(3975)CDU637.54:576.8 |_ NORMA GUATEMALTEGA OBLIGATORIA _ é PESCADO Y PRODUCTOS PESQUEROS Deteccién y recuento de Staphylococcus aureus COGUANOR NGO 35 015h5 Up OBJETO Esta norma tiene por objeto establecer el métedo para ia deteccién y recuento de Staphyloco- cus aureus en el pescado y los productos pesqueros. 2. CAMPO DE APLICACION. 24 La presente norma describe 5 métodos; la aplicacién de uno u otro método depende del ndmero de microorganismos que se espera enconirar, del tipo de producto y de la disponi- bilided de medios de cultivo. 2.1.1 Métodos de siembro directa en placa. Se deseriben 4 métodes alternatives de siembra directa en placa para aplicar @ productos crudos © procesados, en los que se espera encentrar més de 100 Staphylococcus aureus por gramo de producto; sin embargo, el método de siembra di- recta en agar Baird-Parker es ei método recomendado para anélisis de referencia. 2.1.2 Método del néimero més probable (NMP). Este método se aplica a productos no pro~ cesados o materias primas, en los que se espera encontrar un niimero reducido de Staphyloco- cus aureus (menor de 100), entre una poblacién grande de especies competitivas. Este méio~ do puede aplicarse simulténeamente con cualquiera de los métodos de siembra directa en pla- ca. STERIO DE ECONOMIA, GUATEMALA, C.A, 3. NORMAS COGUANOR A CONSULTAR Para 1a aplicacién de la presente norma Guatemalteca no es necesaria la consulta especitica de ninguna otra. 4 TERMINOLOGIA 41 Staphylococcus aureus. Son microorganismes que forman colonias tipicas en los medios sélidos selectivos correspondientes y que ccagulan el plasma cuando se reaiiza el ané- isis de acuerdo al método descrito en esta norma. 4.2 Deteccién y recuento de Staphylococcus aureus. Es la determinacién de la presen ~ Sia y ndmero de estos microorganisms en una muestra del producto, cuando se realiza el ané= lisis de acuerdo al método descrito en esta norma. ECA DE NORMAS(COGUANOR), Mi 5. METODOS DE SIEMBRA DIRECTA EN PLACA 5.1 Método de siembra directa en agor Baird=Parker. Reactivos o moteriales. Los componentes de los medios de cultivo o los medios de cultive completos deshicratades, deben ser de calidad recorocida para use microbiclégico; } COMISION GUATEMAL’ el agua debe ser destilada o de pureza equivalente. Se debe verificar cada partidadel medio, Continga— COGUANOR NGO 35 015 h5 Z 2/7 sembrando en estrfas una cepa conocida de Staphylococcus aureus para determinar los criter de diagnéstico apropiodos, tales como, tamafio y apariencia de las colonias, pigmentacién y reaceién con fa yema de huevo. Noto 1. Los medios completos deshidratades se deben preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Nota 2. Para cjustor ef pH de los medios y soluciones indicadas en la presente norma, pueden emplearse soluciones aproximadamente 6N de écido clorhidrico 0 de hidréxido de sodio, segin corresponca. 5.1.1.1 Solucién diluyente de peptona Peptona lg Agua destilada 1.000 em? Se disuelve la peptona en el agua destilada y se ajusta el pH a 7,0 + 0,17 se lucién en frascos de manera de obtener voldmenes de 450 cm3 + 2% y 99 m3 de esterilizados en un autoclave a 121°C durante 15 min. 2%, después Nota. Si los frascos estan calibrados se puede reajustar asépticamente el volumen, después de fa esterilizacién, utilizando una pipeta estér 5.1.1.2 Solucién diluyente de peptona y sol. Esta solucién se usa en forma alternativa a la solucién indicada en el numeral 5.1.1.1. Peptona lg Cloruro de sodio 8,59 Agua destilada 1000 em3 Se disvelven los ingredientes sélidos en el agua destilada y se ajusta el pHa 7,0 + 0,17 se distribuye la solucién en frascos de manera de obtener voliimenes de 450 cm3 + 2% y 99 cm? + 2%, después de esterilizados en un autoclave a 121°C durante 15 min. Nota. Si los frascos estén calibrados se puede reajustar asépticamente el voldmen, después de Ia esterilizacién, utilizando una pipeta estéril. 5.1.1.3 Agar Baird=Parkers 5.1.1.3.1 Medio basal Triptona 10g Extracto de carne 59 Extracto de levadura 19 Cloruro de litio hexahidratado 59 ‘Agar 209 Aqua destilada 1000 cm3 Se disuelven los ingredientes sélidos en el agua destilada aplicando calor y agitacién hasta obtener una solucién completa, se enfria entre 50 y 60°C y se ajusta el pH a 6,8. Sin filtrar se distribuye el medio en frascos de 90 cm3 y se esteriliza en autoclave o 121°C durante 15 min; el pH final después de la esterilizacién debe ser 6,8 4 7,0. El medio basal puede ser al~ macenado en frascos con tapa de rosca, durante varios meses a ia temperatura ambiente, sin pérdida de selectividad ni incremento de foxicidad para Staphylococcus aureus. Nota. Si la muestra a analizarcontiene un nimero grande de Proteus, se agrega al medio ba Sal, como inhibidor, 0,055 g de sulfametazina por cada litro de medio basal antes de la es~ terilizacién. ContindaCOGUANOR NGO 35 015 h5 3/I7 i 5.1.1.3.2 Preparacién del medio completo. Las porciones de 90 cm3 de medio basal se fur~ den y se Ilevan a una temperatura de 45 ¢ 50°C, luego se agregan en forma aséptica y en su orden, los siguientes componentes Ilevados también previamente a una temperatura de 45 4 50°C: Solucién acuosa al 20% (m/v) de glicina, esterilizada por filtracién 6,3 om Solucién acuosa al 1% (m/v) de telurito de potasio, esterilizada por filtracién 1,0 cm3 Solucién acuosa al 20% (m/v) de piruva~ to de sodio, esterilizada por filtracién 5,0 m3 Emulsién de yema de huevo (para su pre~ paracién véase el numeral 5.1.1.3.4) 5,0 cm Se mezela bien e inmediatamente se vierte en cajas de Petri, en porciones de 15 cm3 y se de— jan secar utilizando uno de los métodos descritos a continvacién: a) Se colocan las placas con las tapas removidas y las superficies de agar hacia abajo, en un horno colentado por conveccién o en incubadora, a 50°C durante 30 min; b) Se colocan las placas tapadas y con las superficies de agar hacia arriba, en un horno 0 in= cubadora, preferiblemente con conveccién forzada a 50°C durante 2 hy ¢) Se colocan las placas tapadas y con las superficies de agar hacia arriba, en una incubado~ ra @ 37°C durante 4h; & 4) Se colocan las placas tapadas y con las superficies de agar hacia arriba, sobre una mesa de loboratorio a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 h. 5.1.1.3.3 Las placas con el medio completo deben ser usadas preferiblemente deniro de las 24h de preparadas y no se pueden usar después de 48 h. Nota 1. Muchos microbiélogos han encontrado que la forma comercial del medio no es tan satisfactoria como el medio preparado en el Laboratorio, debido posiblemente al deterioro del piruvate contenido en la férmula deshidratada comercial . Nota 2. Las soluciones al 20% de glicina y al 1% de telurito de potosio, pueden ser almace~ nadas a temperatura ambiente durante varios meses; la solucién de piruvato de sedio debe al- macenerse « 5°C y debe reemplazarse cada mes. 5.141.3.4 Preporacién de la emulsin de yema de huevo. La emulsién de yema de huevo de~ be prepara'se con yema fresea obtenida de huevos que tengan su céscara intacta y estén libres de antibidticos, procediéndose en Ia forma siguiente: ) Se lavan con un cepillo las céscaras de los huevos utilizando agua ligeramente més tibia que Ia temperatura de los huevos, se los sumerge en una solucién acuosa al 1% de cloruro mer— cirico, también un poco mas tibia que los huevos, y se secan con una toalla estéril; b) Se quiebran los huevos en forma aséptica, se hacen rodar las yemas sobre la toalla estéril para remover las trazas de clara y luego se las coloca en una probeta graduada provista de fapény ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h5. 47 ¢) Se agrega a Ia probeta igual volimen de una solucién acuosa al 0,85% de cloruro de sodio, previamente esterilizada en un autoclave a 121°C durante 15 min, y se mezcla bien, La emul- sién debe usarse inmediatamente. Nota 1. La emulsién de yema de huevo puede también obtenerse en el comercio ya prepara~ da. Nota 2. El cloruro mercirice residual debe descartarse conlas precauciones necesarias para evitar Ia contaminacién de los desagues y efluentes. 5.1.1.4 Agar Baird=Parker modificado por Holbrook. Este agar se usa en forma alternativa al agar Baird=Farker indicado en el numeral 5.1.1.3. a) Se prepara el ager Baird=Parker en la forma indicada en el numeral 5.1.1.3 pero omitien~ do la solucién de piruvato de sodio; las placas que contionen’el medio modificado pueden almacenerse a 4°C durante un periodo no mayer de 28 dias. b) Antes de usar las placas, se distribuye sobre la superficie de cada una, 0,5 em3 de una solucién al 20% (m/v) de piruvato de sodio esterilizada por filtracién y luego se dejan secar; véase el numeral 5.1.1.3.2 (a) a (d). 5.1.1.5 Caldo de infusion de cerebro y corazén. Infusién de cerebro de ternero (véase nota) 200 em3 Infusién de coraz6n de vaca (véase nota) 250 cm3 Peptona 0 proteosa peptona 109 Cloruro de sodio 59 Fosfato monodcido de sodio 2,56 Glucosa 29 Agua destilada 550 cm3 Se agregan la infusién de cerebro y la infusién de corazén a los 550 cm3 de agua y luego se _agregan los ofros componentes y se ajusta el pH de manera que después de la esterilizacin sea 7,4; se distribuye el caldo en porciones de 5 cm? en tubos de ensayo y se est autoclave @ 121°C durante 15 min. Se obtiene un mejor resultado si el medio se usa el mis- mo dfa de preparado, en caso contrario,.se debe hervir o trator con vapor durante algunos mi- nutos y Ivego se enfrfa antes de usarlo. Nota. Cada una de estos infusiones se prepara en Ia forma siguiente: se calienta a ebullicién 1 L de sotucién acuosa 0,5 N de hidréxido de sodio, se agregan 1000 g de cerebro de ternero ‘0 de corazén de vaca libre de grasa, se mezcla bien, se lleva a ebullicién y se mantiene a calor suave durante 20 min con agitacién frecuente; el pH de la mezcla debe ajustarse a aptoxi: madamenie 7,5. Se cyela a través de verias capas de gasa exprimiendo el Ifquido y se ajusta el volumeri a 1000 cm® con agua destilada; la infusién debe usarse inmediatamente para pro= parar 1a formulacién del medio especifico. 5.1.1.6 Plasma bacto-coagulasa con EDTA, deshidratado, Se rehidrote disolviendo 100mg de plasma deshidratado en 3,0 cm® de agua destilada estéril y se distribuye en alfcuotas de 0,3 em3 en iubos de 10 mm x 75 mm con tapa roscada. El plasma rehidratado puede almace~ narse entre 0 y 5°C durante varios dias. Nota. Si no se dispone de producto deshidratado, se emplea plasma humano o de conejo, fres — oy estéril , diluyendo T cm del plasma con 2 em? de agua destilada estéril; antes deusar el plasma en forma rutinaria, se debe probar cada tanda asf diluida, con cepas de Staphyloco— ccus coagulase~positiva, tanto de reaccién débil como de reaccién4uerte, y con cepas coa~ gulasa-negativa, ContingeCO,GUANOR NGO 35 015 h5 5A 5.1.1.7 Agar de azul de toluidina - ADN Acido desoxiribonucléico (ADN) Clorure de calcio anhidro Cloruro de sodio Solucién acuosa al 1% (m/v) de azul de toluidina O 9,2 cms Tris (hidreximetil) aminometano &lg Agar 10g Agua destilada 1000 cm3 Se disuelve ef reactivo tris (hidroximetil) aminometano en los 1000 cm3 de agua destilada y se ajusta el pHa 9,0. Se agrega el resto de los ingredientes, excepto el azul de toluidina O, y:se lleva a ebullicién hasta que se disuelvan completamente el ADN y el agar, se agre~ ge ala solucién el azul de toluidina O y se disirituye en frascos de volumen apropiade con tapén de hule; esta solucién no requiere esterilizacién. Nota. El medio es estable a temperatura ambiente durante 4 meses y no sufre modificacién ‘aunque se funda varias veces. 5.1.2 Aporatos. 5.1.2.1 Balanza semianalitica, con capacidad minima de 2 500 g y sensibilidad de 0,19. 5.1.2.2 Mezclador mecénico (licuadora), de dos velocidades o una velocidad controlada con un reéstato, provista con vasos mezeladores de vidrio o de metal, de un lifro de capaci~ dad, con topadera y resistentes a las temperaturas de esterilizacién. 5.1.2.3 Frascos para las soluciones diluyentes, de 150 y 500 cm3 aproximadamente. 5.1.2.4 Pipetas oraduadas, esterilizados, de 0,1; 1 y 10 em3, 5.1.2.5 Cojas de Petri, de 15 mmx 100 mm, © cajas de pléstico de 15 mm x 90 mm. 5.1.2.6 Bafto de agua o incubadora, regulada a 44-46°C. 5.1.2.7 Incubadoras, reguladas a 35-37°C, y a 50°C respectivamente. 5.1.2.8 Esparcidores de vidrio, de aproximadamente 3,5 mm de diémetro y 20 em de largo. 5.1.2.9 Tubos de ensayo, de 10 mm x 75 mm con tapa roscada. 5.12.10 _Asa en punta, de nicténo platino-iridio. Portoobjetos para microscopio. Pipetas Pasteur o tubos copilares para punto de fusién, con ambos extremos abier- Tubos capilares. con orificios de salida de 2 mm de diémetro. Bato de agua hirviendo. Instrumental de loboratorio. ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 6/17 5.1.3 Preparacién de la muestra. 5.1.3.1 Se debe comenzar el anélisis tan pronto como sea posible después que la muesira ha sido tomada, Cuando la muestra no pueda ser analizada inmediatamente debe refrigerarse a 0- 5°C; si fo muestra esté congelada, se debe colocar durante 18 h como maximo en una “refrigeradora a 2-5°C sin removerla del envase que la contiene. 5.1.3.2 Se pesan 50 + 0,1 g de la muestra en un vaso mezclador estéril y se agregan 450 em3 de la solucién diluyente de peptona o de Ia solucién diluyente de peptona y sal; esta di- lucién corresponde a una concentracién de muestra de 10-1, 5.1.3.3 De inmediato se mezelo durante unos pocos segundos a une velocidad lenta, luego se lleva a velocidad alta durante 2 min, se esperan 2 @ 3 min para que se disperse la espuma y se procede répidamente con la preparacién de las diluciones restantes. 5.1.3.4. Se transfieren 10 em3 de Ia dilucién 1071, evitondo la $spuma, aun frasco que contenga 90 m3 de la solucién diluyente o bien, 11 m3 a 99 em® del diluyente; se agita vigorosamente 25 veces en un arco de 30 cm. Se repita el proceso incrementando progresiva— mente las diluciones, de manera de obtener diluciones de 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5, u otras que la experiencia indique como apropiades de acuerdo el grado de contaminaci&n del producto. 5.1.4 Procedimiento. 5.1.4.1 En duplicado se transfieren alfcuotas de 0,1 cm3 del homogeneizado, y de coda una de las diluciones del homogeneizado, vaciando cada alicuota sobre la superficie de cada pleca por separado, y se esparce cada porcién con un esparcidor de vidrio estéril, hasta que la superficie del medio se vea seca, teniendo cuidado de emplear un esparcidor diferente po~ ra cada placa. 5.1.4.2 Se incuban las placas invertidas entre 35 y 37°C durante 30 a 48 h; después de 30 h de incubacién, se seleccionan las places que tengan de 20 a 200 colonias separades y, en cade placa,se cuentan y registran como colonias tipicas, todas las colonias que sean ne~ gras y brillantes, con bordes angostos de color blanco y rodeades por zonas transldcidas que se extiendeni en el medio opaco, pues hay una alta probabilidad de que dichas colonias sean Staphylococcus aureus. 5.1.4.3 Se marca la posicién de las colonios seleccionadas como tipices y se continéa la incubacién de las placas durante 18h adicionales; terminado el perfodo total de incubacién de 42h, se cventan y registran como colonies sospechosos las colonias que durante el peri- odo de incubacién adicional desarrollaron las caracteristicas descritas en el numeral 5.1.4.2 y, edicionalmente,las colonias negras y brillantes con o sin bordes angostos de color blanco y sin zenas translicidas. Nota. Con algunas preparaciones, debido a la naturaleza de la yeme de huevo empleada, pueden desarrollorse colonias de unas pocas cepas de Staphylococcus aureus que se presen tan rodeadas de una zona opaca después de 30 h de incubacién; sin embargo, un gran nime~ +o de cepas muestra esta apariencia después de las 48 h de incubacién. 5.1.4.4 Prueba de la cougulasa. a) Se prueban todes las colonias sospechosos de ser Staphylococcus aureus, registradas en el numeral 5.1.4.3 6, si el néinero es muy alfo, se selecciona un nimero significativo, pero no menos de 5 colonias, y se siembran por seporada en los tubos que contienen caldo de infusién de cerebro y corazén; se incuban los tubos asf inoculados entre 35 y 37°C durante 20 a 24h. ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 hS TAT b) Se transfiere 0,1 cm3‘de los cultivos resultantes a los tubos que contienen plasma bacto~ coagulasa con EDTA (véase:e! numeral 5.1.1.5) y se incukan entre 35 y 37°C; se sxaminan los tubos después de 4h de incubacién para ver si hay coagulacién. Si‘los resultados son ne- gativos, se ineuban los tubos a temperatura ambiente y se vuelven a examinar después de 24h. ¢) En la figura 1 se muestran los distintos grados de coagulacién con sus respectivas designa— ciones: = Grados de coagulacién Negativo ninguna evidencia de formacién de fibrina codgulos pequeros separados codgulo pequetio aglomerado codgule grande aglomerado todo el contenido de! tubo he coagulado y no se desplaza cuando se invierte el tubo Fig. 1 Grados de coagulacién y sus respectivas designaciones. d) Interpretacién de Ia prueba de la coagulasa. De acuerdo al grado de coagulacién obser- vado en los tubos de ensayo se interpretan los resultados en la forma siguiente: Los colonias con reaccién 1+ no se consideran Staphylococcus aureus. Todas las colonias con reaccién 4+ se registran como Staphylococcus aureus. Las colonias con reaccién 2+ y 3+ deben someterse a la prueba adicional indicada en el numeral 5.1.4.5 para ‘confirmar si correspondén a Staphylococcus aureus. 5.1.4.5 _Prueba de produccién de nucleasa termoestable- 2) Sobre la superficie de un némero apropiado de portacbjetos, se distribuyen alfcuotas de 3,0 em3 del agar de azul de toluidina - ADN; cuando el medio haya solidificado se cortan en cada porta objeto 10 & 12 porciones cilfndricas de agar, utilizando un tubo capilar estéril de 2 mm de diémetro y removiendo la porcién de agar por aspiracién, quedando asi formadas 10 & 12 cavidades. b) Con las pipetas Pasteur o tubos capilares, se transfieren a cada cavidad aproximadamente 10 jal de los cultivos usados para la prueba de la coagulasa (véase el numeral 5.1.1.4(a)) y que se designaron como 2+ pésitivo y 3+ positivo; dichos ctltives deben ser previemente co- Jentedos en el baiio de agua hirviende durante 15 min, antes de ser transferidos. ContingaCOGUANOR NGO 35 015 5 8/17 ¢). Se colocan los portaobjetos en una cémara himeda entre 35 y 37°C durante 4 hy la reac - cién se considera positiva si se observa un halo de color rosado brillante que se extiende co- ¢ mo minimo 1 mm mas alld de la periferia de lo cavidad. d) Al ndmero de colonias positivas de Staphylococcus aureus encontrado en esta prueba se a~ di¢iona el némero de colonias positives de la prueba de la coagulosa (véase el numeral 5.1.1 -A(d)); esta suma se registra como "np" 5.1.4.6 _Clculo del némero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 & 200 colonias. Para calcular el ndmero de Staphylococcus aureus, se aplica Ia siguiente férmula: N Nr + (Ns x 22) Nimero de Staphylococcus aureus para cada place seleccionada con 20 & 200 co~ lonias. Némero registrado como colonias tipicas; véase el numeral 5.1.4.2 mero registrade de colonias sospechosas; véase el numeral 5.1:4.3 Nimero de colonias sospechosas de Staphylococcus aureus que se someten a con firmacién; véase el numeral Se Fe Nimero de colonias positivas de Staphylococcus aureus; encentradas en las n co- lonias ensayadas, véase el numeral 5.1.4.5 (d). 5.2 Método de siembra directa en agar TPEY . 5.2.1 Reactivos o materiales. Se utilizan los reactivo: ficados en el numeral 5.1.1 excepto los medios de Tos tumerales 5.1.1.3 y 5.1.1.4, que son reemplazadds por el siguien- te medio. 5.2.1.1 Agar telurito-polimixina - yema de huevo (agar TPEY). 2) Medio basal (ingredientes). Triptona Extracto de levadura D = manitol Cloruro de sodio Cloruro de litio Agar Agua destilada 900 cm b) Prepardeién del medio completo. Se agregan los ingredientes sélidos del medio basal al oque destilada, se hierve con agitacién hasta disolucién completa, se enfria entre 50 y 55°C y se ajusta el pH a 7,2-7,3; se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min y se enfriaen— tre 50 y 55°C. Luego se agregan asépticamente al medio basal los siguientes ingredientes: ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5__ GAT Emulsién al 30% (v/v) de yema de huevo (véase nota) 100 cm3 Solucién acuosa al 1% de polimixina B, esterilizada por filtracién 0,4 emd Solucién acuesa ol 1% de telurito de po tasio, esterilizada por filtracién 10 em? Se mezcla bien y se distribuye en porciones de 15 a 20 cm en cajas de Petri; las placas se secon como se indica en el numeral 5.1.1.3-2(a),(b),(c) 0 (d) ” Nota. La emulsién de yema de huevo se prepara como se indica en el numeral 5.1.1.3.4 ‘excepto que en la etapa (c) de dicho numeral se deben emplear 30 partes en volumen de yema de huevo por cada 70 partes envolumen de la solucién acuosa al 0,85% de cloruro Aparatos. Se utilizan los aparatos indicados en el numeral 5.1.2 Preparacién de la muestra. Se prepara la muestra como se indica en.el numeral Procedimiento. 5.2.4.1 En duplicado se transfieren alfcuotas de 0,1 em3 del homegeneizado, y de cada una de las diluciones del homogeneizado, vaciando cada alcuota sobre la superficie de co= da placa por separado, y se esparce cada porcién con un esparcidor de vidrio estéril, hosta que la superficie del medio se vea seca, teniendo cuidado de emplear un esparcidor diferente pora cada placa. 5.2.4.2 Se incuban las placas invertidas entre 35 y 37°C durante 24h, y luego se exami: nan; las colonias de Staphylococcus aureus tienen aproximadamente 1,0 @ 1,5 mm de diame= tro de color oscuro o negro azabache y muestran una de las siguientes reacciones de la yema de huevo. Una zona bien definida de yema de huevo precipitada alrededor y por debajo de le colonia. Una zona translécida o halo, pero con precipitacién visible por debajo de la co- lonia. 5.2.4.3 Se vuelven a incubar les placas durante un perfodo adicional de 24h (48 h en to- tal), y se examinan nuevamente; las reacciones de yema de huevo son generalmente mas per~ ceptibles después de 48 h de incubacii 5.2.4.4 _ Se seleccionan las placas que tengan 20 & 200 colonias y se eventan y registran to- des las colonias negro azabache que dieron reaccién tipica de precipitacién de yema de hue~ vo. 5.2.4.5 Luego se hace la prueba de !a coagulasa a todes las colenias 0, si el nmero es muy alto se selecciona un niémero significative, pero no menos de 5 colonias; para tal fin se siembran las colonias por separado en los tubos que contienen caldo de infusién de cerebro y corazén, se incuban entre 35 y 37°C durante 20 a 24h y se continda como se indica en el numeral’5.1.4.4 desde (b) en adelante, incluyendo la prueba de produccién de nuclease termoestable que aparece en el numeral 5.1.4.5. Continéa: COGUANOR NGO 35 015 h5 1/17, 5.2.4.6 _Célculo del némero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 @ 200 colonias. Para calcular ei niimere de Staphylococcus aureus, se apiica la formula nD N= Ns xt N = Némero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 a 200 colonias. Némero registrado de colonias sospechosas; véase el numeral 5.2.4.4 n Némero de colonias sospechosas de Staphylococcus aureus que se someten ala prusba de la coagulasas vase. el nimeral BAB np = Nimero de colonias positivas de Staphylococcus aureus encontradas en las n co- onias ensayadas. 5.3 Método de siembra directa en agar KRANEP, 5.3.1 Reactivos o materiales. Se utilizen los reactivos indicados en el numeral 5.1.1 excepto los medios de los numerales 5.1.1.3 y.5.1.1.4, que son reemplezados por el siguien- te medio 5.3.1.1 Agar KRANEP c) Medio basal (ingredientes). Extracto de corne 59 Peptona Wg Cloruro de sodio 39 Fosfato monodcido de sodio «2g. Agar 59 D-manitol 5,19 Piruvato de sodio 8,29 Cloruro de litio 5,1g Tiocianato de potasio 25,59 Aqua destiloda 880 cmd b) Preparacién del medio completo. Se agregan los cinco primeros ingredientes de! medio ba - sal al agua destilada y se calienta con ai in hasta objener disolucién completa, se enfria entre 50 y 60°C y se ajusta el pH o 6,8 ~ 7,0; se agregan los 4 ingredientes sélidos remanen- tes, se disvelven con agitacién, se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min y,después de Ilevado a una temperatura de 45 a 50°C se le adicionan asépticamente los siguientes ingre- dientes: Solucién acvosa al 0,5% de azida de sodio, esterilizada por filtracién 10 em3 Solucién acuosa al 0,41% de cicloheximida, esterilizada por filtracién 10 cm3 Emulsién de yema de huevo (véase nota) 100 m3 ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 - Wt: Se mezcla bien y se transfiere inmediatamente, en porciones de 15 cm3, a cajas de Pe! Placas se secan como se indica en el numeral 5.1.1.3.2 (a), (b), (c) 6 (d). Nota. La emulsién de yema de huevo se prepara como se indica en el numeral 5.1.1.3.4 5.3.2 Aparatos. Se utilizan los aparates indicados en el numeral 5.1.2 Preparacién de la muestra. Se prepara la muestra como se indica en el numeral Procedimiento. 5.3.4.1 En duplicado se transfieren alfcvotas de 0,1 em3 del homogeneizado, y de cada una de las diluciones del homogeneizado, vaciando cada alfcuota sobre la superficie de cada placa por separado, y se esparce cada porcién con un esparcidor de vidrio estéril, hasta que la superficie del medio se vea seca, teniendo cuidado de emplear un esparcidor diferente pa— ra cada placa. 5.3.4.2 _ Se incuban las placas invertidas entre 35 y 37°C durante 30h,se examinan y se seleccionan las placas que tengan 20 a 200 colonias, se cuentan y registran todas las colonias que estén rodeadas por una zona de.precipitacién o una zona translicida « menudo junto con una zona de yema de huevo precipitada por debajo de la colonia. Se marca la posicién de diches colonics y se incuban nuevamente las placas por un perfodo nal de 18h. 5.3.4.3 Se cventan las colonias tipicas desarrollades durante el perfodo adicional de iney - bacién y se adicionan al obtenido después de 30h de incubacién, registrando la suma total. 5.3.4.4 — Luego se hace la prueba de coagulasa a todas las colonias o,si el niimero es muy alto se selecciona un némero significative, pero no menor de 5 colonias; para tal fin se siem= bran las colonias por separado en los tubos que contienen caldo de infusién de cerebro y co- raz6n, se incuban entre 35 y 37°C durante 20 & 24h y se continda como se indica en el. nume~ ral 5.1.4.4 desde (b) en adelante, incluyende la prueba de produccién de nucleasa termoes- table que aparece en el numeral 5.1.4.5 5.3.4.5 Cleulo del niimero de Staphylococcus aureus pora cada placa seleccionada con 20 4 200 colonias. Para calcular el numero de Staphylococcus aureus se aplica la siguiente férmuli N= Ns xR Némero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 & 200 colonias. Némero registrado de colonias sospechosas, véase el numeral 5.3.4.3 Némero de colonias sospechosas de Staphylococcus aureus que se someten a la prueba de coagulasa, véase ol numeral Sched Nimero de colonias positivas de Staphylococcus aureus encontradas en lasn colo~ nios ensayadas. Método de siembra directa en agar PPAI ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 12/17 5.4.1 Reactivos o materiales. Se utilizan los reactivos indicados en el numeral 5.1.1 excepto los medios de los numerale: 5.1.1.3 y 5.1.1.4, que son reempiazados por el siguien- te medio. 5.4.1.1 Agar fenolftalefna difosfato con polimixina (agar PPAP). a) Medio basal (ingredientes). Extracto de carne 9 Peptona 10g Cloruro de sodio 59 Agar 15g Agua destilada 1000 cm b) Preparacién del medio completo. Se disvelven los ingredientes sélidos en el agua destila~ da y se gjusta el pH a 7,4; se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min y se enfria en tre 50 y 55°C. Luego se le adicionan asépticamente los siguientes ingredientes previomente esterilizades por filtracién bacteriolégica. Solucién acuosa al 1% de fenolf= taleina difosfato pentasddico 10 cm3 Solucién acuosa de sulfato de poli mixina B 125000UI en 10 m3 10 em3 Se mezcla bien y se distribuye en porciones de 15 6 20 cm en cajas de Petri; las placas se secan como se indica en el numeral 5.1.1.3.2 (a),(b}, (c) 6 (d) Solucién al 5% de hidréxido de amonio. Aparatos. Se utilizan los aparates indicados en el numeral 5.1.2. Preparacién de la muestra. Se prepara la muestra como se indica en el numeral Procedimiento. 5.4.4.1 En duplicado se transfieren alfcuotas de 0,1 cm3 del homogeneizado, y de cada una de les diluctones del homogeneizado, veciando cada alicuota sobre la superficie de coda placa por separado, y se esparce cada poreidn con un esparcidor de vidrio estéril hasta quela superficie del medio se vea seca, teniendo cuidado de emplear un esparcidor diferente para cada placa. 5.4.4.2. Se incuban las placas invertidas entre 35 y 37°C durante 30 h, se seleccionan las placas que contengan 20 & 200 colonias separadas y se las coloca invertidas durante pocos se - gundos en una bandeja que contenga solucién al 5% de hidréxido de amonio. 5.4.4.3 Se cuentan y registran todas las colonias que tomen color rosado brillante’ (eolo= nias fosfatasa positivas) « 5.4.4.4 Luego se hace le prueba de la coagulasa a todas las colonias 0, si el ndmero es muy alto, se seleceiona un niimero significative, pero no menor de 5 colonias; para tal fin se siembran las colonias por separado en los tubos que contienen caldo de infusién de cerebro y corazén, se incuban entre 35 y 37°C durante 20 a 24h y se continda como se indica en el nu~ meral 5.1.4.4 desde (b) en adelante incluyendo la prueba de produccién de nuclease termo- estable que aparece.en el numeral 5.1.4.5. ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 138/17 5.4.4.5. Célculo del nimero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 a 200 colonias. Para calculor el nimero de Staphylococcus aureus ‘se aplica la sigeiente férmula: N= Ns x 2 Nimero de Staphylococcus aureus para cada placa seleccionada con 20 @ 200 co- lonias. . Nimero registrado de colonias sospechosas, véase en el numeral 5.4.4.3 Namero de colonies sospechosas de Staphylococcus aureus que se someten a la prueba de la coagulasa, véase el numeral 5.4.4.4 Nimero de colonias positivas de Staphylococcus aureus encontradas en las n co lonias ensayadas. 6 METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Segin se indicé en el numeral 2.1.2, este método puede oplicarse simulténeamente con cual- quiera de los métodos de siembra directo en placa. é Reactivos o materiales. Los componentes de los medios de cultivo 0 los medios de cultivo completos deshidratados, deben ser de calidad reconocida para uso microbiolégico; el agua debe ser destilada o de pureza equivalente. Se debe verificar cada partida del me= dio sembrando en esirias una cepa conocida de Staphylococeus aureus para determinar los cri- terios de diagnéstico apropiodos, tales como, tamafo, apariencia y pigmentacién de las colo- nias. Nota. Los medios completos deshidratados se deben preparar de acuerdo a las indicaciones del fabricante. 6.161 Se usan los reactivos indicados en el numeral 5.1.1, excepto los nimerales 5.1.. 1.3 y 5.1.1.4, y ademas los siguientes: 6.1.2 Caldo telurito-manitol-glicina. ) Medio basal (ingredientes). Triptena Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de litio Manitol Cloruro de sodio Glicina Piruvato de sodio Agua destilada ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 MAT b) Preparacién del medio completo. Se disuelven los ingredientes sélidos del medio basal en el agua destilada y se ajus- ta el pH 6,9; se distribuye el medio en tubos de ensayo de 20 mm x 200 mm, en porciones de 19 em3 y se esteriliza en un autoclave a 115°C durante 20 min. El medio basal puede ser almacenado a 4°C durante 10 4 12 dias. Antes de usar el medio se le debe extraer el aire mediante calentamiento a 100°C en un baito de agua durante 20 min, se enfria y se le agrega a cada tubo 0,1 cm3 de una solucién acuo~ sa al 1% (m/v) de telurito de potasio esterilizado por filtracién bacteriolégica. 6.1.3 Solucién de agar: Se disuelven 20 g de agar en 1000 cm3 de agua destilada, se hierve hasta disolucion completa, se distribuye en frascos de capacidad apropiada y se este iza en un autoclave a 121°C durante 20 min. 6.164 Agar leche ~ sal 2) Medic basal (ingredientes). Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio Agor 59 Agua destilada 1.000 cm3 b) Preparacién del medio completo. Se suspenden los ingredientes sSlidos del medio basal en el agua destilada, semez— cla y se hierve con agitacién frecuente hasta completa disolucién; se enfria entre 50 y 60°C, se gjusta la solucién de manera que después de la esterilizacién el pH sea 7,44 0,1, se dis~ tribuye en frascos en porciones de 100 cm3 y se esteriliza en un autoclave a 121°C durante 15 min. Por aparte, se esterilizan en un autoclave aproximadamente 120 cm3 de leche des= cremada, @ 110°C durante 15 min, se transfieren 10 em3 a cada 100 m3 de medio basal Ne~ vado previamente a una temperatura de 50°C, se mezcla bien y se vierte en cajas de Petri; jas placas pueden ser almacenadas entre 5 y 8°C durante 2 & 3 dias, si fuera necesario. 6.2 Aparatos. Se utilizan los aparatos indicados en el numeral 5.1.2 6.3 Preparacién de la muestra. Se prepara la muestra como se indica en el numeral 3.1.3 6.4 Procedimiento. 6.401 Con una pipeta se transfieren en triplicado, porciones de 1 cm3 de las tres prime~ ras diluciones decimales (10-1, 10-2 y 10-3), a tubos de ensayo que contienen caldo teluri — to-manitol-glicina; cuidadosamente se coloca sobre la superficie del caldo una capa de la so= lucién de ager fundida, de 2 & 3 cm de espesor, para excluir el aire. 6.4.2 Se incuban los tubos entre 35 y 37°C durante 24 & 48 h; las colonias de Staphylo~ coccus aureus formarén un precipitado negro o ennegrecerén el medio. 6.4.3 __Utilizando pipetas Pasteur estériles, se remueven del fondo de cada tubo algunas getas del cultivo y se las distribuye sobre las superficies de placas separadas de agar leche~ sal. ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 b5 Nota. Alternativamente se pueden utilizar placas que contengan cualquiera de los medios selectivos indicados para la siembra directa en placa; véase los numerales 5.1, 5.2, 5.3 y 5.4 64.4 Se incuban las placas entre 35 y 37°C durante 24h; en el agar leche~sal los colo- nias de Staphylococcus aureus_que tienen reaccién positiva a la coagulasa se desarrollan co- mo colonias planas, redondas y con margenes intactos los cuales pueden o no estar rodeados ya sea por una zona opaca o bien por una zona transideida. 6.4.5. De'cada una de las placas en triplicado correspondientes a cada una de las tres dilu~ ciones (véase el numeral 6.4.1), se ensayan con la prueba de la coagulasa todes las colonias 0, si el némero es muy alto se selecciona un ndmero significative, pero no menos de 5 colenias; para tal fin se siembran las-colonias por separado en los tubos que contienen caldo de infusién de cerebro y corazén, se incuban enire 35 y 37°C durante 20 a 24h y se continda como se indi~ ca en el numeral 5.1.4.4 desde (b) en adelante, incluyendo la prueba de produccién de nuclee: sa termoesiable que aparece en el numeral 5.1.4.5. * 6.4.6 Interpretacién de los resultados. En base a los colonias ensayadas que tuvieron reaccién positiva con la prueba de la coagulasa y la prueba de la rucleasa termoestable , se establece qué ntimero de los 3 tubos para cada dilucién son positives, procediéndose en orden descendente de dilucién, es decir, de 10-1 a 10-3, 7 EXPRESION DE LOS RESULTADOS 71 Recuento por medio de la siembra directa en placa. El recuento total se expresa como némero de Staphylococcus aureus por gramo de muestra y se calcula en le forma siguien - te: 7.1.1 Si se selecciona una sola placa (véase los numerales 5.1.4.2, 5.2.4.4, 5.3.4.2 6 5.4.4.2), se multiplica el némero calculado de Staphylococcus aureus para la placa (véase los numerales 5.1.4.6, 5.2.4.6, 5.3.4.5 6 5.4.4.5), por el valor reciproco de la dilucién usoda. . 7.1.2 Sise seleccionan placas en duplicado, se multiplica el valor promedio de los nd= meros calculados de Staphylococcus aureus por el valor reciproco de la dilucién usada. Si se selecciona una placa de cada una de 2 diluciones decimales consecutivas, se ica el ndmero calculado de Stophylococcus aureus , de cada placa, por ol valor reci= proco de su correspondiente dilucién y finalmente se promedian ambos resultados. Nota. Si el recuento total més alto es mayor de dos veces el recuento total més bajo obteni~ do en placas de dos diluciones decimales consecutivas, se debe descartar ‘el més alto, consi~ derandose solamente el recuento total mas bajo. 7.1.4 Sise seleccionan places en duplicado pora cada una de dos diluciones consecuti- vas, se obtiene primero el némero caleulado promedio de Staphylococcus aureus para cada dilucién, luego se multiplica cada promedio por el valor reciproco de su correspondiente di lucién y, finalmente, se promedian ambos resultados; también aqui debe tomarse en conside= racién fa nota al numeral 7.1.3. 7.1.5 Si enlas places de todas las diluciones se producen menos de 20 colonias, se con - sidera solo el nimero de colonias de a menor dilucién usada y se multiplica por el valor re~ elproco de esta dilucién. ContindaCOGUANOR NGO 35 015.45 16/17 7.2 Recuento por medio del_ndmero més probable. El recuento total se expresa como nimero mas probable de Staphylococcus aureus por gramo de muestra, y se calcula a partir del niimero de tubos positives de cada dilucién en triplicedo, considerando 3 diluciones su cesivas (véase el numeral 6.4:6), y empleando el cuadro | siguiente: Cuadro 1. Nimero mas probable de Staphylococcus aureus por_grame (NMP); 3 tubos por cada dilucién Combinacién Combinceié Combinacién de tubos NMP | de tubos NMP | de tubos NMP positives por gramo | positivos por gramo | positivos per gramo 107! 10-2 10-3 |. tor! 1072 19°3 10-1 10-2 19-3 0 in 2 15 19 i 15 20 24 16 20 24 2 9 4 20 26 15 20 27 34 2 28 A wWaNvawonwe BERSBBRVBBS 4444-0 coco cp CCC CCC C000 HOWN=0 ON HOWN-OUN=OON— 12 8 3 16 19 4 7 u 15 7 © OWO WOW WW WWW WWWENNNNNN @OWO NNN N= COOOWOWON Nota. Algunas veces ed necesario calcular el NMP para diluciones sucesivas diferentes a las indicadas en el cuadrol ; en estos casos, se debe calcular el NMP aplicando la siguien- te formula. wpe NMELx En la que: 100 NMP_ = Nimero més probable calevladg, para diluciones sucesivas diferentes de las dilu. nes sucesivas 10°', 107 y 10 NMP}= —Ndémero més probable lefdo en el cuadro | para la combinacién especifica de tubos positives Valor reciproco de la concentracién intermedia de la serie cuyo NMP se desea calcular. Ejegplo:_$i al anglizar una muestra se emplearon las diluciones sucesivas correspondientes @ 10°, 107° y 10°", y la combinacién de tubos positives correspondié a la combinacién 3 21 se calcula el NMP, en Ia forma siguiente: ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h5 WAZ Se busca en el evadro | el NMP} para Ia combinacién 321 de tubos positives, el cual corresponde al valor 150; ) Se obtiene el valor reciproce de la concentracién intermedia de las diluciones sucesivas anclizades y que corresponde a 1000, ya que la concentracién intermedia de nestro o- jemplo es 103; Se aplica la formula: 150 x 1000 _ 100 INFORME DEL ENSAYO O ANALISIS NMP, 1500 En el informe del andlisis debe indicorse lo siguiente: | nimero de tubos empleados para cada dilucién y el resultado 8.2 Cualquier condicién no especificada en la norma, o seftalada como opcional, asi como cualquier circunstancia que pueda haber influido en el resultado. 8.3 Todos los detalles que permitan la completa identificacién de la muestra. %. CORRESPONDENCIA Pora la redaccién de la presente norma se tomaron en cuenta: a) “Microorganisms in Foods 1. Their significance and methods of enumeration, Second Edition, a pul ion of the International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF) of the International Association of Microbiological Societies, Univer- sity of Toronto Press", 1978; y b) Literature técnica = ULTIMA LINEA