UNE-EN 16858-2017. Productos Alimenticios. Determinación de Melamina y Ácido Cianúrico.

Norma Española
UNE-EN 16858
Diciembre 2017
Productos alimenticios
Determinación de melamina y ácido cianúrico en
productos alimenticios mediante cromatografía líquida
y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/SM)
Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

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desempeña FIAB.
Asociación Española
de Normalización
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915 294 900
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UNE-EN 16858
Determinación de melamina y ácido cianúrico en productos alimenticios mediante
cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/SM)
Foodstuffs. Determination of melamine and cyanuric acid in foodstuffs by liquid chromatography and
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
Produits alimentaires. Détermination de la teneur en mélamine et en acide cyanurique dans les

produits alimentaires par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en
tandem (CL-SM/SM).
Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN 16858:2017.
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NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD
EN 16858
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Mayo 2017
ICS 67.050
Versión en español
Determinación de melamina y ácido cianúrico en productos alimenticios mediante
cromatografía líquida y espectrometría de masas en tándem (LC-MS/SM)
Foodstuffs. Determination of melamine Produits alimentaires. Détermination Lebensmittel. Bestimmung von

and cyanuric acid in foodstuffs by liquid de la teneur en mélamine et en acide Melamin und Cyanursäure in
chromatography and tandem mass cyanurique dans les produits Lebensmitteln mit
spectrometry (LC-MS/MS). alimentaires par chromatographie en Flüssigchromatographie und Tandem-
phase liquide couplée à la Massenspektrometrie (LC-MS/MS).
spectrométrie de masse en tandem
(CL-SM/SM).
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2017-04-10.
Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento Interior de CEN/CENELEC que define las
condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma europea como norma
nacional. Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas
normas nacionales pueden obtenerse en el Centro de Gestión de CEN/CENELEC, o a través de sus
miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra
lengua realizada bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada al
Centro de Gestión, tiene el mismo rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes:
Alemania, Antigua República Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia,
Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia, España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda,
Islandia, Italia, Letonia, Lituania, Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino
Unido, República Checa, Rumanía, Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
CENTRO DE GESTIÓN: Rue de la Science, 23, B-1040 Brussels, Belgium
 2017 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.
UNE-EN 16858:2017 -4-
Índice
Prólogo europeo .................................................................................................................................5
1 Objeto y campo de aplicación........................................................................................6
2 Normas para consulta ......................................................................................................6
3 Principio ...............................................................................................................................6
4 Reactivos...............................................................................................................................6
5 Aparatos ............................................................................................................................. 10
6 Procedimiento ................................................................................................................. 11
7 Configuración del sistema ........................................................................................... 12
8 Cálculos y expresión de los resultados ................................................................... 18
9 Datos de precisión .......................................................................................................... 21
10 Informe del análisis ....................................................................................................... 23
Anexo A (Informativo) Cromatogramas de HPLC típicos ............................................. 24
Anexo B (Informativo) Datos de precisión ........................................................................ 28
Bibliografía ........................................................................................................................................ 30
-5- UNE-EN 16858:2017
Prólogo europeo
Esta Norma EN 16858:2017 ha sido elaborada por el Comité Técnico CEN/TC 275 Análisis de los
productos alimenticios. Métodos horizontales, cuya Secretaría desempeña DIN.
Esta norma europea debe recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto
idéntico a ella o mediante ratificación antes de finales de noviembre de 2017, y todas las normas
nacionales técnicamente divergentes deben anularse antes de finales de noviembre de 2017.
Se llama la atención sobre la posibilidad de que algunos de los elementos de este documento estén
sujetos a derechos de patente. CEN y/o CENELEC no es(son) responsable(s) de la identificación de
dichos derechos de patente.
Esta norma europea ha sido elaborada bajo un Mandato dirigido a CEN por la Comisión Europea y por
la Asociación Europea de Libre Comercio.
ADVERTENCIA – El uso de esta norma puede implicar el uso de materiales, operaciones y

equipamiento peligrosos. Esta norma no tiene por objeto establecer todos los problemas de
seguridad asociados a su utilización. Es responsabilidad del usuario de esta norma tomar las
medidas necesarias para asegurar la seguridad y salud del personal antes de la puesta en
práctica de la norma, así como cumplir todos los requisitos reglamentarios para este propósito.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, están obligados a adoptar esta norma
europea los organismos de normalización de los siguientes países: Alemania, Antigua República
Yugoslava de Macedonia, Austria, Bélgica, Bulgaria, Chipre, Croacia, Dinamarca, Eslovaquia, Eslovenia,
España, Estonia, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Irlanda, Islandia, Italia, Letonia, Lituania,
Luxemburgo, Malta, Noruega, Países Bajos, Polonia, Portugal, Reino Unido, República Checa, Rumanía,
Serbia, Suecia, Suiza y Turquía.
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1 Objeto y campo de aplicación

Esta norma europea describe un método para la determinación de melamina y ácido cianúrico en los
productos alimenticios mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en
tándem. El método se ha validado en un estudio interlaboratorios mediante el análisis de muestras de
fórmulas infantiles a base de leche fórmulas infantiles, a base de soja, leche en polvo, lecha entera, una
bebida de soja y chocolate con leche contaminadas de forma artificial a unos niveles comprendidos
entre 0,71 mg/kg y 1,43 mg/kg para la melamina y entre 0,57 mg/kg y 1,45 mg/kg para el ácido
cianúrico. Los límites de cuantificación (LOQ; limits of quantification) para la melamina y el ácido
cianúrico en los alimentos son de 0,05 mg/kg y de 0,25 mg/kg respectivamente. El límite superior del
rango de trabajo es de hasta 10 mg/kg para la melamina y de hasta 25 mg/kg para el ácido cianúrico.
2 Normas para consulta

Los documentos indicados a continuación, en su totalidad o en parte, son normas para consulta
indispensables para la aplicación de este documento. Para las referencias con fecha, solo se aplica la
edición citada. Para las referencias sin fecha se aplica la última edición (incluida cualquier
modificación de esta).
EN ISO 3696:1995, Agua para uso en análisis de laboratorio. Especificación y métodos de ensayo.
3 Principio
Una porción para análisis de la muestra alimentaria homogénea se refuerza con patrones internos
marcados con 13C (melamina y ácido cianúrico). Tras una incubación durante un tiempo de una hora
como mínimo, se añade agua a la muestra y, después de agitar, la suspensión se disuelve en una mezcla
de acetonitrilo y agua. La muestra se agita y se centrifuga. Tras la separación del sobrenadante del
sedimento, se añade benzoguanamina como patrón de recuperación. Una alícuota de la fase acuosa
sobrenadante se inyecta en el sistema de LC-MS/MS. El espectrómetro de masas de triple cuadrupolo
se acopla a un equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o bien a un equipo de
cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UHPLC; ultra performance liquid chromatography). La
cromatografía consiste en una cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC; hydrophilic
interaction liquid chromatography). La ionización se realiza por ionización en electrospray (ESI;
electrospray ionization) con registro de múltiples reacciones (MRM; multiple reaction monitoring).
4 Reactivos
Salvo indicación en sentido contrario, se utilizan exclusivamente reactivos de grado analítico
reconocido y agua que cumpla los requisitos de grado 1 conforme a la Norma EN ISO 3696:1995. Se
utilizan exclusivamente reactivos de pureza adecuada para el análisis de melamina y ácido cianúrico.
La pureza de los reactivos y los materiales de referencia (por ejemplo, de las disoluciones patrón) se
comprueba realizando un análisis en blanco en las mismas condiciones utilizadas en el método. El
cromatograma no debe mostrar impurezas interferentes en el tiempo de retención de los compuestos
analizados.
4.1 Ácido fórmico, de una fracción en masa comprendida entre el 98% y el 100% (CAS 64-18-6).
4.2 Acetonitrilo, de calidad adecuada para gradiente de HPLC (CAS 75-08-8).
-7- UNE-EN 16858:2017
4.3 Acetato amónico, de una fracción en masa de aproximadamente el 98% (CAS 631-61-8).
4.4 Metanol, de grado ultra LC-MS (CAS 67-56-1).
4.5 Melamina, de una fracción en masa ≥ 99%, en estado sólido, (CAS 108-78-1).
4.6 Ácido cianúrico, en estado sólido, (CAS 108-80-5).
4.7 Benzoguanamina, en estado sólido, (CAS 91-76-9).
4.8 13C-Melamina, 13C3 (99%), Amino-15N3 (98%), disolución de una concentración en masa
 = 1 000 g/ml.
4.9 13C-Ácido cianúrico, 13C3 (99%), 15N3 (98%), disolución de una concentración en masa
 = 1 000 g/ml.
4.10 Preparación de las disoluciones concentradas
4.10.1 Disolución concentrada de melamina,  = 1 000 g/ml.
Se pesan, con una aproximación de 0,01 mg, unos 100 mg de melamina (4.5), se introducen en un
matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se añade, en peso, la cantidad de agua necesaria para alcanzar una
concentración de 1 000 g/ml. La disolución se conserva en una nevera a una temperatura de 4 °C
(±3 °C). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución permanece estable en estas condiciones
durante un tiempo mínimo de 1 año.
4.10.2 Disolución concentrada de ácido cianúrico,  = 1 000 g/ml.
Se pesan, con una aproximación de 0,01 mg, unos 100 mg de ácido cianúrico (4.6), se introducen en un
matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se añade, en peso, la cantidad de agua necesaria para alcanzar una
concentración de 1 000 g/ml. La disolución se conserva en una nevera a una temperatura de 4 °C
durante un tiempo mínimo de 1 año.
4.10.3 Disolución concentrada de benzoguanamina,  = 1 000 g/ml.
Se pesan, con una aproximación de 0,01 mg, unos 100 mg de benzoguanamina (4.7), se introducen en
un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se añade, en peso, la cantidad de metanol (4.4) necesaria para
alcanzar una concentración de 1 000 g/ml. La disolución se conserva en una nevera a una
temperatura de 4 °C (±3 °C). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución permanece estable en
estas condiciones durante un tiempo mínimo de 1 año.
4.10.4 Disolución concentrada de 13C-melamina,  = 20 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de 13C-melamina (4.8) dentro de un matraz aforado de 50 ml (5.3). Se enrasa con
agua y se mezcla. La concentración final es de 20 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de
vidrio de 100 ml (5.2). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución permanece estable en estas
condiciones durante un tiempo mínimo de 1 año.
UNE-EN 16858:2017 -8-
4.10.5 Disolución concentrada de 13C-ácido cianúrico,  = 20 μg/ml.
Se pipetea 1,0 ml de 13C-ácido cianúrico (4.9) dentro de un matraz aforado de 50 ml (5.3). Se enrasa
con agua y se mezcla. La concentración final es de 20 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz
de vidrio de 100 ml (5.2). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución permanece estable en
estas condiciones durante un tiempo mínimo de 1 año.
4.11 Preparación de las disoluciones patrón
4.11.1 Disolución patrón I de melamina,  = 20 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución concentrada de melamina (4.10.1) dentro de un matraz aforado de

50 ml (5.3). Se enrasa con la disolución de dilución (4.16) y se mezcla. La concentración queda a
20 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se conserva en una
nevera a una temperatura de 4 °C (±3 °C). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución
permanece estable en estas condiciones durante un tiempo mínimo de 1 mes.
4.11.2 Disolución patrón I de ácido cianúrico,  = 20 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución concentrada de ácido cianúrico (4.10.2) dentro de un matraz aforado
de 50 ml (5.3). Se enrasa con la disolución de dilución (4.16) y se mezcla. La concentración queda a
20 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se conserva en una
4.11.3 Disolución patrón II de melamina,  = 0,2 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución patrón I de melamina (4.11.1) dentro de un matraz aforado de

0,2 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se conserva en una
4.11.4 Disolución patrón II de ácido cianúrico,  = 0,2 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución patrón I de ácido cianúrico (4.11.2) dentro de un matraz aforado de
0,2 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se conserva en una
nevera a una temperatura de 4 °C (±3 °C). Si la masa se controla cuidadosamente, la disolución
4.11.5 Disolución patrón I de benzoguanamina,  = 20 μg/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución concentrada de benzoguanamina (4.10.3) dentro de un matraz

aforado de 50 ml (5.3). Se enrasa con la disolución de dilución (4.16) y se mezcla. La concentración
queda a 20 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 100 ml (5.2) y se conserva en
una nevera a una temperatura de 4 °C (±3 °C). Si la masa se verifica cuidadosamente, la disolución
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4.11.6 Disolución patrón II de benzoguanamina,  = 2 g/ml.
Se pipetea 1,0 ml de la disolución patrón I de benzoguanamina (4.11.5) dentro de un matraz aforado

de 10 ml (5.3). Se enrasa con la disolución de dilución (4.16) y se mezcla. La concentración queda a
2 g/ml. Esta disolución se transfiere a un matraz de vidrio de 20 ml (5.2) y se conserva en una nevera
a una temperatura de 4 °C (±3 °C). Si la masa se controla cuidadosamente, la disolución permanece
estable en estas condiciones durante un tiempo mínimo de 1 mes.
4.11.7 Disolución patrón de 13C-melamina y 13C-ácido cianúrico,  = 2 g/ml.
Se pipetean 0,5 ml de la disolución concentrada de 13C-melamina (4.10.4) y 0,5 ml de la disolución

concentrada de 13C-ácido cianúrico (4.10.5) dentro de un matraz aforado de 5 ml (5.3). Se enrasa con
agua y se mezcla. Las concentraciones de ambos compuestos es de 2 g/ml. Esta disolución se
transfiere a un matraz de vidrio de 20 ml (5.2) y se conserva en una nevera a una temperatura de 4 °C
durante un tiempo mínimo de 1 mes.
4.11.8 Preparación de las disoluciones de calibración

Se pipetean los volúmenes indicados en la tabla 1 en matraces aforados de 10 ml (5.3) y se enrasa con
la disolución de dilución (4.16).
Tabla 1 – Preparación de las disoluciones de calibración
Número de la disolución de calibración

Disolución patrón I de melamina (4.11.1), ml 1 2 3 4 5 6 7
Disolución patrón I de ácido cianúrico (4.11.2), ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Disolución patrón II de melamina (4.11.3), ml 0 0 0 0 0 0,05 0,25
Disolución patrón II de ácido cianúrico (4.11.4), ml 0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
Disolución patrón II de benzoguanamina
0 0,05 0,25 1,25 2,5 0 0
(4.11.6), ml
Disolución patrón de 13C-melamina – 13C-ácido
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
cianúrico (4.11.7), ml
Concentración de 13C-melamina – 13C-ácido
0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
cianúrico, g/ml
Concentración de melamina – ácido cianúrico
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
nativos, g/ml
0 0,001 0,005 0,025 0,05 0,1 0,5
4.12 Fase móvil A para HPLC, de concentración c(acetato amónico) = 10 mmol/l.
Se disuelven 0,77 g de acetato amónico (4.3) en 1 000 ml de agua.
4.13 Fase móvil B para HPLC
Acetonitrilo (4.2).
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4.14 Fase móvil A para UHPLC
Se mezclan 3 volúmenes de ácido fórmico (4.1) con 97 volúmenes de agua.
4.15 Fase móvil B para UHPLC, c(acetato amónico) = 20 mmol/l en una mezcla de 3 volúmenes de
agua con 97 volúmenes de acetonitrilo.
Se disuelven 1,54 g de acetato amónico (4.3) en 30 ml de agua. Se añaden a la mezcla 970 ml de

acetonitrilo (4.2) y se agita con energía. La mezcla turbia resultante adquirirá una apariencia clara de
un día para otro.
NOTA La elección de las fases móviles A y B óptimas puede depender de la configuración del instrumento (véanse 5.10 a
5.12) y, más en concreto, del tipo de columna utilizada. Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda
demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
4.16 Disolución de dilución
Mediante el uso de probetas, se transfieren 70 ml de acetonitrilo (4.2) y 30 ml de agua a un matraz

aforado de 100 ml (5.3) y se mezcla. Se almacena a temperatura ambiente durante un tiempo máximo
de un mes.
5 Aparatos
Todas las descripciones técnicas son ejemplos de parámetros y configuraciones instrumentales
posibles y deben escalarse o adaptarse al equipamiento utilizado por el usuario. El equipamiento y el
material de vidrio habitual de un laboratorio y, en particular, lo siguiente:
5.1 Tubos desechables de carbonato de polipropileno, de una capacidad de aproximadamente

50 ml.
5.2 Matraces de vidrio, de 20 ml y 100 ml de capacidad.
5.3 Matraces aforados de enrase único, de 5 ml, 10 ml, 50 ml y 100 ml de capacidad.
5.4 Aparato de agitación, ajustable desde 0 pulsos/min hasta 300 pulsos/min.
5.5 Baño de ultrasonidos.
5.6 Centrífuga, que permita centrifugar tubos de 50 ml (véase 5.1) y alcanzar una fuerza g máxima
de 4 000 g como mínimo.
5.7 Centrífuga, que permita centrifugar micro-tubos de análisis normales (véase 5.8) y alcanzar
una fuerza g máxima de 8 000 g como mínimo.
5.8 Micro-tubos de análisis normales, de 1,5 ml
5.9 Viales, para LC.
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5.10 Equipo de cromatografía líquida y espectrómetro de masas con cuadrupolo triple,

consistente en:
5.10.1 Sistema de bombeo, capaz de dispensar un gradiente a la velocidad de flujo requerida.
5.10.2 Inyector, con capacidad de inyección de 5 l.
5.11 Columna de HILIC TSKgel® Amide-801), de 100 mm de longitud, 3,0 mm de diámetro interno
y partículas de 3 m de tamaño.
5.12 Columna de HILIC para UHPLC® BEH (híbrido de etilo en puente; bridged ethyl hybrid)1),
de 150 mm de longitud, 2,1 mm de diámetro interno y partículas de 1,7 m de tamaño.
6 Procedimiento
6.1 Preparación de la muestra

Todos los productos líquidos a base de leche, como la leche entera, la leche desnatada, la leche cruda o
la leche con chocolate se calientan hasta 40 °C y se agitan suavemente.
En caso necesario, todos los productos secos a base de leche, soja o trigo, como la leche en polvo, las
fórmulas infantiles y las galletas se trituran para reducir el tamaño de las partículas hasta < 1 mm.
Todos los productos a base de leche o de cacao, como el chocolate, los caramelos y los dulces (toffee)
se trituran criogénicamente utilizando, por ejemplo, nitrógeno líquido tras haberlos cortado en dados
pequeños de un tamaño ≤ 1 cm.
6.2 Extracción
6.2.1 Generalidades
Deben incluirse las siguientes muestras en todas las series:
– disoluciones de calibración;
– un blanco del procedimiento (n = 1);
– un material de referencia (certificado) a una concentración adecuada o una muestra de referencia

preparada por el propio laboratorio;
– todas las muestras;
– la disolución de calibración de número 3, 4 o 5 (véase la tabla 1).
1) Este es un ejemplo de un producto comercial disponible adecuado. Esta información se facilita por su utilidad para los
usuarios de esta norma europea sin que ello constituya una recomendación por parte de CEN hacia dicho producto.
Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
UNE-EN 16858:2017 - 12 -
El blanco del procedimiento no debe presentar contaminantes a niveles iguales o superiores a los
límites de cuantificación. La cantidad de muestra utilizada para la extracción es de 1 g. Si se modifica la
masa de muestra utilizada, dicho cambio debe tomarse en consideración en la fórmula (5) del
apartado 8.5 (m = masa de la muestra en g).
Se utiliza la gráfica de calibración para la identificación y la cuantificación, y se utiliza la disolución de

calibración 3, 4 o 5 después de cada serie para el control de la estabilidad. Las áreas de los picos de
melamina y de ácido cianúrico obtenidos con este patrón deben ser iguales a las áreas obtenidas con
ese mismo patrón en la gráfica de calibración con una desviación máxima del 10%.
6.2.2 Procedimiento de extracción

Se pesa, con una aproximación de 0,01 g, 1 g de muestra y se lleva a un tubo desechable (5.1). Se
añaden 250 l de la disolución concentrada de 13C-melamina (4.10.4) y 250 l de la disolución
concentrada de 13C-ácido cianúrico (4.10.5). Se incuba a temperatura ambiente durante un tiempo de
1 h como mínimo. Se añaden 5 ml de agua y se agita a mano durante 30 s, obteniéndose una
suspensión lechosa. Se añaden 5 ml de acetonitrilo (4.2) y se vuelve a agitar. La suspensión se mezcla
con 30 ml de acetonitrilo (4.2) y 10 ml de agua caliente (entre 96 °C y 100 °C). Se agita bien durante
5 min y se centrifuga durante 10 min a 3 400 g. Se transfieren 1,5 ml del extracto a un micro-tubo de
análisis normal (5.8) y se centrifuga durante 10 min a 7 800 g. Se transfieren 1 000 l de la capa
superior a un vial de LC (5.9) y se añaden 50 l de la disolución patrón II de benzoguanamina (4.11.6).
6.3 Determinación
Se inyectan 5 μl de las disoluciones de calibración (1 a 7, véase la tabla 1) y 5 l de los extractos de las
muestras. Los picos de melamina y de ácido cianúrico se identifican en base a sus tiempos de
retención, las transiciones y las proporciones entre iones. La cantidad de melamina y de ácido
cianúrico se determina comparando las áreas de los picos de las muestras con las cantidades
conocidas correspondientes a los picos de melamina y de ácido cianúrico en las disoluciones de
calibración. La calibración se basa en el principio de dilución isotópica.
7 Configuración del sistema
7.1 Parámetros de HPLC

Los parámetros en gradiente mostrados en la tabla 2 han demostrado proporcionar unos resultados
satisfactorios. En función del sistema de LC-MS/MS, los parámetros podrían necesitar pequeños
ajustes. Alternativamente, puede utilizarse un sistema de UHPLC, véase el apartado 7.3.
- 13 - UNE-EN 16858:2017
Tabla 2 – Parámetros del gradiente de HPLC
Tiempo Velocidad de flujo Fase móvil A Fase móvil B

min ml/min % %
1 Inicial 0,25 10 90
2 8,00 0,25 10 90
3 13,00 0,25 65 35
4 14,00 0,25 90 10
5 15,00 0,25 90 10
6 15,50 0,25 10 90
7 25,00 0,25 10 90
7.2 Parámetros de HPLC-MS/MS

Durante la validación del método, se utilizó un espectrómetro de masas de tipo Micromass Quattro
Ultima2) y es a este equipo al que se refiere la configuración instrumental. El espectrómetro de masas
se emplea en modo alternativo para los iones positivos y negativos en tres ventanas diferentes. La
ventana 1 se utiliza para los iones positivos (benzoguanamina), la ventana 2 se utiliza para los iones
negativos (ácido cianúrico) y la ventana 3 para los iones positivos (melamina). La ventana que define
los tiempos de retención se determina antes de cada serie de muestras, analizando una disolución de
calibración de melamina y ácido cianúrico en primer lugar en el modo positivo y a continuación en el
modo negativo a lo largo del gradiente de LC.
La optimización de los parámetros de las transiciones de MS puede variar en función de las

características del espectrómetro de masas de cuadrupolo triple. Los parámetros se deben determinar
por infusión de melamina y ácido cianúrico y optimizando la energía en el cono y la energía de colisión
para la transición.
Fuente (ES-) (ES+)
Capilar (kV) 3,00 2,70
Cono (V) 25 35
Temperatura de la fuente de iones (°C) 120 120
Temperatura de desolvatación (°C) 350 350
Velocidad de flujo del gas en el cono (l/h) de 190 a 193 de 190 a 193
Velocidad de flujo del gas de desolvatación (l/h) de 560 a 565 de 560 a 565
Presión en la cubeta de colisión (Pa) aproximadamente 0,26 aproximadamente 0,26
2) Micromass Quattro Ultima es un nombre comercial propiedad de Waters Company. Este es un ejemplo de un producto
comercial disponible adecuado. Esta información se facilita por su utilidad para los usuarios de esta norma europea sin
que ello constituya una recomendación por parte de CEN hacia dicho producto. Pueden utilizarse productos equivalentes
siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
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Analizador
Resolución para masas bajas (LM; low mass) 1 12,5 14,0
Resolución para masas altas (HM; high mass) 1 12,5 14,0
Energía iónica 1 (V) 1,0 1,0
Resolución LM 2 12,5 13,0
Resolución HM 2 12,5 13,0
Multiplicador (V) 650 650
Los parámetros indicados en la tabla 3 han demostrado proporcionar unos resultados satisfactorios.
En función del sistema de LC-MS/MS, los parámetros podrían necesitar pequeños ajustes.
Alternativamente, puede utilizarse un sistema de UHPLC, véase el apartado 7.3.
Tabla 3 – Parámetros de HPLC MRM
Tiempo de Energía de
Modo de Cono
Analitoa Transición retención colisión
ionización V
s eV
188 > 85 ES+ 0,2 35 20
BENZ IS
188 > 104 0,2 35 25
128 > 85 ES- 0,2 25 10
CYA
128 > 42 0,2 25 15
134 > 89 ES- 0,2 25 10
13C CYA IS
134 > 44 0,2 25 15
127 > 85 ES+ 0,2 35 20
MEL
127 > 68 0,2 35 30
133 > 89 ES+ 0,2 35 20
13C MEL IS
133 > 71 0,2 35 30
a 13C CYA IS: 13C-ácido cianúrico; 13C MEL IS: 13C-melamina; BENZ: benzoguanamina.
Retardo entre canales (s) 0,010
Tiempo entre barridos (s) 0,100
Volumen de inyección (l) 5
Temperatura de la columna (°C) 40
Retardo hasta el inicio del disolvente 1 (min) 0
- 15 - UNE-EN 16858:2017
Retardo hasta la finalización del disolvente 1 (min) 3,5
Retardo hasta el inicio del disolvente 2 (min) 15
Retardo hasta la finalización del disolvente 2 (min) 23
Tiempo de MRM ES- (min) de 4 a 8,5
Tiempo de MRM ES+ (min) de 1,5 a 4, de 8,5 a 16
Fase móvil A agua con 10 mmol/l de acetato amónico (4.12)
Fase móvil B acetonitrilo (4.13)
Columna Columna de HILIC TSKgel®1) Amide-80 (5.11)
7.3 Parámetros de UHPLC

Los parámetros del gradiente descrito en la tabla 4 han demostrado proporcionar unos resultados
satisfactorios. En función del sistema de UHPLC-MS/MS, los parámetros podrían necesitar pequeños
ajustes. Alternativamente, puede utilizarse un sistema de HPLC, véase el apartado 7.1.
Tabla 4 – Parámetros del gradiente de UHPLC (proporción de reparto 1:1)
Tiempo Velocidad de flujo Fase móvil A Fase móvil B

min ml/min % %
1 Inicial 0,7 0 90
2 1,00 0,7 0 90
3 3,20 0,7 6,0 94
4 3,50 0,7 50 50
5 5,00 0,7 50 50
6 5,20 0,7 0 100
7 9,00 0,7 0 100
7.4 Parámetros de UHPLC-MS/MS

Durante la validación del método, se utilizó un espectrómetro de masas de tipo Micromass Quattro
Ultima3) y es a este equipo al que se refiere la configuración instrumental. El espectrómetro de masas
se emplea en modo alternativo para los iones positivos y negativos en dos ventanas diferentes. La
ventana 1 se utiliza para los iones negativos (ácido cianúrico) y la ventana 2 para los iones positivos
(melamina y benzoguanamina). La ventana que define los tiempos de retención se determina antes de
cada serie de muestras, analizando una disolución de calibración de melamina y ácido cianúrico en
primer lugar en el modo positivo y a continuación en el modo negativo a lo largo del gradiente.
3) Este es un ejemplo de un producto comercial disponible adecuado. Esta información se facilita por su utilidad para los
usuarios de esta norma europea sin que ello constituya una recomendación por parte de CEN hacia dicho producto.
Pueden utilizarse productos equivalentes siempre que pueda demostrarse que proporcionan los mismos resultados.
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Fuente (ES-) (ES+)
Capilar (kV) 3,00 2,70
Cono (V) 30 35
Temperatura en la fuente de iones (°C) 120 120
Temperatura de desolvatación (°C) 350 350
Velocidad de flujo del gas en el cono (l/h) de 190 a 193 de 190 a 193
Velocidad de flujo del gas de desolvatación (l/h) de 560 a 565 de 560 a 565
Presión en la cubeta de colisión (Pa) aproximadamente 0,26 aproximadamente 0,26
Analizador
Multiplicador (V) 650 650
Los parámetros mostrados en la tabla 5 han demostrado proporcionar unos resultados satisfactorios.
Tabla 5 – Parámetros de UHPLC MRM
Tiempo de Energía de
Modo de Cono
Analitoa Transición retención colisión
ionización V
s eV
128 > 85 ES- 0,05 25 10
CYA
128 > 42 0,05 25 15
134 > 89 ES- 0,05 25 10
13C CYA IS
134 > 44 0,05 25 15
127 > 85 ES+ 0,05 35 20
MEL
127 > 68 0,05 35 30
133 > 89 ES+ 0,05 35 20
13C MEL IS
133 > 71 0,05 35 30
188 > 85 ES+ 0,2 35 20
BENZ IS
188 > 104 0,2 35 25
a 13C CYA IS: 13C-ácido cianúrico; 13C MEL IS: 13C-melamina; BENZ: benzoguanamina.
- 17 - UNE-EN 16858:2017
Retardo entre canales (s) 0,010
Tiempo entre barridos (s) 0,030
Volumen de inyección (μl) 5
Temperatura de la columna (°C) 40
Tiempo de MRM ES- (min) de 0 a 2
Tiempo de MRM ES+ (min) de 2 a 10
Fase móvil A mezcla de agua y ácido fórmico (4.14)
Fase móvil B mezcla de acetonitrilo y agua con acetato amónico (4.15)
Columna Columna de HILIC UHPLC® BEH (5.12)
7.5 Preparación del sistema de LC-MS/MS y de las muestras
7.5.1 Ajuste del sistema de LC-MS/MS

Se verifica cada dos semanas que la calibración de las masas del sistema de LC-MS/MS es correcta
siguiendo las indicaciones proporcionadas por el fabricante. El sistema solamente se calibra si se
observan diferencias entre las masas medidas y las teóricas.
7.5.2 Comprobación de la configuración instrumental

Se inyectan 5 l de una disolución de concentración media y se comprueba el perfil de los picos y los
tiempos de retención de la melamina y el ácido cianúrico.
7.5.3 Comprobación de la sensibilidad del sistema

Se inyectan 5 l de la disolución con la concentración más baja. La relación señal-ruido de la melamina
en la transición 127 > 85 y del ácido cianúrico en la transición 128 > 85 debe ser como mínimo de 6. En
caso contrario, se ponen en práctica las medidas pertinentes, como la limpieza del cono o el cambio de
columna analítica (con un mal perfil de los picos).
7.5.4 Relación de muestras

Se analizan las siguientes muestras dentro de cada serie:
– disoluciones de calibración;
– un blanco del procedimiento (n = 1);
– un material de referencia (certificado) a una concentración adecuada o una muestra de referencia

preparada por el propio laboratorio;
– todas las muestras;
– la disolución de calibración de número 3, 4 o 5 (véase la tabla 1).
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8 Cálculos y expresión de los resultados
8.1 Generalidades
De forma general, el cálculo de los resultados se realiza con el programa informático de cuantificación
que suele venir incorporado en el instrumento de LC-MS/MS. Para realizar unos cálculos correctos se
necesitan evaluar distintos aspectos de los datos, que se relacionan a continuación:
– los cálculos (8.2 – 8.4) se basarán en el área de los picos (no en la altura de los picos);
– los tiempos de retención de todos los compuestos de interés se comprueban respecto a los tiempos
de retención pre-establecidos en el método de procesamiento de datos. En caso necesario, se
modifican los tiempos de retención en el método de procesamiento de datos para permitir la
identificación automática de los compuestos y el procesamiento de los datos. Después del
procesamiento de los datos, se comprueba de forma manual en todos los resultados que la
integración es correcta. Los tiempos de retención se evaluarán respecto a los criterios del apartado
8.3;
– el coeficiente de variación de la respuesta relativa de la melamina y del ácido cianúrico debe ser
inferior al 5% a lo largo del rango de calibración. Debe utilizarse un RRF promediado para cada
compuesto. El coeficiente de variación de 13C MEL IS y de 13C CYA IS debe ser inferior al 30%.
8.2 Criterios de calibración

Se utiliza una gráfica de calibración de un mínimo de cinco puntos y se calcula el coeficiente de
correlación r2. En el estudio de validación se utilizaron dos estrategias de calibración: forzando a que la
gráfica pase por el origen de coordenadas y calculando la suma de las áreas de los picos de las dos
transiciones, o bien sin forzar a que la gráfica pase por el origen de coordenadas y calculando el área
de los picos para una transición escogida. Ambas estrategias proporcionaron unos resultados
comparables. No obstante, se recomienda no forzar a que la gráfica pase por el origen de coordenadas.
Los resultados de las muestras deben quedar incluidas dentro del rango de concentraciones de
calibración. Si un resultado queda fuera del rango de las concentraciones de la calibración, la muestra
se debe diluir convenientemente y volverse a analizar hasta que quede incluida dentro de dicho rango.
8.3 Criterios de identificación

La melamina y el ácido cianúrico se identifican en base a los tiempos de retención, la transición de
masas y la proporción de las transiciones de las masas. Las intensidades relativas de las transiciones
de masas detectadas (en base a las áreas de los picos), expresadas en forma de tanto por ciento
respecto a la intensidad de la transición de masa de mayor intensidad, deben corresponder a las de la
disolución de calibración, medida en las mismas condiciones dentro de las siguientes tolerancias
(conforme a la decisión de la Comisión nº 657/2002/CE, véase la referencia [1] de la bibliografía);
véase la tabla 6.
- 19 - UNE-EN 16858:2017
Tabla 6 – Tolerancias relativas
Intensidad relativa
Tolerancias relativas
% respecto al pico base
> 50% ±20%
> 20% hasta 50% ±25%
> 10% hasta 20% ±30%
< 10% ±50%
Para cada muestra, la proporción entre los tiempos de retención de la melamina y del ácido cianúrico
respecto a los de sus respectivos análogos 13C (RRT; ratio retention time), debe corresponder al RRT de
la melamina y del ácido cianúrico en la disolución de calibración con una tolerancia de ±2,0%.
8.4 Tasa de recuperación

Debe señalarse que la tasa de recuperación sólo se registra para el análisis del funcionamiento del
método. La tasa de recuperación se calcula solamente a título informativo y no se aplican factores de
recuperación para la corrección de los resultados.
La estimación de la tasa de recuperación se realiza en base a la proporción entre los factores de

respuesta relativos (RRF; relative response factors) de los patrones internos marcados con isótopos
estables (13C MEL IS y 13C CYA IS).
La tasa de recuperación R, en %, del patrón interno utilizado (13C MEL IS), se calcula utilizando las
fórmulas (1) y (2):
RRFmsa
R  100 (1)
RRFmst
Ais   rs
RRFm  (2)
Ars   is
donde
RRFmsa es el factor de respuesta relativo en masa del patrón interno marcado en la muestra;
RRFmst es el factor de respuesta relativo en masa del patrón interno marcado en la disolución de
calibración;
Ais es el área del pico del ion más intenso de 13C MEL IS en la muestra;
Ars es el área del pico del ion más intenso de BENZ en la muestra;
is es la concentración en masa de 13C MEL IS, en g/ml;
rs es la concentración en masa de BENZ, en g/ml.
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Los datos recogidos permiten comprobar un conjunto de valores de recuperación.
1) El efecto de supresión o potenciación por parte de la matriz se puede calcular a partir del área de
BENZ en el extracto de la muestra, por comparación con el área promediada de BENZ de los
distintos niveles de calibración. La supresión o potenciación por la matriz debería oscilar entre el
60% y el 150%.
2) El tanto por ciento de recuperación del patrón interno de 13C MEL IS en una muestra se puede
calcular de la siguiente forma. En primer lugar, se calcula el área relativa de 13C MEL IS
determinando la proporción entre las áreas de los picos de 13C MEL IS y BENZ IS en la muestra de
interés. A continuación, se calcula la proporción entre 13C MEL IS y BENZ IS en la disolución de
calibración. Finalmente, se divide la proporción calculada de 13C MEL IS/BENZ en la muestra entre
la proporción 13C MEL IS/BENZ en la disolución de calibración y se multiplica por 100%.
Se evalúa la tasa de recuperación de 13C CYA IS siguiendo el mismo procedimiento indicado

anteriormente.
La veracidad se puede determinar analizando un material de referencia (certificado) a una

concentración adecuada o una muestra de referencia preparada por el propio laboratorio (6.2.1).
Además, la veracidad se puede determinar comparando el resultado de MEL y CYA calculado en una
muestra en blanco reforzada respecto al valor teórico (cantidad añadida en la muestra reforzada),
expresada en forma de tanto por ciento. La veracidad debería oscilar entre el 80% y el 110%.
8.5 Cálculo de los resultados

El factor de respuesta relativo (RRFn) de los compuestos nativos se calcula a partir de la gráfica de
calibración utilizando la fórmula (3):
Ax   is
RRFn  (3)
 x  Ais
donde
Ax es el área del pico de melamina y ácido cianúrico;
Ais es el área del pico de 13C-melamina y 13C-ácido cianúrico;
is es la concentración en masa de 13C-melamina y 13C-ácido cianúrico, en g/ml;
x es la concentración en masa del compuesto nativo, en g/ml.
En consecuencia, el factor de respuesta relativo promediado se calcula utilizando la fórmula (4):
m
1
RRFn 
m
 RRFi n (4)
i 1
donde
- 21 - UNE-EN 16858:2017
m es el número de patrones (niveles de concentración);
n es el compuesto nativo;
i es el nivel de calibración.
La fracción en masa del compuesto de interés se calcula utilizando la fórmula (5):
Ax   is
wx  (5)
Ais  F  RRFn
donde
ωx es la fracción en masa de melamina y de ácido cianúrico, en mg/kg;
Ax es el área del pico de melamina y de ácido cianúrico en los extractos de las muestras;
Ais es el área del pico de 13C-melamina y de 13C-ácido cianúrico en los extractos de las muestras;
is es la concentración en masa del patrón interno marcado inyectado, en g/ml;
F es el factor utilizado para transformar la concentración (g/ml) en contenido en base a la

muestra (mg/kg) = m/ν, donde ν = volumen final, en ml y m = porción para análisis, en g.
9 Datos de precisión
9.1 Generalidades
Los detalles del análisis interlaboratorios referidos a la precisión del método se resumen en el anexo B.
Los valores procedentes del análisis interlaboratorios pueden no resultar aplicables a rangos de
concentraciones de analitos o matrices diferentes de las indicadas en el anexo B.
9.2 Repetibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisiss individuales obtenidos sobre un material
de análisis idéntico, realizados dentro del intervalo de tiempo más corto posible por el mismo analista
y utilizando los mismos aparatos, no será superior al límite de la repetibilidad r en más de un 5% de
los casos.
Los valores para la melamina son:
x = 1,26 mg/kg r = 0,183 mg/kg (formula infantil a base de leche)
x = 0,73 mg/kg r = 0,367 mg/kg (formula infantil a base de soja)
x = 1,04 mg/kg r = 0,136 mg/kg (leche en polvo)
x = 1,43 mg/kg r = 0,126 mg/kg (leche entera)
UNE-EN 16858:2017 - 22 -
x = 1,06 mg/kg r = 0,435 mg/kg (bebida de soja)
x = 0,71 mg/kg r = 0,354 mg/kg (chocolate con leche)
Los valores para el ácido cianúrico son:
x = 0,83 mg/kg r = 0,175 mg/kg (formula infantil a base de leche)
x = 0,87 mg/kg r = 0,292 mg/kg (formula infantil a base de soja)
x = 1,45 mg/kg r = 0,375 mg/kg (leche en polvo)
x = 0,57 mg/kg r = 0,104 mg/kg (leche entera)
x = 0,91 mg/kg r = 0,365 mg/kg (bebida de soja)
x = 0,96 mg/kg r = 0,365 mg/kg (chocolate con leche)
9.3 Reproducibilidad
La diferencia absoluta entre los resultados de dos análisis individuales obtenidos sobre un material de
análisis idéntico en dos laboratorios diferentes no será superior al límite de reproducibilidad R en más
de un 5% de los casos.
Los valores para melamina son:
x = 1,26 mg/kg R = 0,680 mg/kg (formula infantil a base de leche)
x = 0,73 mg/kg R = 0,626 mg/kg (formula infantil a base de soja)
x = 1,04 mg/kg R = 0,647 mg/kg (leche en polvo)
x = 1,43 mg/kg R = 0,453 mg/kg (leche entera)
x = 1,06 mg/kg R = 0,657 mg/kg (bebida de soja)
x = 0,71 mg/kg R = 0,609 mg/kg (chocolate con leche)
Los valores para ácido cianúrico son:
x = 0,83 mg/kg R = 0,402 mg/kg (formula infantil a base de leche)
x = 0,87 mg/kg R = 0,450 mg/kg (formula infantil a base de soja)
x = 1,45 mg/kg R = 0,375 mg/kg (leche en polvo)
x = 0,57 mg/kg R = 0,214 mg/kg (leche entera)
x = 0,91 mg/kg R = 0,608 mg/kg (bebida de soja)
x = 0,96 mg/kg R = 0,365 mg/kg (chocolate con leche)
- 23 - UNE-EN 16858:2017
10 Informe del análisis

El informe del análisis debe incluir los siguientes datos:
a) toda la información necesaria para la identificación de la muestra (tipo de muestra, origen y

designación de la muestra);
b) una referencia a esta norma europea;
c) la fecha y el tipo de procedimiento de toma de muestras utilizado (si se conoce);
d) la fecha de recepción;
e) la fecha del análisis;
f) los resultados obtenidos en el análisis y las unidades en los que éstos se han expresado;
g) todas las operaciones no descritas en el método o consideradas opcionales que pudieran haber
influido sobre los resultados.
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Anexo A (Informativo)
Cromatogramas de HPLC típicos
Los cromatogramas mostrados en este anexo corresponden a una disolución de calibración (figura
A.1), una muestra en blanco (figura A.2) y una muestra de leche en polvo de un análisis de capacitación
procedente de FAPAS (figura A.3). En cada figura se muestran diez cromatogramas que corresponden,
empezando desde arriba hacia abajo:
– A: BENZ m/z 188 → 85;
– A: BENZ m/z 188 → 145;
– B: CYA m/z 128 → 85;
– B: CYA m/z 128 → 42;
– B: 13C-CYA IS m/z 134 → 89;
– B: 13C-CYA IS m/z 134 → 44;
– C: MEL m/z 127 → 85;
– C: MEL m/z 127 → 68;
– C: 13C-MEL IS m/z 133 → 89;
– C: 13C-MEL IS m/z 133 → 71;
– eje-x: tiempo, en min;
– eje-y: abundancia relativa.
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Figura A.1 – Ejemplo de la disolución de calibración nº 5;

las concentraciones se indican en la tabla 1
UNE-EN 16858:2017 - 26 -
Figura A.2 – Ejemplo de una muestra en blanco. El ácido cianúrico no se detectó. La

concentración de melamina (MEL) es aproximadamente de 0,03 mg/kg, que procede de una
traza de impurezas de MEL nativa en la masa del patrón interno marcado de 13C MEL IS
- 27 - UNE-EN 16858:2017
Figura A.3 – Ejemplo de muestra para análisis de leche en polvo de un análisis de capacitación
de FAPAS. Valor asignado de ácido cianúrico (CYA) = 2,93 mg/kg y de melamina
(MEL) = 2,41 mg/kg
UNE-EN 16858:2017 - 28 -
Anexo B (Informativo)
Datos de precisión
Los datos mostrados en las tablas B.1 y B.2 se obtuvieron en un estudio interlaboratorios (véase la
referencia [2] de la bibliografía), organizado por RIKILT Wageningen UR conforme a la Norma
ISO 5725-2 [3] en relación a los procedimientos de los estudios en colaboración para la validación de
las características de un método de análisis.
Tabla B.1 – Datos de precisión para la melamina en fórmulas infantiles, fórmulas infantiles a
base de soja, leche en polvo, leche entera, una bebida de soja y chocolate con leche
Fórmula Fórmula
Leche
infantil a infantil a Leche Bebida Chocolate
Muestra en
base de base de entera de soja con leche
polvo
leche soja
Año del análisis interlaboratorios 2014 2014 2014 2014 2014 2014
Número de laboratorios mantenidos tras la
9 9 9 9 9 9
eliminación de los discrepantes
Número de discrepantes (laboratorios) 0 0 0 0 0 0
Número de resultados aceptados 9 9 9 9 9 9
Valor medio, x mg/kg 1,26 0,73 1,04 1,43 1,06 0,71
Desviación estándar de la repetibilidad sr,
0,1268 0,1691 0,0674 0,0431 0,1465 0,1195
mg/kg
Desviación estándar relativa de la
10,1 23,1 6,51 3,00 13,9 16,9
repetibilidad, RSDr, %
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], mg/kg 0,183 0,367 0,136 0,126 0,435 0,354
Desviación estándar de la reproducibilidad sR,
0,2428 0,2237 0,2312 0,1260 0,2348 0,2175
mg/kg
19,4 30,7 21,2 11,7 21,0 35,1
reproducibilidad, RSDR, %
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR],
0,680 0,626 0,647 0,453 0,657 0,609
mg/kg
Tasa de recuperación, % n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Valor de HorRat conforme a la referencia [4]
1,26 1,83 1,33 0,77 1,32 2,08
de la bibliografía
- 29 - UNE-EN 16858:2017
Tabla B.2 – Datos de precisión para el ácido cianúrico en fórmulas infantiles, fórmulas
infantiles a base de soja, leche en polvo, leche entera, una bebida de soja y chocolate con leche
Fórmula Fórmula
Leche
infantil a infantil a Leche Bebida Chocolate
Muestra en
base de base de entera de soja con leche
polvo
leche soja
Año del análisis interlaboratorios 2014 2014 2014 2014 2014 2014
Número de laboratorios mantenidos tras la
6 7 6 6 7 6
eliminación de los discrepantes
Número de discrepantes (laboratorios) 1 1 1 1 1 1
Número de resultados aceptados 5 6 5 5 6 5
Valor medio, x mg/kg 0,83 0,87 1,45 0,57 0,91 0,96
Desviación estándar de la repetibilidad sr,
0,0624 0,1044 0,1341 0,0371 0,1304 0,1305
mg/kg
7,51 12,0 9,23 6,47 15,0 13,5
repetibilidad, RSDr, %
Límite de la repetibilidad r [r = 2,8  sr], mg/kg 0,175 0,292 0,375 0,104 0,365 0,365
Desviación estándar de la reproducibilidad sR,
0,1437 0,1606 0,1341 0,0766 0,2172 0,1305
mg/kg
17,3 18,5 9,23 13,4 25,1 13,5
reproducibilidad, RSDR, %
Límite de la reproducibilidad R [R = 2,8  sR],
0,402 0,450 0,375 0,214 0,608 0,365
mg/kg
Tasa de recuperación, % n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Valor de HorRat conforme a la referencia [4]
1,05 1,13 0,61 0,77 1,53 0,84
de la bibliografía
UNE-EN 16858:2017 - 30 -
Bibliografía
[1] Commission Decision No. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning
the performance of analytical methods and the interpretation of results, Official Journal of the
European Communities, 12.8.2002, L221/8-36.
[2] RIKILT report 2011.014 “Method validation study on determination of melamine and cyanuric
acid in food” project leader W.A. Traag; http://www.rikilt.wur.nl/UK/publications/Reports
[3] ISO 5725 2:1994, Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2:
Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard
measurement method.
[4] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A Useful Index of Method Performance with
Respect to Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095–1109.
Para información relacionada con el desarrollo de las normas contacte con:
Asociación Española de Normalización
Génova, 6
28004 MADRID-España
Tel.: 915 294 900
info@une.org
www.une.org
Para información relacionada con la venta y distribución de las normas contacte con:
AENOR INTERNACIONAL S.A.U.
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normas@aenor.com
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Norma Española

Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico

Produits alimentaires. Détermination de la teneur en mélamine et en acide cyanurique dans les

Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN 16858:2017.

Las observaciones a este documento han de dirigirse a:

Asociación Española de Normalización

Foodstuffs. Determination of melamine Produits alimentaires. Détermination Lebensmittel. Bestimmung von

Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 2017-04-10.

COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN

 2017 CEN. Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

Prólogo europeo .................................................................................................................................5

1 Objeto y campo de aplicación........................................................................................6

2 Normas para consulta ......................................................................................................6

7 Configuración del sistema ........................................................................................... 12

8 Cálculos y expresión de los resultados ................................................................... 18

9 Datos de precisión .......................................................................................................... 21

10 Informe del análisis ....................................................................................................... 23

Anexo A (Informativo) Cromatogramas de HPLC típicos ............................................. 24

Anexo B (Informativo) Datos de precisión ........................................................................ 28

ADVERTENCIA – El uso de esta norma puede implicar el uso de materiales, operaciones y

1 Objeto y campo de aplicación

2 Normas para consulta

4.2 Acetonitrilo, de calidad adecuada para gradiente de HPLC (CAS 75-08-8).

4.4 Metanol, de grado ultra LC-MS (CAS 67-56-1).

4.6 Ácido cianúrico, en estado sólido, (CAS 108-80-5).

4.7 Benzoguanamina, en estado sólido, (CAS 91-76-9).

4.10 Preparación de las disoluciones concentradas

4.10.1 Disolución concentrada de melamina,  = 1 000 g/ml.

4.10.2 Disolución concentrada de ácido cianúrico,  = 1 000 g/ml.

4.10.3 Disolución concentrada de benzoguanamina,  = 1 000 g/ml.

4.10.4 Disolución concentrada de 13C-melamina,  = 20 g/ml.

4.10.5 Disolución concentrada de 13C-ácido cianúrico,  = 20 μg/ml.

4.11 Preparación de las disoluciones patrón

4.11.1 Disolución patrón I de melamina,  = 20 g/ml.

Se pipetea 1,0 ml de la disolución concentrada de melamina (4.10.1) dentro de un matraz aforado de

4.11.2 Disolución patrón I de ácido cianúrico,  = 20 g/ml.

4.11.3 Disolución patrón II de melamina,  = 0,2 g/ml.

Se pipetea 1,0 ml de la disolución patrón I de melamina (4.11.1) dentro de un matraz aforado de

4.11.4 Disolución patrón II de ácido cianúrico,  = 0,2 g/ml.

4.11.5 Disolución patrón I de benzoguanamina,  = 20 μg/ml.

Se pipetea 1,0 ml de la disolución concentrada de benzoguanamina (4.10.3) dentro de un matraz

4.11.6 Disolución patrón II de benzoguanamina,  = 2 g/ml.

Se pipetea 1,0 ml de la disolución patrón I de benzoguanamina (4.11.5) dentro de un matraz aforado

4.11.7 Disolución patrón de 13C-melamina y 13C-ácido cianúrico,  = 2 g/ml.

Se pipetean 0,5 ml de la disolución concentrada de 13C-melamina (4.10.4) y 0,5 ml de la disolución

4.11.8 Preparación de las disoluciones de calibración

Tabla 1 – Preparación de las disoluciones de calibración

Número de la disolución de calibración

4.12 Fase móvil A para HPLC, de concentración c(acetato amónico) = 10 mmol/l.

Se disuelven 0,77 g de acetato amónico (4.3) en 1 000 ml de agua.

4.13 Fase móvil B para HPLC

4.14 Fase móvil A para UHPLC

Se mezclan 3 volúmenes de ácido fórmico (4.1) con 97 volúmenes de agua.

Se disuelven 1,54 g de acetato amónico (4.3) en 30 ml de agua. Se añaden a la mezcla 970 ml de

4.16 Disolución de dilución

Mediante el uso de probetas, se transfieren 70 ml de acetonitrilo (4.2) y 30 ml de agua a un matraz

5.1 Tubos desechables de carbonato de polipropileno, de una capacidad de aproximadamente

5.2 Matraces de vidrio, de 20 ml y 100 ml de capacidad.

5.3 Matraces aforados de enrase único, de 5 ml, 10 ml, 50 ml y 100 ml de capacidad.

5.4 Aparato de agitación, ajustable desde 0 pulsos/min hasta 300 pulsos/min.

5.5 Baño de ultrasonidos.

5.8 Micro-tubos de análisis normales, de 1,5 ml

5.9 Viales, para LC.