNC); la glía radial (un tipo especial de células de la glía por la que
migran los neuroblastos postmitóticos); los astrocitos (descendientes fenotípicos de la glía

2
Resumen

radial que poseen receptores para la serotonina -5-HT- y, ante cuyo estímulo, liberan a la
proteína S-100B, una proteína con actividad promotora de la estabilización del
citoesqueleto neuronal y astrocitario, la extensión de neuritas y el establecimiento de
circuitos sinápticos); y el sistema nitrérgico (un particular sistema neurotransmisor
relacionado con el serotoninérgico y los astrocitos).
La mayoría de los estudios experimentales que han lidiado con el AMF han intentado
reproducir los grados mayores de afectación por consumo prenatal de EtOH. En ese tipo
de estudios se han encontrado alteraciones fehacientes en muchos de los elementos
mencionados. Sin embargo, son escasos los trabajos que intentan reproducir in vivo grados
de afectación menores o mínimos (que son, probablemente, mucho más numerosos que los
casos de afectación catastrófica). Es lo que se ha intentado en este trabajo: realizar un
modelo animal de ARND, caracterizarlo y estudiarlo bajo diferentes aspectos con foco en
las relaciones neuro-gliales en las que el sistema serotoninérgico es el centro.
Así, en distintos períodos del desarrollo vital, en sendos protocolos experimentales en
animales de utilización habitual en el laboratorio (ratas Wistar), se expuso a estos al EtOH
6,6% v/v en el agua de bebida y se evaluó el daño provocado en distintos parámetros. Los
períodos vitales estudiados fueron los siguientes:
I) durante el desarrollo prenatal por medio de un modelo de AMF en el que se intoxicó
a las hembras 6 semanas antes de la preñez, y
A) durante la gestación y la lactancia, para exponer a las crías durante el desarrollo
intra- y extrauterino (por vía transplacentaria y por la leche materna; protocolo de
exposición prenatal al EtOH sin prevención del daño); y
B) solo durante la gestación para exponer a las crías durante el desarrollo intrauterino
al tiempo que se administró a las madres una droga (buspirona) durante la parte
final de la gestación, concomitantemente con el EtOH, con la finalidad de evaluar
la posibilidad de prevención del daño provocado por el EtOH (protocolo de
exposición prenatal al EtOH con prevención del daño);
II) durante la adolescencia, en el que a un subgrupo de animales se le permitió
recuperarse del daño por el simple expediente de una abstinencia prolongada
bebiendo agua (protocolo de expsoción al EtOH durante la adolescencia con
abstinencia posterior); y

3
Resumen

III) durante la adultez (protocolo de exposición al EtOH durante la adultez).


En los cuatro protocolos experimentales todos los animales recibieron alimento estándar
para roedores de laboratorio y su alimentación se realizó de modo apareado para minimizar
los efectos nutricionales debido al de consumo o no de EtOH.
En los cuatro protocolos de exposición al EtOH se han evaluado el sistema
serotoninérgico, la astroglía, las relaciones neurogliales y el sistema nitrérgico desde
distintos puntos de vista:
I) morfológicos, en dos núcleos mesencefálicos (núcleo dorsoal y medial del rafe -NDR
y NMR-) en los que asientan las neuronas serotoninérgicas que constituyen la
principal fuente de inervación distal al prosencéfalo y en tres áreas de este último (el
área CA1 del hipocampo, el cuerpo estriado y la corteza frontal): por medio de
A) microscopía óptica: con
1) tinciones histológicas de rutina (tinción de Nissl con azul de toluidina como
medio para evaluar la citoarquitectura del SNC en general y de la neocorteza
en especial); y
2) técnicas de inmunocitoquímica (ICQ) para:
a) la enzima triptofano hidroxilasa (TPH), la primer enzima (y limitante) de la
vía biosintética de la 5-HT;
b) la 5-HT;
c) el transportador de serotonina (5-HTT), presente en las prolongaciones de
las neuronas serotoninérgicas, esté o no presente la 5-HT en el interior de la
célula;
d) la proteína gliofibrilar ácida (GFAP), la principal proteína del citoesqueleto
astrocitario, un filamento intermedio de clase III;
e) la proteína S-100B (S-100B), presente en el citoplasma astrocitario,
secretada bajo estimulación por la 5-HT de los receptores 5-HT1A de los
astrocitos;
f) los neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200), un filamento intermedio de clase
IV, marcador del citoesquelto de dendritas y axones, cuyos niveles se ven
afectados por los de la S-100B;
g) la proteína asociada a los microtúbulos de tipo 2 (MAP-2), marcador

4
Resumen

neuronal de localización casi exclusivamente dendrítica y que, igual que el


anterior, se ve afectado por los niveles de S-100B;
h) la enzima óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS) una isoenzima presente
en una variedad de neuronas y que está asociada de diversos modos con el
sistema serotoninérgico.
B) microscopía electrónica de transmisión;
II) conductual: en el paradigma de la prueba de campo abierto, se evaluó ante la
exposición a un ambiente novedoso:
A) la actividad locomotora; y
B) la respuesta de ansiedad.
Los resultados, complejos y variados, permitieron observar globalmente que el daño del
provocado por el EtOH aún en bajas dosis es cierto y notorio en cualquier edad; que el tipo
de daño provocado sobre determinados marcadores de los sistemas en estudio no fue
paralelo en las distintas edades y regiones cerebrales estudiadas sino que varió (en cantidad
y calidad) en función de estos mismos factores (edad y región); que la simple abstinencia
permite cierta recuperación (incompleta y variable) del daño en la adultez tras el consumo
en la adolescencia pero no tras la exposición prenatal; y que la administración de buspirona
prenatalmente en forma concomitante con la intoxicación alcohólica previene la mayor
parte de los efectos producidos por el EtOH (incluso los conductuales) aunque su uso no
es inocuo completamente para los animales no expuestos. Se hallaron de manera constante
ciertas alteraciones cualitativas de la morfología del citoesqueleto neuronal y astrocitario
que han podido ponerse de manifiesto tanto por microscopía óptica cuanto por electrónica.
Finalmente, el EtOH, consumido a cualquier edad en forma crónica, aún a bajas dosis,
es capaz de provocar alteraciones notorias en el SNC. Por ello, sigue siendo válida la
máxima de que para prevenir el daño al cerebro, no hay como no exponerlo en lo absoluto.
La mejor prevención es la abstinencia. No obstante lo cual, se puede intervenir en el
sistema para modificarlo de manera beneficiosa para el individuo.

5
Introducción
“Hoy es el alcohol etílico la única sustancia sedativa ydependígena que, por hallarse
institucionalizada, nuestra sociedad maneja y absorbe con toda libertad. Es la droga del
establishment, la droga de nuestro sistema sociopolítico. Esta es precisamente su singularidad
psicofarmacológica. No ocurre nada parejo con ninguna otra sustancia psicotropa.”
Francisco Alonso-Fernández 1

I.1. Un caso clínico ilustrativo (a modo de prólogo):

Ángela J. S. M. 2, nacida en Salto (Uruguay) en 1966.


Es una persona apacible, de voz suave y bajo volumen; tranquila, tímida y algo retraída; respetuosa, de
tendencias depresivas y modos aniñados sin llegar a la puerilidad patológica; físicamente menuda. Inquieta
cuando niña, no podía estar sentada; dificultades escolares a pesar de no haber tenido trastornos específicos
del aprendizaje. Se mordía los dedos llegando a provocarse lesiones leves. Desde la infancia experimentó
frecuentes fenómenos de déjà vu y jamais vu. Ha padecido episodios de discontinuidad vivencial con lagunas
mnésicas (de pronto, se encontraba en su cama o en su cuarto sin saber cómo había llegado allí ni qué había
estado haciendo) (¿ausencias?; ¿crisis parciales complejas con automatismos?). A los 8 años,
aproximadamente, comenzó a padecer crisis convulsivas generalizadas tónico-clónicas (CCGT-C) que
aparentemente ante episodios febriles. A los 20 años, un episodio depresivo con hipobulia y desinterés por
el medio. A los 23 años, recostada en su cama, rumiando ideas de muerte, se levantó impulsivamente, fue a
la cocina, tomó un cuchillo e intentó clavárselo en el estómago para acabar con su vida. Durante el transcurso
de su segundo embarazo sufrió una CCGT-C. En 1995, conización de cuello de útero por metaplasia escamosa
sin signos de malignidad. En 1997, intentó suicidarse cortándose las venas de la muñeca con un cuchillo. En
otra ocasión, intentó electrocutarse metiendo un objeto de metal en un enchufe. Ambos intentos, realizados
en forma impulsiva.
Primera internación en el Hospital Moyano (08/04 al 19/05/97; 41 días); 30 años de edad; presentó a
lo largo de la internación: impulsividad; ideación suicida; se le imponía obsesivamente la idea de que debía
matarse; humor depresivo; ideas de ruina y desvalorización; hipobulia; anorexia; ideas de persecución;
angustia, a veces de carácter paranoide; contracturas musculares generalizadas; tenía la sensación de que su
cabeza se agrandaba pero, al tocarla, reconocía la irrealidad de la sensación; desde aproximadamente un año
antes escuchaba voces de tonos graves, de hombres, que desde fuera de su cabeza le decían claramente “te
voy a matar”; veía ojos grandes, brillantes, negros y amenazantes que la observaban y se le venían encima o
que, ubicados en la pared, la miraban fijamente o se transformaban en figuras que salían de la pared y la
amenazaban: “te vamos a matar”; también veía manos que sostenían cuchillos en forma amenazante; macro

1
Alonso-Fernández, 1992; pág. 44.
2
Historia clínica Nº 81.595 del Hospital Neuropsiquiátrico “Braulio A. Moyano” de la Ciudad Autónoma de
Buenos Aires. Atendí a Ángela (no solo yo) durante mi residencia en psiquiatría (1996-2000), realizada en
“el Moyano”.

7
Introducción

y microzoopsias; episodios de recuerdos escénicos; sentía que le tocaban el brazo y que se lo movían;
también, que la apretaban del cuello o una mano en el estómago que se abría y se cerraba, le clavaban algo
en el pecho; desrealización; intenso miedo a morirse; aspecto pueril. El cuadro fue controlado con el uso de
antipsicóticos y antiepilépticos. Diagnóstico presuntivo: HEBEFRENIA DEPRESIVA.
Segunda internación en el Hospital Moyano (19/08/97 al 05/09/97; 17 días de estadía): en esta ocasión
se presentó inhibida; rígida; signos de la rueda dentada y de la almohada psíquica; mirada perpleja;
hipomímica; piel seborreica; flexibilidad cérea y catalepsia; tensión arterial: 110/80 mm Hg; frecuencia
cardíaca: 134/min.; temperatura axilar: 37,5ºC. Sin negativismo ni alucinaciones; estaba triste pero no sabía
por qué; tenía ideas de matarse que reconocía como no impuestas, sino como propias, pero en las que no podía
dejar de pensar, al tiempo que no se explicaba el por qué y sin tener un plan para llevarlo a cabo; las voces
le decían “tenés que matarte” o “matáte”. Se diagnostica: SÍNDROM E CATATÓNICO, presuntivamente
SÍNDROM E NEUROLÉPTICO M ALIGNO. Se realizaron dos sesiones de tratamiento electroconvulsivo
(TEC; días 29/08 y 01/09); luego del primero, desaparecieron totalmente las voces ; con el segundo,
recuperación del cuadro. Diagnóstico de base: PSICOSIS EPILÉPTICA.
Luego del alta, realizó controles mensuales. Excelente evolución: comenzó a trabajar como recepcionista
en una academia de peluquería en la que luego aprendió el oficio. Cuidaba a sus hijos y tenía una buena
relación con su marido. Presentó en la cara un cloasma como efecto secundario a las fenotiazinas que recibía.
En 1999 se mudó a Uruguay pero continuó realizando controles en Buenos Aires. Internada en un hospital
general, en su país natal, entre el 14/06 y el 14/07/99; en el baño de su casa, había sufrido una CCGT-C que,
por broncoaspiración, produjo como complicación una neumonía aspirativa colapsante, insuficiencia
respiratoria aguda y shock; ingresó a terapia intensiva con una severa insuficiencia respiratoria por edema
pulmonar; sufrió un paro cardiorrespiratorio en bradiasístole por hipoxemia extrema, revertido con medidas
farmacológicas.
Tercera internación en el Hospital Moyano (08/11 al 23/11/99; 11 días); 32 años de edad; viajó sola
desde Uruguay para un control de rutina, se constataron ideas obsesivas de matar a sus hijos con un cuchillo
sumado a gran angustia; nueva internación y, luego, alta con mejoría.
Antecedentes heredofamiliares: su padre es alcohólico, la maltrataba de niña y con un cuchillo en la mano,
la amenazaba con matarla; la madre, también alcohólica, bebió alcohol durante la gestación de Ángela, varios
intentos de suicidio, ejercía la prostitución frente a ella y permitía que sus clientes abusaran de su hija
obligándola a prostituírse; una sobrina padece epilepsia y debilidad mental a causa de una hipoxia cerebral
perinatal; un tío materno padece epilepsia desde la infancia. Tabaquista moderada; niega en todo momento
el consumo de alcohol o cualquier otra droga de abuso (dato confirmado por el esposo). El cuadro de
presentación inicial en la primera internación recordaba al del delirium tremens, motivo por el cual se indagó
con especial énfasis en los antecedentes de consumo de alcohol por parte de la paciente.
Exámenes complementarios de diagnóstico: un EEG (02/05/97) reveló una “discreta desorganización
cortical difusa moderada y generalizada”. Una RM N de cerebro (26/05/97) informó “acortamiento con
reducción moderada de volumen de ambos hipocampos a predominio derecho, sin alteraciones de la señal

8
Introducción

hipocámpica, resto normal”; sin embargo, aunque no se lo informa, es visible, en la cara medial del cerebro,
en posición posterior a la cisura perpendicular interna, comprometiendo todo el lóbulo occipital derecho, una
polimicrogiria focal; se observa también una hipoplasia de la zona posterior del tronco del cuerpo calloso
inmediatamente por delante de su rodete (Fig. 1). Un segundo EEG y mapeo cerebral (10/11/99) informaron
“normalidad eléctrica cortical”. Una segunda RM N (12/11/99), de baja calidad técnica, que impedía apreciar
la polimicrogiria, informaba “normalidad estructural en el cerebro”.

Figura 1. R esonancia m agnétic a nuclear d e cerebro de la paciente Á ngela J.S .M . en la que se observa, en un corte sagita l (A ) la
dism inución localizada del grosor del cuerpo calloso en la región posterior de su cuerpo, inm ediatam ente por delante del rodete,
en la zona correspondiente al cruce de fibras interhem isféricas que conectan a las áreas auditivas (A en a’) y tém poroparietales
(T/P en a’; otras referencias: F: fibras frontales; M : fibras m otoras; S s: fibras som atosensitivas; V : fibras visuales). E n A tam bién
se o bse rva la polim icrogiria del lóbulo occipital en posición p osterior a la cisura p erp end icular interna y q ue im p id e d isting uir con
c la ridad a la cisura calcarina (m ag nificado en a). En un corte coronal (B ) se ob serva la dism inución d el volum en d e am b os
hipoca m pos a pred om inio del derech o (*) pero sin inten sifica ción de la señ al. E n A ’ y B ’, im á g e n e s c o m p a ra bles de u n su jeto
norm al a m odo de c ontrol co m parativo . R eferencias en a’ (m odifica do de P au l et al, 20 07 ): fibras interh em isférica s frontales (F ),
m otoras (M ), so m ato senso riales (S s), au ditivas (A ), tém poroparietales (T/P ) y visuales (V ).

Analicemos el caso clínico. ¿El morbo?. Neuropsiquiátrico (¿qué duda cabe?). ¿El agente etiológico
determinante? El alcohol. ¿El período de acción de la noxa? La gestación de Ángela. ¿El mecanismo
etiopatogénico? Un trastorno del normal desarrollo cerebral. ¿Agentes etiológicos concurrentes? Las
especiales condiciones socio-ambientales en las que Ángela creció, maduró y se desarrolló.

9
Introducción

En el trabajo que sigue, por medios experimentales, intentaré aportar algo al

conocimiento de los mecanismos etiopatogénicos que son responsables de la aparición de

enfermedades como la que afectó a Ángela. Para ello, en la Introducción, reseñaré lo hasta

hoy conocido acerca de las enfermedades originadas en la descendencia por el consumo

materno gestacional de alcohol; revisaré los datos relevantes de la farmacocinética y la

farmacodinamia de esta droga, principalmente en relación a la madre y al feto; luego

repasaré los hitos fundamentales del desarrollo normal en general, y de la corteza cerebral

en particular, que permitirán interpretar los hallazgos experimentales en animales adultos

que fueran gestados bajo la influencia del alcohol, cuando ya no es posible observar

directamente los procesos del desarrollo que fueran alterados por la droga sino solo sus

consecuencias. Para finalizar la Introducción, se verá de qué modo se interrelaciona el

sistema serotoninérgico (un sistema neurotransmisor que se altera en muchas enfermedades

neuropsiquiátricas) con los astrocitos en lo que ha dado en llamarse relaciones neurogliales

y cómo ambos, por medio de una proteína astrocitaria secretada bajo estímulo de la

serotonina (la S100B), se relacionan con el citoesqueleto de neuronas y glía y el

establecimiento de circuitos neuronales por medio de la extensión de neuritas. En la sección

de Hipótesis y Objetivos, tras considerar lo conocido hasta hoy sobre los efectos del

alcohol en estos sistemas a lo largo del desarrollo (desde el prenatal hasta la adultez),

expondré las hipótesis que originaron este trabajo y los objetivos que me propuse cumplir

con él. En la sección de Materiales y Métodos detallaré qué, cómo y con qué realicé los

experimentos para poner a prueba las hipótesis por medio de cuatro protocolos

experimentales distintos (en un anexo detallo las consideraciones que me llevaron a elegir

la administración en el agua de bebida como método de alcoholización de las ratas usadas

10
Introducción

en los experimentos). En la sección de Resultados, se enumeran acríticamente los

hallazgos que obtuve por métodos morfológicos con la microscopía óptica y electrónica,

con tinciones de rutina y, principalmente, por marcaciones inmunocitoquímicas y la

posterior medición de distintos parámetros morfométricos; una breve subsección detalla

hallazgos conductuales adicionales. En la Discusión, analizo críticamente los hallazgos

experimentales en particular en relación al alcoholismo materno-fetal y con respecto a otras

consideraciones más generales y mediatas, para finalizar en las Conclusiones con lo que

de enseñanzas o reflexiones se pueda obtener de todo esto. Para finalizar la presente tesis

doctoral, antes de enumerar la Bibliografía consultada, en una serie de Anexos (además

del ya mencionado), reseño sistemas diagnósticos al uso, la estructura de varias proteínas

cuya descripción en el cuerpo principal del texto haría muy engorrosa su lectura (pero que

considero necesario tener en cuenta si se pretende comprender cabalmente lo hallado en los

experimentos), como así también todos los datos numéricos de las mediciones que

sustentan los resultados, la discusión y las conclusiones.

I.2. El alcoholismo materno-fetal (AMF) (el morbo):

Hoy en día resulta una obviedad decir que al alcoholismo, al abuso y la dependencia del

EtOH se los considera como uno delos trastornos más comunes relacionados con

sustancias. Y el que mayor cantidad de muertes produce.3 Pero no por ser un tema remanido

deja esto de ser verdad.

3
A pesar de que otras drogas tengan mayor “prensa” a este respecto, incluso entre los médicos.

11
Introducción

El etanol (EtOH) es una sustancia de aparición espontánea en la naturaleza. Por ello, el

uso de bebidas alcohólicas se remonta, seguramente, a tiempos prehistóricos. Es la droga

más vastamente empleada a lo largo de la historia de la humanidad con la finalidad de

“alterar la consciencia”. Sin embargo, según las épocas y los pueblos que se consideren, su

utilización se ha asociado a muy diversas finalidades. El uso ritual mágico-religioso es (y

ha sido) compartido con muchas otras drogas como purificante espiritual. Pero su

utilización no se agota con esto ya que también es la droga más versátil en cuanto a

variedad de usos se refiere; según el contexto histórico y socio-cultural, se lo ha utilizado

como anestésico, afrodisíaco, energético, alimento, narcótico, o como medicamento de

amplio espectro (por ejemplo, durante la Edad Media). Pero, en cuanto a alterar la

consciencia es, probablemente, la droga más antigua usada a tal fin y, geográficamente, la

de más amplia distribución (Heath, 1974).

El consumo de bebidas alcohólicas por parte de las mujeres ha de haber comenzado,

evidentemente, en la misma época en que comenzó a hacerlo el hombre. Sin embargo, a lo

largo de la historia, los estudios científicos dedicados específicamente al alcoholismo

femenino son muchísimo menos numerosos que los estudios referidos al masculino.

Posiblemente esto se deba a que también es mucho menor la frecuencia con que beben las

mujeres. Más aún, los estudios dedicados al consumo de EtOH por parte de las

embarazadas también son menos frecuentes.

Pero sucede que las mujeres beben alcohol. E incluso, lamentablemente, cuando se

embarazan.

Parecería que desde la antigüedad distintos pueblos han tenido algún tipo de sospecha

vaga, imprecisa, acerca de lo que le sucedía a los hijos de las mujeres alcohólicas y que no

12
Introducción

era bueno que estas bebieran durante el embarazo (Abel, 1997, 1999, 2001a, 2001b). Pero

los primeros estudios científicos serios que informaron acerca de los efectos deletéreos del

consumo de EtOH por parte de las embarazadas sobre sus hijos se remontan a la Europa de

los siglos XVIII y XIX. En un principio se confundían (o no se diferenciaban) los efectos

debidos al consumo de EtOH por parte del padre o de la madre y los médicos se referían

a estos hijos como a los “hijos de alcohólicos”, indiscriminadamente. Hacia mediados del

siglo XIX, en Francia, dos famosos neuropsiquiatras (Bénédict Augustin Morel y Jacques

Joseph Valentin Magnan) comenzaron a hablar con creciente fuerza de la “degeneración”

producida en la especie por el alcoholismo de los padres. Magnan fue quien inició estudios

experimentales al respecto.4 Sin embargo, el primer estudio epidemiológico realizado en

humanos y del que se tenga noticia, en el que se relacionó específicamente el consumo de

EtOH por la embarazada con los daños en sus hijos, lo realizó William C. Sullivan, un

teniente oficial médico de la prisión de convictos “Parkhurst” de Su Real Majestad

Británica, en Liverpool (Reino Unido), en 1899 (Sullivan, 1899).5

El cuadro completo, con todas las características de lo que hoy se conoce en el ámbito

médico como Síndrome Alcohólico Fetal (FAS, por las siglas en inglés de Fetal Alcohol

Syndrome) fue descripto por primera vez por una pediatra francesa, Jacqueline Rouquette,

en 1957 en su tesis doctoral (Rouquette, 1957). Las observaciones que dieron lugar a su

trabajo las realizó mientras trabajaba en París para el Centro de Higiene Infantil de la

4
Cfr. el Anexo III (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).
5
El artículo de Sullivan es realmente brillante y digno de ser leído, incluso hoy, como un excelente ejemplo
de epidemiología retrospectiva.

13
Introducción

Fundación Paul Parquet.6 No obstante ello, la mayoría de los investigadores que trabajan

sobre el alcoholismo materno-fetal (AMF), sean clínicos o básicos, cuando citan en sus

trabajos alguna referencia histórica a la “primera descripción del FAS” se empecina en citar

como los primeros descriptores o descubridores, casi invariablemente, a Jones y Smith

(1973). Algunos pocos citan a Clarren y Smith (1978) y los menos, aunque en número cada

vez mayor, a Lemoine et al. (1968).7

Andando el tiempo, los investigadores estadounidenses han agrupado ahora a todas las

alteraciones observables en los hijos habidos de madres alcohólicas, y relacionadas al

consumo gestacional de EtOH, en un grupo de trastornos a los que denomina Trastornos

del Espectro del Alcoholismo Fetal (FASD, por las siglas en inglés de Fetal Alcohol

Spectrum Disorders).8

I.2.1. Los Trastornos del Espectro del Alcoholismo Fetal (FASD):

En principio, habrá de tenerse en cuenta algo que no por básico deja de ser importante.

Hay muchos factores que inciden en la manifestación final (en el feto o en el recién nacido)

de las alteraciones originadas por el AMF. Algunos de estos factores, que pueden

6
La Fundación Paul Parquet es una fundación privada cuyo Centro de Higiene Infantil, aún hoy, trabaja como
anexo de los servicios pediátricos de la Asistencia Pública de París (la Ayuda Social a la Infancia). Los datos
históricos y administrativos de la Fundación se pueden consultar en Internet en la página web de la misma
Fundación (http://www.fondation-paul-parquet.com/article.php3?id_article=27).
7
Paul Lemoine, otro pediatra francés, era Jefe del Servicio de Pediatría en el Centro Hospitalario
Universitario de Nantes. Como jefe de servicio era el responsable de la sala de lactantes depositaria de la
Asistencia Pública (Lemoine, 2003), la misma organización gubernamental con la que estaba relacionada la
Fundación de París en la que trabajaba Jacqueline Rouquette una década antes.
8
Afortunadamente, las trágicas épocas en que la humanidad padecía enfermedades ya finalizaron; ahora los
humanos sólo presentamos trastornos.

14
Introducción

considerarse verdaderos factores de riesgo, dado que muchos de ellos se relacionan con el

alcoholismo materno, son los que se enumeran a continuación (Jacobson y Jacobson, 1999;

May y Gossage, 2001; Thomas y Riley, 1998):9

I) factores de la salud materna perigestacional:


i ) la edad materna (es mayor la incidencia del FAS en hijos de madres mayores de 25
años y a mayor edad materna, mayor frencuencia de manifestación del FAS);
ii) la parición previa de 3 ó más niños afectados por el FAS;
iii) el uso concomitante de otras drogas de abuso (como marihuana, cocaína, tabaco);
iv) morbi-mortalidad prematura en gestas previas por causas relacionadas con el EtOH;
v) el estado metabólico y nutricional de la madre antes y durante la gestación;
vi) el período de la gestación durante el cual se produjo la exposición (primero, segundo
o tercer trimestre o toda la gestación;
vii) la presencia o ausencia de episodios de abstinencia aguda durante la gestación;
II) factores del nivel socio-económico:
i) bajo nivel socioeconómico y cultural (pobreza; baja y/o incompleta escolaridad;
desempleo, subempleo o empleo marginal);
ii) bajo acceso a los servicios de salud y control de la salud materna;
III) patrón de ingesta alcohólica:
i) edad temprana de inicio en el consumo de EtOH (a menor edad, mayor riesgo de
FAS);
ii) el patrón de ingesta de EtOH que presentó la embarazada durante la gestación (agudo
tipo parranda -binge-like de los angloparlantes, que consiste en beber 5 o más tragos
por ocasión, 2 ó más días en una semana- o crónico);10

9
No los consideraré con detalle en este lugar.
10
La palabra “trago estándar” en la literatura anglosajona sobre el FAS se define como: 12 onzas fluídas de
cerveza, ó 5 de vino ó 1,5 de bebidas destiladas de una graduación alcohólica de 80º (Maier y W est, 2001).
En el sistema métrico decimal, una onza fluida equivale, a 29,57 ml; por lo tanto, un trago de cerveza son (12
× 29,57 =) 354,84 ml (aproximadamente el contenido de una lata común); un trago de vino equivale a 147,87
ml (algo así como medio vaso); y uno de bebida destilada a 44,35 ml.
En consecuencia, 5 tragos (cuyo consumo en una sola ocasión definen al patrón de ingesta aguda (“en
parranda” o “binge-like”) equivalen a 60 onzas fluidas (= 60 × 29,57 = 1.774,2 ml) de cerveza o 25 onzas

15
Introducción

iii) la consecución de alcoholemias altas y/o sostenidas;


iv) ausencia de la reducción de la ingesta alcohólica durante la gestación;
IV) perfil psicológico materno:
i) baja autoestima;
ii) depresión;
iii) enfermedades psiquiátricas comórbidas;
iv) trastornos de la personalidad preexistentes;
v) disfunciones sexuales;
V) factores socio-familiares:
i) abuso de alcohol en la familia;
ii) abuso de alcohol por parte de la pareja de la mujer;
iii) relativa tolerancia al gran consumo de alcohol en el grupo social de pertenencia;
iv) inestabilidad vincular/marital;
v) pérdida previa de la tenencia de otros hijos dados en adopción o en guardas
transitorias.

En virtud de la actuación consecutiva o simultánea de muchos o todos estos factores, los

trastornos ocasionados por el AMF se presentan a lo largo de un continuum que configura

todo un espectro: desde la normalidad fenotípica casi total hasta el más severo conjunto de

las manisfestaciones del AMF que amenazan (o se cobran) la vida y la salud de los hijos.

Sin embargo, con fines prácticos, los distintos grados de afectación se agrupan, por fuerza

artificialmente, en distintas “categorías diagnósticas”. Todas estas categorías se ordenan,

en definitiva, a partir de la definición del grado máximo de afectación provocado por el

AMF; es decir, lo que se denomina FAS completo.

fluidas de vino (es decir, 25 × 29,57 ml = 739,25 ml, casi una botella común de vino de ¾ litro) o 7,5 onzas
de destiladas (7,5 × 29,57 = 221,77 ml). M ás abajo se verá, sin embargo, que no todas las cervezas (ni los
vinos, ni las bebidas destiladas) tienen el mismo contenido alcohólico, por lo que las “onzas fluidas” varían
en contenido alcohólico según el tipo de bebida que se considere. Por lo tanto, el cálculo del EtOH consumido
en determinada ocasión en función de las onzas fluidas no es de lo más seguro ni, mucho menos, exacto.

16
Introducción

De las mujeres que consumen alcohol en grandes cantidades durante la gestación, se

estima que sólo el 4-15% de los niños habidos de ellas estarán afectados por el FAS

completo (George et al., 2007; Gray y Henderson, 2006). Para comprender en alguna

categoría al resto de ellos, que caen en algún lugar del actual espectro, se había adoptado

en un principio la designación de Efectos del Alcoholismo Fetal (FAE, por sus siglas en

inglés -Fetal Alcohol Effects-). Esta denominación se tomó de los estudios realizados en

animales expuestos prenatalmente al EtOH (AAP, 2006). Más tarde se cayó en la cuenta

de que estos FAE también se presentaban en los hijos habidos de madres que habían bebido

alcohol en forma moderada a leve. Así fue como surgió el concepto de lo que hoy se

denomina FASD (Chudley et al, 2005; Gray y Henderson, 2006).

La incidencia y la prevalencia11 del FAS completo se estima en valores muy variables

según los distintos países del mundo. Dentro de un mismo país, estas cifras pueden variar

mucho de una región a otra y, dentro incluso de una misma región, también puede variar

muchísimo según el grupo humano étnico o socio-cultural particularmente considerado.

Así, por ejemplo, en los Estados Unidos de América (EUA) la incidencia general se ha

estimado en 0,5-3 por cada 1000 nacidos vivos (Chudley et al, 2005; Gray y Henderson,

2006; May y Gossage, 2001). En distintas comunidades y momentos, en Canadá, se la ha

estimado entre 0,515-190 (¡!) por cada 1000 nacidos vivos (Chudley et al., 2005). En el

Reino Unido, ha sido estimada en 0,21 (BMA, 2007). La prevalencia mundial del FAS

se ha estimado en alrededor de 0,5-2,0 cada 1000 nacidos vivos, si bien que para el cálculo

de estos valores, los de EUA han contribuido en gran medida por lo que es probable que

11
Se considera aquí como incidencia a la cantidad de casos nuevos en una determinada población o grupo
etario en un año. La prevalencia, por otro lado, es la cantidad de los casos totales (nuevos y ya existentes)
en un momento determinado, en una población determinada.

17
Introducción

el valor de la incidencia mundial esté significativamente sesgado (Bertrand et al., 2005;

BMA, 2007; May y Gossage, 2001; Mitten, 2004).

Independientemente del FAS completo, los otros elementos agrupados en los FASD

constituyen mayoría, son mucho más frecuentes que el FAS y pueden ser relativamente

comunes. Así, la prevalencia mundial de los FASD se ha estimado en 9-10 por cada

1000 nacidos vivos (es decir, alrededor del 1%) (Basford et al., 2004; Gray y Henderson,

2006; May y Gossage, 2001). Téngase en cuenta, a modo de comparación (por nombrar

sólo una de todas las enfermedades neuropsiquiátricas), que la prevalencia de las

esquizofrenias también se calcula en alrededor del 1% de la población.

Excluidos los casos de FAS puro, completo, el resto de los trastornos agrupados en los

FASD está parcialmente constituido por hijos de madres alcohólicas que presentan

malformaciones congénitas en distintos órganos de la economía.12 Sin embargo, el 50-80%

de los niños afectados por los FASD presentan solamente daños o disfunciones debidas a

alteraciones del desarrollo cerebral, es decir, alguno de todos aquellos efectos del AMF

agrupados bajo la categoría de Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el

Alcohol (ARND, por las siglas en inglés de Alcohol-Related Neurodevelopmental

Disorders) (BMA, 2007; Gray y Henderson, 2006).

Actualmente, existe mucho debate acerca de la prevalencia real y de la verdadera

importancia del FAS y de los FASD como “enormes problemas” de salud pública.13

Sin embargo, los ARND, por su alta prevalencia y por el hecho de que pueden ser

12
Cfr. Anexo II: M anifestaciones fenotípicas físicas en el Síndrome Alcohólico Fetal.
13
Téngase presente, sin embargo, que en estos fuertes debates no dejan de estar implicados variados intereses
económicos y académicos que en más de una ocasión ponen en riesgo y condicionan la imparcialidad y
rigurosidad científica de los datos que se publican.

18
Introducción

debidos a grados leves a moderados de AMF, son (potencialmente) los de mayor

importancia desde el punto de vista de la salud pública dentro del conjunto de todos los

trastornos agrupados en los FASD.

En resumen: el cuadro configurado en su totalidad comprende, como manifestación

global del AMF, a los llamados FASD. Estos FASD engloban, por un lado, a los casos

puros de FAS y por el otro a lo que antes se denominaba FAE y que hoy se desglosa en

ARBD y ARND.

Pasemos entonces ahora a considerar con algún detalle cómo se realiza el diagnóstico

de cada una de estas condiciones.

I.2.1.1. El síndrome alcohólico fetal (FAS):

Desde Jacqueline Rouquette (Rouquette, 1957) en adelante el diagnóstico clínico del

FAS reposa en una tríada de elementos semiológicos que constituyen el conjunto nuclear

de las manifestaciones del síndrome. Estas manifestaciones son:

a) el retraso del crecimiento intra y extrauterino;


b) un dismorfismo facial característico; y
c) anomalías morfofuncionales del neurodesarrollo en el SNC.

Todo ello, y como condicio sine qua non, en el contexto de una madre fuertemente

bebedora de EtOH durante la gestación.

El retraso del crecimiento se puede constatar ya intrauterinamente, durante la gestación.

19
Introducción

Los niños nacen con bajo peso si lo hacen a término o con bajo peso para la edad

gestacional si son prematuros (cosa que, por otro lado, es frecuente). La talla también suele

ser baja. Postnatalmente, el progreso pondoestatural no se recupera como suele suceder en

niños afectados de otras causas de bajo peso al nacer. Siempre continúan siendo pequeños,

incluso si se controla la evolución de su peso hasta el final de la adolescencia y a pesar de

que reciban la mejor de las alimentaciones posibles. Son, desde el principio, simplemente

hipotróficos y/o hipoplásicos globales. Hay quien los ha llamado “niños miniatura”.

La cara de los niños afectados tiene características particulares durante la primera

infancia: frente pequeña asociada a (y consecuencia de) la microcefalia; la raíz nasal es

aplanada o incluso presenta el aspecto en silla de montar similar al de la sífilis congénita;

las alas de la naríz son pequeñas; los ojos son pequeños (microftalmia) y están muy cerca

entre sí, las hendiduras palpebrales son más cortas que lo normal y el párpado superior

frecuentemente está en ptosis; a veces puede haber un pligue epicanto o epicanto invertido

o blefarofimosis; la región media de la cara es pequeña; el labio superior es

característicamente fino, delgado, recto y está como “arremangado” hacia dentro mostrando

muy poco el bermellón (a veces puede haber labio leporino con o sin paladar hendido); el

philtrum supralabial está notablemente aplanado o es, incluso, inexistente por lo que la

zona facial superior a la boca toma un aspecto un aspecto como de planchado; los dientes

pueden ser pequeños, hipoplásicos y de esmalte defectuoso; las orejas pueden tener una

implantación baja y sus conchas estar malformadas; suelen tener un notable hirsutismo al

nacer, más marcado en la piel perifacial. Sin embargo, todas estas características faciales,

que hablan a las claras de defectos en el desarrollo del mesodermo facial, van suavizándose

a medida que el afectado crece y pueden desaparecer, y ya no es posible distinguir a los

20
Introducción

nacidos con FAS, cuando son adultos, sólo por el aspecto facial. El retraso madurativo del

macizo facial, lentamente, se va completando.

Con respecto a las alteraciones del neurodesarrollo, más abajo los trato en detalle.

Sin embargo, a pesar de que el diagnóstico clínico es relativamente sencillo para el ojo

avezado y para el que tiene un razonable grado de sospecha, entre las alambicadas proezas

diagnósticas de los tiempos que corren, para complicar las cosas, han proliferado los

sistemas diagnósticos para los FASD. En EUA y Canadá, los de uso más extendido son:14

i) los Criterios Diagnósticos del Instituto de Medicina, de la Academia Nacional de


Ciencias de EUA (Stratton et al., 1996), que ya han sido convenientemente revisados
(Hoyme et al., 2005),
ii) los Criterios Diagnósticos del Centro para el Control de Enfermedades del
mismo país (Bertrand et al., 2004),
iii) el Código Diagnóstico de 4-Dígitos (Astley y Clarren, 2000), y
iv) los Lineamientos Canadienses para el Diagnóstico de los FASD (Chudley et al.,
2005).

Entre los diagnósticos diferenciales que por fuerza se han de descartar, se encuentran los siguientes
síndromes y enfermedades, por su aspecto similar en algunas de las características fenotípicas faciales
(Bertrand et al., 2004; Stratton et al, 1996):

i) síndrome de Cornelia de Lange, viii) displasia camptomélica,


ii) síndrome de Floating-Harbor, ix) secuencia de DiGeorge,
iii) displasia geleofísica, x) síndrome de Dubowitz,
iv) síndrome de Smith-Lemli-Opitz, xi) secuencia 10q duplicada,
v) embriopatía por tolueno, xii) secuencia 15q duplicada,
vi) síndrome lisencefálico de Miller-Diecker, xiii) síndrome GF,
vii) síndrome del valproato fetal, xiv) efectos fetales de la fenilcetonuria materna,

14
Cfr. en el Anexo I (Síndrome Alcohólico Fetal [FAS] y trastornos asociados. Criterios diagnósticos) el
detalle de estos sistemas diagnósticos.

21
Introducción

xv) síndrome óculo-dento-digital, xviii) síndrome velocardiofacial.


xvi) trisomía del par 18,
xvii) síndrome de W illiams, y

Los siguientes síndromes, por otro lado, deben ser globalmente diferenciados del FAS (Bertrand et al.,
2004; Stratton et al, 1996):

i) síndrome de Aarskog, vi) embriopatía por tolueno,


ii) síndrome de W illiams, vii) síndrome de la difenilhidantoína fetal,
iii) síndrome de Noonan, viii) síndrome del valproato fetal,
iv) síndrome de Dubowitz, ix) efectos fetales de la fenilcetonuria materna.
v) síndrome de Brachmann-DeLange,

Finalmente, otras enfermedades pueden confundirse no por su fenotipo (en el que no se parecen realmente)
sino por el aspecto cognitivo y conductual semejantes (Stratton et al, 1996):

i) síndrome del X frágil, iii) síndrome de Turner, y


ii) síndrome velocardiofacial, iv) síndrome de Opitz .

I.2.1.2. Los efectos del alcoholismo fetal (FAE):

La categoría, en algún momento, diagnóstica de los FAE surgió a modo de “cajón de

sastre” como una manera de engloblar , en los trabajos de investigación básica sobre el

AMF realizados en animales de laboratorio, todo aquello que no constituyera el FAS

completamente desarrollado. Es decir, conceptualmente, los FAE engloban todos los

efectos provocados en la descendencia por el EtOH consumido por la madre, sean estos

efectos físicos o cognitivos-conductuales, y que no alcanzan a conformar el FAS completo.

En cierto modo, la presencia de algún tipo de FAE implica un tipo de daño menor al

máximo que es capaz de provocar el AMF. Los FAE engloban, entonces, a los ARBD y a

los ARND.

22
Introducción

I.2.1.2.1. Los trastornos congénitos relacionados con el alcohol (ARBD).

En esta categoría se agrupan los efectos “puramente” físicos inducidos por el EtOH, las

malformaciones congénitas orgánicas.15 En el Anexo II (Manifestaciones fenotípicas físicas

en el Síndrome Alcohólico Fetal) se listan todas las malformaciones orgánicas (según su

frecuencia y sistema orgánico) que pueden estar presentes y que, en sí solas (excluyendo

las pre- y postnatales y las craneofaciales de la tabla y las del neurodesarrollo), dan lugar

a, y definen, los ARBD. No abundaré en esta categoría; no vienen al caso en este trabajo,

pero téngase en cuenta que puede determinar gran parte de la morbimortalidad que afecta

a estos desgraciados que pueden nacer mono- o polimalformados.

I.2.1.2.2. Los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el alcohol (ARND).

En contraste con la categoría anterior, en esta se incluye a todos aquellos signos y

síntomas cuyo origen depende o representa, si se quiere, un daño morfológico y/o funcional

del SNC.

En este amplio agrupamiento signo-sintomatológico se pueden observar desde las

groseras malformaciones anatómicas que amenazan la vida (o determinan la muerte) del

afectado, pasando por las más groseras y las más sutiles manifestaciones conductuales y

cognitivas observables por simple inspección o por delicados tests, hasta alteraciones sólo

puestas en evidencia por métodos de microscopía o bioquímicos, en el laboratorio clínico

15
Como se ve, el dualismo cartesiano aún tiene efectos ciertos en la ciencia del siglo XXI.

23
Introducción

o de investigación básica. Desde la simple microcefalia, se pueden observar defectos del

cierre del tubo neural (disrafias); holoprosencefalia y esquizencefalia; alteraciones del

desarrollo del cuerpo calloso desde las hipoplasias localizadas hasta la agenesia total;

hipoplasias del vermis y alteraciones en la foliación del cerebelo; distintos tipos de

displasias corticales, desde las que pueden ponerse en evidencia con estudios de imágenes

como las lisencefalias y macrogirias, las polimicrogias, o las heterotopías nodulares y en

banda hasta las que sólo pueden observarse por medio del uso del microscopio.

Sin embargo, más o menos afectado anatómicamente el cerebro, siempre será posible

observar alteraciones cognitivas o conductuales en los afectados por el FAS y por los

ARND. Así, por ejemplo, se ha dicho que el AMF es la principal causa teratogénica de

retraso mental (RM) (Bregman et al., 1995). El RM puede ser desde leve a profundo. Aún

más, el AMF puede provocar distintos tipos de trastornos cognitivos que no llegan a

conformar un diagnóstico de RM pero que comprometen la óptima actuación del individuo

en el mundo. Se pueden observar trastornos en el desarrollo del lenguaje y la memoria o de

las habilidades matemáticas y lingüísticas, trastornos práxicos y en las funciones ejecutivas,

alteraciones en el normal desarrollo psicomotor y de la socialización, inestabilidades en la

conducta, auto- y heteroagresividad y comportamientos socialmente desadaptativos (Conry,

1990; Famy et al., 1998; Jacobson, 1997; Jacobson y Jacobson, 1999; Kelly et al., 2000;

Mattson et al., 1996, 2001).

Entrando ya decididamente en el terreno de las enfermedades neuropsiquiátricas, se ha

implicado fuertemente al AMF como causa potencial de autismo y trastorno generalizado

del desarrollo; del trastorno por déficit de atención con o sin hiperactividad (TDAH);

de determinados trastornos de la personalidad (disocial, limítrofe, dependiente y

24
Introducción

evitativo) que por sí sólos son causa suficiente de un significativo sufrimiento para el

individuo que la padece y de la sociedad que lo aloja pero a la vez, además, causa

importante de otros trastornos neuropsiquiátricos; trastornos por abuso y/o dependencia

de sustancias (incluído el mismo alcohol además de, obviamente, otras drogas de uso ilegal

– cocaína, marihuana, anfetaminas, alucinógenos, etc. –); trastornos de la conducta

sexual; trastornos psicóticos y/o afectivos mayores (Baer et al., 2003; Famy et al., 1998;

Spear y Molina, 2005).

Párrafo aparte merecería la consideración in extenso acerca de que la EPE es una causa

importante de epilepsias de distinto tipo.16 Por sí solas, aún si se prescindiera del resto de

las alteraciones del SNC, las epilepsias son también generadoras de gran morbi-mortalidad

para quienes las padecen. Por otro lado, y sin llegar a las epilepsias, se han documentado

alteraciones eléctricas corticales en los hijos de madres alcohólicas que se ponen fácilmente

en evidencia con un simple electroencefalograma (EEG) (por ejemplo, disminución del

voltaje de las ondas ", lentificación eléctrica generalizada o localizada del trazado EEG)

o con un estudio de potenciales evocados (PE) (por ejemplo, aumento de la latencia en la

onda P300, etc.) (Mattson et al., 2001).

Vistos ya los efectos, consideremos ahora la causa eficiente de los FASD: el etanol.

16
Este punto en particular es bien conocido por los neuropsiquiatras ya desde los siglos XVIII y XIX. Cfr.
Magnan, 1871; Morel, 1857, 1860; Sullivan, 1899.

25
Introducción

I.3. El etanol (el agente etiológico):17

El alcohol etílico o etanol (EtOH; C2H6O;

Fig. 2) es un líquido incoloro, translúcido, de

olor característico, excelente solvente, menos

denso que el agua (* = 0,789 g/ml), con un

peso molecular (PM) de 46,0634 daltons. Fig ura 2. El etanol en representación trid im ensional con sus
nu bles electrón icas.

El EtOH se forma por la fermentación

anaerobia de algunos glúcidos (como Tabla 1. Concentración de etanol en distintos tipos de


bebidas alcohólicas.
la glucosa, fructosa y manosa) que
Graduación alcohólica
Bebida
llevan a cabo ciertas bacterias y (rango en %)

hongos espontáneamente, sin FERMENTADAS

Sidra 2-5
intervención humana. Por tal motivo, Cerveza 3-10
Vinos de mesa 8-13
el EtOH se produce en forma Vinos generosos o de licor 14-24
Vermuth 14-24
relativamente simple y a bajo costo
DESTILADAS o AGUARDIENTES
(Heath, 1974). Se lo encuentra en
Pisco 35-50
Brandy o Cognac 36-42
una gran cantidad de productos Ginebra 40-50
Ron de Jamaica 40-75
formando parte de bebidas, Whisky 45-53
Vodka 45-60
perfumes, solventes, productos Ron 45-70
Ron de Martinica 65

medicinales y cosméticos.
ARTIFICIALES o LICORES

Las bebidas que lo contienen, Licores 20-50

17
Excepto en los lugares en los que se indica, la mayor parte de la información de esta sección se basa en
datos tomados de las siguientes fuentes bibliográficas: Alonso-Fernández, 1992; Bruch Igartúa, 1993; Curci,
1993; Hobbs et al., 1996; Lehninger, 1986; Mayes, 1992; y Rall, 1991.

26
Introducción

según su forma de obtención, se clasifican en fermentadas, destiladas y artificiales. Son las

bebidas destiladas las que generalmente contienen la mayor concentración de EtOH (Tabla

1).

I.3.1. Farmacocinética:

El EtOH se puede absorber por varias vías. La vía enteral es, por lejos, la de más

frecuente uso. Pero otras vías de absorción se observan con frecuencia e importancia

variables.18

Una vez ingerido, la absorción del EtOH se lleva a cabo en un 20% en el estómago y el

80% restante en el duodeno y el yeyuno-íleon. Sin embargo, la absorción varía ampliamente

en función de la cantidad y calidad del contenido gástrico y la concentración alcohólica de

la bebida ingerida. Así, por ejemplo, en promedio, la ingestión de 44 g de EtOH en forma

de whisky (esto es, aproximadamente, unos 77 ml de un whisky de 45º) produce una

alcoholemia máxima de alrededor de 67-92 mg/dl si se lo ingiere con el estómago vacío;

en cambio, tras la ingestión de una comida mixta la alcoholemia correspondiente será de

unos 30-53 mg/dl. Igual cantidad de EtOH consumida en forma de cerveza (esto es, unos

694 ml de una cerveza de 5º, unas dos latas comunes) produce alcoholemias de 41-49 y 23-

18
Por ejemplo, la vía inhalatoria (de importancia en las exposiciones profesionales), la vía transdérmica
(como en el caso de la tan difundida costumbre en ciertos ámbitos socioculturales, en los que “para que el
bebé esté más tranquilito y se pueda dormir”, las madres les ponen a sus hijos lactantes un algodón o un paño
embebido en alcohol entre el pañal y la piel del abdomen), la vía rectal (de interés médico-toxicológico) y
la vía parenteral intravenosa (utilizada en el tratamiento de las intoxicaciones por metanol y etilenglicol –
etilterapia –) o las vías de inflitración local (como en el tratamiento de ciertas neuralgias por medio de la
llamada neurólisis alcohólica).

27
Introducción

29 mg/dl, con el estómago vacío y tras una comida mixta, respectivamente.

La distribución es rápida y amplia por tratarse de una molécula de bajo PM y muy

hidrosoluble y liposoluble. En virtud de su liposolubillidad atraviesa fácilmente todas las

barreras (entre ellas la hematoencefálica – BHE – y la placentaria, la hematotesticular y la

hematoalveolar). Tras la ingestión, en 5 a 10 minutos se lo puede detectar en la sangre y el

tiempo hasta la concentración plasmática pico es de 30 a 90 minutos. Para el ser humano,

el volumen de distribución del EtOH es, aproximadamente, de 0,7 l/kg para los hombres

y de 0,6 l/kg para las mujeres (la diferencia se debe a los distintos porcentajes de grasa

corporal total).

El EtOH desaparece del plasma, con una cinética de orden cero, entre las 8 a 10 horas

posteriores a la finalización de la ingesta.

El 90-98% del EtOH ingerido se oxida completamente a una velocidad de 100-150

mg/kg/h.19 Los alcohólicos crónicos, en tanto tengan una función hepática conservada,

pueden presentar un aumento de la velocidad de oxidación; por otro lado, la alcoholemia

de una persona que tiene daño hepático puede permanecer elevada más allá de las 24 horas

de finalizada la última ingestión.

En el hígado se produce la metabolización del 85-90% del EtOH ingerido. En un 70%

se metaboliza por medio de la acción secuencial de las enzimas alcohol deshidrogenasa

(ADH; E.C.: 1.1.1.1) y aldehído deshidrogenasa (ALDH; E.C.: 1.2.1.8). La ADH20 oxida

19
La velocidad de oxidación en los ratones es de unos 550 mg/kg/h y en las ratas de 300 mg/kg/h (Livy et al.,
2003). Es decir, ambas especies de roedores metabolizan el EtOH de 3 a 5 veces más rápido de lo que lo
hacemos los humanos.
20
La ADH, además de en el hígado, se expresa también en la mucosa gástrica (Livy et al., 2003). Este hecho
explica algunas diferencias farmacocinéticas como, por ejemplo, las mayores alcoholemias en mujeres que
en hombres (aquellas expresan la enzima gástrica en menor cantidad que estos) o en algunas etnias orientales
como, por ejemplo, en los japoneses quienes, en conjunto, expresan menores niveles de ADH gástrica que
los occidentales y por ello son más propensos a presentar el cuadro clínico de la denominada embriaguez

28
Introducción

el EtOH a acetaldehído y la ALDH lo convierte en acetato. En ambos pasos se generan

equivalentes reductores al reducirse el NAD+ a NADH.21

CH3-CH2-OH (etanol) + NAD+ º CH3-CHO (acetaldehído) + NADH + H+


Alcohol
deshidrogenasa

CH3-CHO (acetaldehído) + H2O + NAD+ º CH3-COOH (acetato) + NADH + H+


Aldehído
deshidrogenasa

El acetato, posteriormente, y por acción de la acetil-CoA sintetasa, es “activado” por

su unión a la coenzima A para formar acetil-CoA. La acetil-CoA puede ser luego utilizada

en varias reacciones anabólicas implicadas, entre otras, en la síntesis de colesterol y ácidos

grasos (contribuyendo así con la aparición de la esteatosis hepática – hígado graso – en los

alcohólicos crónicos22) y de otros constituyentes tisulares.

CH3-COOH (acetato) + CoA-SH + ATP º CH3-CO-S-CoA (acetil-CoA) + AMP + PPi


Acetil-CoA
sintetasa

Aproximadamente el 10 al 30% del EtOH se oxida por medio del denominado sistema

patológica ante bajos consumos de EtOH.


21
En la generación de NADH se basa uno de los métodos de detección bioquímica usados en el laboratorio.
22
Por otro lado, el aumento de la proporción [NADH]/[NAD +] tiene el efecto neto de reducir la actividad del
ciclo del ácido cítrico (ciclo de Krebs) y de inhibir la $-oxidación de los ácidos grasos, por lo que aumenta
la esterificación de estos para formar triacilglicéridos que se almacenan y contribuyen aún más al hígado
graso, lesión precursora primaria de la cirrosis alcohólica.

29
Introducción

microsomal de oxidación del etanol (MEOS)23 u oxidasas microsomales de función

mixta-citocromo P-450 2E1 (CYP2E1), asociado al retículo endoplasmático liso de los

hepatocitos. Este sistema enzimático es inducible por la acción crónica del mismo EtOH

y responsable del leve aumento en la velocidad de oxidación que se observa en los

bebedores crónicos. Esta inducción enzimática es también importante desde el punto de

vista médico-toxicológico en cuanto a las potenciales interacciones farmacocinéticas con

otras drogas y tóxicos.

CH3-CH2-OH (etanol) + NADPH + H+ + O2 º CH3-CHO (acetaldehído) + NADP+ + 2H2O


Oxidasas microsomales
de función mixta-citocromo CYP2E1

Existe un gran polimorfismo en los genes que codifican a las enzimas ADH, ALDH y

CYP2E1.24 Se postula que este polimorfismo podría ser responsable de las diferencias de

capacidad metabolizadora que se observan entre los sexos, diferentes individuos y grupos

étnicos. También serían responsables de las diferentes susceptibilidades o resistencias a

desarrollar dependencia y/o tolerancia al consumo de EtOH.25 Una consecuencia importante

del polimorfismo genético con respecto a las enzimas metabolizadoras es la que se

relaciona con la ADH gástrica, responsable de un efecto metabolizador de primer paso, más

o menos importante, llevado a cabo en el estómago, antes de que el EtOH se absorba y

pueda ejercer sus efectos sobre los órganos blanco (el hígado, incluido).

23
MEOS, por las siglas en inglés de microsomal ethanol oxydizing system, así denominado por sus
descubridores, Charles Lieber y Leonore DeCarli, en la década de 1960.
24
Para una revisión de los tipos de isoenzimas de la ADH y ALDH, cfr. Sanchis Fortea et al., 1999.
25
Es irrelevante analizar aquí los distintos tipos de isoenzimas de cada uno de los sistemas mencionados, pero
téngase presente que los mismos pueden estar involucrados en la producción de distintos tipos de daños en
los tejidos blanco.

30
Introducción

Un tercer sistema de metabolización es el de la catalasa (E.C.: 1.11.1.6), enzima

presente en los peroxisomas, que oxida al EtOH utilizando peróxido de hidrógeno. Este

sistema parecería ejercer su acción sólo ante concentraciones elevadas de la droga y ser de

escasa importancia en el metabolismo hepático, no así en el cerebro.

CH3-CH2-OH (etanol) + H2O2 º CH3-CHO (acetaldehído) + 2H2O


Catalasa

El acetaldehído formado como metabolito intermedio en todos los sistemas

metabolizadores del EtOH, es una molécula muy reactiva, responsable de gran parte de los

efectos tóxicos atribuidos al propio EtOH.

El 2-10% del EtOH que escapa a la oxidación se elimina, sin modificar, por vía renal y

pulmonar (principalmente) si bien que, en virtud de su capacidad para atravesar

membranas, se lo puede encontrar en todas las secreciones corporales.26

Desde el punto de vista energético, el EtOH es una molécula con una capacidad de

liberación de energía de 7,07 kCal/g (es decir, 29,58 kJ). Estas calorías se derivan, como

se vió, de la producción de equivalentes reductores en la forma de moléculas de NADH

que, por un mecasnismo indirecto, entran a las mitocondrias, organelas en las que, por

medio de la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa, se almacena

químicamente la energía en forma de ATP (adenosintrifosfato). También se almacena

energía del EtOH a partir de las moléculas de acetil-CoA que ingresan al ciclo de los ácidos

tricarboxílicos en el que se generan más equivalentes reductores que siguen la misma vía.

26
Como máximo, la concentración en la orina puede alcanzar un 130 % de la plasmática. Por otro lado, en
el aire espirado se encuentra una concentración de EtOH que corresponde al 0,05 % de la plasmática.

31
Introducción

De todas maneras, suele decirse que las calorías aportadas por el EtOH son “calorías

vacías” en el sentido de que las bebidas que lo contienen no aportan cantidades

significativas de vitaminas, minerales, oligoelementos, proteínas, glúcidos o lípidos. Las

calorías generadas por la oxidación del EtOH carecen de acción termogénica.27 Más

importante aún, el EtOH carece de capacidades “bioplásticas”, en el sentido de que no pasa

a formar parte de moléculas estructurales de las células o los tejidos28, algo que, se verá, es

de primordial importancia en la consideración del AMF.

I.3.2. Farmacocinética del etanol en la mujer. Características particulares:

El daño hepático se desarrolla más rápidamente en las mujeres que en los hombres

alcohólicos. Ante iguales niveles de consumo de EtOH, las mujeres (alcohólicas o no)

presentan mayores niveles de alcoholemia que los hombres.

Más arriba hemos visto que el volumen de distribución para el EtOH, en la mujer, es de

0,6 l/kg y que la diferencia es debida a los distintos porcentajes de grasa corporal total en

relación con el hombre (mayor porcentaje de grasa corporal – un tejido relativamente

exento de agua –) y además, en general, a un menor peso corporal que los hombres.

Una de las consecuencias muy importantes a tener en cuenta en el AMF (en relación al

27
De hecho, la sensación transitoria de calor que se experimenta tras beber una bebida alcohólica es debida
a una vasodilatación de los territorios vasculares periféricos por efecto del acetaldehído. Pero por este medio,
en realidad, se pierde calor por convección, radiación y conducción y el EtOH como tal es así, más bien, un
agente inductor de hipotermia.
28
Esto ha hecho que el gran fisiólogo francés y premio Nobel de Medicina en 1913, Charles Robert Richet
(1850-1935) dijera del EtOH que es en realidad un “antialimento” en su obra Les aliments et l’alimentation
normale de l’homme.

32
Introducción

polimorfismo de las enzimas metabolizadoras del EtOH que se mencionara ut supra) es que

la ADH gástrica (clase IV o F-ADH) tiene, normalmente, una actividad 70-80% menor en

la mujer no alcohólica que en el hombre no alcohólico. Más aún, en las mujeres, el abuso

crónico del EtOH reduce la actividad de la ADH gástrica entre un 11-20% por sobre el

basal ya de por sí menor con respecto al hombre.29 Así, las diferencias entre los sexos en

el efecto de primer paso hacen que, en las mujeres alcohólicas – a diferencia de los hombres

alcohólicos – sean iguales el área bajo la curva tras dosis iguales de EtOH/kg de peso

corporal administradas por vía oral o intravenosa; es decir que, para estas mujeres, beber

EtOH es prácticamente lo mismo que administrárselo por vía intravenosa (el alcoholismo

crónico prácticamente abole en ellas el efecto de primer paso). De este modo, la

biodisponibilidad del EtOH, en la mujer, es mucho mayor que en el hombre y los daños

potenciales, por lo tanto, también (Frezza et al., 1990).

I.3.3. Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido:

Si una embarazada consume bebidas alcohólicas, el 100% del EtOH que cosuma puede

estar en contacto con y/o pasar al embrión o al feto que gesta.

Debido a su bajo PM y a sus propiedades físicoquímicas, el EtOH puede atravasar

fácilmente las membranas biológicas. Por ello, ambos individuos, madre y concepto, en el

estado de equilibrio, comparten el EtOH y se comportan ante él como si fueran,

29
En el hombre alcohólico crónico la reducción de la actividad de la ADH gástrica se verifica entre el 37-46%
(Frezza et al., 1990).

33
Introducción

prácticamente, un solo compartimiento farmacocinético. De hecho, el coeficiente

alcoholemia materna/alcoholemia fetal es de 1, algo que no sucede con otras drogas de

abuso para las cuales la concentración plasmática fetal suele ser menor que la materna. Es

muy importante tener en cuenta que, para el feto, la vía de eliminación de drogas más

importante es el transporte feto-materno transplacentario. Ello se debe, en parte, a la menor

(o aún no desarrollada) capacidad fetal de metabolización de drogas (Szeto, 1995). La

placenta también permite el paso libre del acetaldehído (con potencialidad tóxica) y puede,

además, generarlo a partir del EtOH (Lieber, 2000).

Si una mujer que amamanta consume bebidas alcohólicas, sólo el 2% del EtOH total que

ingiera pasará al lactante por medio de su leche. No obstante, en tanto la mujer tenga

alcoholemias sustancialmente altas, su leche también contendrá EtOH (Mennella, 2001).

Esto se debe a que, en virtud del libre pasaje del EtOH a través de las membranas, la

concentración de EtOH en la leche es similar a la concentración plasmática y su

eliminación de ambos líquidos es temporal y cuantitativamente paralela. La alcoholemia

que se encuentre en el lactante será muy baja por efecto de la dilución del EtOH ingerido

con la leche en el agua corporal total del lactante (Heil y Subramanian, 1998). Sin embargo,

esto no implica que los bajos niveles de EtOH ingeridos a través de la leche que mama

carezcan de efectos biológicos dado que, en los recién nacidos, la vida media de

eliminación del EtOH es mayor que en los fetos ya que carecen de la placenta, importante

compartimiento metabolizador de la unidad materno-fetal (Szeto, 1995). Por otro lado (y

esto tiene importantes consecuencias conductuales a corto y largo plazo) la leche materna

que contiene EtOH ve modificados sus caracteres organolépticos (olor y sabor) (Mennella,

2001; Mennella y Beauchamp, 1991). Y el lactante es, desafortunadamente, altamente

34
Introducción

capaz de detectar estos cambios, igual que lo es el feto bañado por un líquido amniótico con

EtOH en solución (Molina et al., 2007).

I.3.4. Farmacodinamia:

El EtOH tiene varios mecanismos de acción farmacológica. Uno inespecífico en cuanto

que, por sus propiedades físicoquímicas, es capaz de atravesar membranas biológicas y de

insertarse, intercalarse entre sus lípidos. De esta manera altera las propiedades de las

membranas con las que entra en contacto (altera su grado de fluidez, principalmente) y, en

virtud de las alteraciones metabólicas que induce, altera la composición fosfolipídica de las

membranas.

Por otro lado, se postula que el EtOH tiene también un mecanismo de acción específico

uniéndose a receptores de neurotransmisores.

En el cerebro, por un lado, el EtOH actúa como un agonista de los receptores GABAA

incrementando su conductancia al Cl- y aumentando así la inhibición sináptica; de este

modo, actúa de manera similar a como lo hacen los barbitúricos y las benzodiazepinas,

drogas que comparten con el EtOH su capacidad sedativa y depresora del SNC y con las

que presenta tolerancia cruzada ante el consumo crónico.

Por otro lado, el EtOH actúa como un antagonista de los receptores glutamatérgicos

NMDA y, de este modo, disminuye la conductancia para los iones divalentes (el Ca2+ y el

Mg2+) a través de este canal iónico. Disminuye así la excitabilidad neuronal, pero induce,

a largo plazo, una regulación en más (o hacia arriba, up-regulation) de los receptores

35
Introducción

NMDA por aumento compensatorio de su expresión en la membrana neuronal. Este

fenómeno puede ser el origen de la hiperexcitabilidad observable ante las supresiones o

abstinencias agudas tras un consumo crónico. Se sospecha que, en los alcohólicos crónicos,

muchas de las manifestaciones de neurotoxicidad provocadas por el EtOH podrían deberse

a la excitoxicidad NMDA-dependiente provocada por las sucesivas abstinencias agudas en

aquellos que intentan abandonar su adicción, sin lograrlo finalmente. Esta misma

excitotoxicidad por abstinencia aguda es la que se supone que aumenta el daño en el

cerebro de los fetos de madres crónica y fuertemente alcohólicas que, a lo largo del

embarazo, presentan sucesivas y frecuentes abstinencias.30

I.3.5. Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivo-

conductuales en la intoxicación aguda:

En los seres humanos, la intoxicación alcohólica aguda se manifiesta, desde el punto de

vista cognitivo y conductual, de manera diferente según sea el nivel de alcoholemia

alcanzado (Tabla 2).

La dosis letal 50 (DL50) del EtOH es de 5-8 g/kg para los humanos adultos y de 3 g/kg

para los niños. En las intoxicaciones agudas fatales, la alcoholemia promedio que se ha

detectado es de unos 400 mg/dl (4 g/l). Sin embargo, un alcohólico crónico puede tolerar

niveles de hasta 500 mg/dl sin manifestar grandes alteraciones conductuales. Esta mayor

30
Por ello, se ha especulado con que, para el cerebro fetal, el daño por el AM F sería incluso mayor en madres
que beben fuertmente y se abstienen en forma repetitiva que en aquellas que lo hacen en forma sostenida.

36
Introducción

tolerancia de los alcoholistas crónicos se debe a los lentos y progresivos cambios

metabólicos que van sucediéndose con el tiempo y que le permiten al bebedor modificar

la respuesta habitual al EtOH (tolerancias farmacocinética y farmacodinámica).

En las ratas, la DL50 también varía según la vía de administración y la edad. Así, en ratas

jóvenes (3-4 meses de edad) la DL50 es de 10,6 g/kg por vía oral y de 6,71 g/kg por vía

intraperitoneal, en tanto que para las ratas viejas (10-12 meses de edad) estos valores son

de 7,06 y 5,10 g/kg, respectivamente (Wiberg et al., 1970). En la rata adulta, la DL50 por

vía intravenosa es de 1,44 g/kg. Por otro lado, la DL50 por vía oral es de 3,45 y 6,3 g/kg para

el ratón y el conejo, respectivamente.

Tabla 2. Relación de los distintos niveles de alcoholemia con las manifestaciones cognitivo-conductuales
observables en el ser humano agudamente intoxicado:

Alcoholem ia
M anifestaciones cognitivo-conductuales
mg/dl* g/l mM *

Período subclínico, sin signosintomatología evidente; sin embargo, en


pruebas psicométricas se observa enlentecimiento de la respuesta ante
10-50 0,1-0,5 2,17-10,85
estímulos; comienza el deterioro del juicio crítico; alteración de la
motricidad fina.

Euforia, excitación psicomotriz, hiperactividad, logorrea, hipoprosexia,


signos de afectación cerebelosa (adiadococinesia, ataxia, disartria,
50-150 0,5-1,5 10,85-32,56
dismetría); visión borrosa o diplopía, visón en tunel; compromiso
judicativo franco.

Aumenta la excitación; confusión mental, heteroagresividad, labilidad


150-250 1,5-2,5 32,56-54,27
afectiva; alteraciones sensoperceptivas, ataxia, vértigo; juicio suspendido.

Apatía, marcada ataxia, nistagmus, falta de respuesta a los estímulos,


relajación esfinteriana; hipo o arreflexia, hipo/analgesia, hipotermia;
250-350 2,5-3,5 54,27-75,98
obnubilación, estupor, coma. En mujeres que amamantan, inhibición del
reflejo de eyección de la leche.

>350 >3,5 >75,98 Bradipnea; parálisis respiratoria, muerte.

* Para interconvertir valores de concentración de mg/dl a mM debe multiplicarse o dividirse por un factor de 0,21709.

Es claro, entonces, que distintas especies animales tienen diferente sensibilidad al EtOH

y que dentro de una misma especie, la sensibilidad varía de acuerdo con la edad del animal

37
Introducción

y la vía por la que se administra el tóxico.31

I.4. Desarrollo normal del sistema nervioso central (el período de acción de la noxa):

En el cerebro de cada ser humano se producen innumerables y muy complejos cambios

morfofuncionales durante el desarrollo. Estos cambios son tanto groseros como

extremadamente sutiles y cada uno de ellos puede ser el blanco potencial de alteraciones

causadas por factores físicos, químicos y/o biológicos. Estas alteraciones serán, a su vez,

el origen de diversas enfermedades que se manifestarán durante la niñez, adolescencia o

adultez de la persona afectada.

El desarrollo cerebral comienza en el neuroectodermo del embrión trilaminar y llega a

ser un complejo órgano de intrincadísima anatomía.

En el adulto, el cerebro está compuesto por unas 10 11 neuronas (cien mil millones) 32 (Hubel, 1981;
Kandel, 1991; Kandel et al., 1991). Sólo en la corteza cerebral, la región cerebral que suponemos
evolutivamente más avanzada, se estima que las neuronas suman alrededor de 9 × 10 9 (nueve mil millones)
(Angevine, 1995). Cada neurona, por su parte, es capaz de formar, en promedio, alrededor de 10.000 sinapsis
por lo que puede suponerse que el número total de sinapsis en el sistema nervioso central es de unos 10 14 (cien
billones) en promedio (Hubel, 1981; Kandel et al., 1991). Es comprensible entonces que se pueda producir
alguna alteración en la formación de tan descomunal estructura.33

El desarrollo cerebral prenatal es, así, un complejo y continuo proceso de eventos

31
Todas estas son consideraciones que han de tenerse en cuenta a la hora de diseñar experimentos que
mimeticen las condiciones ambientales observadas en la realidad de los humanos (Cfr Anexo IV: Métodos
experimentales de exposición animal al etanol. Ventajas y Desventajas de cada uno).
32
Más o menos un factor de 10 (10 10-10 12 = diez mil millones a un billón).
33
De hecho, parece casi realmente milagroso que, por lejos las más de las veces, este proceso se lleve a cabo
con una relativa normalidad en cada uno de los seres humanos que nacen todos los días y que no sean
muchísimo más frecuentes las malformaciones con un correlato funcional apreciable.

38
Introducción

genéticos y epigenéticos.

Los investigadores, tan afectos a esquematizar la realidad, afirman que, en el desarrollo

de cualquier región del SNC, se pueden identificar siete u ocho fases generales (Cowan,

1980; Monk y Webb, 2001); son estas:

1) Inducción de la placa neural, regionalización y establecimiento de valores


posicionales de las células neuroepiteliales;
2) Neurulación, proceso básico por el que la placa neural se transforma en el tubo
neural, cerrado, con una cavidad central;
3) Proliferación regionalmente diferenciada de las células neuroepiteliales y producción
de neuroblastos en los distintos territorios (neurogénesis);
4) Migración de los neuroblastos (Nb) postmitóticos desde su lugar de generación hasta
su lugar de residencia final, con la consiguiente agregación celular para formar
regiones diferentes del cerebro y desde las cuales los Nb comienzan la
5) Extensión axonal inicial para interconectar a los Nb, y las distintas regiones en que
residen, entre sí;
6) Sinaptogénesis, por el establecimiento de conexiones de los Nb postmigratorios
entre sí y comienzo, con ello, de la
7) Diferenciación de los Nb a neuronas maduras; con la posterior
8) Muerte celular programada selectiva de ciertas neuronas, la mayor parte de ellas
por apoptosis, que lleva, finalmente, a la eliminación de muchas de las sinapsis
inicialmente formadas y a la estabilización de las restantes (“sintonía fina”, o fine
tuning de los angloparlantes) en un proceso que insume, en realidad, toda la vida del
individuo.34

34
De más está aclarar que varios de los estadíos o fases enumerados no son estrictamente secuenciales sino
que, varios de ellos, se solapan entre sí. Así, por ejemplo, mientras los Nb migran, otras células proliferan y
aún otras sufren apoptosis.

39
Introducción

I.4.1. La inducción de la placa neural y la neurulación:

Tras la gastrulación, el embrión está

conformado por un disco trilaminar en

el que se interpone un tejido celular

laxo (el mesodermo intraembrionario)

entre dos láminas (ectodermo y

endodermo) de epitelio cúbico simple.

La inducción de la placa neural es

el proceso por el cual una región del

ectodermo comienza a transformarse en

un tejido comprometido hacia el

desarrollo del SNC: la placa neural

(también epitelial, laminar, pero

cilíndrica simple). 35 Durante la


Fig ura 3. La neurulación. En esta fig ura se resum en los cam b ios q ue
o c u rren du ran te la n eu ru lació n: la tran sfo rm ació n d e u na p lac a
inducción de la placa neural se epitelial lam inar (A ) en una estructura tubular cerrada (G ). D e A a D ,
los p asos sucesivos en vistas sup erior (colum na izq uierd a), en un
corte coro nal (m edio) y en vista s de cortes coro nales al m icro scopio
elec trónico de barrido (derecha). La lám ina epitelial de la placa
establecen en el neuroectodermo los ne ural ya ind uc ida (E) ya está region alizad a en distintas zo na s,
llam adas placas; esta s son (d e m edial a late ral): p laca del piso, basal,
alar y del techo. A l m ism o tiem po se establecen los p rincipales ejes
ejes principales del futuro SNC d el futuro SN C (céfalocuad al y m ediolateral/d orsoventral). Lueg o d e
transform arse la placa en tub o, tras el cierre de los neurop oros
anterior y po ste rior (F), queda conform ada una estructura tubu lar
hueca, cerrada, que conserva los m ism os territorios (G ) pero en
(céfalocaudal y dorsoventral). A la par distinta conform ación espacial. D e la p laca basal surgirán todas las
ne u ronas y estructuras m otoras del S N C y de la placa alar, las
intern eu ronas; la casi totalidad de las neuronas sensitivas surgen
quedan establecidos también los com o derivados extratubu lares d e las crestas neurales. E n las
vesículas telencefálicas solo se conocen derivados de la p lac a alar
q ue d an orig en a la corteza cerebral. M od ificad o y com p uesto a
partir de: A lberts et a l., 1996; C ow an, 1980; H ib, 1986; y R ubinste in
territorios presuntivos que darán origen et al., 1998.

35
En el proceso de inducción intervienen múltiples sustancias solubles y de superficie celular que
intercomunican a tejidos y estructuras adyacentes (que no viene al caso detallar aquí) y que son las
responsables de que tal inducción se lleve a cabo correctamente. Entre otras estructuras debe mencionarse,
ineludiblemente, a la notocorda y al mesodermo precordal.

40
Introducción

luego a cada una de las principales regiones del SNC (Fig. 3E,G). La corteza cerebral (CC),

por ejemplo, deriva íntegramente de un territorio delimitado en la región anterolateral de

la placa neural que dará origen a todo el telencéfalo (Rubenstein et al., 1998).

Las células del neuroectodermo que forman la placa, a diferencia de lo que sucede en

el ectodermo general (que dará origen a los derivados tegumentarios -piel y faneras-), se

multiplican a mayor velocidad, crecen en altura y terminan por transformar la placa

original, plana, en un estructura tubular, el tubo neural, en principio abierto pero que va

cerrándose progresivamente hasta conformar un tubo totalmente cerrado. El proceso

completo de transformación de una lámina epitelial bidimensional (la placa neural) en un

tubo epitelial cerrado (el tubo neural) es el proceso que recibe el nombre de neurulación

(Fig. 3) (Alberts et al., 1994; Jessell y Schacher, 1991; Martin y Jessell, 1991).

I.4.2. Formación de las vesículas encefálicas:

Por crecimiento diferencial en la región

cefálica el tubo neural desarrolla tres

expansiones: la vesícula prosencefálica

(cerebro anterior), la mesencefálica

(cerebro medio) y la rombencefálica

(cerebro posterior). La vesícula

prosencefálica se dividirá posteriormente

en dos (telencéfalo y diencéfalo) y la


Figura 4. E l em brión y el S N C en sus estadíos d e 3 y 5 vesículas
y los derivados a qu e d arán o rige n p osteriorm en te. M od ificado de
A lberts et al., 1996.

41
Introducción

vesícula rombencefálica hará lo propio dando origen a otras dos vesículas (metencéfalo y

mielencéfalo) en tanto que la vesícula mesencefálica permanecerá indivisa (Fig.4). Así,

tempranamente en el desarrollo quedan conformadas las principales regiones del SNC que

perdudarán como tales hasta la adultez. En la Tabla 3 se esquematizan estas relaciones y

se puede apreciar qué regiones maduras derivan de cuáles vesículas embrionarias.

Tabla 3. Divisiones y subdivisiones anatómicas macroscópicas principales del Sistema Nervioso y su


relación con estructuras embrionarias:

SISTEM A N ERVIOSO CEN TRAL (SNC)

Componentes de los
Divisiones macroscópicas mayores del estadíos embrionarios de Cavidad
Sistema Nervioso adulto* central
5 vesículas 3 vesículas

Corteza Cerebral
HEMISFERIOS Ventrículos
Telencéfalo
CEREBRALES Cerebro Anterior laterales
Ganglios Basales
o Prosencéfalo

Diencéfalo Diencéfalo III Ventrículo


ENCÉFALO
Cerebro Medio Acueducto de
TRONCO Mesencéfalo Mesencéfalo
o Mesencéfalo Silvio
DEL
ENCÉFALO
Protuberancia Cerebelo Metencéfalo
Cerebro Posterior
IV Ventrículo
o Rombencéfalo
Bulbo Raquídeo Mielencéfalo

Conducto del
MÉDULA ESPINAL
epéndimo

SISTEM A NERVIOS O PERIFÉRICO (SNP)

GANGLIOS CRANEALES

NERVIOS CRANEALES

GANGLIOS RAQUÍDEOS o de la RAÍZ DORSAL

NERVIOS ESPINALES

GANGLIOS AUTÓNOMOS

MÉDULA SUPRARRENAL

* Para la división del SNC humano adulto sigo la esquematización neuroanatómica tal como consta en Carpenter (1985).

42
Introducción

I.4.3. Desarrollo de las vesículas telencefálicas y corticogénesis:

La historia histogenética de la CC es la historia de los sucesos ontogénicos que se

suceden en el neuroepitelio de las vesículas telencefálicas a partir de la formación del tubo

neural, hasta el final del embarazo y aún después del parto, probablemente durante toda la

vida postnatal.

Debido a que la mayor parte de las enfermedades neuropsiquiátricas son manifestaciones

de alteraciones morfofuncionales de la CC, en este trabajo me centraré en los aspectos del

desarrollo que están más directamente relacionados con esta estructura.

I.4.3.1. Formación del neuroepitelio:

El epitelio del tubo neural formado a partir de la neurulación se denomina neuroepitelio.

Las células pluripotenciales que lo forman, denominadas células neuroepiteliales (cNEp),

comienzan a dividirse por mitosis y dan inicio así al período de proliferación.

Como en todo epitelio

pseudoestratificado las células tienen su

núcleo en la porción más abultada del

citoplasma y prolongaciones
Fig ura 5. Etapas d el d esarrollo d el neuroep itelio en la reg ión
citoplasmáticas que alcanzan tanto la d orsal d e las vesículas telencefálicas. V er exp licación y
referencias en el texto. M odificado de S idm an y R akic, 1973.

membrana basal (o membrana limitante

externa – MLE –, como se la denomina en el tubo neural) como la superficie apical que

43
Introducción

reviste la cavidad (donde forman la membrana limitante interna – MLI –) (Fig. 5A). Sin

embargo, en el neuroepitelio la mayoría de las células comienzan a acomodar su núcleo

cerca de la MLI y las prolongaciones que se proyectan hacia la MLE determinan en

conjunto una zona relativamente libre de núcleos y abundante en prolongaciones, que se

denomina zona marginal (ZM) o preplaca (PP). Por otro lado, la zona interna del

neuroepitelio, cercana a la MLI, donde se acumulan los núcleos de las cNEp, se denomina

zona ventricular (ZV). Así, en un principio, el tubo neural está formado por un epitelio en

el que se distinguen dos zonas, la ZV (interna) y la ZM o PP (externa) (Fig. 5B). A medida

que los Nb postmitóticos de reciente formación comienzan a migrar (vide infra) comienza

a observarse una tercera zona, la zona intermedia (ZI), migratoria, que separa a las dos

anteriores (Fig. 5C); una vez que arriban a su lugar de residencia final por debajo de la PP

se acumulan en una zona progresivamente más gruesa, la placa cortical (PC), que

constituye el precursor de la CC (Fig. 5D,E). De este modo, en su pleno desarrollo el

neuroepitelio está compuesto por cinco zonas claramente diferenciables desde el punto de

vista histológico que, de dentro afuera, son: ZV, ZSV, ZI, PC, ZM o PP (Sidman y Rakic,

1973).

I.4.3.2. Cinética proliferativa de las células neuroepiteliales:

Al principio de la neurogénesis36 las cNEp se dividen de forma simétrica de modo tal

que generan, como células hijas, a dos nuevas cNEp que permanecen en el ciclo celular

36
Alrededor de los días E11-E12 para los roedores, y en la 5ª semana gestacional humana (E29-E35).

44
Introducción

(Guillemot, 2005; Supèr et

al., 1998). Estas divisiones

simétricas, también

llamadas proliferativas,

tienen por efecto expandir

la población de cNEp y, por

lo tanto, incrementar el

número de células madre.

Posteriormente, la mayoría Figura 6. N eurog énesis tem p rana en la vesícula telencefálica d orsal d e los m am íferos
(región de la futu ra corteza cerebral). La referencia tem poral corresponde al desarrollo
del cerebro d el ratón. V er d escrip c ión y referencias en el texto. M od ificad o d e
G uillem ot, 2005.
de las cNEp que entran en

mitosis se dividen de manera asimétrica, es decir que, tras la citocinesis, una de la células

hija continúa siendo una cNEp y la otra se diferencia a uno de dos tipos celulares posibles:

a) un Nb postmitótico que sale del ciclo celular (se dice que entra en G0) y comienza a

migrar tangencialmente hacia la ZM/PP, o b) una célula progenitora basal. Estas divisiones

asimétricas se denominan también divisiones diferenciativas en virtud de que dan origen

a diferentes tipos de células hijas una de las cuales se diferencia a Nb (Fig. 6A) (Guillemot,

2005).

A medida que progresa la neurogénesis, se ponen en juego múltiples vías de señalización

intracelular que inducen la expresión de marcadores gliales en las cNEp por lo que estas

se transforman en células de la glía radial (cGR). Las cGR también se dividen

simétricamente para originar otras dos cGR y asimétricamente para originar una nueva cGR

y un neuroblasto postmitótico (que luego migra radialmente hacia la PC) o a una célula

progenitora basal que se interna algo en el espesor de la pared del tubo neural en dirección

45
Introducción

a la ZM, y se localiza en una zona de reciente formación, la ZSV (Fig. 6B) (Guillemot,

2005). En conjunto, entonces, la ZV y la ZSV forman lo que se llama globalmente zona de

germinación o germinativa (ZG) del neuroepitelio (Sidman y Rakic, 1973).

I.4.3.3. Ritmo proliferativo de las zonas ventricular y subventricular del

neuroepitelio:

La proliferación de las cNEp en el

tiempo es continua, pero no uniforme.

Existen picos u oleadas de proliferación

activa (picos proliferativos) que se


Figua 7. O rigen de las neuronas corticales de las oleadas
alternan con períodos de relativo reposo ne ur ogenéticas p rim aria y secund aria. M P, D P, LP y V P: cortez a
m edial, dorsal, late ral y ventral, respectivam ente . LG E : e m inencia
g an gliónica lateral. M G E : em inencia gangliónica m edial. A E P /P O A :
(valles proliferativos). área entorrinoped uncu lar/preó ptica an terior. ZV : zo na ven tricu lar.
ZS V : zo na subventricu lar. H : h ipoca m po. N C x: neoco rteza. S tr:
cuerp o estriado. PC x: cor tez a p iriform e. M od ificad o d e M arin y
R ubenstein, 2001.
La CC se forma a partir de dos

grandes ondas proliferativo-migratorias. La primer gran onda migratoria, compuesta por

varios picos sucesivos, es la llamada neurogénesis primaria. En esta se originan Nb que

migran con un patrón predominantemente radial. Finalizada la migración, estos Nb se

diferencian a macroneuronas, excitatorias, de proyección, que utilizan glutamato como

neurotransmisor (Dobyns et al., 1996; Guillemot, 2005; Marín y Rubenstein, 2001; Sidman

y Rakic, 1973). Esto es, se originan primero las neuronas que constituirán la principal

eferencia cortical (Flores et al., 1988). La neurogénesis primaria se lleva a cabo en la ZG

(ZV – principalmente – y ZSV) de la región dorsal de las vesículas telencefálicas

46
Introducción

(Guillemot, 2005) (Fig. 7). Luego de abandonar el ciclo celular, los Nb migran hacia la ZM,

según hemos visto. Así, se generan ondas de desplazamiento u ondas migratorias que

tienen un patrón de desplazamiento típico: los Nb comienzan a migrar en un momento

determinado y lo hacen a una velocidad propia y característica para alcanzar localizaciones

precisas (su residencia final). Las ondas de desplazamiento, originadas por los picos

proliferativos, son la base de la organización laminar característica de las regiones

dorsales del tubo neural37 en las que cada lámina en el adulto se corresponde con una

onda de desplazamiento en el embrión o el feto (Hatten, 1999).38 Las capas o láminas de

la CC se forman por la migración de sucesivas oleadas que conformarán las diferentes

láminas. Pero el modo de ordenación es tal que, tras una oleada de Nb, la próxima oleada

(y cada una de las sucesivas posteriores) se sitúa sobre (y no debajo de) los Nb de la oleada

anterior. Cada Nb de una oleada detiene su migración cuando hace contacto con las células

de Cajal-Retzius de la ZM/PP (vide infra) por lo que la primera capa en formarse en la CC

es la VI, luego la V, la IV, la III y, por último, la II en un patrón de formación que se

denomina de “dentro-afuera” (inside-out, originalmente en inglés) (Sidman y Rakic,

1973).39

Cuando la neurogénesis primaria aún no se ha agotado pero está ya en franca

disminución, comienza una segunda onda migratoria que involucra numéricamente a

muchos más Nb y que dura considerablemente más tiempo que la primera onda; es la

neurogénesis secundaria (Dobyns et al., 1996; Sidman y Rakic, 1973). En estos picos

37
Como la CC, tubérculos cuadrigéminos, cerebelo, astas grises dorsales de la médula espinal.
38
Esto difiere con lo que sucede en las regiones ventrales del tubo neural en las cuales se forman estructuras
no laminadas (a excepción del tálamo y del cuerpo geniculado externo) (Hatten, 1999). Esta es otra
consecuencia de la temprana especificación regional que se produce con el establecimiento del eje
dorsoventral en la placa neural.
39
La futura capa I de la CC es la ZM/PP.

47
Introducción

proliferativos más tardíos se produce la proliferación de cNEp indiferenciadas que han

dispuesto a sus células hijas en la ZSV luego de la citocinesis (las células progenitoras

basales, ya mencionadas) (Fig. 6B). Estas últimas, en la ZSV, proliferan aún más y generan

Nb que, luego de migrar mayormente en forma tangencial hasta su residencia final, darán

origen a las microneuronas que utilizan GABA como neurotransmisor; esto es, a aquellas

que constituirán las pequeñas interneuronas inhibitorias de circuito local (Cowan, 1980;

Hatten, 1999).40 Estas microneuronas se originan a partir de Nb que han migrado desde la

ZSV de regiones ventrales de las vesículas telencefálicas, especialmente de una estructura

transitoria llamada eminencia gangliónica lateral (EGL) (Fig. 7) (Guillemot, 2005; Hatten,

1999).41 Más tarde aún durante la neurogénesis secundaria, en forma generalmente más

abundante durante la segunda mitad de la gestación humana e incluso después del

nacimiento (esto último es especialmente cierto para los roedores), se producen los picos

proliferativos que originarán predominantemente a los glioblastos. Los glioblastos, por

diferenciación, darán origen a los distintos tipos de células de la macroglía central42 (Fig.

8).

Se puede apreciar que, en virtud de estos picos proliferativos y ondas migratorias, el

desarrollo del SNC no es homogéneo. Las neuronas no se producen todas a la vez o en

40
Con esto, se ve nuevamente confirmada la validez general del clásico postulado de la ley biogénetica
fundamental que acuñara en 1874 el zoólogo alemán Ernst Haeckel (1834-1919) y que reza “la ontogenia
recapitula la filogenia”. Filogenéticamente, han aparecido primero las macroneuronas (neuronas sensitivas
y motoras, principalmente excitatorias) y más tarde las microneuronas (interneuronas, principalmente
inhibitorias).
41
La EGL también es el origen de Nb que migran hacia áreas ventrales, hacia el adyacente núcleo caudado,
al putamen, al complejo nuclear amigdalino y al tálamo (en el diencéfalo) por vía de la cápsula interna
(Hatten, 1999).
42
Células de la macroglía central son todas aquellas que, exceptuando a los microgliocitos, residen en el SNC,
como, por ejemplo, los astrocitos protoplasmáticos subependimarios, velamentosos, candelabro subpiales,
plumosas de Fañanas; astrocitos fibrosos y ependimarios; células cometa, de Bergmann y de Müller;
oligodendrocitos perineuronales e interfasciculares, etcétera.

48
Introducción

forma constante e

indiscriminada, sino con

patrones o secuencias

proliferativas que son

específicas, ordenadas y

características para cada

región del SNC. Cada región

puede iniciar así, en momentos

distintos, un número variable

de picos de proliferación y

ondas de migración de

velocidad también variable.

Las consecuencias de la
Figura 8. R esum en esq uem ático d e la neurog énesis a p artir d e la diferenciación
acci ón de un agente de las células neuroepiteliales. A bajo, línea tem p oral según sucede en el
desarrollo de la CC de la rata. M odificado de H ib, 1986 y S auvageot y Stiles, 2002.

teratogénico que interfiera con

estos procesos dependerá del momento en que éste actúe y pueden explicar muchas de las

malformaciones congénitas que aparecen en el hombre o en los animales de

experimentación (Flores et al., 1988).

I.4.3.4. Las células de la glía radial:

Hemos visto que las cGR se forman a partir de cNEp que, tras dividirse asimétricamente,

49
Introducción

comienzan a expresar marcadores gliales y conservan sus prolongaciones citoplasmáticas

apical y basal. Más tarde también son generadas a partir de glioblastos que emiten

prolongaciones radiales inducidos por la presencia de factores difusibles de origen neuronal

(Hatten, 1999; Supèr et al., 1998). La masa citoplasmática mayor de la cGR, en la que se

encuentra el núcleo, se localiza en la ZSV del neuroepitelio (Sidman y Rakic, 1973).

Las cGR le proveen a los Nb el andamiaje a través del cual migrar. Ese andamiaje es

inducido y mantenido por los mismos Nb y por ciertas neuronas de la corteza en desarrollo

(las de Cajal-Retizius de la ZM/PP). Además, al proveer un sistema ordenado y conservado

de migración radial, las cGR sirven para preservar externamente la representación del

protomapa ventricular que existe en el neuroepitelio desde los estadíos de placa neural y

de tubo neural (vide supra) (Fig. 3E y 9); es decir, mantienen tridimensionalmente

inalterada la representación bidimensional de los territorios presuntivos al permitir que los

Nb partan de un lugar

periventricular para llegar a

lugares equivalentes en la

pared externa del tubo neural

que se está engrosando (Rakic,

2003a; Supèr et al., 1998).

Las cGR son una guía

migratoria también para los

axones que, más tarde,


Figura 9. H ipótesis de la u nidad rad ial de R ak ic. A la iz q u ie rda, neu roblasto
postm itótico m ig ratorio (N b ), en p lena m ig ración , adherid o a la prolong ación
comienzan a llegar para citoplasm ática externa de una cG R . A la derecha, m odo de form ación d e las
colum nas corticales, y especificación de las áreas corticales, según predice la
hipótesis d e R ak ic. G racias a la m ig ración p or m edio d e las cGR , se conservan,
expand id as, las áreas d efinid as p reviam ente en el p rotom apa ventricular. N b :
inervar a la corteza en neuroblasto po stm itótico m igratorio. M odificado de R akic, 1988 y 2003a.

50
Introducción

desarrollo, desde regiones subcorticales y desde otras áreas corticales (aferencias

tálamocorticales y corticorticales) (Fig. 9).

Por otro lado, estas células también proveen la estructura que le permite a los Nb

corticales disponerse en una organización columnar (Sidman y Rakic, 1973; Supèr et al.,

1998) ya que los Nb migran uno tras otro, separados por cierta distancia, adheridas a las

prolongaciones externas de las cGR (Fig. 9) (Hatten, 1999; Sidman y Rakic, 1973).43

Las cGR también son neuroprogenitoras ya que se

dividen simétrica y asimétricamente. Por división

asimétrica pueden dar origen a Nb que posteriormente

migran hacia la PC por medio de otras cGR (Tamamaki et

al, 2001). De hecho, las cGR de regiones diferentes del

telencéfalo determinan también la formación de Nb

corticales específicamente comprometidos hacia

determinados fenotipos en lo relativo a la utilización de

neurotransmisores (Fig. 7) (Kriegstein y Götz, 2003;

Marín y Rubenstein, 2001).

Una vez terminado el período migratorio, las cGR no

permanecen en el cerebro adulto con su fenotipo radial

sino que lo modifican radicalmente. Las células retraen

primero sus prolongaciones y los pies terminales de la


Figura 10. Transform ación fenotípica de las
cGR en d istintos tip os m orfológ icos d e
prolongación externa, pasando luego por formas astr o c ito s u n a vez te rm in ad a la
ne urog én esis. a: cG R ; b-k: as tro citos.
M od ificad o d e R akic, 2003b .

43
Nótese que, con esto, hemos visto ya cuáles son los dos mecanismos del desarrollo que permiten la
estructuración básica de la citoarquictetura neocortical adulta normal. Esto es, la organización laminar en
virtud de las ondas proliferativas y migratorias de los Nb y la organización columnar en virtud de la migración
radiada que posibilitan las cGR.

51
Introducción

morfológicas intermedias, hasta convertirse finalmente en distintos tipos de astrocitos (Fig.

10) (Rakic, 2003b; Sidman y Rakic, 1973; Supèr et al., 1998). El cambio de fenotipo se

pone en evidencia por el cambio de expresión en el principal tipo de filamentos intermedios

de su citoesqueleto que es la vimentina. Al cambiar el fenotipo comienza a expresarse la

GFAP44, una proteína marcadora típica de la astroglía madura.

I.4.3.5. Evolución posterior del neuroepitelio en las vesículas telencefálicas:

A medida que los Nb de las sucesivas oleadas migran y engrosan progresivamente la PC,

comienzan a arribar a esta estructura axones de neuronas catecolaminérgicas cuyos somas

residen en vesículas más caudales (prosencéfalo basal, mesencéfalo, metencéfalo -futura

protuberancia-) (Zecevic y Verney, 1995). Estos axones catecolaminérgicos invaden la PC

en desarrollo, realizan sinapsis con las células de Cajal-Retzius (cC-R)45 ya residentes en

la ZM/PP y parecerían cumplir funciones como organizadores de la corticogénesis en

progreso (Marín-Padilla, 1998; Supèr et al., 1998). Posteriormente comienzan a

diferenciarse secuencialmente las allocortezas de 3 capas (arqui- y paleocorteza) y luego

la isocorteza de 6 capas (neocorteza), nuevamente recapitulando la filogenia.

Algo después comienzan a arribar axones desde los núcleos talámicos (las aferencias

44
Por las siglas en inglés de glial fibrilar acidic protein (proteína gliofibrilar ácida).
45
Las cC-R son un tipo especial de neuronas, quizás de las primeras en migrar a la ZM/PP y diferenciarse a
partir de los Nb generados en las primeras divisiones asimétricas de las cNEp. De maduración precoz, se
establecen tempranamente en la PP y , posteriormente, una vez que la PP sea escindida por la PC, residirán
por fuera de esta última, en la ZM (futura capa I o molecular de la neocorteza madura). Las cC-R tienen
capital importancia en el desarrollo y organización de la CC madura (tanto arqui, como palio y neocorteza).
Son, en la corticogénesis, las primeras en diferenciarse, madurar y recibir contactos sinápticos (Marín-Padilla,
1998; Supèr et al., 1998; Zecevic y Verney, 1995).

52
Introducción

tálamocorticales específicas). Estos axones, durante un tiempo, antes de penetrar en la PC,

establecen contactos sinápticos con neuronas situadas en una estructura transitoria de

localización inmediatamente subyacente a la PC y destinada a desaparecer hacia el

momento del nacimiento: la subplaca (SP) (Allendoerfer y Shatz, 1994; Zecevic y Verney,

1995). Cuando progresa el desarrollo de la PC y estas aferencias tálamocorticales

específicas envían colaterales definitivas hacia afuera (a la PC), establecen contactos

sinápticos sobre todo con las neuronas de la futura capa IV (granular interna) y empieza de

este modo a determinarse la regionalización en áreas corticales según qué áreas reciben

axones desde cuál núcleo talámico específico (O’Leary et al., 1994; Rakic, 1988). Poco

tiempo después comienzan a establecerse, desde cada área cortical, las conexiones

asociativas corticocorticales intrahemisféricas por medio de fascículos y haces

asociativos46 y las conexiones asociativas corticorticales interhemisféricas por medio del

cuerpo calloso (fibras comisurales).47

Con el progresivo desarrollo de las distintas áreas corticales, el manto va plegándose

cada vez más y comienzan a aparecer los surcos que separan a las incipientes

circunvoluciones (proceso de “girificación”). En el último tercio de la gestación (7º mes en

el ser humano; postnatalmente en la rata), cuando empiezan a diferenciarse los

oligodendrocitos a partir de los glioblastos, comienza la mielinización de las primeras áreas

corticales (los campos primordiales o de premaduración de Flechsig) (Flechsig, 1896;

46
Las eferencias intrahemisféricas hacia áreas corticales en los que el nivel de procesamiento de la
información es de nivel creciente salen principalmente desde las capas II-III (supragranulares), y desde las
capas V-VI (infragranulares) si se dirigen hacia áreas de menor nivel. Las aferencias intrahemisféricas
correspondientes llegan a la capa IV si provienen de áreas de menor nivel, y a las capas I y VI si provienen
desde áreas de mayor nivel (Amaral, 2000; Carpenter, 1985).
47
Las eferencias interhemisféricas salen desde las capas II-III (principalmente) y V-VI (en menor grado). Las
aferencias interhemisféricas llegan a las capas III profunda (principalmente), II, IV y VI (Amaral, 2000;
Carpenter, 1985; Zilles, 1990).

53
Introducción

Outes y Funes, 1992) que ya estarán mielinizados al momento del nacimiento.

* * *

En vista de que el desarrollo del cerebro es tan complejo y la mayoría de los sucesos que

en él ocurren son temporalmente simultáneos, en la Figura 11 se presenta un gráfico que

resume muchos de los procesos hasta aquí analizados y que hará más comprensible el

proceso global. Quizás pueda resultar arduo tener que repasar con cierto detalle el

desarrollo del SNC con la finalidad de comprender lo que sucede en el cerebro de un feto

sometido a AMF. Pero no hay otra forma de hacerlo si se quieren comprender cabalmente

los hallazgos que se observen en animales postnatales (infantes, adolescentes o adultos),

tal como intentaré hacerlo en este trabajo tras la fase experimental.

Figura 11. E volución tem poral de algun os p arám etros d el desarrollo cerebral hum ano qu e suceden sim ultanea y/o consecutiva-
m ente. M odificado de R ice y B arone, 2000.

54
Introducción

I.5. Las relaciones neurogliales (el mecanismo etiopatogénico):

Las neuronas y las células de la glía se relacionan entre sí de múltiples maneras.

Coexisten en un mismo tejido, tienen un mismo origen embriológico y una temporalidad

evolutiva compartida, según hemos visto. A diferencia de lo que hasta hace unas décadas

se consideraba establecido acerca de la glía, hoy se comienza a ver que no son meras

“células de sostén”. Más aún, se está comenzando a considerar que con sus contrapartes,

las neuronas, forman una comunidad morfofuncional muy estrecha y dinámicamente

interrelacionada. Uno de los modos en que las neuronas y las células de la glía, los

astrocitos específicamente, se interrelacionan es por medio de un neurotransmisor: la

serotonina. Entiéndase bien que este es sólo uno de esos modos y no es, bajo ningún

concepto, el único ni el más importante.

I.5.1. La serotonina:

El neurotransmisor básico del SNC, predominante por la cantidad de neuronas y las vías

asociativas que se sirven de él, es el glutamato. El sistema glutamatérgico es múltiple y muy

finamente regulado por un gran número de otros sistemas de neurotransmisores que,

muchas veces, actúan más como verdaderos sistemas de neuromodulación de aquél que

como verdaderos sistemas de neurotransmisión.

Una de las sustancias más importantes, y filogenéticamente más antiguas, utilizadas

55
Introducción

como neurotransmisor/neuromodulador es la serotonina.48

I.5.1.1. Síntesis, almacenamiento, liberación y degradación.:

La serotonina o 3-($-aminoetil)-5-hidroxi-

indol, en el SNC, es el miembro más

prominente de la familia de las sustancias

aminérgicas clasificadas como indolaminas.

Su biosíntesis se logra en dos pasos

enzimáticos a partir del aminoácido triptofano

(ácido 2S-amino-3-(1H -indol-3-il)-

propanoico), un aminoácido aromático

esencial, que los mamíferos obtenemos sólo a

partir de la dieta. Este aminoácido compite

con otros de su tipo para ingresar al SNC a

través de la BHE. Su ingreso se cumple por

medio de un transportador específico. La


Fig ura 12. V ía b iosintética d e la serotonina. A la derecha d e
la flecha, en cada reacción, se ubica el nom bre de la enzim a
interviniente y, a la izqu ierda, los co factores y co sustratos.
primer enzima biosintética de la vía (y La TP H es la p rim e ra en zim a d e la vía y lim itante de la tasa
de síntesis.

limitante de la tasa de producción de 5-HT) es

48
Ya las plantas utilizan y sintetizan serotonina y otros derivados del triptofano, como la auxina. El anillo
indólico, que comparte la serotonina con el triptofano y con la melatonina, tiene la capacidad de absorber luz.
Incluso todavía en los mamíferos, la serotonina y la melatonina están relacionadas con la regulación del ciclo
sueño-vigilia y los ritmos biológicos basados en la transducción de señales lumínicas (Azmitia, 2001; Parent,
1981).

56
Introducción

la triptofano hidroxilasa (L-triptofano-5-monoxigenasa, TPH ó TrpOH, EC: 1.14.16.2)

que hidroxila al triptofano en la posición del carbono 5 para producir 5-hidroxitriptofano

utilizando oxígeno molecular como cosustrato y la tetrahidrobiopterina como cofactor.49

El 5-hidroxitriptofano es descarboxilado luego por la enzima descarboxilasa de los l-

aminoácidos aromáticos (ADCC, EC: 4.1.1.28) que utiliza piridoxal fosfato (la forma

activa de la vitamina B6) como coenzima. El producto: la 5-hidroxitriptamina o serotonina

(5-HT) (Fig. 12). Todos estos eventos biosintéticos ocurren en las terminales presinápticas,

lugar en el que la 5-HT es inmediatamente almacenada en vesículas tras ser sintetizada.

Dentro de la vesícula, la 5-HT se une a la proteína de unión a la serotonina (SBP;

disminuye la presión osmótica intravesicular que crearía la gran cantidad de moléculas de

5-HT almacenadas si estuvieran en solución libre)50 (Tamir et al., 1994). En muchas

sinapsis serotoninérgicas, la 5-HT es co-almacenada y co-liberada junta con otras sustancias

como la sustancia P y el VIP.51

Tras la liberación sináptica, y una vez ejercido su efecto transmisor sobre alguno de los

múltiples tipos de receptores que le son

propios, la acción de la 5-HT finaliza por uno

de tres mecanismos conocidos: la recaptación

presináptica, la degradación enzimática y/o la

captación glial . La recaptación presináptica

es un mecanismo económico de finalización Fig ura 13. Estructura del transp ortador d e 5-H T (5-H T T ) con
sus 12 dom inios transm em b ran a y los bucles intra y
extracelulares. M odificado de R udn ick, 2006.

49
En virtud de su ubicación en neuronas serotoninérgicas, se utiliza a los anticuerpos dirigidos contra la TPH
como “marcadores” específicos de este tipo celular.
50
SBP, por las siglas en inglés de la serotonin binding protein. Existen de ella tres formas de distinto PM :
45, 56 y 68 kDa (Tamir et al, 1994).
51
Péptido intestinal vasoactivo, por sus siglas en inglés (vasoactive intestinal peptide).

57
Introducción

de la acción neurotransmisora ya que elimina a la 5-HT de la hendidura sináptica y la

reingresa en la presinapsis donde es reutilizada, previo realmacenamiento. El

transportador de 5-HT (5-HTT o SERT; Fig. 13) es una proteína con 12 dominios

transmembrana con actividad antiportadora 5-HT-Na+-Cl-/K+ que utiliza la energía del

gradiente electroquímico favorable para el ingreso del Na+ y el Cl- y la salida de K+

(generado, en última instancia, por la Na+/K+-ATPasa) para transportar al mismo tiempo

la 5-HT hacia el interior de la presinapsis (para una revisión, véase Rudnick, 2006).52 La

degradación enzimática se cumple en la misma hendidura sináptica por obra de la enzima

monoaminooxidasa A (MAO-A; E.C.: 1.4.3.4) que realiza una desaminación oxidativa y

transforma a la 5-HT en 5-hidroxiindolaldehído, el cual posteriormente es transformado en

ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) por acción de la enzima aldehído deshidrogenasa

(ALDH; la misma enzima que, hemos visto, cumple el segundo paso degradativo del

EtOH). El 5-HIAA es el principal metabolito de la 5-HT; se transporta fuera del SNC a

través de la BHE y se excreta por orina. Al mecanismo de captación glial lo mencionaré

al tratar los astrocitos.

I.5.1.2. El sistema serotoninérgico:

El sistema serotoninérgico está compuesto por el conjunto de las neuronas que sintetizan

y utilizan este neurotransmisor, los axones que estas proyectan a distancia y los receptores

52
Dado que el 5-HTT se encuentra en las presinapsis serotoninérgicas, los anticuerpos dirigidos contra esta
molécula se utilizan como “marcadores” específicos de tales neuronas, útiles aún en ausencia de la misma 5-
HT dentro de la presinapsis (como podría ocurrir en casos de depleción, parcial o total, aguda o crónica, del
neurotransmisor).

58
Introducción

para los que la 5-HT es el ligando específico.

El sistema serotoninérgico constituye, filogenéticamente, el sistema neurotransmisor más

antiguo y, anatómicamente, el más extendido de entre los sistemas de inervación difusa de

la CC (Frazer y Hensler, 1994; Parent, 1981).53

Tabla 4. Núcleos del tronco encefálico humano en los que se localizan neuronas
serotoninérgicas (listado en orden rostrocaudal; Törk y Hornung, 1990).

I) Núcleo CAUDAL LINEAL.


II) Núcleo DORSAL DEL RAFE: subnúcleos B6-B7
A) Medial: subdivisiones
1) Medial (o ventral de Baker).
2) Interfascicular.
B) Ventrolateral.
C) Dorsal.
D) Caudal.
E) Lateral.
III) Núcleo MEDIAL (o SUPERIOR CENTRAL) del RAFE: subnúcleos B8
A) ROSTRAL.
B) LATERAL.
C) DORSAL.
D) VENTRAL.
IV) Núcleo PARAMEDIAL.
V) Núcleo PONTINO ORAL. B9
VI) Núcleo B9 homólogo. B9
VII) Núcleo PONTINO DEL RAFE.
VIII) Núcleo MAGNO DEL RAFE. B1
IX) Núcleo OSCURO DEL RAFE. B3
X) Núcleo PÁLIDO DEL RAFE. B2
XI) Núcleos de la FORMACIÓN RETICULAR BULBAR:
A) Núcleo RETICULAR GIGANTOCELULAR PARS ".
B) Núcleo RETICULAR PARAGIGANTOCELULAR LATERAL.
C) ZONA RETICULAR INTERMEDIA.
D) Bulbo Rostral Ventrolateral.

* En la colum na de la derecha se listan los n úcleos equivalentes para la rata; en este anim al, según
D ahlström y Fuxe (1964), los núcleos B1-B 3 son de localización bulbar; B 4-B 6 son protuberanciales y B7-
B 9, m esencefálicos. E n tanto, en el hom bre, los n úcleos listados I-IV son principalm ente m esencefálicos;
V -V II, protuberanciales y V III-XI, bulbares.

Las neuronas de este sistema se encuentran, todas, en el tronco del encéfalo. En el ser

53
Así como cada área de la CC recibe aferencias específicas desde determinado núcleo talámico
exclusivamente, cada una de ellas recibe también aferencias inespecíficas (inespecíficas, porque también otras
áreas las reciben). Entre estos sistemas neuronales de proyección cortical difusa se encuentran: los núcleos
talámicos intralaminares; las neuronas que conforman la formación reticular del tronco del encéfalo; y los
núcleos del prosencéfalo basal y del tronco encefálico que utilizan neurotransmisores específicos como: la
acetilcolina (núcleos basal de Meynert, septal medial y de la banda diagonal de Broca), la dopamina
(sustancia negra y área tegmental ventral), la noradrenalina (locus coeruleus y otros núcleos) y los núcleos
serotoninérgicos del rafe (vide infra) (Martin, 1998).

59
Introducción

humano, se hallan agrupadas en dos grandes conjuntos nucleares: uno rostral y otro caudal,

compuestos cada uno de ellos por varios nucleos neuronales, la mayoría de los cuales se

localizan en la región del rafe. Pero, valga la aclaración, así como no todos los núcleos

serotoninérgicos se localizan en el rafe, de la misma manera, no todos los núcleos del rafe

son serotoninérgicos (Törk y Hornung, 1990). En muchos de los núcleos considerados

habitualmente como serotoninérgicos hay neuronas que expresan otros neurotransmisores.

Por ello, hasta cierto punto, es una simplificación (simplificación útil, en todo caso) hablar

de núcleos serotoninérgicos del rafe como generalmente se ve en la literatura y como, de

todas formas, también lo haremos aquí. En la Tabla 4 se presenta un listado de estos

núcleos con su denominación equivalente en la rata, que es el animal en el que Dahlström

y Fuxe (1964) describieron y nominaron

originalmente a los componentes del sistema.

Pero, como es previsible, el sistema

serotoninérgico de la rata no se corresponde

exactamente con el del ser humano.

El grupo rostral está compuesto por los

núcleos mesencefálicos y protuberanciales

rostrales, en tanto que los protuberanciales

caudales y los bulbares conforman el grupo

caudal. Si nos atenemos a las denominaciones

de la Tabla 4, estas dos grandes agrupaciones

se corresponden con los núcleos I-VII (grupo Figura 14. Localización d e los núcleos serotoninérg icos d e
los g rup os rostral y caud al en el tronco encefálico hum ano
(arriba) y de la rata (abajo), co n la d istribución pred om inan te
rostral) y VIII-XI (grupo caudal) en el ser de sus fibras de inervación h acia áreas rostrales y caudales
del S N C . M odificado a partir de Frazer y H ensler, 1994.

60
Introducción

humano o con los núcleos B5-B9 (grupo rostral) y B1-B4 (grupo caudal) en la rata (Fig.

14).

Desde el grupo rostral salen axones que inervan, principalmente, el prosencéfalo. Estas

fibras ascienden por el gran haz prosencefálico medial (hpm o medial forebrain bundle –

mfb – de los angloparlantes), un haz de fibras filogenéticamente antiguo, en el que un

significativo número de las fibras serotoninérgicas (-25%) están fuertemente mielinizadas

(Jacobs y Fornal, 1995; Törk y Hornung, 1990). De igual modo, por el fascículo

longitudinal medial (flm, otro haz filogenéticamente antiguo) descienden las fibras desde

el grupo caudal hacia los distintos niveles de la médula espinal. Ambos grupos contribuyen

a inervar, conjuntamente, el cerebelo (Fig. 14).

Los núcleos dorsal y medial del rafe

(NDR y NMR) son los dos principales

núcleos componentes del grupo rostral.

Ambos contribuyen con fibras al hpm pero

tienen áreas de inervación distintas para cada

uno y a la vez funcionalmente relacionadas

entre sí. Así, el NDR inerva, entre otras áreas,

a la sustancia negra, el cuerpo estriado (Strt),

la amígdala y el núcleo accumbens. En tanto, Figura 15. D istribu ción de la ine rvación prosenc efálica de los
d o s p rin c ip a le s n ú cleo s se ro to n in é rg ic o s d e l ra fe
m esencefalico. N D R : núcleo d orsal del rafe; N M R : núcleo
el NMR inerva, entre otras, a las cortezas del m edial del rafe; S G P A : su sta ncia gris periacueducta l; TC I:
tu bérb ulos cuadrig ém inos inferio res; lm : lem nisco m edial.
M odificado a partir de Frazer y H ensler, 1994.

cíngulo y entorrinal, los núcleos del septum

y la formación del hipocampo (Hipp) (Fig. 15). Entre los dos contribuyen a inervar el

conjunto de la neocorteza y, en particular a la corteza frontal (CxF) (Frazer y Hensler, 1994;

61
Introducción

Jakobs y Fornal, 1995; Törk y Hornung, 1990).

Las fibras emanadas de estos núcleos rostrales se


diferencian también por su morfología (Fig. 16): las
provenientes del NDR, llamadas fibras de tipo D, se
caracterizan por ser delgadas y de aspecto varicoso,
poseen una distribución difusa y profusa arborización Figura 16. M orfología de los tipos de fibras serotoninérgicas
prosence fá lic as. M odifica do a p artir de F razer y H en sler,
y presentan botones sinápticos fusiformes o esféricos 1994.

pequeños ( -1 :m de diámetro), pleomorfos; es dudoso


que estos botones formen contactos sinápticos clásicos; en todo caso, se sospecha que podrían realizar un tipo
de neurotransmisión volumétrica ya que la 5-HT, liberada al líquido extracelular, puede difundir por varios
cientos de micrómetros antes de encontrar un receptor específico al cual acoplarse. Este tipo de fibras podría
liberar la 5-HT en forma menos específica y ser más dinámicas y, por tanto, más a propósito para cumplir
funciones neuromoduladoras y/o tróficas. Por otro lado, las fibras de tipo M , provenientes del NMR, se
caracterizan por estar formadas por axones gruesos, con tractos fibrosos no varicosos, tienen arborizaciones
delgadas y cortas, y botones sinápticos esféricos grandes que forman muchas y repetidas sinapsis clásicas
(Frazer y Hensler, 1994; Törk y Hornung, 1990).

I.5.1.3. Los receptores 5-HT1A:

Una vez liberada de la presinapsis, la acción que ejerza la 5-HT sobre sus células blanco

dependerá de los receptores que éstas expresen. Al momento actual se postula la existencia

de 16 tipos distintos de receptores para la 5-HT.54

De todos los receptores serotoninérgicos descriptos hasta el momento, el receptor 5-

HT1A, en particular (Fig. 17, abajo), es especialmente interesante desde el punto de vista de

las relaciones neurogliales por varios motivos (Azmitia, 2001a, 2001b): i) se expresan

ampliamente en el mesencéfalo (dónde se localizan muchas de las neuronas

54
Cfr. Anexo III (Receptores serotoninérgicos).

62
Introducción

serotoninérgicas) y en el prosencéfalo (el

territorio rostral de inervación distal de esas

neuronas); ii) como receptores de

localización presináptica permiten inhibir la

descarga de 5-HT por parte de la neurona (y

por tanto, regularla), particularmente en los

NDR y NMR; iii) como receptores de

localización postsináptica, en los territorios

de inervación distal, cumplen distintas

funciones según el tipo de neurona que los

exprese; iv) en condiciones fisiológicas,


F igura 17. A rriba: estructura genérica de los receptores
pueden ser regulados ampliamente por serotoninérgicos de las fam ilias 1, 2, 4-7 (acoplados a proteínas
G ). A bajo: el receptor 5-H T 1A y sus m ecanism os efectores al ser
estim ulado por u na dro ga agonista parcial com o la buspiro na.
distintos mecanismos moleculares M od ificad o d e http ://w w w .cnsforum .com /im agebank section/
/receptor_system s_S eroton ergic/de fau lt.aspx.

i n t r a c e l u l ar es ; v) se e x pr e san

tempranamente en el desarrollo en el neuroepitelio y en la PC por lo que, posiblemente,

cumplan un rol importante durante la neuro- y/o corticogénesis; vi) tienen una alta afinidad

(Kd = 1 × 10-9 M) por su ligando (5-HT) lo que los hace especialmente a propósito para ser

activos durante el desarrollo incluso en presencia de bajas concentraciones del

neurotransmisor; vii) los astrocitos también expresan este tipo de receptor, por lo que se

erigen como un importante y directo nexo entre la función de las neuronas y los astrocitos;

viii) se han desarrollado distintas drogas agonistas y antagonistas que se le acoplan

selectivamente (lo que provee herramientas moleculares para intervenir exógenamente en

el sistema); ix) en condiciones clínicas, algunas de esas drogas tienen una probada utilidad

63
Introducción

terapéutica como ansiolítico y actualmente están aprobadas para su uso en humanos

afectados por algunos tipos de enfermedades neuropsiquiátricas.

I.5.1.4. Funciones de la serotonina en el SNC adulto y en el desarrollo:

El sistema serotoninérgico, hemos visto, es un sistema neurotransmisor filogenéticamente

antiguo y anatómicamente muy ampliamente distribuido en el encéfalo humano que cuenta

con gran variedad de receptores para ejercer sus acciones.

Así, durante la adultez, a este sistema se lo ha implicado en multiplicidad de funciones

cerebrales. Tan es así que se ha dicho que “la serotonina es un enigma. Está implicada en

virtualmente todo, pero no es responsable de nada” (Jacobs y Fornal, 1995). A la 5-HT se

la ha implicado en procesos fisiológicos tan dispares como la regulación de procesos

cardiovasculares y de la actividad ventilatoria, en los ritmos circadianos entre ellos el ciclo

ueño-vigilia; en las conductas sexual, alimentaria y agresiva; en la regulación de las

secreciones neuroendócrinas y de la nocicepción y los mecanismos de analgesia; en la

generación de respuestas motoras, de los estados de ansiedad, y de los estados de ánimo

(Frazer y Hensler, 1994; Jacobs y Fornal, 1995). En el terreno de la clínica

neuropsiquiátrica, correspondientemente, se la ha implicado, entre otras, en los siguientes

trastornos y enfermedades: dolor crónico y cefaleas (las migrañas, particularmente); emesis;

mioclonías; endocrinopatías; síndrome carcinoide; trastornos neurodegenerativos y en el

envejecimiento (normal y patológico); abuso y dependencia de drogas; trastornos del control

de los impulsos y agresividad; trastornos sexuales, alimentarios y del sueño; trastornos por

64
Introducción

ansiedad y obsesivo-compulsivo; trastornos afectivos (enfermedad maníaco-depresiva,

manías y depresiones unipolares); los distintos tipos de esquizofrenias; y, por último, en una

variedad de trastornos del desarrollo del SNC (Frazer y Hensler, 1994).55

El sistema serotoninérgico aparece tempranamente durante el desarrollo. Hacia la 5ta

semana gestacional empiezan a diferenciarse las primeras de sus neuronas en el rafe del

mesencéfalo humano (Azmitia, 2001a; Sundstrom et al., 1993); en la rata, en los días E11-

E12 las neuronas de los grupos mesencefálicos B7-B9 y en E13-E14 las de los núcleos del

grupo caudal (Lauder, 1990). El grupo rostral (entre los que están el NDR y el NMR)

comienza a enviar fibras hacia el prosencéfalo por medio del hpm en cuanto las células se

diferencian en el mesencéfalo. Son las primeras fibras en arribar a la PC y, en la rata, lo

hacen en el día E17. Su llegada coincide con el período pico de proliferación, migración y

diferenciación de las ZG. Estos axones se localizan en principio en aquellas capas en las que

residen las neuronas corticales establecidas primariamente: la ZM/PP y la SP. En las

distintas capas corticales desarrollan luego un patrón de inervación que sigue una secuencia

de dentro-afuera (“inside-out”) aproximadamente paralela al gradiente cortical de

neurogénesis y diferenciación y, aparentemente, realizan conexiones con las neuronas una

vez que estas han finalizado su migración. Los axones serotoninérgicos que arriban a la PC

y van inervando las sucesivas capas parecerían interactuar y coincidir en el tiempo, a la vez,

con los axones de las aferencias específicas tálamocorticales que arriban a la PC desde la

SP. Durante el desarrollo cortical se han observado variaciones temporoespaciales en el

55
Prueba cabal de su amplia implicancia en tan dispares trastornos es la existencia de drogas en uso
terapéutico con acción sobre el sistema serotoninérgico, a su vez tan dispares como el naratriptán (un
antimigrañoso, agonista de los receptores 5-HT 1B/1D), la clozapina (un antipsicótico atípico, antagonista
combinado 5-HT 2A/1C y dopaminérgicos D 4/2), el ondansentrón (un antiemético, antagonista 5-HT 3) o la
buspirona (un ansiolítico no benzodiazepínico, agonista parcial de los receptores 5-HT 1A).

65
Introducción

patrón de inervación serotoninérgica que podrían tener relación con un importante rol de la

5-HT en el desarrollo de las sinapsis intracorticales (D’Amato et al., 1987; Dori et al.,

1996). El patrón adulto de inervación cortical, en la rata, se alcanza recién hacia el final de

la tercera semana postnatal (-P21) (Dori et al., 1996). De todas formas, la inervación

serotoninérigica prosencefálica varía notablemente según la región y el momento

considerados tanto en el patrón espacial de extensión de las fibras como en el tipo y lugar

de establecimiento de las sinapsis (botones terminales, botones en pasaje, sinapsis

axosomáticas o axodendríticas, etc.) (Dori et al., 1996, 1998).

Durante el desarrollo, el 5-HTT comienza a expresarse sincrónicamente con la síntesis

de 5-HT en el soma de las mismas neuronas pero también se expresa transitoriamente en las

cNEp del telencéfalo dorsal incluso antes de que lleguen las fibras serotoninérgicas desde

el mesencéfalo. El 5-HTT también se expresa en axones serotoninérgicos que no realizan

aún contactos sinápticos y, más aún, en los conos de crecimiento de los axones

serotoninérgicos. Los niveles de expresión del 5-HTT varían también a lo largo del

desarrollo pre- y postnatal tanto en los núcleos del rafe cuanto en las áreas de inervación

distal. Estos hechos han llevado a pensar que la 5-HT pueda actuar durante el desarrollo, en

muchos casos no como un neurotransmisor clásico sino más como un factor difusible, cuasi-

hormonal, con un mecanismo de transmisión volumétrica (Galineau et al., 2004; Zhou et al.,

2000).

El receptor 5-HT1A, pasible de ser activado aún por bajos niveles de 5-HT en virtud de

su alta afinidad de unión (vide supra), se expresa en niveles máximos durante el desarrollo

y no durante la vida postnatal. En el ser humano, de hecho, su pico de expresión se sitúa

entre las semanas gestacionales 16ª-22ª en tanto que en la rata aparece en E12 en los núcleos

66
Introducción

del rafe, tiene un pico de expresión en E15 y disminuye posteriormente hacia el fin de la

gestación para alcanzar los niveles menores del adulto, solo postnatalmente (Azmitia,

2001a; Bar-Peled et al., 1991; Daval et al., 1987). Es muy interesante el hecho, además, de

que este receptor se expresa en altos niveles en zonas donde residen células madre

indiferenciadas, en las ZV y ZSV durante el desarrollo prenatal (Lidow y Rakic, 1995) e

incluso en la ZSV del hipocampo adulto (Banasr et al., 2004).

Como se puede apreciar, son varias las razones que han llevado ya desde hace tiempo a

enunciar la hipótesis de que la 5-HT sería una señal importante para guiar e influir en el

desarrollo de todo el SNC, tanto de neuronas corticales cuanto de neuronas que utilizan

otros neurotransmisores, como así también en el de las mismas neuronas serotoninérgicas

(Lauder y Krebs, 1978).

I.5.2. Los astrocitos:56

“Las células de neuroglia ó aracniformes (por parecerse á una araña) llamadas también
corpúsculos de Deiters -en honor de su descubridor- forman el armazon y soporte de la trama
nerviosa de los centros. Este armazón separa por una parte las expansiones dendríticas y fibrillas
nerviosas que no deben mantener contactos funcionales, y por otra, protege y sostiene los
57
capilares sanguíneos.”

Los astrocitos son un tipo de células de la neuroglía (el otro componente celular del

tejido nervioso). Junto con los oligodendrocitos, las cGR y las células ependimarias,

56
Excepto donde se aclara puntualmente, los datos de esta sección se han tomado de la revisión de Magistretti
y Ransom (2002).
57
Esto decía el genial aragonés en 1899 acerca de la neuroglía (Ramón y Cajal, 1899; t. I, pág. 174.). En lo
esencial, poco más se puede agregar hoy en día acerca de estos tipos celulares del tejido nervioso.

67
Introducción

constituyen la llamada macroglía del SNC.

Los astrocitos sobrepasan ampliamente el número de las neuronas en una proporción

aproximada de 10 por cada neurona (hay autores que elevan la cifra hasta 50:1). Tan

numerosos son que constituyen, por sí solos, del 25 al 50% del volumen cerebral total. Por

su forma y ubicación se los clasifica en distintos tipos: los protoplasmáticos predominan en

la sustancia gris, los fibrosos en la sustancia blanca,

astrocitos velamentosos, astrocitos subependimarios,

en candelabro subpiales, plumosos de Fañanas, etc.

También existen en los mamíferos adultos dos tipos

celulares derivados de las cGR (las células de

Bergmann del cerebelo y las células de Müller en la

retina, considerados como tipos de astrocitos adultos

por muchos autores ). De hecho, la gran mayoría de

las cGR, una vez concluida su función durante el

desarrollo embriofetal, se transforman en variedades

fenotípicas de astrocitos (vide supra) (Fig.10).

I.5.2.1. Morfología y funciones:

Figura 18. A sp ecto q ue adop tan los astrocitos con


d i st in t o s m é t o d o s h is t o ló g ic o s p a ra s u
La forma de los astrocitos varía mucho según el visualización. A rriba, en tinción c o n la técnica del
sublim ado de cloruro aúrico m ercúrico de C ajal (se
aprecian los p ies chup ad ores d e varios astrocitos
qu e se d ispo ne n alred ed or de un ún ico y gran vaso
lugar en el que se encuentren pero, básicamente, la sang uíneo). En m edio, d os im ágenes a distintos
au m en tos de astroc itos inm unom arcados contra la
G FA P . A b ajo, asp ecto d e un típ ico astrocitos
mayoría son células de soma estrellado del que p rotoplasm ático im pregnado con la técnica d e
G olg i.

68
Introducción

parten prolongaciones citoplasmáticas más o

menos numerosas (más cortas, abundantes y

ramificadas en los protoplasmáticos y más

largas, rectas y escasas y menos ramificadas en

los fibrosos) (Fig. 18). El soma en sí es escaso

y tiene poco desarrollo de la mayoría de las

organelas. El núcleo es generalmente oval,

siempre de cromatina laxa y sin nucléolos Fig u ra 19. R epresentación esq uem ática d e los d om inios
territoriales ana tom ofuncionales de los astrocitos en
relación a los va so s sa nguíneo s. M odifica do de N ed erg aa rd
visibles (Ham y Cormack, 1986; Jones y et al., 2003 (realizad o a pa rtir de un a reco nstruc ción en ba se
a tinciones de IC Q para la G FA P ).

Cowan, 1986).

Los astrocitos tienen numerosas funciones. Algunas de ellas son58: i) por medio de las

prologaciones citoplasmáticas, llenan todo el espacio que se halla entre las neuronas y sus

prolongaciones y que no es ocupado por otras células de la glía (tal como dijera Cajal); de

hecho, emiten lengüetas en todas direcciones y así envuelven o recubren virtualmente todas

las sinapsis, aislándolas del resto del tejido nervioso; ii) las prolongaciones de cada astrocito

individual ocupan un espacio tal que no se interdigitan (prácticamente) con las

prolongaciones de otros astrocitos y definen así dominios territoriales anatomofuncionales

(Fig. 19) (Nedergaard et al., 2003); iii) son células altamente polarizadas que se encuentran

en una situación especialmente a propósito para actuar de mediadores entre las neuronas

y los elementos no neuronales del SNC: el epéndimo, la piamadre y los vasos sanguíneos;

con estos últimos toman contacto por medio de unas expansiones terminales especiales (los

58
Sólo menciono las más importantes o las mejor establecidas por no prolongar la exposición
innecesariamente. Para una reciente revisión global, cfr. Verkhratsky y Butt (2007).

69
Introducción

pies chupadores o pies terminales59) que llegan a cubrir entre el 95 al 100% de la superficie

externa de los vasos y forman parte importante de la BHE; conforman así una compleja

trama o red gliovascular (Nedergaard et al., 2003); iv) en los pies chupadores expresan

distintos tipos de transportadores y canales moleculares que permiten a los astrocitos

regular el acceso de las sustancias al SNC (por ejemplo, el transportador de glucosa del tipo

GluT1); v) son el único tipo celular del tejido nervioso que almacena glucosa en forma de

glucógeno; vi) los astrocitos maduros (y solo ellos) poseen en el citoesqueleto un tipo

especial de filamentos intermedios: la proteína gliofibrilar ácida (GFAP), más abundante

en los astrocitos fibrosos que en los protoplasmáticos; vii) se unen y acoplan entre sí por

medio de uniones en hendidura (o nexus) a través de los que, se sabe, viajan señales

moleculares (como el Ca2+ y el inositol-1,4,5-trifosfato) que acoplan funcional y

metabólicamente a estas células (son conocidas las denominadas ondas de calcio); viii) en

la membrana celular expresan canales iónicos (K+, Na+, Ca2+) voltaje-dependientes de

significación fisiológica aún oscura, que no les permiten generar potenciales de acción u

otros tipos de respuestas eléctricas regenerativas (que sí se ven en las neuronas), aunque sí

despolarizarse y variar su potencial de membrana; ix) amortiguan las altas concentraciones

de K+ extracelular (un producto de la actividad neuronal intensa) incorporándolo a su

citoplasma por medio de canales específicos y, ante esta señal, degradan glucógeno para

proveer de glucosa a las neuronas vecinas; x) por los pies chupadores expulsan el exceso de

K+ hacia los vasos sanguíneos vecinos donde éste ión induce una vasodilatación que

aumenta secundariamente la provisión de oxígeno y otros nutrientes necesarios para la

actividad neuronal aumentada (Kandel, 1991); xi) por medio de otros mediadores (tanto

59
También llamados procesos pediculares, pies perivasculares o aparato chupador de Cajal.

70
Introducción

extra- como intracelulares, como el óxido nítrico, glutamato, factor natriurético atrial, Ca2+,

ácidos epoxieicosatrienoicos y prostaglandinas) también contribuyen a regular el flujo

sanguíneo regional en función de la actividad neuronal circumvecina (Anderson y

Nedergaard, 2003; Fellin y Carmignoto, 2004); xii) intervienen en el anabolismo y/o

catabolismo de varios neurotransmisores por medio de circuitos metabólicos que los

proveen a las neuronas (como en el caso del glutamato, por ejemplo) o contribuyendo a

recaptarlos una vez finalizada su acción sináptica (como en el caso de varios

neurotransmisores -como el glutamato, DA, noradrenalina, 5-HT, GABA) por medio de

sistemas de recaptación de baja afinidad pero de alta capacidad (es el sistema de captación

glial que mencionáramos ut supra a propósito de la finalización de la acción sináptica de

la 5-HT); xiii) expresan receptores de membrana funcionalmente activos para muchos de

esos (y otros) neurotransmisores como, por ejemplo, el receptor serotoninérgico 5-HT1A;

xiv) modifican su morfología en respuesta a los cambios producidos en las sinapsis de la

vecindad (es decir, presentan plasticidad astrocitaria ante la plasticidad sináptica o neural)

y pueden así intervenir en los fenómenos de aprendizaje y memoria por medio de la

regulación de (e interacción con) la neurotransmisión y la sinaptogénesis; xv) también

modifican su morfología y actividad metabólica ante estímulos nocivos físicos y/o químicos

e intervienen en las respuestas inflamatorias del SNC (sufren hipertrofia e hiperplasia en una

serie de cambios morfofuncionales que ha llevado a que se los designe como astrocitos

reactivos) (Ridet et al., 1997); de hecho, son células inmunocompetentes que expresan

moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II y poseen capacidad de

presentación de antígenos a ciertas células del sistema inmune (Dong y Benveniste, 2001);

xvi) pueden regular la neurogénesis adulta en el hipocampo al especificar el destino

71
Introducción

neuronal de las células madre (Song et al., 2002) y pueden “desdiferenciarse”

morfofuncionalmente a sus tipos celulares precursores (las cGR) ante estímulos adecuados

(Leavitt et al., 1999) e, incluso, algunos subtipos de astrocitos adultos pueden actuar como

verdaderas células madre (Barres, 1999; Steindler y Laywell, 2003); xvii) durante la

neurogénesis que se observa en la ZSV del III ventrículo en los mamíferos adultos, los

astrocitos migran junto a los Nb hacia el bulbo olfatorio, formándoles una especie de

“cápsula” tubular migratoria que envuelve y guía a los Nb en su largo trayecto, en un tipo

adulto de migración que se denomina migración en cadena (García-Verdugo et al., 1998)60;

xviii) son una población celular topográficamente heterogénea: varían su morfología y

función según su lugar de residencia en el SNC adulto y en determinadas áreas cerebrales,

según que se trate de machos o hembras (dismorfismo sexual astrocitario) (McCarthy et al.,

2002); xix) filogenéticamente, aumentan su complejidad morfofuncional según aumenta

evolutivamente la complejidad cerebral (Oberheim et al., 2006).

Evidentemente, los astrocitos (y las células de la neuroglía en general) distan mucho de

ser el tipo de células “de pegamento”, “conectivas” o “de relleno” o “soporte” que

antiguamente eran consideradas. Muy por el contrario, son extremadamente versátiles e

intervienen muy activamente en (casi) todos los procesos que se observan en el SNC en

desarrollo y adulto.

60
Los otros dos mecanismos conocidos de migración de N b se dan durante el desarrollo prenatal (ya he
hablado de ellos): la migración radial (con eje en el andamiaje de las cGR) y la migración tangencial (con
eje principalmente en los axones en desarrollo que transitan por la ZI).

72
Introducción

I.5.2.2. La proteína S100B:61

Una función muy importante de los astrocitos, que no he mencionado hasta ahora, es la

síntesis y secreción al medio extracelular de distintas proteínas con acción neurotrófica.62

Entre ellas se encuentra la proteína S100B (S100B, en adelante).63

Los astrocitos secretan S100B al medio extracelular de manera constitutiva. Pero también

pueden ser estimulados a ello por distintas moléculas. Entre éstas se encuentran el

glutamato, la adenosina, el ácido lisofosfatídico y la 5-HT actuando sobre receptores 5-

HT1A localizados en su membrana citoplasmática. No se conocen aún los mecanismos

íntimos por los que los astrocitos secretan la S100B aunque se sospecha que es por un

mecanismo independiente de la vía clásica retículo endoplasmático-aparato de Golgi; al

menos en una línea celular de origen astrocitario, la secreción depende de una elevación de

la concentración intracelular de Ca2+, o de una disminución de la de Zn2+ (Davey et al.,

2001).

La S100B, como la mayoría de las proteínas S100, cumple funciones intra- y

extracelulares (Tabla 5). Dentro de las células regula la función de proteínas efectoras y,

dado que su función depende de la unión de átomos de Ca2+, la S100B funciona como una

proteína censora de Ca2+ aunque algunas de sus acciones son independientes del catión

(Tabla 6).

61
Cfr. las excelentes revisiones de Donato (1999, 2003) sobre la familia de proteínas S-100 (que he seguido
para escribir esta subsección, excepto donde específicamente lo aclaro).
62
Como el GDNF (por las siglas en inglés del glial cell line-derived neurotrophic factor), el BDNF (brain
derived neurotrophic factor), el CNTF (cilliary neurotrophic factor), las neurotrofinas 3 y 4 (NT-3y NT-4)
o el NGF (por las del factor de crecimiento nerviso en inglés, nerve growth factor).
63
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla su
estructura molecular.

73
Introducción

Entre las muchas funciones que cumple la S100B se cuentan, como particularmente

relevantes a los fines de este trabajo, su participación como factor promotor de la extensión

de neuritas por parte de las neuronas en diferenciación; la estabilización del citoesqueleto

neuronal y glial (tanto por modificar el estado de fosforilación de diversas proteínas

citoesqueléticas como por interactuar directamente con ellas); la estimulación de la

diferenciación de distintos tipos de neuronas inmaduras de varios sistemas

neurotransmisores (colinérgico, noradrenérgico, glutamatérgico, dopaminérgico e, incluso,

del serotoninérgico mismo) hacia fenotipos maduros; su acción como factor promotor de

la sobrevida neuronal, antiapoptótico, y de la plasticidad sináptica cuando está presente en

bajas concentraciones (en el rango de las altas pM a bajas nM). Por el contrario, cuando se

encuentra en altas concentraciones (altas nM a bajas :M) puede promover un efecto

neurotóxico (Hu et al., 1996; Hu y van Eldik, 1999).

En los mismos astrocitos, por otro lado, la S100B interactúa con la GFAP e induce su

expresión y el incremento del grado de arborización de las prolongaciones citoplasmáticas

además de ser capaz de inducir la proliferación mitótica de estas células (por tanto, es

mitógena para los astrocitos).

La S100B juega así un papel especial, central, de interrelación entre las neuronas

serotoninérgicas, los astrocitos, las neuronas de otros sistemas neurotransmisores y el

citoesqueleto en todas ellas.

Pero más allá de las funciones que cumple por medio de la unión directa a diversas

proteínas blanco, una vez liberada al medio extracelular, también puede unirse, en la

superficie de otras células, al receptor para los productos finales de la glucosilación

avanzada (RAGE, por las siglas en inglés de receptor for advance glycosylation end-

74
Introducción

Tabla 5. Funciones intra- y extracelulares de la S100B, establecidas al momento actual:

FUN CION ES de la S100B

intracelulares extracelulares

INHIBICIÓN DE LA FOSFORILACIÓN DE ! En neuronas, efecto prosobrevida y promotor de la


PROTEÍNAS: extensión de neuritas en concentraciones bajas (en el
! inhibe la fosforilación de proteínas bloqueando el rango nM) por interacción con receptores RAGE e
acceso de las quinasas -como la PKC- a sus proteínas inducción de efectos neurotróficos (por la vía de la
sustrato pertinentes; activación Ras-MAPK-NF6B y de la vía cdc42/Rac);
! inhibe la fosforilación de la proteína tau y MAP-2 ! Efectos tóxicos (muerte neuronal apoptótica por
(tipos de proteínas asociadas a los microtúbulos ); activación persistente de la vía Ras-MAPK) en
! inhibe la fosforilación de la proteína p53 concentraciones altas (en el rango :M);
! Estimulación de la proliferación astrocitaria por un
REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA: mecanismo no conocido;
! estimula al Ndr (serin-/treonin-proteinquinasa nuclear ! Apoptosis astrocitaria, por inducción de la iNOS
importante en la regulación de la división celular y de la astrocitaria via translocación nuclear del NF6B;
morfología celular); ! Apoptosis neuronal, vía activación del RAGE, con
! estimula la actividad de la guanilatociclasa de activación de caspasa 3 mediada por citocromo C;
membrana en los segmentos externos de los aumento de la conductancia al calcio por canales de
fotorreceptores tipo L y por regulación en más de genes proapoptóticos
(c-fos, c-jun, bax, bcl-x, p-15, p-21;
REGULACIÓN DEL CRECIMIENTO Y LA ! Estimulación de la secreción de NO astrocitario por
DIFERENCIACIÓN CELULAR: inducción de iNOS astroglial vía translocación nuclear
! se une a las secuencias bHLH de los factores de del NF6B;
transcripción MyoD y E12; ! Estimulación de la secreción de NO microglial por
! interacciona con la proteína de supresión tumoral p53 inducción de la iNOS microglial por unión a RAGE en
(cooperaría con la p53 para provocar detención del sinergia con lípido A e IFN-(;
crecimiento celular y apoptosis) ! Modulación de la plasticidad sináptica por depresión
de la potenciación a largo plazo (LTP) en CA1 Hipp.
REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO:
! jugaría un papel como tampón de calcio citosólico
directamente o indirectamente por medio de la acción
sobre la fosfoproteína gigante AHNAK

REGULACIÓN DEL ESTADO DEL CITOESQUELETO,


MORFOLOGÍA Y MOTILIDAD CELULARES:
! inhibición del ensamblaje de los microtúbulos por
secuestro de tubulina y por la estimulación de la
sensibiliad al calcio de los microtúbulos armados;
! inhibición del ensamblaje y estimulación del
desensamblaje de los FI tipo III (como la GFAP) por
secuestro de subunidades no ensambladas de
proteínas de los FI;
! reversión de la inhibición caldesmona- y calponina-
dependiente de la actividad de ATPasa de la
actomiosina

* AHNAK: fosfoproteína gigante idéntica a la desmoyokina; CacyBP/SIP1: calcyclin-binding protein/Siah-1-interacting


protein; CapZ (TRTK-12): proteína de capping de la actina; GFAP: glial fibrillary acidic protein; IQGAP1: IQ motif GTPase-
activating protein (un itpo de proteína ligada a la actina); MAG: myelin-associated protein; NDR: nuclear Dbf2-related
protein kinase; RAGE: receptor for advanced glycation end-products.

products).64

La propiedad de la S100B de estimular al RAGE no es exclusiva de ella: la comparte con

otras proteínas de su familia (S100A1, S100A6, S100A12 y S100P) (Donato, 2003; Leclerc

64
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla la
estructura íntima de esta receptor.

75
Introducción

et al., 2007) pero se une de manera diferencial y específica entre los dominios V y C1

(Dattilo et al., 2007; Leclerc et al., 2007).65 La estimulación de los RAGE se sigue de la

activación de complejas cascadas de señalización intracelular que llevan finalmente a la

extensión de neuritas, la proliferación y la sobrevida celular (u otras acciones dependiendo

de las condiciones microambientales predominantes como, por ejemplo, la concentración

local de S100B) (Huttunen et al., 1999; Santamaria-Kisiel et al., 2006).

Tabla 6. Funciones conocidas de la S100B en relación con su dependencia de la unión al calcio:*

Proteína blanco con


K d (nM ) Función promovida
la que interactúa**

FUNCIONES CALCIO-DEPENDIENTES

AHNAK 50 regulación de la homeostasis del calcio


Aldolasa C estimulación de la actividad de la aldolasa C
Anexina A6 < 1000 regulación del flujo de calcio y del ensamblaje de los FI
CacyBP/SIP regulación de la ubiquitinación
Caldesmona 500 disminución de la inhibición de la actomiosina por la caldesmona
CapZ (TRTK-12) 150-1000 regulación de la extensión de los filamentos de actina
Filamentos intermedios regulación del ensamblaje y desensamblaje de los FI
Fosfoglucomutasa estimulación de la actividad de la fosfoglucomutasa
GFAP, vimentina ensamblaje de FI
Guanilato ciclasa 2000 activación de la guanilato ciclasa
IQGAP1 rearreglo de membrana
MAG 7000 regulación del citoesqueleto de la célula glial
Microtúbulos regulación de la dinámica de los microtúbulos
NDR 500 modulación de la actividad de la NDR-quinasa
Neuromodulina (GAP43) inhibición de la fosforilación de la neuromodulina por la PKC
p53 24-23500 inhibición de la función de la p53
RAGE promoción de la sobrevida celular
Proteína tau inhibición de la fosforilación de la proteína tau por la proteinkinasa II

FUNCIONES CALCIO-INDEPENDIENTES

Aldolasa A estimulación de la actividad


Glucógeno fosforilasa

* Modificado de Santamaria-Kisiel et al., 2006.


** AHNAK: fosfoproteína gigante idéntica a la desmoyokina; CacyBP/SIP1: calcyclin-binding protein/Siah-1-interacting
protein; CapZ (TRTK-12): proteína de capping de la actina; GFAP: glial fibrillary acidic protein; IQGAP1: IQ motif GTPase-
activating protein (un itpo de proteína ligada a la actina); MAG: myelin-associated protein; NDR: nuclear Dbf2-related
protein kinase; GAP43: growth associated protein 43; RAGE: receptor for advanced glycation end-products.

65
La S100A6 y la S100A12, por ejemplo, se unen en los dominios C 1 y C 2 (Leclerc et al., 2007).

76
Introducción

Finalmente, desde el punto de vista ontogenético, la S100B comienza a expresarse

durante el desarrollo fetal en las cGR (Gómez et al., 1990; Brusco et al., 1995). Hemos visto

que muchas de estas células se transformarán más tarde, fenotípicamente, en astrocitos. La

S100B interviene de este modo, también, en el desarrollo del SNC.

A modo de resumen, puede decirse que la S100B actúa, durante el desarrollo y en la

adultez, como un factor promotor y de mantenimiento de la forma diferenciada y madura

del SNC.

I.5.3. El citoesqueleto neuronal y astrocitario:

Hemos visto que la proteína S100B interactúa con varias proteínas del citoesqueleto y

modifica y/o regula sus características estructurales y funcionales.

El citoesqueleto en las células eucariotas está compuesto por tres elementos principales:

los microtúbulos (MT; formados por 13 protofilamentos de "- y $-tubulina que determinan

una estructura hueca de unos 15 nm de diámetro; también llamados neurotúbulos – NT –

en las neuronas), los filamentos intermedios y los microfilamentos (MF; de 7-9 nm de

diámetro y formados, fundamentalmente por actina).

I.5.3.1. Los filamentos intermedios (FI):66

66
Cfr. el Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en el que se detalla la
estructura de los filamentos intermedios.

77
Introducción

Los filamentos intermedios (FI) representan un componente particular del citoesqueleto,

presente exclusivamente en las células eucariotas (Karp, 2006). A diferencia de los MTs y

los MFs, que están filogenéticamente más conservados, los FI varían notablemente en su

secuencia aminoacídica (estructura primaria). Están compuestos por proteínas que, por su

alto grado de resistencia a las fuerzas tensionales, le confieren a la célula protección contra

las tensiones mecánicas asociadas con el estiramiento. De hecho, son los elementos más

resistentes y estables del citoesqueleto.

Las diferencias en la estructura primaria son la base de la existencia de los diferentes

tipos de FI, cada uno de ellos con perfiles particulares de expresión celular y tisular y

posibilidades de regulación e interacción molecular. En base a estas diferencias es que se

los clasifica (Tabla 7).

Además, de las proteínas que forman la estructura principal de los FI, existen distintos

tipos de proteínas accesorias que estabilizan su extructura, los refuerzan y unen a otros FI

por medio de uniones cruzadas entre haces de filamentos para formar así una red resistente.

En las neuronas, las principales proteínas de FI expresadas son las de los neurofilamentos

(Nf). Los Nf se ensamblan a partir de la reunión de tres proteínas que pertenecen a la clase

IV (son, por ello, heteropolímeros). Las proteínas de Nf se clasifican en base a su PM y son:

los livianos (Nf-L o Nf-68), los medianos (Nf-M o Nf-160) y los pesados (Nf-H o Nf-200)

El ensamblaje de los Nf comienza con la reunión primaria de subunidades de la proteína

Nf-68 sobre la que se depositan luego, en menor proporción, los Nf-160 y Nf-200. In vivo,

los Nf estructuralmente maduros están compuestos, mayoritariamente, por una relación

estequiométrica de 7:3:2 (para los Nf-68, -160 y -200, respectivamente). En cambio, en las

neuronas en desarrollo, en regeneración o afectas de alguna enfermedad se pueden observar

78
Introducción

otras proporciones estequiométricas. Así, generalmente se acepta que la expresión de los

Nf-68 predominan durante el desarrollo y en los fenómenos de regeneración (Hoffman et

al., 1987; Hoffman y Cleveland, 1988) en tanto que los Nf-200 son característicos de las

neuronas maduras (Nixon y Sihag, 1991).

Tabla 7. Clasificación de las proteínas de los filamentos intermedios:*

Ubicación Tipo Distribución tisular


Proteína de FI PM
celular de FI principal

I Queratinas ácidas (> 25 tipos) 40-64


Células epiteliales
Queratinas neutras o básicas (> 25 53-67
II
tipos)

Vimentina 54 Células de origen mesenquimáti-


co, células de la glía radial

Desmina 53 Miocitos
III
Citoplasma 50
Proteína gliofibrilar ácida (GFAP) Astrocitos

Periferina 57 Neuronas periféricas y centrales

Neurofilamentos:
- livianos (Nf-L o Nf-68) 68
- medianos (Nf-M o Nf-160) 160
IV Neuronas
- pesados (Nf-H o Nf-200) 200

"-Internexina 66

Proteínas de lámina nuclear:


Todas las células nucleadas
- Lámina A 70
Núcleo V (formando parte de la envoltura
- Lámina B 67
nuclear)
- Lamina C 60

Nestina 240 Células madre del SNC,


Citoplasma VI
heterogénea
* Modificado a partir de Alberts et al., 2006; Cooper, 2002; Karp, 2006.

Las subunidades de Nf-160 y Nf-200 poseen brazos laterales que se proyectan hacia fuera

del Nf desde las colas globulares del extremo carboxi-terminal. En los axones, estos brazos

laterales están fosforilados y los niveles de fosforilación son particularmente altos en los de

los Nf-200 (Ackerley et al., 2003; Huh et al., 2002). Una de las funciones postuladas para

los brazos laterales es que mantendrían un espaciado apropiado entre los Nf paralelos del

79
Introducción

axón (Karp, 2006). La fosforilación de esta región de los Nf-160 y -200 juega también un

papel fundamental en el proceso de ensamblaje/desensamblaje e influye asimismo en la

fosforilación de los mismos sitios adecuados en el dominio de la cola carboxi-terminal.67

Se sospecha que la fosforilación también puede jugar un rol en la formación de puentes

cruzados entre los Nf y de estos con los NTs y, de esta manera, enlentecer el transporte

axonal promoviendo la integración de las proteínas de los Nf a la red del citoesqueleto

neuronal. Por medio de estos procesos se controlaría el diámetro del axón y se estabilizaría

el citoesqueleto neuronal (Sihag et al., 2007). Contrariamente, la desfosforilación de los Nf-

200 incrementa mucho la tasa y extensión de la proteólisis de los Nf (Huh et al., 2002).

Durante el desarrollo o el establecimiento de nuevos circuitos neuronales, una vez que

una neurona ha extendido una neurita y establecido un contacto y, por ello, ha dejado de

crecer el axón en longitud, se incorporan los Nf al axón, le brindan soporte mecánico y este

crece notablemente en diámetro (Karp, 2006). La densidad de los Nf axonales es constante

en axones de distinto diámetro y el número de los Nf presentes en un corte transversal de

un axón determinado se correlaciona bien con el área de dicho corte. La densidad

relativamente constante de los Nf está estrechamente relacionada con la presencia de los

puentes laterales que parecen determinar el espaciado entre los Nf adyacentes. Así, los Nf

son los principales determinantes del diámetro axonal. A su vez, el diámetro axonal es uno

de los principales determinantes de la velocidad de conducción en los axones mielinizados

(Hoffman et al., 1987).

La enorme importancia que poseen los Nf en la estructura neuronal está dada por el

67
Una enzima importante, con capacidad fosforilatoria de los brazos laterales de los Nf-160 y y Nf-200, es
la PKC. El acceso de la PKC a los FI para fosforilarlos se puede ver inhibido por la unión previa a estos de
la S100B (cfr. ut supra Tabla 5: Funciones intra- y extracelulares de la S100B, establecidas al momento
actual).

80
Introducción

hecho, entre otras cosas, de que las alteración de la estructura de los Nf puede alterar el

transporte axonal lento, puede afectar la velocidad de conducción de ese axon o llevar a la

neurodegeneración (Huh et al., 2002). Por ello, una buena forma de evaluar la “salud” de

una neurona es por medio de la evaluación cualicuantitativa de sus Nf.

Como se puede observar en la Tabla 7, el FI propio y característico de los astrocitos

(equivalente en todo a los Nf de las neuronas), es la GFAP, un FI de tipo III que ya he

mencionado al hablar del cambio de fenotipo de cGR al fenotipo astrocitario y al describir

los astrocitos mismos. Nótese también que la vimentina es la principal proteína de los FI de

las cGR y, al igual que la GFAP, es un FI de tipo III.

En los astrocitos es la GFAP el principal determinante de la forma celular y de la forma

y grado de extensión de las prolongaciones citoplasmáticas que los caracterizan.

I.5.3.2. La proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2):68

Además de las proteínas que forman a los NTs, los FIs y los MFs existe todo un gran

grupo de proteínas que se unen, principalmente, a los MTs (son, por ello, proteínas unidas

a los MTs). Así, por ejemplo, existen proteínas asociadas a los centrosomas, proteínas

motoras (como las kinesinas y las dineínas) y proteínas estructurales unidas a los MTs.

Entre estas últimas se cuentan las proteínas de ruptura (por ejemplo, la catanina-p60 y la

espastina), los factores catástrofe (por ejemplo, la stathmina), la doblecortina, y todo un gran

grupo de proteínas promotoras del ensamblaje de los MTs o, como se las denomina más

68
La mayor parte de los datos de esta subsección los he tomado de la excelente revisión de Sánchez et al.
(2000).

81
Introducción

frecuentemente, proteínas asociadas a MTs (MAPs, por las siglas en inglés de microtubule

associated proteins). Todos los miembros de las MAPs se unen a los MTs y, al hacerlo,

promueven su ensamblaje y estabilizan su estructura. De los varios tipos existentes de

MAPs, la MAP-2 y la proteína tau (J), y principalmente la primera, son especialmente

importantes en relación al presente trabajo.69

La MAP-2 se expresa en gran cantidad en el SNC aunque también se la encuentra en

otros tejidos. Dentro del SNC, las MAP-2 de alto PM (HMWMAP-2) se expresan

específicamente en las neuronas, en somas y dendritas, asociadas principalmente a los MTs

y en co-localización con la actina en las espinas dendríticas y en las densidades

postsinápticas; pueden estar presentes en el axón pero sólo en pequeñas cantidades, a punto

tal que, en general, a la inmunomarcación específica para la MAP-2 se la utiliza

habitualmente como marcador de dendritas. Las MAP-2 de bajo PM (LMWMAP-2), en

cambio, tienen una distribución más generalizada dentro de los distintos compartimientos

celulares de las neuronas y se las puede encontrar también en las células de la glía (aunque

en menor proporción).

Las distintas variantes de la MAP-2 varían también en su momento de aparición durante

el desarrollo, por lo que se supone que cada variante puede tener funciones temporalmente

diferentes.70

Se postula que la MAP-2 cumple, entre otras, con las siguientes funciones: i) está

implicada (y puede ser esencial) en el brotado y crecimiento de las neuritas y en el

69
Cfr. Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) donde se detalla la estructura
de la MAP-2.
70
Así, por ejemplo, la MAP-2A se expresa mayormente en el cerebro adulto; la M AP-2B está presente a lo
largo de todo el desarrollo del SNC pero sus niveles disminuyen en el período postnatal temprano en la rata;
la MAP-2C se expresa en estadíos tempranos del desarrollo y luego en el adulto pero selectivamente en las
dendritas y somas; la M AP-2D se expresa en el cerebro de la rata sólo a partir de P5 (si bien que su ARNm
está presente desde antes, durante todo el desarrollo).

82
Introducción

establecimiento de la polaridad celular en las neuronas inmaduras, y en su mantenimiento

en la maduras; ii) interactúa con los MTs y, al hacerlo, incrementa su rigidez, los estabiliza

y da origen a polímeros microtubulares más largos; iii) estimula la formación de haces

microtubulares (no se sabe bien aún por cuál mecanismo, si por la unión cruzada de los MTs

por medio de la dimerización de la MAP-2 y/o por la rigidez inducida en los MTs); iv)

puede intervenir en (y regular) el transporte microtubular de organelas mediado por

proteínas motoras de manera diferencial en axones y dendritas; v) se puede unir, y parece

interactuar con los MFs de actina-F, aparentemente por medio de los mismos dominios por

los que se une a los MTs (TBD), especialmente en las espinas dendríticas durante la

sinaptogénesis; vi) puede unirse a los Nf, quizás por medio de un dominio particular,

distinto del TBD; vii) los cambios en sus niveles acompañan a las modificaciones

sinápticas y, por lo tanto, a las modificaciones en los circuitos sinápticos; viii) sus ciclos

de fosforilación y desfosforilación acompañan la dinámica sináptica (el establecimiento, la

consolidación y la modificación de las sinapsis).71

I.5.4. El óxido nítrico y el sistema nitrérgico:

El óxido nítrico (NO; monóxido de nitrógeno) es un gas, una molécula difusible que

actúa, en el SNC, como un neurotransmisor volumétrico (Dawson et al., 1992; Dawson y

Snyder, 1994). Su síntesis se lleva a cabo a partir del aminoácido L-arginina en presencia

71
Es precisamente este mecanismo, la fosforilación/desfosforilación, el principal medio de control molecular
de su dinámica. Cfr. Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo) en donde se
detallan los modos de transducción de las cambiantes señales extracelulares en cambios estructurales del
citoesqueleto.

83
Introducción

de oxígeno molecular (O2) y NADPH, tetrahidrobiopterina, FMN y FAD como cofactores

enzimáticos (Fig. 20). La enzima que realiza la reacción biosintética es la óxido nítrico

sintetasa (NOS; E.C.: 1.14.13.39), una metaloenzima que posee un grupo prostético hemo

en el sitio catalítico y es Ca2+-calmodulina-dependiente. En los mamíferos existen tres

isoformas conocidas de la enzima: i) la isoforma neuronal o tipo I (nNOS) expresada

constitutivamente por determinadas neuronas en el SNC, codificada en el cromosoma 12;

ii) la isoforma inducible o tipo II (iNOS) expresada por los macrófagos y los microgliocitos

tras la inducción de su transcripción del cromosoma 17; y iii) la isoforma endotelial o tipo

III (eNOS) expresada constitutivamente por las células endoteliales y codificada en el

cromosoma 7 (Wang y Marsden, 1995).

Al NO se lo ha implicado en funciones

tan amplias y dispares como el desarrollo

del SNC, neuromodulación, neurotoxicidad,

plasticidad sináptica, potenciación a largo


Fig ura 20. R eacción catalizada por la óxid o nítrico sintetasa
plazo, enfermedades neurodegenerativas, (N O S ) y biosíntesis del óxido n ítrico (N O ). B H 4: tetrahidrobiopte-
rina; FM N : flavinm ononucleótico; FA D : flavina adenina dinucleóti-
d o.
etc. (Black et al., 1999; Cerruti et al., 1995;

Dawson y Dawson, 1996; Liberatore et al., 1999; Lu et al., 1999; Roskams et al., 1994).

Durante el desarrollo prenatal, por ejemplo, funciona como un factor extrínseco de

diferenciación neuronal y como inhibidor de la neurogénesis en la adultez (Moreno-López

et al., 2004; Packer et al., 2003).

Las neuronas nitrérgicas están relacionadas con las serotoninérgicas tanto desde un punto

de vista morfológico (Johnson y Ma, 1993; Ramos et al., 2002; Tagliaferro et al., 2001;

Wang et al., 1995; Wotherspoon et al., 1994; Xu y Hökfelt, 1997) como funcional (Kaehler

84
Introducción

et al., 1999; Karolewicz et al., 2000; Sugimoto et al., 1999; Wegener et al., 2000) y por este

motivo se las considerará también en este trabajo. Un número importante de las neuronas

serotoninérgicas del NDR coexpresan galanina y la enzima nNOS y se proyectan

mayoritariamente al cuerpo estriado (Xu y Hökfelt, 1997). Por otro lado, en el Strt, muchas

terminales serotoninérgicas hacen contacto con neuronas productoras de NO que expresan

a la nNOS (neuronas medianas, sin espinas, GABAérgicas que coexpresan somatostatina

y neuropéptido Y); el Strt es una de las regiones anatómicas en las que existe una mayor

interacción entre ambos sistemas neurotransmisores.

Entrando en el terreno de las enfermedades y de la toxicología, se sabe que la acción de

algunas drogas neurotóxicas para el sistema serotoninérgico (como la cocaína y ciertas

anfetaminas sustituidas) podría estar en parte mediada por el NO (Tagliaferro et al., 2003;

Torres y Rivier, 1994; Zheng y Laverty, 1998). El NO puede alterar la actividad de distintas

proteínas y enzimas, entre ellas la TPH, la primera enzima (y limitante) de la biosíntesis de

la 5-HT (Kuhn y Arthur, 1997; Kuhn y Geddes, 1999). Por otro lado, los niveles de

expresión de la nNOS y la iNOS pueden verse alterados tras la depleción de los niveles

cerebrales de 5-HT (Ramos et al., 2002; Tagliaferro et al., 2001, 2003). Tras la isquemia

cerebral focal se han observado alteraciones de las neuronas que expresan a la nNOS (Zhang

et al., 1994); se han observado también neuronas nitrérgicas citomegálicas en el Strt tras la

asfixia perinatal (Loidl et al., 1997) y alteraciones del sistema nitrérgico en las enfermedades

de Parkinson y de Alzheimer (Duncan y Heales, 2005). In vitro, la S-100B es capaz de

estimular la producción de NO, probablemente por medio de un efecto iNOS-dependiente

(Hu et al., 1996; Hu y Van Eldik, 1999). El NO, si está presente en el medio en altas

concentraciones por efecto de la S100B, puede inducir muerte celular apoptótica tanto en

85
Introducción

neuronas (Hu et al, 1997; Hu y Van Eldik, 1999) como en astrocitos (Hu y Van Eldik,

1996).

Como se ve, hay una relación de dos vías entre el sistema nitrérgico y el serotoninérgico

en el que cada uno puede verse alterado a consecuencias de la alteración concomitante del

otro.

* * *

Es evidente la interrelación que existe entre el sistema nitrérgico y el serotoninérgico por

un lado y, por otro lado, entre el sistema nitrérgico y los astrocitos y el serotoninérgico y los

astrocitos; más aún, el sistema serotoninérgico y los astrocitos se relacionan con el

citoesqueleto neuronal y glial por medio de la S100B. Estas interrelaciones neurogliales

comienzan tempranamente durante el desarrollo prenatal y continúan en el desarrollo

postnatal temprano y tardío, durante la infancia, adolescencia y durante la adultez también.

Por lo tanto, es probable que ante injurias de distintos tipos estos elementos

interrelacionados se vean afectados de un modo u otro. Es lo que nos proponemos estudiar

en este trabajo, en el caso de que se administre EtOH a un animal en distintas etapas del

desarrollo de su SNC.

86
Hipótesis
y Objetivos
“Las preguntas superficiales siempre encuentran una respuesta. Las preguntas profundas
generan nuevas preguntas.”
Refrán del Budismo Zen.

“Sabio no es aquel que da las respuestas correctas, es el que hace las preguntas correctas.”
Claude Lévi-Strauss (1908- )

II.1. Consideraciones generales acerca del alcoholismo materno-fetal, el sistema

serotoninérgico, los astrocitos y la proteína S100B y el sistema nitrérgico:

Hasta el momento previo a iniciarse los experimentos originales que se exponen en el

presente trabajo se sabía, a grandes rasgos, lo siguiente acerca del efecto del AMF sobre el

desarrollo pre- y postnatal del cerebro en general, y sobre los sistemas serotoninérgico y

nitrérgico y los astrocitos y la S100B en particular.

Durante el desarrollo prenatal, el EtOH es capaz de alterar los mecanismos

neurogenéticos y provocar así la aparición de displasias corticales por alteración de los

mecanismos corticogenéticos (Miller, 1986). También en la adultez puede alterar la

neurogénesis en el giro dentado de la formación del hipocampo (Herrera et al., 2003).

Existe mucha evidencia que indica que durante la EPE el sistema serotoninérgico es uno

de los principales sistemas de neurotransmisores que se ven afectados (Rathbun y Druse,

1985; Sari et al., 2001). Sobre el sistema serotoninérgico varios son los efectos que se han

demostrado de la EPE; entre muchos otros, los siguientes: i) la inducción de una notable

reducción de la 5-HT cerebral, especialmente en la corteza, el cerebelo y el tronco del

encéfalo (Rathbun y Druse, 1985); ii) el retardo en la migración y en el desarrollo de las

neuronas serotoninérgicas (Zhou et al., 2001); iii) la disminución del número de las

neuronas serotoninérgicas en los núcleos del rafe mesencefálico (NDR y NMR) en

desarrollo (Tajjudin y Druse, 1999); iv) la reducción de los niveles de los receptores 5-HT1A

88
Hipótesis y Objetivos

en el tronco del encéfalo y en distintas regiones de la CC, el Hipp y el septum lateral (Kim

et al., 1997); v) la disminución de los sitios transportadores de 5-HT (5-HTT) en distintas

regiones corticales (Druse y Paul, 1989; Druse et al., 1991); vi) la alteración de la expresión

de la proteína S-100B y de otros factores neurotróficos (Sari et al., 2001; Tajjudin y Druse,

1989, 1999). También se han registrado alteraciones en las cGR, en los astrocitos, y en el

cambio de fenotipo normal de unas a otros (Fletcher y Shain, 1993; Goodlett et al., 1993;

Miller y Robertson, 1993; Vallés et al., 1996, 1997).

El EtOH, según se ha demostrado en múltiples trabajos, puede ejercer efectos diversos

(y, lo que es muy importante, incluso contradictorios) sobre el desarrollo del cerebro

dependiendo del/los período/s durante el/los que actúe, dependiendo también del patrón del

exposición al EtOH (contínuo o intermitente), de la vía de administración del tóxico y de

los niveles de alcoholemia alcanzados (Ahluwalia et al., 2000; Bonthius y West, 1988).

En los seres humanos adultos el EtOH produce efectos deletéreos en el cerebro y la

mente que se conocen desde hace ya mucho tiempo.1 En animales adultos (humanos o no),

al igual que durante el desarrollo, el EtOH también puede provocar efectos neurotóxicos

en el sistema serotoninérgico; así, puede: i) dañar los principales núcleos serotoninérgicos

y provocar degeneración de sus axones y de las terminales axónicas distales (Halliday et

al., 1995); ii) provocar o no la pérdida de neuronas en los NDR y NMR (dependiendo de

la cantidad y de la duración de la ingesta alcohólica y de la presencia o no del síndrome de

Wernicke-Korsakoff) (Baker et al., 1996a, 1996b; Berggren et al., 2002; Halliday et al,

1993); iii) disminuir los niveles cerebrales de 5-HT (Lovinger, 1999); iv) alterar el patrón

de descarga eléctrica de las neuronas del NDR (Pistis et al., 1997); v) disminuir la

1
Cfr., por ejemplo, Korsakoff, 1890; Magnan, 1871; Marchiafava y Bignami, 1903; W ernicke, 1881.

89
Hipótesis y Objetivos

distribución y la densidad del 5-HTT en la corteza anterior del cíngulo (áreas 24, 25, 32 y

35 de Brodmann -áreas corticales límbicas-) (Mantere et al., 2002).

A pesar de la existencia de una gran cantidad de datos sobre los efectos que tiene el

EtOH sobre el sistema serotoninérgico en el feto y en el adulto, en los animales

adolescentes casi no existen datos concernientes a este respecto y no los hay desde el punto

de vista mofológico. Tampoco hay datos sobre el EtOH y el sistema nitrérgico y los

citoesqueletos neuronal y astroglial. Sin embargo, en los adolescentes, tanto sean seres

humanos o ratas, sí se sabe que el EtOH provoca respuestas conductuales diferentes en

relación con lo que se ve en los adultos. Los adolescentes se acomodan más fácil y

rápidamente a la presencia del EtOH en su medio interno (Doremus et al., 2003; Spear,

2000). Las ratas adolescentes muestran menos signos de ansiedad ante la abstinencia aguda

en la prueba del laberinto elevado en cruz (Doremus et al., 2003), en la prueba de campo

abierto (Slawecki y Roth, 2004) o en pruebas de interacción social (Varlinskaya y Spear,

2004). Además, tienen una resistencia relativa al compromiso motor y a los efectos

sedativos del EtOH (el inicio de la sedación suele ser más lento y de menor magnitud) pero

parecen ser más sensibles que los adultos a las alteraciones en el aprendizaje y en la

memoria espacial (funciones conductuales que dependen de la integridad del Hipp)

(Markwiese et al., 1998; Spear, 2000; White y Swartzwelder, 2004). La exposición crónica

de las ratas adolescentes al EtOH induce alteraciones a largo plazo en sus funciones

congnitivas (Osborne y Butler, 1983). La administración aguda de EtOH inhibe la

neurotransmisión glutamatérgica NMDA-dependiente en el Hipp, más fuertemente durante

la periadolescencia que en la adultez (White y Swartzwelder, 2004). Diferentes regiones

corticales (zonas olfatorias, la porción anterior de la corteza piriforme y entorrinal) son

90
Hipótesis y Objetivos

vulnerables a los efectos del EtOH solo en las ratas adolescentes y no en las adultas (Brown

y Tapert, 2004; Crews et al., 2000). También en las ratas, la exposición a niveles

intermitentes breves pero altos de EtOH durante la adolescencia (P35-P40), parecería

inducir cambios persistentes a largo plazo en los efectos de nuevas dosis agudas de EtOH

sobre la actividad eléctrica cortical registrada con el EEG; dado que estos cambios no se

ven en condiciones basales se ha especulado con que los cambios neuroadaptativos que

normalizaron la función neurofisiológica tras la exposición al EtOH, indujeron cambios

“latentes” en los mecanismos neurobiológicos que regulan la respuesta EEG al EtOH

(Slawecki, 2002).

II.2. Hipótesis:

El tejido nervioso en general, y el SNC en particular, son muy sensibles al daño

provocado por distintos tóxicos en todas las edades de la vida aunque con distinto grado de

sensibilidad según la edad particular que se considere. Es harto y de antiguo sabido que el

EtOH en altas dosis es capaz de provocar daños severos y evidentes en los animales adultos

y más aún en los adolescentes, infantes y, mucho más aún, en los que se encuentran en su

desarrollo prenatal. Sin embargo, considerados el SNC y el EtOH a la vez, en virtud de la

especial sensibilidad de uno y los múltiples mecanismos farmacocinéticos y

farmacodinámicos del otro, es lícito emitir la hipótesis de que la administración de la droga

por períodos prolongados (administración crónica), incluso a bajas dosis, será capaz de

provocar distintos tipos de daños. Es probable que esto sea así en los distintos momentos

91
Hipótesis y Objetivos

vitales del desarrollo (pre- y postnatal) y, lógico es suponer, que el daño (si existiere) sea

mayor cuanto más inmaduro sea el organismo pero que, al mismo tiempo, la capacidad de

recuperación espontánea o de prevención de tal daño sea (a la inversa) menor cuanto más

maduro o diferenciado esté el SNC del animal intoxicado.

Así pues, para el presente trabajo, y en relación con las relaciones neuro-gliales y el

sistema serotoninérgico y su relación con el desarrollo, en general del SNC y con la

corticogénesis en particular, hube de manejarme atento a las siguientes hipótesis referidas

a la experimentación con animales de laboratorio:

I) el EtOH administrado por una vía fisiológica (la oral) a hembras preñadas induce
daños evidentes a las relaciones neurogliales que tienen como centro al sistema
serotoninérgico, incluso si el tóxico fuere administrado a bajas dosis incapaces de
por sí de inducir manifestaciones conductuales visibles en las madres y que
constituirían, parcialmente, un correlato experimental de los observado y descripto
en los seres humanos como Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con
Alcohol (ARND);
II) el bajo grado de exposición prenatal al EtOH es incapaz de inducir alteraciones
estructurales groseras (displasias corticales, entre ellas) aunque sí, acaso,
ultraestructurales y más aún en la expresión de distintas moléculas marcadoras de
las relaciones neuro-gliales; sin embargo, en virtud del bajo grado de exposición
es esperable que el daño sea, también, leve;
III) si se provocare un daño leve en las relaciones neuro-gliales por la exposición prenatal
de bajo grado al EtOH, es probable que, en virtud de la alta plasticidad de los
animales jóvenes, el daño sea reparado total o parcialmente durante el crecimiento
y desarrollo;
IV) si se provocare un daño prenatal en las relaciones neuro-gliales que tienen como
centro al sistema serotoninérgico, tal que no se recuperaren espontáneamente, es
probable que se lo pueda prevenir por métodos farmacológicos por medio de, por

92
Hipótesis y Objetivos

ejemplo, la administración de una droga que actúe reforzando la acción de tal


sistema “dañado”;
V) el daño provocado por la exposición de animales adolescentes a bajos niveles de
EtOH provocará daños presumiblemente leves pero ciertamente evidentes (si los
provocare) en las relaciones neuro-gliales que, en virtud de la aún presente
plasticidad del cerebro joven, es probable que se recuperen espontáneamente, total
o parcialmente, tras la abstinencia prolongada;
VI) el daño provocado por la exposición de animales adultos a bajos niveles de EtOH (si
lo provocare), en virtud de lo ya diferenciado y maduro del tejido nervioso, será
de grado leve pero ciertamente evidente sobre las relaciones neuro-gliales que
tienen como centro al sistema serotoninérgico.

II.3. Objetivos:

Con la finalidad de confirmar o refutar las hipótesis anteriores se fijaron los siguientes

objetivos generales y específicos.

II.3.1. Generales:

Los objetivos generales que nos fijamos para el presente trabajo experimental son los

que se detallan a continuación:

I) Desarrollar un método experimental de administración del EtOH a ratas Wistar, que


cumpla con los siguientes requisitos:

93
Hipótesis y Objetivos

a. que sea de administración por vía oral, en el agua de bebida;


b. que sea compatible con su uso en animales de distintas edades y sexo;
c. que no modifique el estado nutricional de los animales durante y después de la
exposición;
d. que no modifique los parámetros gestacionales más importantes al implementarlo
en hembras preñadas (incremento de peso gestacional materno, número de crías
por camada, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer);
e. que genere bajos niveles de alcoholemia en todos los animales, sean estos de la
edad y sexo que fueren.
II) Desarrollar protocolos experimentales que permitan evaluar los efectos de la
alcoholización crónica de bajo nivel sobre las relaciones neuro-gliales en varios
períodos del desarrollo del SNC:
a. protocolo de exposición prenatal al EtOH;
b. protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia;
c. protocolo de exposición al EtOH durante la adultez.
III) Generar en el protocolo de exposición prenatal al EtOH un modelo
experimentalmente válido en animales de laboratorio de los Trastornos del
Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND) que se observan en el ser
humano.
IV) Evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales que tienen como centro
al sistema serotoninérgico, en animales de cada uno de los protocolos de exposición
al EtOH, por medio de métodos de microscopía óptica (observación cualitativa,
morfometría en experimentos de ICQ con marcadores neuronales —TPH, 5-HT, 5-
HTT, Nf-200, MAP-2 y nNOS— y gliales —GFAP y S-100B —), de microscopía
electrónica y/o conductuales, según correspondiere o se evaluare pertinente en cada
caso.
V) Evaluar el daño (si existiere), por los métodos morfométricos del punto anterior, en
los núcleos mesencefálicos fuente de la inervación serotoninérgica distal (es decir,
el NDR y el NMR) y en las correspondientes áreas prosencefálicas por ellos
inervadas (es decir, CA1 Hipp, Strt y CxF).
VI) Comparar los tipos y/o patrones de daño (si existire) en las relaciones neuro-gliales,

94
Hipótesis y Objetivos

en los distintos grupos etarios provocados por la exposición crónica leve al EtOH.

II.3.2. Específicos:

Los objetivos específicos fijados para el presente trabajo experimental son los que se

detallan a continuación:

I) En el protocolo de exposición prenatal al EtOH:


a. lograr el desarrollo de crías de ratas Wistar bajo condiciones tales que sean
expuestas al EtOH durante todo el período de desarrollo de su SNC (pre- y
postnatal, teniendo en cuenta que en las ratas el período de desarrollo prenatal
corresponde a los dos primeros trimestres del desarrollo gestacional humano y que
los primeros 14 días su de vida postnatal equivalen, aproximadamente, al tercer
trimestre gestacional humano);
b. evaluar minuciosamente los parámetros de salud gestacional en las hembras
preñadas y de los fetos al nacer y durante su desarrollo postnatal, durante la niñez
y adolescencia, hasta la adultez;
c. evaluar cualitativamente, por medio de la observación con microscopía óptica, la
citoarquitectura del SNC en general, y la neocortical en especial, en las crías
sometidas a EPE;
d. evaluar cuali- y cuantitativamente, por medio de la observación con microscopía
óptica y la morfometría, en experimentos de ICQ, la presencia o ausencia de
cambios en la expresión de distintos marcadores neuronales y gliales en las área
especificadas ut supra en los objetivos generales;
e. evaluar, en crías postnatales tempranas y tardías, la presencia o ausencia de
alteraciones ultraestructurales en las neuronas de áreas prosencefálicas por medio
de la utilización de la microscopía electrónica de transmisión;
f. administrar buspirona (una droga agonista parcial de los receptores 5-HT1A) a las
hembras gestantes concomitantemente con el EtOH, en un subprotocolo ad hoc

95
Hipótesis y Objetivos

(denominado protocolo de exposición prenatal al EtOH con prevención del daño


por la administración de buspirona), con la finalidad de evaluar, por microscopía
óptica en experimentos de ICQ, la posibilidad de prevenir el daño provocado por
el EtOH;
g. evaluar, en crías ya adultas sometidas a EPE, dos parámetros conductuales
(motilidad y ansiedad ante la exposición a un ambiente novedoso) en caso de que
la evaluación de la estructura cerebral en los experimentos del punto anterior
hubieran arrojado diferencias significativas;
II) En el protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia:
a. exponer crónicamente al EtOH a ratas Wistar en su adolescencia tardía;
b. evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales, por métodos
morfométricos de microscopía óptica en experimentos de ICQ, en áreas
mesencefálicas y prosencefálicas, en las ratas adolescentes inmediatamente
después de la exposición;
c. evaluar (si se verificare daño en la evaluación del punto anterior) la presencia o
ausencia de capacidad de recuperación espontánea por medio de la simple
abstinencia tras exposición crónica al EtOH.
III) En el protocolo de exposición al EtOH durante la adultez:
a. evaluar el daño (si existiere) de las relaciones neuro-gliales, por métodos
morfométricos de microscopía óptica en experimentos de ICQ, en áreas
mesencefálicas y prosencefálicas, en las ratas adultas expuestas crónicamente a
bajos niveles de EtOH.

96
Materiales
y Métodos
“Quien trabaja sin método, trabaja en vano.”
Proverbio monástico .

III.1. Materiales:

El EtOH que se administró a los animales era de grado analítico (Merck KgaA;

Darmstadt, Germany).

La buspirona utilizada (clorhidrato de N-[4-[4-(2-pirimidinil)-1-piperazinil]butil]-8-

azaspiro[4.5]decano-7,9-diona; PM: 421,96 Da; lote 101H0402) se adquirió a Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, EUA.

Para los experimentos de inmunocitoquímica (ICQ) se utilizaron los siguientes

anticuerpos primarios:

i) anti-TPH (anti-triptófano hidroxilasa; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma;


clon WH-3, lote 105H4831);
ii) anti-5-HT (anti-serotonina; anticuerpo policlonal de conejo; desarrollado
previamente, por la Prof. Dra. Alicia Brusco; ver Brusco et al., 1983);
iii) anti-5-HTT (anti-transportador de serotonina; anticuerpo monoclonal de ratón;
adquirido a Chemicon International; Temecula, CA, EUA; clon VBS1; lote
18111727);
iv) anti-GFAP (anti-proteína gliofibrilar ácida; anticuerpo policlonal de conejo anti-
vaca; adquirido a Dako Corp.; Glostrup, Denmark; lote 096, edición 05.07.00);
v) anti-S100B (anti-proteína S100B; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma; clon
SH-B1, lote 099H4812);
vi) anti-Nf-200 (anti-neurofilamentos de 200 kDa; anticuerpo monoclonal de ratón;
Sigma; clon N52, lote 90K4843);

98
Materiales y Métodos

vii) anti-MAP-2 (anti-proteína asociada a microtúbulos tipo 2; anticuerpo monoclonal


de ratón dirigido contra los tres tipos de MAP-2 de alto PM [es decir, MAP-2A,
MAP-2B y MAP-2C]; Sigma; clon HM-2, lote 053K4838);
viii) anti-nNOS (anti-óxido nítrico sintetasa; anticuerpo monoclonal de ratón; Sigma;
clon NOS-B1, lote 60K4885);

Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:

i) anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con biotina (Sigma; lote 078H9161) para
los casos en los que se utilizaron anticuerpos primarios policlonales de conejo;
ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con biotina (Sigma; lote 078H9060) para
los casos en los que se utilizaron anticuerpos primarios monoclonales de ratón.

Finalmente, en el último paso de la técnica ICQ se utilizó un complejo de avidina-

peroxidasa (Extravidin®-Peroxidase; Sigma; lote 103K4840). En el paso de revelado de la

reacción enzimática se usó tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobenzidina (Sigma; lote

65H0170), sulfato amónico de níquel (Carlo Erba Reagenti; Milano, Italia) y peróxido de

hidrógeno (H2O2; Merck KgaA).

Para realizar los cortes ultrafinos para microscopía electrónica, el tejido fue incluído en

el medio de inclusión Durcupan (Fluka AG, Chemische Fabrik, Buchs SG, Switzerland).

Todas las otras sustancias químicas utilizadas eran de grado analítico.

III.2. Métodos:

III.2.1. Método utilizado de administración de etanol:

99
Materiales y Métodos

En todos los protocolos que se detallan más abajo se utilizó el método de administración

de EtOH en el agua de bebida a una concentración de 6,6% (v/v).1

En la elección de este modelo se tuvieron en cuenta, como factores decisivos, las

siguientes ventajas y hechos:

i) la vía de administración oral, que es fisiológicamente semejante al consumo


humano;
ii) la ausencia de generación de estrés con la utilización de esta vía de administración
(a diferencia de lo que sucede, por ejemplo, en la administración intrabucal o
intragástrica por sonda orogástrica o por gastrostomía, o en la inyección
intraperitoneal);
iii) la facilidad de preparación de la solución de EtOH;
iv) la economía del método en estudios a largo plazo;
v) la posibilidad cierta y conocida de inducir bajas alcoholemias concomitantemente
a una baja capacidad para provocar signos conductuales de intoxicación aguda o
crónica durante el período de administración y de signos conductuales de
abstinencia aguda ante la retirada brusca;
vi) para los estudios que se habrían de llevar a cabo no era necesario bajo ningún
aspecto asegurarse la producción de lesiones hepáticas por lo que se podía
prescindir de la utilización de dietas líquidas, mucho más onerosas;
vii) la existencia de antecedentes ciertos y conocidos acerca de que con este método
de administración, a concentraciones levemente mayores (10% v/v) se obtienen
concentraciones de EtOH clínicamente relevantes en el líquido extracelular del
SNC (Nurmi et al., 1999); y que
viii) en estudios previos similares, con administración del EtOH en dieta líquida y con
la utilización de igual concentración que la aquí elegida, se obtuvieron importantes
alteraciones en la corticogénesis (Miller, 1986).

1
Cfr. Anexo III (M étodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).

100
Materiales y Métodos

III.2.2. Metodología general del tratamiento de los animales:

III.2.2.1. Origen, alojamiento:2

Según el protocolo experimental de que se tratara, se utilizaron animales machos y/o

hembras de ratas noruegas de la cepa albina Wistar (Rattus norvegicus; Hsd: WI) de

distintas edades postnatales.

Los animales se adquirieron en el bioterio central de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires o se obtuvieron por cría directa en el

bioterio del Instituto de Biología Celular y Neurociencias de la Facultad de Medicina de la

Universidad de Buenos Aires.

Durante los períodos experimentales, todos los animales utilizados fueron mantenidos

en el mismo ambiente: ciclo luz-oscuridad de 12:12 hs (las luces se apagaban a las 18:00

hs), en una habitación bien ventilada, con temperatura y humedad controladas (20 ± 2ºC y

50-70%, respectivamente).

Los machos y las hembras no preñadas o en apareo fueron alojados, en grupos de 4 a 5,

en jaulas de acero inoxidable (44 cm de longitud × 31 cm de ancho × 20 cm de alto) con

camas de viruta de madera.

Cada día, entre las 09:00 y las 11:00 hs (según se detalla más abajo), se calculó el

consumo de alimento y bebida, se repuso lo consumido y se pesó a cada animal utilizado,

fueran machos o hembras (preñadas o no), crías o adultos.

2
El tratamiento de los animales se llevó a cabo de acuerdo con la Guía para el Uso y Cuidado de los Animales
de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud de EUA y con los principios presentados en la Guía para
el Uso de Animales en Investigación en Neurociencias de la Society for Neuroscience (SfN).

101
Materiales y Métodos

III.2.2.2. Apareamiento, diagnóstico de preñez y cría:

En los protocolos experimentales en los que se requiría el apareo de animales para el

estudio postnatal de las crías se alojó, en cada jaula, a un macho adulto cada 2 a 4 hembras.

El diagnóstico de preñez se realizó por el estudio de una muestra de extendido vaginal

tomado cada mañana entre las 07:00 y las 09:00 hs. La toma de la muestra se realizó

instilando y aspirando dos o tres veces, con una pipeta Pasteur, 0,5-1,0 ml de solución

fisiológica tibia en el introito vaginal de cada hembra. Recogido el material en un

portaobjetos gelatinado, se lo examinaba inmediatamente, en fresco, con un microscopio

Zeiss Axiolab en busca de determinar la presencia de espermatozoides. El día en que se los

hallaba era considerado como el inicio de la gestación y se lo designaba día gestacional o

embrionario cero (E0).

Las hembras preñadas eran inmediatamente alojadas en forma individual en jaulas más

pequeñas, de acero inoxidable (30 cm de longitud × 18 cm de ancho × 18 cm de alto), con

camas de viruta de madera, para permitirles la construcción del nido y evitar fuentes de

estrés por la convivencia con el macho u otras hembras. El día del parto (E21 o E22) se

determinó el sexo de cada cría nacida viva o muerta (proceso de sexado) y se registró su

peso al nacer para controlar su crecimiento y desarrollo. Las camadas se redujeron siempre

a un tamaño de 10-12 animales para asegurar la adecuada alimentación de las crías lactantes

por parte de la madre. La reducción de las camadas se hizo a expensas de las hembras. La

reducción se llevaba a cabo por decapitación previa anestesia inhalatoria con éter o con

dióxido de carbono.

El día del nacimiento se consideró como día postnatal cero (P0). Hasta el momento del

102
Materiales y Métodos

destete, en P21, se mantuvo juntas a las crías con su madre en la misma jaula,

permitiéndoles que mamaran e interactuaran libremente. A las crías que se estudiaron más

allá de la edad P21 se las separaba por sexo ese día y se las alojaba en jaulas grandes, en

grupos de 3 a 5.

III.2.2.3. Alimentación apareada:

A los animales se les ofreció alimento estándar para roedores de laboratorio (Alimentos

Pilar; SENASA Nº 02-014/A; Pilar, Buenos Aires, Argentina). Cada gramo de este

alimento provee 2,5 kCal de energía digestible.

En todos los protocolos experimentales que se detallan más abajo se llevó a cabo un

modo de alimentación tal que asegurara que las diferencias experimentales observadas no

se debieran a diferencias nutricionales sino a los efectos del EtOH exclusivamente. Este

modo de alimentación se denomina alimentación apareada. Es decir, es apareada ya que

a los animales del/los grupo/s control se les ofreció cada día, durante todo el período

experimental, una cantidad de alimento (en gramos) equivalente a las calorías que

incorporaron los animales del/los grupo/s tratado el día anterior. Por lo tanto, los animales

tratados iniciaron, siempre, el período experimental un día antes que los animales control.

Para calcular las calorías consumidas por los animales tratados se tuvieron en cuenta las

calorías aportadas por el alimento (2,5 kCal/g) y las calorías derivadas de la solución de

EtOH (7,07 kCal/g de EtOH; * = 0,789 g/ml). Así, cada día se calculó por diferencia el

peso del alimento consumido por los animales tratados durante el día anterior y se

103
Materiales y Métodos

calcularon las calorías incorporadas a partir de este. También por diferencia se calculó el

volumen de solución de EtOH consumida, la cantidad de EtOH consumida en mililitros y

en gramos y las calorías que aportaron. Sumadas las calorías del alimento y del EtOH se

ofrecían, entonces, estas mismas calorías (convertidas previamente a gramos) en forma de

alimento sólido a los animales control. Todos los cálculos se hicieron en base a la unidad

de peso corporal (el gramo, pero en beneficio de la claridad, en los resultados se informa

por kg de peso corporal).

III.2.2.4. Bebida:

En todos los protocolos experimentales, para beber, a los animales del/los grupo/s

control se les ofreció agua. A los animales del/los grupo/s tratado se les ofreció siempre una

solución de EtOH 6,6% (v/v) en agua. A ambos grupos de animales se les permitió beber,

en todos los casos, ad libitum.

La solución de EtOH se preparaba cada día inmediatamente antes de ofrecer una ración

fresca. A fin de asegurar el consumo obligado del EtOH, a los animales que lo recibieron,

no se les permitió la posibilidad de elegir entre tomar agua o la solución de EtOH ya que

esta fue la única fuente de líquido con la que contaron. A los fines de asegurar la adaptación

gradual de los animales a la ingesta de EtOH, este fue incorporado al agua de bebida en

forma paulatina (en concentración de 1% el primer día, a 3,3% el segundo y tercer días y

recién a partir del cuarto día se incorporaba la concentración máxima de 6,6% (v/v) a usar

durante los períodos de intoxicación).

104
Materiales y Métodos

III.2.3. Protocolos experimentales:

Se llevaron a cabo cuatro protocolos experimentales distintos a los fines de estudiar los

efectos que tienen las bajas alcoholemias sobre el sistema serotoninérgico y la astroglía en

distintos momentos evolutivos del desarrollo cerebral: durante el desarrollo prenatal y,

durante la vida postnatal, en la adolescencia y la adultez.

III.2.3.1. Exposición prenatal al etanol, sin prevención del daño:

En este primer protocolo experimental se utilizaron ratas hembra nulíparas que pesaban

221,9 ± 18,9 g (rango: 202,0-251,0 g; n = 10). A estas hembras se las dividió en dos grupos

cuyos pesos eran de 225,63 ± 16,2 g (rango: 202,0-238,5 g) para el grupo Control (n = 4)

y de 219,33 ± 21,5 g (202,5-251,0 g) para el grupo tratado (en adelante denominado grupo

EtOH; n = 6). Las medias de los pesos iniciales no diferían estadísticamente entre sí (P =

0,6342).

Las hembras EtOH fueron expuestas a la solución de EtOH durante las 6 semanas

previas al apareo3, durante las tres semanas de la gestación y en el período postparto hasta

el destete de sus crías 21 días más tarde. En total, el período de exposición materna crónica

al EtOH (EMCE) se prolongó durante 12 semanas (Cuadro 1), en tanto que sus crías

estuvieron expuestas transplacentariamente durante la gestación y por la leche de sus

3
Para permitir que se produjeran los cambios metabólicos propios del alcoholismo crónico. Cfr. sección I.3.1.
(Farmacocinética) en la Introducción y Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al
etanol. Ventajas y desventajas).

105
Materiales y Métodos

madres durante todo el período de la lactancia.

Para los estudios de


Período de exposición materna crónica al etanol (EMCE)
microscopía óptica (tinción con

azul de toluidina e ICQ con

distintos marcadores) se utilizó 6 sem anas 21 días 21 días

Pregestacional Gestacional Lactancia


el cerebro de las crías macho de

edad P21 y para los de


P arto Fijación
Inicio del P reñez
(P 0) (P 21)
tratam iento (E 0)
microscopía electrónica se
C uadro 1. C ronogram a de tratam iento del protocolo de exposición p renatal al
eta nol sin p revención d el d año.

utilizaron cerebros de crías

macho de edades P5 y P21.

III.2.3.2. Exposición prenatal al etanol, con prevención del daño por administración

de buspirona:

En este protocolo experimental también se utilizaron ratas hembra nulíparas que pasaron

por un período de exposición al EtOH de 6 semanas previas al apareo. Los dos grupos

iniciales (Control y EtOH), a medida que las hembras eran preñadas, fueron subdivididos

en cuatro subgrupos experimentales. Dos subgrupos continuaron bebiendo agua

(denominados C) y dos EtOH (denominados E). A un subgrupo C y a un subgrupo E habría

de administrárseles la droga buspirona y a los otros, solución salina. De este modo,

quedaron conformados cuatro subgrupos: CS (control-salina, es decir, bebieron agua y se

les admnistraría solución salina), CB (control-buspirona), ES (EtOH-salina) y EB (EtOH-

106
Materiales y Métodos

buspirona). Al inicio del período gestacional las hembras de los cuatro grupos de este

protocolo presentaban pesos estadísticamente equivalentes (CS: 279,0 ± 8,485 g, n = 2; CB:

268,8 ± 26,52 g, n = 2; ES: 260,2 ± 32,27 g, n = 3; EB: 231,0 ± 3,54 g, n = 3).

Se preparó una solución de buspirona a una concentración 7,11 mM (3,0 mg/ml p/v) en

solución salina. Esta solución fue esterilizada por filtrado a través de filtros de nylon

descartables, con poros de 0,45 :m de diámetro (Advantec MFS, Inc.; modelo DISMIC

25NSO45AS; Dublin, CA, EUA). Desde el día E13 hasta el día E20, diariamente entre las

11:00 y las 12:00 hs, a las hembras CB y EB se les administró la buspirona en una dosis de

4,5 mg/kg/d (10,66 mmol/kg/d), por vía subcutánea. A los restantes subgrupos (CS y ES)

se les administró volúmenes equivalentes de solución salina, también por vía subcutánea.

El volumen inyectado en cada ocasión estuvo en el orden de los 0,4-0,6 ml, dependiendo

del peso gestacional, variable, de la hembra. La inyección se realizaba por inmovilización

suave de la hembra, con deprivación visual para minimizar el grado de stress, y

administración de la solución correspondiente en un pliegue de la piel laxa interescapular.

A diferencia del anterior protocolo, en éste, al momento del parto se discontinuó la

administración de EtOH en el agua de bebida. Así, las hembras fueron expuestas durante

9 semanas a la acción del tóxico y sus crías sólo durante el período gestacional,

transplacentariamente.

Para los estudios de microscopía óptica (ICQ con distintos marcadores) se utilizaron

crías macho de edades P5, P21, P35, P60 y P90. Para los estudios conductuales se

utilizaron crías macho y hembra de edad P90 de una segunda tanda experimental ad hoc

(Cuadro 2).

107
Materiales y Métodos

Período de EMCE

Período de administración de
BUSPIRONA 4,5 mg/kg/d via sc (E13-E20)

6 sem anas 21 días 90 días

Pregestacional Gestacional Postnatal

P5 P 21 P 35 P 60 P 90

Inicio del P reñez P arto E studios


tratam iento (E 0) (P 0) Fijaciones conductuales

C uadro 2. C rono gram a del tratam iento del protocolo de E P E con prevención d el daño p or la adm inistración d e buspirona.

III.2.3.3. Exposición al etanol durante la adolescencia con abstinencia posterior:

Se utilizaron 20 ratas macho de edades comprendidas entre P45 y P50 (adolescencia

tardía) que pesaban 194,1 ± 28,11 g (201,3 ± 23,4 g las asignadas al grupo Control, n = 10,

con un rango de 167,0-235,0 g y 186,9 ± 32,05 g las asignadas al grupo EtOH, n = 10, con

un rango de 146,0-230,0 g). Las diferencias de peso no eran estadísticamente significativas

(P = 0,2662).

Durante 6 semanas (42 días) los machos bebieron agua o la solución de EtOH.

Inmediatamente tras la finalización del período de exposición al EtOH, 5 machos del grupo

Control y otros 5 del grupo EtOH fueron fijados y sus cerebros procesados para realizar

los estudios de microscopía óptica (ICQ con distintos marcadores) en tanto que a los otros

5 machos de ambos grupos se los forzó a pasar por un período de recuperación de 10

semanas (70 días; Cuadro 3). Durante este período de recuperación los machos de ambos

grupos (Control/R y EtOH/R) continuaron bebiendo solamente agua con la finalidad de

108
Materiales y Métodos

estudiar si la abstinencia prolongada al EtOH, tras un consumo también prolongado,

permite la recuperación o no del daño provocado por la intoxicación leve y crónica. Una

vez finalizada la recuperación, los cerebros de los machos recuperados (ya adultos) de

ambos grupos fueron procesados de igual manera que sus homólogos a los que no se les

permitió pasar por la abstinencia tras la intoxicación.

6 sem anas con agua


Control
Fijación
6 sem anas con EtO H 6,6%
EtOH

6 sem anas con agua 10 sem anas con agua


Control/R

6 sem anas con EtO H 6,6% 10 sem anas con agua


EtOH/R

Período de exposición Período de recuperación

C uad ro 3. C ronogram a de tratam ien to del p rotoco lo de e xp osición al etanol duran te la adolesce ncia con ab stinen cia p osterior.

III.2.3.4. Exposición al etanol durante la adultez:

Para este protocolo experimental se utilizaron 10 ratas macho adultas con pesos

comprendidos entre 250-300 g. Al grupo Control se asignaron 5 animales y otros tantos

al grupo EtOH. Como es habitual, el grupo Control bebió agua y el grupo EtOH bebió la

solución de EtOH durante 6 semanas, al cabo de las cuales sus cerebros fueron procesados

para realizar los estudios de microscopía óptica correspondientes (ICQ con distintos

marcadores).

109
Materiales y Métodos

III.2.4. Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia:

En los cuatro protocolos experimentales llevados a cabo, diariamente se evaluó el grado

de intoxicación de las ratas expuestas, macho y hembra (preñadas o no), adultas o crías, por

medio de dos escalas conductuales (Nixon y Crews, 2004; Slawecki, 2002). Las

puntuaciones obtenidas se correlacionaron con los niveles de alcoholemia medidos en

machos, hembras y crías de los distintos protocolos.

La escala de Slawecki (modificada a partir de Freund, 1969) consta de los siguientes parámetros
conductuales y su correspondiente puntuación:
- sin efectos conductuales visibles: 0
- notablemente calmo, con hipotonía durante la manipulación: 1
- ataxia leve con marcha rápida: 2
- compromiso de la marcha, el animal cae hacia un lado: 3
- gran hipotonía, inmóvil en el suelo: 4
La escala de Nixon y Crews (tomada a su vez de Penland et al., 2001) que permite evaluar grados mayores
de intoxicación, consta de los siguientes parámetros conductuales y su correspondiente puntuación:
- normal: 0
- hipoactivo: 1
- ataxia: 2
- ataxia + arrastre del abdomen por el piso y/o lentificación del reflejo de enderezamiento: 3
- pérdida del reflejo de enderezamiento: 4
- pérdida del reflejo corneal: 5

En los protocolos en los que se suprimió bruscamente la administración de EtOH se

evaluaron los signos de abstinencia aguda por medio de una escala de abstinencia tomada

de Penland et al. (2001) quienes a su vez la modificaron a partir de Majchrowicz (1975).

Esta escala consta de los siguientes signos conductuales y su correspondiente puntuación:


- neutralidad: 0
- hiperactividad general: 1,0
- temblor de la cola: 1,4
- espasticidad de la cola: 1,6
- temblor de la región caudal: 2,0
- miembros abiertos y extendidos hacia fuera: 2,4
- temblor generalizado: 2,6
- temblor cefálico: 3,0

110
Materiales y Métodos

- episodios de carrera inducida: 3,2


- sacudidas de secado (wet shakes): 3,4
- castañeteo de dientes: 3,6
- convulsiones espontáneas: 3,8
- muerte: 4,0

III.2.5. Determinación de la alcoholemia:

En cada uno de los cuatro protocolos experimentales se midieron los niveles de

alcoholemia alcanzados por los animales durante la exposición al EtOH. Se realizaron

mediciones:

i) en las hembras expuestas durante la gestación (sangre tomada de la vena de la cola


o del tronco, obtenida por decapitación previa anestesia con dióxido de carbono),
ii) en las crías al momento de nacer (sangre del tronco, obtenida por decapitación
previa anestesia con dióxido de carbono), y
iii) en los machos adolescentes y adultos expuestos al momento de la fijación (sangre
obtenida de la cavidad ventricular izquierda del corazón al momento de la
fijación).

A modo de control, también se tomaron muestras de sangre (aleatoriamente) de algunos

animales pertenecientes a los grupos Control.

Las muestras se tomaron en tubos heparinizados, tipo Eppendorf de 0,5 o de 2,0 ml. La

sangre se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos a 3000 rpm en una

microcentrífuga ECYS; se separó el plasma y se envió para la determinación bioquímica

a la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de

la Universidad de Buenos Aires.

111
Materiales y Métodos

La determinación de la alcoholemia se llevó a cabo por el método enzimático de la

NAD/NADH, cuya sensibilidad es $ 0,1 mg/dl (= 21,7 :M).

III.2.6. Estudios de microscopía:

III.2.6.1. Fijación de los animales y procesamiento de los cerebros:

En las edades correspondientes a lo ya detallado en cada protocolo experimental, se

anestesió profundamente a los animales con una inyección intraperitoneal de hidrato de

cloral en dosis de 300 mg/kg. Como parámetro de profundidad de la anestesia se tomó el

reflejo corneal.

Tras realizar una toracotomía, a cada animal se lo perfundió a través del ventrículo

izquierdo del corazón, inicialmente con 30-60 ml de una solución salina fría conteniendo

0,05% (p/v) de NaNO2 (nitrito de sodio; como vasodilatador) más 1% (v/v) de heparina

5000 UI/ml (como anticoagulante) y posteriormente con 300 ml de una solución fijadora

fría de 4% (p/v) de paraformaldehído y 0,25% (v/v) de glutaraldehído en solución

amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4. De cada animal se abrió el cráneo, se extrajó el

cerebro y se lo mantuvo sumergido en la misma solución fijadora fría durante otras 4 hs

(período de postfijación). Luego, se lavó cada cerebro tres veces en solución amortiguadora

de fosfato 0,1 M, pH 7,4 con sacarosa 5% (p/v) y se lo dejó en esta solución lavadora

durante 18 hs a 4ºC.

Los cortes de los cerebros (espesor de 40–50 :m) se realizaron con un vibrátomo Oxford

112
Materiales y Métodos

Vibratome Series 1000. Se realizaron cortes coronales del mesencéfalo y sagitales del

prosencéfalo. Hasta su utilización en los experimentos de ICQ, los cortes se almacenaron,

en crioviales de 2,0 ml, a –20ºC, crioprotegidos en una solución de sacarosa 25% (p/v)

disuelta en solución amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4.

III.2.6.2. Selección de los cortes de tejido. Áreas cerebrales evaluadas:

Los cortes a utilizar en los experimentos de ICQ se seleccionaron en placas de Petri, en

flotación libre en solución amortiguadora de fosfato 0,1 M, pH 7,4 con sacarosa 5% (p/v),

bajo control visual con una lupa estereoscópica Wild Heerbrugg M5.

Para seleccionar los cortes se tuvieron en cuenta

estructuras anatómicas correspondientes a las

planchas 91-101 (para los cortes coronales

mesencefálicos)4 y a las planchas 169-174 (para los

cortes sagitales prosencefálicos)5 del atlas del

cerebro de la rata, de Paxinos y Watson (2007).

En los cortes transversales de niveles

mesencefálicos se evaluaron los dos principales Figura 21. N úcleos serotoninérgicos del rafe en el
m esencéfalo d e la rata (fotocom p osición d e
im á g e n e s; in m u n o m a rcación para TP H ). S e
observan los núcleo s dorsal (N D R ), m ed ial (N M R ) y
núcleos serotoninérgico del rafe del grupo cefálico, ventral (N V R ). S e evaluaron los dos prim eros. A S : el
acueducto de S ilvio.

es decir, aquellos que inervan el prosencéfalo. Estos

4
Bregma: -6,96 a -8,16 mm; interaural: 2,04-0,84 mm.
5
Lateral: 1,90-3,20 mm.

113
Materiales y Métodos

núcleos son (Fig.21):6

i) el núcleo dorsal del rafe (NDR) y

ii) el núcleo medial del rafe (NMR).

En los cortes parasagitales prosencefálicos se evaluaron (Fig. 22):

i) el stratum radiatum del área CA1 de la formación del hipocampo (CA1 Hipp),

b) el cuerpo estriado o caudado-putamen (Strt), y

c) la corteza frontal (CxF).

F igu ra 22. Á reas estudiadas en los cortes p arasagitales d el p rosencéfalo. C xF: corteza frontal; Strt: cuerp o
estriado; C A 1 H ipp: stratum radiatum del á rea C A 1 d el hip ocam p o.

III.2.6.3. Microscopía óptica:

6
La razón de estudiar estos núcleos se basa en las estructuras prosencefálicas inervadas por cada uno de ellos.
Cfr. ut supra, la sección I.5.1.2. (El sistema serotoninérgico) de la Introducción.

114
Materiales y Métodos

III.2.6.3.1. Coloración de Nissl:

Se seleccionaron cortes sagitales de cerebro para evaluar la citoarquitectura general de

las áreas prosencefálicas que habrían de ser estudiadas en los experimentos de ICQ, y

principalmente la de la CxF.

A los cortes seleccionados y montados sobre portaobjetos gelatinados se los coloreó con

una gota de una solución de azul de toluidina 0,1%, durante 20 a 30 segundos para obtener

una tinción suave. Inmediatamente se los lavó suavemente con agua destilada y, en caso de

que la coloración fuera demasiado oscura, se lo aclaró con alcohol 96º. Se los dejó desecar

al aire y se los cubrió con medio de montaje Permount y un cubreobjeto.

III.2.6.3.2. Inmunocitoquímica (ICQ):

En cada uno de los experimentos de ICQ realizados en cada protocolo experimental con

los cortes de cerebro de las ratas macho de distintas edades postnatales, el procedimiento

técnico fue el mismo que se detalla a continuación.

Los cortes de cerebro de cada uno de los grupos experimentales se procesaron en

flotación libre, simultáneamente, en condiciones estandarizadas (para cada

inmunomarcador, al mismo momento, el mismo día).

Para inhibir la actividad de peroxidasa endógena, los cortes se deshidrataron

previamente pasándolos por concentraciones crecientes de soluciones de EtOH (50-100%),

se los trató con H2O2 al 0,5% (v/v) en metanol durante 30 minutos y se los rehidrató

115
Materiales y Métodos

pasándolos por soluciones de EtOH en concentraciones decrecientes. Luego se los lavó en

agua destilada y en una solución amortiguadora de fosfato salino 0,1 M, pH 7,4 (PBS). Se

incubaron los cortes durante 1 hora en una solución “bloqueadora” de suero normal de

cabra 3% (v/v) más Triton X-100 0,5% (v/v) en PBS para bloquear los sitios inmunógenos

de unión inespecíficos y para permeabilizar los tejidos. Tras dos lavados con PBS más

Triton X-100 0,025% (v/v) (PBS-X), se los incubó durante 48 hs a 4ºC con anticuerpos

primarios dirigidos contra los distinos marcadores a explorar en cada caso particular,

diluídos en las siguientes proporciones:

- TPH 1:1000 - S100B 1:500


- 5-HT 1:4000 - Nf-200 1:3000
- 5-HTT 1:1000 - MAP-2 1:700
- GFAP 1:3000 - nNOS 1:1000

Luego de la incubación por 48 hs con los anticuerpos primarios y tras 5 lavados en PBS-

X, los cortes se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente con los

correspondientes anticuerpos secundarios biotinilados (diluidos 1:100). Es decir, se utilizó

un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con biotina en los casos en los que el

marcador de interés era la 5-HT o la GFAP, y en los restantes casos (TPH, 5-HTT, S100B,

Nf-200, MAP-2 y nNOS) se utilizó un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado

con biotina.

Tras nuevos lavados en PBS-X, los cortes se incubaron otros 90 minutos con el

complejo de avidina-peroxidasa (1:200) y se lavaron nuevamente, 5 veces en PBS-X y 2

veces en una solución amortiguadora de acetato 0,1 M, pH 6,0. Tras ello, los cortes se

incubaron por 5 minutos a temperatura ambiente en tetraclorhidrato de 3,3’-

116
Materiales y Métodos

diaminobenzidina 0,035% (p/v) más sulfato amónico de níquel 2,5% (p/v) en solución

amortiguadora de acetato. Se llevó a cabo el revelado de la actividad de peroxidasa

agregando a la solución H2O2 0,1% (v/v). Siguiendo al paso de la reacción enzimática, los

cortes se lavaron 3 veces en la solución amortiguadora de acetato y una vez en agua

destilada.

Finalmente, se montaron los cortes en portaobjetos gelatinados, se los deshidrató por

desecación al aire7 y se los cubrió con cubreobjetos utilizando medio de montaje Permount

para su observación por microscopía de luz.

Todos los anticuerpos primarios y secundarios, al igual que el complejo de avidina-

peroxidasa, se disolvieron en PBS conteniendo suero normal de cabra 1% (v/v) y Triton X-

100 0.3% (v/v).

En cada experimento de ICQ, un grupo de cortes de cerebro se utilizó como control

positivo y negativo apropiado para el procedimiento de ICQ per se; por ejemplo, se

omitieron intencionalmente los anticuerpos primarios para descartar la existencia de

reacciones positivas falsas.

III.2.6.3.3. Análisis de imágenes digitales asistido por computadora. Morfometría:

Para maximizar las condiciones de objetividad, para cada grupo de experimentos de

ICQ, en los cuatro protocolos experimentales, todas las mediciones se realizaron en

portaobjetos codificados, en condiciones ciegas. Las mediciones de los cortes de los

7
Raramente se observó retracción de los tejidos por la desecación al aire y cuando así sucedió, los cortes en
cuestión se descartaron.

117
Materiales y Métodos

distintos grupos experimentales se llevaron a cabo en condiciones estandarizadas (en la

misma sesión de medición, en el mismo día). En cada corte de tejido, se seleccionó el

campo microscópico a analizar morfométricamente dentro los límites de cada área

anatómica de interés.

Las imágenes del tejido se obtuvieron por medio de un microscopio óptico Zeiss

Axiophot equipado con una cámara de video conectada en línea con un analizador de

imágenes Zeiss-Kontron VIDAS. Las imágenes de video se transfirieron al analizador de

imágenes y se digitalizaron con un patrón de 512 × 512 píxeles (correspondientes a un área

de tejido de aproximadamente 140 × 140 :m para una magnificación primaria de 40×). A

cada píxel se le asignó una resolución de 256 niveles distintos de gris (8 bits). Tras una

normalización automática de la escala de grises se realizó una delineación interactiva de

las estructuras inmunomarcadas de interés y se procedió luego a la eliminación de las

imágenes inespecíficas. Las imágenes resultantes se midieron utilizando distintos

parámetros morfométricos, dependiendo en cada caso del marcador evaluado.

Así, la intensidad de la inmunorreactividad (-ir) citoplasmática a la TPH, a la 5-HT, a

la S100B y a la nNOS se evaluó por medio de un valor de densidad óptica relativa

(DOR). Según lo descripto en trabajos previos del laboratorio de la Dra. Brusco

(Tagliaferro et al., 1997; Ramos et al., 2000), los valores de DOR se obtuvieron tras la

transformación de cada valor medio de gris usando la siguiente fórmula: DOR = log

(256/gris medio). Para evaluar la DOR del citoplasma de cada célula individual,

independientemente del fondo local del tejido en que tal célula se hallaba, se obtuvo un

parámetro del fondo del tejido de cada corte (fuera de las estructuras inmunomarcadas) y

se lo sustrajo de cada valor de DOR celular antes de procesar estadísticamente los valores

118
Materiales y Métodos

obtenidos. Los valores de DOR se informan como unidades de DOR.

Para los astrocitos GFAP-ir, se evaluó el área celular. A este parámetro se lo midió

determinando en forma interactiva los límites de cada célula particular y teniendo en cuenta

que toda la imagen de cada célula estuviera dentro de los límites del campo que se

evaluaba.

Para evaluar las fibras 5-HTT-ir, Nf-200-ir y MAP-2-ir se relacionó el área total de las

fibras inmunomarcadas en cada campo con el área total del campo microscópico

correspondiente (19.332,35 :m2; 40× de magnificación primaria), lo que se tradujo en un

parámetro de área relativa de tejido (Ramos et al., 2000).

III.2.6.4. Microscopía electrónica:

Para realizar observaciones por microscopía electrónica se seleccionaron algunos cortes

sagitales de los cerebros de las crías P5 y P21 del protocolo de exposición prenatal al EtOH

sin prevención del daño. A los cortes seleccionados se los transfirió a una solución

amortiguadora de fosfato 0,1 M pH 7,4. Luego se los postfijó durante 30 minutos con

tetróxido de osmio 1% en la misma solución amortiguadora de fosfato; se los deshidrató

por pasajes en soluciones de etanol de concentraciones crecientes; se contrastó el tejido con

acetato de uranilo 5% y se los incluyó en Durcupan. De los tacos con el tejido incluído se

ralizaron cortes ultrafinos con un ultramicrótomo Reichert-Jung Ultracut E. A tales cortes

se los tiñó con citrato de plomo según el método estándar de Reynolds (Reynolds, 1967).

Finalmente, los cortes, una vez montados en grillas de cobre, se observaron en un

119
Materiales y Métodos

microscopio electrónico Zeiss 109 perteneciente al Laboratorio Nacional de Análisis y

Servicios (LANAIS-MIE) dependiente del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas

y Técnicas (CONICET) y ubicado en dependencias del Instituto de Biología Celular y

Neurociencias “Prof. Eduardo De Robertis”.8

III.2.7. Estudios conductuales:

Para los estudios conductuales se utilizaron animales de una segunda tanda de animales

críados ad hoc del protocolo de EPE con prevención del daño por administración de

buspirona. A la edad de P90 se expuso a las crías macho a un ambiente novedoso

constituido por un campo abierto, de forma cuadrada, de 50 cm de lado y cerrado por

paredes de 39 cm de alto. Tanto las paredes como el piso eran de madera enchapada negra,

y el piso estaba dividido en 9 cuadrados

por líneas blancas (Fig. 23). Las sesiones

se realizaron en un ambiente bien y

homogéneamente iluminado y silencioso.

Sin sesiones de entrenamiento previas,

para evitar la habituación, a cada uno de

los animales se lo situó suavemente en uno

de los cuadrados de los vértices del campo


Fig ura 23. D isp ositivo d e la prueb a cond uctual d e cam p o ab ierto.

8
En toda esta tarea de postfijación, inclusión, corte, montaje y observación conté con la muy experta e
inestimable colaboración de la Sra. Emérita Jorge Vilela de Banchieri (nuestra muy querida Meri) técnica del
CONICET experta en microscopía electrónica. ¡Gracias, Meri!

120
Materiales y Métodos

abierto, con la cabeza mirando inicialmente hacia el ángulo formado por la convergencia

de las dos paredes adyacentes. A partir del momento mismo en que se los dejó libres en el

campo, y por 5 minutos, se contabilizó el número de veces que cada animal cruzaba el

límite de un cuadro a otro (parámetro: número de cruces) como medida de actividad

locomotora) y el tiempo total que se detenía y permanecía en el cuadro central (parámetro:

tiempo en el cuadro central) como medida del estado de ansiedad. Así, se evaluó y comparó

el comportamiento de todas las crías macho de los cuatro gupos experimentales (CS, CB,

ES y EB) con la finalidad de estudiar si el tipo de tratamiento prenatal producía efectos

duraderos en dos importantes parámetros conductuales.

III.3. Análisis estadístico de los datos:

En cada protocolo experimental, por cada inmunomarcador utilizado en los estudios de

microscopía óptica, se realizaron 4-6 experimentos de ICQ. Los experimentos individuales

estuvieron compuestos por 6-10 cortes de tejido cerebral de cada animal de cada grupo

experimental. Se midieron 5-10 campos de cada área cerebral en cada corte de cada animal.

Las diferencias entre los animales, en cada uno de los grupos experimentales, tanto

como las diferencias entre los experimentos, no fueron estadísticamente significativas.

Tanto para los experimentos de ICQ (estudios de morfometría) como para los estudios

conductuales, los valores que se informan corresponden a la media ± DS (desvío estándar).

Las diferencias entre las medias de los grupos experimentales en cada protocolo se

analizaron estadísticamente por medio de las siguientes pruebas estadísticas, según

121
Materiales y Métodos

correspondiera en cada caso particular: i) test t de Student de dos colas, ii) análisis de la

varianza de una vía (ANOVA) seguido por un test de comparaciones múltiples de Student-

Newman-Keuls o de un test de Dunnett (comparación de los grupos experimentales contra

el grupo control), según correspondiera.

El nivel de significancia estadística se estableció, en todos los casos, para un valor de

P < 0,05.

Para el análisis estadístico de los datos se utilizaron los progamas de computadora

GraphPad Instat v2.05a y GraphPad Prism v3.00 (GraphPad Software Inc.).

A los fines de simplificar la presentación gráfica y el poder de comparación, los valores

de los grupos experimentales se presentan como procentajes de sus respectivos grupos

Control (valor control = 100%) en la mayoría de los casos. En todos los gráficos de barras,

las barras representan el valor de la media ± ES (error estándar de la media).

122
Resultados
“Miserables son aquéllos a quienes mueve a obrar el resultado de sus actos.”
Krishna, 8 vo avatar de Vishnú (en el “Bhagavad-Gita”)

IV.1. Protocolo de exposición prenatal al etanol sin prevención del daño:

IV.1.1. Resultados generales del tratamiento:

IV.1.1.1. Consumo de alimento:

Durante los períodos pregestacional y gestacional de exposición al EtOH, las hembras

de ambos grupos recibieron, cada día, una cantidad distinta de alimento. Las hembras del

grupo Control consumieron, cada día, una cantidad de alimento calóricamente equivalente

al consumido en alimento y EtOH, el día previo, por las hembras del grupo EtOH.

Como es lógico suponer, las hembras del grupo Control comieron cada día, durante el

período pregestacional, significativamente más alimento (por kg de peso corporal) que las

hembras del grupo EtOH (73,71 ±17,26 versus 60,56 ±12,39 g/kg/d; P < 0,0001; Fig. 24;

Anexo VI, Tabla 1). Lo mismo sucedió considerado desde el punto de vista de cada hembra

individual: las del grupo Control comieron significativamente más alimento cada día que

las del grupo EtOH (18,14 ± 4,18 versus 13,92 ± 2,63 g/animal/d; P < 0,0001). Durante este

período del tratamiento, el consumo de alimento de las hembras EtOH representó (en

promedio) un 82,15% del consumo de las hembras Control. Es decir, recibieron 17,85%

menos alimento.

Durante el período de tratamiento gestacional, las hembras del grupo Control comieron

124
Resultados

64,28 ± 6,0 g/kg/d ó 19,59 ± 2,36 g/animal/d, en tanto que las hembras EtOH consumieron

59,9 ± 6,31 g/kg/d ó 16,48 ± 2,08 g/animal/d. En ambos casos, las diferencias son

estadísticamente significativas (P = 0,023 y < 0,0001, respectivamente; Fig. 24; Anexo VI,

Tabla 1). En términos de consumo de calorías derivadas del alimento por unidad de peso,

durante la gestación, las hembras EtOH ingirieron sólo 6,82% menos que las Control, ya

que ingieron un 93,15% de las calorías ingeridas por las hembras Control.

Figura 24. C onsum o de alim ento por parte de las hem bras durante los período s de tratam iento pregestacional y gestacional del
pro to co lo de EP Esin prevención del daño (en g/k g/d y k C al/k g/d ). Los núm eros en la p arte sup erior d entro d e las b arras d el g rup o
E tO H indica n el porcentaje de lo co nsu m ido en relación al grupo C ontrol (ba se 10 0). * P < 0,05. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent
de do s co las.

IV.1.1.2. Consumo de bebida:

Las hembras del grupo EtOH bebieron

significativamente menos líquido que las

del grupo Control durante el período

pregestacional tanto si se lo considera Figura 25. C onsu m o de beb ida por parte de las hem bras d uran te
los períodos pregestacional y gestacional del protocolo de E P E
sin p reve n c ió n del dañ o (en m l/kg/d). Los n úm ero s en la p arte
desde el punto de vista de los animales superior dentro d e las barras del grupo E tO H corresponden al
po rcen taje d e lo c o n su m ido en relación al grup o C on trol (ba se
10 0). N S : no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.

125
Resultados

individuales como si se lo hace desde el consumo por unidad de peso corporal (35,99 ±

9,21 versus 24,51 ± 4,77 ml/animal/d, ó 146,9 ± 42,08 versus 106,3 ± 21,56 ml/kg/d; P <

0,0001 en ambos casos; Fig. 25; Anexo VI, Tabla 1). Así, las hembras EtOH bebieron

aproximadamente un 27,64% menos de líquido (por unidad de peso corporal) que las

hembras del grupo Control. A pesar de ello, no se observaron signos físicos ni conductuales

de deshidratación.

Durante el período gestacional, en cambio, las hembras EtOH bebieron

comparativamente más líquido que durante el período anterior, tanto si se lo considera por

animal individual como por unidad de peso corporal. De este modo su nivel de consumo

de líquido se acercó al de las hembras Control (38,55 ± 8,02 versus 32,7 ± 4,77

ml/animal/d, P = 0,0053; ó 126,3 ± 22,67 versus 118,3 ± 10,37 ml/kg/d, P = 0,1398).

Durante la gestación, las hembras EtOH bebieron así sólo 6,34% menos líquido que las

Control. Entre ambos grupos, el consumo de líquido por unidad de peso (ml/kg/d) no fue

estadísticamente diferente durante toda la preñez (Fig. 25 y 26; Anexo VI, Tabla 1).

Figura 26. E vo lución del co nsu m o de b eb ida p or las hem bras d e los grupos C ontrol y E tO H duran te los p eríod os d e tratam ien to
pregestacional y gestacional en el protocolo de E P E sin prevención del daño. Los m om entos im portantes del tratam iento están
señ alad os p or flech as.

126
Resultados

IV.1.1.3. Consumo de etanol:

En los estudios de alcoholización experimental como el presente es muy importante

establecer la cantidad de EtOH que se le ofrece, consumen y/o administra a los animales

de laboratorio.

Durante el período de tratamiento pregestacional las hembras del grupo EtOH

consumieron, en el agua de bebida, una media de 5,474 ± 1,11 g/kg/d (rango: 3,805-8,065).

El EtOH consumido les aportó unas 39,3 ± 7,96 kCal/kg/d (rango: 27,32-57,90) (Fig. 27).

Durante la preñez, paralelamente al incremento del consumo de líquido, aumentó el

consumo de EtOH. Así, las hembras preñadas del grupo EtOH consumieron 6,092 ± 0,534

g/kg/d de EtOH (rango: 5,323-7,126). La amplitud del consumo, como se aprecia, fue

menor pero con un promedio sostenidamente mayor al correspondiente de la etapa

pregestacional (Fig. 27; Anexo VI, Tabla 1). Para las hembras EtOH el consumo de bebida,

y con ella de EtOH, fue 11,29% mayor durante la gestación que en el período previo. En

cambio, las hembras Control bebieron 14,02% menos de agua durante la gestación que

durante el período previo.

Figura 27. C onsum o de etanol de las hem bras del grupo E tO H durante los período s de tratam iento pregestacional y gestacional
d el protocolo de E P E sin prevención d el daño (en g/kg/d y kCal/kg/d). Los valores en la parte superior dentro de las barras
co rresp ondien tes al períod o de tratam ien to gestacional indican el porcenta je d e variación co n resp ec to al tratam ien to
preg estacional (ba se 10 0). N S : no sign ifica tivo . * P < 0,05. Test t de S tuden t de d os colas.

127
Resultados

Por último, hemos de recordar que el agua de bebida consumida por las hembras EtOH

también les aportó calorías que serán tenidas en cuenta en el apartado siguiente al momento

de hacer el cálculo del ingreso calórico total.

IV.1.1.4. Ingreso calórico total:

En la etapa experimental pregestacional

las hembras Control y las EtOH recibieron

una media de 184,3 ± 43,14 versus 151,4 ±

30,98 kCal/kg/d (P < 0,0001; Fig. 28 y 29;

Anexo VI, Tabla 1) derivadas del alimento.

A estas calorías se le sumaron, en el grupo


Fig ura 28. C onsum o calórico total d e las hem b ras d e los g rup os
EtOH, las derivadas del EtOH consumido C ontrol y E tO H duran te lo s p e río d o s de tratam ien to
pregestacional y gestacion al de l protoc olo de E P E sin p reven ción
del daño (en kC al/kg/d). E n las barras del grupo E tO H se indica
con el agua de bebida. Dado que estas en la zona grisada el porcentaje propo rcion al de calorías
derivadas del etanol. N S . no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t d e
Studen t de d os colas.

fueron 39,3 ± 7,967 kCal/kg/d, sumadas a

las derivadas del alimento, el ingreso calórico total para las hembras EtOH fue, en este

período experimental, de 190,7 ± 35,74 kCal/kg/d. Esta diferencia no fue estadísticamente

significativa con respecto a las calorías ingresadas por las Control (P = 0,4559). Es decir,

la alimentación de ambos grupos fue definitivamente apareada desde el punto de vista

calórico. El EtOH ingerido representó para las hembras que lo recibieron el 20,61% del

valor calórico total diario.

Si consideramos a cada una de las hembras individualmente, hemos visto que las 4

128
Resultados

hembras Control recibieron un total de 45,33 ± 10,45 kCal/d cada una, todas derivadas del

alimento consumido, en tanto que las 6 hembras del grupo EtOH consumieron 34,8 ± 6,59

kCal/d cada una. Estas calorías, sumadas a las 9,058 ± 1,764 kCal/d derivadas del EtOH

de la bebida, totalizaron 43,86 ± 7,56 kCal/d. Nuevamente, la diferencia de calorías

ingeridas por las hembras de ambos grupos no fue estadísticamente significativa (P =

0,4569; Anexo IV, Tabla 1).

Durante la gestación las hembras Control y EtOH ingirieron una cantidad de calorías

derivadas del alimento que fue significativamente diferente (160,7 ± 15,01 versus 149,7 ±

15,79 kCal/kg/d; P = 0,0226; Fig. 28; Anexo VI, Tabla 1). Cuando, para el grupo EtOH,

se consideran también las calorías derivadas del EtOH del agua de bebida (43,74 ± 3,83

kCal/kg/d) se aprecia que, sumadas a las calorías ingeridas a partir del alimento, finalmente,

las hembras EtOH ingirieron significativamente más calorías que las hembras Control

(160,7 ± 15,01 versus 193,5 ± 18,74 kCal/kg/d; P < 0,0001; Fig. 28; Anexo VI, Tabla 1).

El EtOH ingerido durante la gestación representó para las hembras que lo recibieron el

F igu ra 29 . E v olución del consum o de calorías totales (d erivadas d el alim ento y d el etanol) p ara las hem b ras d e los g rup os C ontrol
y E tO H du ra nte los períodos de tratam iento pregestacional y g estacional d el p rotocolo d e EP E sin p revención d el d año.

129
Resultados

22,6% del VCT diario. Así, las hembras EtOH ingirieron 20,41% más de calorías por kg

de peso corporal, por día, que las del grupo Control. Esas calorías extra ingeridas por las

hembras EtOH provinieron casi enteramente del EtOH consumido, ya que las derivadas del

alimento fueron prácticamente iguales (Fig. 26).

IV.1.1.5. Evolución ponderal de las hembras:

La ganancia de peso de las madres durante los períodos de tratamiento pregestacional,

gestacional y postnatal fue equivalente para los dos grupos de tratamiento.

Al finalizar el período pregestacional de exposición al EtOH 6,6% en el agua de bebida

(es decir, tras 43 días de “aclimatación metabólica” al consumo de EtOH) el peso de las

hembras Control era 276,5 ± 18,8 g (rango: 249,5-289,0 g) y el de las hembras EtOH,

245,67 ± 25,5 (rango: 225,5-285,5 g). Las diferencias de peso fueron, estadísticamente, no

significativas (P = 0,0742). Sin embargo, la ganancia de peso de las hembras expuestas al

EtOH mostró una leve tendencia a ser menor que la de las Control (Fig.30 y 31 -curva-;

Anexo VI, Tabla 1). Así, la ganancia de peso entre el inicio y la finalización de esas 6

semanas fue significativa para las hembras Control (P = 0,0064), que aumentaron un 22,5%

sobre el peso inicial, pero no lo fue para las del grupo EtOH (P = 0,0824; Fig. 30), que

aumentaron sólo un 12% por sobre el peso inicial.

Transcurrido el período de apareamiento, el día E0 (inicio de la gestación), las hembras

de ambos grupos, Control y EtOH, pesaron una media de 273,9 ± 17,1 y 245,7 ± 26,2 g,

respectivamente. Durante la gestación el aumento de peso fue armónico y comparable para

130
Resultados

ambos grupos (Fig. 31). Al finalizar la gestación (E21) pesaban 376,8 ± 25,1 y 351,4 ±39,4

g, respectivamente, una diferencia estadísticamente no significativa (P = 0,2906). Durante

la preñez, entonces, las hembras de los grupos Control y EtOH aumentaron 37,5% y 43,0%

de su peso corporal inicial, respectivamente (Fig. 30 y 31; Anexo VI, Tabla 1).

Tras el parto, durante el período de lactancia, mientras las madres Control mantuvieron

su peso aproximadamente invariante, las del grupo EtOH fueron incrementandolo

lentamente hasta reducir la diferencia de pesos a 9 g hacia el final de la lactancia cuando

sus crías tenían 18 días de vida postnatal (Control: 290,4 ± 30,8 g; EtOH: 281,4 ± 24,4 g;

P = 0,6191; Fig. 30 y 31).

F igu ra 30 . P eso de las hem bras en los distintos m om entos d el tratam iento, en el p rotocolo d e EP E sin p revención d el d año. Los
núm e ro s p o r so b re las líneas de punto s horizonta les en las barras correspondiente s a los m om ento s pregesta cional final y
gesta cio n al final indican el porcentaje de aum ento d e p eso d esd e el m om ento anterior, tom and o a este com o b ase 100. N S: no
significativo. **: P < 0,01. Test t de S tuden t de d os colas.

131
F igu ra 31 . E volución del peso de las hem bras durante los p eríod os d e tratam iento p regestacional, g estacional y p ostp arto en el p ro to co lo d e E P E s in p re ve nc ió n d el d añ o .
Resultados

IV.1.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer y su

evolución ponderal hasta P21:

Como fuera dicho en el apartado III.2.2. de los Materiales y Métodos (Metodología

general del tratamiento de los animales), inmediatamente después de finalizado el período

de exposición al EtOH todas las hembras fueron alojadas en grupos de 3- 4 por jaula, con

un macho, para el apareo. En un plazo de 1-10 días todas las hembras fueron preñadas.1

La duración de la gestación no varió entre las hembras del grupo Control y las del grupo

EtOH. Esa duración fue de 22 días para todas las hembras de ambos grupos de

tratamiento.

El tamaño de las camadas que parieron las hembras Control y EtOH y la relación

machos/hembra fue estadísticamente equivalente para ambos grupos y también lo fueron

los pesos de las crías al nacer y su ganancia de peso hasta el día P21.

El peso al nacer de las crías Control (n = 46) fue de 5,9 ± 0,37 g y el de las crías EtOH

(n = 79) fue de 5,8 ± 0,5 g (P = 0,312; Fig. 32).

El tamaño de las camadas fue de 11,5 ± 4,43 crías para las hembras Control y 13,17 ±

2,92 crías para las hembras EtOH (P = 0,4884; Fig. 32). No se obsevaron diferencias

significativas.

La relación machos/hembra fue de 1,15/1,0 para las crías Control y de 1,02/1,0 para las

del grupo EtOH.

Cualitativamente, no se observó ningún caso de malformación congénita (microcefalias

1
Excepto una del grupo EtOH que demoró 27 días (esta última hembra no se diferenció en nada,
posteriormente, de las restantes en cuanto a ganancia de peso, número de crías paridas, relación
machos/hembra o peso al nacer de las mismas).

133
Resultados

incluídas).

La evolución del peso de estas crías fue en todo paralela para ambos grupos de

tratamiento y el proceso de crecimiento y desarrollo en todo normal (aparición del pelo

corporal, apertura del conducto auditivo externo, apertura palpebral, comienzo de la

reptación y de la marcha, etc.). El peso de las crías a la edad de P21 fue de 39,48 ± 4,31 g

para las crías Control y de 40,96 ± 6,64 g para las EtOH (P = 0,3411), una diferencia

estadísticamente no significativa (Fig. 32 y 33).

Figura 32. P eso de las crías al nacer, cantidad de crías por cam ada y peso de las crías en edad P 21 nacidas de las hem bras del
protoco lo d e E P E sin p reve nción d el dañ o. N S : n o significa tivo . Test t de S tuden t de d os colas.

IV.1.1.7. Alcoholemias en madres y crías:

Evaluadas por medio de dos escalas conductuales de intoxicación2, las hembras EtOH

no mostraron signos de intoxicación (ni sus crías cuando, por su edad, pudieron ser

evaluadas) en ningún momento de los períodos de tratamiento pregestacional, gestacional

y postparto. En todos los casos puntuaron con valor cero en ambas escalas. Tampoco

mostraron signos de abstinencia aguda las hembras al día P21 (momento del destete y de

2
La escala de Slawecki (2002) (modificada a partir de Freund [1969]) y la de Nixon y Crews (2004). Véase
el punto III.4. (Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en Materiales y Métodos, ut supra.

134
Resultados

la fijación de las crías) cuando se las evaluó con una escala conductual ad hoc.3 Las crías

no pudieron ser evaluadas para abstinencia porque al día del destete inmediateamente se

las anestesió y fijó para extraer sus cerebros.

Tanto en las madres a lo largo de la gestación como en las crías al momento del parto,

la alcoholemia medida para el grupo EtOH fue de 19,0 ± 4,87 mg/dl (rango: 15-25 mg/dl

= 3,25-5,42 mM). Como era previsible, en los animales Control no se hallaron niveles de

alcoholemia detectables.

Figura 33. E volución postn ata l del peso de las crías m acho, nacidas de m adres C ontrol y E tO H , desde P 0 a P 21, en el pro to colo
de E P E sin p reven ción de l da ño . N ótese el pa ralelism o e n e l ascen so d el pe so d e am bo s grup os.

3
La escala de Penland et al. (2001) modificada a partir de Majchrowicz (1975). Véase el punto III.4.
(Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en Materiales y Métodos, ut supra.

135
Resultados

IV.1.2. Observación de los cortes de los cerebros de crías P21 teñidos con la

coloración de Nissl:

Se observaron sistemáticamente los cortes de cerebro de los animales de edad P21 del

grupo Control y EtOH teñidos con azul de toluidina. No pudieron constatarse variaciones

del tamaño o grosor de las distintas áreas prosencefálicas estudiadas ni, en general,

alteraciones citoarquitectónicas. Tampoco se observaron neuronas de localización

aberrante, ni alteraciones de la laminación ni del grosor cortical.

No obstante ello, en algunos animales (pero no en todos) de distintas camadas (es decir,

no hermanos entre sí), sí se observaron alteraciones estructurales en ciertas neuronas

piramidales, específica y únicamente, en la CxF. Más aún, estas alteraciones sólo se

observaron en la corteza frontal orbitaria lateral (LO -lateral orbital- correspondiente a la

plancha 170 del atlas de Paxinos [Paxinos y Watson, 2007]; Fig. 34A,B), histológicamente

correspondiente al área 10 de Brodmann, según la clásica caracterización citoarquitectónica

que hiciera Wendell Krieg de la CC de la rata (Krieg, 1946a, 1946b).

En esta área cortical, las neuronas piramidales anormales se ubicaban unas debajo de las

otras respetando estrictamente la organización columnar neocortical típica. En sentido

paralelo a la superficie pial, en cada corte observado, la región de células anormales

abarcaba una extensión máxima de unas 15-20 columnas y mínima de 3-5, afectando toda

la región la forma bidimensional de un trapezoide angosto y elongado, de base mayor

orientada hacia la pía y base menor orientada hacia la sustancia blanca subyacente. En

sentido perpendicular a la pía, estas pirámides anormales se disponían entre las capas II

(granular externa) y V (piramidal interna), respetando la capas I (molecular) y la mayor

136
Figura 34. C oloración de N issl. La figura m u estra el aspecto de la citoarquitectura de la C xF de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin pre ve nc ión del daño, según se la observó con la coloración d e N issl. La p lancha 170 (A ) d el atlas d el cerebro d e la rata de
P axinos y W atson (2007) correspondiente a la zona de la C xF en la que se observaron las m a yores alteraciones m o rfológicas. E n
B se o bserva el po lo fron tal y la zo na trap ezo ida l recu ad rad a en rojo co rres p o n d e a la fo to m ostrad a en C . E n e sta últim a se
m u estra n, som breadas en rojo, las zonas m ostrada s a m ayor aum ento en C 1-5 y F. D escrip ciones adicionales véanse en el texto.
B arras de escala = 675 :m en B ; 250 :m en C ; 50 :m en C 1 (válida para C 1-5,D -I).

137
Resultados

parte de la VI (capa de células fusiformes) (Fig. 34B,C). Cuando se la hallaba, esta región

anormal estaba presente en 3-5 cortes contiguos (150-250 :m, aproximadamente) y a

medida que se pasaba de un corte al otro de la serie, la extensión lateral de la zona afectada

se iba reduciendo en cantidad de columnas afectadas. De ello es posible inferir que la

región afectada ha de haber presentado in vivo la forma tridimensional aproximada de un

cono truncado de base orientada superficialmente y vértice dirigido hacia la profundidad

de la sustancia gris cortical. Es decir, lo más llamativo de estas células, desde el punto de

vista espacial, era su confinamiento a una zona determinada que podría describirse como

un compartimiento o agrupamiento de neuronas anormales, individualmente orientadas

correctamente dentro de la columna (salvo muy escasas excepciones en las que alguna

célula parece haber estado “desorientada” en su eje con respecto a las vecinas normalmente

situadas; véase la neurona marcada por la doble flecha negra en la Fig. 34C4).

Observadas a mayor aumento, lo que resaltaba en estas neuronas era el incremento

llamativo de la tinción citoplasmática. Neuronas piramidales claramente hipercromáticas

en las que se hubo perdido la separación habitual entre los grumos de la sustancia de Nissl.

La hipercromasia era siempre llamativa si bien que la forma del citoplasma podía variar

a lo largo de un espectro en el que las neuronas presentaban desde una forma casi normal

(Fig. 34E) hasta aquellas en las que el citoplasma estaba tan retraído que no representaba

más que la escasa y oscura envoltura de un núcleo también anormal (Fig. 34H,I). Entre

estos dos tipos polares se hallaban los estadíos intermedios (Fig. 34F-H). En muchas de

estas pirámides podían observarse ondulaciones de la superficie citoplasmática (Fig.

34G,H). A causa de la retracción del citoplasma muchas de estas células adquirían un

aspecto “espiculado” (Fig. 34C1,C2,C4) en el que las espículas se correspondían con la

138
Resultados

emergencia de axón y dendritas. Globalmente considerado, el citoplasma tendía a adquirir

un aspecto adelgazado, avejentado, o rugoso, haciendo recordar a veces (para ser gráficos)

al perfil de las pasas de uva.

En cuanto a las prolongaciones de estas neuronas piramidales, era característica (aunque

no constante) la presencia de dendritas apicales de inicio y trayecto tortuoso o zigzagueante

(flechas negras en la Fig. 34C1-4,D) como así también, en ocasiones, de la porción inicial

del axón (flechas blancas en la Fig. 34C1-3).Estas ondulaciones mostraban, al cambiar de

dirección, un ángulo habitualmente obtuso pero, rara vez, lo eran de ángulo muy agudo (ver

la dendrita señalada por la flecha negra del medio en la Fig. 34C1).

En cuanto al núcleo de estas neuronas (contrastando con la forma circular normal,

cromatina laxa y nucléolo evidente) su forma acompañaba en general al grado de afectación

de la forma y tinción del citoplasma. Así, se encontraron núcleos con forma desde casi

normal (pero siempre al menos algo angostado; Fig. 34E) hasta aquellos muy estrechados

en sentido laterolateral y de formas netamente anormales, con indentaciones superficiales

que seguían el perfil también ondulado del citoplasma que los rodeaba (Fig. 34C1-3,E-I).

Estas alteraciones de la morfología nuclear fueron visibles ya con el poder de resolución

del microscopio óptico. Sin embargo, y a pesar de estar los núcleos y los citoplasmas tan

alterados, fue llamativo constatar que la cromatina nuclear era siempre laxa y sin signos de

picnosis. Aún más llamativo: el núcleolo se encontró presente en forma casi constante,

incluso en las células más anormales (Fig. 34H,I).

Otro hallazgo, por cierto muy llamativo para cerebros de ratas de edad P21, fue el de una

célula bipolar (marcada con un asterisco amarillo en la Fig. 34C5) de citoplasma

hipercromático y núcleo central de cromatina laxa, nucléolo evidente y una clara

139
Resultados

escotadura, que se hallaba orientada perpendicularmente con respecto a la piamadre. El

citoplasma presentaba una prolongación apical y otra basal de menor longitud

perfectamente alineadas (marcadas con sendas flechas amarillas en la Fig. 34C5) como si

se hallaran adheridas (prolongaciones y citoplasma) a alguna fibra. Este aspecto

morfológico, en conjunto, recuerda al de un Nb postmitótico migratorio aún en proceso de

migración a lo largo de la fibra apical de una cGR.

Por último, que las neuronas anormales se dispusieran en columnas dentro de un área

circunscripta, no significa que todas las columnas de esa región estuvieran integradas por

neuronas anormales. De hecho, sólo algunas de las 15-20 columnas de la región anormal

mostraban pirámides afectadas y así, al lado de una columna de neuronas anormales se

encontraban una o más columnas con neuronas en todo normales. Tampoco es cierto que

todas las neuronas dispuestas en una misma columna afectada fueran anormales. De este

modo, en una misma columna podían hallarse una, dos y hasta tres o más neuronas

anormales contiguas seguidas más arriba o abajo por células completamente normales. Sin

embargo, cuando se observaba a las columnas a bajo aumento (Fig. 34C) eran fácilmente

identificables las anormales y las normales. A este respecto, han de tenerse presentes las

limitaciones de la microscopía óptica, de la inespecificidad de la tinción utilizada y del

grosor (50 :m) de los cortes utilizados (que no permite decidir con certeza si dos neuronas

visualmente alineadas corresponden a la misma columna o a columnas contiguas ubicadas

a distinta profundidad dentro del corte).

140
Resultados

IV.1.3. Experimentos de inmunocitoquímica en P21:

IV.1.3.1. Triptófano hidroxilasa (TPH):

La enzima TPH, primera enzima (y limitante) de la vía biosintética de la 5-HT, se evaluó

por ICQ en las neuronas del NDR y del NMR en cortes transversales de niveles

mesencefálicos por medio de los valores de DOR. En ambos núcleos se observaron

neuronas de soma típicamente estrellado, multipolares, con imágenes negativas del núcleo

celular (en donde no se halla marcación para esta enzima).

En el NDR de las crías de edad P21 sometidas a EPE, los valores de DOR de las

neuronas TPH-ir fueron casi 5 veces mayores que las de las crías Control (Figs. 35A,B; Fig.

36; Anexo VII, Tabla 1).

En las neuronas del NMR el valor de la DOR fue 4 veces mayor que en el de las Control

(Figs. 35C,D; Fig. 36; Anexo VII, Tabla 1).

En ambos núcleos, el citoplasma de las neuronas se observó mucho más intensamente

teñido en los animales del grupo EtOH y el trayecto de las principales prolongaciones

citoplasmáticas se pudo observar por mayor longitud y con mayor claridad que en las

neuronas de los animales del grupo Control (Figs. 35B y D). En muchas neuronas de las

crías EtOH, en el NMR, algunas prolongaciones citoplasmáticas tenían un trayecto sinuoso,

zigzagueante (Fig. 35D) y se observaron incluso, contra el fondo del tejido, perfiles aislados

de prolongaciones que se podrían describir como “segmentos en sacacorcho”.

No se detectaron diferencias en el número de neuronas TPH-ir en los NDR y NMR de

las crías EtOH con respecto a los de las crías Control.

141
Figura 35. N eu ron as TP H -ir en el N D R (A ,B ) y en el N M R (C ,D ) de las crías P 21 del protocolo de E P E sin prevención del daño. E n
la fila superior, anim ales Co ntrol. E n la fila inferior, anim ales E tO H . V éase la descripción en el texto. Las flechas en B y D señalan
prolong aciones celulares en sacacorcho. B arra de escala en A = 50 :m (válida p ara A -D ).

Figura 36. D en sida d ó ptica relativa de las neu ron as TP H -ir de


los núcleo s do rsal y m edial del rafe m esencefálico en las
crías de edad P 21 d el p ro tocolo de E P E sin prevención d el
dañ o. ** P < 0,01. *** P < 0 ,00 01 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.

142
Resultados

IV.1.3.2. Serotonina (5-HT):

No se observó ningún cambio significativo en los valores de la DOR en las neuronas del

NDR (Figs. 37A,B; Fig. 38; Anexo VII, Tabla 1). El aspecto de estas neuronas estrelladas

multipolares era similar en los cortes de las crías pertenecientes a ambos grupos. En este

Figura 37. N eu ron as 5-H T-ir en el N D R (A ,B ) y en el N M R (C ,D ) de las crías P 21 del protocolo de E P E sin prevención del daño. E n
la fila superior, anim ales Co ntrol. E n la fila inferior, anim ales E tO H . V éase la d escripción en el texto. B arra d e escala en A = 20 :m
(válida p ara A -D ).

143
Resultados

núcleo, a pesar de no haberse detectado variaciones en la DOR del citoplasma, se

observaron algunas neuronas aisladas con prolongaciones sinuosas (no mostradas).

En las neuronas 5-HT-ir del NMR de las crías EtOH, el valor de la DOR aumentó casi

1,3 veces con respecto al valor de los

Controles ( Figs. 37C,D; Fig. 38; Anexo

VII, Tabla 1).

Nuevamente, no se detectaron

diferencias estadísticamente significativas

en el número de neuronas 5-HT-ir en los


Fig ura 38. D ensid ad óp tica relativa d e las neuronas 5-H T -ir d e los
NDR y NMR de las crías EtOH con núcleos dorsal y m e dial del rafe m e sencefálico en las crías d e
edad P 21 del protoco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. *** P <
0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.

respecto a los de las crías Control.

IV.1.3.3. Transportador de serotonina (5-HTT):

En las tres áreas prosencefálicas estudiadas, la expresión del 5-HTT-ir se observó como

delgadas fibras arrosariadas con una ramificación densa y muy intrincada. La medición

semicuantitativa permitió evaluar la densidad de las fibras por unidad de área de tejido

cerebral y se expresa como área relativa de fibras 5-HTT-ir.

En el stratum radiatum del CA1 Hipp de las crías EtOH se observó un incremento

significativo del área relativa ocupada por estas fibras que fue 1,5 veces mayor que en las

crías Control (Figs. 39A,B; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).4

Figura 39 (en la próxim a página). Fibras 5-H TT-ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin prevención del daño. La fila superior corresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferio r a los anim ales E tO H . V éase la
descripción en el texto. B arras de escala = 20 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).

144
145
Resultados

En el Strt, las fibras 5-HTT-ir se

observaron en la matriz estriatal,

respetando los estriosomas. El análisis de

las imágenes se focalizó en la matriz

estriatal en la que se

ncuentra normalmente una densa

inervación serotoninérgica. En el Strt de Figura 40. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras
5-H TT-ir en áreas prosencefálicas de las crías de edad P 21 en el
pro toco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. * P < 0,05. *** P <
las crías EtOH hubo un aumento 0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.

significativo del área relativa de las fibras que alcanzó a ser 1,3 veces mayor que en el Strt

de las Control (Figs. 39C,D; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).

En la CxF de los animales EtOH también se observó un aumento significativo del área

relativa ocupada por las fibras 5-HTT-ir que alcanzó un valor 1,5 veces mayor que el de los

Controles (Figs. 39E,F; Fig. 40; Anexo VII, Tabla 1).

No se observaron variaciones morfológicas en las fibras 5-HTT-ir, en ninguna de las tres

áreas prosencefálicas, de las crías EtOH con respecto a las de las crías Control.

IV.1.3.4. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):5

En el CA1 Hipp de las crías P21 sometidas a EPE los astrocitos presentaron un cuerpo

celular agrandado, con prolongaciones citoplasmáticas más alargadas y de trayecto más

tortuoso en comparación con los de los animales Control. En estos últimos animales las

Figura 41 (en la p róxim a p ág ina ). A stroc itos G FA P -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e las crías P21 del p rotocolo d e
E P E sin prevención del daño. La fila superio r corresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferio r a los anim ales E tO H . V éase la
descripción en el texto. B arras de escala = 100 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).

146
147
Resultados

prolongaciones de estas células se

observaron siguiendo un trayecto

aproximadamente paralelo al de las

dendritas de las células del estrato

piramidal que transcurren por este estrato.

En cambio, en los animales EtOH las


F ig ura 42. Á rea celu lar d e lo s astro cito s G F A P -ir en áre a s
prosencefálicas de las crías de edad P 21 en el protocolo de E P E
prolongaciones de los astrocitos mostraron sin p reve nción del dañ o. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
co las.

un perfil mucho más aracnoideo, no tan

organizado y cubriendo una mayor superficie de tejido. El análisis morfométrico mostró

que el área celular astrocitaria aumentó significativamente en los animales EtOH, aumento

que alcanzó 2,5 veces el valor de los Controles (Figs. 41A,B; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1).

En el Strt de las crías EtOH se observó un pequeño aumento, no significativo, del área

celular de los astrocitos (Figs. 41C,D; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1). No se observaron

variaciones morfológicas.

En la CxF, como en el CA1 Hipp, los astrocitos de los animales sometidos a EPE se

observaron hipertróficos, con un aumento significativo de su área celular cuando se los

comparó con los de los Control. El área celular fue 1,7 veces mayor en los animales EtOH

(Figs. 41E,F; Fig. 42; Anexo VII, Tabla 1).

IV.1.3.5. Proteína S100B (S100B):

Tanto en los animales Control como en los EtOH se observó la S100B-ir de ubicación

148
Resultados

intracitoplasmática en los astrocitos de cada área prosencefálica analizada. La

inmunotinción para la S100B marcó el cuerpo celular y algunas de las principales

prolongaciones y, como era de esperar para un marcador citoplasmático, mostró imágenes

negativas del núcleo celular.

En el stratum radiatum del CA1 Hipp de los animales sometidos a EPE hubo un

aumento significativo del valor de la DOR del citoplasma astrocitario que alcanzó 1,2 veces

el valor del de los animales Control (Figs. 43A,B; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).

En el Strt de las crías EtOH también se observó un aumento significativo de la DOR, de

1,4 veces con respecto al valor de los Control (Figs. 43C,D; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).

También se observó un aumento significativo, nuevamente de 1,2 veces sobre el valor

Control, en la CxF de los animales EtOH ( Figs. 43E,F; Fig. 44; Anexo VII, Tabla 1).

Con la utilización de este marcador citoplasmático astrocitario no se observaron mayores

variaciones morfológicas en los animales EtOH con respecto a los Control en ninguna de

las áreas. Solamente, se pudo observar un aumento de la longitud durante el cual se pudo

seguir visualmente el trayecto de las principales prolongaciones citoplasmáticas (véase, por

ejemplo, la Fig. 43B y F).6

Figura 43 (en la próxim a p ág ina). A stroc itos S -100B -ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) d e las crías P 21 del pro to colo
de E P E sin p reven ción de l da ño . La fila supe rior correspon de a los an im ales C on trol y la fila inferior a los an im ales E tO H . E n B se
o bse rva un vaso sanguíneo (v) al que llega una prolong ación d e un astrocito q ue term ina en p ie chup ad or. V éase la descrip ción
am pliada en el texto. B arras de escala = 20 :m en A (válida para A -D ) y 50 :m en E (válida p ara E ,F).

149
150
Resultados

Figura 44. D ensidad óp tica relativa de los astrocitos S 10 0B -ir en


áreas prosencefálicas d e las crías d e edad P21 en el p rotoc ol o d e
E P E sin p reve nción del dañ o. ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t d e
S tuden t de d os colas.

IV.1.3.6. Neurofilamentos de 200kDa (Nf-200):

En el CA1 Hipp se observó una importante alteración del patrón de expresión de los Nf-

200 dado que el área relativa de tejido cubierta por estos aumentó 1,27 veces su valor en

los animales sometidos a EPE con respecto al valor de los animales Control (Figs. 45A,B;

Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1). En unos y otros animales se observó la inmunomarcación

predominante de las dendritas de las neuronas piramidales del Hipp que discurren por el

stratum radiatum, como así también la de algunos somas aislados en el stratum piramydale.

En el Strt de los animales EtOH también aumentó significativamente el área relativa de

los Nf-200-ir. Este aumento nuevamente alcanzó un valor 1,27 veces mayor que el de los

animales Control (Figs. 45C,D; Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1).7

En la CxF, semicuantitativamente, no se observó ningún cambio en la expresión de los

Figura 45 (en la p róxim a p ág ina). Fibras N f-200-ir en el H ipp (A ,B ), el S trt (C ,D ) y la C xF (E ,F) de las crías P 21 del protocolo de E P E
sin pre ve nc ión del daño. La fila superior corresp on d e a los anim ales C ontrol y la fila inferior a los anim ales EtO H . En F
(fotocom posición d e dos cam pos distintos), en la m itad izquierda se observa un vaso sanguíneo (vs) alrededor del cual se dispone,
c on to rn eá nd olo parcialm ente, la dendrita apical de una neurona p iram id al. V éase la descrip ción am p liada en el texto. B arras d e
escala = 100 :m en A (válida para A ,B ) y 50 :m en C (válida p ara C -F).

151
152
Resultados

Nf-200-ir de las ratas sometidas a EPE. Hubo un cambio muy pequeño, no significativo,

del área relativa en los animales EtOH que alcanzó sólo a 1,05 veces el valor de los

animales Control (Figs. 45E,F; Fig. 46; Anexo VII, Tabla 1).

En las tres áreas estudiadas (incluída la CxF en la que no se detectaron cambios

semicuantitativos), muchas fibras Nf-200-ir mostraron importantes alteraciones

morfológicas consistentes, principalmente, en ondulaciones, zigzagueos de su trayecto que,

teniendo en cuenta que el grosor de los cortes fue de 50 :m y que probablemente incluyera

el grosor total de las prolongaciones, podría ser descripto como una estructura (símil-

sacacorcho(, nombre con el que otros autores han descripto previamente esta imagen

(“corkscrew-like”; cf. Onizuka et al., 1996 y Muramatsu et al., 1997). Esta alteración

morfológica cualitativa se observó tanto en las dendritas de las células piramidales del Hipp

(no mostrado), como en los axones que transcurren por los estriosomas en el Strt y en las

dendritas apicales de la neuronas piramidales de la CxF (Fig. 45D y 45F). No todos los

animales ni todas las neuronas o fibras presentaron esta alteración y, cuando estaba

presente, la ondulación no era siempre, ni en todas las fibras, igualmente cerrada o angulada

en su zigzagueo. En el Strt, el zigzagueo se

pudo observar tanto en los axones que

discurren por los estriosomas como, con

mayor dificultad y por menor longitud, en

las prolongaciones presentes en la matriz

estriatal (correspondían en este caso tanto

a axones como a dendritas de las células

propias del Strt). En la CxF, por ejemplo, Figura 46. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras
N f-20 0-ir en áreas prosencefálicas de crías de edad P 21 en el
protoco lo de E P E sin p reve nción del dañ o. * P < 0,05. *** P <
0,00 01 . Test t de S tuden t de d os colas.

153
Resultados

esta alteración morfológica tampoco estuvo presente en toda su extensión sino que pareció

estar presente en “parches” o en “islotes”; es decir, había zonas que la presentaban y otras

que no, de igual modo que otras regiones corticales no evaluadas en este estudio (como la

Cx parietal y la occipital). Las neuronas estrelladas de la CxF parecen haber estado, en

general, menos afectadas que las piramidales, pero lo estuvieron. Cuando estaban afectadas,

las neuronas estrelladas mostraban un zigzagueo corto pero notorio, de escasa longitud de

sus prolongaciones (predominantemente dendritas). De las neuronas piramidales, parecen

haber sido más afectadas las de más largas dendritas apicales y grandes somas de la capa

V (piramidal interna).

IV.1.3.7. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS):

Lamentablemente, en el CA1 Hipp no se pudo observar una cantidad adecuada de

neuronas nNOS-ir que pudiera ser confiablemente evaluada, por lo que no se muestran

datos ni imágenes acerca de esta región.

En el Strt de las crías EtOH se observó un aumento significativo de la DOR del

citoplasma de las neuronas nNOS-ir que fue 2,77 veces mayor con respecto al valor de la

DOR de los animales Control (Figs. 47A,B; Fig. 48; Anexo VII, Tabla 1).

De manera similar, en la CxF de los animales sometidos a EPE hubo un incremento

significativo en el valor de la DOR que alcanzó 2,47 veces el de los animales Control (Figs.

47C,D; Fig. 48; Anexo VII, Tabla 1).

En ambas áreas de los animales EtOH, las neuronas nNOS-ir presentaron largas

154
Resultados

Fig. 47. N eu ron as nN O S -ir en el S trt (A ,B ) y en la C xF (C ,D ) de las crías P 21 del pro to colo de E P E sin prevención del daño. La fila
su perio r c orresponde a los anim ales C ontrol y la fila inferior a los a ni m ales EtO H . B es una fotocom p osición d e d os cam p os
distintos. B arra de escala en A = 20 :m (válida p ara A -D ).

prolongaciones citoplasmáticas. Más aún, las prolongaciones que se observaron en el fondo

del tejido pudieron haber pertenecido a otras neuronas cuyos somas estaban en otros cortes

de tejido, distintos al de aquellos en los que se evaluó morfométricamente su DOR

citoplasmática. Los núcleos celulares mostraron una tinción negativa en los animales

Control (la nNOS una enzima de localización citoplasmática), pero en los animales EtOH

el aumento de la DOR fue tal que, en algunos casos, el núcleo quedó total o parcialmente

155
Resultados

oscurecido por la inmunotinción

(recuérdese que el grosor de los cortes de

tejido fue de 50 :m, en los que fácilmente

se puede incluir la totalidad o la mayor

parte del volumen del soma de una

neurona).
Figura 48. D ensidad óptic a relativa de las neuro nas nN O S -ir
en áreas prose n cefálicas de las crías de edad P 21 en el
Para un resúmen de los resultados protoco lo de E P E sin preve nción del dañ o. *** P < 0,0001.
Test t de S tuden t de d os colas.

obtenidos en las crías de edad P21

sometidas a EPE, véase el la Tabla 8, y la Tabla 1, Anexo VII.

Tabla 8. Resumen de los resultados morfométricos de los experimentos de ICQ


realizados en cortes de cerebros de ratas de edad P21 sometidos a EPE sin prevención
del daño.

M arcador M ESENCÉFALO

NDR NM R

TPH
8 8
5-HT
z 8

PROS ENCÉFALO

CA1 H ipp Strt CxF

5-HTT
8 8 8
GFAP
8 z 8
S100B
8 8 8
Nf-200
8 8 z
nNOS n/d *
8 8
* n/d: no detectado.

156
Resultados

IV.1.4. Microscopía electrónica de transmisión del cerebro de las crías en P5 y P21:

Por microscopía electrónica de transmisión (MET) se estudiaron el Strt y la CxF de

crías recién nacidas (P5) y a la edad de P21, la misma edad en que se realizaron los estudios

de ICQ en este protocolo experimental.

En el Strt (Fig. 49)8de las crías EtOH se encontraron algunas alteraciones

ultraestructurales. No se observaron alteraciones en los astrocitos, oligodendrocitos ni en

la mayoría de los vasos sanguíneos, aunque en ocasiones sí se observó escaso edema

perivascular. Los axones mielinizados de los estriosomas, tanto en cortes longitudinales

como transversales, mostraban aspecto normal en algunas zonas, pero en otras se eran

claramente anormales. Así, se vieron, por ejemplo, axones seccionados longitudinalmente

que seguían una trayecto claramente sinuoso en el plano de corte, tanto como en planos

transversales, (según se puede deducir de la variación de la sección transversal en el plano

de corte); ello indicando que el axón se desplazaba ligeramente hacia arriba o abajo del

plano observado, curvándose. Se observaron axones curvados repetidamente en uno y otro

sentido lo que, muy plausiblemente, se corresponda con las imágenes “en sacacorcho”

observadas en los axones de los estriosomas vistos en los experimentos de ICQ con

inmunomarcación para Nf-200 (Cfr. Fig. 49 de MET y Fig. 45D de ICQ). El neuropilo en

Figura 49 (en la p róxim a p ág ina). Fotom icrografías de m icroscop ía electrónica d e transm isión en el S trt de las crías P5 y P21 del
pro to co lo de EP E sin prevención del daño.
S e o bse rva n m itocond rias m orfológicam ente anorm ales en A -C (m itocond ria acod ad a en A ; una larg a m itocond ria, en el interior
de una dend rita, con form a groseram ente sem ejante a un signo de interrogación –?– en cuya cavidad parecen disponerse otras
dos pequeñas m itocond rias; m itocond ria co n una expansión bulbosa en C ; en D , en el interior de una dend rita, se observan tres
larg as m itoco ndrias, una d e las cu ales – la de la izquierd a – parec e b ifurcarse junto co n la d en drita q ue la contien e).
E n E se observa un axón de trayecto sinuoso – cam b ia de dirección, alternad am ente, al m enos 4 veces en un corto tram o – q ue
en tres o ca sion es – en am bos extrem os y e n la zona m ed ia d e la im ag en – d ism inuye su secc ión de co rte, indica ndo claram en te
que se aleja del plano del corte que se m uestra. Las m itocond rias tienden a ubicarse en la perifieria. E n F-H se m uestran im ágenes
de un axón norm al (F ) y dos segm ento s contig uos del axón m ostrado en E (la orienta ción no se ha respeta do en H sino que se lo
dispuso de m odo tal que su puediera apreciar aproxim adam ente en paralelo los filam entos del citoesqueleto en las tres im ágenes
qu e se m u e stra n in ve rtida s, en ne ga tivo p ara perm itir ob servarlo c on m ás clarida d). E l citoesq ue leto en el axó n n orm al (F) se
a pre cia m á s ordenado que en G y H en los que, por ejem p lo en G , se ob servan zonas en p arches en las q ue falta el citoesq ueleto.
S e o bse rva ron neuronas con núcleos de conto rn os claram ente irregulares, con pro fundas escota duras (I), lobulados (J ) y m ulti-
indenta dos (K ) e n los que, sin em barg o, se aprecian los nucléolos (K ) rodeados por u na cro m atin a laxa de aspecto norm al.
M ag nifica ciones prim arias: 4400 × (I); 50 00 × (E ); 70 00 × (B ,D ,J,K ); 20 00 0× (A ,C ); 31 50 0× (F,G ,H ).

157
158
Resultados

general, y las sinapsis en particular, no mostraron alteraciones ultraestructuralmente

apreciables.

En la CxF (Fig. 50)9de las crías EtOH tampoco se encontraron alteraciones en los

astrocitos, en los oligodendrocitos. El compartimiento vascular estaba mayormente

inalterado (Fig. 50K) si bien que, en ocasiones se observó (igual que en el Strt) esacaso

edema perivascular. Sin embargo, al lado de neuronas piramidales de aspecto en todo

normal (Fig. 50K) se encontraron, a pocos micrómetros de distancia, otras neuronas,

también piramidales, de aspecto “adelgazado”, de citoplasma poco abundante retraído sobre

el núcleo, y con escaso edema perineuronal (Fig. 50L) que se corresponderían con las

imágenes de las neuronas piramidales anormales previamente observadas y descriptas en

la CxF, en los cortes de vibrátomo teñidos con azul de toluidina (cfr. ut supra Fig. 34). Se

observaron también alteraciones ultraestructurales en algunas prolongaciones neuronales

(no en todas), principalmente en las largas dendritas de las neuronas piramidales. En estas

se observó, por ejemplo, sinuosidad del recorrido dendrítico en el plano de corte,

compatible con un trayecto “en sacacorcho” que se corresponde con el hallado en los

Figura 50 (en la p róxim a p ág ina). Fotom icrografías de m icroscop ía electrónica d e transm isión en la C xF de las crías P5 y P21 del
pro to co lo de EP E sin prevención del daño.
S e o bse rva n m itocond rias de gran long itud (m egam itcondrias) y ubicación preferentem ente periférica dentro de las dendritas
ap ica les de n eu ronas piram idales (flec has neg ras, en A ), algunas d e las cu ales se ac odan y cam bian de dirección den tro y fuera
de l plano de co rte (flech a inferior en A ; C ). E n B se observan do s gruesas de nd ritas (d); la de la d erecha recibe un a sina psis (s)
so bre un a e spina dendrítica (*); en la dendrita de la izq uierd a se ob serva una m egam itocond ria d e ub icación p eriférica. En D , un
gru po de , a l m enos, 8 m itocondrias ubicadas en el c itop lasm a q ue ocup a una g ran ind entación nuclear en una neurona; d os d e
e sa s m ito co ndrias, una de ellas en form a de clava o m aza (m ) p arecen estar d ivid iénd ose p or fisión b inaria. En E, d entro d e una
den drita, se o bservan dos m itoco ndrias, una de ellas de dirección ca m bian te (prese nta 3 ac odad uras de an gulo obtuso ) y la o tra
c la ra m e nte bifurcada en Y; m ás arriba, otra m itocon d ria en form a de U ab ierta. En F, una m itocond ria larg a y sinuosa, acod ad a
en 3 oportunidades (u na de ellas saliendo del plano de corte). E n G se observa una larg a dendrita (d ) a p ic a l sinuosa, cuyo eje
c am bia de dirección en dos oportunidades; en su interior, una m itoco nd ria (m ) b ifurcad a en Y d e b razos cerrados, uno de los
c ua le s (e l izquierdo) parece salir del plano del corte ap enas orig inad o d el tronco com ún.
Lo s n ú cle os de m uchas d e las neuronas presentaron (igual que en el S trt) indentaciones m últiples (H ) o ún icas y profund as (J)
m ie ntra s o tras neuronas m ostraron núcleos con escotaduras d ob les enfrentadas q ue p rácticam ente lo b ilob ulaban d ejand o un
puente de nucleoplasm a relativam ente delgado entre las dos m asas nucleares m ayores. E n H : g, aparato de G olgi; reg: retíc ulo
en doplasm ático gran ular.
E n K y L s e observan dos neuronas piram idales. La neurona d e la izq uierd a (K ) es una célula de ap ariencia en tod o norm al, con
abund ante citoplasm a en el que se observa toda la variedad norm al de organelas, la em ergencia d e d endritas apical (da) y basal
(db), e l n ú cle o central, elipsoidal, con la crom atina laxa y d os nucléolos visib les (nu). A su lado, un capilar norm al (vs). La neurona
de la d erecha (L) se ub icab a en cercan ías de la preced en te, en la m ism a g rilla estud iad a, y se observa ad elga zad a, co n e scaso
citoplasm a retraído sobre el núcleo, a u n q u e d e a p a riencia norm al en su interior, retraído del resto del tejido por edem a
perineuronal (pu ntas de flec ha blan ca ); el núcleo an gostado y con la cro m atina levelm en te m ás co nden sada que lo norm al pero
co n un nucléo lo claram en te prese nte (nu). Inm ed iatam en te a la izq uierd a de la neu rona afectad a se observa u na larga d en drita
en cu yo interior hay una m eg am itoco ndria (m ).
M ag nifica ciones prim arias: 3150 × (A ,K ,L); 44 00 × (H ,I,J); 50 00× (G ); 20 00 0× (B -F).

159
160
Resultados

experimentos de ICQ realizados con anticuerpos anti-Nf-200 (Cfr. Fig. 50 de MET y Fig.

45D,F de ICQ). Estas dendritas sinuosas muchas veces contenían largas mitocondrias en

su interior, de aspecto también sinuoso, acompañando su recorrido; más aún, muchas de

esas mitocondrias sinuosas (contenidas en dendritas sinuosas) presentaban, además,

aberraciones morfológicas. En otras ocasiones se encontraron, en el interior de largas

dendritas apicales, mitocondrias de gran longitud y ubicación inusualmente periférica. Se

han observado mitocondrias bifurcadas en Y, ampliamente acodadas; bifurcadas en Y y,

a la vez, de ramas de trayecto sinuoso; mitocondrias dismórficas en forma de clava o maza

contenidas en el citoplasma que llenaba las indentaciones nucleares, etc. (Fig. 50). Igual

que en el Strt, en la CxF el neuropilo y las sinapsis no mostraron alteraciones

ultraestructurales.

IV.2. Protocolo de exposición prenatal al etanol con prevención del daño por

administración de buspirona:

IV.2.1. Resultados generales del tratamiento:

IV.2.1.1. Consumo de alimento:

Las hembras de los cuatro grupos experimentales del presente protocolo: control-salina

(CS), control-buspirona (CB), etanol-salina (ES) y etanol-buspirona (EB), fueron sometidas

a un período de “aclimatación metabólica” de 6 semanas de duración durante el cual su

161
Resultados

aumento de peso, consumo de alimento y bebida e ingreso calórico fue en todo similar.

Dado que en esta serie de experimentos las hembras se diferenciaron entre sí por su

pertenencia a distintos grupos recién a partir del ingreso al período gestacional, se presentan

los datos relevantes solamente para este período experimental.

Durante la gestación las hembras de los distintos grupos consumieron diariamente

cantidades equivalentes de alimento, medido en g/kg/d (Anexo VI, Tabla 2). Sólo el grupo

de hembras EB difirió significativamente de lo consumido por el grupo CS durante la

gestación (Fig. 51), pero estas hembras pesaron, desde el inicio, siempre menos que las

hembras de los otros grupos.

Figura 51. C onsum o de alim ento (en g/kg/d y kC al/kg/d) durante el período de tratam iento gestacional
de las hem bras de los cuatro grupos e xp erim entales d el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
ad m inistración de b usp irona. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + post-test de D unnett.

IV.2.1.2. Consumo de bebida:

El consumo diario de líquido durante toda la gestación fue equivalente en todos los

grupos experimentales (considerado en ml/kg). Ningún grupo difirió significativamente de

lo bebido por las hembras CS cuando a cada uno de ellos se lo comparó con este grupo

162
Resultados

(ANOVA seguido de posttest de Dunnett). Sin embargo, si se comparan todos los grupos

entre sí (ANOVA seguido por post-test de Student-Newman-Keuls), se observa que la

única diferencia significativa es la existente entre los grupos CB y ES (Fig. 52).

Considerado desde el punto de vista de la cantidad de líquido bebido diariamente por

cada animal individual (ver valores en la Tabla 2, Anexo VI), las únicas diferencias

significativas se hallaron entre lo consumido por las hembras CB con respecto a las que

recibieron EtOH, es decir, las de los grupos ES y EB, cuando se realizaron comparaciones

múltiples (ANOVA seguido por el test de Student-Newman-Keuls; Fig. 52). Sin embargo,

si a la cantidad media consumida por los individuos de cada grupo experimental se la

compara únicamente con la bebida por el grupo control (CS; es decir, ANOVA seguido por

el test de Dunnett) no se hallan diferencias significativas (gráficos no mostrados).

Figura 52. C onsum o de bebida (en m l/k g/d y m l/anim al/d ) p or p arte de las hem b ras d e cad a uno de los
cuatro grupos experim entales durante el p eríod o de tratam iento g estacional en el p rotocolo d e EP E con
preve nción del dañ o por la a dm inistración de b uspirona. * P < 0,05. A N O V A d e d os vías + p ost-test d e
S tuden t-N ew m an -K eu ls de co m pa racion es m últiples.

IV.2.1.3. Consumo de etanol:

El consumo de EtOH fue paralelo al del líquido. Durante la gestación las hembras del

163
Resultados

grupo ES consumieron una media de 5,85 ± 0,69 g/kg/d de EtOH, con un rango de 4,53-

7,11 g/kg/d. Las del grupo EB consumieron una media algo superior de 6,51 ± 0,71g/kg/d

(P = 0,0031) con un rango de 5,63-8,49 g/kg/d (Figs. 53 y 54; Anexo VI, Tabla 2). Las

hembras del grupo EB ingirieron 11,3% más de EtOH diariamente que las hembras ES.

Figura 53. C antidad de E tO H consum ido (en g/kg/d y kC al/kg/d) por las hem b ras de los grupos E S y E B
durante el período de tratam ien to gestacional en el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
ad m inistra c ió n d e b usp irona. Los n úm ero s en blan co por sobre la línea punteada e n la b arra
co rresp ondien te al grupo E B indica el porcentaje d e consum o co n resp ec to al del grupo E S (base 1 00 ).
** P < 0,01. Test t de S tuden t de d os colas.

Figura 54. E vo lución del co nsu m o de E tO H (en g/kg/d) de las hem bras de los grupos E S y E B duran te el período de tratam ien to
gestacional en el protocolo de E P E con prevención d el daño p or adm inistración d e buspirona.

164
Resultados

IV.2.1.4. Ingreso calórico total:

Si se consideran solamente las calorías

aportadas por el alimento, el grupo de

hembras EB es el único que difirió

significativamente del grupo CS en cuanto

a ingreso calórico diario durante la

gestación (Fig. 53 derecha; Anexo VI,

Tabla 2). Pero, el EtOH consumido les

aportó a los grupos que lo recibieron 41,36


Fig ura 55.C onsum o calórico total d iario d e las hem b ras d e los
grupos C S , C B , E S y E B duran te el períod o de tratam ien to
± 4,86 y 46,03 ± 5,01 kCal/kg/d para los g estacional d e l p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or
adm inistración d e buspirona. E n la parte superior de las barras
cor resp ondientes a los g rup os ES y EB , la zona g risada
corresp onde a l porcentaje d el V C T ap ortado por el E tO H . *** P <
grupos ES y EB, respectivamente. Así, las 0,0 0 01. A N O V A de do s vías + po st-test de S tuden t-N ew m an s-
K eu ls de co m pa racion es m últiples.

calorías aportadas por el EtOH

representaron 20,16% y 24,55%, respectivamente, del valor calórico total diario ingerido

por cada uno de los grupos crónicamente intoxicados.

Si se tiene en cuenta ahora la totalidad de las calorías ingresadas diariamente por las

hembras gestantes (provenientes del alimento y del EtOH) se observa que, comparadas con

el grupo CS, sólo las hembras de los grupos ES y EB ingresaron cantidades

significativamente mayores de calorías (ANOVA seguido por el testde Dunnett; gráfico no

mostrado). Si se comparan todos los grupos experimentales entre sí (Fig 57; ANOVA

seguido por el test de Student-Newman-Keuls), se observa que los subgrupos de animales

dentro de un mismo grupo (CS y CB por un lado, y ES y EB por otro) no difirieron entre

sí en su consumo calórico. Pero, al mismo tiempo, cada uno de los dos grupos que

165
Resultados

recibieron EtOH (ES y EB) ingirieron significativamente más calorías que cada uno de los

grupos que bebieron agua (CS y CB) independientemente de que hubieran o no recibido

buspirona entre los días E13-E20 (Figs. 55 y 56; Anexo VI, Tabla 2).

F igu ra 56 . Evolución del consum o calórico total (alim ento + b eb id a) d urante el tratam iento g estacional d e las hem b ras d e cad a
grupo experim etal en el protocolo de E P E con prevención d el daño por adm inistración d e buspirona.

IV.2.1.5. Evolución ponderal de las hembras:

A semejanza de lo ocurrido en el anterior protocolo experimental, la ganancia de peso

de las madres durante los períodos de tratamiento pregestacional y gestacional fue

equivalente para los cuatro grupos de tratamiento.

Como puede verse en las Figs. 57 y 58 y en el Anexo VI, Tabla 2 la evolución del peso

de las hembras de los cuatro grupos fue paralela y en todo comparable a lo largo de la

gestación, independientemente de que hubieran recibido o no EtOH y/o buspirona. Más

166
Resultados

aún, durante el período de administración de esta última droga (E13-E20), no se alteró en

nada la evolución del peso de las hembras que la recibieron (Fig. 52). Las hembras del

grupo EB, con respecto a las del grupo CS eran las de menor peso hacia el final de la

gestación, pero la diferencia de peso fue exactamente la misma que existía al inicio de la

misma (48 g). Las hembras de cada grupo aumentaron porcentajes similares de su peso

corporal durante la gestación (134-144% sobre el valor inicial) (Fig. 54).

A pesar de que las hembras de los grupos expuestos dejaron de recibir EtOH al momento

del parto (P0), se siguió su evolución ponderal durante toda la lactancia y, hacia el

momento del destete de sus crías (P21) tampoco se observaron diferencias significativas

en sus pesos, independientemente de que hubieran pertenecido a uno u otro grupo

experimental (Fig. 52).

Figura 57. Peso de las hem bras en distintos m om entos d el tratam iento, en el p rotocolo d e EP E con
preve nción del dañ o por ad m inistra c ió n de b usp irona. Los n úm ero s so bre las b arras al m om en to
gestacional final indican los porcentaje s d e aum ento d e p eso p or sob re aq uellos al inicio d e la gestación
(base 100). Independientem ente del g rup o de tratam iento a q ue p ertenecieran las hem b ras, los
porcentajes d e a um en to de p eso so n de la m ism a m ag nitud. Test t de S tuden t de d os colas.

167
Figura 58. E volución del peso de las hem b ras durante el período de tratam iento gestacional y durante el postparto, discrim inado por grupo de tratam iento (C S , C B , E S y E B ) en el protocolo de E P E
c on pre vención del daño por la adm inistración de b usp irona. Las flechas neg ras en la parte inferior d el g ráfico, en el p eríod o ge sta cio n al, in d ic an lo s d ía s (E 1 3 -E 2 0 ) e n lo s q u e se in ye ctó la bu sp iro n a
a dosis 4,5 m g/kg/d a las hem bras de los gru pos C B y E B o un volum en equivalente de solución salina a las de los gru pos C S y E S . La adm inistración de buspirona no m odificó la evolución de la ganancia
gesta cio nal de peso.
Resultados

IV.2.1.6. Número de crías, relación machos/hembra, peso de las crías al nacer y su

evolución ponderal hasta P88:

Igual que en el protocolo experimental anterior, la duración de la gestación de todas las

hembras fue de 22 días en los cuatro grupos experimentales.

El tamaño de las camadas que parieron las hembras y la relación machos/hembra fue

estadísticamente equivalente para los cuatro grupos y también lo fue el peso de las crías al

nacer y la ganancia de peso de esas crías hasta el día P88 (Figs. 59 y 60; Anexo VI, Tabla

2).

El peso de las crías al nacer fue estadísticamente equivalente para los cuatro grupos de

tratamiento tanto se lo considere en forma global (machos y hembras en conjunto) como

si se lo discrimina por sexo (Fig. 59; Anexo VI, Tabla 2). La relación de peso entre los

machos y las hembras dentro de una misma camada también fue equivalente para los cuatro

grupos (Anexo VI, Tabla 2).

F igu ra 59 . G ráficos relativos a las crías de las hem b ras d el p rotocolo d e EP E con p revención d el d año p or adm inistración d e
buspiro na. A N O V A + post-test d e D unnett. E n ninguno de los gráficos se observaro n diferencias significativas.

169
Resultados

El tamaño de las camadas tampoco difirió estadísticamente para los cuatro grupos y

estuvo dentro de los parámetros considerados como normales (Fig. 59; Anexo VI, Tabla

2).

La relación machos/hembra estuvo dentro de lo esperado como normal (ligeramente más

machos que hembras en cada camada) excepto para las crías de las hembras pertenecientes

al grupo ES en las que la relación se invirtió (Fig. 59; Anexo VI, Tabla 2).

No se observó ningún caso de malformación congénita (microcefalias incluídas). Su

crecimiento y desarrollo fue normal.

La evolución del peso de las crías de los cuatro grupos fue paralela desde el nacimiento

y hasta la edad de P88, último momento en que fueron evaluadas antes de la realización de

los estudios conductuales (Figs. 59 y 60). No se observaron diferencias estadísticas en el

peso de estas crías.

Figura 60. E volución d el peso postnatal de las crías m acho, discrim inadas por grupo de tratam iento, desde P0 hasta P 88,
en el protocolo de E P E con prevenvión d el daño p or adm inistración d e buspirona.

170
Resultados

IV.2.1.7. Alcoholemia en madres y crías:

Al igual que en el protocolo anterior, las hembras fueron evaluadas por medio de escalas

conductuales de intoxicación a lo largo de los períodos de tratamiento pregestacional y

gestacional. En ningún caso mostraron signos de intoxicación por EtOH.

A pesar de que, al momento del parto, se hubo realizado una suspensión brusca de la

administración de EtOH, en ninguna de las hembras que lo recibiera se pudieron observar

signos de abstinencia cuando fueron evaluadas por medio de las escala de abstinencia para

ratas de Penland et al. (2001) y para ratones de Ikeda et al. (1999).

Las alcoholemias medidas en hembras y crías fueron comparables a las obtenidas en el

protocolo experimental previo, es decir, bajas y en el orden de los 15-25 mg/dl (3,25-5,42

mM).

IV.2.2. Experimentos de inmunocitoquímica:

IV.2.2.1. Serotonina (5-HT):

A lo largo del desarrollo postnatal de las crías CS se observó que la DOR del citoplasma

de las neuronas 5-HT-ir en los NDR y NMR siguió un patrón similar de variación desde P5

y P21 hasta P90, con un claro pico de expresión hacia P35, de mayor magnitud y pendiente

de ascenso y descenso para el correspondiente al NMR. Luego del pico de P35 se observó,

en ambos núcleos, una disminución hacia P60 y un posterior nuevo aumento hacia P90

171
Resultados

(Fig. 61; Anexo VII, Tabla 2).

El perfil de la DOR en los animales

ES mostró un perfil similar al de los

animales CS entre P5 y P21 para el

NMR y entre P60 y P90 para ambos

núcleos; sin embargo, tanto en el NDR

como en el NMR, fue evidente la

ausencia del pico de expresión en P35

en los animales ES. Es decir, hacia P35

en ambos núcleos de los animales ES se

vió una curva aplanada de la DOR de

las neuronas 5-HT-ir con respecto a la

de los animales CS (Fig. 61). La adición

de buspirona al tratamiento de las

hembras que recibían EtOH (grupo EB)

hizo que la curva de la DOR de las

neuronas 5-HT-ir se modificara en sus


Figura 61. D ensidad óp tica relativa del citoplasm a de las neuronas 5-
H T-ir, a distin ta s edades, en los núcleos dorsal y m edial d e l rafe
crías con respecto a la del grupo ES. m e sencefálico (N D R y N M R ) en las crías postnatales som e tidas a E P E
con prevenció n d e l daño por adm inistración de buspirona. C S :
control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nol-
buspirona. E dad es evaluad as: para el N D R : P 21 , P 35 , P 60 y P 90 ; para
Así, para el NDR, en P35 y P60 los el N M R : P 5, P 21, P 35, P 60 y P 90. S e grafican los valores absolutos en
unida des de D O R . * P < 0,05. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + post-
test d e D unnett, p ara cada ed ad .
niveles de DOR en los animales EB no

se diferenciaron de los niveles del grupo CS, en tanto que hacia P90 cayeron por debajo del

nivel de CS y ES. En el NMR, por otro lado, la adición de buspirona al tratamiento de la

hembras EtOH (grupo EB) indujo que el perfil de la curva entre P5 y P90 fuera en todo

172
Resultados

similar a la de CS, incluyendo el pico de expresión en P35 (Fig. 61). Es llamativo que en

los animales EB, las curvas de la DOR, aunque se acercaron al perfil mostrado por las crías

CS y se alejaron a la vez de las del grupo ES, mostraron algunas desviaciones llamativas

de las curvas de los animales CS: por ejemplo, en el NDR, en P21 y en P90 los niveles

fueron mayor y menor, respectivamente, a los de los grupos CS y ES que, salvo por el pico

de P35, mostraron un perfil similar. En el NMR el nivel de la DOR en P5, si bien no fue

estadísticamente diferente a los de CS y ES, mostró una clara tendencia a ser mayor.

Por último, en los animales cuyas madres recibieron buspirona durante el embarazo a

la vez que bebían agua (grupo CB) se observaron varios hechos llamativos: i) en el NDR,

a la edad P21 y P60, los niveles de DOR no fueron diferentes a los de los animales CS, pero

en P35 fueron mucho mayores que en CS y mostraron un pico exacerbado (Figs. 61 y 62)

en tanto que hacia P90 su nivel, si bien no significativamente diferente al de los animales

CS, sí mostró una tendencia a la disminución, acercándose al nivel que mostraron las crías

EB, en vez de aumentar nuevamente desde P60 como lo hicieron las del grupo CS; ii) en

el NMR, los niveles de la DOR en las crías P5 fueron significativamente mayores que en

el grupo CS (a semejanza de los de las crías EB, aunque en estas no hubo diferencias

estadísticamente significativas), en tanto que en las otras edades (P21, P35, P60 y P90) sus

niveles fueron en todos iguales a los de los animales CS.

Figura 62. N eu ron as 5-H T-ir del N D R a la edad P 35 del protocolo de E P E con prevención d el daño p or adm inistración d e buspirona.
L o s gru po s d e tratam iento son CS (A ), C B (B ), ES (C ), y EB (D ). V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de escala en A
= 20 :m (válida p ara A -D ).

173
Resultados

IV.2.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):

En el CA1 Hipp de las crías de edades P5, P21, P35 y P60 se observó un aumento

consistente y sostenido del área celular de los astrocitos GFAP-ir incluso en la edad adulta

(P60). La curva del área celular de los astrocitos en esta área de los animales CS mostró un

pequeño pico coincidente con la edad P21 y una posterior disminución paulatina en P60

y P90 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2). En los animales ES, el área celular estuvo

significativamente aumentada, con respecto a CS, en todas las edades y el pico se localizó

en P35. Para los animales EB, es decir, aquellos a cuyas madres se les administró buspirona

juntamente con el EtOH en el agua de bebida, se observó que el área celular astrocitaria

disminuyó en todas las edades evaluadas y no difirió estadísticamente de los valores de los

animales CS en P5 y P21, aunque sí en P60 y P90. Por otro lado, el pico del área celular

astrocitaria, igual que en CS, volvió a observarse en P21 aunque posteriormente, en vez de

bajar, volvió a subir en P60 a partir de P35 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2). Por último,

en los animales CB, los niveles del área celular de los astrocitos en el CA1 Hipp no

variaron estadísticamente con respecto a los niveles observados en los animales CS pero

el perfil temporal fue diferente en tanto que el pico de aumento se observó en P35 con una

leve disminución posterior hacia P60 (Figs. 63 y 65; Anexo VII, Tabla 2).

En la CxF, se evaluó el área celular de los astrocitos en tres edades postnatales: P21, P35

y P60. La curva de los animales CS mostró un pequeño valle a la edad P35 con un fuerte

aumento posterior hacia P60 coincidente con el inicio de la adultez. En los animales ES los

174
Figura 63. A stroc itos G FA P-ir en el H ipp de las crías de ed ad es P 5, P 21 , P 35 y P 60 de los g rupos d e tratam ien to
C S , C B , E S y E B del pro to colo de E P E con prevención del daño por adm inistración de buspiro n a . V é ase la
explicación d etallada en el texto. E l recuadro en P 60 E B m uestra un astrocito con el citoesqueleto alterado de tal
m odo que una de sus prolong aciones exhibe un p erfil en sacacorcho. B arra de escala en P 5 C S = 50 :m (válida p ara
todas las edades y tratam ientos) y 20 :m en el recuadro.

175
Figura 64. A stroc itos G FA P -ir en la C xF de las crías de edades P 21, P 35 y P 60 d e los g rupo s de tratam iento C S , C B , E S y EB del
pro to co lo de EP E con prevención del daño por adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de
escala en P 21 C S = 50 :m (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).

176
Resultados

niveles del área celular de

los astrocitos estuvieron

aumentados fuerte y

significativamente

en P21 y en P35 y

disminuidos (con respecto a

CS) en P60, con la

particularidad de que el

perfil de la curva fue

inverso al observado en los

animales CS, es decir, en

P35 se observó un pico en Figura 65. Á rea celular de los astrocito s G FA P -ir en el stratum radiatum del área C A 1
de l hipoc am po (C A 1 H ipp) y en la co rteza fron tal (C xF), a d istintas ed ad es postna tales,
en las crías som etid as a EPE con p revención d e l d año p or adm inistración d e
lugar de un valle (Figs. 64 y buspiro n a . C S : control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nol-
buspirona. Ed ad es evaluad as: P5, P21, P35 y P60 en C A 1 H ip p y P21, P35 y P60 en C xF.
Se grafic an los valores absolutos d el área celular en :m 2. ** P < 0,01. A N O V A d e d os
vías + po st-test D unnett, p ara cada ed ad .
65; Anexo VII, Tabla 2).

En los animales EB se restituyó por completo el perfil normal del área astrocitaria

observado en las crías CS si bien que el nivel en P21 fue significativamente menor para este

grupo de tratamiento. Por último, en los animales del grupo CB se observó una curva de

perfil idéntico al observado en los animales del grupo CS aunque con una disminución

estadísticamente no significativa (Figs. 64 y 65; Anexo VII, Tabla 2).

Se observaron alteraciones morfológicas cualitativas similares a las vista en el protocolo

anterior, en las prolongaciones de algunos de los astrocitos GFAP-ir en los animales

sometidos a EPE independientemente de que hubieran o no recibido buspirona (ver, por

ejemplo, en la Fig. 63 el recuadro en el grupo EB edad P60).

177
Resultados

En el Strt no se evaluó el área celular de los astrocitos.

IV.2.2.3. Proteína S100B (S100B):

La expresión de la S-100B fue evaluada en el CA1 Hipp de las crías postnatales

sometidas a EPE con prevención del daño por administración de buspirona a las madres

gestantes concomitantemente con el consumo de EtOH en el agua de bebida.

Las curvas de los valores obtenidos de la DOR del citoplasma de los astrocitos S-100B-

ir mostraron un perfil en U amplia, a concavidad superior, similar para todos los grupos de

tratamiento y con valores mínimos en P35 para el grupo CS. Los valores del grupo ES

fueron superiores a los del CS en todas las edades; la administración concomitante de

buspirona al grupo de madres que bebieron EtOH (grupo EB) hizo que los valores de la

curva correspondiente se acercaran a los del grupo CS y no difirieran estadísticamente

excepto para la edad P60 en la que los niveles fueron mayores en EB que en CS, pero sin

llegar a ser tan altos como los de ES. Los valores correspondientes a las distintas edades

del grupo CB no difirieron de aquellos del grupo CS; en P60 se noto un aumento no

significativo por sobre los valores de CS que tendieron a acercarse a los valores del grupo

EB (Figs. 66 y 67; Anexo VII, Tabla 2). Se observaron nuevamente, a semejanza de lo

ocurrido en el protocolo experimental anterior, alteraciones morfológicas de los astrocitos

en virtud de las cuales las prolongaciones de algunos de ellos, en los grupos sometidos a

la administración de EtOH, es decir, ES y EB, se mostraron zigzagueantes, onduladas, en

tirabuzón (Cfr. Fig. 66, grupo ES en P35, y EB en P35 y P60).

178
Figura 66. A stroc itos S-100B-ir en el H ipp de las crías de e dad es P 5, P 21 , P 35 y P 60 de los gru pos de tratam ien to
C S , C B , E S y EB del protocolo de E P E con prevención del daño por adm inistración de buspirona. Las flechas en
P 3 5 ES, P35 EB y P60 EB señalan prolongaciones citop lasm áticas en sacacorcho. V éase la exp licación d etallada
en el texto. B arra de escala en P 5 C S = 20 :m (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).

179
Resultados

Figura 67. D ensidad óp tica relativa de los astrocitos S 10 0B -ir, a distintas edades postnatales, en el
stratum radiatum del área C A 1 del hipocam p o (C A 1 H ip p ) d e las crías p ostnatales som etid as a EPE con
prevención del daño por adm inistración de buspirona. C S : control-salina; C B : control-buspiro n a; E S :
etanol-salina; E B : etanol-buspirona. E dades evaluadas: P 5, P 21 , P 35 y P 60. S e grafican los valores
ab so lutos en unidad es de D O R . * P < 0,05; ** P < 0,01. A N O V A de d os vías + post-test de D unnett p ara
cad a u na de las ed ad es.

IV.2.2.4. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):

En este protocolo experimental la expresión de la MAP-2-ir se evaluó en dos áreas

prosencefálicas: el CA1 Hipp y la CxF. En ambas regiones, su inmunomarcación mostró

un perfil filamentoso o fibroso orientado predominantemente según la orientación de las

dendritas apicales de las neuronas piramidales de ambas áreas.

En el CA1 Hipp los niveles del área relativa de tejido cerebral ocupado por las fibras

MAP-2-ir aumentó con una pendiente suave desde P5 hasta P90, con un leve incremento

de la pendiente entre P21 y P35, coincidiendo con el final de la infancia y el inicio de la

adolescencia. Hacia P90 el aumento final del área relativa fue de 129,32% con respecto a

P5 (Figs 68 y 70; Anexo VII, Tabla 2). En los animales del grupo ES la curva de valores

del área relativa de las fibras MAP-2-ir en relación con la edad evaluada se ubicó en valores

sostenidamente menores que los del grupo CS, con una leve pero perceptible disminución

180
Resultados

entre P5 y P21, un cambio relativamente abrupto de la pendiente (con aumento) entre P21

y P35 y un nuevo estancamiento entre esta última edad y la siguiente, P60, en la que el

valor, incluso, disminuyó con respecto a la anterior; entre P60 y P90, nuevamente, un

incremento leve de la pendiente. Entre P5 y P90, sin embargo, no se observó el aumento

total que se observara en CS sino que, por el contrario, el aumento entre estas dos edades

fue de solamente 117,9% (Anexo VII, Tabla 2). Es decir, en los animales ES los valores del

área relativa de las fibras MAP-2-ir partieron de niveles más bajos en P5 y no llegaron,

siquiera, a tener un nivel de aumento comparable con el del grupo CS. En aquellos animales

sometidos a EPE a cuyas madres se les administró buspirona concomitantemente (grupo

EB), los valores se acercaron a los del grupo CS en todas las edades, con dos excepciones:

en P5, los valores en EB fueron significativamente mayores que en los de CS y

significativamente mayores en P60, con valores estadísticamente comparables en P21, P35

y P90, por lo que el perfil de la curva presentó un valle en P21 que alteró la armonía del

cambio de los valores que se observara en el grupo CS entre las sucesivas edades. Por

último, en los animales del grupo CB (cuyas madres bebieron agua en todo momento y

recibieron buspirona) la curva de aumento del área relativa de las fibras MAP-2-ir, si bien

en todas las edades fue estadísticamente similar en valores a la del grupo CS, no presentó

el aumento armónico que mostró esta última aunque, globalmente, entre P5 y P90

aumentara un 139,42%.

En la CxF, se observó que el área relativa de tejido nervioso ocupado por las fibras

MAP-2-ir, en el cerebro de las crías del grupo CS, presentó una disminución transitoria en

la edad P35 a partir de los valores previos de P21 para volver a aumentar hacia P90,

quedando este fenómeno, en la curva temporal, representado por un valle. Igual perfil

181
Figura 68. Fibras M A P-2-ir en el H ipp de las crías de edades P 5, P 21, P 35 y P 60 de los grupos de tratam iento C S ,
C B , ES y EB del protocolo de EP E con prevención d el d año p or adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación
detallada en el texto. B arra de escala P 5 C S = 50 :m en (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).

182
Resultados

Figura 69. Fibras M A P -2-ir en la C xF de las crías de edades P21, P 35 y P 60 de los grupo s de tratam iento C S , C B , E S y EB del
pro to co lo de EP E con prevención del daño por adm inistración d e b usp irona. V éase la exp licación d etallada en el texto. B arra de
escala P 21 C S = 50 :m en (válida p ara todas las ed ad es y tratam ien tos).

183
Resultados

presentó la curva correspondiente a la CxF de las crías del grupo ES, pero a niveles mucho

más bajos (aproximadamente la mitad). Las crías sometidas a EPE y cuyas madres

recibieran buspirona entre los días E13 a E20 de la gestación (grupo EB) mostraron un

perfil similar al de las crías CS en niveles estadísticamente equivalentes.

Por último, lo mismo sucedió para las crías de madres del grupo CB (Figs. 69 y 70;

Anexo VII, Tabla 2).

Figura 70. Á rea relativa de te jido cerebral ocupado por las fibras M A P -2-ir en el stratum
radiatum del área C A 1 d el hipoca m po (C A 1 H ipp ) y en la c orteza frontal (C xF ) a
distintas edades de las crías postnatales som etid as a EPE con p revención d el d año p or
la adm inistración de buspiro na. C S : control-salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-
salina; E B : etanol-buspirona. E dades evaluadas: P 5, P 21, P 35, P 60 y P 90 para el C A 1
H ipp y P21, P35 y P60 para la C x F. Se p resentan los valores absolutos en unid ad es d e
área relativa. * P < 0,05. ** P < 0,01. A N O VA de d os vías + post-test de D unnett, para
cada edad.

184
Resultados

IV.2.3. Experimentos conductuales en P90:

En un grupo de ratas macho de una segunda tanda experimental de animales, criados ad

hoc, del protocolo de EPE con prevención del daño por administración de buspirona, se

realizaron estudios conductuales cuando estas alcanzaron la edad P90. Estos estudios se

llevaron a cabo con la finalidad preliminar de evaluar si las alteraciones morfológicas que

se habían observado en los cerebros de los animales tratados de igual manera presentaban

o no un correlato funcional en dos aspectos importantes de la conducta animal: el

comportamiento motor y el grado de ansiedad

provocados por la exposición a un ambiente

novedoso. El estudio se realizó con el

dispositivo del campo abierto según lo

descripto en el apartado III.2.7. (Estudios

conductuales) de la sección de Materiales y

Métodos. En una misma sesión experimental

se evaluaron ambos parámetros conductuales.

En cuanto a la respuesta motora frente a la

exposición a un ambiente novedoso, los

animales del grupo CS realizaron, en los 5

minutos que duró la evaluación, 53,22 ± 15,68

(n = 10) cruces de cuadros; los del grupo CB Fig u ra 71. Evaluaciones cond uctuales en ratas m acho d e
edad P90 som etid as a EPE con p revención d el d año p or
adm inistración de buspiro na. A rriba, resulta dos de la
evaluación de la conducta m oto ra y abajo, resulta dos de la
realizaron 42,33 ± 11,04 (n = 15); los del evalua c ión de la conducta de ansiedad, am bos, ante la
exp osición a un am b iente novedoso (p rueb a d el cam p o
abierto). T iem po de evaluación: 5 m inuto s. C S : control-
grupo ES 63,0 ± 18,86 (n = 10) y los del salina; C B : control-buspiro na; E S : eta nol-salina; E B : eta nol-
bu spiron a. S e rep resen tan los valores ab solutos ( 0 ± E S ). *
P < 0,05. ** P < 0,01. A N O V A de dos vías + post-test d e
S tuden t-N ew m an -K eu ls de co m pa racion es m últiples.

185
Resultados

grupo EB 59,0 ± 15,37 (n = 15) cruces de cuadros. La evaluación de los resultados por

medio del ANOVA de dos vías seguido del post-test de Dunnett mostró que, desde el punto

de vista estadístico, ninguno de los grupos experimentales se diferenció significativamente

del grupo control (CS), pero sí se encontraron diferencias significativas entre los grupos CB

y ES, y CB y EB cuando tras el ANOVA se realizó el post-test de Student-Newman-Keuls

de comparaciones múltiples (Fig. 71).

Con respecto al tiempo de permanencia en el cuadro central como medida del grado de

ansiedad, los resultados de las mediciones para cada grupo experimental fueron: grupo CS:

11,62 ± 5,407 segundos (n = 10); CB: 6,145 ± 4,54 segundos (n = 15); ES: 17,38 ± 18,19

segundos (n = 15); y EB: 11,82 ± 9,12 segundos (n = 15). Realizado el ANOVA de dos vías

seguido por el post-test de Dunnett, se encontró, también aquí, que ninguno de los grupos

experimentales difirió significativamente (desde el punto de vista estadístico) del grupo

control (CS). Cuando, en cambio, se realizaron múltiples comparaciones entre todos los

grupos de tratamiento entre sí por medio del post-test de Student-Newman-Keuls, se pudo

apreciar que el único resultado significativamente diferente era el que comprendía al par

de grupos integrado por CB y ES (Fig. 71).

IV.3. Protocolo de exposición durante la adolescencia con abstinencia posterior:

IV.3.1. Resultados generales del tratamiento (consumo de alimento y líquido,

alcoholemias y peso de las ratas):

186
Resultados

No hubo diferencias de peso entre los cuatro grupos experimentales antes y después de

los períodos de exposicíon y abstinencia al EtOH.

Durante el período de exposición las ratas del grupo EtOH, cada día, comieron alimento

en una cantidad equivalente a 143,5 ± 13,9 kCal/kg/d (rango: 124,1-170,0). Por otro lado,

bebieron una media de 134,4 ± 32,33 ml/kg/d (rango: 86,81-178,0) de la solución de EtOH

6,6% v/v. Este consumo significó la ingestión de 6,997 ± 1,68 g/kg/d (rango: 4,52-9,27) de

EtOH. De este EtOH, las ratas macho adolescentes obtuvieron 49,47 ± 11,9 kCal/kg/día

(rango: 31,96-65,53). Este ingreso calórico constituyó a su vez un 25,42 ± 4,637% (rango:

18,46-33,12%) para un del VCT diario de 192,9 ± 19,78 kCakl/kg/d (rango: 157,4-230,9).

Al igual que en los protocolos experimentales anteriores, las ratas macho del grupo ido

que las ratas Control, pero a pesar de ello no desarrollaron un estado de deshidratación

detectable.

Las alcoholemias, determinadas en los animales del grupo EtOH, según lo esperado,

fueron bajas y comprendidas en los valores previamente hallados: 19,0 ± 5,2 mg/dl (rango:

16-25 mg/dl = 3,47-5,42 mM). En los animales Control, también según lo esperado, las

alcoholemias fueron indetectables a pesar de haberse realizado para mantener las mismas

condiciones de tratamiento en ambos grupos.

Al comienzo del período de 42 días de exposición al EtOH, todas las ratas tenían una

edad comprendida entre P45 y P50 (adolescencia tardía) y pesaban 194,1 ± 28,11 g (201,3

± 23,4 g las asignadas al grupo control, n = 10, con un rango de 167,0-235,0 g y 186,9 ±

32,05 g las asignadas al grupo expuesto, n = 10, con un rango de 146,0-230,0 g; P =

0,2662). Para el final de este período los animales tenían una edad de P87 a P92 (adultas),

casi habían duplicado su peso inicial (con aumentos de 182,02% y 188,23%,

187
Resultados

respectivamente) y pesaban 366,4 ± 18,15 g y 351,8 ± 29,55. No hubo diferencias

estadísticamente significativas entre los pesos de estos dos grupos (P = 0,6787) (Fig. 72).

Hacia la finalización del período de recuperación de 70 días los machos tenían una edad

de P157 a P162 y pesaban 403,3 ± 16,93 g (Control/R; n = 5) y 395,1 ± 18,72 g (EtOH/R;

n = 5). Nuevamente, no hubo diferencias significativas entre los valores de ambos grupos

(P = 0,7536). Así, durante este período aumentaron 110,07% y 112,3%, respectivamente,

a partir de su peso inicial. Y, con respecto al peso al inicio de todo el período experimental

(exposición más recuperación) los machos Control y EtOH aumentaron 200,44% y 211,4%,

respectivamente.

Figura 72. Peso de los m achos adolesc entes d e los g rup os C ontrol y EtO H al inicio y al final d el p eríod o
de exposición al EtO H y de los m achos ya adultos d e los g rup os C ontrol/R y EtO H /R , tras el p eríod o de
abstinencia. Lo s nú m eros den tro d e las barras en el m om en to de p ost-exp osición y de po st-recuperación
corresponden a los porcentajes de aum ento de peso con respecto al p eríod o anterior, es decir, al
m om ento inicial y al m om ento de po st-ex p o sición, respectivam ente. Los núm eros situados sobre las
barras de los grupo s C o n trol/R y EtO H /R , en el m om ento de po st-recuperación, corresponden al
au m en to de p eso total en relación al m om en to inicial del tratam ien to. Test t de S tuden t de d os colas.

El patrón de exposición crónica al EtOH que utilizamos en este protocolo experimental

no provocó ningún signo conductual de intoxicación aguda o crónica durante el período de

administración ni de abstinencia aguda o crónica al EtOH, en ninguno de los animales,

luego de que la administración del EtOH fuera finalizada abruptamente. Nuevamente, los

188
Resultados

signos de intoxicación, tanto como los de abstinencia, se evaluaron por medio de las escalas

conductuales para roedores de laboratorio previamente utilizadas (Nixon y Crews, 2004;

Penland et al., 2001; Slawecki, 2002).

IV.3.2. Experimentos de inmunocitoquímica:

IV.3.2.1. Serotonina (5-HT):

La 5-HT-ir se evaluó, por medio del valor de la DOR, en las neuronas del NDR y del

NMR en cortes de niveles mesencefálicos. Para ambos núcleos, no se observaron cambios

significativos en el número de neuronas inmunomarcadas. Las neuronas de estos dos

núcleos presentaron su característico perfil estrellado; la inmunotinción marcó el soma,

oscureció el núcleo de cada una de las neuronas en la mayoría de los casos, y también

marcó las principales prolongaciones citoplasmáticas o el inicio de estas.

En el NDR de los animales del grupo EtOH se observó una disminución significativa

de la 5-HT-ir; el valor de la DOR llegó solo a 0,71 veces del valor de los animales Control

(P < 0,0001; Figs. 73A,B y 74; Anexo VII, Tabla 3). En el mismo núcleo de los animales

del grupo EtOH/R se observó una recuperación del valor de la DOR; este fue 0,97 veces

el valor de los animales Control/R y esta diferencia no fue estadísticamente significativa

(P = 0,7609; Figs. 73A,C y 74; Anexo VII, Tabla 3). En las neuronas de los animales del

grupo EtOH el perfil nuclear siempre fue evidente dado que la inmunotinción, al estar

disminuida, no lo oscureció como sí fue el caso en los animales de los grupos EtOH/R,

189
Resultados

Control y Control/R (Fig. 73B).

F ig u ra 73. N eu ron as 5-H T-ir en el N D R (A -C ) y en el N M R (D -F) d e los m achos del pro to colo de exposición al E tO H durante la
adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,D ) c orresponde a los anim ales Co ntrol; la colum na del
m ed io (B ,E ) a los an im ales E tO H ; y la co lum na de la derech a (C -F) a los anim ales E tO H /R .V éa se la d escripción en el texto . B arra
de escala en F = 50 :m (válida p ara A -F).

En el NMR no hubo cambios en los valores medidos de la DOR en el par de grupos de

190
Resultados

animales Control-EtOH ( P = 0,324; Figs. 73D,E y 74; Anexo VII, Tabla 3) ni en el par de

grupos Control/R-EtOH/R (P = 0,9136; Figs. 73D,F y 74; Anexo VII, Tabla 3).

Figura 74. D ensidad óp tica relativa de las neuronas 5-H T -ir d e lo s núcleos dorsal y m edial del rafe m esencefálico en ratas
adolescente s tras el perío do de into xicación y de recuperación en el pro to colo de exposición al eta nol durante la adolescencia
co n ab stinen cia p osterior. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.

IV.3.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):

En los animales del grupo EtOH, en las tres áreas prosencefálicas evaluadas, los

astrocitos mostraron un cuerpo celular agrandado, con procesos citoplasmáticos más

tortuosos y ramificados y una inmunotinción más intensa comparada con la de los animales

del grupo Control. El análisis morfométrico reveló que el área celular aumentó

significativamente en los animales del grupo EtOH, en todas las áreas.

En el CA1 Hipp el incremento fue de 1,62 veces con respecto al de los animales Control

(P < 0,0001; Figs. 75A,B y 76; Anexo VII, Tabla 3). En el Strt el aumento alcanzó 1,68

191
Fig. 75. A stroc itos G FA P -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C xF (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e exp osición
al E tO H durante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,C ,D ) corresponde a
los anim ales C ontrol; la colum na del m edio (B ,E,H ) a los anim ales EtO H ; y la colum na d e la derecha (C ,F,I) a los
anim ales E tO H /R . V éase la descripción en el texto. B arra de escala = 100 :m en A y G (válida para A -C y G -I) y
50 :m en D (válida p ara D -F).

192
Resultados

veces el valor del grupo Control (P < 0,0001; Figs. 75D,E y 76; Anexo VII, Tabla 3). En

la CxF el incremento del área celular alcanzó 1,73 veces el valor del Control (P < 0,0001;

Figs. 75G,H y 76; Anexo VII, Tabla 3).

Tras 70 días de abstinencia, los astrocitos del cerebro de los animales del grupo EtOH/R

tendieron a recuperar su morfología normal en las tres áreas a pesar de que el valor medio

de sus áreas celulares aún persistió aumentado con respecto a sus controles (pero disminuyó

con respecto al que tenían los del grupo EtOH).

Así, los astrocitos del CA1 Hipp mostraron un incremento del área celular que alcanzó

un valor 1,24 veces el de sus respectivos controles (P < 0,0001; Figs. 75A,C y 76; Anexo

VII, Tabla 3) pero, al mismo tiempo, este valor representó 0,77 veces el valor del grupo

EtOH.

En el Strt, el valor del área celular alcanzó 1,11 veces el de los Control/R (P < 0,0001;

Figs. 75D,F y 76; Anexo VII, Tabla 3) pero fue 0,66 veces el valor del grupo EtOH.

Finalmente, en la CxF, el valor del área celular fue 1,26 veces mayor que en el

respectivo control (P < 0,0001; Figs. 75G,I y 76; Anexo VII, Tabla 3) y 0,73 veces el valor

del grupo EtOH.

Figura 76. Á rea celular de los astrocitos G FA P -ir en áreas prosencefálicas de las ratas adolescentes
tras el perío do de into xic a c ión y de recuperación en el pro to colo de exposición al eta nol durante la
ad olesce ncia con ab stinen cia p osterior. * P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.

193
Resultados

IV.3.2.3. Proteína S100B (S100B):

La S100B-ir intracelular se observó en los astrocitos de cada una de las áreas

prosencefálicas que se analizaron. La inmunotinción marcó el cuerpo celular y algunas de

las proyecciones citoplasmáticas primarias (Fig. 77). En los animales adolescentes del

grupo EtOH, en las tres áreas, los astrocitos mostraron una disminución de la S100B-ir.

Esta disminución fue visualmente evidente en el hecho de que los astrocitos dejaban ver

su perfil nuclear, un fenómeno que no se observó en los animales no expuestos (Control,

Control/R) ni en los abstinentes (EtOH/R) (Fig. 77).

En el CA1 Hipp de los animales del grupo EtOH hubo una disminución del valor de la

DOR que alcanzó 0,51 veces el valor del grupo Control (P < 0,0001; Figs 77A,B y 78;

Anexo VII, Tabla 3).

En el Strt, estos animales mostraron una disminución que llegó a 0,41 veces el valor del

grupo Control (P < 0,0001; Figs 77D,E y 78; Anexo VII, Tabla 3).

En la CxF, la DOR llegó a valores que representaron 0,64 veces el valor del grupo

Control (P < 0,0001; Figs 77G,H y 78; Anexo VII, Tabla 3).

Tras el período de abstinencia, la DOR en los animales EtOH/R se recuperó a los valores

medidos en los animales del grupo Control/R. Así, en el CA1 Hipp, los astrocitos de los

animales del grupo EtOH/R mostraron valores de DOR que alcanzaron 1,13 veces el de los

animales del grupo Control/R (P = 0,1333; Figs 77A,C y 78; Anexo VII, Tabla 3); al

mismo tiempo, este valor fue 2,2 veces mayor que el del grupo EtOH.

En el Strt, los valores de la DOR llegaron a 0,86 veces el valor de los animales del grupo

Control/R (P = 0,0428; Figs. 77D,F y 78; Anexo VII, Tabla 3). De este modo, el valor de

194
Fig. 77. A strocitos S -1 0 0 B -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum n a de la izquierda (A ,C ,D )
corresponde a los anim ales C ontrol; la colum na de l m edio (B ,E ,H ) a los anim ales E tO H ; y la colum na de la
derecha (C ,F,I) a los anim ales E tO H /R . V éase la descripción en el texto. B arra de escala en I = 20 :m (válida p ara
A -I).

195
Resultados

la DOR del grupo EtOH/R representó un cambio en más de 2,1 veces con respecto al del

grupo EtOH.

En la CxF, el valor de la DOR de los astrocitos alcanzó 1,22 veces del valor de los

animales del grupo Control/R (P = 0,0908; Figs. 77G,H y 78; Anexo VII, Tabla 3), lo que

representó un cambio en más de 1,9 veces con respecto al valor del grupo EtOH.

F igu ra 78 . D e nsidad óptica relativa de los astrocitos S100B -ir en áreas p rosencefálicas d e las ratas adolescentes tras el p eríod o
de into xicación cró nica y tras la recuperación en el pro to colo de into xicación con eta nol durante la adolescencia y abstin encia
posterior. N S : no sign ifica tivo . *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.

IV.3.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200):

Los Nf-200-ir mostraron una inmunomarcación de tipo filamentosa o fibrosa

correspondiente al cuerpo celular de las neuronas, al axón y a los procesos dendríticos, dado

que esta proteína se expresa en toda la neurona.

El análisis morfométrico de los cortes de cerebro de los animales del grupo EtOH mostró

196
Resultados

alteraciones en el patrón de expresión de estos filamentos intermedios ya que el área

relativa de tejido cubierta por estas fibras disminuyó en el CA1 Hipp, en el Strt y la CxF.

En el CA1 Hipp la disminución alcanzó un valor que fue 0,18 veces el valor de los

animales Control (P < 0,0001; Figs. 79A,B y 80; Anexo VII, Tabla 3). En el Strt el área

relativa alcanzó 0,50 veces el valor del Control (P < 0,0001; Figs. 79D,E y 80; Anexo VII,

Tabla 3). En la CxF el área relativa en los animales EtOH llegó a ser 0,36 veces con

respecto al valor de los animales Control (P < 0,0001; Figs. 79G,H y 80; Anexo VII, Tabla

3).

Tras 70 días de abstinencia, bebiendo solamente agua, los machos del grupo EtOH/R

mostraron un patrón regional diferencial de respuesta en la expresión de los Nf-200. En el

CA1 Hipp, hubo una tendencia a la recuperación ya que el valor del área relativa llegó a ser

0,66 veces el valor de sus respectivos animales Control/R (P = 0,0004; Figs. 79A,C y 80x;

Anexo VII, Tabla 3). A pesar de que este valor aún estuvo por debajo del de los animales

Control/R, fue 3,67 veces mayor que el de los animales del grupo EtOH. En el Strt, tras la

abstinencia, hubo un incremento leve pero no significativo del área relativa ocupada por los

Nf-200-ir que llegó a ser de 1,19 veces con respecto al de los animales Control/R (P =

0,1709; Figs. 79D,F y 80; Anexo VII, Tabla 3). Este cambio, con respecto al valor de los

animales del grupo EtOH, representó un incremento de 2,38 veces. En la CxF, por último,

el valor en los animales del grupo EtOH/R alcanzó a ser 1,33 veces el de los animales

Control/R (P = 0,0024; Figs. 79G,I y 80; Anexo VII, Tabla 3). El valor alcanzado por los

animales del grupo EtOH/R representó así un cambio en más de 3,65 veces con respecto

al de los animales EtOH.

Algunos de los animales expuestos al EtOH (pero no todos) mostraron un perfil

197
Fig. 79. Fibras N f-2 0 0 -ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e
e xp osición al E tO H d urante la adolescencia con abstinencia posterior. La colum n a de la izquierd a
(A ,D ,G ) corresponde a los anim ales C ontrol; la colum na del m e d io (B ,E ,H ) a los anim ales E tO H ; y la
colum na de la derecha (C ,F,I) a los anim ales E tO H /R. V éase la descrip ción en el te xto . B arra de escala
= 100 :m en B y H (válida para A -C y G -I) y 50 :m en E (válida p ara D -F).

198
Resultados

ondulante, “en sacacorcho”, en las fibras Nf-200-ir en algunas de las áreas estudiadas (Fig.

79H). Esta característica morfológica anormal se encontró en algunos de los animales que

pasaron el período de abstinencia, a pesar de que se hubieran recuperado desde un punto

de vista semicuantitativo (Fig. 79C,F) (ver más abajo una descripción ampliada).

Figura 80. Á rea relativa de tejido cerebral cubierto po r las fibras Nf-200-ir en áreas prosencefálicas de las ratas adolescentes tras
el períod o de intoxicación y de recuperación, en el protoco lod de into xicación duran te la adolesce ncia con ab stinen cia p osterior.
N S : no sign ifica tivo . ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de do s colas.

IV.3.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):

La inmunomarcación para la MAP-2 también puso en evidencia unas estructuras de tipo

filamentoso o fibroso que corresponden, en este caso, a las dendritas, dado que la

localización de esta proteína citoesquelética es casi exclusivamente dendrítica (algo de ella

199
Resultados

puede verse, sin embargo, en el soma neuronal).

El análisis morfometrico reveló que, en el CA1 Hipp de las ratas del grupo EtOH, hubo

una disminución del área relativa cubierta por los procesos MAP-2-ir que llegó a ser 0,51

veces el de los animales Control (P < 0,0001; Figs 81,C y 82; Anexo VII, Tabla 3). En el

Strt hubo una importante disminución; el valor llegó a ser 0,31 veces el valor de los

animales Control (P < 0,0001; Figs 81D,F y 82; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, la

disminución representó un valor de 0,41 veces el valor de los animales Control (P <

0,0001; Figs 81G,I y 82; Anexo VII, Tabla 3).

En aquellos animales expuestos al EtOH y sometidos a un período de abstinencia de 10

semanas (EtOH/R) hubo una reversión de la disminución de los valores de área relativa

ocupada por las fibras MAP-2-ir en el CA1 Hipp. Así, estas fibras ocuparon un área relativa

que llegó a 0,92 veces el valor de sus respectivos animales control (Control/R). Esta

diferencia no fue estadísticamente significativa (P = 0,2414; Figs 81A,C y 82; Anexo VII,

Tabla 3) pero, con respecto al valor de los animales del grupo EtOH representó un cambio

en más de 1,8 veces. Algo similar fue lo que se observó en el Strt; el área relativa llegó a

ser 1,23 veces del valor de los animales del grupo Control/R; la diferencia entre ellos

tampoco fue estadísticamente significativa (P = 0,2291; Figs 81D,F y 82; Anexo VII, Tabla

3) pero el cambio con respecto a los animales del grupo EtOH fue mucho mayor que el del

Hipp: 3,96 veces. Finalmente, en la CxF no se observó tal recuperación de este parámetro

morfométrico. En los animales EtOH/R este valor alcanzó a ser sólo 0,58 veces el valor de

los animales del grupo Control/R, y la diferencia fue extremadamente significativa desde

un punto de vista estadístico (P = 0,0001; Figs 81G,I y 82; Anexo VII, Tabla 3). Este valor

fue solamente 1,42 veces mayor que el de los animales del grupo expuesto y sin recuperar

200
Fig. 81. Fibras M A P -2-ir en el H ipp (A -C ), el Strt (D -F), y la C x F (G -I) d e los m achos d el p rotocolo d e exp osición
al E tO H durante la ad olescencia co n abstinencia p osterior. La colum na de la izquierda (A ,D ,G ) corresponde a
lo s anim ales C ontrol; la colum na del m edio (B ,E,H ) a los anim ales EtO H ; y la colum na d e la derecha (C ,F,I) a los
anim ales EtO H /R . V éase la d escripción en el texto. B arra de escala = 100 :m en B e I (válida p ara A -C y G -I) y
50 :m en E (válida p ara D -F).

201
Resultados

(EtOH), una diferencia estadísticamente no significativa (P = 0,2391).

Figura 82. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras M A P -2-ir en áreas prosencefálicas de las
ra tas adolescentes tras la intoxicación crónica y la recup eración p osterior en el p rotocolo d e intoxicación
co n etanol duran te la adolesce ncia y co n recuperación posterior. N S : no sign ifica tivo. ** P < 0,01. *** P <
0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.

Desde un punto de vista descriptivo puramente morfológico, las fibras MAP-2-ir, si bien

se recuperaron semicuantitativamente en el CA1 Hipp y en el Strt de los animales del grupo

EtOH/R, no lo hicieron desde un aspecto cualitativo. Las dendritas apicales de las neuronas

piramidales mostraron un claro perfil ondulado (Fig. 81I; ver más abajo una descripción

ampliada).

IV.3.2.6. Óxido nítrico sintetasa neuronal (nNOS):

En el Strt y en la CxF de los animales Control, EtOH y Control/R se pudieron observar

claramente neuronas de soma estrellado y algunas fusiformes, más o menos agrupadas, con

una inmunotinción fuerte y uniforme que oscureció el núcleo de manera consistente.

202
Resultados

También se observaron algunas de sus principales prolongaciones citoplasmáticas por

trayectos de longitudes variables (Fig. 83A,B,D,E). Contrariamente, en ambas áreas de los

animales del grupo EtOH/R se observó una marcación mucho menos intensa, de modo tal

que el perfil nuclear fue evidente en cada neurona. Las prolongaciones citoplasmáticas

también estaban teñidas pero más tenuemente y por mucha menos longitud (Fig. 83C,F).

En el grupo de animales EtOH, la medición de los valores de la DOR de las neuronas

situadas en el Strt no mostró cambios con respecto a las de los animales Control (P =

0,2852; Figs 83A,B y 84; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, tampoco se observaron cambios

significativos en los valores de la DOR (P = 0,4878; Figs 83D,E y 84; Anexo VII, Tabla

3).

En los animales del grupo EtOH/R, las neuronas nNOS-ir del Strt mostraron una

disminución significativa en sus valores de DOR que llegó a ser 0,53 veces el valor de los

animales Control/R (P = 0,0339; Figs 83A,C y 84; Anexo VII, Tabla 3). En la CxF, la

disminución, también estadísticamente significativa, alcanzó valores que fueron 0,63 veces

el valor de los animales del grupo Control/R (P = 0,0024; Figs 83D,F y 84; Anexo VII,

Tabla 3).

Finalmente, en el CA1 Hipp no se observó un número de neuronas nNOS-ir suficiente

desde el punto de vista estadístico, tal que pudiera ser evaluado en forma confiable. Por lo

tanto, no se muestran datos acerca de esta región.

Para un resúmen de los resultados obtenidos en los animales adolescentes expuestos al

EtOH y tras la abstinencia, véase la Tabla 9.

203
Resultados

F ig . 8 3 . N e u ron as n N O S -ir en el S trt (A -C ), y la C xF (D -F) d e los m achos del pro to colo de exposición al E tO H durante la
adolescencia con abstinencia posterior. La colum na de la izquierda (A ,D ) c orresponde a los anim ales Co ntrol; la colum na del
m ed io (B ,E ) a los anim ales E tO H ; y la colum na d e la d erech a (C ,F) a los anim ales E tO H /R . V éa se la d escripción en el texto . B arra
de escala en F = 50 :m (válida p ara A -F).

204
Resultados

Figura 84. D ensidad óptic a relativa de las neuro nas nN O S -ir d el S trt y la C xF de las rata s adolescente s tras la into xicación y la
re cu p eración posterior en el protocolo de adm inistración de etanol durante la adolescencia con abstinencia posterior. N S : n o
sign ifica tivo . ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os co las.

Tabla 9. Resumen de los resultados morfométricos de los experimentos de ICQ realizados en cortes de
cerebros de ratas adolescentes expuestas al EtOH y tras la abstinencia (con respecto a sus respectivos
controles).

M arcador M ESENCÉFALO

NDR NM R

EtOH EtOH/R EtOH EtOH/R

5-HT 9 z z z

PROS ENCÉFALO

CA1 H ipp Strt CxF

EtOH EtOH/R EtOH EtOH/R EtOH EtOH/R

GFAP 88 8 88 8 88 8
S100B 9 z 9 z 9 z
Nf-200 99 9 9 z 9 8
MAP-2 9 z 9 z 9 9
nNOS n/d* n/d* z 9 z 9
* n/d: no detectado.

205
Resultados

IV.3.2.7. Descripción de los cambios morfológicos observados en el citoesqueleto

neuronal:

Los animales del grupo EtOH, en los cortes prosencefálicos inmunomarcados tanto para

Nf-200 como para MAP-2 (marcadores del citoesqueleto neuronal), mostraron fibras

(correspondientes tanto a axones como a dendritas) con un perfil claramente ondulado en

el CA1 Hipp, el Strt y la CxF, zigzagueando como si ellas mismas hubieran estado ebrias

al momento de ser fijadas (Figs. 79 y 81). Este cambio morfológico no se observó

constantemente en todas las áreas de todos los animales pero sí se lo observó en forma

general, a veces en algunos animales o en algunas áreas, en las tres áreas evaluadas del

prosencéfalo. Lo mismo es válido para los animales del grupo EtOH/R. Por ejemplo, en la

CxF, comparadas con las neuronas piramidales normales (Fig. 85A), las de los animales del

grupo EtOH presentaron dendritas de perfil ondulado que podría ser descripto como una

estructura (símil-sacacorcho(. El tronco primario de las dendritas apicales parece haber sido

la porción dendrítica más afectada en las neuronas piramidales de los animales

pertenecientes a los grupos tanto EtOH como EtOH/R (Fig. 85B,C,E). Sin embargo, esta

dismorfología también se observó en las dendritas basales y, con menor frecuencia, en las

ramas secundarias de las dendritas apicales (Fig. 85C). También se observó esta alteración

estructural del citoesqueleto en las neuronas estrelladas corticales pero con mucha menor

frecuencia, incluso cuando las dendritas apicales de las neuronas corticales inmediatamente

vecinas estaban claramente afectadas (Fig. 85D).

206
F ig. 85. A lte raciones cualita tivas del cito esqueleto neuro nal. Las foto m icro grafías m uestran neuro nas corticales N F-200-ir
ilu stra tiva s de la C xF de los m achos del protocolo d e exp osición al EtO H d urante la ad olescencia con ab stinencia p osterior, d e
a nim a le s C o ntrol (A ), EtO H (B ), y EtO H /R (C -E). En e l H ip p y en el Strt d e los anim ales tanto EtO H com o EtO H /R se han ob servado
im ágenes com parables con la M A P -2-ir (véase, por ejem plo, las Figs. 79C ,F y 8 1C ). E n las neuronas corticales de los anim ales
C ontrol (A ) se pudieron observar las dendritas apicales (da) y basales (db) com o así tam bién el inicio del axón con su cono axónico
(ax) y las dendritas secundarias (ds), todo s ellos con un perfil liso y regular. E n los anim ales E tO H (B ), tanto las dendritas apicales
(da) com o las basales (db) exhibieron u na apariencia estructural sem ejante a un sacacorcho o a un tirabuzón, m ás evidente en
las dendritas apicales y m enos en las basales; en la m ayoría de las dendritas secundarias (ds) esta alteración n o se hizo evidente.
E n los anim ales E tO H /R (C -E ), se pudiero n ob servar d endritas apicales (d a), b asales (d b) y apicales secundarias (d s) c on la
a pa rie nc ia en sacacorcho en las neuronas corticales p ero no en la m ayoría de las neuronas estrelladas q ue, en cam b io, m ostraron
una silueta lisa y reg ular (nE en D ) a p esar de que las den dritas apica les de n eu ronas piram idales vecinas estab an claram en te
afectadas (flechas en D ). B arras de escala = 50 µ m en A -E .

207
Resultados

IV.4. Protocolo de exposición al etanol durante la adultez:

IV.4.1. Resultados generales del tratamiento:

Los registros referentes al consumo de alimento, de líquido y de EtOH y a la evolución

ponderal, fueron, en este protocolo experimental, en todo similar a lo ya visto en los

protocolos anteriores. Valga aclarar que los machos del grupo EtOH consumieron menos

líquido (en general) que los del grupo Control; que la evolución del peso de ambos grupos

fue similar y no significativamente diferente; que la ingesta diaria de EtOH en el agua de

bebida fue similar a la de los machos adolescentes del protocolo anterior como así también

lo fue el porcentaje del VCT que constituyeron las calorías derivadas del mismo; y, por

último, que las alcoholemias halladas también estuvieron dentro del rango de las halladas

en los anteriores protocolos experimentales.

IV.4.2. Experimentos de inmunocitoquímica:

IV.4.2.1. Transportador de serotonina (5-HTT):

El 5-HTT,10recordemos, se expresa no solamente en las terminales presinápticas, sino

también a lo largo de las fibras que interconectan los botones en pasaje por lo que la

morfología observable se asemeja a imágenes de fibras arrosariadas.

Figura 86 (en la próxim a págin a). Fibras 5 -H T T -ir en el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . B arra d e e scala = 50 µ m en A (válida p ara A -F).

208
209
Resultados

Las fibras 5-HTT-ir se observaron claramente en cada corte analizado de los animales

Control y EtOH, pero en estos últimos se observó una importante reducción del área

relativa por unidad de tejido en las tres áreas prosencefálicas estudiadas (Fig. 86A-F).

Estas observaciones cualitativas se confirmaron por medio de la morfometría y el

análisis estadístico. Así, la disminución del área ocupada por las fibras 5-HTT-ir en el CA1

Hipp de los animales EtOH fue significativa y de una magnitud equivalente a 0,74 veces

el valor de los animales Control, no expuestos (Figs 86A,B y 87; Anexo VII, Tabla 4). En

el Strt el mismo valor fue 0,72 veces el de

los Control (Figs 86C,D y 87; Anexo VII,

Tabla 4). Finalmente, en la CxF el área

relativa también disminuyó y fue de 0,83

veces el valor respectivo de los animales

Control (Figs 86E,F y 87; Anexo VII,

Tabla 4). La morfología de las fibras en sí Figura 87. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras
5-H TT-ir en áreas prosencefálicas de las ratas adultas expuestas
crónica m en te al etanol. *** P < 0,0001 . Test t d e Stud ent d e d os
mismas no se vió alterada. colas.

IV.4.2.2. Proteína gliofibrilar ácida (GFAP):

En los animales Control, los astrocitos GFAP-ir mostraron su clásica apariencia con

procesos citoplasmáticos largos y delgados (Fig. 88A,C,E).11

En las ratas adultas expuestas al EtOH 6,6% en el agua de bebida durante 6 semanas, se

Figura 88 (en la p róxim a p ág ina). A stroc itos G FA P -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . B arra d e e scala = 50 µ m en A (válida p ara A -F).

210
211
Resultados

observó una importante reacción astroglial puesta en evidencia como un aumento

tremadamente significativo del área

celular, nuevamente, en las tres áreas

evaluadas. En el CA1 Hipp, el área de los

astrocitos de los animales EtOH fue 1,92

veces mayor que en los animales Control

(Figs 88A,B y 89; Anexo VII, Tabla 4). En


F ig ura 89. Á rea celu lar d e lo s astro cito s G F A P -ir en áre a s
el Strt, el área celular de los astrocitos fue prosence fálicas de ratas adultas expuestas crónicam ente al
etanol. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.

1,36 veces mayor que en los Control (Figs

88C,D y 89; Anexo VII, Tabla 4). Por último, en la CxF, el área celular astrocitaria fue 1,46

veces mayor en los animales EtOH que en los Control (Figs 88E,F y 89; Anexo VII, Tabla

4). Estos astrocitos hipertróficos presentaron no solamente cuerpos celulares agrandados

sino también prolongaciones celulares más largas y tortuosas, muchas de ellas

zigzagueantes (Fig. 88B).

IV.4.2.3. Proteína S100B (S100B):

En los astrocitos normales la S100B-ir presenta una distribución citosólica limitada al

cuerpo celular, en tanto que los procesos citoplasmáticos aparecen escasamente

inmunomarcados y por trayectos cortos (Fig. 90A,C,E).12

En las ratas macho adultas expuestas crónicamente al EtOH, el patrón morfológico de

Figura 90 (en la próxim a p ág ina). A stroc itos S -100B -ir en el H ip p (A ,B ), el Strt (C ,D ) y la C xF (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H d urante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a en el texto . La im ag en en C es una fotoco m posición. B arra de esca la = 50 µ m en B (válida p ara A -F).

212
213
Resultados

distribución intracelular de la S100B fue cualitativamente normal pero la intensidad de la

inmunotinción estuvo significativamente aumentada en las tres áreas prosencefálicas que

se estudiaron. En el CA1 Hipp el aumento de la DOR alcanzó valores que fueron 1,56

veces mayores que en los animales Control (Figs 90A,B y 91; Anexo VII, Tabla 4). En el

Strt, la DOR fue 1,21 veces mayor (Figs

90C,D y 91; Anexo VII, Tabla 4) y en la

CxF, finalmente, el valor medio de la

DOR del citoplasma de los astrocitos

S100B-ir fue 1,1 veces mayor en los

animales EtOH que en los Control (Figs


Figura 91. D ensidad óptica relativa de los astrocitos S 100B -ir en
área s p rosence fálica s d e ratas ad ultas expuestas cró nica m en te
90E,F y 91; Anexo VII, Tabla 4). al etan ol. *** P < 0,0001 . Test t de S tuden t de d os colas.

IV.4.2.4. Neurofilamentos de 200 kDa (Nf-200):

Los Nf-200 son filamentos intermedios que expresan las neuronas tanto en el soma como

en las prolongaciones (axónicas y dendríticas). Su inmunomarcación permite observar, en

general, estructuras fibrosas. En las tres áreas estudiadas se observaron disminuciones

significativas del área relativa de tejido nervioso ocupado por estas fibras Nf-200-ir.13

En el stratum radiatum del CA1 Hipp se observaron imágenes correspondientes a las

dendritas apicales de las neuronas piramidales ubicadas en el estrato inmediatamente

Figura 92 (en la p róxim a p ág ina). Fibr as N f-200-ir e n el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H durante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
V éa se la d escripción detallad a e n el texto . La im ag en en F es una fotoco m posición. B arra de e scala en A = 10 0 µ m (válida p ara
A ,B ), 50 µ m (válida p ara C ,D , E ), 20 µ m (valida p ara F).

214
215
Resultados

suprayacente. En esta área, el valor del área relativa en los animales EtOH fue 0,50 veces

el valor medido en los Control (Figs 92A,B

y 93; Anexo VII, Tabla 4). En el Strt de los

animales EtOH tal valor fue 0,84 veces el

valor de los Control (Figs 92C,D y 93;

Anexo VII, Tabla 4). En la CxF, por fin, el

valor medio del área relativa de las fibras

Nf-200-ir fue 0,85 veces el valor medio Figura 93. Á rea relativa de te jido cerebral cubierto por fib ras N f-
20 0 -ir en áreas prosence fálica s d e ratas ad ultas cró nica m en te
exp uestas al etanol. * P < 0,05. ** P < 0,01. *** P < 0,0001 . Test t
de S tuden t de d os colas.
medido en los animales Control (Figs

92E,F y 93; Anexo VII, Tabla 4). En esta última área, si bien la disminución fue

significativa, visualmente, fue más llamativa la alteración cualitativa consistente en el

aspecto símil-sacacorcho, zigzagueante que adquirieron las fibras Nf-200-ir y que ya se

observara en los anteriores protocolos experimentales (Fig. 92F).

IV.4.2.5. Proteína asociada a microtúbulos tipo 2 (MAP-2):

En los cortes de cerebro de los machos adultos sometidos a alcoholización crónica con

una solución de EtOH 6,6% v/v en el agua de bebida que se estudiaron en este protocolo,

no se pudo medir confiablemente el área relativa de las fibras MAP-2-ir en el Strt (Fig.

94C,D).14 Esto se debe a que la organización estructural de las dendritas de las neuronas

Figura 94 (en la p róxim a p ág ina). Fibras M A P -2 -ir en el H ip p (A,B ), el Strt (C ,D ) y la C x F (E,F) d e los m achos d el p rotocolo d e
exposición al E tO H durante la adultez. La fila superior corresponde a los anim a les C ontrol y la fila inferior a los anim a les E tO H .
Vé a se la de scripción detallada en el texto. En el Strt (C ,D ) p rácticam ente no se ob serva m arca q ue hub iera pod id o ser m edid a
por m orfom etría. B arra de escala e n A = 50 µ m (válida para A -F).

216
217
Resultados

que se localizan en esta área no se disponen tan ordenadamente como en las otras dos áreas

evaluadas.

En estas últimas áreas, CA1 Hipp y CxF, donde sí se la pudo medir confiablemente, la

inmunomarcación para la MAP-2 se vió notoriamente reducida. El stratum radiatum del

CA1 Hipp contiene a las dendritas apicales de las neuronas piramidales del

stratumpiramydale. Siendo la MAP-2 una proteína citoesquelética de expresión

predominantemente dendrítica,

lainmunomarcación para esta proteína

permitió observar fibras de trayecto

aproximadamente paralelo que cruzan todo

el espesor de aquel estrato hipocámpico. El

análisis de imágenes y el estadístico de los Figura 95. Á rea relativa de tejido cerebral cubierta por fibras
M A P -2-ir en áreas prosencefálicas de ratas adultas expuestas
crónica m en te al etanol. *** P < 0,0001 . n/d: no detectado. Test t
de S tuden t de d os colas.
datos numéricos obtenidos demostró que el

valor medio medido en los animales EtOH fue 0,64 veces el valor medido en los animales

Control (Figs 94A,B y 95; Anexo VII, Tabla 4). En la CxF el valor medio del área relativa

fue, también, 0,64 veces el valor de los machos Control (Figs 94E,F y 95; Anexo VII, Tabla

4). Además de la disminución semicuantitativa objetivada, los procesos dendríticos

mostraron una estructura irregular y fragmentada, también en sacacorcho. En la Tabla

10 se puede observar un resumen de los datos morfométricos obtenidos en las tres áreas

prosencefálicas, evaluadas con los distintos marcadores astrogliales y neuronales, de los

machos adultos alcoholizados crónicamente.

218
Resultados

Tabla 10. Resum en de los resultados morfométricos de los


experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de ratas
expuestas al EtOH durante la adultez.

M arcador CA1 H ipp Strt CxF

5-HTT
9 9 9
GFAP
8 8 8
S100B
8 8 8
Nf-200
9 9 9
MAP-2 n/d*
9 9
* n/d: no detectado.

219
Discusión
“Il apparaît donc clairement que la responsabilité de la mère alcoolique sur l’ avenir de ses
enfants est écrasante, tant au point de vue physique que psycho-affectif.”1
Jacqueline Rouquette

“En realidad, la disposición de una neurona adulta representa el término de una serie de
movimientos, de impulsos interiores y exteriores, que obraron durante la época embrionaria y
juvenil (...) La razón de la forma está, pues, por entero en la función actual ó pasada.”2
Santiago Ramón Cajal

V.1. Parámetros generales de los tratamientos en los distintos protocolos:

V.1.1. Consumo de alimento, bebida y calorías:

La alimentación es un factor extremadamente importante a tener en cuenta en cualquier

estudio experimental en el que se administre EtOH. En los seres humanos algunos de los

efectos patológicos atribuidos al tóxico se deben en gran parte al menor consumo de

alimento (en calidad y cantidad) y menos a los efectos de la ingesta del EtOH per se. Por

ello, para deslindar los efectos propios del EtOH de los debidos a la alimentación, es

menester asegurarse de que los animales en experimentación, a la vez que intoxicados por

el EtOH, estén adecuadamente alimentados. Sólo así podrá asegurarse que los efectos

observados han sido debidos exclusivamente al EtOH. En los estudios experimentales de

AMF este deslinde es crítico ya que simples alteraciones nutricionales pueden provocar

importantes trastornos del desarrollo en los fetos.

En los dos protocolos de EPE (sin y con prevención del daño), durante el período de

intoxicación pregestacional, las hembras de los grupos que recibieron EtOH en el agua de

bebida (EtOH y ES y EB, respectivamente) consumieron menos alimento y recibieron

1
“Por consiguiente, parece claro que la responsabilidad de la madre alcohólica sobre el porvenir de sus niños
es abrumadora, tanto desde el punto de vista físico como psico-afectivo.” Rouquette, 1957; pág. 54.
2
Ramón Cajal S, 1899; pág. viii.

221
Discusión

menos calorías de él derivadas que las de los grupos control (Control y CS y CB) (Fig. 24;

Anexo VI, Tabla 1). Esto era de esperarse dado que el método de alimentación al que

fueron sometidas fue apareado en cuanto al VCT diario que recibían. Pero el VCT por

ambos grupos fue el mismo (Figs. 28 y 29; Anexo VI, Tabla1). También era esperable que

los animales que bebían la solución de EtOH, por su natural aversión al tóxico, bebieran

menos líquido que los animales control (Fig. 25; Anexo VI, Tabla 1) y eso fue lo que

sucedió. A pesar de que las hembras de los grupos EtOH, ES y EB bebieron diariamente

un 27,64% menos de líquido que las hembras de los grupos Control, CS y CB, no se

observaron consecuencias por deshidratación dado que su consumo diario de líquido en

ambos protocolos estuvo dentro de los límites del consumo considerado normal (20-50

ml/animal/d ú 80-120 ml/kg/d). Como se puede apreciar en la Fig. 28 y en el Anexo VI,

Tabla 1, el VCT diario recibido por ambos grupos de animales (controles y tratados) fue

estadísticamente equivalente.

Durante el período de exposición gestacional, la situación varió. El apareamiento de la

alimentación no fue igual desde el punto de vista del VCT diario recibido por ambos grupos

de animales sino desde el punto de vista de las kCal recibidas a partir de los componentes

plásticos de la dieta, es decir, del alimento. Estas kCal plásticas fueron las que aseguraron

la igualdad de nutrición de las hembras, hecho de la máxima importancia para los fetos en

gestación. Así, las hembras gestantes de ambos grupos consumieron prácticamente la

misma cantidad de alimento (en g y kCal/kg/d) a lo largo de toda la preñez (Fig. 24 y

Anexo VI, Tabla 1). Si se analiza en detalle la Tabla 1 del Anexo VI se observa que lo

sucedido es que, considerada la alimentación por unidad de peso corporal (g o kCal/kg/d),

los animales del grupo EtOH no variaron prácticamente su consumo entre el período de

222
Discusión

exposición pregestacional y el gestacional (151,4 ± 30,98 versus 149,7 ± 15,79 kCal/kg/d,

ó 60,56 ± 12,39 versus 59,9 ± 6,31 g/kg/d; una variación en menos de alrededor de 1,1%).

Por otro lado, los animales del grupo Control lo disminuyeron (espontáneamente) en forma

más notoria (184,3 ± 43,14 versus 160,7 ± 15,01 kCal/kg/d ó 73,71 ±17,26 versus 64,28

± 6,0 g/kg/d; una variación en menos de alrededor de 12,8%). Esta disminución en el

consumo de alimento al entrar en la gestación es paradójico si se piensa que, normalmente,

las hembras gestantes de todos los animales aumentan su ingesta de alimento. Sin embargo,

esta paradoja es sólo aparente si se considera a cada grupo de tratamiento, no ya como

grupo sino desde el punto de vista del consumo de cada animal individual dentro de cada

grupo. Así, en realidad, los animales de ambos grupos aumentaron su ingesta de alimento

(en g y en kCal/animal/d). Este aumento en el consumo de alimentos fue notoriamente

mayor en los animales individuales del grupo EtOH que en los del Control. Parecería que

las hembras gestantes del grupo EtOH hubieran percibido de alguna manera sus mayores

necesidades calórico-plásticas de alimento en función de su nuevo estado de preñez y que

aumentaron en consecuencia su consumo de alimento (quizás previamente diminuido por

el efecto anorexígeno propio del EtOH) en mayor medida de lo que lo hicieron las hembras

del grupo Control. Así, individualmente consideradas, las hembras del grupo Control

aumentaron su consumo de alimento, de un período al otro, casi un 8% (18,14 ± 4,178

versus 19,59 ± 2,361 g/animal/d ó 45,33 ± 10,45 versus 48,97 ± 5,9 kCal/animal/d) en tanto

que las del grupo EtOH lo hicieron en casi un 18,4% (13,92 ± 2,635 versus 16,48 ± 2,08

g/animal/d ó 34,8 ± 6,59 versus 41,2 ± 5,2 kCal/animal/d). En esta explicación de las

variaciones de los niveles de consumo de alimento entre un período y otro del tratamiento,

de uno y otro grupos de animales, debe también tenerse presente el efecto debido a la

223
Discusión

diferente cantidad de animales en uno y otro grupo (n = 4 y 6 para los grupos Control y

EtOH). Esto hace que, consideradas por unidad de peso corporal, las hembras de ambos

grupos parecieran haber disminuido su consumo de alimento al preñarse (según se

desprende de lo que se observa en la Fig. 24) cuando lo que realmente sucedió es que,

consideradas individualmente, lo incrementaron.

Algo en todo similar es lo que se puede decir con respecto al consumo líquido, para

ambos grupos de tratamiento (cfr. Figs. 25 y 26 y Anexo VI, Tabla 1); parecería que las

hembras Control hubieran bebido menos líquido durante la gestación que antes de ella si

se considera el consumo por unidad de peso corporal, cuando lo que en realidad sucedió (lo

mismos es válido para las hembras EtOH) es que aumentaron el consumo de líquido (como

sería lógico esperar) si se las considera, ahora, desde el punto de vista individual de cada

hembra.

Nuevamente, considérese la Tabla 1 del Anexo VI. Se aprecia que durante la gestación,

si bien el VCT fue significativamente mayor en los animales EtOH que en los Control

cuando lo relacionamos a la unidad de peso corporal, ese aumento no lo fue tanto cuando

se tiene en cuenta a cada hembra individualmente.3

En el protocolo de EPE con prevención del daño por la administración de buspirona:

¿provocó la administración de buspirona a las hembras gestantes algún efecto sobre la

alimentación, la bebida o las calorías ingresadas diariamente? Aparentemente no, sobre el

consumo de alimento según surge de considerar las Figs. 51 y 56. El hecho de que las

hembras del grupo EB consumieran significativamente menos alimento que las del grupo

CS puede ser atribuido con mayor seguridad a sus diferencias de peso al inicio de la

3
Y son las hembras individuales las que, finalmente, paren a las crías y no su unidad de peso corporal.

224
Discusión

gestación que a un efecto de la buspirona per se. Los mismo puede decirse acerca de los

efectos de la buspirona sobre el consumo de bebida. Si al consumo de bebida de cada grupo

se lo refiere al grupo control (CS; ANOVA + post-test de Dunnett; figura no mostrada), las

diferencias no son significativas. Si se observa la Fig. 52 y se comparan todos los grupos

entre sí (ANOVA + post-test de Student-Newman-Keuls) se aprecia que las hembras del

grupo CB han bebido algo más que las de los grupos ES y EB pero, sabemos, los animales

que recibieron EtOH bebieron espontáneamente menos que las que no y, por otro lado, no

hubo diferencias entre el consumo de CB con respecto a CS. Más aún, no hubo diferencias

significativas entre el consumo de líquido de los animales que, habiendo tomado EtOH,

recibieron o no buspirona (ES y EB). De todo ello es legítimo suponer que en este

protocolo experimental la buspirona no ha causado efectos sobre el consumo de bebida en

general, o de EtOH en particular, y ello a pesar de que existen trabajos que relacionan la

administración de buspirona con una merma en el consumo de EtOH por parte tanto de

humanos alcohólicos (Fawcett et al., 2000; Lovinger, 1999) como de ratas expuestas al

EtOH (Hedlund y Wahlström, 1996; Kostowski y Dyr, 1992).

Por último, sobre el ingreso de calorías diariamente durante la gestación (Figs. 55 y 56;

Anexo VI, Tabla 2), de los resultados obtenidos y ya expuestos, tampoco se puede decir que

la buspirona haya tenido algún efecto apreciable.

En los protocolos de exposición al EtOH durante la adolescencia y durante la adultez no

hay nada llamativo que se pueda agregar a lo expuesto en las respectivas secciones de los

resultados más allá de que todos los parámetros que aquí se consideran no se alteraron con

respecto a los de los respectivos animales Control (o Control/R, según el caso).

225
Discusión

V.1.2. Consumo de etanol y alcoholemias:

Hemos considerado ya lo que sucedió en los distintos protocolos de exposición al EtOH

con el alimento, la bebida y las calorías de ellos derivados. Ahora bien, ¿qué sucedió con

el consumo de EtOH –considerado en sí mismo– entre uno y otro períodos de exposición

pregestacional y gestacional en los protocolos de EPE (sin y con prevención del daño)?

Aumentó 11,3% si se toma en cuenta el consumo por unidad de peso corporal, y un

importante 33,25% si se considera a las hembras individualmente. Sin embargo, el

porcentaje del VCT diario que representó exclusivamente el EtOH entre uno y otro

períodos de exposición aumentó sólo 9,65% (20,61% a 22,60%, respectivamente).

La administración de buspirona en el segundo de los protocolos de EPE, ¿indujo algún

efectos sobre el consumo de EtOH puro? A semejanza de lo dicho acerca de la acción de

la buspirona sobre el consumo de bebida, nada se puede decir al respecto. La buspirona

parece no haber tenido efectos estadísticamente significativos (Figs. 52-54) y la diferencia

de consumo de EtOH que se aprecia en la Fig. 53 entre los grupos ES y EB no se debe a la

buspirona en sí sino, simplemente a la distinta manera de considerar el consumo (por

unidad de peso corporal o individualmente de cada animal; cfr. la Fig. 53 con la 52).

Independientemente de estos hechos, veamos cuál fue el nivel de consumo diario de

EtOH de los animales (hembras gestantes o no, y machos) (Tabla 11).

Tal como era de esperar, los animales que más EtOH consumieron diariamente fueron

los machos adultos y adolescentes. Estos animales exhibieron no sólo el mayor consumo

sino también el rango de consumo más amplio y el mayor nivel máximo. En comparación,

las hembras bebieron menos EtOH que los machos, estuvieran preñadas o no. Las hembras,

226
Discusión

consumieron más EtOH durante la gestación en concordancia con el mayor consumo de

bebida. Por último, a pesar de lo que se observa en el cuadro (véanse más arriba las

aclaraciones pertinentes) las hembras de los grupos ES y EB del protocolo de EPE con

prevención del daño no difirieron entre sí en el consumo de EtOH gestacional.

Tabla 11. Consumo de EtOH por parte de los animales de experimentación en


cada uno de los protocolos de este trabajo (valores en g/kg/d):

Protocolo Sexo M edia DE Rango

EPE sin prevención


- exposición pregestacional 5,47 1,11 3,805 - 8,065
- exposición gestacional 6,09 0,53 5,323 - 7,126
Hembras
EPE con prevención (gest.)
- ES 5,85 0,69 4,53 - 7,11
- EB 6,51 0,71 5,63 - 8,49

Adolescentes y adultos Machos 6,997 1,68 4,52 - 9,27

Los consumos observados en nuestros protocolos están en relación con los niveles de

consumo que han observado otros investigadores utilizando igual método de exposición al

EtOH.4 A modo de comparación, digamos que si un hombre adulto de 1,70 m de estatura

y 70 kg de peso bebiera en un sólo día 3,805-9,27 g/kg de EtOH, estaría bebiendo el

equivalente a 3820-9303 ml de cerveza (de 5,5º), ó a 1750-4264 ml de vino (de 12º) ó a

525-1279 ml de whisky (de 40º). Ahora bien, este trabajo ha versado, principalmente, sobre

los efectos del AMF, por lo que, extrapolados ahora estos niveles al consumo que

correspondería a una mujer de 1,60 m de estatura y 55 kg de peso corporal, estos valores

4
Cfr. el Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno) y especialmente lo dicho en los puntos VII.5.1. (Administración en el agua de bebida) y VII.5.5
(Administración por dieta líquida).

227
Discusión

equivaldrían a 3002-7309 ml de cerveza, ó 1375-3350 ml de vino, ó 412-1005 ml de

whisky. Siempre diariamente durante todo el embarazo. Nadie diría, en presencia de una

tal hipotética mujer, que estos niveles de consumo sean bajos. Y posiblemente no

determinarían alcoholemias bajas en las mujeres. Sin embargo, en nuestras ratas, las

alcoholemias a las que dan lugar estos niveles de consumo sí son bajas. Recuérdese

entonces aquí que las ratas tienen una velocidad de metabolización del EtOH que es de 2-3

veces mayor que la que poseemos los humanos (300 versus 100-150 mg/kg/h).5

Especulemos un poco más y supongamos que, para compensar las velocidades de

metabolización, le administramos a nuestra hipotética mujer 2-3 veces menos EtOH en cada

uno de los tipos de bebidas. Las cifras anteriores se convertirían en alrededor de 1000-3654

ml de cerveza, ó 458-1675 ml de vino, ó 137-501 ml de whisky. Bebidas estas cantidades

a lo largo de todo un día, quizás sí podría decir ahora, más de una mujer alcohólica, que

estos son niveles de consumo bajo. Más adelante analizaremos lo que, en las ratas crías de

madres alcohólicas producen estos bajos niveles de alcoholemia. Un daño desde ningún

punto de vista despreciable.

Hablemos ahora entonces de las alcoholemias medidas en las ratas de los distintos

protocolos. ¿Por qué decimos que son bajos niveles de alcoholemia? Porque las

alcoholemias en el rango de 15-25mg/dl (o, lo que es lo mismo, 3,25-5,42 mM o, en

unidades más frecuentemente usadas en el ámbito legal, 0,15-0,25 g/l) caen dentro de lo

que, en las alcoholizaciones agudas, se denomina período subclínico.6 Es decir, no es, en

la práctica, notable para un observador externo y, muy posiblemente, tampoco por el mismo

5
Cfr. sección I.3.1 (Farmacocinética) en la Introducción.
6
Cfr. la Tabla 2 (Relación de los distintos niveles de alcoholemia con las manifestaciones cognitivo-
conductuales observables en el ser humano agudamente intoxicado) en la subsección I.3.5. de la
Introducción.

228
Discusión

sujeto alcoholizado. Seamos aún más gráficos: en los términos de la hoy vigente Ley de

Tránsito Nº 24.449/94 de la Nación Argentina, nuestras ratas, en cualquier momento,

podrían haber conducido automóviles (de haber podido, sabido y querido) ya que la

alcoholemia máxima permitida para ello es de 500 mg/l (= 50 mg/dl). En más de una

ocasión podrían, incluso, haber conducido motocicletas (límite máximo: 200 mg/l). Más

aún, hemos visto que nuestras ratas hembras o machos; adultas, adolescentes o infantes;

preñadas o no, en ningún momento mostraron signos conductuales de intoxicación aguda

cuando fueron evaluadas con las escalas de Nixon y Crews (2004) y Slawecki (2002). En

ambas escalas, siempre puntuaron nivel 0 (cero).7 Igual sucedió al retirar bruscamente el

EtOH cuando se las evaluó en busca de signos de abstinencia con la escala de Penland et

al. (2001).

Todos los motivos anteriores de consuno son los que permiten afirmar taxativamente que

las alcoholemias fueron bajas más allá aún de las propias mediciones realizadas en el

plasma de los animales.

Ahora bien, otros investigadores han establecido previamente, por medios

experimentales, que la concentración plasmática pico (alcoholemia pico) alcanzada tras

la ingesta materna de EtOH es un factor crítico en la determinación del daño cerebral

producido en el feto. Al mismo tiempo es su principal predictor, es decir, a mayores

alcoholemias, y mantenidas por mayor tiempo, mayor daño cerebral (Pierce y West, 1986).

Del mismo modo, el nivel de alcoholemia que se alcance, en comparación con la dosis total

de EtOH consumida (o administrada a los animales de experimentación), es un indicador

más preciso del daño tisular inducido. Estos factores se deben, nuevamente, a las

7
Cfr. subsección III.2.4. (Evaluación conductual de la intoxicación y la abstinencia) en la sección de
Materiales y Métodos.

229
Discusión

diferencias farmacocinéticas interindividuales e interespecies (Bonthius et al., 1988; Livy

et al., 2003).

En cuanto a las alcoholemias necesarias para inducir displasias corticales por

neurodegeneración apoptótica, ha de ser necesario que los niveles de alcoholemia se

mantengan por sobre los 200 mg/dl durante más de 8 horas al día en ratas de edad P7

(Ikonomidou et al., 2000). Prenatalmente, por otro lado, con alcoholemias de niveles algo

menores (171 mg/dl; pero siempre altas en comparación con las obtenidas en nuestro

trabajo) se han observado alteraciones importantes en la cantidad de los Nb generados en

las regiones corticales, un retraso y a la vez extensión del período de generación de los Nb

en la CC al tiempo que se redujo (al medirlas en la CC adulta) la cantidad total de neuronas

con el mismo momento de origen; quizás más importante aún, se alteró la distribución

intracortical de las neuronas generadas en un día particular, esto es, su localización resultó

alterada (Miller, 1986). Más abajo se verá que algo similar se encontró en nuestros

experimentos.

En ratones adultos se ha visto que bajos niveles de alcoholemia (15-21 mg/dl) son ya

capaces de inducir disminuciones de la neurogénesis en el giro dentado de la formación del

hipocampo, alteraciones que son reversibles por el simple ejercicio físico (Crews et al.,

2004). Prenatalmente, también en ratones, las alcoholemias bajas a moderadas (11,3-65

mg/dl y 44,3-142,7 mg/dl) son capaces de provocar disrafias del tubo neural (alteraciones

del cierre) tanto en la placa del piso como en la placa del techo (Zhou et al., 2003).

Por lo tanto, se ve claramente que las alcoholemias bajas si bien no inducen en los

animales de experimentación los catastróficos cuadros neuropatológicos que se observan

en lo niños con el FAS completo (esquizencefalia, holoprosencefalia) sí son capaces de

230
Discusión

provocar las alteraciones morfológicas macro y microscópicas del desarrollo del SNC

propias de los ARND. Luego veremos que, de hecho, en nuestros experimentos se

produjeron displasias corticales sutiles.

V.1.3. Variaciones de peso:

La medición seriada del peso corporal de los animales sometidos, a cualquier edad, a la

exposición crónica al EtOH es uno de los principales parámetros que permiten evaluar el

impacto global de la intoxicación sobre la salud del animal. Si un animal expuesto

crónicamente al EtOH no ve modificado su peso (o, mejor, lo incrementa) es esto un signo

de buena salud global. Es fácil imaginar que este parámetro general de salud será de más

frecuente alteración en aquellos animales que ven fácilmente alterada su evolución ponderal

ante muchas noxas. Es lo que, día a día, hacen los pediatras al evaluar el peso de los recién

nacidos y de los niños mientras crecen.

Por otro lado, hemos visto que, ya con Rouquette (1957), uno de los tres elementos

semiológicos del FAS en cualquier sistema diagnóstico de los FASD es la evolución del

peso pre- y postnatalmente.8 Por ello es que en este trabajo se dedico especial cuidado a su

medición evolutiva, día a día desde antes de la gestación hasta 90 días luego del parto (154

días, o más).

En los protocolos de EPE la evolución del peso materno durante el período de

exposición pregestacional fue paralelo para ambos grupos de tratamiento (Figs. 30 y 31;

8
Cfr. Anexo I (Síndrome Alcohólico Fetal (FAS) y trastornos asociados. Criterios diagnósticos).

231
Discusión

Anexo VI, Tabla 1). Sin embargo, el aumento de peso fue mayor, y significativo, para las

hembras Control; para las hembras expuestas al EtOH, en tanto, si bien al finalizar este

período no difirieron estadísticamente del peso de las Control, mostraron un aumento que,

a diferencia del de las Control, no fue significativo con respecto al peso de inicio (Fig. 30;

Anexo VI, Tabla 1). Este hecho está indicando que, por efecto del consumo obligado de

EtOH, las hembras de este grupo mostraron un leve efecto anorexígeno. Sin embargo,

durante la gestación las hembras de ambos grupos mostraron un aumento de peso armónico

y en todo paralelo (Fig. 30, y 31 especialmente; Anexo VI, Tabla 1) hecho que habla a las

claras de la salud general de esas preñeces. Tras el parto y la lógica brusca disminución del

peso por la eliminación del feto, las membranas ovulares y los líquidos correspondientes,

las hembras del grupo EtOH retomaron el aumento de peso con una pendiente levemente

mayor que las del grupo Control, acercándose al peso de estas hacia el final de la lactancia

(Figs. 30 y 31) incluso a pesar de que estaban dando de mamar a sus crías. Nuevamente,

esto habla de la salud general de ambos grupos.

En el protocolo de EPE con prevención del daño, se puede apreciar que la evolución del

peso gestacional de las hembras de los 4 grupos de tratamiento fue en todo paralelo (Fig.

57, de mejor apreciación en la curva de la Fig. 58; Anexo VI, Tabla 2). Se observa también

que ni la evolución del peso ni los pesos finales se vieron alterados por la administración

de buspirona o solución salina por vía sc a las hembras de este protocolo entre los días E13-

E20. Nuevamente, luego del brusco descenso de peso postparto, los cuatro grupos de

hembras que amamantaron a sus crías (esta vez, y a diferencia del protocolo anterior) sin

recibir EtOH, aumentaron de peso también de manera armónica y comparable entre sí (Fig.

58).

232
Discusión

En los animales adolescentes sometidos a 6 semanas de exposición al EtOH con

posterior abstinencia de 10 semanas, y en los animales adultos expuestos crónicamente por

6 semanas, se observaron aumentos de peso en todo comparables entre los grupos de

animales control (Control y Control/R) y los tratados (EtOH y EtOH/R). A este respecto

véase la Fig. 72 y consúltense las subsecciones IV.3.1. y IV.4.1. de los Resultados.

Nuevamente, esto es indicador fiable de la salud general de los animales sometidos a

experimentación, independientemente del grupo de tratamiento al que hubieran pertenecido,

y que el EtOH no ocasionó efectos mayores en lo relativo a este parámetro.

V.1.4. Efectos generales de la exposición prenatal al etanol sobre la descendencia:

La salud de las crías habidas de una madre es indicador certísimo de la corrección

general de sus respectivas gestaciones.

En ambos protocolos de EPE la duración de la gestación ha sido la misma y normal: 22

días. Las camadas habidas de los distintos grupos de tratamiento en uno y otro protocolos

fueron de tamaños estadísticamente equivalentes (Fig. 32 y 59; Anexo VI, Tablas 1 y2). El

peso al nacer de estas crías (parámetro importantísimo de salud fetal) tampoco difirió

estadísticamente aunque se observó una leve tendencia a ser menor el de las crías de las

madres del grupo EB en el protocolo de EPE con prevención del daño (algo más notable

en las crías hembras; Fig. 59 y Anexo VI, Tabla 2). Si bien estadísticamente las diferencias

de peso no fueron significativas, nótese que el peso al nacer de las crías machos y hembras,

en este protocolo, presenta el mismo perfíl, con una leve disminución no significativa

233
Discusión

(reitero a riesgo de resultar repetitivo en demasía) paras los/las hijos/as de los grupos que

recibieron buspirona. Naturalmente, deberían realizarse experimentos adicionales con la

finalidad de determinar si esta aparente tendencia en la disminución del peso de las crías

continúa observándose en la descendencia de aquellas madres que reciben buspirona

durante la gestación (independientemente de que hubieran bebido o no EtOH). ¿Tendrá

algún efecto la buspirona sobre el peso de las crías al nacer?

La cantidad de machos nacidos por cada hembra nacida parece haber sido levemente

menor para las madres sometidas a EPE. Este es un efecto que ya se ha observado en

humanos: los fetos masculinos son más sensibles que los femeninos a los efectos

intrauterinos del EtOH y terminan en aborto más frecuentemente lo que podría causar una

menor tasa de natalidad de varones entre los hijos de madres alcohólicas (Spohr y

Steinhausen, 1996). Ahora bien, en el EPE sin prevención del daño, aunque

estadísticamente no fue significativo, se observó una tendencia a la presencia del mismo

fenómeno (ver subsección IV.1.1.6. de la sección de Resultados). En el protocolo de EPE

con prevención del daño por administración de buspirona, aunque las diferencias fueron

(otra vez) no significativas, parece haber habido una reversión de la relación

machos/hembra con un aumento relativo de los machos en el grupo EB con respecto al ES

(Fig. 59 y Anexo VI, Tabla 2). Al igual que en el caso del peso, es necesario aumentar la

cantidad de sujetos con experimentos nuevos para ver si la tendencia se mantiene y la

fuerza estadística se incrementa. Mientras tanto, cabe preguntarse: ¿tendrá algún/os efecto/s

la buspirona sobre el sexo de las crías nacidas tras la EPE? ¿Prevendrá la buspirona el

aborto de fetos masculinos que llegan así a término?

Tras nacer, el peso postnatal de las crías en ambos protocolos de EPE fue aumentando

234
Discusión

en forma paralela y comparable, siendo no significativamente distintos en ningún punto

temporal desde P0 hasta P21 en el protocolo de EPE sin prevención del daño (Fig. 33) y

desde P0 hasta P88 en el de prevención del daño con buspirona (Fig. 60). Es importante

destacar, en este último caso que, a pesar de las diferencias de tratamiento prenatales, la

administración de buspirona (tampoco la de EtOH) no parece haber alterado la evolución

ponderal postnatal incluso hasta bien entrada la adultez de las crías. Otro hecho más que

habla en favor de la salud general de estas crías.

Se sabe que el consumo de EtOH por parte de madres que están en período de

amamantamiento puede interferir con la lactancia e inducir trastornos nutricionales en las

crías lactantes (Heil y Subramanian, 1988; Little et al., 1989; Mennella, 2001; Mennellay

Beaucham, 1991). Sin embargo, en el protocolo de EPE sin prevención del daño no hubo

diferencias en la ganancia de peso durante el período postnatal en el que las crías recibieron

EtOH a través de la leche materna hasta el momento del destete y fijación (P21),

comparado con el de las crías Control (Fig. 33). De este modo, la ingesta por vía oral, en

la leche materna, de bajas concentraciones de EtOH9 no indujo ningún daño físico mayor.

En fin que, de todo lo dicho, sumado a que en ningún caso se observó la presencia de

malformaciones orgánicas ni de microcefalia, se desprende claramente que el presente es

un modelo válido, en ratas, de los ARND observados en los seres humanos.

9
Cfr. subsección I.3.3. (Farmacocinética materno-fetal y en el recién nacido).

235
Discusión

V.2. Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung:

V.2.1. Hallazgos con el Nissl en la corteza frontal:

La coloración de Nissl con el azul de toluidina es un procedimiento particularmente a

propósito para escudriñar las células del tejido nervioso (colorea al 100% de las células

presentes) y “la herramienta fundamental para estudiar la citoarquitectura cortical”10. Por

ello se prefirió, por sobre otras técnicas más modernas pero menos rendidoras, “al sencillo

cuanto perfecto método imaginado por este sabio”11.

Remito al lector a la subsección IV.1.2. para la descripción detallada de las alteraciones

que se encontraron en la CxF de las crías macho de edad P21 sometidas a EPE sin

prevención del daño. Aquí solamente me atendré al análisis de su posible significación.

Buscando lo que estas alteradas neuronas piramidales pudieran significar me topé con

literatura reciente que les adscribe un origen, en general, artefactual. Serían originadas por

la mala manipulación de los cerebros tras ser fijados, por una fijación defectuosa o

retrasada (extenso tiempo de autólisis postmortem). Así, en dos trabajos recientes, Bernard

Jortner (Jortner, 2005, 2006) se alinea entre los que taxativamente afirman que las neuronas

“oscuras” (como las llama este investigador) son simples artefactos de técnica. Entre sus

referencias cita 5 veces a Jan Cammermeryer –a quien sigue en sus ideas– y previene sobre

la mala interpretación de estas neuronas en los estudios de neurotoxicología (mala noticia,

entonces, para nuestros hallazgos, si esto fuera así). Muestra una muy ilustrativa fotografía

de neuronas alteradas en la capa V de la corteza motora de ratas intoxicadas

10
Cfr. Outes, 1981, pág. 43.
11
Cfr. Ramón Cajal, 1899; tomo I, pág. 118.

236
Discusión

transdérmicamente con un pesticida (la N,N-dietil m-toluamida o DEET). Adscribe la

apariencia de estas neuronas a la mala fijación y manipulación de los cerebros, en mi

opinión, por qué, llamativamente, la lesión se observa en la capa V o en la III y no en todas

las capas de la corteza bajo la zona “lesionada”.12

En 1975, Ebel Ebels, de la Universidad de Gröningen, en Holanda (Ebels, 1975) observó

fácilmente células de Purkinj oscuras en el cerebelo de ratas jóvenes, muertas por

decapitación; eran animales de edad P16 y mayores. Sin embargo, en animales más jóvenes

(de P0-P12 días de edad) a esas neuronas oscuras, no las observó nunca. El autor concuerda

con Cammermeyer y otros en que las células oscuras son un artefacto evitable. Pero sus

hallazgos le sugieren, sin embargo, que la posibilidad de ocurrencia de este tipo de

artefacto dependa del estado madurativo de la neurona en cuestión. Luego veremos que

esto puede estar relacionado con el citoesqueleto, los Nfs más específicamente, y en

particular con la forma como cada uno de los tipos de proteínas que conforman a los Nf (68,

160 y 200) se van agregando a estos según va madurando la neurona. Pero vayamos ahora

al trabajo de Jan Cammermeyer.

Este neuropatólogo belga mudado a los EUA, en una serie de artículos muy citados, pero

principalemente en uno de 1961 (Cammermeyer, 1961)13 pretendió establecer que las

neuronas oscuras son simples artefactos de técnica. En este artículo, una revisión, hace gala

de erudición citando 165 referencias bibliográficas entre las cuales a muchos grandes de la

neurohistología y neuropatología (entre ellos Cajal, Nissl, von Economo o Spielmeyer), a

12
Recordemos al pasar que Jortner es profesor de patología en el Colegio Regional de Medicina Veterinaria
de Virginia-Maryland, en EUA (¡!). Y no menciona para nada a Gallyas (véase más abajo), en sus trabajos.
Parecería no haberlo leído.
13
El artículo lleva el sugestivo título “La importancia de evitar las neuronas «oscuras» en neuropatología
experimental” (Cammermeyer, 1961). Se comprenderá mi desazón al leer su título.

237
Discusión

la vez que descree de los hallazgos de

todos ellos (¡!). Realizó una extensa

serie de experimentos con los que creyó

demostrar que estas neuronas son

artefactos por mala fijación14 o que son

producto de la mala manipulación de las


Figura 96. Figuras 1C (izquierda) y 2C (derecha) correspondientes al
trab ajo de 1961 de Jan C am m erm eyer en el que m uestra neuronas
muestras de cerebro antes o después de oscuras (d), ne uron as de m orfología no rm al (n) al lad o d e a qu ellas,
y un oligoden drocito (o) “hinchado” (sw ollen) según él, p ero d el q ue
se ap recia claram ente que em ite una d end rita ap ical en sacacorcho
p or lo q ue, en rig or d e verd ad , ha d e adscrib írsela com o neurona y no
su extracción del cráneo. co m o oligoden drocito. A la d erech a, neu ronas oscuras c on clara
d isp osición encolum nad a y con el eje m ayor alterado en su d irección.
Tom ado y m odificado de C am m erm eyer, 1961.
Inexplicablemente para un

neuropatólogo, confunde una neurona colapsada e hipercromática (idéntica a las halladas

en nuestro trabajo) con un oligodendrocito “hinchado” (¡!) y como tal lo señala en su figura

1C (Fig. 96). A pesar de que muestra excelentes fotografías (como la de su figura 2C)

tampoco él explica por qué estas células artefactuales se ubican, extraña y llamativamente,

en columnas, exactamente del mismo modo en que las hemos visto nosotros (Fig. 96).15 En

su erudición, no obstante, hace un aporte enorme: da la más completa lista de sinónimos16

de esta alteración morfológica de las neuronas y discute acerca de muchas de ellas

14
Usó fijadores en soluciones tan ácidas como pH 1,5-4,5 que alteran la carga de las proteínas citosólicas,
según sabemos hoy pero que bien podría fácilmente haber intuido entonces.
15
Es muy posible que Cammermeyer haya desconocido, al momento de escribir su trabajo, aquel en el que
Mountcastle describió la organización columnar de las neuronas en la corteza somatosensorial del gato
(Mountcastle, 1957).
16
Sinonimia recopilada por Cammermeyer (Cammermeyer, 1961) (entre paréntesis el autor y año de la
primera descripción): célula oscura o cromófila (Koneff, 1886, 1887); células cromófilas, osmiófilas o
argirófilas (Kotlarewsky, 1887); célula picnomorfa (Nissl, 1895); célula retraída y oscura (Ramón y Cajal,
1909); célula cortical contraída, célula retraída del ganglio sensorial (Ramón y Cajal, 1913); célula contraída
o retraída, contracción o retracción simple, célula ganglionar esclerótica (Spielmeyer, 1922); célula
hipercromática (Miskolczy, 1925); célula especial del lóbulo del cíngulo y del lóbulo de la ínsula (von
Economo, 1925, 1926); célula homogenea retraída (Gildea y Cobb, 1930, 1931); célula pescado (Stern,
1936); célula de Purkinje tipo II (Hydén, 1943); cromofilia, hipercromasia, cromofilia extrema, cromofilia
de actividad incialmente aumentada, cromofilia de actividad disminuida (Einarson, 1945, 1946); células
ganglionares multiangulares sensibles a la formalina (Bacsich y W iburn, 1953); célula siderófila (Hägqvist,
1958); reacción axonal primaria (Grünthal y W alther-Büel, 1960).

238
Discusión

(desdeñándolas a todas por erróneas). Pero

por esta enumeración se puede seguir la

“genealogía”, si se quiere, de esta

alteración.

Existe una extensa serie de trabajos,

tanto argentinos como extranjeros, que

documentaron, desde hace más de 100

años, la existencia de este tipo de

alteraciones neuronales ante distintos tipos

de circunstancias patológicas, tóxicas o no.

Veamos algunas de ellas.

Las mismas alteraciones estructurales

que nosotros hemos encontrado en el soma

de las neuronas, o la disposición en F igura 97. A lteraciones en sacacorcho observadas: arriba , p o r


Tagliaferro et al. (2006) en las dendritas apicales (IC Q p ara M A P -
2) de las neuronas piram idales del área C A 1 el H ipp de ratas
tratadas crónicam ente con un ag onista d e los receptores
sacacorcho de las dendritas apicales de las cannabinoides; abajo a la izquierda, axones en sacacorcho (IC Q
p ara N f-200) ob servados p o r R am os et al. (2000) en el Strt d e
ra ta s, 1 día d espués de la finalización de u n tratam ien to
neuronas piramidales de la CC, o de los depleción crónica de la 5-H T utilizando P C P A ; abajo a la derecha,
neurona citom egálica nN O S -ir observada por Loidl et al. (1997)
en e l S trt de una rata d e 6 m eses de e dad so m etida a a sfixia
perin ata l.
axones en los estriosomas del Strt o las

alteraciones nucleares visibles al óptico, las han constatado también, en nuestro medio: i)

Tagliaferro et al. (2006), han descripto, con técnicas de ICQ para la MAP-2, cambios

estructurales similares en las dendritas apicales (que transcurren por el stratum radiatum)

de las neuronas piramidales del área CA1 del Hipp en experimentos de exposición crónica

de ratas Wistar a un agonista de los receptores cannabinoides (el WIN-55,212-2) (Fig. 97);

ii) Ramos et al. (2000), tras la exposición crónica de ratas Wistar a una droga (la p-

239
Discusión

clorofenilalanina, PCPA) que produce la depleción de 5-HT por inhibición irreversible de

la TPH, han mostrado también alteraciones estructurales del citoesqueleto (con ICQ para

los Nf-200) en los axones que corren por

los estriosomas del Strt (Fig. 97); iii) Loidl

et al. (1997), tras un tratamiento de asfixia

perinatal a ratas Wistar, han mostrado,

también en el Strt y en la CxF, cambios

morfológicos similares en las dendritas de

neuronas citomegálicas que muestran

actividad de NADPH-diaforasa e

inmunorreactividad para la nNOS (Fig.

97); iv) Benítez et al. (1996), esta vez

desde el terreno de la clínica

neuropsiquiátrica, mostraron también estos

mismos cambios en neuronas agrupadas en

“nidos” en las capas III y V de la corteza

órbitofrontal anterior de un sujeto de 30

años de edad17 (además de estas

alteraciones, M.G. tenía un cuerpo calloso Figu ra 98. M icrosco pía óp tica de las capas III y V de la co rteza
órbitofrontal anterior del cerebro de M .G . A rriba, grupo neuronal
anorm al con d isp osición en islote; tod as las neuronas con
d en dritas ap icales en sacaco rch o. E n m e dio , n eu ro n a s
adelgazado notoriamente en su porción ano rm ales en la capa V de la m ism a región , algu na s no rm ales y
otras con la m ism a alteración. A bajo, nótese la dendrita apical en
sacacorcho (p unta de flecha neg ra) en una neurona q ue
posterior)18 (Fig. 98); v) más atrás en el co nserva u n núcleo de a sp ec to aún norm al co n nucléo lo eviden te
sim ilar a los nuestros. E sta neuro na, seguram ente , era to davía
vital al m om ento de m orir M .G . M odificado de B enítez et al., 1996.

17
M.G., alias “La Iguana”, un psicópata grave, antisocial, ladrón y asesino. Murió al intentar escapar de una
persecución policial.
18
Exactamente igual que el cuerpo calloso de Ángela (cfr. en la subsección I.1. la Fig. 1A).

240
Discusión

tiempo, Jacinto Carlos Orlando (Orlando, 1952), en su tesis doctoral apadrinada por Braulio

Moyano, mostró con el Nissl, neuronas piramidales con esclerosis y atrofia celular en las

capas III, V y VI de la CxF de sujetos afectados por la enfermedad de Marchiafava-Bignami

(la degeneración sistemática de las fibras comisurales que se observa en el alcoholismo

crónico) (Fig. 99); vi) Christfried Jakob, el maestro e iniciador de la escuela

neuropsiquiátrica germano-argentina, en un estudio anatomopatológico realizado en

cerebros de esquizofrénicos (Jakob y Pedace, 1938) mostró, también en la CxF, “focos de

desintegración lacunar” con ausencia total de pirámides corticales y, aunque no lo menciona

explícitamente, en la periferia de estas lagunas de desintegración se observan pirámides

claramente retraídas y con dendritas en sacacorcho (Fig. 99); vii) cinco años antes, Braulio

A. Moyano en su tesis doctoral (Moyano, 1933), apadrinada por su maestro, Ch. Jakob,

mostró neuronas piramidales en todo similares en la capa III de la CC de pacientes

dementes (Fig. 99). Moyano, en su descripción de la atrofia de Pick, hace explícito que

sigue la de Spielmeyer de 1922 (véase más abajo; Spielmeyer denominaba Zellschrumpfung

a esta alteración).19 Dice Moyano:20 “Las células presentan los grados sucesivos de la atrofia

esclerótica (Zellschrumpfung) retracción de la célula, contornos rígidos, dendritas

flexuosas, el núcleo opaco, la sustancia cromática (del citoplasma) forma una masa

compacta, amorfa” (las itálicas son mías). En otro lugar (Moyano, 1954), tras mostrar la

misma fotomicrografía, afirma que esta esclerosis celular es un “proceso crónico, se

caracteriza por la retracción y oscurecimiento de la célula, los senderos claros que dejaban

entre sí los grumos cromáticos desaparecen, el núcleo se hace picnótico: proceso

19
Una de las descripciones que, entre otras, tildara de inexacta Cammermeyer en 1961.
20
Moyano, 1933; pp. 41-42.

241
Discusión

irreparable, lleva a la destrucción lenta

celular” (las itálicas son mías).21

Entre los de la literatura internacional, se

pueden consignar los siguientes trabajos

antecedentes que muestran a estas neuronas

“oscuras” y a las dendritas en sacacorcho a

ellas asociadas en la casi totalidad de los

casos: i) en modelos experimentales de

hipoxia-isquemia cerebral con posterior

reperfusión (Iizuka et al., 1989; Kövesdi et al.,

2007; Nedergaard, 1987; Onizuka et al.,

1996); ii) modelos de traumatismo encéfalo-

craneano en ratas (Gallyas et al., 2006a;

Ooigawa et al., 2006); iii) un modelo de

esclerosis lateral amiotrófica en ratas

transgénicas (Rafalowska et al., 2006); iv) un

modelo de enfermedad de Huntington en

ratones R6/2 transgénicos (Petersén et al.,

2005); v) un modelo de enfermedad de


F ig u ra 9 9 . N e u r o n a s e s c l e r ó tic a s y a tró fic a s
(zellschrum p fung). A rriba, deta lle de la figura 20 de la te sis
Alzheimer en ratones transgénicos que de O rlando sobre la enferm edad de M archiafava-B ignam i en
los alcoholista s cró nicos. E n m edio, el desierto lacunar en la
corteza fro nta l de paciente s esquizofrénicos según lo
m ostraran Jakoby P ed ace. A bajo, atrofia celular en la
sobreexpresan la presenilina-1 humana (Chui dem encia de P ick ta l com o lo expusiera M oyano en su te sis
d octoral. En las tres fotos, las flechas y p untas d e flecha
(ausentes en los originales) señalan a las neuronas
et al., 1999); vi) un modelo de peritonitis fecal alteradas. T om ado y m od ificad o d e O rland o, 1952; J ak ob y
P edace, 1938; y M oyano, 1933.

21
Moyano, 1954; t. II, pág. 23. Veremos luego, en la explicación que da Gallyas en 1992 y 2004 a estos
fenómenos, que afirma lo mismo que decían ya Moyano y Spielmeyer 60 a 80 años antes.

242
Discusión

en cerdos (Papadopoulos et al., 1999); vii) un modelo de dolor neuropático crónico por

constricción nerviosa periférica (Mayer et al., 1999); viii) un modelo de injuria neuronal

leve (por nado forzado) o severa (por inyección local de ácido iboténico en el hipocampo)

(Ishida et al., 2004); ix) un modelo de neuroexcitoxicidad por aplicación iontoforética de

ácido kaínico en la amígdala de ratas (Hajnal et al., 1997); x) en modelos de lesión por

distintos tipos de descargas eléctricas (Islam et al., 1994; Zsombok et al., 2005); xi) en un

trabajo realizado en humanos viejos normales, en el que se estudió la agregación

acumulativa de la proteína J (otro tipo de MAP, axónica predominantemente) de manera

más prominente en las capas II-IV de las CxF y entorrinal (Yang et al., 2005) y en otro

trabajo, en el contexto de estudios de infarto cerebral en ratas, se ha encontrado en neuronas

piramidales de las capas III y V de la CxF de ratas viejas normales (20 meses edad) que

algunas dendritas apicales tenían una estructura claramente en sacacorcho (Schroeder et al.,

2003).22

También destacable es la figura 16 del Lehrbuch der Psychiatrie de Eugen Bleuler,23

quien muestra, bajo el título de degeneración fibrilar de Alzheimer (¡¿?!), dos neuronas al

Bielchowski con prolongaciones que adoptan un “aspecto serpenteante o parecido al

alambre” (Bleuler, 1967). No podía ser de otra forma, y también don Santiago Ramón y

Cajal muestra alteraciones en todo semejantes, en sacacorcho, en su obra Sobre la

degeneración y regeneración del sistema nervioso (Ramón Cajal, 1913). Finalmente, el

antecedente más remoto, a quién el mismo Cajal cita, es un trabajo de 1898 del belga Jean

22
Cfr. su Fig. 3Db.
23
Eugen Bleuler (1857-1940), el psiquiatra suizo a quien se debe la denominación actual de las
esquizofrenias.

243
Discusión

Demoor (1867-1941) (Demoor, 1898).24 Demoor, al igual

que Cajal y otros, llama a los cambios neuronales que nos

ocupan como “estado neuronal moniliforme” porque el

aspecto que adoptaban en su microscopio las

prolongaciones neuronales afectadas hacía recordar al de

las hifas y pseudohifas de la Candida albicans

(antiguamente llamada Monilia albicans). Además de

haber realizado experiencias en amebas, leucocitos, Figura 100. E stado m oniliform e de las
neuronas. A rrib a, en la corteza cerebral d e
p erros “m orfinizados” (m od ificad o d e
heliozoarios, Actinospaerium, y otros organismos D em oor, 1896) y abajo, neuronas olfatorias
d e ranas som etid as a la acción de la
co ca ína (m odifica do de D em oor, 18 98 ).

inferiores, Demoor obtuvo estas mismas alteraciones en

perros, ranas (Fig. 100) y ratones sometidos a intoxicación con cocaína, alcohol, hidrato de

cloral, cloroformo, electricidad, éter, gas de alumbrado, exponsición al frío, en animales

normales en período de hibernación. También, en humanos, las observó en cerebros de

imbéciles, afectados de “demencia consecutiva”, epilépticos y paralíticos generales.

Más allá de que las teorías explicativas que ensaya han sido dejadas de lado hoy en día

(movimientos ameboideos de las prolongaciones, responsabilidad de estos cambios en el

mecanismo de producción del sueño o del pensamiento) debe reconocérsele a Demoor que

intuyó que este estado de la neurona (también llamado estado perlado de Renaut o

desintegración granular [körnige Zerfall] de Verworn) comenzaba en los apéndices

piriformes de Stefanowska –nuestras espinas dendríticas– y a partir de ellas se propagaba

24
Como siempre, y con muchas otras cosas, debo mi eterno agradecimiento a mi gran amiga Patricia
Tagliaferro quien pudo conseguir para mí (¡en archivo .pdf!) el artículo original de Demoor en la National
Library of Medicine de EUA, por intermedio de la National Institute of Health Library.

244
Discusión

al resto de las dendritas.25

Pero, quizás, la mejor descripción de estas

neuronas, la más clara, se deba a Walther

Spielmeyer (1869-1935), un eminente

neuropatólogo alemán, autor de un famosísimo

texto de neuropatología (Spielmeyer, 1922) en el

que, en su figura 30, muestra una “célula ganglionar

esclerótica con un grueso apéndice sinuoso y

puntiagudo” en un preparado de Nissl (Fig. 101).

Véanse más arriba, la Fig. 34 de esta tesis y Figura 101. C o rre sponde a la figura 30 de la
N europ atolog ía de Sp ielm eyer. V éase la descripción
en el texto.
confróntesela con la de Spielmeyer. Huelgan las

palabras.

Actualmente, existen trabajos que proponen la utilización de técnicas tintoriales

específicas para este tipo de neuronas (también llamadas oscuras o argirófilas por distintos

autores). Algunos de estos colorantes son: i) el fluoro-jade C (Schmued et al., 2005) y ii)

la fucsina ácida-vanadio con contratinción con azul de toluidina o hematoxilina (Victorov

et al., 2000). Además de estos dos últimos métodos, existen también otras técnicas

tintoriales histológicas (todas ellas, impregnaciones argénticas) para poner en evidencia este

tipo de neuronas: el método de la argirofilia III (Gallyas et al., 1990) y la técnica amino-

cupro-argéntica de de Olmos (de Olmos et al., 1994).

25
En la página 231 de su trabajo hay dos frases premonitorias: i) “En la neurona, el estado moniliforme es
una reacción de contracción” (¡!); y ii) “El estudio en profundidad de la fisiología de las espinas o apéndices
piriformes dará probablemente la solución al problema” (¡!). ¡Más de 100 años después seguimos debatiendo
los mismos problemas!. Paradojas de la historia, a pesar de las excelentes descripciones de Demoor, Ernesto
Lugaro (psiquiatra italiano e introductor del término plasticidad en referencia al tejido nervioso) por no
encontrar en sus propios experimentos los mismos hallazgos que Demoor, había tildado a este de cometer
errores en su técnica experimental, ya en 1896 (Demoor, 1898).

245
Discusión

Ferenc Gallyas, un investigador de la Universidad de Pécs, en Hungría, es quien ha dado

una explicación acerca del origen de la morfología de estas neuronas que, a mi modo de

ver, resulta mucho más convincente que las

que postulan el origen artefactual. La “teoría

de la transición de fase gel-a-gel de la

compactación ultraestructural holocelular”,

como él la ha denominado. Dos son los

trabajos en los que adelanta y expone su teoría

(Galllyas et al., 1992, 2004). Permítaseme

transcribir textualmente una traducción mía

de lo que Gallyas postula a fin de evitarme Fi g ura 102. G ráfico q ue intenta exp licar los p rincip ios
energéticos im plicados en la teoría de la tran sición de fase
gel-a-gel de la co m pactación u ltraestructural holocelular d e
G allyas. V er en el texto los d etalles d el p roceso. M od ificad o
disquisiciones más largas. de G allyas, 1992.

“La teoría de la transición de fase gel-a-gel postula que numerosos sitios de unión no
covalente de las proteínas en el “citoplasma acuoso” están involucrados no en mantener su
conformación, tal como se la observa in vitro, sino en acompañar mutuamente la conformación
in vivo de cada una, uniendo iones potasio y adsorbiendo moléculas de agua en múltiples capas
ordenadas. La estructura en gel resultante, que es continua en toda la célula y se ancla a los
elementos ultraestrucuturales “visibles” [las organelas], almacena energía en forma de uniones
no covalentes. Si esta energía libre almacenada se libera en cualquier punto intracelular por
acción de algún tipo de energía de activación exógena, tal energía servirá como energía de
activación para los puntos vecinos (principio del dominó) [Fig. 102]. Si se asume como cierta
la existencia de tal estructura citoplasmática en gel, la compactación ultraestructural de toda
la célula que se ve en las neuronas consiste de dos estadíos, que son los siguientes: una fuerza
física o un proceso patometabólico transmite la energía de activación solamente a un punto en
cada dominio somatodendrítico (estadío inicial) y su ultraestructura deviene compactada en el
próximo estadío. Subsecuentemente, en este punto inicial, el cambio conformacional de las
moléculas proteínicas se acompaña por la liberación de moléculas de agua e iones potasio, y
se propaga por toda la estructura del gel gracias a la liberación de energía libre no covalente
almacenada (fase de propagación). En otros términos, se propaga por todo el gel citoplasmático

246
Discusión

un cambio conformacional cooperativo en las proteinas de la matriz del supuesto gel


citoplasmático. Como resultado final, el gel se encoge, causando que los elementos
ultraestructruales “visibles” [las organelas] se acerquen unos a otros (compactación)
extruyendo a las moléculas de agua y a los iones potasio que son liberados fuera de la célula
a través de numerosos poros no visibles de la membrana plasmática. Teniendo todo esto en
cuenta, es el proceso de propagación el que determina las características morfológicas
intracelulares, independientemente del factor de iniciación. Por otro lado, el proceso de
inciación es, al determinar cuáles son las neuronas que se compactarán, el que juega un papel
importante en delinear el patrón de distribución de las neuronas afectadas”. (Gallyas et al.,
2004) (las itálicas y los agregados entre corchetes son míos).

Nótese que el proceso de propagación que postula Gallyas ya había sido intuido u

observado 100 años antes (Demoor) y que es en las espinas dendríticas donde la MAP-2,

molécula crítica del citoesqueleto y que regula el estado de polimerización de los MTs, se

halla libre y en estrechísima relación molecular con los eventos sinápticos (potenciación

y depresión a largo plazo, comunicación transináptica bidireccional independiente de los

neurotransmisores, acción local de las quinasas y fosfatasas con acción fosforilante y

desfosforilante sobre la MAP-2, etc.).26

En muchos de sus trabajos Gallyas muestra imágenes de microscopía electrónica en las

que se observan procesos astrocitarios perineuronales edematizados, hinchados, y a los que

él interpreta como habiendo absorbido parte del agua extruída de la neurona afectada por

el proceso descripto (es más que factible si se recuerdan las funciones del astrocito como

tampón de potasio extracelular y sus conexiones con los vasos sanguíneos por medio de sus

pies chupadores). Cammermeyer, por otro lado, en su trabajo de 1961, muestra excelentes

imágenes de microscopía óptica de neuronas en proceso de retracción (cfr. sus figuras

26
Cfr. I.5.3.2. (La proteína asociada a los microtúbulos de tipo 2) y la subsección VII.4.4. (Estrucutra de
la proteína asociada a microtúbulos de tipo 2 (MAP-2)) del Anexo IV (Estructura de ciertas proteínas
relevantes al presente trabajo) en esta tesis, y, especialmente, la excelente revisión de Sánchez et al., 2000.

247
Discusión

9B,D,F) con claros y amplios espacios perineuronales del mismo tipo de los que se

observan en la Fig. 50L de este trabajo, marcado por cabezas de flecha blancas. En los

cortes al Nissl, si se observa en detalle a las neuronas más retraídas de la Fig. 34G,H,I, se

puede detectar un delgado halo claro perineuronal refringente, compatible con un delgado

espacio de edema perineuronal.27

Más allá del factor “etiológico” que potencialmente determine el inicio de este proceso

de retracción, una vez que ha comenzado, según Gallyas, el cambio se propaga por toda la

célula (recuérdese a Demoor). Este proceso sería, en definitiva, el modo morfológico de

manifestación de múltiples noxas actuando sobre las neuronas susceptibles. Y el tipo de

aspecto morfológico observado, en sí mismo, no sería más que la traducción visible del

daño a una vía final común. Vía final común que, en virtud de varios elementos que

veremos más adelante, es factible que sea es el citoesqueleto y, como afirma Gallyas en su

artículo de 1992, más específicamente, los Nfs.

Abandonemos por ahora la Zellschrumpfung.

Otro aspecto importante a destacar en esta subsección con respecto a los hallazgos en

los cortes al Nissl en las ratas machos de edad P21 sometidas a EPE, es la presencia (entre

las mismas neuronas afectadas por la Zellschrumpfung) de una célula que tiene todo el

aspecto morfológico de un Nb en migración (Fig. 34C5, marcada con el asterisco). Esta

célula se encontró en la CxF de animales en los que, según hemos visto (Fig. 8 abajo, Fig.

27
Es posible que este espacio perineuronal no se observe tan claramente en los cortes al Nissl de la Fig. 34
porque son, recuérdese, cortes gruesos de vibrátomo, de 50 :m de espesor, que fueron cortados con la
finalidad principal de realizar experimentos de ICQ. Si estos espacios perineuronales estuvieron presentes
alrededor de las neuronas retraídas quizás se hubieran puesto mejor en evidencia con cortes más finos,
incluidos en parafina y realizados con micrótomo.

248
Discusión

11 y subsección I.4.3.5.) ya no debería estar. No es normal hallar un Nb migrando28 en un

animal que habría sido destetado de no haber sido fijado. Pero ténganse en cuenta a este

respecto, varios trabajos previos de otros investigadores que indican que el EtOH, actuando

durante el desarrollo, induce un retraso (delay) general en todos los procesos madurativos

(Miller, 1986, Vallés et al., 1996, 1997). No sería descabellado especular aquí con que el

AMF ha retrasado la migración de algún Nb o que, habiéndolos dañado antes de migrar,

han detenido su migración sin alcanzar a diferenciarse a neuronas.29 De cualquier modo que

hubiera sido, para desentrañar este misterio sería necesario emprender nuevos

experimentos.

Ahora bien, cómo explicar, siquiera tentativamente, las alteraciones observadas en las

neuronas (su Zellschrumpfung) y, particularmente, su especial disposicón.

Hemos visto que en la mayoría de los trabajos sobre las neuronas “oscuras”,

independientemente del tipo de noxa productora, en general, las neuronas afectadas se

ubican paralelamente a la superficie pial en las capas III y V, principalmente, de animales

adultos y, con menor frecuencia, en las capas II-VI (es decir, todo el grosor del derivado de

la original PC). En el trabajo de Benítez et al. (1996) vimos que las neuronas alteradas se

disponían en las capas III y V de la corteza órbitofrontal anterior pero también en islotes

28
No podemos saber, en rigor de verdad, sólo por su aspecto morfológico, si estaba migrando o no; quizás
estaba detenido en su migración. Pero, migrando o no, lo cierto es que es un Nb bipolar. Cfr. las Fig. 34C 5
con la Fig. 9 izquierda. Por otro lado, no pude encontrar ni una célula similar en los animales Control, a pesar
de haber inspeccionado los cortes muy exhaustivamente.
29
Especulemos. Si ese Nb hubiera estado destinado a dar origen a una macroneurona, es evidente que no ha
terminado de migrar radialmente, ya que estas se detienen tras hacer contacto con las cC-R en la ZM/PP. Si,
por otro lado, hubiera estado destinada a dar origen a una microneurona (originada en la eminencia
gangliónica lateral y arribada a la PC tras migrar tangencialmente por la ZI), se detuvo en su migración radial
final y en su diferenciación antes de haber originado una pirámide pequeña o una célula estrellada.

249
Discusión

dentro de esas capas.30 En el trabajo de Jakob y Pedace (1938), en disposición

circunferencial alrededor de desiertos lacunares en la corteza frontal. En nuestro trabajo,

las neuronas con la Zellschrumpfung se dispusieron, claramente, en columnas.

¿Existe algún factor unificador que pueda explicar estas distintas presentaciones

lesionales? En tren de especulación se podría decir que si una hipotética noxa actúa durante

el desarrollo cortical en un momento x, podrían verficarse al menos dos situaciones básicas

en relación a la corticogénesis. Por un lado, si todos los Nb recién generados al momento

de actuación de la noxa se vieran afectados en una región particular, la imagen que uno

esperaría ver en el adulto (en caso de que las celulas migraran finalmente y no murieran por

apoptosis o necrosis) sería la de neuronas dispuestas con una organización laminar (en una

o varias capas) ya que, en principio, habrían migrado todas durante el período de acción del

tóxico. Su localización en cuanto a las particulares áreas corticales se correspondería con

la del particular momento durante el cual se desarrolló tal área (los conocidos períodos

ventana de susceptibilidad particular de cada órgano o región de que habla la

embriología).31

¿Y en el caso de nuestras ratas P21 sometidas a EPE? Si nos atenemos a la veracidad de

30
Sumado esto a la alteración del cuerpo calloso del cerebro de M.G., en todo igual al visto en Ángela (Fig.
1), y que se sabe que puede ser originado por el AMF (Bookstein et al., 2001, 2007; Miller et al., 1999; Paul
et al., 2007), he llegado a preguntarme: M .G. ¿habrá sido hijo de una madre alcohólica? Imposible saberlo
ya.
31
Una noxa, actuando en un determinado momento, puede afectar el desarrollo de determinada área cortical
y no de otras. Por ejemplo, podrá afectar, potencialmente, el área 11 de Brodmann (órbitofrontal); así podría
explicarse lo visto en el caso M.G. de Benítez et al. (1996). O podrá afectar potencialmente las áreas 17, 18
y 19 (occipitopolares); así podría explicarse también la polimicrogiria del lóbulo occipital que se ha
observado en la RM N de Ángela (Fig. 1). Más aún: en virtud de que cada área cortical finaliza su maduración
a distintas edades postnatales, diferentes de la de las otras áreas (recuérdense las áreas mielogenéticas
primordiales, intermediarias y terminales de Flechsig –1896– y la finalización de su mielinización a distintas
edades postnatales), una misma noxa de actuación prenatal podrá manifestarse en su acción en distintos
momentos de la vida del sujeto que la sufrió. Y, según el área afectada, se manifestará en la forma de distintos
cuadros clínicos, a semejanza de lo que ocurre con un epiléptico cuyo foco epileptógeno está en la amígdala
o en el occipital. Misma noxa, mismo mecanismo de daño, distintas manifestaciones neuropsiquiátricas.

250
Discusión

la hipótesis de la unidad radial de Rakic (Rakic, 1988, 2003a) que postula, no sólo que los

Nb postmitóticos migran siguiendo el andamiaje que les proveen las cGR, sino también que

los Nb que migran por una misma fibra radial tienen un orgien clonal (es decir, son

originados por la multiplicación mitótica de la misma cNEp –o de la misma cGR más

adelante en el desarrollo–) (cfr. Fig. 6), y que estos Nb se disponen finalmente en la misma

columna cortical, es factible especular con que la clara disposición columnar lesional

observada en nuestras ratas podría estar indicando que el EtOH, de algún modo, lesionó

leve pero certeramente a un grupo particular de cNEp o cGR (una leve lesión clonal de

células madre). Así, éstas se habrán multiplicado repetidas veces por mitosis, habrán dado

origen a Nb que, tras migrar hacia la PC se dispusieron correctamente32 en las distintas

capas corticales dentro de las mismas columnas. Posteriormente, tras diferenciarse los Nb

a neuronas maduras, tras extender neuritas para establecer circuitos y contactos sinápticos

a la vez que expresaban nuevas proteínas de Nfs para consolidar su citoesqueleto y la forma

neuronal, ha de haberse manifestado la alteración biofísica de que habla Gallyas en su

teoría de la transición de fase gel-a-gel de la compactación ultraestructural holocelular.

¿En qué momento y cuál pudo haber sido el factor determinante de la aparición de la

Zellschrumpfung a lo Gallyas? No lo sabemos. Pudo haber sido un factor externo a las

mismas neuronas afectadas o, quizás también, interno a ellas y determinado por alteraciones

en la estructura de los mismos Nfs. O el mismísimo EtOH. Pero, cualquiera que fuera el

origen, podemos ciertamente suponer que el factor desencadenante habrá sido leve ya que

las neuronas inmediatamente vecinas, de aspecto normal, evidentemente, han tolerado sin

mayores consecuencias la presencia de tal factor.

32
Alguna que otra con su eje alterado; cfr. Fig.34C 4 la neurona marcada con flecha doble. Nada es perfecto,
se ve.

251
Discusión

Las neuronas alteradas que descubrimos en la CxF de las crías P21 sometidas a EPE

poseían prolongaciones celulares, axón y dendritas. Es factible pensar entonces que han

recibido conexiones sinápticas de otras neuronas y las habrán hecho, a su vez con otras

neuronas. Habrán tomado parte de ciertos circuitos sinápticos.

Uno de los mecanismos que se postulan que están involucrados en la epileptogénesis es

la existencia de ciertos circuitos neuronales anómalos como, por ejemplo, aquellos que

determinan las neuronas sobrevivientes o regenerativas en la esclerosis hipocámpica que,

tras años de convulsiones, intentan reparar el daño (Mathern et al., 1997). Entre los ARND

se cuenta, sugestivamente, la epilepsia.

Estas mismas neuronas, aún sin generar “tormentas eléctricas” en el cerebro podrían

fácilmente generar “tormentas cognitivas o conductuales” si llegan a asentar en

determinadas áreas corticales que subyacen a tales rendimientos. Así, estas neuronas

pueden estar en parte, en la base de las enfermedades neuropsiquiátricas a que puede dar

lugar el AMF y la EPE.

V.2.2. Hallazgos en el cuerpo estriado y en la corteza frontal con la microscopía

electrónica:

La totalidad de los hallazgos obtenidos con el MET son plenamente concordantes con

lo observado en la microscopía electrónica con el Nissl y con la teoría de Gallyas. Veamos.

En principio, los núcleos de las neuronas. No se observaron imágenes nucleares

compatibles con el proceso de muerte por apoptosis a pesar de las claras alteraciones

252
Discusión

estructurales de los núcleos (indentaciones únicas y profundas o múltiples y pequeñas,

escotaduras profundas, cuasi-lobulación). Aunque pudieran parecerlo, tampoco son

compatibles estas imágenes con las alteraciones nucleares que se ven en otro proceso,

recientemente descripto, de muerte celular programada: la paraptosis (Sperandio et al.,

2000).33 Podría haberse pensado válidamente en ella, dado que la paraptosis es frecuente

durante el desarrollo y en procesos neurodegenerativos (Bröker et al., 2005). Sin embargo,

en la paraptosis es característica la presencia de vacuolización citoplasmática (igual que en

la necrosis) y edematización mitocondrial y del retículo endoplasmático (Sperandio et al.,

2000). Nada de esto se vió en las neuronas que contenían a los núcleos morfológicamente

anormales, tanto fuera en el Strt como en la CxF.

Más comunes en el Strt, menos en la CxF, es normal la presencia, en estas dos áreas

prosencefálicas, de algunas pocas34 interneuronas medianas GABAérgicas con dendritas sin

espinas (medium-sized type I aspiny neurons, del Strt). Con citoplasma pálido,

ocasionalmente también se encuentran neuronas estrelladas con núcleos indentados en la

capa II de la CC (Cragg, 1976). En los preparados de MET de nuestras ratas de P5 y P21

sometidas a EPE, sin embargo, la presencia de neuronas que poseían este tipo de núcleos,

muchos de ellos muy indentados, era frecuente y se correspondieron con las imágenes

nucleares indentadas que se observan en la microscopía óptica (cfr. Fig. 49I,J,K y la

Fig.50H,I,J con la Fig. 34C-I). No se los observó en los cortes de los animales Control.

Los axones y las dendritas llamativamente sinuosas tanto en el Strt como en la CxF no

33
Debo el conocimiento de este tipo de muerte celular a Laura Caltana que me alertó sobre su existencia y
acerca del hecho de que algunas imágenes nucleares de nuestras fotomicrografías al electrónico tenían
semejanza con las de la paraptosis. ¡Gracias, Lau!
34
En el Strt de la rata en proporción de un escaso 4-5% del total de las neuronas en tanto que en los primates
puede alcanzar el 23% (Graveland y DiFiglia, 1985).

253
Discusión

se hallaban universalmente en todos los cortes, ni siquiera en todo el corte cuando había

una región afectada sino que, por el contrario las alteraciones parecían disponerse en

“parches” o “islotes”. Lo visto en la MET se correlaciona perfectamente con los hallado en

los experimentos de ICQ con los marcadores citoesqueléticos (Nf-200 y MAP-2). Más aún,

las imágenes de MET permiten entrever el desorden del citoesqueleto (cfr. Fig. 49F –axón

normal– con 49G,H –axón anormal–).35 El citoesqueleto, evidentemente, se ha visto

alterado por la EPE.

Las alteraciones de las mitocondrias constituyen (casi) todo un capítulo aparte. Hemos

visto ya que se encontraron mitocondrias muy largas, delgadas y desplazadas a la periferia

dentro de dendritas corticales (Fig. 50A,B), onduladas o zigzagueantes (Fig. 50C,E,F),

acodadas y de formas bizarras e incluso bifurcadas en horquilla bidente (Fig. 49A-D, Fig.

50E,G).

Normalmente, las mitocondrias son, de por sí, organelas pleomorfas y, en forma aislada

y raramente, es posible encontrar, en animales en todo aspecto normales, cualquiera de

estas formas mitocondriales como también se las puede observar en varias condiciones

anormales (Cervós-Navarro et al., 1999; Djaldetii, 1982; Setoguti, 1977). También en

animales normales, raramente, pueden observarse mitocondrias bifurcadas en las dendritas

apicales de neuronas piramidales corticales; en el interior de estas dendritas normales se

han descripto mitocondrias de hasta 10 :m de longitud (Cragg, 1976).

Entonces, ¿en qué se diferencian las mitocondrias por nosotros halladas en los animales

P5 y P21 sometidos a EPE, de las mitocondrias normales raramente hallables en animales

35
Con MET de alto voltaje, con la cual se pueden alcanzar muy grandes amplificaciones, con réplicas de
criofractura incluso, sería posible obtener mayor resolución y dilucidar con mayor fineza la alteración
ultraestructural en el citoesqueleto. Para ello serán necesarios nuevos experimentos.

254
Discusión

normales? Simplemente, en que nuestros animales Control no las presentaban. A pesar de

que se inspeccionó la misma cantidad de grillas de animales EtOH y Control, en iguales

áreas e incidencias de corte, no fue posible hallar estos tipos de morfología mitocondrial

en los animales Control ni tan solo una vez.

Más aún, existen numerosos antecedentes acerca de las alteraciones que el EtOH induce

no sólo en la morfología sino también en la fisiología de las mitocondrias. El EtOH hace

que las mitocondrias produzcan más especies reactivas del oxígeno que lo normal, que se

altere su estado redox (recuérdese el incremento de equivalentes reductores en forma de

NADH y NADPH debida a la metabolización del EtOH y los efectos tóxicos del

acetaldehído),36 que esas especies reactivas del oxígeno y otros radicales libres induzcan

la peroxidación lipídica (con el consiguiente daño a las membranas biológicas) y el ataque

oxidativo directo a muchas proteínas, entre ellas las numerosas que poseen las mismas

mitocondrias en sus membranas interna y externa (Cahill et al., 2002); además de lo

anterior, el daño oxidativo alcanza también al ADN de la mitocondria (Cahill et al., 2002).

En neuronas humanas inmaduras en cultivo, el daño al ADN y la funcionalidad

mitocondrial pueden contribuir a disparar fenómenos de apoptosis (de la Monte y Wands,

2001).

Nuevamente en el terreno de la morfología, se ha encontrado en la miocardiopatía

alcohólica humana y en un modelo en ratas de esta misma enfermedad, que las

mitocondrias pueden desplazarse de su ubicación sarcoplasmática habitual y entrar al

núcleo de los miocardiocitos en gran cantidad (¡!) (Bakeeva et al., 2001). En los

hepatocitos, las alteraciones de la ultraestructura mitocondrial son de antiguo conocidas,

36
El acetaldehído, por sí solo, es capaz de provocar daño mitocondrial ultraestructural y funcional (Lane y
Lieber, 1966; Lieber, 2000).

255
Discusión

siendo una de las más características la aparición de mitocondrias muy grandes

(megamitocondrias), de aspecto globuloso y frecuentemente bizarro, con disminución del

número y alteración de la orientación normal de las crestas mitocondriales y aparición de

estructuras cristaloides en la matriz que a menudo se torna electrón-lúcida y vesiculada

(Flax y Tisdale, 1963; Koch et al., 1977). Estas alteraciones se observan incluso en sujetos

humanos alcoholistas aún sin enfermedad hepática (Koch y Gamboni, 1977) o alimentados

con dietas nutricionalmente adecuada (Lane y Lieber, 1966) y pueden ser parcialmente

revertidas con la abstinencia (Koch et al., 1977).

Resumiendo los hallazgos de la MET, es posible aseverar que, aún habiendo sido

llamativos, los cambios encontrados en las neuronas (sus núcleos, axones, dendritas o

mitocondrias) no denotaron un compromiso letal de la vitalidad celular. Esto posiblemente

se relacione con el hecho de que las alcoholemias alcanzadas no fueron altas en ningún

momento durante la gestación. Así, el daño, según lo visto, fue leve. Pero existió. Y fue

duradero en el tiempo.

V.3. La exposición prenatal al etanol:

El sistema serotoninérgico está íntima y extensamente involucrado en el desarrollo del

SNC. La depleción de 5-HT así como la EPE en altas concentraciones pueden retrasar su

desarrollo. Por lo tanto, es posible que algunos de los efectos del EtOH durante el

desarrollo sean debidos a sus efectos deletéreos sobre el sistema serotoninérgico y la

interacción de este con la astroglia y el sistema nitrérgico.

256
Discusión

Las crías en desarrollo recibieron EtOH intraútero a través de la placenta y

postnatalmente a través de la leche de sus madres durante toda la lactancia hasta el día del

destete natural (P21).De este modo, el desarrollo completo del SNC de las crías de rata se

cumplió bajo la influencia del EtOH. Esta exposición incluyó al equivalente al tercer

trimestre de la gestación humana, durante el que se lleva a cabo parte del período

sinaptogénico, un período de de crecimiento explosivo del cerebro (llamado brain growth

spurt, en inglés). Este período es enteramente postnatal en la rata, desde el nacimiento y

hasta el momento de la apertura ocular (P0-P14); en los humanos es pre- y postnatal

(Bonthius y West, 1988).

Para evaluar los efectos de este tipo de exposición de bajo nivel sobre el sistema

serotoninérgico en sí mismo, se utilizaron dos marcadores neuronales: la TPH y la misma

5-HT.

La expresión de la TPH estuvó muy aumentada (4 a 5 veces) en los dos núcleos fuentes

de la 5-HT estudiados en el mesencéfalo (NDR y NMR). La 5-HT también aumentó en

ambos núcleos pero en el NDR no alcanzó niveles estadísticamente significativos en tanto

que en el NMR el aumento fue evidente si bien que no tan importante comparado con el

mucho mayor incremento de la inmunorreactividad de su enzima biosintética. El aumento

de los niveles de la TPH-ir podría estar indicando un aumento en la expresión de la enzima

misma, una disminución de su reciclado (degradación seguida de síntesis de novo) con la

consecuente acumulación en el soma neuronal o ambas cosas a la vez. Si los niveles de

expresión de la TPH estuvieran efectivamente incrementados, estos resultados indicarían,

a su vez, que quizás este nivel de expresión no se correlaciona con un incremento de la

257
Discusión

actividad funcional de la enzima.37

Por otro lado, el aumento de la 5-HT-ir también puede haberse debido al aumento en la

expresión de la TPH, a un aumento parcial de la actividad de la TPH, a un incremento en

el almacenamiento intracelular de la 5-HT o a una disminución de su liberación. En

cualquier caso, y a diferencia de lo que han hallado otros autores con niveles de exposición

alcohólica más altos (Baker et al., 1996a, 1996b; Berggren et al, 2002; Halliday et al.,

1993), los bajos niveles de exposición a que fueron sometidos estos animales no alteraron

el número ni, groseramente, la morfología de las neuronas serotoninérgicas en los NDR y

NMR.38

El 5-HTT se utiliza como marcador de las fibras serotoninérgicas y como tal es útil

incluso si existe una notoria disminución, o incluso depleción, del neurotransmisor dentro

de neuronas y fibras serotoninérgicas (algo que, en base a los antecedentes, era razonable

esperar al experimentar con el EtOH) (Rathbun y Druse, 1985; Whitaker-Azmitia et al.,

1996). El 5-HTT, entonces, se utilizó para evaluar la inervación serotoninérgica distal en

las tres áreas prosencefálicas inervadas por el NDR y por el NMR (Hipp, Strt y CxF). A

fines de valorar en ellas los posibles cambios en el nivel de inervación, se midió el área

relativa de tejido cerebral cubierta por las fibras 5-HTT-ir y se encontró que hubo un

aumento significativo de este parámetro en las tres áreas, siendo este aumento más

importante en el Hipp y en la CxF y algo menos en el Strt. A pesar de ello, los animales

EtOH de P21 no mostraron alteraciones morfológicas en las fibras (hubo, así, un cambio

cuantitativo pero no cualitativo). Este aumento del área relativa de las fibras

37
Téngase presente que los anticuerpos utilizados en ICQ reconocen porciones inmunogénicas de la molécula
pero nada dicen acerca de la funcionalidad que tenía in vivo la proteína reconocida.
38
Aunque sí se observaron algunas prolongaciones en sacacorcho (cfr. Fig. 35B,D).

258
Discusión

serotoninérgicas se podría interpretar como un fenómeno de gemación (sprouting) ocurrido

durante el desarrollo, quizás como fenómeno compensatorio espontáneo distal para

contrarrestar la presencia en el prosencéfalo, en la CC en desarrollo, de una sustancia

teratogénica. Recordemos además, que recién hacia el final de la tercera semana de vida

postnatal de la rata (-P21) es cuando se alcanza el patrón adulto de la inervación

serotoninérgica distal en la CC (Dori et al., 1996) por lo que sería esperable que el patrón

de inervación por nosotros observado aquí sea el que persista más allá en el tiempo y hacia

la adultez.

El análisis morfométrico de la GFAP es un parámetro sensible para evaluar la respuesta

astroglial bajo diferentes condiciones patológicas y experimentales. En nuestros

experimentos, se puso en evidencia un aumento del área celular de los astrocitos en las tres

regiones prosencefálicas evaluadas. Sin embargo, los aumentos fueron de distinta

intensidad: no fue significativo en el Strt en tanto que en la CxF fue importante y más aún

en el Hipp (un órgano cerebral clásicamente muy sensible a todo tipo de noxas). Así, es

evidente que ha existido una respuesta regionalmente diferente a la exposición al EtOH en

el cerebro de la rata. El aumento del área celular (hipertrofia astrocitaria) indica la

existencia de una reacción astroglial. Esta reacción astroglial es una respuesta bien

caracterizada en este tipo celular ante diferentes tipos de daños al SNC (Brusco et al., 1997;

Eng y Ghirnikar, 1994; Mathewson y Berry, 1985; Ridet et al, 1997; Tagliaferro et al.,

1997, 2002). Informes previos de otros laboratorios acerca de la expresión de la GFAP tras

la EPE mostraron tanto aumentos (Fletcher y Shain, 1993; Goodlet et al., 1993; Miller y

Robertson, 1993) como disminución de los niveles (Vallés et al., 1996, 1997) de la misma

proteína o de su ARNm. Esta discrepancia puede haberse debido a las diferencias existentes

259
Discusión

en los paradigmas experimentales utilizados por los diferentes autores, al período del

desarrollo durante el cual se llevaron a cabo los estudios y a los distintos niveles de

exposición al EtOH.

En nuestros experimentos con bajos niveles de EPE, la expresión de la GFAP-ir,

claramente aumentó si bien que no en todas las áreas estudiadas, sugiriendo esto que existió

una respuesta regionalmente diferente a los efectos del EtOH. Sin embargo, téngase

presente que la expresión del gen de la S-100B es controlada en paralelo con la expresión

del gen de la GFAP (Donato, 1999) y la expresión de la S-100B-ir, en nuestros

experimentos, también estuvo concordantemente aumentada. Por otro lado, en ratones

transgénicos que sobreexpresan la S-100B, se ha demostrado además que el incremento de

los niveles de S-100B es capaz de inducir un aumento en la expresión de la GFAP y que

este aumento está involucrado en la respuesta astrocitaria in vivo (Reeves et al., 1994).

Estos últimos informes respaldan nuestros hallazgos in vivo actuales.

En respuesta a la estimulación de sus receptores 5-HT1A, los astrocitos incrementan la

liberación de la proteína S-100B (Donato, 2003). La S-100B estimula la extensión de

neuritas de, entre otras, las neuronas serotoninérgicas. La S-100B funciona como un factor

de extensión de neuritas al interactuar con diferentes proteínas del citoesqueleto como los

Nf-200, Nf-160, MAP-2 y la proteína J en las neuronas; pero también interactúa

directamente con la GFAP en los mismos astrocitos e induce su expresión y estimula la

ramificación de sus prolongaciones citoplasmáticas (que es una de las características de la

reacción astroglial, la hipertrofia) (Azmitia, 2001b; Donato, 2003; Reeves et al., 1994). En

relación a esto, la expresión de la S-100B medida como valores de DOR, en nuestros

experimentos, estuvo incrementada en el Hipp, Strt y CxF al igual que lo estuvo el área

260
Discusión

relativa de las fibras 5-HTT-ir. Se sabe que un efecto causado por la S-100B es,

precisamente, el aumento de la extensión de las fibras 5-HTT-ir. Hemos visto que la 5-HT-

ir se elevó en el NMR y que mostró una tendencia no significativa al aumento en el NDR.

Coincidiendo parcialmente con ello, las dos áreas prosencefálicas inervadas por el NMR

(el Hipp y la CxF) fueron las áreas en las que el 5-HTT-ir mostró un incremento más grande

en su área relativa (gemado de las fibras) mientras que en el área con la inervación recibida

desde el NDR mostró un incremento menor. Sin embargo, estos cambios no fueron

completamente paralelos con respecto a los observados en la S-100B-ir dado que esta

estuvo (sólo levemente) más aumentada en el Strt que en las otras dos áreas. Anque los

hechos parecerían apuntar a una tal cadena de pensamiento, siendo rigurosos, el incremento

en la S-100B puede haberse debido no solamente a un aumento de su expresión sino a (o

también conjuntamente con) una disminución de su liberación. Quizás otros factores (como

por ejemplo otros factores neurotróficos aquí no evaluados), aparte de la 5-HT y la S-100B,

pueden haber estado involucrados en la génesis del fenómeno de gemación observado en

la fibras 5-HTT-ir. De todas maneras, es razonable especular con que un aumento de la

liberación de la 5-HT en las áreas prosencefálicas estimuló la síntesis y liberación de S-

100B desde los astrocitos la cual, a su vez, estimuló la gemación de las fibras 5-HTT-ir.

Vengamos a considerar ahora al citoesqueleto neuronal. Sabemos que los Nfs son el

componente más importante de su citoesqueleto; determinan íntrinsecamente el calibre

axonal y su remodelación dinámica es necesaria para el crecimiento y guía axonal en su

camino al blanco sináptico a la vez que para el modelado de la forma neuronal (Hoffman

et al., 1987). Los Nf-200 se expresan exclusivamente en las neuronas y junto con los Nf-

160 están fosforilados en niveles inusualmente altos. La fosforilación puede ser regulada

261
Discusión

por varios mecanismos intracelulares (Hammerschlag et al., 1994). En nuestros

experimentos utilizamos anticuerpos primarios dirigidos contra los Nf-200 como medio

para evaluar a los Nfs maduros en neuronas maduras, debido a que en estas células,

recuérdese, esta proteína es el tipo determinante de la madurez de los Nfs. De tal modo

pudimos determinar que el área relativa de los Nf-200 estaba incrementada tanto en el Hipp

como en el Strt. Por el contario, no se observaron variaciones en la CxF pero en esta región

(igual que en los axones de los estriosomas del Strt) muchas neuronas piramidales

mostraron una dendrita apical ondulante, en sacacorcho o tirabuzón (Fig. 45 D,F). Este tipo

de alteración morfológica es indicativo de una alteración del citoesqueleto por alteración

en su desarrollo o ensamblaje o, una vez ensamblado normalmente, por una alteración

adquirida en su estructura, alteración de orden biofísico, según ha postulado Gallyas.

Por otro lado, el aumento de los niveles de los Nf-200-ir junto con los de la S-100B-ir,

concomitantemente con las alteraciones morfológicas del citoesqueleto podrían sugerir

también que se está ante la presencia de un proceso de maduración acelerado tal como el

visto, por ejemplo, en el síndrome de Down (que sobreexpresa la S-100B, codificada en el

cromosoma 21) o en la enfermedad de Alzheimer. En respaldo de nuestros resultados

vienen los informes previos de otros laboratorios que también han mostrado signos de

desarrollo y maduración acelerados en ratones transgénicos que sobreexpresan la S-100B

como así también cambios morfológicos en las dendritas (en todo similares a los hallados

por nosotros) y que serían compatibles con un envejecimiento temprano (Whitaker-Azmitia

et al., 1997). En esos mismos ratones transgénicos se ha encontrado también un aumento

de la expresión de los Nf-200 y de otros componentes del citoesqueleto tal como lo que

nosotros encontramos aquí (Reeves et al., 1994).

262
Discusión

Finalmente, analicemos a la nNOS. El NO y la nNOS se ralcionan con el sistema

serotoninérgico en diferentes condiciones normales y patológicas (Ramos et al., 2000,

2002; Segieth et al., 2001; Tagliaferro et al., 2001, 2003). En nuestros experimentos, en el

Hipp se detectaron muy bajos niveles de nNOS-ir (que no permitireron su evaluación) pero

en el Strt y en la CxF hubo un aumento muy importante de la nNOS-ir. En experimentos

in vitro con células PC12 se ha demostrado previamente que el EtOH y el factor de

crecimiento nervioso (NGF) inducen sinérgicamente a la nNOS (Phung y Black, 1999) y,

en vista de nuestros resultados, estamos tentados a especular con el hecho de que en ambas

áreas evaluadas con aumento de la nNOS-ir también hubo un aumento muy importante en

la S-100B-ir. Tal como sucedió en el caso del aumento de los niveles de la TPH-ir, no

podemos excluir aquí la posibilidad de que el aumento de la nNOS-ir haya sido debido a

un aumento de la expresión de la enzima así como también a una muy disminuída tasa de

su reciclado (turnover) con la consecuente y lógica acumulación en el soma neuronal. No

mucho tiempo atrás, se ha especulado con que el nivel de la nNOS podría cumplir un rol

protector contra la toxicidad y la microcefalia inducida por el EtOH en el cerebro del ratón

en desarrollo a través de la vía NO-GMPc-PKG (Bonthius et al., 2002). En coincidencia

con ello, nosotros tampoco observamos ningún caso de microcefalia en las crías de nuestras

hembras. Más aún, contrariamente a nuestros resultados a la vez que respaldándolos, se ha

demostrado no hace mucho que la deficiencia de nNOS empeora la microcefalia y la

pérdida neuronal inducidas por el EtOH en los ratones en desarrollo (Bonthius et al., 2002).

El EtOH inhibe la función de los receptores glutamatérgicos NMDA que contienen las

subunidades NR2C y/o NR2D (Allgaier, 2002). Los receptores NMDA inducen la

activación de la nNOS mediada por el GMPc; la nNOS, a su vez, sintetiza NO a partir de

263
Discusión

la arginina. De este modo, en nuestros experimentos in vivo, es posible que los bajos

niveles crónicos de EtOH, al inhibir a los receptores NMDA, indujeran una sobreexpresión

compensatoria de la nNOS. Asumiendo que los niveles incrementados de nNOS-ir

implicaran un aumento conscuente de los niveles de NO, y teniendo en mente que el NO

inactiva a la TPH por vía de la oxidación de residuos sulfhidrilos críticos del sitio activo

de la enzima (Kuhn y Arthur, 1997; Kuhn y Geddes, 1999), es razonable especular con que

los muy incrementados niveles de la TPH-ir que hemos hallado fueran una sobreexpresión

compensatoria tendiente a minimizar los efectos de tal inhibición sobre la biosíntesis de la

5-HT. Esto podría explicar también el incremento relativamente menor del nivel de la 5-

HT-ir per se dado que la mayoría de la TPH-ir pudo haber estado, catalíticamente, inactiva.

Pero los niveles incrementados de la 5-HT-ir pueden explicar razonablemente el incremento

de la S-100B-ir, el incremento de la GFAP-ir y la reacción astroglial (conjuntamente con

el efecto tóxico directo del EtOH), y así, los niveles aumentados de los Nf-200-ir.

Por lo tanto, una forma de interpretar lo sucedido en este modelo de EPE, crónica y de

bajo nivel, es que el EtOH puede haber actuado como un factor acelerador del desarrollo

en ciertos aspectos moleculares, induciendo una maduración y desarrollos acelerados,

contrariamente a lo observado en otros modelos en los cuales los niveles altos de EtOH

generalmente causan un retraso en la maduración y desarrollo del SNC. Otra forma de

interpretar los hechos, quizás más consistente con lo que hemos anotado con respecto a los

hallazgos de la microscopía óptica al Nissl de la y electrónica, es que los cambios inducidos

por el EtOH son de algún tipo neurodegenerativo activo ya durante el mismo desarrollo del

animal pasivamente intoxicado intrauterinamente.

264
Discusión

V.4. La prevención del daño con buspirona:

La buspirona (Fig. 103)39 es una droga de uso clínico

neuropsiquiátrico en humanos como ansiolítico no

benzodiazepínico (químicamente es una

azaspirodecanodiona). Su mecanismo de acción depende

de una alta capacidad de unión a los receptores 5-HT1A

sobre los cuales posee una acción agonista parcial (con Fig ura 103. La buspirona en representación
d e fó rm u la e xtendida y en m o d e lo
tridim en sion al de esferas.

menor afinidad se liga también a los receptores 5-HT2 y

D2). Administrada por vía oral, se absorbe completamente pero como es objeto de un gran

efecto de primer paso hepático, su fracción biodisponible es de sólo 0,03 pero en nuestros

estudios la administramos por vía sc a las hembras preñadas por lo que su biodisponibilidad

fue total. En el cuerpo se distribuye generalizadamente, cruza la BHE y pasa a la leche

materna. Se metaboliza en el hígado por hidroxilación a un metabolito inactivo y por

desalquilación oxidativa a otro metabolito que es sólo 20% menos activo que la droga

madre. Su vida media en plasma es de 2-11 hs. Administrada conjuntamente con el EtOH,

a diferencia de las benzodiazepinas, no potencia los efectos deletéreos del tóxico en el

desempeño de tareas cognitivas (Baldessarini, 1996). Existen reportes que indican que la

buspirona disminuye la ingesta de EtOH tanto en humanos alcohólicos (Fawcett et al.,

2000; Lovinger, 1999) como en ratas expuestas al EtOH (Hedlund y Wahlström, 1996;

Kostowski y Dyr, 1992). Sin embargo, este efecto no se observó en nuestros

39
Nombre químico: monoclorhidrato de 8-[4-[4-(2-pirimidinil)-1-piperazinil]butil]-8-azaspiro [4,5] decano-
7,9-diona

265
Discusión

experimentos.40

Actuando como un agonista parcial de los receptores 5-HT1A de los astrocitos, la

buspirona puede ser capaz de inducir en estos la liberación de la S-100B. A su vez, la

liberación al medio de la S-100B podría prevenir los efectos la EPE en virtud de su acción

neurotrófica y promotora de la extensión de neuritas y del mantenimiento del fenotipo

maduro y diferenciado de las neuronas. Esta es la justificación racional sobre la que asienta

el uso experimental de las drogas agonistas 5-HT1A en general, y de la buspirona en

particular, como droga neuroprotectora en el AMF (Druse et al., 2005; Eriksen y Druse,

2001; Eriksen et al., 2002; Kim y Druse, 1996).

En el protocolo de EPE con prevención del daño se han replicado varios de los hallazgos

básicos del protocolo anterior en el que no se previno el daño.41

La DOR de la 5-HT-ir en el citoplasma de las neuronas de los núcleos del rafe, en los

animales control (CS) (Fig. 61) siguió una curva bifásica con un aumento de la DOR desde

P5 con un pico en P35, una posterior disminución en P60 y un nuevo aumento hacia P90.

El pico de la DOR en el NDR fue menos pronunciado que en el NMR. Estos perfiles

temporales en la evolución postnatal de la DOR de la 5-HT-ir en animales normales (CS),

que reflejarían semicuantitativamente la 5-HT que efectivamente se hallaba in vivo en el

citoplasma las neuronas, se correlacionan con (y confirman) lo ya observado en otros

trabajos en relación a varias características generales del sistema serotoninérgico (D’Amato

40
Cfr. más arriba, la subsección V.1.1. (Consumo de alimento, bebida y calorías) en esta misma sección de
Discusión.
41
Así, por ejemplo, véase en la Fig. 65, el aumento de la GFAP-ir en el Hipp y en la CxF de las crías ES de
edad P21 tal como sucedió en las crías de igual edad en el protocolo anterior. También el aumento de la S-
100-ir en el Hipp (igual edad y grupo de tratamiento) en la Fig. 67. Sucedió lo mismo con el nivel de 5-HT-ir
medido en los animales ES a la edad P21 en el NDR con respecto a lo visto en el protocolo anterior aunque
en el que nos ocupa ahora no se observó el aumento que sí en aquél.

266
Discusión

et al., 1987; Dinopoulos et al., 1997; Dori et al., 1996, 1998; Galineau et al., 2004; Tanaka

et al., 2006) y, más específicamente, en relación a los niveles en el rafe de la TPH (Rind et

al., 2000) y de la 5-HT mismas (Herregodts et al., 1990). El pico de la DOR en el NMR fue

de mayor intensidad que en el NDR (Fig. 61, línea oscura correspondiente al grupo CS).

El EtOH administrado prenatalmente (grupo ES) abolió el pico de P35 en ambos núcleos

y la buspirona administrada prenatalmente a las madres alcoholizadas (grupo EB) pareció

restaurarlo parcialmente, al menos (completamente) en el NMR.

Algo similar sucedió, y quizás más llamativamente, en el Hipp y la CxF con la GFAP

y la reacción astroglial. La buspirona en el grupo alcoholizado (EB) restauró prácticamente

los perfiles normales del grupo CS (Fig. 63-65). Nuevamente, pero ahora con respecto a la

S-100B, la buspirona, en el Hipp, pareció mostrar un efecto neuroprotector sobre la acción

deletérea del EtOH (Fig. 66 y 67).

También se estudió en este protocolo el efecto de esta droga sobre un marcador

citoesquelético: la MAP-2. Recuérdese que la MAP-2 es, además, marcador de dendritas

y utilizado como medio para evaluar la “salud” de los circuitos sinápticos subyacentes a los

rendimientos cognitivos. En dos regiones prosencefálicas muy sensibles desde el punto de

vista cognitivo (el Hipp y la CxF) los perfiles temporales normales (grupo CS) de expresión

de la MAP-2 fueron distintos (incremento sostenido desde P5 hasta P90 en el Hipp;

pequeño valle en P35, entre P21 y P60 en la CxF). ¿A qué pudo haberse debido esta

diferencia entre los perfiles de las dos áreas en animales normales? Posiblemente, a la

adquisición progresiva de funciones mnésicas en el Hipp a medida que el animal madura

y se desarrolla y, en la CxF es posible que estos cambios se hayan relacionado con los

cambios madurativos que se sabe ocurren en esta región entre el inicio (P35) y la

267
Discusión

finalización (P60) de la adolescencia (véanse más detalles abajo al tratar el protocolo de

exposición durante la adolescencia).42 De cualquier modo, el EtOH alteró profundamente

los niveles de expresión de la MAP-2 en ambas áreas (Fig. 68-70, grupo ES). En todas las

edades postnatales, la MAP-2 vió disminuída su expresión (incluso hasta en la adultez

–P90–) y, así, es lógico suponer que disminuyeron los niveles de los circuitos sinápticos en

éstas áreas y, por tanto, su rendimiento funcional cognitivo (algo que se correlaciona bien

con lo observado en humanso afectos de ARND). La buspirona, previno también este daño

(Fig. 68-70, grupo EB).

¿Qué efectos produjo la buspirona en los experimentos conductuales? A largo plazo,

en las crías ya adultas (P90), parece haber restaurado un parámetro de la actividad

locomotora, medido como la cantidad de cruce de cuadros en sesiones de evaluación de 5

minutos en un paradigma de exposición a un ambiente novedoso en forma de campo abierto

(Fig. 71, arriba). Las ratas que fueron sometidas a EPE (grupo ES), en comparación con los

animales normales (CS), mostraron una tendencia no significativa al incremento de la

actividad locomotora (exploraron más el ambiente novedoso), algo que podría

correlacionarse con lo observado en los humanos afectados de ARND que suelen padecer,

frecuentemente (hasta un tercio de ellos), el trastorno por déficit de atención con

hiperactividad –TDAH– (Famy et al., 1998). Coincidentemente con el incremento de la

exploración, las crías P90 del grupo ES mostraron una tendencia no significativa a

permanecer más tiempo en el cuadro central del dispositivo, lo cual se podría interpretar

42
Evidentemente, es necesario realizar nuevos experimentos con la finalidad de caracterizar en detalle estos
cambios normales.

268
Discusión

como un grado de ansiedad menor en relación a los sujetos normales (grupo CS).43 El

EtOH, en consumo agudo, es un conocido ansiolítico.44 Y la buspirona, también. Pero aquí

nos encontramos con los efectos de la EPE en animales ya adultos por lo que no es posible

adscribir la disminución de la ansiedad en el campo abierto a la acción inmediata del EtOH

o de la buspirona. Es posible, entonces, que las alteraciones morfológicas del sistema

serotoninérgico (que se observaron en los experimentos de ICQ) han sido el substratum

antecedente de esta conducta alterada en los animales ES adultos; y que la acción

neuroprotectora de la buspirona administrada intrauterinamente es la responsable de la

modificación preventiva –tanto morfológica como conductual– observada en los animales

del grupo EB.

La secuencia explicativa posible de los eventos observados puede haber sido la que

sigue: en presencia del EtOH que tiende a provocar una reacción astroglial (con aumento

de la GFAP), acumulación de la S-100B intracitoplasmática y lesión dendrítica con

disminución de su contenido de MAP-2, la buspirona, al estimular a los receptores 5-HT1A

de los astrocitos induciría la liberación de la S-100B por parte de estos (la DOR de la S-

100B baja), se recompone el citoesqueleto astrocitario (dismuye la GFAP y la reacción

astroglial) y, tras actuar sobre las neuronas, promueve la extensión de neuritas, la

acumulación de MAP-2 dendrítica y el establecimiento de nuevos contactos sinápticos.

Ahora bien, extrapolando entre especies y teniendo en cuenta los riesgos que ello

43
La tendencia natural de la rata es a no permanecer en lugares abiertos e iluminados; son animales, en
general, temerosos a los que no les gusta la exposición que pudiera ponerlos en peligro, por lo que prefieren,
en este paradigma, permanecer cerca de las paredes del dispositivo.
44
D e hecho, muchos humanos psicóticos o adictos a drogas de abuso como la cocaína, utilizan
espontáneamente el EtOH como droga ansiolítica para contrarrestar, estos los efectos de la droga y aquellos
los de su psicosis. O simplemente también los adolescentes normales que lo utilizan con igual finalidad antes
de encarar situaciones ansiógenas, como por ejemplo, hoy en día en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires,
ir a bailar y enfrentarse a personas del sexo opuesto (Avaca, 2006; Sousa Dias, 2008).

269
Discusión

siempre implica en ciencia, y habida cuenta de que la buspirona se halla en uso clínico

humano y es una droga relativamente segura ¿sería también seguro el uso de la buspirona

en embarazadas alcohólicas o en recién nacidos con ARND con la finalidad de prevenir el

daño provocado al feto por el EtOH consumido por la madre?

A pesar de que los datos aquí mostrados y los informados previamente por otros

investigadores (Druse et al., 2005; Eriksen y Druse, 2001; Eriksen et al., 2002; Kim y

Druse, 1996) hacen presuponer que sí podría hacerse, no creo que se debiera antes de

realizar investigaciones más exhaustivas que diluciden ciertos hallazgos que provocan

cierto alerta acerca de la buspirona. Por ejemplo, si bien esta droga en nuestros

experimentos y en los de otros investigadores parece haber sido eficaz como sustancias

neuroprotectora, no es menos cierto que su uso en animales no alcoholizados (grupo CB)

desvió de la normalidad (grupo CS) ciertos parámetros.45 Habrá de tenerse en cuenta aquí

que la buspirona estaría actuando en este caso como droga con una función “plastica”,

neuroprotectora capaz de modificar el desarrollo del sistema serotoniérgico. Pero al ligarse

a los receptores 5-HT1A dendrosomáticos de las neuronas de los núcleos del rafe, estaría

actuando, además, como un inhibidor de la tasa de descarga de potenciales de acción a

partir de estas células y, por lo tanto, disminuyendo la liberación de 5-HT. Por ello, los

efectos farmacológicos finales de la buspirona son de interpretación mecanística compleja.

Todas estas consideraciones llaman a la cautela.

45
Cfr. en la Fig. 61, en el grupo CB, el pico exagerado de la DOR de la 5-HT-ir en P35 y su disminución casi
significativa en P90, ambos en el NDR, o el aumento significativo del mismo parámetro en P5 en el NM R;
también la alteración del perfil normal de la curva CB, con corrimiento del pico de P35 a P60, en el Hipp en
la Fig. 65 –GFAP-ir–. Cfr. también, en la Fig. 71 –conducta– la disminución de la actividad exploratoria y
el aumento de la ansiedad en las crías P90 del grupo CB.

270
Discusión

V.5. Los adolescentes:

V.5.1. El problema de definir y delimitar la adolescencia en humanos y en ratas:

La adolescencia se puede definir como el período de transición gradual desde la juventud

a la adultez. También como el período de la vida entre la adquisición de la madurez sexual

y la consecución de roles y responsabilidades de adulto (Dahl, 2004; Spear, 2000).

La Organización Mundial de la Salud delimita temporalmente a la adolescencia humana

como el período que va de los 10 a los 20 años de edad (10-14 años: adolescencia

temprana; 14-17 años: adolescencia media; y 17-20 años: adolescencia tardía (WHO, 1986).

Sin embargo, sus límites parecen variar algo arbitrariamente según los tiempos y las

conceptualizaciones cambiantes (Dahl, 2004).

En lo que a las ratas se refiere, el momento exacto de la adolescencia también es motivo

de cierta disputa. Existen dos criterios temporales para definirla: uno de ellos la define

como el período que va aproximadamente desde P30 hasta P42 (concepto estrecho) (Spear,

2000). El otro, entre P28 y P55 (un concepto amplio que toma en cuenta los últimos

cambios de la adolescencia, especialmente aquellos que se ven en las ratas macho (Ojeda

y Urbanski, 1994).

Así, decidimos evaluar ratas macho en edades de P45-P50 (adolescencia tardía en las

ratas), con la intención de mimetizar el contexto de un humano que se involucra en un

consumo excesivo de alcohol, conducta que es altamente prevalente durante la adolescencia

tardía (Monti et al., 2005; Spear, 2004).

271
Discusión

V.5.2. Cambios nerviosos y conductuales normales durante la adolescencia:

Tanto los seres humanos como las ratas experimentan muchos cambios conductuales

y biológicos notables durante la adolescencia. Al ingresar a la adolescencia, los humanos

incrementan mucho sus interacciones sociales, pasan mucho más tiempo en compañía de

sus pares (incluso más que los adultos entre sí), buscan constantemente experimentar

sensaciones nuevas y frencuentemente se ven involucrados en conductas riesgosas o

potencialmente dañinas; se conducen de forma salvaje e incluso antisocialmente y a

menudo comienzan a beber alcohol o a consumir otras drogas (Spear, 2000; Dahl, 2004).

Entre los 13 y los 15 años de edad se describe un pico de ansiedad en los humanos que

seguramente contribuye (junto a otros factores de riesgo) al frecuente inicio del consumo

de EtOH (Pohorecky, 1991).

Mientras todas estas conductas comienzan con la pubertad misma, en forma más lenta

y tardía se adquieren la mayoría de los desarrollos cognitivos superiores que podrían

oponérseles sensatamente (Dahl, 2004). Hay un desfasaje conductual evidente entre lo que

se puede y lo que se debe.

En los humanos adolescentes muchos de estos cambios frecuentemente los predispone

a iniciar el consumo de alcohol o de otras drogas (Dahl, 2004; Spear, 2000). Muchas áreas

cerebrales cambian notablemente, en particular la corteza prefrontal y las regiones

mesolímbicas prosencefálicas (Lewis, 1997; Spear, 2000). Estas áreas (como la corteza

órbitofrontal) son la base de las funciones cerebrales más elevadas y típicamente humanas,

tales como los sentimientos sociales y los rendimientos éticos (Goldar, 1975; Goldar y

Outes, 1972; Goldar et al., 1993; Kleist, 1934; Welt, 1888).

272
Discusión

Existen muchos cambios químicos y estructurales cerebrales que subyacen a los

conductuales y cognitivos, tanto en los humanos como en las ratas. Muchos de estos

difieren entre uno y otro sexo y que pueden explicar la vulnerabilidad aparentemente más

alta que tienen los cerebros femeninos comparados con los masculinos (Bethea et al., 2002;

Juraska y Markham, 2004; Lewis, 1997; White y Swartzwelder, 2004).46 Los sistemas

neurotransmisores monoaminérgicos, y el serotoninérgico entre ellos, también

experimentan importantes cambios durante la adolescencia (Bethea et al., 2002; Dinopoulos

y Dori, 1995; Dinopoulos et al., 1997; Dori et al., 1996).

Como era de preverse, si se viera interferido en cualquier modo evidente el desarrollo

del cerebro adolescente (tal como en otros períodos del desarrollo cerebral), también

podrían verse comprometidos concomitantemente los rendimientos cognitivos y

conductuales subsecuentes que el individuo hubiera podido alcanzar de no haber sido así.

V.5.3. Cambios morfológicos duraderos tras la exposición durante la adolescencia

y la abstinencia:

A pesar de que existen abundantes datos acerca de los efectos del EtOH sobre el sistema

serotoninérgico del feto y de los adultos casi no existen datos relativos a este sistema

neurotransmisor y el consumo de EtOH durante la adolescencia.

En el protocolo de exposición al EtOH durante la adolescencia, tras 6 semanas de una

46
Teniendo en cuenta este hecho, sería interesante diseñar experimentos adicionales con la finalidad de
comparar los hallazgos en machos del presente trabajo con los que podrían tener lugar en los cerebros
femeninos y determinar si uno u otro sexo es más vulnerable o resistente que el otro a los efectos del EtOH
bajos las condiciones experementales que he utilizado aquí.

273
Discusión

exposición baja, las ratas macho adolescentes mostraron un descenso significativo de los

niveles de expresión de la 5-HT-ir (medida como DOR; Figs. 73 y 74) en las neuronas del

NDR pero no en las del NMR. No se observó disminución del número de neuronas

serotoninérgicas. Este hallazgo acerca de un sistema serotoninérgico disfuncional tras la

exposición al EtOH en la adolescencia es consistente con la implicación de este

neurotransmisor en las conductas riesgosas, la agresión y el alcoholismo (Barr et al., 2004).

Estos resultados también son consistentes con estudios previos que han demostrado que el

NDR es más sensible que otros núcleos del rafe a los estímulos tóxicos (Gartside et al.,

1997; Tagliaferro et al., 1997). Tras el período de abstinencia, las neuronas del NDR

recuperaron los niveles de 5-HT-ir a un nivel no significativamente diferente del de los

controles, sugieriendo esto que el daño inducido por el EtOH en baja dosis, no fue tan

importante como para imperdir la recuperación. Entre otras estructuras funcionalmente

relacionadas, recuérdese que el NDR envía axones para inervar el Strt, el NMR las envía

al Hipp y entre ambos contribuyen a inervar la totalidad de la CC (Fraser y Hensler, 1994).

A pesar de esta correlación anatómica, en nuestro estudio parece no haber existido una

correlación completa entre el grado de descenso de la 5-HT-ir en el NDR (y la ausencia de

cambios en el NMR) con las alteraciones observadas en sus respectivas áreas blanco de

inervación. Así, por ejemplo, mientras la 5-HT-ir en el NDR se alteró y recuperó en

paralelo con la GFAP-ir, la S-100B-ir, la MAP-2-ir y los Nf-200-ir en una de sus áreas de

inervación (el Strt), la 5-HT-ir del NMR no siguió los cambios observados en el Hipp

sugieriendo este hecho que otros factores, más allá de los estudiados aquí, pueden haber

estado implicados en su génesis. Se necesitan experimentos adicionales diseñados ad hoc

para poder dilucidar este punto.

274
Discusión

En los astrocitos, la GFAP-ir, aumentó significativamente en las tres áreas

prosencefálicas y mostraron una morfología hipertrófica y reactiva, según era esperable

(Figs. 75 y 76). Tras la abstinencia, cuando los animales eran ya adultos, los astrocitos

mostraron una reducción de su área celular y la disminución de la expresión de la GFAP

que tendió, aunque no alcanzó, a los valores control. Esta reducción, de recuperación podría

decirse, fue de magnitud comparable en las tres áreas (77% en el Hipp, 66% en el Strt y

73% en la CxF). Este hallazgo sugiere que, a pesar de que la exposición fue de bajo nivel,

el daño inducido por el EtOH durante la adolescencia tardía fue lo suficientemente intenso

como para inducir efectos residuales a largo plazo en los astrocitos, efectos que fueron

evidentes bien entrada la adultez.

La DOR de la S-100B-ir en el citoplasma de los astrocitos disminuyó, a diferencia de

lo visto en los protocolos de EPE (Figs. 77 y 78). Sin embargo, en ratones adultos knock-

out para la S-100B, no hace mucho, se ha observado un aumento correlativo de la expresión

de la GFAP a semejanza de lo que hemos visto en este protocolo (Chang et al., 2005). Tal

como se ha hipotetizado ya (Chang et a., 2005) la reactividad glial que observamos puede

haberse debido en parte al efecto tóxico directo del EtOH y no haber estado tanto en

relación con la S-100B y puede reflejar también, de hecho, la disminución intraglial de esta

proteína dado que, se sabe, la S-100B inhibe la polimerización dela GFAP (Bianchi et al.,

1995); de este modo, aunque parezca paradójico, la disminución intracitoplasmática de los

niveles de S-100B en el astrocito se acompañó por aumento de la GFAP-ir.

También encontramos que la S-100B-ir, la MAP-2-ir y los Nf-200-ir disminuyeron

todos claramente (si bien que a distintos niveles) en el Hipp, Strt y CxF (Figs. 79-82).

Teniendo en mente las acciones postuladas de la S-100B sobre las proteínas del

275
Discusión

citoesqueleto, la disminución paralela de estos tres inmunomarcadores es mecanísticamente

consistente y también lo es con hallazgos previos de Azmitia et al. (1995), quienes

encontraron (en las cortezas parietal y temporal, el Hipp y el hipotálamo) un descenso

conjunto en la 5-HT, la S-100B y la MAP-2 luego de una depleción experimental de 5-HT.

El mismo paralelismo se encontró entre el descenso de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir en

el Hipp y la CxF de ratas macho adultas luego de 6 semanas de intoxicación alcohólica leve

en el protocolo de exposición al EtOH en la adultez (ver más adelante). Hasta donde sé, no

existen estudios previos que informen la alteración de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir tras

la exposición al EtOH en la adolescencia.

Dado que las neuronas son críticamente dependientes, en su funcionamiento correcto y

en el establecimiento de nuevos circuitos neuronales, de la integridad del citoesqueleto, los

presentes hallazgos en el Hipp, Strt y CxF se correlacionan en forma consistente con, y

respaldan, informes previos que demuestran que las ratas adolescentes expuestas al EtOH

exhiben trastornos en el aprendizaje y en la memoria espacial (Markwiese et al., 1998;

White y Swartzwelder, 2004) y alteraciones a largo plazo en el funcionamiento cognitivo

(Osborne y Butler, 1983).

Tras la abstinencia, la S-100B-ir retornó a los valores control. El aumento de

recuperación fue de similar magnitud en las tres áreas prosencefálicas sugiriendo que (como

en el caso de la GFAP) la capacidad de recuperación de los astrocitos es similar en las tres

áreas. Tal recuperación estuvo en paralelo con la de la GFAP-ir a pesar del hecho que el

área celular no se recuperó totalmente (efecto “residual”). Pero no fue esta la situación en

el caso de la MAP-2-ir y de los Nf-200-ir. La MAP-2-ir alcanzó los valores control en el

Hipp y en el Strt (tras un aumento de 1,8 y casi 4 veces, respectivamente). Este resultado

276
Discusión

está de acuerdo con hallazgos previos de Putzke et al. (1998), quienes encontraron una

disminución del ARNm de la MAP-2 en varias áreas cerebrales y una subsiguiente

recuperación de sus niveles tras la abstinencia al EtOH. También de acuerdo con los

nuestros están los hallazgos de Whitaker-Azmitia et al. (1997) quienes encontraron en el

Hipp un aumento de la expresión de la MAP-2 en ratones trasngénicos que sobreexpresan

la S-100B. La recuperación pudo haberse relacionado no solo con la de la S-100-ir sino

también con otros factores (tal como ciertos factores neurotróficos que se sabe están

alterados tras la exposición alcohólica) porque, a pesar de la recuperación la S-100B-ir vista

en la CxF, no hubo una tal recuparación en la MAP-2-ir de esta área. De hecho, en la CxF

hubo una recuperación de aumento de 1,42 veces sobre el nivel postexposición que no

alcanzó los niveles pre-exposición. Esto puede estar indicando que, a pesar de la mayor

capacidad plástica y de recuperación del cerebro adolescente, la CxF, como área cortical

filogenéticamente más moderna que es, es también más lábil a las injurias que otras áreas

más antiguas. Y, en consecuencia, la ausencia de recuperación completa en la expresión

de la MAP-2 frontal tras una larga abstinencia, indica que hubo menos dendritas

involucradas en circuitos neuronales en los machos adultos expuestos al EtOH durante la

adolescencia. Esto implica que los animales abstinentes, comparados con los controles,

pueden haber tenido menos habilidades cognitivas correspondientes, algo que se ha visto

más que frecuentemente en los humanos adultos alcohólicos crónicos de gran nivel de

consumo que no recuperan completamente sus rendimientos cognitivos incluso tras una

larga abstinencia. La exposición durante la adolescencia tardía, incluso habiendo sido de

bajo nivel, pero crónica, provocó cambios estructurales tales al cerebro de los animales que

probablemente estuvieran en desventaja en relación con sus controles. Para corroborar si

277
Discusión

los cambios estructurales se correlacionan fehacientemente con un daño conductual

duradero incluso tras la abstinencia prolongada, se necesitaría realizar estudios

conducturales adicionales.

Después del período de abstinencia, los Nf-200-ir no alcanzaron los valores control en

el Hipp a pesar de haber incrementado sus valores post-abstinencia en 3,67 veces desde la

finalización de la exposición. Por el contrario, sí los alcanzaron en el Strt. Y en la CxF

excedieron los valores control en un 33% en lo que parece haber sido un fenómeno de

rebote. Estos resultados nuevamente sugieren que hay, probablemente, otros factores

involucrados en la recuperación de la expresión de los Nf-200 más allá que la proteína S-

100B per se. También harían falta nuevos experimentos al efecto para aclarar

completamente este hecho.

En cuanto a las notables alteraciones cualitativas del citoesqueleto neuronal (Fig. 85),

es válido considerar aquí lo mismo que se dijo en relación a las neuronas “oscuras” o la

Zellschrumpfung puestas de manifiesto en los protocolos de EPE. No me repetiré y remito

al lector a la subsección correspondiente.47 Llamaré la atención, solamente, sobre el hecho

de que, una vez más, la alteración morfológica persistió en el citoesqueleto de las neuronas

incluso mucho tiempo después de que cesara la noxa (cfr. Fig. 85). Por ellom, es válido

suponer, que aún lastimadas, estas neuronas seguían estando vivas y siendo funcionales (a

favor de ello habla también la conservación del nucléolo visto en los cortes al Nissl).

Quizás su patrón de conectividades y, por lo tanto, los circuitos neuronales en los que

entrarían a formar parte, también estarían alterados. Precisamente, algo similar se observa

en el Hipp de pacientes epilépticos que, tras repetidas convulsiones y por virtud de

47
Cfr. subsección V.2. (Las neuronas “oscuras” o la Zellschrumpfung).

278
Discusión

fenómenos que intentan ser neurorregenerativos, se alteran las vías sinápticas a punto de

partida de neuronas alteradas que vuelven a formar, también, circuitos alterados (Mathern

et al., 1997).

El NO y la nNOS han sido relacionados con el sistema serotoninérgico en diferentes

condiciones normales y experimentales (Kaehler et al., 1999; Ramos et al., 2000, 2002b;

Segieth et al., 2001; Tagliaferro et al., 2001, 2003). El NO modula los cambios de la

liberación de 5-HT tanto basales como los evocados por el receptor NMDA (Segieth et al.,

2001); disminuye la liberación de 5-HT en el Hipp y en el hipotálamo in vivo por vía

GMPc-dependiente e inhibe tónicamente la recaptación de 5-HT (Kaehler et al., 1999; Kiss

y Vizi, 2001; Wegener et al., 2000). Algunos astrocitos (no todos) de los que expresan la

S-100B, co-expresan la eNOS (la isoenzima endotelial) y constituyen otra fuente de NO en

la neocorteza cerebral (Wiencken y Casagrande, 1999). En concordancia con lo observado

por otros investigadores (Dizon et al., 2004), nosotros hemos visto más arriba que la EPE

incrementa los niveles de expresión de la nNOS. Existen informes contradictorios, in vivo

e in vitro, con respecto a los efectos de la exposición aguda o crónica al EtOH sobre la

formación del NO (Chandler et al., 1997; Rossetti y Crespi, 2004; Seo y Rivier, 2003). En

un trabajo, la exposición crónica reguló diferencialmente los niveles del ARNm de la nNOS

en distintas regiones cerebrales (fueron normales en la CxF, disminuyeron en el Hipp y

aumentaron en el Strt) (Naasila et al., 2003). Gerlach et al. (2001) encontraron aumentos

de la expresión de la nNOS en varias regiones cerebrales de humanos alcohólicos crónicos,

incluyendo la CxF, pero no en el Strt ni en el Hipp. En nuestros resultados no se detectaron

alteraciones en las neuronas que expresaban la nNOS-ir en el Strt o la CxF de los animales

adolescentes tras la exposición (Figs. 83 y 84). No obstante ello, tras la abstinencia, la DOR

279
Discusión

de esas neuronas disminuyó en ambas áreas (los valores fueron 0,53 y 0,63 veces del valor

control, respectivamente). La técnica de ICQ no permite, lo dijimos antes, evaluar la

actividad enzimática de la nNOS en los animales EtOH ni en los EtOH/R pero el hecho de

que su expresión estuviera reducida tras la abstinencia sugiere que puede haber tenido lugar

algún tipo complejo de mecanismo adaptativo tanto en la CxF cuanto en el Strt. Es

relevante recordar aquí que el EtOH es un antagonista de los receptores NMDA (Allgaier,

2002), receptor que, a su vez, activa la vía guanilato ciclasa-GMPc-quinasa GMPc-

dependiente, que a su vez activa a la nNOS. Tras la supresión del EtOH y durante la

abstinencia, es razonable especular entonces con que existió algún grado de regulación en

más (up-regulation) de los receptores NMDA y, si se produjo una mayor cantidad de NO

(a niveles que pueden haber sido dañosos) la reducción de la expresión de la nNOS pudo

haber sido un mecanismo adaptativo tendiente a minimizar el daño. Por otro lado, dado que

el NO inhibe la 5-HT en algunas áreas prosencefálicas (Kaehler et al., 1999; Wegener et

al., 2000) la reducción de sus niveles pueden haber incrementado los niveles de liberación

de la 5-HT y, con esto, puede haber tenido lugar un mayor mecanismo neurotrófico y

neurorreparador por medio de la S-100B. De cualquier modo que fuere, es obviamente

necesario realizar más estudios para aclarar completamente el asunto.

Finalmente, deberíamos considerar una serie de mecanismos que pueden haber ocurrido

en los machos de adolescencia tardía/adultez joven como para determinar los fenómenos

de recuperación que se han observado. Uno de ellos puede haber sido que la recuperación

de los niveles de la 5-HT, actuando sobre los receptores 5-HT1A, pudo haber atenuado el

daño alcohólico y contribuido a la recuperación observada por medio de la acción directa

sobre las neuronas que lo expresan, al inhibir la apoptosis (Adayev et al., 2003) e,

280
Discusión

indirectamente, por medio de la estimulación de la liberación de la S-100B tal como se ha

visto previamente en otras condiciones experimentales (Kim et al., 1997; Tajuddin and

Druse, 1999; Ramos et al., 2004). Independientemente de ello, deberíamos recordar que el

EtOH es un conocido neurotóxico que causa daño a las células madre neurales tanto durante

el desarrollo como en los animales adultos (Crews et al., 2003, 2004; Herrera et al., 2003).

Más aún, en un reciente artículo de Nixon and Crews (2004) los autores mostraron que la

intoxicación alcohólica disminuyó la proliferación celular en el Hipp, y con la supresión

del tóxico hubo una reversión temprana y un posterior aumento explosivo en la

proliferación celular una semana después de la última dosis de EtOH. Aquí debo enfatizar

que en el presente estudio se evaluó la recuperación de la morfología neuronal 10 semanas

después de la cesación alcohólica y que el fenómeno de recuperación que observamos es

fuertemente consistente con los efectos post-alcoholización mostrados por Nixon and

Crews (2004). Sería interesante desde el punto de vista clínico, de las salud pública y social,

diseñar experimentos y desarrollar estrategias farmacológicas que exploten la capacidad de

neuroprevención o de neurorreparación de ciertas drogas como la buspirona o de otras

drogas con probada actividad neuroprotectora para la neurogénesis (Herrea et al., 2003).

* * *

El EtOH es la droga psicoactiva y neurotóxica más comúnmente usada (Ling et al.,

1996). Durante la adolescencia es cuando mucha gente experimenta con el EtOH por

primera vez en sus vidas. La edad de más alta prevalencia en el consumo de EtOH es desde

la adolescencia media o tardía hasta mediados de la década de los 20 años (adolescencia

281
Discusión

media a adultez temprana (Schuckit, 1995; Spear, 2000; WHO, 1986). Se ha dicho que

cuanto antes comienza una persona a beber alcohol, es más probable que más tarde se haga

dependiente de él. Más aún, el inicio temprano del consumo de EtOH es uno de los factores

predictores o marcadores más fuertes (pero no precursor) de la posterior dependencia al

alcohol (Spear, 2000; Barr et al., 2004). Todavía más: se ha asociado la edad en que por

primera vez comienza a beberse en forma regular y el alcoholismo familiar con los rasgos

de personalidad antisocial (Spear, 2000), un trastorno tan gravoso en términos médicos,

morales, económicos y sociales para la calidad de vida de la gente y para la salud social.

Se han llevado a cabo pocos estudios básicos acerca de los posibles beneficios de

manterner una abstinencia prolongada tras un, también prolongado, periódo de intoxicación

alcohólica incluso aunque este período fuera solamente del tipo denominado de bajo

consumo. Es claro que el uso de alcohol durante la adolescencia puede tener,

potencialmente, consecuencias a largo plazo e influir más tarde en las funciones

neurocognitivas.48

Tal como lo han destacado estudios previos, nosotros encontramos que diferentes

regiones cerebrales en la rata macho difieren en su vulnerabilidad a los efectos del EtOH

y en su capacidad de recuperación durante el desarrollo (Brown and Tapert, 2004; Crews

et al., 2000).

En un trabajo reciente, Brown y Tapert (2004) se plantearon las siguientes interesantes

inquietudes acerca del consumo adolescente de EtOH: i) “sigue siendo incierto hasta qué

punto se reparan, con la abstinencia sostenida, la anomalías cognitivas observadas en los

48
Piénsese, solamente, que hay adolescentes y adultos jóvenes que, tras haber bebido crónicamente en su
adolescencia o juventud pueden, más tarde en la vida, incluso, llegar a ser presidentes de una nación, con todo
lo que ello implica.

282
Discusión

jóvenes fuertemente bebedores y si tales anomalías se repararan, que tanta sobriedad

[temporal] se requiere para que los rendimientos y la integridad cerebrales reasuman los

niveles preexposición”; ii) “aún está por verse si la capacidad de recuperación de la

integridad cerebral y de las funciones cognitivas pueden ser más completas en los jóvenes,

cuyos cerebros son más plásticos, o si la recuperación es menos probable porque la injuria

neurotóxica puede haber afectado adversamente el curso de la neuromaduración”; y iii)

“sigue siendo poco claro si el cerebro adolescente es, en última instancia, más vulnerable

a esta toxina [el EtOH] o si serán más resistentes y capaces de recuperarse que los adultos.”

Creo que hemos dado respuesta parcial a estas relevantes preguntas con un modelo de

alcoholismo crónico en ratas macho adolescentes. Es evidente, según surge de nuestro

estudio, que es posible alguna capacidad de recuperación en el SNC de las ratas macho en

la adolescencia tardía luego de la supresión del consumo crónico bajo de EtOH y de

mantener una abstinencia prolongada. Pero esta capacidad de recuperación no es,

claramente, la misma en todas las áreas prosencefálicas y, ciertamente, no es completa en

algunas de ellas (por ejemplo, la CxF). A pesar del hecho de que no comparamos la

resistencia de los animales adolescentes con la de los adultos, sí evaluamos la capacidad

de recuperación del cerebro macho adolescente permitiéndoles pasar por un largo período

de abstinencia. Así, claramente se encontró que, a pesar de su mayor capacidad

neurogenética y plástica, los machos adolescentes no tienen la capacidad para recuperarse

completamente del daño provocado por el consumo crónico de EtOH a bajo nivel en todas

las áreas estudiadas. En lugar de ello, en diferentes áreas mesencefálicas y

prosencefálicas, hubo recuperaciones completas, parciales, o no las hubo para nada o

hubo, incluso, fenómenos de rebote que, no por ello, pueden ser llamados normales.

283
Discusión

Después de todo, beber alcohol crónicamente durante la adolescencia, incluso en bajos

niveles, claramente, no es gratis.

V.6. Los adultos:

Los cambios observados en los animales adultos sometidos a exposición alcohólica

crónica leve los consideraremos principalmente en cuanto contrasten con los anteriores.

La casi la totalidad de las células cerebrales están en proximidad con una fibra

serotoninérgica (Azmitia y Whitaker-Azmitia, 1995). Debido a la amplia extensión del

sistema serotoninérgico y a su interacción con diversos tipos celulares, es de esperarse que

cualquier alteración producida sobre él, se refleje sino en todo, en parte del SNC.

La signficativa disminución de la inervación serotoninérgica distal en las áreas

prosencefálicas estudiadas con este protocolo (5-HTT-ir; Fig. 87 y 88) bien pueden

explicar parcialmente el por qué del surgimiento de los déficits mnésiscos (Hipp), motores

(Hipp), cognitivos (Strt y Cxf), anímicos e ideativos (CxF) observados en los alcohólicos

crónicos tras mucho beber. Lo que se encontró aquí concuerda plenamente con la conocida

acción neurotóxica del EtOH. La reducción observada fue leve49 pero también fue leve la

intoxicación. Son ciertas las alteraciones morfológicas y, para determinar si se acompañan

de manifestaciones en la conducta de los animales, se necesitarían nuevos experimentos.

Los astrocitos, según lo que permitió evaluar la GFAP-ir, estuvieron hipertrofiados,

49
Recuérdese que en otros sistemas (como en la sustancia nigra, por ejemplo) para que aparezcan signos y
síntomas (de enfermedad de Parkinson, en ese caso) es necesario que desaparezcan antes alrededor el 80-90%
de las neuronas dopaminérgicas. Aquí, la inervación se redujo alrededor de “sólo” un 30%.

284
Discusión

mostraron reactividad, signo cierto de daño al SNC. La proteína S-100B-ir aumentó en el

citoplasma de los astrocitos de las tres áreas. Inversamente proporcional al aumento de la

S-100B-ir en los astrocitos, fue la expresión de los Nf-200-ir en las neuronas de las mismas

áreas. Así, allí donde más aumentó la S-100B-ir, más disminuyeron los Nf-200-ir: en el

Hipp. Y, viceversa, allí donde menos aumentó la S-100B-ir (en la CxF), menos

disminuyeron los Nf-200-ir. Sin embargo, en esta última área, aunque la disminución fue

menor que en las otras dos, nuevamente, encontramos alteraciones cualitativas del

citoesqueleto neuronal: las consabidas dendritas apicales en sacacorcho (Fig. 92F). La

MAP-2-ir, nuestro marcador de “salud” dendrítica, mostró que en el Hipp, tanto como en

la CxF, las dendritas estaban alteradas (también se vieron los sacacorchos).

Mecanísticamente, podríamos suponer que la disminución de la inervación

serotoninérgica indujo la acumulación de la S-100B en los astrocitos y su menor

disponibilidad para las neuronas, la disminución y alteración de la normal conformación

de su citoesqueleto y de su estado maduro de diferenciación. Que otros factores han de

haber estado implicados en lo observado, es evidente ya que, a diferencia de los sucedido

con los adolescentes tras 6 semanas de intoxicación, la S-100B, por ejemplo, no disminuyó

en los adultos sino que, por el contrario, aumentó. Nuevos experimentos, al estilo de los

realizados con los animales adolescentes, podrían ser útiles para indicar porqué difieren

entre ambas edades estos hallazgos de alteración y si se recuperan tras la abstinencia y

comparar la recuperación eventual con lo sucedido en los adolescentes.

285
Discusión

V.7. Comparación de los hallazgos entre las distintas edades:

Por último, ¿qué sucedió con cada marcador en cada edad considerada en los distintos

protocolos? ¿Cómo se comportaron evolutivamente ante el mismo estímulo tóxico? Los

distintos protocolos no son enteramente comparables y esto, lamentablemente, es una

debilidad del presente trabajo.

La 5-HT-ir no se modificó en el NDR y aumentó en NMR en las crías sometidas a EPE

desde de E0 hasta P21. En los adolescentes disminuyó en el NDR y no se modificó en el

NMR tras 6 semanas de intoxicación. No es la 5-HTT, es su transportador, el 5-HTT pero,

¿qué pasó con este marcador en los adultos? Disminuyó consistentemente en las tres áreas

prosencefálicas.

¿Qué sucedió con la GFAP-ir, con el área celular de los astrocitos y con su estado de

reactividad ante el estímulo tóxico del EtOH a una concentración del 6,6%? En todas las

edades, en todos los protocolos, en todas las áreas prosencefálicas, la GFAP-ir aumentó.50

Los astrocitos estuvieron hipertrofiados. El daño fue evidente. ¿Se recuperaban del daño?

En los protocolos de EPE (tamto a la edad P21 en el de sin prevención del daño como a

cualqueir edad en el de EPE con prevención del daño), espontáneamente, no. Tampoco en

los adolescentes, aunque tendió a hacerlo. No lo sabemos en los adultos. Sin embargo, con

el uso prenatal de la buspirona, se previno parcialmente el incremento del área celular de

los astrocitos en casi todas las edades postnatales y áreas (sí en el Hipp en P5 y P21 –Figs.

63 y 65– y en la CxF en P35 y P60 –Figs. 64 y 65–; no lo previno en el Hipp en P35 y P60).

50
Las excepciones a lo dicho se observaron en el Strt en las crías P21 del protocolo de EPE sin prevención
del daño (Figs. 41 y 42) y en la CxF de las crías P60 del grupo ES en el protocolo de EPE con prevención del
daño (Figs. 64 y 65).

286
Discusión

¿Qué sucedió con los Nf-200-ir? En el protocolo de EPE sin prevención del daño, en

P21, estaban aumentados en el Hipp y el Strt mas no en la CxF. En los adolescentes, tras

la intoxicación crónica, disminuyeron en las tres áreas y luego de la abstinencia prolongada

siguieron disminuídos en el Hipp, se normalizaron en el Strt y tuvieron un aumento de

rebote en la CxF. En los adultos, tras 6 semanas de intoxicación, igual que lo que sucedió

en los adolescentes, disminuyeron en las tres áreas prosencefálicas. Se ve que,

postnatalmente, en la adolescencia y la adultez, los Nf-200 se compartan de manera similar

tras 6 semanas de exposición in vivo al EtOH pero en los animales expuestos

intrauterinamente la situación postnatal fue inversa.

¿Qué sucedió con la MAP-2-ir, nuestro marcador de dendritas? En la EPE, estaba

postnatalmente disminuída en todas las edades tanto en el Hipp como en la CxF. Esto

implica que ha habido un daño a los circuitos sinápticos y que no se han recuperado

espontáneamente (ES) tras la exposición. Sí pudo prevenirse esta disminución postnatal con

el uso de buspirona. En los adolescentes, la MAP-2-ir disminuyó tras la intoxicación

crónica, en las tres áreas y, tras la abstinencia prolongada, se recuperaron sus niveles en el

Hipp y el Strt mas no en la CxF (un área cognitiva crítica). En los adultos, tras 6 semanas

de EtOH en el agua de bebida, la MAP-2-ir, nuevamente, disminuyó en el Hipp y la CxF;

no pudimos determinar qué le sucedió en el Strt ni sabemos que habría pasado en estos

animales tras una abstinencia prolongada similar a la de los adolescentes. En cualquier

caso, la MAP-2-ir es el marcador más uniforme y consistentemente alterado: a cualquier

edad que se exponga al EtOH a los animales, el daño a las dendritas es cierto, llamativo,

importante y no siempre se recupera tras la abstinencia (CxF); con la buspirona parece

poder prevenirse el daño, en general, más allá de ciertas alteraciones que se observan. En

287
Discusión

todo caso, siempre se manifiesta la alteración morfológica, cualitativa, se haya recuperado

o no, prevenido o no el daño cuantitativo.

¿Qué sucedió con la nNOS? Se vió muy aumentada su expresión en el Strt y la CxF de

las crías P21 sometidas a EPE. En los adolescentes, disminuyó sólo tras la abstinencia tras

haberse mantenido normal luego de la intoxicación.

288
Conclusiones
y Comentarios Finales
“La particular función [del cerebro] es acá la transmisión de los hechos existenciales a través
del flujo cerebral y la consecutiva construcción del Yo con tal grado de claridad que podamos
contraponer los propios límites de nuestros procesos internos individuales con el siempre
configurado mundo exterior.”
Theodor Meynert (1867)1

“El hombre se encuentra profundamente inmerso en ilusiones y en imágenes oníricas, su ojo se


limita a resbalar sobre la superficie de las cosas para ver “formas”, su sensación no conduce
en ningún caso a la verdad, sino que se limita a recibir estmulos y a jugar tecleando sobre el
dorso de las cosas.”2
Friedrich Nietzsche (1873)

“Cuanto más se devela ante nuestro entendimiento la grandeza y el poder de la Creación


viviente tanto más claramente sentimos que detrás del mundo de las manifestaciones aparentes
gobiernan poderes frente a los cuales el saber humano contrapone fuerzas insignificantes de
sólo meras «semejanzas».3
Paul Emil Flechsig (1896).

V.1. Conclusiones:

1. El modelo experimental de AMF en ratas puesto a punto en este trabajo por medio de

la EPE en el agua de bebida, en bajas dosis, en forma crónica, resultó ser un modelo

válido de lo que en los humanos se conoce como trastornos del neurodesarrollo

relacionados con el alcohol (ARND). Esta afirmación se basa en la producción cierta

de daño cerebral microscópico manteniendo a la vez, dentro de los parámetros normales,

el peso al nacer y durante el desarrollo postnatal, la ausencia de microcefalias y

alteraciones groseras del cerebro como así también de malformaciones faciales u

orgánicas congénitas; también hubo ausencia de alteraciones nutricionales en las madres

y en las crías y ausencia de alteraciones en la natalidad. Ttodos estos factores excluyen

1
Meynert (1867), citado en Outes y Eurnekian, 1992. La cita original corresponde al inicio del primer artículo
de una serie en la que el genio de Viena describe la histoarquitectura de la corteza cerebral humana. Esta serie
de artículos se publicó como: M eynert T. Der Bau der Grosshirnrinde und seine örtlichen Verschiedenheiten
nebst einen patologisch-anatomischen Korolarium. Vierteljahrsschrift für Psychatire (1867); 1: 77-93, 198-
217, 381-403 y Vierteljahrsschrift für Psychatire (1868); 2: 88-113.
2
Nietzsche, 1951; pp 86-87.
3
Flechsig, 1896; pág. 41.

290
Conclusiones y Comentarios Finales

la posibilidad de que se hubiera modelado un FAS. Se confirmó la hipótesis I).

2. Aunque microscópicas y moleculares, hubo alteraciones celulares conspicuas en el

cerebro de las crías de madres alcoholizadas gestacionalmente. Según a que se denomine

daño leve, se confirmó total o parcialmente la hipótesis II).

3. Se produjeron displasias corticales microscópicas en la CxF de las crías con EPE.

4. Se constató un tipo de lesión neuronal que, aunque no exclusiva del AMF, sí es

indicativa de la alteración cierta del citoesqueleto.

5. En las crías de madres alcoholizadas la simple abstinencia (no exposición) postnatal no

permite la recuperación espontánea del daño. Por el contrario, la lesión nerviosa se

conserva, incluso, hasta la adultez (P90). Se refutó la hipótesis III).

6. La administración conjunta con el EtOH de una droga agonista de los receptores 5-HT1A,

la buspirona, permitió prevenir completa o parcialmente, según el caso, muchos de los

daños constatados previamente por la EPE. Se confirmó parcialmente la hipótesis IV).

7. En los animales adolescentes expuestos crónicamente al EtOH se indujeron daños que,

tras la abstinencia prolongada, no se recuperaron o se recuperaron parcialmente o

presentaron cambios sobrecompensatorios. Por lo tanto, se confirmó parcialmente la

hipótesis V).

8. El daño al cerebro adulto, por la exposición alcohólica crónica, evidente y de signo

similar al de los adolescentes en la mayoría de los marcadores. Así, se confirmó la

hipótesis VI).

291
Conclusiones y Comentarios Finales

VI.2. Comentarios finales:

Alterando el desarrollo del cerebro, en parte afectando al sistema serotoninérgico, a la

astroglía y al sistema nitrérgico, la EPE predispone al uso y abuso de EtOH y otras drogas

en la adolescencia y a la manifestación de personalidades de tipo antisocial o limítrofe que

predisponen aún más al uso de drogas. También hemos visto que el consumo de EtOH

iniciado en la adolescencia predispone a su vez al alcoholismo como enfermedad ya en la

adultez. Y si la alcohólica es una mujer en edad fértil, y si se embaraza y gesta un feto

sometiéndolo a la EPE... el círculo se cierra, y perpetúa el daño.

En 2006, dos renombrados y sagaces investigadores de EUA (Miller y Spear , 2006), con

una dilatada experiencia en investigación básica en el AMF, han emitido una hipótesis en

una prestigiosa revista especializada. Se percataron de que el círculo “vicioso” expuesto en

el párrafo anterior puede ser la base de lo que

ellos llaman “el generador de alcoholismo”

(Fig. 104).

En dos libros publicados en 1857 y 1860,

Morel postuló su teoría de la degeneración de

la especie como la causa de las enfermedades

mentales (Morel, 1857, 1860). Para Morel,

“las degeneraciones son desviaciones

mórbidas del tipo humano normal que son


Figura 104 . E l gen erador de a lco holism o de M iller y S pea r.
V ersión rem ozada de la decim onónica te oría de la
transmisibles hereditariamente y que deg en eración de M orel y M ag nan . Tom ad o de M iller y S pea r,
2006.

evolucionan progresivamente a la

292
Conclusiones y Comentarios Finales

decadencia”.4 Morel citaba a la intoxicación alcohólica como una de las causas de

degeneración y describió varios casos de hijos de padres alcohólicos. Sin el fondo moral

y religioso de Morel, las ideas de otro psiquiatra francés, Jacques Joseph Valentin Magnan

(1835-1916), sobre la degeneración devinieron en un concepto de regresión en sentido

lamarckiano. A propósito, Magnan estudió la degeneración en pacientes alcohólicos e hizo,

incluso, valiosos experimentos sobre alcoholismo en animales (Magnan, 1874).5 De las

ideas de Morel y Magnan, sumadas a la (mal entendida) teoría de la evolución de las

especies por selección natural de Charles Darwin, surgió, con ciertos coletazos de la

frenología de Gall y de la mano de Cesare Lombroso la teoría de l’uomo delinquente, del

criminal nato. Bien sabemos lo que sucedió con parte de estas teorías en manos de los

nazionalsocialistas alemanes de las décadas de 1930 y 1940, fogoneadas por las ideas del

superhombre de Nietzsche y la superioridad de una “raza” por sobre otras. En todo el

mundo y en el nuestro también, mucha de las ideas de la degeneración dieron origen al

movimiento de la temperancia (que promovía la abstinencia alcohólica), al movimiento

higienista (recuérdese la Liga Argentina de Higiene Mental) y al movimiento eugénico

(recuérdese lo sucedido a los enfermos mentales en la Alemania nazi). Hoy en día, en el

ámbito académico, se ignora soberanamente el concepto de degeneración adquirida como

explicación general de las enfermedades mentales al modo de las líneas de pensamiento de

Morel y Magnan. Pero, desde 1957 (Clarren y Smith, 1978; Jones et al., 1973; Lemoine et

al., 1968; Rouquette, 1957), el FAS y los FASD han venido a ser cada vez más reconocidos

como uno de los efectos de la EPE; ahora sabemos que el consumo de EtOH durante el

4
De esta cita de M orel, quítese la palabra “hereditariamente” (su concepto de herencia era distinto al nuestro)
y se obtendrá la hipótesis del generador de alcoholismo de Miller y Spear.
5
Cfr. el Anexo V (Métodos experimentales de exposición de animales al etanol. Ventajas y desventajas de
cada uno).

293
Conclusiones y Comentarios Finales

embarazo puede dañar el cerebro fetal en desarrollo pasando así a la descendencia el

“estigma de la degeneración” de una madre “degenerada”.

La falta de cultura científica de Miller y Spear los ha llevado a postular una idea

novedosa con 150 años de antigüedad, al modo como Mountcastle (1957) describió las

columnas corticales de Meynert casi 90 años después de que el genio de Viena la observara

en 1867-1868 (Outes y Eurnekian, 1992). Del mismo modo, Clarren, Jones y Smith

describieron el FAS por primera vez, 5 años después de que lo hiciera, por “primera vez”,

Lemoine. Y Lemoine lo describió6 11 años después de que lo describiera, sí por primera

vez, Jacqueline Rouquette, una oscura y olvidada pediatra francesa. Pero ni Morel, ni

Magnan ni Meynert eran personajes desconocidos. La historia, la de la Ciencia también,

muchas veces, se repite.

¿Se repite la historia? En EUA y en Canadá, en ocasiones se enjuicia y encarcela a

mujeres alcohólicas, negras o aborígenes nativas, principalmente, por haber cometido

“maltrato físico infantil” en la figura de sus hijos nonatos, al someterlos a una gestación en

presencia de EtOH (Armstrong, 2003; Goloden, 2005). En ambos países se publican largos

folletos que instruyen a los miembros de las Policías acerca del FAS y su relación con, por

ejemplo, los “sin techo” (¡!) (Laporte et al., 2002; Stade et al., 2004).

Investigadores y los científicos debemos mirar no sólo a nuestros tubos de ensayo,

nuestras grillas de electrónica y nuestras cubetas de Western. También tenemos

responsabilidades éticas y morales para con nuestros colegas actuales y pasados, para con

6
Mejor dicho, lo hizo describir un año antes, en 1967, en la tesis doctoral de un discípulo suyo, Jean-Pierre
Borteyru, que llevaba por sugestivo título “La toxicomanie alcoolique parentale et ses répercussions sur la
desendance” (Borteyru, 1967). La tesis de Rouquette, en 1957, se tituló “Influence de la toxicomanie
alcoolique parental sur le développement physique & psychique des jeunes enfants” (Rouquette, 1957).

294
Conclusiones y Comentarios Finales

nuestros pacientes y, sobre todo, recuérdese, para con la sociedad.

* * *

Nuestro cerebro no es otra cosa que un instrumento, una herramienta de que nos

servimos los animales que lo poseemos para perseverar en la existencia, y propagarla. Esta

herramienta genera regularidades a partir del mundo sensible, crea regularidades allí donde

no las hay; iguala lo desigual. Y crea conceptos y les asigna un valor. Y se sirve de estos

conceptos para predecir el mundo en el que vivimos y permitirnos tener así la oportunidad

de alcanzar la edad necesaria como para poder perpetuarnos en otros.

Si la herramienta ha sido mal forjada mal podrá cumplir, cabalmente, con las funciones

a ella destinadas. Así, la existencia de ese ser poseedor de un cerebro congénitamente

tarado por el alcohol no será, muy lamentablemente, una existencia plena. Muy

posiblemente sufrirá y hará sufrir a otros por efecto de la intemperancia (la de sus

progenitores y la suya propia, eventualmente). Todo aquello que podamos hacer quienes

tenemos la capacidad y la responsabilidad de hacer algo, todas la acciones que podamos

emprender para evitar, minimizar, recuperar o eliminar el daño provocado por el alcohol

a un cerebro en desarrollo, redundará en beneficio no solo de la persona afectada sino

también de su familia, de sus amigos, de sus parejas y compañeros de trabajo, de sus hijos

y nietos. De nosotros mismos, incluso. De la sociedad, en fin.

295
Anexos
Anexo I

Síndrome Alcohólico Fetal (FAS) y trastornos asociados.


Criterios diagnósticos.

VII.1.1. Elementos diagnósticos de Jacqueline Rouquette:1

- Prematuridad.
- Bajo peso y talla al nacer / Bajo peso para la edad gestacional (“niño miniatura”).
- Escaso progreso pondoestatural postnatal.
- Retraso psicomotor paralelo al insuficiente desarrollo físico.
- Microcefalia.
- Facies características (cráneo “abollado” con redes venosas visibles, raíz nasal aplanada, narinas
redondeadas y anchas, labio superior pequeño y “como arremangado”, angioma plano de la frente
persistente más allá de los primeros meses; orejas de implantacón baja y/o en anteversión) (Fig. 105).
- Anorexia.
- “Niño nervioso”: gestos bruscos, sacádicos, temblorosos; atención frágil, fácilmente fatigable.
- Malformaciones asociadas: estrabismo, labio leporino y paladar hendido, pie varo equino, criptorquidia,
hidrocefalia, cardiopatías congénitas, varios tipos de anomalías dactilares.
- Padres negligentes en el cuidado de su desarrollo tanto físico como psicoafectivo.
- Alcoholismo de los padres pero, especialmente, de la madre.

VII.1.2. Criterios Diagnósticos del Institute of Medicine (IoM):2

Categoría 1: FAS con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada:


A Exposición materna al alcohol confirmada.3
B Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales, incluyendo hendiduras palpebrales cortas,
y anormalidades de la región maxilar superior (por ej., labio superior plano, filtrum aplanado,
aplanamiento de la región media de la cara) (Fig. 105).
C Evidencia de retraso del crecimiento, tal como en, al menos, uno de los siguientes:

1
Confeccionados a partir de Rouquette, 1957.
2
Tomado de Stratton et al., 1996.
3
La exposición materna al EtOH se define como un patrón de ingesta alcohólica excesiva caracterizada por
una ingesta regular sustancial, o por una alta ingesta episódica. La evidencia de este patrón de ingesta debe
incluir a los signos de dependencia al alcohol.

297
i. bajo peso al nacer para la edad gestacional,
ii. falta de progreso ponderal postnatal no debido a la nutrición,
iii. bajo peso en relación a la talla.
D Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i. bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.

Categoría 2. FAS Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:


Ausencia del Criterio A. Criterios B-D como en la Categoría 1.

Categoría 3. FAS Parcial con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada:


A Exposición materna al alcohol confirmada.
B Evidencia de algunos componentes del patrón facial del SAF.
Presencia de al menos uno de los siguientes (C, D o E):
C Evidencia de retraso del crecimiento, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i. bajo peso al nacer para la edad gestacional,
ii. falta de progreso ponderal postnatal no debido a la nutrición,
iii. bajo peso en relación a la talla.
D Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i. bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.
E Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el nivel
de desarrollo alcanzado y no explicado por la carga genética o las condiciones ambientales tales como
dificultades en el aprendizaje; déficits en el desempeño escolar; bajo control de los impulsos;
problemas en la percepción social; déficits del lenguaje; baja capacidad de abstracción y
metacognición; déficits específicos en las habilidades aritméticas; o problemas de memoria, atención
o juicio.

Categoría 4. Defectos Congénitos Relacionados con el Alcohol (ARBD, por la sigla en inglés de Alcohol-
related birth defects):
Lista de defectos congénitos, incluyendo malformaciones y displasias:

298
Cardíacos CIA CIV
Transposición de los grandes vasos Tetralogía de Fallot
Esqueléticos Uñas hipoplásicas Clinodactilia
Meñiques cortos Pectus excavatum y carinatum
Sinostosis radiocubital Síndrome de Klippel-Feil
Contracturas en flexión Hemivértebras
Camptodactilia Escoliosis
Renales Aplasia, displasia o hipoplasia renal Duplicación ureteral
Riñón en herradura Hidronefrosis
Oculares Estrabismo Trastornos de la refracción debido a microftalmia
Auditivos Hipo- o acusia de conducción Hipo- o acusia sensorial
Otros Virtualmente cada malformación ha sido descripta en algún paciente con FAS. Sigue siendo
incierta la especificidad etiológica del alcohol para la mayoría de esas anomalías.

Categoría 5. Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND, por la sigla en inglés
de Alcohol-related neurodevelopmental disorders):
A Evidencia de anomalías del neurodesarrollo del SNC, tal como en, al menos, uno de los siguientes:
i. bajo perímetro craneal al nacer,
ii. anomalías cerebrales estructurales (por ej., agenesia parcial o total del cuerpo calloso, o hipoplasia
cerebelosa);
iii. signos neurológicos severos o leves (apropiados para la edad) tales como compromiso de las
habilidades motoras finas, hipo o acusia neurosensorial, pobre marcha en tándem [poor tandem
gait], mala coordinación visuo-manual.
y/o
B Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el nivel
de desarrollo alcanzado y no explicado por la carga genética o las condiciones ambientales tales como
dificultades en el aprendizaje; déficits en el desempeño escolar; bajo control de los impulsos;
problemas en la percepción social; déficits del lenguaje; baja capacidad de abstracción y
metacognición; déficits específicos en las habilidades aritméticas; o problemas de memoria, atención
o juicio.

VII.1.3. Propuesta de revisión de los Criterios Diagnósticos del Institute of Medicine


(IoM) para los FASD:4

I: FAS con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada (todas las características, A-D, son necesarias para
realizar el diagnóstico de esta categoría):

4
Tomado de Hoyme et al., 2005.

299
A Exposición materna al alcohol confirmada.
B Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes (Fig. 105):
i. hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
ii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iii. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C Evidencia de retraso del crecimiento pre- y/o postnatal:
i. altura o peso # al percentilo 10, si es posible corregido para las normas de raza.
D Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más de los
siguientes:
i. anomalías cerebrales estructurales,
ii. perímetro cefálico # al percentilo 10.

II. FAS Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:


IB, IC y ID, como arriba.

III. FAS Parcial con Exposición M aterna al Alcohol Confirmada (todas las características, A-C, son
necesarias para realizar el diagnóstico de esta categoría):
A Exposición materna al alcohol confirmada.
B Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes:
i. hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
ii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iii. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C Otras características, una de las siguientes:
i. Evidencia de retraso del crecimiento pre- y/o postnatal:
a. altura o peso # al percentilo 10, si es posible corregido para las normas de raza.
ii. Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más
de los siguientes:
a. anomalías cerebrales estructurales,
b. perímetro cefálico # al percentilo 10.
iii. Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el
nivel de desarrollo alcanzado y que no pueda explicarse por la carga genética, el ambiente familiar
o las condiciones ambientales solamente
a. Este patrón incluye un compromiso marcado en el rendimiento en tareas complejas (tareas de
resolución de problemas complejos, planeamiento, juicio, abstracción, metacognición, y
aritméticas); déficits de alto nivel en el lenguaje receptivo y expresivo; y conducta alterada
(dificultad en las maneras personales, labilidad emocional, disfunción motora, bajo rendimiento
académico, y deficientes interacciones sociales).

300
III. FAS Parcial Sin Confirmación de la Exposición M aterna al Alcohol:
IIIB y IC, como arriba.

V. Defectos Congénitos Relacionados con el Alcohol (ARBD; todas las características, A-C, son necesarias
para realizar el diagnóstico de esta categoría):
A Exposición materna al alcohol confirmada.
B Evidencia de un patrón característico de anomalías faciales menores, incluyendo dos o más de las
siguientes:
ii. hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10),
iii. borde bermellón fino del labio superior (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum),
iv. philtrum aplanado (puntaje 4 ó 5 con la guía de labio/philtrum).
C Defectos congénitos estructurales en una o más de las categorías sigueintes, incluyendo
malformaciones y displasias (si el paciente presenta solamente anomalías menores, deben estar
presentes dos o más): cardíacos: CIA, CIV, transposición de los grandes vasos; esqueléticos:
sinostosis radiocubital, defectos de la segmentación vertebral, contractura de las grandes
articulaciones, escoliosis; renales: aplasia, displasia o hipoplasia renal, riñón en herradura, duplicación
ureteral; oculares: estrabismo, ptosis, anomalías vasculares retinianas, hipoplasia del nervio óptico;
auditivos: hipo- o acusia de conducción, hipo- o acusia sensorial; anomalías menores: uñas
hipoplásicas, meñiques cortos, clinodactilia de los meñiques, pectus carinatum o excavatum,
camptodactilia, pliegues palmares “en palo de hockey”, trastornos refractivos oculares, orejas “en vías
de ferrocarril”.

VI. Trastornos del Neurodesarrollo Relacionados con el Alcohol (ARND, para realizar el diagnóstico se
requieren tanto A como B):
A Exposición materna al alcohol confirmada.
B Al menos uno de los siguientes:
i. Evidencia de crecimiento cerebral deficiente o de morfogénesis anormal, incluyendo uno o más
de los siguientes:
a. anomalías cerebrales estructurales,
b. Perímetro cefálico # al percentilo 10.
ii. Evidencia de un patrón complejo de anomalías cognitivas o conductuales inconsistentes con el
nivel de desarrollo alcanzado y que no pueda explicarse por la carga genética, el ambiente familiar
o las condiciones ambientales solamente
a. Este patrón incluye un compromiso marcado en el rendimiento en tareas complejas (tareas de
resolución de problemas complejos, planeamiento, juicio, abstracción, metacognición, y
aritméticas); déficits de alto nivel en el lenguaje receptivo y expresivo; y conducta alterada
(dificultad en las maneras personales, labilidad emocional, disfunción motora, bajo rendimiento
académico, y deficientes interacciones sociales).

NOTA: las siguientes consideraciones vales para los criterios diagnósticos propuestos. En cada una de las categorías se asume que la
evaluación genética y médica ha excluído una fenocopia, incluyendo a otros síndromes genéticos y de malformaciones. La exposición

301
materna al EtOH se define como un patrón de ingesta alcohólica excesiva caracterizada por una ingesta regular sustancial, o por una
alta ingesta episódica. La evidencia de este patrón puede incluir frecuentes episodios de intoxicación, el desarrollo de tolerancia o
abstinencia, problemas sociales y/o legales relacionados con la bebida, el involucramiento en conductas físicamente riesgosas mientras
se está bajo los efectos de la bebida, o problemas médicos relacionados con el alcohol tales como hepatopatías. La confirmación puede
ser por entrevista materna o a partir de fuentes colaterales confiables.
Los ARBD y ARND se refieren a condiciones clínicas en las que debe existir una historia de exposición materna al alcohol, y en
las que la investigación clínica o en animales deben correlacionarse la ingesta materna de alcohol con el desenlace observado. Los
ARBD comprende a niños con anomalías estructurales mayores y/o menores que exhiben un crecimiento físico y un desarrollo
intelectual normales. Los ARND comprenden a un patrón específico de conducta y desarrollo alterados en niños con crecimiento y
desarrollo estructural normales.

VII.1.4. Criterios Diagnósticos del Centro para el Control de Enfermedades (CDC)


para los FASD:5

Dismorfia facial:
Basado en normas raciales, el individuo exhibe las tres siguientes características faciales (Fig. 105):
• philtrum liso (puntaje 4 ó 5 de la Guía Labio-Philtrum de la Universidad de W ashington),
• borde bermellón delgado (puntaje 4 ó 5 de la Guía Labio-Philtrum de la Universidad de W ashington),
• hendiduras palpebrales cortas ( # al percentilo 10).

Problemas de crecimiento:
Altura o peso pre- o postnatal, o ambos, # al percentilo 10, confirmados, documentados en cualquier punto
temporal (ajustado por edad, sexo, edad gestacional y raza o etnia).

Anomalías del sistema nervioso central:


I. Estructurales:
1) Perímetro cefálico # al percentilo 10 ajustado para la edad y el sexo.
2) Anomalías cerebrales clínicamente significativas observables por medio de imágenes.
II. Neurológicas:
Problemas neurológicos no debidos a fiebre o injurias postnatales, u otros signos neurológicos
leves fuera de los límites normales.
III. Funcionales:
Rendimiento sustancialmente menor que el esperado para la edad, escolaridad o circunstancias del
individuo, puesto en evidencia por:
1) déficit cognitivo o intelectual global que representa a múltiples dominios o déficit (o retraso
significativo en el desarrollo en los niños más jóvenes) con rendimientos por debajo del
percentilo 3 (2 desvíos estándar bajo de la media para pruebas estandarizadas),
o
2) déficits funcionales por debajo del percentilo 16 (1 desvío estándar bajo la media para
pruebas estandarizadas) en al menos tres de los siguientes dominios:

5
Tomado de Bertrand et al., 2004.

302
a déficits o discrepancias cognitivas o del desarrollo,
b déficits del funcionamiento ejecutivo,
c retraso en el funcionamiento motor,
d problemas en la atención o hiperactividad,
e habilidades sociales,
f otros tales como problemas sensoriales, problemas en el lenguaje pragmático, déficits de
memoria, etc.

Exposición materna al alcohol:


I. Exposición prenatal al alcohol confirmada.
II. Exposición preantal al alcohol desconocida.

Criterios para el diagnóstico de FAS:


Se necesitan los tres hallazgos siguientes:
1. Documentación de las tres anomalías faciales (philtrum liso, bermellón fino, y hendiduras palpebrales
cortas;
2. Documentación de déficits del crecimiento; y
3. Documentación de anormalidad del SNC.

VII.1.5. Código Diagnóstico de 4-Dígitos:6

Este sistema diagnóstico utiliza una escala Likert de 4 grados (donde 1 corresponde a
ausencia y 4 a expresión extrema) para cada uno de las cuatro principales características
diagnósticas:
1) el déficit de crecimiento (ninguna, leve, moderado y significativa);
2) el fenotipo facial del FAS (ausente, leve, moderado y severo) (Fig. 105);
3) el daño o la disfunción del SNC (improbable, posible, probable y definitivo); y
4) la exposición gestacional al EtOH (sin riesgo, desconocido, algún riesgo, alto riesgo).
En la codifición, según el orden previo invariable,cada una de las categorías ocupan sólo
uno y siempre el mismo lugar en el código de 4 dígitos. Así, en esta escala existen,
finalmente, 44 = 256 códigos posibles de 4 dígitos cada uno (desde el 1111 al 4444). Cada
uno de estos 256 códigos se agrupan, y caen, dentro de una de 22 categorías diagnósticas
diferentes (denominadas con letras, de la A a V). Las categorías E-J, K-P, y Q-V sólo

6
Tomado de Astley y Clarren, 2000.

303
difieren por la exposición al alcohol por lo que, esencialmente, hay solamente 9 categorías
diagnósticas únicas en contraste con las 5 categorías del criterio utilizado por los CDC. Para
mayores detalles de este sistema algo engorroso se remite al lector al trabajo original
(Astley y Clarren, 2000). Solo a modo de ejemplo se presenta la grilla siguiente:

3 2 4 4

significativo severo definitivo (4) X X (4) alto riesgo

moderado moderado probable (3) X (3) algún riesgo

leve leve posible (2) X (2) desconocido

ninguno ausente improbable (1) (1) sin riesgo

Crecimiento Cara Cerebro Alcohol

Déficit de Fenotipo Daño Alcohol


crecimiento facial del cerebral prenatal
FAS

Esta grilla se utiliza para registrar el Código Diagnóstico de 4-Dígitos siguiendo los lineamientos
presentados por Astley y Clarren (2000). Un código de 3 ó 4 en la columna Crecimiento o Cara se denomina
como “hallazgo físico centinela” (cuadros gris oscuro). Un código de 2 en la columna Cerebro es un
“trastorno neuroconductual” (cuadro rayado horizontal); un código de 3 ó 4 es “encefalopatía estática”
(cuadros negros). Un código de 3 ó 4 en la columna de Alcohol es “expuesto al alcohol” (cuadros rayado
vertical) y un código 2 es “exposición al alcohol desconocida” (cuadro gris claro). Por lo tanto, el código
ejemplificado (3244) recibiría el nombre de “hallazgos centinela físicos, encefalopatía estática, expuesto al
alcohol).

VII.1.6. Lineamientos canadienses para el diagnóstico del FAS, FAS parcial y los
ARND:7

Los criterios para el diagnóstico del síndrome alcohólico fetal, tras haber excluído otros diagnósticos, son:
A. Evidencia de un compromiso pre- o postnatal del crecimiento, tal como en al menos 1 de los siguientes:
a. Peso o talla al nacer # percentilo 10 para la edad gestacional.
b. Peso o talla # percentilo 10 para la edad.
c. Relación peso/talla desproporcionadamente baja ( # percentilo 10).
B. Presentación simultánea de al menos 3 de las siguientes anomalías faciales a cualquier edad (Fig. 105):
a. Hendidura palpebral corta (2 o más desvíos estándar bajo la media).
b. Philtrum liso o aplanado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
c. Labio superior delgado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).

7
Tomado de Chudley et al., 2005.

304
C. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
D. Exposición materna al alcohol confirmada (o no confirmada).

Los criterios diagnósticos para el síndrome alcohólico fetal parcial, tras haber excluído otros diagnósticos,
son:
A. Presentación simultánea de 2 de las siguientes anomalías faciales a cualquier edad:
a. Hendidura palpebral corta (2 o más desvíos estándar bajo la media).
b. Philtrum liso o aplanado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
c. Labio superior delgado (puntaje 4 ó 5 en la guía labio-philtrum).
B. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
C. Exposición materna al alcohol confirmada.

Los criterios diagnósticos para los trastornos del neurodesarrollo relacionados con el alcohol, tras haber
excluído otros diagnósticos, son:

A. Evidencia de compromiso en 3 ó más de los siguientes dominios del sistema nervioso central: signos
neurológicos leves o severos; estructura cerebral; cognición; comunicación; logros académicos; memoria;
funcionamiento ejecutivo y razonamiento abstracto; déficit de atención/hiperactividad; conducta
adaptativa, habilidades sociales, comunicación social.
B. Exposición materna al alcohol confirmada.

El término trastornos congénitos relacionados con el alcohol (ARBD) no debería usarse como un término
diagnóstico paraguas para el espectro de los efectos del alcohol. Los ARBD constituyen una lista de anomalías
congénitas que incluyen malformaciones y displasias y debería usárselo con precaución.

305
Figura 105 . A specto d el fen otipo facial de pe rson as afectadas el A M F y qu e presen tan FA S . A : ne on ato d e 1 d ìa d e ed ad ; nó tese
el m arcado hirsutism o, el labio superio r d elgado, la ausencia del philtrum y la nariz de raíz aplanada, casi en silla en m onta r visible
en el perfil (to m ado de Jones y S m ith , 1973). B : niños de 3 años y 9 m eses de edad y de 2 años y 6 m eses (tom ado de Jones et a l.,
1973). C : pacientes de 17 y de 2,5 años de edad, respectivam ente; nótese cóm o, a p esar de haber llegado a la adolescencia, el
pa cien te d e la izqu ierda aú n presen ta las características faciales típicas d el FA S , algo qu e, sin em ba rgo , pu ed e ir pe rdiénd ose
c on el tie m po y la m aduración (tom ado de C larren y Sm ith, 1978). D : fotom icrog rafías d e m icroscop ía electrónica d e b arrid o d e
fe to s de ra ta norm al (a la izquierda) y afectada por e l FA S (en m ed io) a la m ism a ed ad g estacional, y asp ecto d e un recién nacid o
claram ente m icrocéfalo; nótese, en los fetos de rata, cuán evidente son la m icrocefalia, la m icroftalm ía, y los defectos del
desarrollo fac ial, eviden tes so bre todo en el lab io su perior (m odifica do de S ullik, 20 05 ). E : Fran ço is (34 a ños) y Joseph (22 añ os),
do s h ijo s “de padres alcohólicos”, am bos débiles m entales, p osib lem ente el p rim er registro g ráfico d e p acientes afectados p or
e l F A S , se gú n una litografía del Tratado de M orel (1857). F: K .M ., niña d e 6 años d e edad afectada d e FA S, uno de los p rim eros
ca so s d ocu m en tad os en nuestro p aís (R eich m an et al., 19 79 ).

306
Anexo II

Manifestaciones fenotípicas físicas en el


Síndrome Alcohólico Fetal.8

Grupo de M anifestaciones de presentación clínica


anomalías
Frecuente Infrecuente

Retraso del crecimiento intrauterino, bajo


Pre y perinatales peso para la edad gestacional y bajo peso al
nacer

Microcefalia, ptosis palpebral, estrabismo,


Miopía, microftalmia clínica, blefarofimosis,
hipertelorismo, pliegue epicanto, puente
Craneofaciales conchas auriculares malformadas, labio
nasal plano, philtrum ausente o hipoplásico,
(dismorfismo facial) leporino y/o paladar hendido, dientes
rotación posterior de las orejas, bordes
pequeños con esmalte defectuoso
palatinos laterales prominentes

Comunicación interventricular (CIV),


Soplos (especialmente durante la primera
Cardíacas anomalías de los grandes vasos, tetralogía
infancia), comunicación interauricular (CIA)
de Fallot
Hipospadias, riñones hipoplásicos rotados,
Renogenitales Hipoplasias labiales
hidronefrosis.

Hemangiomas capilares, pliegues palmares Hirsutismo en la infancia, hipoplasia


Cutáneas
aberrantes ungueal especialmente en el meñique

Reducción de la movilidad articular


especialmente de los dedos y codos,
polidactilia, sindactilia, sinostosis
Esqueléticas Pectus excavatum radiocubital, pectus carinatum, apófisis
xifoides bífida, luxación congénita de
cadera, deformidades en flexión de los
dedos, anomalía de Klippel-Feil, escoliosis

Hernias diafragmáticas, umbilicales o


Musculares inguinales, diastasis del recto anterior del
abdomen

8
En base a datos tomados de Clarren y Smith, 1978; Adams y Victor, 1993; Schuckit, 1995; Stratton et al.,
1995.

307
Anexo III

Receptores serotoninérgicos.

Los receptores que tienen a la 5-HT como ligando específico, según las últimas
clasificaciones al uso, se agrupan en cuatro subfamilias de receptores metabotrópicos (7
dominios transmembrana, ligados a proteína G) y una subfamilia constituida por un único
receptor ionotrópico (ligado a un canal iónico) cuyo integrante es el receptor 5-HT3. Se
agrega a estos, un receptor huérfano, no agrupado y atípico, de localización enteral (el
5-HT1P). Se conocen otros dos receptores (5-ht5A y 5-HT5B) que pueden constituir una
familia pero de los que aún se desconoce el mecanismo de acción (ver Tabla 1) (Aghajanian
y Sanders-Bush, 2002).
Los receptores metabotrópicos (Fig. 17) comprenden a los agrupados como subfamilia
5-HT1 (acoplados negativamente a la adenilato ciclasa y que incluyen a los subtipos 5-
HT1A, 5-HT1D"a, 5-HT1D$ß, 5-ht1E y 5-ht1F); la subfamilia 5-HT2 (estimulan a la fosfolipasa
C y la vía de los fosfoinosítidos, e incluye a los subtipos 5-HT2A, 5-HT2B y 5-HT2C), y una
tercera subfamilia 5-HT4, 5-ht6 y 5-HT7, que incluye a esos tres tipos de receptores (todos
acoplados positivamente a la adenilato ciclasa).
Los receptores serotoninérgicos están codificados en distintos genes y pueden sufrir
distintos tipos de modificaciones post-transcripcionales que aumentan potencialmente su
variedad y posibilidades de regulación. Los receptores de esta gran familia presentan
patrones diferenciales de expresión, tanto periférico como central. Para la mayoría de ellos
se han desarrollado también drogas agonistas y antagonistas, con mayor o menor
especificidad, útiles a la hora de realizar estudios farmacológicos y de uso clínico en
humanos.

308
Tabla 12. Receptores serotoninérgicos:

Subfamilia y tipo de Locus Mecanismo


Distribución conocida
receptor* humano efector §

S ubfam ilia 5-H T 1

H ipocam po (capa de células piram idales),


am ígdala, septum lateral, neuronas
piram idales de la corteza cerebral, corteza
entorrinal (altas concentraciones), Inhibe A C
5-H T 1A 5q11.2-13
hipotálam o, ND R , núcleo m agno del rafe, A bre canales de K +
ganglio de la raíz dorsal, células de P urkinj ,
núcleo prepósito del hipogloso, sustancia gris
periacueductal, hipotálam o ventrom edial,

S ustancia negra, ganglios basales, tubérculo


5-H T 1D"a 1p34.3-36.3 Inhibe A C
cuadrigém ino superior

S ustancia negra, ganglios basales, tubérculo


5-H T 1D$ß 6q13 Inhibe A C
cuadrigém ino superior

5-ht 1E ? ? Inhibe A C

C orteza cerebral, estriado, hipocam po, bulbo


5-ht 1F 3p11 Inhibe A C
olfatorio

S ubfam ilia 5-H T 2:

C laustrum , corteza cerebral, bulbo olfatorio, E stim ula P LP C


5-H T 2A 13q14-21
estriado, núcleo accum bens C ierra canales de K +

5-H T 2B 2q36.3-37.1 ? E stim ula P LP C

P lexo coroideo, globo pálido, corteza


5-H T 2C Xq24 cerebral, hipotálam o, septum , sustancia E stim ula P LP C
negra, m édula espinal

H ipocam po, corteza entorrinal, am ígdala,


núcleo accum bens, nervio del tracto solitario C anal iónico para
R eceptor 5H T 3 ?
y trigém ino, núcleo m otor dorsal del vago, cationes
área postrem a, m édula espinal

S ubfam ilia 5-H T 4, 5-ht 6, 5-H T 7

H ipocam po, estriado, bulbo olfatorio,


5-H T 4 ? E stim ula A C
sustancia negra

5-ht 6 ? ? E stim ula A C

C orteza cerebral, septum , tálam o,


5-H T 7 10q23.3-24.3 hipotálam o, am ígdala, tubérculo E stim ula A C
cuadrigém ino superior

S ubfam ilia (?) 5-ht 5A, 5-H T 5B

5-ht 5A 7q36 ? Inhibe A C

5-H T 5B 2q11-13 ? ?

R eceptor 5-H T1P ? periférico, en neuronas del intestino ?

* En algunos casos se utilizan letras en m inúscula debido a que las funciones m ediadas por tales receptores aún no se conocen en tejidos
intactos.
§
A C : adenilato ciclasa; P LP C : fosfolipasa C .

309
Anexo IV

Estructura de ciertas proteínas relevantes al presente trabajo.

VII.4.1. Estructura de la proteína S100B:

La proteína S100B9 es miembro de la familia multigénica de proteínas S100, todas de


bajo PM, que comparten una estructura de tipo hélice-bucle-hélice.10 La familia S100
incluye, al menos, a 25 miembros de expresión exclusiva en los vertebrados y que
pertenece, a su vez, a la gran superfamilia de proteínas ligadoras de Ca2+ (Santamaria-Kisiel
et al., 2006). Los miembros de esta familia son: S100A (tipos 1 a 18), S100B, S100G
(calbindina D9k), S100P, S100Z, profilagrina, tricohialina, y repetina (Santamaria-Kisiel et
al., 2006).
En el ser humano, el gen que codifica a la
S100B se encuentra en el brazo largo del
cromosoma 21 (21q22.3) (Allore et al., 1990). F ig u ra 10 6. R ep rese ntación esquem ática de la estructu ra
secundaria de un m onóm e ro d e pro te ína S 100 com o la
S 100 $. N : extrem o am ino-term in a l; H I, H II, H III y H IV :
La S100B es una proteína ácida, segm entos h elicoidales; L1 y L2: bucles; H : región b isagra;
C : región carboxilo-term inal. M odificado de D onato, 2003.
homodimérica, formada por dos monómeros
de 91 aminoácidos y 21 kDa de PM, secuencialmente iguales. Ambos monómeros de
S100$ se unen por uniones no covalentes para formar la S100B dimérica. Cada
monómero11 está formado por cuatro regiones helicoidales (denominadas HI, HII, HIII y
HIV) separadas por dos bucles ligadores de Ca2+ del tipo llamado “EF-hand” (el bucle L1,
situado entre HI y HII, comprende a los aminoácidos 18-31 y es de estructura no
convencional – o “pseudocanónica” –) mientras que el L2, situado entre HIII y HIV,
comprende a los aminoácidos 61-72 y es de estructura canónica). Entre las hélices HII y
HIII se ubica una región bisagra, denominada H (por hinge, en inglés). Tras la región HIV
se situa un corto segmento carboxi-terminal (Figs. 106 y 107). El bucle L1, situado hacia

9
También denominada, en ocasiones, con la sigla NEF por neurite extension factor (factor de extensión de
neuritas, en inglés).
10
Helix-loop-helix, en inglés.
11
A la proteína monomérica (y al gen que la codifica) se los denomina, generalmente, S100 $; en tanto que
al dímero conformado se lo denomina S100B o S100b.

310
el extremo amino-terminal del monómero,
liga Ca2+ con una afinidad aproximadamente
100 veces menor (Kd . 200-500 :M) que el
bulce L2 situado hacia el otro extremo (Kd .
10-50 :M) (Santamaria-Kisiel et al., 2006). Si
bien las principales funciones de la S100B
están relacionadas a su capacidad ligadora de
dos átomos de Ca2+ por monómero, puede
ligar también iones Zn2+ con afinidades
nanomolares (Kd = 94 ± 17 nM) en un sitio
distinto a aquel en el que se une el Ca2+; la
Figura 107. R epresenta ción de un m odelo de cinta s de la
unión de un átomo de Zn2+ incrementa p roteína S-100B hum ana en la que los seg m entos
helicoidales se m uestran con núm ero s ro m anos para uno (I-
IV ) y otro m o nóm ero (I’-IV ’). M odificado de Ferguson y S haw ,
notablemente la afinidad de la proteína por los 2002.

iones de Ca2+ y por sus proteínas blanco


(Scotto et al., 1998; Wilder et al., 2003). La S100B puede ligar también iones Cu2+ (Kd =
0,46 :M) a razón de 4 ó 6 iones por dímero (en ausencia o presencia de L-ascorbato,
respectivamente) y, en determinadas condiciones, podría disminuir el daño celular
oxidativo por medio del secuestro de iones Cu2+ (Nishikawa et al., 1997).
Tras la unión de dos átomos de Ca2+ a cada
monómero, la S100B se dimeriza y modifica
notablemente su estructura terciaria de modo
tal que el dímero abre su estructura y expone
al medio regiones hidrofóbicas (previamente
ocultas) de su secuencia aminoacídica. Esto le
permite acomodar a (e interactuar con) una Fi g ura 108. R epresentación esq uem ática d el p osib le m od o
de interacción d e la p ro teína S 100B dim érica con las
p roteínas b lanco. Las regione s d e reconocim iento (zona
proteína blanco en cada uno de sus extermos rayada), localizadas en los extrem os d el d ím ero y
conform adas p or p orciones hid rofób icas d e am b os
o p u e st os. P uede así en t re c r u z a r m o nóm e ros, perm iten la interacción del dím e ro co n
p roteínas b lanco hom ólog as o heterólog as. M od ificad o d e
D onato, 2003.
funcionalmente dos proteínas blanco, sean
estas homólogas o heterólogas (Fig. 108). En esta interacción de la S100B con las proteínas
blanco, las regiones bisagra y el segmento carboxi-terminal juegan un papel crítico ya que
le permiten unirse a varias proteínas. Dentro de los astrocitos, en el SNC normal, la S100B
se acumula en estado libre, reducido en los grupos sulfhidrilos de los residuos Cys $68 y
Cys $84. Sin embargo, es secretada en forma oxidada (Scotto et al., 1998). La capacidad

311
promotora de la extensión de neuritas (como las capacidades neurotrófica y mitogénica
glial, en general) depende críticamente de que la S100B dimérica se encuentre en estado
oxidado en los grupos sulfhidrilo de los residuos Cys $68 y Cys $84, ya que la forma
reducida es inactiva en relación a tales funciones (Scotto et al., 1998).
Los niveles de expresión de la S100B dependen de varios factores ambientales. Su
expresión está bajo un fuerte control regulatorio transcripcional y se postula que, en los
seres humanos, la expresión puede estar reprimida constitutivamente en todos los tipos
celulares por elementos regulatorios represores. De este modo, sólo la presencia de factores
inductores que contrarreste los efectos de los represores sería capaz de favorecer la
expresión del gen. Esto permitiría una muy fina y óptima regulación de los niveles de
expresión de la proteína.

VII.4.2. Estructura del receptor para los productos finales de la glucosilación


avanzada (RAGE):

Este receptor fue descripto originalmente en el endotelio de los capilares pulmonares


de terneros recién nacidos, en investigaciones relacionadas al daño vascular que se observa
en la diabetes y que se sospechaba producido por la acumulación y adhesión al endotelio
de proteínas que han sufrido una extensa glucosilación no enzimática; de allí su
denominación (Schmidt et al., 1992; Neeper
et al., 1992).
El RAGE es una proteína transmembrana
de 45 kDa de PM, perteneciente a la
superfamilia de los receptores de superficie
celular símil-inmunoglobulinas con capacidad
de unión a múltiples ligandos. Se lo encuentra
en muchos tipos celulares entre los que se F ig u ra 109. E structu ra del R A G E con los dom inios sím il-
inm unoglobulina d e tipo V (variab le) y C 1 y C 2 (co nstantes).
encuentran las células endoteliales, células del Se m uestran los sitios d e unión d e: i) la anfoterina (una
proteína con actividad prom otora de la extensión d e neuritas
de m áxim a expresión d urante el desarrollo y, quizá s, el
sistema mononuclear fagocítico, hepatocitos, lig and o esp ecífico d el R A G E); ii) los p rod uctos finales d e
glucosilación avanzada (A G E s); iii) la S 100A 6 y S 100A 12; y
células musculares lisas, células mesangiales iv) la S 100B , entre los dom inios V y C 1 . A la derecha,
esquem a de la inm uno globulina G (IgG ) con su típica
estruc tura de do bles cade na s livian as y pesad as; se o bserva
y ciertos tipos de neuronas (Valencia et al., la sim ilitud estructural. A m b as m oléculas se m uestran en sus
fo rm a s tra n sm e m b rana, adherid a s a la m e m b ra n a
citoplasm ática. A se m e ja n za de lo que sucede con la IgG ,
2004). tam bién existen form as secretorias del R A G E (sR A G E ) en las
q ue falta el p eq ueño d om inio intracitop lasm ático.

312
El RAGE está conformado por una cadena de 394 aminoácidos con 3 dominios
globulares extracelulares de 332 aminoácidos (un dominio V y dos dominios C -C1 y C2-)
con estructuras secundarias predominantes de hoja $ plegada en los que reside la capacidad
de unión a sus ligandos; un corto segmento helicoidal intramembranoso de 19 aminoácidos
hidrofóbicos y una pequeña secuencia intracelular fuertemente ácida de 43 aminoácidos que
es crítica para su capacidad de transducción intracelular de señales (Huttunen et al., 1999;
Neeper et al., 1992) (Fig. 109). El gen del RAGE, en el ser humano, está localizado en el
brazo corto del cromosoma 6 (6p21.3), en la región codificante de las moléculas del
complejo mayor de histocompatibilidad de tipo III (CMH III) (Sugaya et al., 1994).

VII.4.3. Estructura de los filamentos intermedios (FI):

Ultraestructuralmente, los filamentos


intermedios forman unas fibras semejantes
a cuerdas de unos 8-12 nm de diámetro y
de longitud variable (pueden sobrepasar los
100 :m).
Fig ura 110.. Estructura general d e las p roteínas d e los filam entos
Las proteínas que constituyen a todos in term edios. E n a) se observa el dom inio central bastoniform e
con estructura terciaria en " -hélice y los dos d om inios g lobulares
los tipos de FI están compuestas por unos de los extrem o s a m ino - y carbo xilo-term ina l. E n b ) se ob serva
q ue el segm ento central se halla interrum p id o p or cortos
segm entos d e unión no helicoid ales. M od ificad o a p artir d e
310-350 residuos de aminoácidos y tienen C oop er, 2002 y B ecker et al., 2007.

unos 45 nm de longitud. Estas proteínas


poseen una cabeza globular en el extremo
amino-terminal, una cola también globular
en el extremo carboxi-terminal y un
dominio bastoniforme central, alargado,
con estructura de "-hélice levógira. En el
dominio central se encuentran 4
subdominos helicoidales (denominados
Figura 111. E nsam blaje de los filam ento s inte rm edios desde la
1A, 1B, 2A y 2B) separados entre sí por unidad m onom érica con p olarid ad hasta el tetram ero escalonad o
sin po laridad. M odificado a partir de A lberts et al., 2006.

cortos segmentos de unión no helicoidales


(Fig. 110). A medida que se van ensamblando en el citoplasma, dos moléculas de FI se
enrollan en espiral por la zona central helicoidal y conforman un dímero. Dos dímeros se

313
asocian entre sí por medio de enlaces covalentes para formar un tetrámero. Esta asociación
no es simétrica o paralela sino que es escalonada e intercalada, o antiparalela, ya que las
cabezas y las colas globulares de los dos dímeros se asocian en forma despareja; es decir,
las cabezas amino-terminales de un dímero con las colas carboxi-terminales del otro en un
mismo extremo. Así, los dímeros, que tenían una polaridad estructural (por presentar una
cabeza y una cola), se asocian en tetrámeros que carecen de tal polaridad (Fig. 111).
Dado que el tetrámero no es polar, el
FI resultante, ensamblado a partir de la
reunión de estos también carece de tal
propiedad (Karp, 2006).12 Por último,
ocho tetrámeros se unirán luego entre
sí, en forma términoterminal y
laterolateral por medio de enlaces no
covalentes, para formar el FI cordiforme
(Alberts et al., 2006; Karp, 2006) (Fig.
112).
El agregado o la resección de grupos
fosfato (fosforilación y desfosforilación
de las subunidades) controla el
F igura 11 2. E nsam blaje de los filam en tos interm ed ios desd e la
ensamblaje y desensamblaje de casi form ación d e octám eros a partir d e d os tetrám eros y la com p osición
final del FI co rdiform e (arriba). E n m ed io, im ag en al m icro sc o p io
todos los tipos de FI (Karp, 2006). e lectrónico de un neurofilam e nto en el que se aprecian los bra zo s
laterales exten d i énd ose desd e el eje central. A b ajo, im agen d e
m icroscop ía electrónica d e un p reparado d e axón obtenid o p or
Estos cambios controlados del nivel de críofractura en el que se ap recia el entram ado citoesquelético
form ado p or los neurotúb ulos (sólo se ven d os, flechas) y los
neurofilam entos, unid os entre sí p or los b razos laterales (cab ezas d e
grupos fosfatos hace que los FI sean un flecha). M : m itocond rias. M odificado de A lberts et al., 2006 y Lee y
C leveland, 1996.
componente del citoesqueleto
fácilmente regulable por las especiales condiciones cambiantes de una célula. Son, por ello,
estructuras particularmente dinámicas.
Los dominios centrales en "-hélice tienen una secuencia aminoacídica semejante en los
diferentes tipos de proteínas de FI lo que determina que, cuando se asocian en haces entre
sí, formen filamentos con un diámetro y una estructura interna similar independientemente
del tipo de FI. Sin embargo, las cabezas y las colas globulares, por el contrario, varían
considerablemente en tamaño y secuencia aminoacídica y, al estar expuestas en la

12
Recuérdese que los otros componentes del citoesqueleto (los microtúbulos y los microfilamentos), a
diferencia de los FI, sí presentan polaridad.

314
superficie, permiten que los FI interactúen entre sí y con otros componentes del citoplasma
(Alberts et al., 2006).

VII.4.4. Estructura de la proteína asociada a microtúblos de tipo 2 (MAP-2):13

La MAP-2 está codificada en el


cromo so ma 2q 34 -q3 5. Tras la
transcripción de los 20 exones que
contiene este único gen, se pueden obtener
múltiples isoformas que resultan del
empalme alternativo del pre-ARNm. Sin
embargo, todas las isoformas se agrupan en
dos grandes grupos de alto y bajo PM
(HMWMAP-2 y LMWMAP -2,
respectivamente, por las siglas en inglés de Figu ra 113. A rriba , estruc tura de las M A P -2 de alto y ba jo p e so
m olecular (H M W M A P-2 y LM W M A P-2, resp ectivam ente) con sus
dom inio central (C D ), dom inio de u nión d e la subunidad
high y low molecular weight MAP-2). Las regulatoria R II de la P K A (R II), dom inio rico en prolina (P R D ) y el
dom inio de un ión a la tubulina (TB D ). M odificado de S ánchez et
HMWMAP-2 incluye a las MAP-2A (280 al., 2000. A b ajo, representación d e la M A P-2 unid a a un M T y
posición del dom inio o brazo de pro yección late ral.

kDa) y MAP-2B (270 kDa) y las


LMWMAP-2 incluyen a las MAP-2C (70 kDa) y MAP-2D (75 kDa). Ambos grupos de
MAP-2 poseen, hacia el extremo carboxi-teminal de la molécula, 3 ó 4 secuencias repetidas
espaciadas por 13-14 residuos de aminoácidos, que constituyen los dominios de unión a la
tubulina (TBD, por las siglas en inglés de tubulin-binding domain).14 Inmediatamente antes
de los TBD, todas las isoformas de MAP-2 poseen un dominio rico en prolina (PRD, por
las siglas en inglés de proline rich domain); finalmente, hacia el extremo amino-terminal,
existe en todas ellas una secuencia de 31 residuos de aminoácidos que constituye la región
de unión de la subunidad regulatoria RII de la proteín-quinasa AMPc-dependiente (PKA)
(Fig. 113). La principal diferencia entre las HMWMAP-2 y LMWMAP-2 es la ausencia en
estas últimas de un dominio central constituido por los exones 9-11 del transcripto

13
La mayor parte de los datos de esta subsección los he tomado de la excelente revisión de Sánchez et al.
(2000).
14
La MAP-2 se une por medio de sus TBD a la región carboxi-terminal ácida de los dímeros de tubulina, al
igual que las proteínas motoras (dineína y kinesina) por lo que puede interferir con la unión de éstas a los MTs
y, por ello, con el proceso de transporte de organelas mediado por proteínas motoras.

315
primario. Todas las MAP-2 son moléculas no compactas, flexibles que parecen carecer de
una estructura secundaria definida. La región carboxi-terminal de la MAP-2, incluyendo
a los TBD y PRD, se une estrechamente a los MTs en tanto que el resto de la molécula
(denominado dominio de proyección, y que comprende el extremo amino-terminal) se
proyecta fuera de la superficie del MT formando una especie de extensión en forma de
brazo (Fig. 113).

La M AP-2 es regulada en sus funciones por medio de la acción de importantes modificaciones post-
traduccionales de la molécula. M ás allá de algunos mecanismos regulatorios que parecen ser de menor
importancia (como por ejemplo los mediados por el fosfatidilinositol, la glucosilación y la ADP-ribosilación),
los principales mecanismos regulatorios de esta proteína se hacen efectivos por medio de su fosforilación y
desfosforilación en residuos específicos de serina y treonina ubicados en distintos lugares de la cadena
aminoacídica. Así, la M AP-2 es sustrato de numerosas quinasas y fosfatasas.
Entre las proteín-quinasas, se ecuentran: i) la proteín-quinasa AM Pc-dependiente (PKA), para la cual
la M AP-2 posee una secuencia de unión específica donde se une la subunidad RII de la enzima (Fig. xx); la
fosforilación de la MAP-2 por la PKA disminuye su unión a la tubulina y a la actina, aumenta la tasa constante
de disociación de los polímeros MTS, reduce la actividad de nucleación de los MTs inducida por la MAP-2
e inhibe la proteólisis de la MAP-2 mediada por calpaína; ii) la proteín-quinasa II Ca 2+-calmodulina-
dependiente (CAM KII), una enzima muy abundante en las espinas dendríticas y en las densidades
postsinápticas (que puede estar involucrada en los procesos de almacenamiento de los trazos de memoria);
su acción fosforilatoria sobre la MAP-2 inhibe la acción promotora del ensamblaje de los M Ts y de
entrecruzado de los MFs que posee la MAP-2; iii) la proteín-quinasa Ca 2+/fosfolípidos-dependiente (PKC),
cuya acción fosforilatoria sobre los residuos del TBD y otros lugares de la MAP-2 reduce su capacidad de
inducir la polimerización de tubulina y también inhibe su interacción con la actina de los MFs; iv) las proteín-
quinasas dirigidas por prolina (PDPKs), un grupo de quinasas con actividad fosforilatoria sobre residuos
de Ser/Thr-Pro capaces de modificar el perfil tridimensional de toda la proteína lo cual, a su vez, puede
modificar su capacidad para interactuar con otras proteínas, su cinética desfosforilatoria, su localización
subcelular o su degradación; entre este grupo de quinasas se encuentran: las quinasas reguladas por señales
extracelulares (ERK),15 las quinasas ciclina-dependientes (CDK), y la glucógeno sintetasa quinasa 3
(GSK3). Las ERKs están asociadas a los MTs; su acción fosforilatoria sobre la región carboxi-terminal de
la MAP-2 puede reducir significativamente su capacidad para inducir la polimerización de la tubulina aunque
la mayoría de los sitios de fosforilación de la MAP-2 por las ERKs están en la región amino-terminal; las
ERKs pueden participar así en la regulación del crecimiento de las neuritas, en la transmisión sináptica y en
la memoria a largo plazo. De las CDKs, la CDK5 es particularmente abundante en las neuronas en las que
pueden jugar un rol importate en la migración neuronal y en la extensión y el crecimiento de las neuritas; las
CDKs se asocian a los MTs y la acción fosforilatoria de las CDKs sobre la funcionalidad de la MAP-2 puede
ser similar a la que ejercen las ERKs. La acción fosforilatoria de la GSK3 sobre la MAP-2 puede modificar
la estabilidad de los MTs (hacia la desestabilización) y controlar el desarrollo neuronal.16
Entre las fosfatasas que la desfosforilan se encuentran las serina/treonina proteín-fosfatasas como la PP1,
PP2A, PP2B (calcineurina, una fosfatasa Ca 2+-dependiente) y la PP2C. La estimulación de los receptores
glutamatérgicos NMDA aumenta la desfosforilación de la MAP-2 presumiblemente por acción de las
fosfatasas PP2B y PP1.

La fosforilación de las MAPs es el principal mecanismo por el cual se regula la dinámica

15
Las ERKs (por las siglas en inglés de extracellular signal-regulated kinases) también reciben la
denominación MAPK/ERK por las siglas en inglés de mitogen-activated protein kinases (MAPK) dado que
varias de las señales extracelulares que las activan son mitógenas y conserva así la misma sigla original que
tenían cuando se las denominaba microtubule-associated protein 2-kinases (MAPK).
16
Es curioso que el litio, una droga que se utiliza en clínica neuropsiquiátrica como estabilizador del ánimo
y antirrecurrencial en la enfermedad maníaco-depresiva, es un inhibidor de la GSK3.

316
microtubular en respuesta a las cambiantes señales extracelulares. Estos cambios de la
dinámica microtubular son cruciales para la morfogénesis y el establecimiento de la
polaridad neuronal. Los altos niveles de fosforilación de la MAP-2 disminuyen su
asociación a los MTs pero también sucede lo mismo con los altos niveles de
desfosforilación. Por ello, se cree que es posible que, más que los niveles totales de
fosforilación de la MAP-2, la ubicación de esos grupos fosfato en la molécula de la MAP-2
sean los determinantes de los niveles de unión intermolecular. Los niveles de fosforilación
de la MAP-2 también determinan su susceptibilidad a la degradación y ello tiene relevancia
para el nivel de ensamblaje de los Mts.

317
Anexo V

Métodos experimentales de exposición de animales al etanol.


Ventajas y desventajas de cada uno.

Un sistema “E” sirve como modelo de otro sistema “R” si el estudio del sistema E
permite conocer íntimamente lo que sucede en R independientemente de cualquier
conexión causal que pueda existir entre E y R. Para que un modelo sea eficiente como tal,
el sistema E debe ser más simple que el sistema R (Tabakoff y Hoffman, 2000).
En las ciencias biomédicas, los modelos experimentales (E) que se llevan a cabo in vivo
permiten reproducir en forma controlada, utilizando animales de laboratorio, uno o varios
aspectos de la realidad (R) observada en los seres humanos con la finalidad última de
comprender sus mecanismos íntimos y/o intervenir en ellos. Por lo tanto, de la correcta
elección del modelo experimental que se utilice dependerá el conocimiento óptimo que se
pueda extraer de él. Huelga aclarar que ese conocimiento, en relación con la realidad, será,
siempre, parcial.

Uno de los primeros investigadores que inició estudios experimentales de alcoholismo utilizando animales
fue Jacques Joseph Valentin M agnan (1835-1916), un célebre neuropsiquiatra francés, quien alcoholizó
perros, cobayos, gatos, y conejos para estudiar los efectos diferenciales del alcohol y una bebida en boga por
entonces: el ajenjo (Amory, 1868; Magnan, 1871, 1874). M agnan, tras comprobar, en perros, que el consumo
de alimentos embebidos en cantidades prefijadas de EtOH era rechazado por los animales tras un período de
consumo inicial, comenzó a administrarles el tóxico intragástricamente a través de sondas orogástricas o de
gastrostomías. Los estudios con animales de laboratorio alcoholizados durante la preñez con el fin de estudiar
a la descendencia comenzaron en 1912 cuando L. B. Nice inició estudios con roedores y en 1913 Charles R.
Stockard utilizando un método de alcoholización de coballos por vía inhalatoria encontró malformaciones
en las crías, bajo peso al nacer, retardo del crecimiento postnatal, alta mortalidad infantil y baja fertilidad en
sus estudios a lo largo de cuatro generaciones. Cole y Davis en 1914 y MacDowell y Vicari en 1917 hallaron
lo mismo en ratones blancos, conejos y ratas. En 1914, Stockard, nuevamente, exponiendo, esta vez, huevos
de gallina a los vapores del alcohol, obtuvo pollitos cíclopes y varios con microcefalia, aplasia o hipotrofia
de segmentos corporales e hipodinamia circulatoria vascular (W arner y Rosett, 1975).

Al momento de mimetizar la realidad del consumo humano de EtOH en un modelo


experimental surgen varias dificultades y factores experimentales a tener en cuenta: i) la
especie animal que se ha de utilizar (las distintas especies animales presentan parámetros
farmacocinéticos distintos para el EtOH,17 el tiempo de generación y el número de crías por

17
Cfr. ut supra, en la Introducción, la nota al pie Nº 18 en la sección I.3.1. (Farmacocinética) y la sección
I.3.5. (Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivo-conductuales en la
intoxicación aguda).

318
camada así como la longevidad de los individuos varían de especie en especie); ii) la vía
de administración por la que se ha de suministrar el EtOH puede mimetizar o no la vía de
consumo habitual en los humanos al tiempo que determinar muy diferentes niveles finales
de alcoholemia (vías subcutánea, intravenosa, oral, intragástrica, intraperitoneal,
intrarrectal, inhalatoria); iii) la necesidad o no de provocar mayores o menores cambios
metabólicos y, particularmente, distintos grados de daño hepático semejantes a los
observados en el ser humano (esteatosis hepática, hepatitis alcohólica, cirrosis alcohólica),
grados cuya consecución experimental se correlaciona parcialmente con la longevidad del
animal y el tiempo de exposición al tóxico y la suplementación calóricoproteica o no que
determinarán la normal nutrición o diferentes grados de malnutrición; iv) la facilidad de
implementación de la vía de administración18; v) el costo de mantenimiento y la facilidad
de manipulación de los animales de la especie elegida19; vi) la necesidad de conseguir
niveles de alcoholemia bajos o altos, permanentes o transitorios, en función de los
requisitos experimentales que se hubieren de perseguir; vii) la posibilidad de permitir o no
al animal de experimentación la capacidad de elegir libremente la ingesta de EtOH; viii)
el tipo de estudio experimental que se ha de llevar a cabo (metabólicos, bioquímicos,
morfológicos, conductuales, reproductivos, bioeléctricos, sociales, de intoxicación aguda
o crónica, de dependencia, tolerancia o abstinencia, etc.); ix) el sexo y grupo etario de los
animales que se han de utilizar para mimetizar aspectos humanos (machos y/o hembras
neonatas, infantes, adolescentes, adultas o ancianas); x) la apetencia relativa por el
consumo voluntario de EtOH que presenta cada especie.20
Por todos estos, y otros, factores interrelacionados y variables es que se han generado,
a lo largo de la historia, distintos modelos experimentales para estudiar diferentes aspectos
del alcoholismo humano.

18
Administrar EtOH en el agua de bebida que consumen diariamente los animales es más fácil, por ejemplo,
que administrarla intragástricamente por medio de una gastrostomía, que requiere la realización de un
procedimiento quirúrgico y cuidados postquirúrgicos de los animales.
19
Previsiblemente, la crianza, mantenimiento y manipulación de, digamos, primates, roedores o células en
cultivo, difieren notablemente.
20
Los animales de cepas salvajes, en su mayoría, y a diferencia de los seres humanos, son espontáneamente
reacios a ingerir bebidas alcohólicas y, si se les ofrece la opción, prefieren beber líquidos que no lo contengan;
más aún, dependiendo de la concetración de EtOH que contenga la bebida que se les ofrezca, pueden
disminuir la cantidad diaria total de líquido ingerido o, incluso, llegar a cesar la ingesta líquida, deshidratarse
y morir. Para vencer estas dificultades se han desarrollado, por cría endogámica, varias cepas de ratas y
ratones con preferencia para beber alcohol, incluso por sobre el agua u otras bebidas.

319
VII.5.1. Administración en el agua de bebida:

En este método de exposición se ofrece a los animales de experimentación el EtOH en


solución en el agua de consumo habitual, en concentraciones comunmente variables entre
0,5-10% y, raramente, hasta 20% (v/v).
Entre las ventajas de este método se cuenta el hecho, muy importante, de que es el único
que mimetiza la vía natural de ingesta de EtOH de en los seres humanos. Las soluciones
de uso son muy fáciles de preparar y administrar y no resultan irritativas para los animales.
Se puede lograr una administración “forzada” en la que, para el animal, no hay posibilidad
de elección acerca de qué tomar ya que se le ofrece una sola botella con la solución de
EtOH, o una administración “electiva” por medio del método de elección de dos botellas
en el que los animales pueden decidir y elegir qué tomar, agua o EtOH u otras soluciones
(se les ofrecen distintas combinaciones de botellas con agua o EtOH en solución e, incluso,
se pueden ofrecer botellas con distintas concentraciones de EtOH) (Tordoff y Bachmanov,
2003). Con los procedimientos de “elección” se puede mimetizar lo que hacen los humanos
alcohólicos que, naturalmente, sí tienen la capacidad de elegir si beber o no EtOH y en qué
concentración. Otra ventaja es que los animales reciben alimento sólido estándar de
consumo habitual en el laboratorio y también pueden elegir libremente cuánto y en qué
momento comer (si bien no qué comer), a semejanza de los humanos. Más aún, el alimento
puede ser suplementado o modificado sin perjuicio de la administración del EtOH. Por
último, a diferencia de otros, es un método barato y simple de implementar, incluso a largo
plazo para realizar estudios de alcoholización crónica.
Entre las desventajas se cuentan el hecho de que los roedores de laboratorio presentan
una aversión natural a beber líquidos con EtOH en solución por lo que, en ocasiones, es
preciso realizar períodos de adaptación previos, más o menos largos, en los que se ha de
titular la concentración de EtOH ofrecida, partiendo de concentraciones bajas y aumentando
hasta lograr que consuman la deseada. De su aversión se deriva el hecho de que,
normalmente, tienden a beber menos volumen de líquido que los animales control que
reciben sólo agua, hasta dejar de beber por completo y, eventualmente, deshidratarse hasta
morir; ello limita la concentración máxima que se pude utilizar con este método (-20%).
Así, incluso con las mayores concentraciones de EtOH, se obtienen alcoholemias
generalmente no superiores a los 150 mg/dl, es decir, difícilmente se lleguen a mimetizar
las alcanzadas por humanos alcohólicos crónicos que son grandes bebedores. Tampoco es

320
posible reproducir, en general, el gran consumo, agudo y brusco, que se observa en las
“borracheras” rápidas21, habituales en los grandes bebedores de fines de semana. Otra
desventaja del modelo es que las alcoholemias varían a lo largo del día en función del
patrón temporal de consumo habitual de los animales (la presencia o ausencia de alimento
en el estómago, por ejemplo, es uno de los factores que más fácilmente altera los
parámetros farmacocinéticos del EtOH); esto, si bien se asemeja a lo que sucede en
humanos, impone una dificultad en el control experimental. Finalmente, en función del
corto período de vida de los roedores de laboratorio (2-3 años para las ratas), de las bajas
alcoholemias obtenidas con este método y de que no es posible lograr en general que los
roedores ingieran más del 30% del VCT como derivado del EtOH en soluciones al 15%
(v/v) (Lieber y DeCarli, 1967; Scheig et al., 1966), no es posible provocar en ratas, con este
método, lesiones hepáticas más allás de la hepatitis alcohólica; es decir, nunca se llega a
producir cirrosis (Lieber y DeCarli, 1967).22

VII.5.2. Administración por inyección intraperitoneal:

La administración intraperitoneal (ip) consiste en la inyección con aguja y jeringa, en la


cavidad abdominal, de un volumen de una solución de EtOH de concentración variable
(pero, en general, del 20% v/v) tal que se administre al animal, rápidamente, una dosis
variable entre 0,5-5 g/kg de peso corporal; raramente la dosis sobrepasa los 6 g/kg/dosis en
virtud de las DL50 correspondientes a cada especie.23
Entre las ventajas de este método se cuentan la facilidad de preparación de la solución
y de la administración del tóxico. Otra enorme ventaja en los estudios en los que el control
de la dosis y la alcoholemia es crítica (como en los modelos de FAS) es que se puede tener
un control muy preciso sobre la dosis administrada y, parcialmente, de la alcoholemia
lograda. Tanto en ratones como en ratas, la administración de EtOH por vía ip induce
alcoholemias mayores que aquellas que las que se observan con la utilización de otros

21
Algo que en la literatura anglófona se denomina binge consumption (consumo de juerga o parranda).
22
Este fue el principal factor por el que estos dos autores desarrollaron su hoy famosa y muy comercializada
dieta líquida ya que ambos persiguían la consecución de lesiones del tipo de la cirrosis hepática en animales
de laboratorio para estudiar un modelo de esta enfermedad humana (Lieber y DeCarli, 2001).
23
Cf. ut supra sección I.2.4. (Correlación entre el nivel de alcoholemia y las manifestaciones cognitivo-
conductuales en la intoxicación aguda) en la Introducción.

321
métodos, como la administración intragástrica.24
En cuanto a las desventajas, también las hay en este método y algunas tan importantes
como las ventajas que aporta. La principal de ellas es la irritación que provoca el EtOH en
contacto con el mesotelio peritoneal. En ocasiones, pueden observarse animales que
intentan aliviarse de la irritación “rascándose” el abdomen. Por cierto que la irritación
podría evitarse disminuyendo la concentración de la solución inyectada pero, en este caso,
el volumen a inyectar para alcanzar igual dosis aumenta tanto que, en la práctica, no se lo
puede administrar sin comprometer, por ejemplo, la excursión ventilatoria de los pulmones
por abovedamiento de la cúpula diafragmática. Por ese motivo, la mayoría de los
investigadores que utilizan este método de administración prefieren inyectar soluciones de
EtOH al 20% (v/v) en solución salina. Una mayor concentración resultaría en un menor
volumen pero conllevaría el incremento de la probabilidad de irritación del peritoneo, y
viceversa. La irritación peritoneal puede provocar, tras repetidas inyecciones y en forma
relativamente rápida, la formación de bridas, sinequias y otras adherencias que pueden
constreñir vísceras abdominales huecas y, en el caso de los estudios gestacionales
precisamente, de los cuernos uterinos y comprometer así el desarrollo fetal. Puede incluso
formarse un plastrón que imposibilita totalmente la realización de cirugías en el abdomen,
en caso de que el experimento lo requiriese. Por último, como la implementación de este
método implica manipular, inmovilizar e inyectar periódicamente a los animales, más allá
del factor agregado de la irritación peritoneal, este método es uno de los que más estrés
genera en los animales de experimentación.

VII.5.3. Administración intragástrica:

La administración intragástrica de soluciones de EtOH en distintos solventes (agua, o


fórmulas lácteas) por medio de un tubo orogástrico es un modo experimental más de evadir
la aversión natural de los animales a ingerir alcohol. Ya utilizado por Magnan en el siglo
XIX (vide ut supra), consiste en colocar por la boca del animal una sonda que, a través del
esófago, llegue a (y quede alojado en) el estómago o en realizar una gastrostomía a través

24
Sin embargo, comparando ambas especies independientemente de la vía de admnistración, los perfiles de
alcoholemia en los ratones son más severos que los que se ven en las ratas, probablemente debido a sus
diferencias farmacocinéticas en la velocidad de metabolización del EtOH (Livy et al., 2003).

322
de la cual se coloca una sonda en el interior del estómago, directamente desde el exterior
y a través de la pared abdominal. Así, se inyectan por ella soluciones de EtOH directamente
en el estómago. La administración intragástrica produce alcoholemias pico menores que las
de la administración ip posiblemente por la presencia en la mucosa gástrica de la enzima
ADH que determina un efecto metabolizador de primer paso (Livy et al., 2003)25. La
administración intragástrica se puede utilizar, además, en los modelos de la denominada
cría artificial (artificial rearing) en la que se realiza una gastrostomía en crías de ratas
neonatales; por medio de la gastrostomía se las alimenta con fórmulas lácteas especiales
para roedores a las que se agrega EtOH. Con este método, según la dosis de EtOH
administrada, se pueden alcanzar altas alcoholemias (300-350 mg/dl) sostenidas en el
tiempo, capaces de inducir microcefalia (Goodlett et al., 1990).
A semejanza de la administración ip, con la intragástrica se puede regular muy
precisamente la dosis con la ventaja adicional de que es más “fisiológica” que aquella dado
que el alcohol ingresa al organismo por el estómago. Se puede además infundir la solución
en forma discontínua (como en la ip) o en forma contínua por gastroclisis y mantener así
niveles altos y sostenidos de alcoholemias. A semejanza de la ingesta por vía oral y a
diferencia de la inyección ip, existe en este método un efecto de primer paso por
metabolización prehepática en la mucosa gástrica.
Las desventajas de este método están a la vista: el procedimiento es altamente estresante
para el animal, tanto sea que se lo sonde por la boca como (y aún más) si se lo opera para
realizarle la gastrostomía (en este último caso se suman los cuidados y las complicaciones
postquirúrgicas). Operativamente, es más complicado y requiere, por parte del operador,
mayor entrenamiento y habilidad manual que en la administración en el agua de bebida o
por vía ip. A pesar de ser este método más “fisiológico” que la vía ip no lo es tanto como
la vía oral ya que el EtOH no pasa por la boca y no tiene contacto, en principio, con la
mucosa yugal, gingival y lingual y se descuidan así muchos de los efectos conductuales
originados por estímulos gustativos, olfativos y cenestésicos.
Una variación de este método, muy utilizado en estudios conductuales llevados a cabo
en animales postnatales tempranos expuestos prenatalmente al tóxico, acerca del
condicionamiento gustativo y olfativo del EtOH, consiste en colocar la sonda directamente
en la boca de animal atravesando para ello, con la sonda, la piel y estructuras subyacentes

25
Cf. ut supra la sección I.2.1. Farmacocinética en la Introducción.

323
de la mucosa yugal (Dominguez et al., 1998). Al inyectarse la solución de EtOH, como los
animales no saben escupir, tragan el líquido muy a su pesar. Sin embargo, este método no
se utiliza primariamente para administrar el EtOH sino para generar efectos locales sobre
la mucosa orofaringolingual que generan importantes correlatos conductuales.

VII.5.4. Administración inhalatoria:

Hemos visto ya que, en 1914, Charles R. Stockard expuso huevos embrionados de


gallina a los vapores del EtOH y obtuvo pollitos cíclopes, varios con microcefalia, y otras
displasias (Warner y Rosett, 1975). La exposición de mamíferos de laboratorio por vía
inhalatoria consiste en alojarlos en cámaras herméticas a través de las cuales se hace
circular aire saturado con EtOH en distintos porcentajes.
Entre las ventajas de este método se cuenta el hecho de que, según la dosis que se utilice,
se pueden alcanzar altas alcoholemias (300-350 mg/dl), sostenidas en el tiempo, capaces
de inducir displasias corticales y microcefalia (Ryabinin et al., 1995), y que se puede evocar
dependencia y abstinencia en especies animales en las que, por su alta tasa metabolizadora
del EtOH (como los ratones) es difícil inducir alcoholemias altas sostenidas por otros
métodos de administración (Goldstein y Pal, 1971). Más aún, regulando el flujo y la
saturación del aire con EtOH se puede modificar la alcoholemia de los animales expuestos
(Kang et al., 2004). Todo ello sin necesidad alguna de manipular al animal.
No obstante, la exposición inhalatoria también tiene las desventajas de que puede ser
irritativa para la vía aérea superior; no es de ningún modo una vía de administración
“fisiológica” que remede ninguna situación humana (ni tan siquiera una laboral); es costosa
desde el punto de vista del equipamiento.

VII.5.5. Administración por dieta líquida:

Algunos de los motivos explícitos que llevaron a Lieber y DeCarli a desarrollar una dieta
líquida nutricionalmente completa y adecuada y en la cual se pudiera adicionar EtOH,
fueron: i) superar la aversión natural de los roedores de laboratorio a beber EtOH; ii) lograr
producir altas alcoholemias sostenidas en el tiempo capaces de producir daño hepático

324
(Lieber, 2000); iii) conseguir, en animales de laboratorio más longevos que los roedores,
que el consumo de EtOH represente hasta el 50% del VCT de la dieta diaria ya que ese
porcentaje es aquel al que puede llegar un humano alcohólico crónico; y iv) reproducir en
esos animales más longevos las alteraciones patológicas observadas en el hígado de
humanos alcohólicos crónicos, principalmente la cirrosis (algo imposible de obtener con
la administración en el agua de bebida ya que lo máximo que se puede lograr es la
esteatosis hepática) (Lieber y DeCarli, 1967, 1994; Lieber et al., 1975).
Entre las ventajas de la dieta líquida Lieber-DeCarli, se cuenta el hecho de que se
pueden obtener consumos diarios de EtOH que son 2-3 veces mayores (12-18 g/kg/d) que
los que se logran con la administración en el agua de bebida, pero por una vía de
administración “fisiológica”. Con estos niveles de consumo no son infrecuentes las
alcoholemias de 100-150 mg/dl. Con esta dieta, los roedores consumen calorías derivadas
del EtOH en relación nunca mayor al 36% del VCT en tanto que en los babuinos se puede
lograr que consuman hasta el 50% (Lieber y DeCarli, 1994). La cantidad de ácidos grasos
en la dieta líquida con EtOH tiene un notable efecto sobre la cantidad de los mismos que
se acumulan en el hígado (Lieber y DeCarli, 1994). El ajuste de los nutrientes en la dieta
es mucho más flexible que en otros métodos por tratarse el alimento de una solución. La
composición relativa de los nutrientes y el porcentaje de EtOH varían según la especie que
se utilice (Lieber y DeCarli, 1994), se pueden adicionar o disminuir los niveles relativos de
lípidos, glúcidos o proteínas, variar los niveles de vitaminas y/u oligoelementos, etc.
También se pueden agregar saborizantes que hagan al líquido de sabor más agradable
(palatable) para el animal y que estimulen así su consumo y contribuyan a vencer la
aversión al EtOH. Con esta dieta, en babuinos26 se puede producir hígado graso en 6-12
meses de exposición contínua (Lieber y DeCarli, 1976, 1994).
Sin embargo, este método de administración también tiene sus desventajas. Es mucho
más costoso que otros métodos. La preparación de la dieta es más engorrosa ya que hay que
prepararla cada día y a veces cada 12 horas; esto se debe a que, al ser un líquido nutritivo
y no poder ser refrigerado mientras se le ofrece a los animales, su tasa de contaminación
microbiana es muy alta y fácilmente se hecha a perder. Su implementación requiere mucho
más cuidado y atención por parte del experimentador. Si no se utilizan los dispositivos
adecuados, por su viscosidad y eventual contaminación, la misma dieta puede taponar el

26
Los babuinos, también llamados papiones, son un tipo de primates cercopitecos del género Papio de los
que hay varias especies; viven unos 30-45 años.

325
tubo dispensador y quedar el animal sin alimento y sin bebida. Si bien la vía de
administración es la oral, no es tan “fisiológica” en comparación con la realidad de los
humanos ya que, en tanto estos consumen alimentos sólidos por un lado y el EtOH en
bebidas alcohólicas por el otro, los animales expuestos a la dieta líquida no pueden desligar
el consumo de líquido del de nutrientes y se ven forzados a consumir uno y otros
conjuntamente. Cuando se introduce el EtOH en la dieta líquida, el consumo total de
nutrientes disminuye lo que obliga a realizar un adecuado apareamiento de las dietas (algo
que, por otro lado, es conveniente realizar con todos los métodos de administración del
EtOH).

* * *

Así bien, hemos visto que existen diferentes métodos de administración del EtOH. Cada
uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas y la elección que se haga de ellos
dependerá de los objetivos que se han de alcanzar y de los recursos con que se cuenta.
De más está decir que también existen diferentes modelos de exposición al EtOH que
intentan mimetizar diferentes aspectos del consumo humano: el alcoholismo en sí -modelos
de preferencia, de restitución, de autoadministración crónica con fases repetidas de
deprivación, modelo del punto de no retorno- (Spanagel, 2000); el alcoholismo crónico o
agudo tipo borrachera (binge) tanto en animales neonatales, adolescentes o adultos como
prenatalmente (Rifas et al., 1997); los efectos motivacionales positivos y negativos en los
modelos de autoadministración -bebida en la jaula de alojamiento o de condicionamiento
operante- y en los modelos de condicionamiento -de lugar o de sabor- (Cunningham et al.,
2000); el modelado del ansia por el consumo (craving) de EtOH -de utilización en
humanos- (Litt y Cooney, 1999); modelado de la abstinencia postconsumo (Becker, 2000);
y muchos otros. También existen modelos de co-administración de EtOH junto con una o
más drogas, como la cocaína (Wilson et al., 2001) o la nicotina (Balogh et al., 2002;
Penland et al., 2001) por nombrar sólo los más comunes.
Los modelos animales de diversos aspectos del consumo humano son, así, muy
numerosos, y casi cada autor posee uno.
En conclusión, la elección de uno u otro método de administración y uno u otro modelo
de alcoholismo dependerá, en última instancia, de lo que se esté buscando con él y de los
recursos de que se disponga.

326
Anexo VI
Tablas de datos de los parámetros nutricionales evaluados en
los protocolos de exposición prenatal al etanol (EPE).27
Tabla 1. Valores de los parámetros nutricionales evaluados durante los períodos de tratamiento
pregestacional y gestacional en el protocolo experimental de EPE sin prevención del daño:

PERÍODO DE TRATAM IENTO

PREGESTACIONAL GESTACIONAL
(t = 43 días) (t = 22 días)

GRUPO DE TRATAM IENTO

PARÁMETROS MEDIDOS CONTROL EtOH P CONTROL EtOH P

Inicial (g) 225,63 ± 16,22 219,33 ± 21,57 NS 273,9 ± 17,13 245,70 ± 26,18 NS

Final (g) 276,50 ± 18,87 245.67 ± 25,54 NS 376,8 ± 25,12 351,40 ± 39,45 NS
P E S O D E LO S
A N IM ALE S
D iferencia inicia/final (g) +50,87 26.34 - +102,9 105.7 -

D iferencia porcentual¶ 122,54% 112,00% - 137,57% 143,02% -

g/anim al/d 18,14 ± 4,178 13,92 ± 2,635 *** 19,59 ± 2,361 16,48 ± 2,080 ***

kC al/anim al/d 45,33 ± 10,45 34,8 ± 6,59 *** 48,97 ± 5,902 41,20 ± 5,20 ***
CONSUMO
D E A LIM E N T O
g/kg/d 73,71 ± 17,26 60,56 ± 12,39 *** 64,28 ± 6,00 59,90 ± 6,31 *

kC al/kg/d 184,3 ± 43,14 151,4 ± 30,98 *** 160,70 ± 15,01 149,70 ± 15,79 *

m l/anim al/d 35,99 ± 9,211 24,51 ± 4,775 *** 38,55 ± 8,022 32,70 ± 4,774 **

CONSUMO
m l/kg/d 146,9 ± 42,08 106,3 ± 21,56 *** 126,30 ± 22,67 118,30 ± 10,37 NS
D E B E BID A

D iferencia porcentual 138,19% 72,36 % - 106,76% 93,66% -

m l/anim al/d 1,618 ± 0,3147 - 2,159 ± 0,3148 -

g/anim al/d 1,263 ± 0,2462 - 1,683 ± 0,2455 -

kC al/anim al/d 9,058 ± 1,764 - 12,09 ± 1,764 -

CONSUMO
m l/kg/d 7,017 ± 1,423 - 7,81 ± 0,6842 -
DE ETANOL

g/kg/d 5,474 ± 1,110 - 6,092 ± 0,534 -

kC al/kg/d 39,30 ± 7,967 - 43,74 ± 3,83 -

P orcentaje del VC T ‡ 20,61% - 22,60% -

INGRESO kCal/animal/d 45,33 ± 10,45 43,86 ± 7,56 NS 48,97 ± 5,902 53,29 ± 6,764 *
CALÓRICO
TOTAL kCal/kg/d 184,3 ± 43,14 190,7 ± 35,74 NS 160,70 ± 15,01 193,50 ± 18,74 ***


: Base 100 = peso inicial del m ism o grupo.

: Base 100 = grupo opuesto.

: V C T : valor calórico total.

27
Todos los datos se informan en valores de 0 ± DE. Referencias: NS: no significativo; *:P < 0.05; **: P <
0,01; ***: P < 0,0001.

327
Tabla 2. Valores de los parámetros nutricionales evaluados durante el tratamiento gestacional en el
protocolo experimental de EPE con prevención del daño por administración de buspirona:

PERÍODO DE TRATAM IENTO GESTACIONAL


(t = 22 días)

GRUPO DE TRATAM IENTO

PARÁM ETROS M EDIDOS CS CB ES EB

Inicial (g) 279,0 ± 8,48 268,8 ± 26,52 260,2 ± 32,27 231,0 ± 3,54

Final (g) 376,5 ± 30,41 377,0 ± 31,11 375,2 ± 44,66 327,6 ± 14,2
P E S O D E LO S
A N IM A LE S
D iferencia inicia/final (g) + 97,5 + 108,2 + 115,0 + 96,6

§
D iferencia porcentual 134,94% 140,25% 144,19% 141,81%

g/anim al/d 20,5 ± 2,72 18,68 ± 2,36 17,95 ± 2,14 14,84 ± 2,54

CONSUMO
g/kg/d 66,46 ± 6,89 62,45 ± 6,79 61,75 ± 6,28 57,11 ± 8,58
D E A LIM E N T O

kC al/kg/d 166,1 ± 17,22 156,1 ± 16,97 154,4 ± 15,69 142,8 ± 21,46

m l/anim al/d 37,21 ± 5,25 39,89 ± 12,09 32,87 ± 5,88 32,53 ± 4,93

CONSUMO
m l/kg/d 120,8 ± 14,05 132,7 ± 36,97 112,3 ± 13,21 121,0 ± 13,6
D E B E BID A

D iferencia porcentual ¶ 100,0 % 109,85 % 92,96 % 100,16 %

m l/anim al/d 2,17 ± 0,39 2,15 ± 0,33

g/anim al/d 1,71 ± 0,31 1,69 ± 0,26

kC al/anim al/d 12,1 ± 2,16 11,98 ± 1,82

CONSUMO
m l/kg/d 7,41 ± 0,87 8,25 ± 0,9
DE ETANOL

g/kg/d 5,85 ± 0,69 6,51 ± 0,71

kC al/kg/d 41,36 ± 4,86 46,03 ± 5,01


P orcentaje del VC T 20,16 % 24,55 %

IN G R E S O
C ALÓ R IC O kC al/kg/d 166,1 ± 17,22 156,1 ± 16,97 195,7 ± 19,19 188,8 ± 24,67
T OT A L

P eso global (g) 5,95 ± 0,37 5,858 ± 0,38 5,923 ± 0,0,39 5,677 ± 0,60

P eso de los % (g) 6,045 ± 0,44 5,969 ± 0,41 6,053 ± 0,27 5,821 ± 0,62

P eso de las & (g) 5,833 ± 0,25 5,746 ± 0,33 5,824 ± 0,47 5,506 ± 0,53
C R ÍA S
al N A C E R
R elación de peso % / &‡ 103,63 % 103,88 % 103,93 % 105,72 %

C antidad por cam ada 10,0 ± 7,07 13,0 ± 0,0 14,67 ± 2,08 11,67 ± 3,215

R elación % / & 1,22 / 1,0 1,0 / 1,0 0,76 / 1,0 1,18 / 1,0

C R ÍA S adultas P eso en P 88 371,1 ± 5,0 401,6 ± 5,0 386,7 ± 19,2 371,9 ± 26,3

§
: Base 100 = peso inicial del m ism o grupo.

: B ase 100 = grupo C S .

: VCT: valor calórico total.

: B ase 100 = peso de las hem bras.

328
Anexo VII
Tablas de datos de los parámetros morfométricos evaluados en
los experimentos de inmunocitoquímica.28
Tabla 1. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de
ratas de edad P21 sometidos a EPE sin prevención del daño.

Grupos de tratamiento

Áreas py
Control EtOH
evaluadas diferencia*

TP H

NDR 0,814821 ± 0,1615 (3) 3,891908 ± 0,8776 (6) 0,0006 / E S

NMR 1,036123 ± 0,6258 (3) 4,201338 ± 0,7399 (4) 0,0019 / M S

5-H T

NDR 0,789988 ± 0,2288 (44) 0,861953 ± 0,2240 (44) 0,1398 / N S

NMR 0,75828 ± 0,2250 (44) 0,961259 ± 0,1642 (35) < 0,0001 / E S

5-H TT

C A 1 H ipp 0,045419 ± 0,0042 (10) 0,070449 ± 0,0086 (10) < 0,0001 / E S

S trt 0,064007 ± 0,0166 (15) 0,083047 ± 0,0166 (15) 0,0244 / S

C xF 0,137057 ± 0,0241 (12) 0,214092 ± 0,0472 (13) < 0,0001 / E S

GFAP

C A 1 H ipp 41,25 ± 22,66 (73) 104,88 ± 36,54 (56) < 0,0001 / E S

S trt 115,42 ± 76,20 (66) 125,17 ± 75,19 (65) 0,4625 / N S

C xF 26,716 ± 8,77 (45) 46,67 ± 12,28 (20) < 0,0001 / E S

S -100b

C A 1 H ipp 0,545846 ± 0,2381 (60) 0,662819 ± 0,2070 (60) 0,0048 / M S

S trt 0,762567 ± 0,2234 (44) 1,031389 ± 0,3967 (74) < 0,0001 / E S

C xF 0,655196 ± 0,1798 (37) 0,796187 ± 0,2370 (69) 0,0021 / M S

N f-200

C A 1 H ipp 0,109472 ± 0,0246 (28) 0,139029 ± 0,0279 (32) < 0,0001 / E S

S trt 0,164948 ± 0,0718 (31) 0,209525 ± 0,0696 (35) 0,0129 / S

C xF 0,141123 ± 0,0349 (30) 0,148725 ± 0,0300 (40) 0,3316 / N S

nN O S

C A 1 H ipp n/d** n/d -

28
Todos los datos se informan en valores de 0 ± DE (n), donde n corresponde, según el caso, al número de
experimentos realizados, los campos microscópicos o el número de células evaluadas. Referencias: NS: no
significativo; S: significativo; MS: muy significativo; ES: extremadamente significativo; n/d: no detectado

329
Grupos de tratamiento

Áreas py
Control EtOH
evaluadas diferencia*

S trt 1,25206 ± 0,5916 (120) 3,46686 ± 1,3956 (120) < 0,0001 / E S

C xF 1,575554 ± 0,7858 (80) 3,895683 ± 1,3073 (90) < 0,0001 / E S

330
Tabla 2. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros de ratas
de distintas edades postnatales, sometidas a EPE con prevención del daño por administración de buspirona.

Área evaluada Grupos de tratamiento


y edad
postnatal CS CB ES EB

5-H T

N D R P21 0,7268 ± 0,2937 (181) 0,7211 ± 0,2314 (66) 0,7109 ± 0,2539 (99) 0,944 ± 0,4725 (110)

N D R P35 0,8339 ± 0,3726 (180) 1,3090 ± 0,6048 (69) 0,6984 ± 0,2906 (124) 0,736 ± 0,3261 (114)

N D R P60 0,5771 ± 0,2625 (14) 0,6601 ± 0,2471 (65) 0,5992 ± 0,2673 (87) 0,6379 ± 0,3306 (24)

N D R P90 0,7802 ± 0,3739 (36) 0,5814 ± 0,1420 (17) 0,7975 ± 0,3245 (24) 0,4895 ± 0,2130 (26)

N M R P5 0,4560 ± 0,5279 (3) 0,7237 ± 0,0363 (76) 0,3654 ± 0,0901 (12) 0,6536 ± 0,2571 (72)

N M R P21 0,6856 ± 0,2844 (52) 0,5809 ± 0,2901 (26) 0,6351 ± 0,2584 (38) 0,6355 ± 0,2856 (49)

N M R P35 1,0240 ± 0,2857 (48) 0,9628 ± 0,2786 (42) 0,6455 ± 0,2488 (47) 0,9064 ± 0,2574 (46)

N M R P60 0,4895 ± 0,2354 (11) 0,5106 ± 0,2943 (33) 0,5401 ± 0,2745 (54) 0,5980 ± 0,6249 (34)

N M R P90 0,5798 ± 0,3048 (45) 0,7010 ± 0,3393 (50) 3,6929 ± 0,3584 (35) 0,5372 ± 0,2924 (28)

GFAP

C A 1 Hipp P 5 59,45 ± 4,011 (6) 53,15 ± 7,989 (7) 87,02 ± 10,98 (11) 58,01 ± 10,43 (10)

C A 1 Hipp P 21 71,30 ± 11,22 (11) 62,61 ± 9,732 (6) 100,5 ± 19,86 (10) 82,4 ± 10,16 (10)

C A 1 Hipp P 35 62,55 ± 11,55 (18) 67,22 ± 8,186 (16) 109,8 ± 8,592 (9) 74,31 ± 9,23 (6)

C A 1 Hipp P 60 56,76 ± 13,68 (7) 65,39 ± 11,67 (18) 99,61 ± 18,72 (9) 82,87 ± 9,487 (12)

C xF P21 92,75 ± 41,71 (14) 87,54 ± 34,95 (15) 157,8 ± 34,25 (19) 56,12 ± 22,43 (27)

C xF P35 83,15 ± 26,16 (25) 58,98 ± 21,2 (15) 262,1 ± 51,49 (20) 83,54 ± 34,53 (25)

C xF P60 249,3 ± 21,13 (16) 224,35 ± 23,0 (15) 208,6 ± 41,05 (19) 230,5 ± 37,18 (23)

S -100b

C A 1 Hipp P 5 1,230169 ± 0,1254 (12) 1,261706 ± 0,1060 (6) 1,449768 ± 0,1503 (7) 1,251831 ± 0,0956 (6)

C A 1 Hipp P 21 0,852514 ± 0,0786 (13) 0,785282 ± 0,1074 (13) 0,981884 ± 0,2434 (9) 0,719301 ± 0,0678 (9)

C A 1 Hipp P 35 0,776545 ± 0,0575 (12) 0,763052 ± 0,0840 (8) 1,004473 ± 0,1522 (15) 0,731432 ± 0,0673 (14)

C A 1 Hipp P 60 0,920032 ± 0,1342 (4) 1,092655 ± 0,2492 (10) 1,61512 ± 0,3505 (8) 1,217059 ± 0,1855 (9)

M AP -2

C A 1 Hipp P 5 0,183113 ± 0,0405 (9) 0,159163 ± 0,0346 (11) 0,103971 ± 0,0206 (21) 0,252530 ± 0,0526 (16)

C A 1 Hipp P 21 0,184044 ± 0,0331 (19) 0,192216 ± 0,0339 (16) 0,100505 ± 0,0212 (17) 0,172612 ± 0,0286 (15)

C A 1 Hipp P 35 0,191751 ± 0,0423 (19) 0,204010 ± 0,0462 (17) 0,122540 ± 0,0254 (14) 0,225270 ± 0,0360 (10)

C A 1 Hipp P 60 0,210631 ± 0,0470 (13) 0,187820 ± 0,0291 (13) 0,116075 ± 0,0258 (19) 0,246323 ± 0,0383 (14)

C A 1 Hipp P 90 0,236805 ± 0,0342 (13) 0,221908 ± 0,0410 (19) 0,122592 ± 0,0243 (19) 0,223821 ± 0,0289 (19)

C xF P21 0,169508 ± 0,0068 (7) 0,160404 ± 0,0413 (25) 0,097298 ± 0,0269 (37) 0,184044 ± 0,0267 (10)

C xF P35 0,143283 ± 0,0289 (23) 0,158749 ± 0,0315 (35) 0,066469 ± 0,0172 (26) 0,167646 ± 0,0361 (21)

C xF P60 0,167543 ± 0,0395 (28) 0,1854922 ± 0,0592 (13) 0,074279 ± 0,0260 (22) 0,156473 ± 0,0122 (18)

331
Tabla 3. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros
de ratas adolescentes expuestas al EtOH y tras la abstinencia.

Grupos de tratamiento
Área
evaluada
Control EtOH Control/R EtOH/R

5-H T

NDR 1,334 ± 0,63 (59) 0,944 ± 0,21 (55) 1,116 ± 0,33 (23) 1,087 ± 0,33 (26)

NMR 0,940 ± 0,23 (25) 1,006 ± 0,26 (32) 1,146 ± 0,34 (15) 1,136 ± 0,28 (36)

G FAP

C A 1 Hipp 61,76 ± 17,12 (49) 100,0 ± 29,40 (28) 62,89 ± 15,16 (47) 78,35 ± 18,33 (84)

S trt 49,96 ± 14,63 (43) 83,99 ± 21,13 (36) 48,99 ± 15,88 (27) 54,64 ± 13,23 (44)

C xF 49,26 ± 16,53 (51) 85,44 ± 22,68 (43) 46,20 ± 12,17 (36) 58,27 ± 18,69 (59)

S -100b

C A 1 Hipp 2,686 ± 1,65 (71) 1,377 ± 0,39 (66) 1,479 ± 0,46 (31) 1,672 ± 0,61 (52)

S trt 2,846 ± 1,65 (45) 1,175 ± 0,27 (61) 1,412 ± 0,41 (27) 1,223 ± 0,33 (38)

C xF 2,624 ± 1,74 (66) 1,687 ± 0,66 (54) 2,785 ± 1,78 (42) 3,399 ± 1,64 (49)

N f-200

C A 1 Hipp 0,0364 ± 0,0114 (30) 0,00659 ± 0,0028 (25) 0,03825 ± 0,0158 (41) 0,02539 ± 0,0121 (30)

S trt 0,04024 ± 0,0177 (57) 0,02021 ± 0,0126 (38) 0,05816 ± 0,026 (39) 0,06968 ± 0,046 (44)

C xF 0,04244 ± 0,0152 (62) 0,01552 ± 0,0079 (48) 0,04993 ± 0,0163 (38) 0,06663 ± 0,0266 (50)

M AP -2

C A 1 Hipp 0,155 ± 0,0256 (20) 0,0793 ± 0,015 (14) 0,1947 ± 0,0249 (10) 0,1798 ± 0,031 (11)

S trt 0,0156 ± 0,008 (22) 0,0049 ± 0,0018 (22) 0,0079 ± 0,0031 (11) 0,0096 ± 0,0041 (16)

C xF 0,0518 ± 0,019 (20) 0,0211 ± 0,0092 (20) 0,0593 ± 0,0129 (10) 0,0343 ± 0,0134 (15)

nN O S

C A 1 H ipp n/d n/d n/d n/d

S trt 1,403 ± 0,29 (27) 1,609 ± 0,94 (23) 2,412 ± 1,61 (17) 1,269 ± 0,61 (11)

C xF 1,63 ± 0,5 (28) 1,741 ± 0,62 (22) 1,593 ± 0,52 (16) 1,01 ± 0,28 (11)

332
Tabla 4. Parámetros morfológicos evaluados en los experimentos de ICQ realizados en cortes de cerebros
de ratas expuestas al EtOH durante la adultez.

Grupos de tratamiento

py
Área
Control EtOH diferencia*
evaluadas

5-H TT

C A 1 H ipp 0,170 ± 0,02 (30) 0,126 ± 0,019 (30) < 0,0001 / E S

S trt 0,225799 ± 0,0130 (30) 0,163077 ± 0,0222 (30) < 0,0001 / E S

C xF 0,201142 ± 0,0279 (30) 0,166873 ± 0,0273 (30) < 0,0001 / E S

GFAP

C A 1 H ipp 80,96 ± 6,78 (40) 155,66 ± 21,13 (40) < 0,0001 / E S

S trt 130,83 ± 6,81 (40) 178,04 ± 32,93 (40) < 0,0001 / E S

C xF 102,09 ± 7,82 (40) 149,15 ± 5,86 (40) < 0,0001 / E S

S -100b

C A 1 H ipp 0,926 ± 0,170 (40) 1,450 ± 0,166 (40) < 0,0001 / E S

S trt 1,28389 ± 0,0765 (40) 1,55585 ± 0,1183 (40) < 0,0001 / E S

C xF 1,239833 ± 0,2594 (40) 1,366412 ± 0,0524 (40) 0,0034 / M S

N f-200

C A 1 H ipp 0,303 ± 0,012 (30) 0,152 ± 0,024 (30) < 0,0001 / E S

S trt 0,246263 ± 0,0605 (30) 0,206219 ± 0,0273 (30) 0, 0016 / M S

C xF 0,160163 ± 0,0385 (20) 0,135945 ± 0,0269 (20) 0,0268 / S

M AP -2

C A 1 H ipp 0,19788 ± 0,0094 (20) 0,127983 ± 0,0328 (20) < 0,0001 / E S

S trt n/d** n/d -

C xF 0,196691 ± 0,0086 (20) 0,126266 ± 0,0217 (20) < 0,0001 / E S

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“Por tanto,¿qué es la verdad? Una multitud en movimiento de metáforas, metonimias,
antropomorfismos; en una palabra, un conjunto de relaciones humanas que, elevadas,
traspuestas y adornadas poética y retóricamente, tras largo uso el pueblo considera firmes,
canónicas y vinculantes; las verdades son ilusiones de las que se ha olvidado que lo son,
metáforas ya utilizadas que han perdido su fuerza sensible, monedas que han perdido su
imagen y que ahora entran en consideración como metal, no como tales monedas.”
Friedrich Nietzsche (1873) 1

1
Nietzsche, 1951; pág. 91.