CDU 639+281,2:576.85 NORMA GUATEMALTECA OBLIGATORIA COGUANOR NGO 35 015 h3 PESCADO Y PRODUCTOS PESQUFROS robiolégico. Deteccién de Salmonella 1 OBJETO La presente norma tiene por objeto esteblecer el método para Ia deteccién de Salmonella en pescades, crustéceos (tales como camarones, cangtejos, langostines y langostu, y 6110s prom ductos pesqueros. 2, NORMAS COGUANOR A CONSULTAR COGUANOR NGO 4010 Sistema Internacional de Unidades (5!) Ja. Revisidn 3. REACTIVOS O MATERIALES Los medios, tanto de cultivo como pare las pruebas bioqumicas,se encuenttan en el comercio ye listo: para usar o bien, en fora deshidratada; es importante que se sigan todas los instruccio~ nes dadas por el fabricante para el uso adecuado de los medios. 3.1 Caldo Lectosado Extrocto de carne 3g Peptona 59 Lectosa 5g Agua destilada 1.000 em Contingo publicada en el Diario Oficial el dia 2 de Junio de 1983.COGUANOR NGO 35 015 h3 p. 2 ‘o disuelven los ingredientes en el agua mediante calentamiento a 65°C, se dishibuye en por- Clones de 225 cm? en frascos de 500 em? de capacidad, y se esterilizan en autoclave @ 121°C durante 15 min. EI pH final debe ser oproximadamente 6,9 £0,2. 3,2___ Calldo Selenito-Cistina_ Triptone o polipeptona 59 t Lactose 4g | Selenito dcido de sodio (NagHSeQ3) 49 | Fosfato dis6dico (NagHPO ,) 10g L =Cistina 0,019 | Aguo destilada 1.000 em3 | Se calienta todo hasta ebullicién y se ajusta el pH final a 7,0 40,2. Se distribuye en tubos de ensayo estériles de 16 mm x 150 mm en porciones de 10 cm y se calienta en corriente de vapor autoclave. El medio no es estéril por lo que se debe ~ durante 10 min; no se debe esterilizor .—' usar el mismo dia que se prepara. 3.3 Caldo Tetrationato eee ae 3.3.1 Caldo Tetrationato bose Polipeptona 59 Sales biliares Vg Carbonato de calcio (CaCO) 109 | Tiosulfato de sodio (Na9503-5H,0) 30g : Agua destilada estéril 1000 cm? Se mezcla el medio completamente y se calienta hasta ebullicién; se enfrfa a 45°C y se alma~ pT cena. a 5-8 °C, 3.3.2 Solucién de lodo~lodure de_poto: ’ loduro de potasio 59 lode resublimado ba Agua destilada, ésteri! 20 em? Se disuelven en 5 em? de agua gstéril los 5 g de ioduro de potasio, se agregan los 6g de resublimado y se diluye a 20 cm’ con el agua destilada estéril. f |COGUANOR NGO 35 015 h3 p.3 3.3.3. Solucién de Verde Brillante Colorante verde brillante 0,19 Agua destilada, estéril 100 em? Se disuelve el colorante en agua y se diluye a 100 cm3, 3.3.4 Preporacién del medio, Se prepara el dia que va a ser usado, agregando 20 cm? de la solucién de I-KTy 10 em® de ta solucién de verde brillonte a 1 litro de caldo base. Se vuel ve @ suspender el precipitado mediante agitacién suave y asépticamente se distribuye en tubos. de ensayo esterilizados (de 20 mm x 150 mm 6 de 16 mmx 150 mm), colocondo 10 em’ en cada tubo. No se debe calentar e! medio después de agregar las soluciones de lodo-loduro y de ver- de brilfente. Nota., El medic base puede ser preparado con o sin verde brillante, distribuido en porciones de TO'cm3, esterilizado en autoclave a 121°C y almacenado hasta que se va a usor; en el momento de usar el medio se le agrega [a solucién de I~KI en cantided apropiada, y también la soluctén de verde brillante si ésta no hubiese sido agregada en el momento de la preparacién. 3.4 Agor Sulfito de Bismuto (Wilson & Bloir) Polipeptona (o peptona) 10g Extracto de carne 59 Glucosa (dextrosa) 59 Fosfato disodico 4g Sulfato ferroso 0,39 Sulfito de bismuto (indicador) 89 Verde brillante 0,025g Agar 20g ~ Agus destilada 1000 em? Se mezclan completamente todos los ingredientes, se calienta con agitactén y se hierve duran— te 1 min para obtener una suspensién uniforme; el precipitado resultante no se disuelve. Se en- firfa a 45-50°C, se suspende el precipitedo mediante agitacién suave y se vierten porciones de 20 em? en placas de petri de 15mmx 100 mm;se dejan secar las placas durante 2h con las tapo: parcialmente removidas y Ivego se cierran. El pH final debe ser 7,6 40,2. No se debe esteri~ lizor; se prepara un dfa antes de user y se guardo en la oscuridad. 3.5____Agar Xilosa-Lisina -Desexicolato (XLD) Extracto de levadura 3,00 g Lelisina 5,009. Xilose 3,759 lactose 7,509 ContingeCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.4 Sacarosa 7,509 Desoxicolato de sodio, 2,50 9 Citrato férrico amoniacal 0,80g Tiosulfato de sodio 6,809 Cloruro de sodio. 5,00 9 Agor 15,00 g Rojo de fenol 0,08 g Agua destilada 1.000,00 em3 Se hierve el medio pora disolver todos los ingredientes completamente; no se debe sobrecalentar, Se enfifa el medio a 50°C y se vierte en placas tan répidamente como sea posible. ET prt fina! debe ser 7,4 20,2. El sotrecalentamiento del medio puede causer precipitacién fo cual no impide que les jones sean satisfactorias aunque las colenias pueden ser ligeramente mas pequeres. 3.6 jar Entérico Hektoen (HE) Peptona 12,09 Extracto de levedura 3,09 Soles bitiores 9,09 Lactose 12,09 Secarosa 12,0 Salicina 2,09 Clorure de sodio 5,09 Tiosulfato de sodio 5,09 Citrato fertico emoniacal 1,59 Azul de bromatimol 0,064 g Acido fucstnico 0,19 Agor 13,59 Agua destilada 1000 em Se suspenden los ingredientes en el agua destilada y se mezcla completamente; se caliente bas~ ta ebullicién con agitacién freesente y se hierve durante no mas de 1 min; no se debe sobre ~ calentar, Se enfria a 50-55°C y se vierten porciones de 20 em’ en placas de petri de 15 mm x TOO min; se dejan secar fas plocas durante aproximadamente 2h con les tapas parcialmente remo las y luego se cierran. EI pH final debe ser 7,6 70,2. No se debe esterilizar. 7 Noto. Las places se pueden preporor un dio antes 0 ¢l mismo dio que se vane usar. ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.5 3.7___Agor triple azicar hierro (agar TS!) Polipeptona 20,00 g Cloruro de sodio 5,00 9 Loctosa . 10,00 g Sacorosa 10,00 g Glucosa 1,009 Sulfato férrico amoniace! Fe(NH4)9(SO 4)9.6H,0 0,209 Tiosulfato de sodie (NazS2O3) 0,20 Rojo de fenol 0,025 g Agar 13,00 g Agua destilada 1.000 ,00 cm3 Se suspenden los ingredientes en 1000 cm? de agua destilada, se mezcla completamente, se calienta con agitacién ocasional y se hierve aproximadamente 1 min hasta que los Ingredientes se disueivan. Se Ilenan tubos de 16 mm x 150 rm hasta un tercio de su capacidad y se tapan en forme tal que se mantengan las condiciones aerébicas durante su uso, Se esterilize el me- dio en autoclave ¢ una femperatura no mayor de 118°C durante 15 ming antes que se solidifique ef medio, se colocan los tubos en una posiciSn inclinada de manera que se formen fondos de 2a 3m y planos inclinados de 4a 5 cm. El pH final debe ser 7,3 20,2. 3.8 ___Agar Lisine: Hierro (agar LIA) (Edwards & Fife) Gelisato 0 peptona 5g Extracto de levadura 3g Glucosa Vg L-lisina 10g Citrato féirico amoniacal 0,59 Tiosulfato de sodio anhidro (Ne S705) 0,04 g Purpura de bromocresol 0,02 g Agar 15¢ Agua destilada 1 000 em? Se calienta el medio hasta que se disuelvan los ingredientes, se distribuye en porciones de 4en? len tubos de ensayo de 13 mmx 100 mm, se tapan los tubos de manera que se mantengan las con diciones aerébicas durante su uso y se esterilizan en autoclave a 121°C durante 12 min. Antes que se solidifique el medio, se colocan los tubos en una posicién inclinada de manera que se formen fondos de 4,0 cm y planos inclinados de 2,5 cm. El pH final debe ser 6,7 0,2. 3.9 Agar MacConkey Protecse peptona o palipeptona 36 Peptona 0 gelisato 7g ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.6 Lactosa 10g Mezclo de sales biliares 1,59 Cloruro de sodio 59 Rojo neutro 0,03 9 Cristal violeta 0,001 g Agar 13,5 Agua destilada 1000 enn Se ponen en suspensién los ingredientes del medio y se mezcla hasta que esté homogeneizado, * se calienta con agitacién ocesional y se hierve durante 1 2 min hasta que los ingredientes se an. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min,seenfrfa a 45-50°C y se vierten porciones de 20 cm’ a placas de Petri de 15 mm x 100 mm; se dejan enfriar las places tepedos durante no menos de 2h. No se deben usar placas hdmedas. El pH final debe ser 7,1 0,2. 3.10 Caldo de urea Urea 209 Extracto de levadura O1g Fosfato de potasio (KH,PO 4) 919 Fosfato disédico (NaHPO ,) 9,59 Rojo de fenol 0,019 Agua destilada 1000 em Se disvelven los ingredientes en el agua destilada, pero sin calentar. Se esteriliza mediante fil tracién a través de up filtro retenedor de bacterias y luego se distribuye asepticamente en porcio nes de 1,5.a 3,0 cm? en tubos de ensayo estériles de 13 mm x 100 mm, El pH final debe ser 6,5 i 40,2. Urea 209 Extracto de levadura O19 Fosfato monopotésico (KHyPO 4) 0,091 g Fosfato disédico (NagHPO 4) 0,095 g Rojo de fenol 0,01g Agua destilada 1.000 cm? Se disvelven los ingredientes en el agua destilada, pero sin calentar. Se esteriliza mediante fil tracién @ través de un filtro retenedor de bacterias y Ivego se distribuye asépticamente en por= ciones de 1,5 0 3,0 cm? en tubos de ensayo esterilizados de 13 mm x 100 mm. El pH final debe ser 6,8 70/1. ContingaCOGUANOR NGO 35 015 hi p.7 Caldo de Infusién Cerebro-Corazén (BHI) Infusién de cerebro de ternero 200g Infusién de corazén de res 2509 Proteosa peptona o gelisato 10g Cloruro de sedio 5g Fosfato disédico (NajHPO, W2HP) 2,59 Dextrosa 29 Agua destilada 1.000 em Se disvelven los ingredientes en el agua destileda, calentando suavemente st fuera necesario. Se distribuye el caldo en frascos 0 botellas para almacenar y se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min. El pH final debe ser 7,4 £0,2. 3.13 __Caldo Tripticaso Soya~Triptosa. Se puede usar indistintamente una de las 3 formulas 3.13.1 Férmule a poriir de ingredientes deshidratados Caldo Tripticasa Soya (producto comercial deshidratado) ‘15 g Caldo Triptosa (producto comercial deshidratodo) 13,59 Extracto de levadure 3,09 Agua destilada 1000 em? 3.13.1. Se mezclan los ingredientes s6lidos, se disuelve todo en el egua destilade y se calien to sugvemente, si fuera necesario, hasta completa disolucién. Se distribuye en porciones de 5 cm® en tubos de 16 mm de didmetro y se esterilizo en autoclave a 121°C durante 15 min. El pH final debe ser 7,2 £0, 2. "8.13.2 Férmula pora Caldo Tripticasa Soya Tripticasa peptona 17,09 Fitone peptona 3,09 Cloture de sodio 5,09 Fosfoto écido dipotdsico 259 Dextrosa 259 Extracto de levadura 3,09 Agua destilada 1.000 em? Se prepara en igual forma como se indica en 3,13.1.1 ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.8 Férmula pore Caldo Triptosa Bacto-triptosa 20,09 Cloruro de sodio 5,09 Bacto dextrose 1,09 E 3,09 Agua destilada 1000 cm3 Se prepara en igual forma como se indica en 3.13.1.1 Nota. El analista tiene la opcién de usar cualquiere de lar férmulas 3.13.1, 3.13.26 3.13.3 ‘@ Bien, una combinacién de volémenes iguales de’ !as f6rmulas 3.13.2 y 3.13.3, ya que cual~ quiera de estos es satisfactoria pora el cultivo de Salmonella destinado a pruebas serolégicas de antigen flagelar. Sin embargo, alguna literafura técnica indica que es preferible usar la férmula 3.13.1 0 bien, la combinacién de las férmulas 3.13.2 y 3.13.3, 3.14 ___ Solucién Salina Fisiolégice Formalinizade Solucién al 36-38% de formaldehido 6 cmd Cloruro de sodio 8,59 Agua destilada 1.000 cm3 Se disuelven 8,5 g de NaClen el litro de agua destilada, se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min, se deja enfriar @ temperatura ambiente y luego se agregan los 6 cm? de la so= lucién al 36-38% de formaldehido. No se debe esterilizar después de agregar el formaldehido. 3.15 Antisuero Polivolente Flagelar (H) para Salmonella 3.16___Antisuero Flagelar (H) de Spicer ~ Edwards 3.17 ___Caldo Lisina Decarboxilasa (Falkow) Gelisato © peptona 5g Extracto de levedura 39 Glucose lg L+lisina 5g Porpura de Bromocresol 0,029 Agua destilada 1.000 em? Se calienta todo hasta que se disuelva, se distribuye en poreiones de 5 cm? en tubos de ensa= YO, con tapa atornillada, de 16mmx 125 mmy se esteriliza enautoclavea 121°C durante 15 min, con Ia tapa floja. Inmediatamente después de esterilizados se aptieta la tapa antes de guardar ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.9 los tubos; obviamente, después de la inoculacién se eprieto la tapa nuevamente. El pH debe ser 6,5 ~ 6,8, 3.18 ___ Solucién al 0, 2% de pOrpura de bromocresol. Usando agua destilada estéril se disvel ¥60,2¢ del colorante purpura de bromocresol y se diluye a 100 em3, ~ 3.19 Caldo Rojo Fenol Dutcitol Tripticasa 0 proteoss peptona No.3 10g Cloruro de sodio 5g Extracto de care (opcional) 1g Rojo fenol (6 7,2 em? de solucién al 0, 25% de rojo fenol) 0,018g Agua destilada 1.000 em? 3.19.1 Se disvelven 5g de dulcitol en este caldo base, se distribuye en porciones de 2, Sen? en tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm que contienen tubos de fermentacién invertidos de 6 mm x 50 mm. Se esterilizan en autoclave @ 118°C durante 10 min. El pH final debe ser 7,370, 2. Nota. Alternativamente, se pueden disolver los ingredientes del ealdo bose, omitiendo el car ohidrato, en 800 em$ de agua con calentamiento y agitacién ocasional; luego se distribuye en porciones de 2,0 om’ en tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm que contienen tubos de fermenta~ cién invertidos. Se esterilizan en auteclave @ 118°C durante 15 min y se dejan enfrior. Por aparte, se disuelve el carbohidrato en 200 cm3 de agua y se esteriliza por filtracién a través de un filtro retenedor de bacterias, y asépticamente, se agrega a cada tubs de caldo esterili= zado, previamente enfriado a una temperatura menor de 45°C, 0,5 cm3 de la solucién estérit de carbohidrato y se mezcle cuidadosamente. El pH final debe ser 7,4 0,2. 3.20 __ Caldo Base Pérpura con 0, 5% de Duleital Proteosa peptona No.3 109 Extracto de carne lg Clorure de sodio 5g Porpura de bromocresol 0,015 6 0,010 g ‘Agua destilada 1000 cm3 Se prepara en la misma forma indicada en 3.19.1 con la excepcién que el pH final debe ser 6,8 0,2. 3.21 Caldo Triptofano. repara disolviendo 10 g de triptofano en 1000 cm? de agua destilada, se distribuye en porciones de 5 cm? en tubos de ensayo y se esteriliza en autoclave @ 121°C durante 15 min. El pH final debe ser 6,9 + 0,2. Contin6éaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.10 7 januro de Potasio (calde KC Proteosa peptona No. 3.0 polipeptona 3g Cloruro de socio 59 Fosfato monopotésico (KH,PO 4) 0,225 g Fosfato disédico (NagHPO 4) 5,649 Agua destilada 1.000 em? Se disuelven los ingredientes y se esteriliza en autoclave el frasco con el medio a 121°C duran te 15 min; se enfria y se refrigera a 5-8°C. El pH final debe ser 7,6 0,2. Por aparte, se dix suelven 0,5 9 de cianuro de potasio en 100 cm$ de agua destilada estéril enfriada a 5-8°C y, usando una pipeta con bulbs estéril o una jeringa estéril y sin utilizar succién bucal, se trans= fieren asépticgmente 15 cm3 de fa solucién frfa de KCN a un litro del caldo base estéril frio, © bien 1,5 cm” de solucién de KCN a 100 em de caldo bese. Se mezcla completamente con agitacién suave y asépticamente se distribuye en porciones de 1a 1,5 em? en tubos de ensayo estériles de 13 mm x 100 mm; mediante técnica aséptica se topan inmediatamente los tubos con corchos No.2 impregnades con parafina. Nota 1. Los corches se preparan haciéndolos hervir en parafina durante 5 min. Nota 2. Los corches se colocan en los tubos de manera que la perafine no fluya hacia el caldo Peto que si forme un buen sello entre el borde del tubo y el corcho. Noto 3. El medio almacenado a 5-8°C generalmente es estable durante 2 semanas. 3.23 CaldoMatonate_ Sulfato de amonio (NH,)7S0 4 29 Fosfato dipotésico (KyHPO,) 0,69 Fosfato monopotésico (KH,PO ,) 0,49 Cloruro de sodio 29 Malonato de sodio 39 Glucose 0,25 9 Azul de bromotimol 0,025 g Agua destilada 1.000 em? Se disuelven todos los ingredientes, calentando si fuera necesario; luego se distribuye en porcio nes de 3 cm? en tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm y se esteriliza en autoclave a 121°C duran te 15 min. El pH final debe ser 6,7 + 0,2. 3.24 Reactive Kovacs_ p- Dimetilaminobenzaldehido 5g Alcohol amtlico 75 em? Acido clorhfdrico concentrado 25 em? ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.11 Se disuelve el p~Dimetilaminobenzaldehido en el alcohol amflico y lentamente se agrega el Gcido clorhfdrico; se almacena a 4°C. 3.25 __ Solucién Salina Fisioligica (estéril). Se prepora disolviendo 8,5 g de cloruro de so= io en 1000 em de agua destilada, se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min y se guarda a temperatura ambiente. 3.26 ____Antisuero Polivalente Somético (0) para Salmonella 3.27 __Antisueros del Grupo Somético (0) para Salmonella; incluyendo el antisuero Vi 3.28 Antisuero'Somético del Grupo D para Salmonella 3,29 __Antisuero Somético del Grupo C, para Salmonella Rojo Fenol Lactosa. Se prepara en la forma indicada en 3.19.1 pero utilizando 0 g de Tactosa en vez de los 5g de dulcitol. 3.31__ Caldo Pérpura Lectosa 3.31.1 Caldo bose Proteosa peptona No. 3 log Extracto de carne Ig Cloruro de sodio 59 Porpura de bromocresol 0,15 6 0,020 g Agua destilada 1000 em? 3.31.2 Se disuelven 10g de lactosa en este caldo base, se distribuye en porciones de 2,5em3 en tubos de ensayo de 13 mm x 100 mm, que contienen tubos de fermentactén invertidos de 6 mm x 50 mm, y se esterilizan en autoclave a 118°C durante 10 min. El pH final debe ser 6,84 0,2, 3.32 __Calldo Rojo Fenol Socarosa. Se prepara en Ia forma indicada en 3.19.1 pero utilizan= ‘do 10g de sacatosa en vez de los 5g de dulcitol. 3.33__Caldo Pérpura Secatosa. Se prepara en ‘la forma indicada en 3.31.2 pero utilizando TO 9 de sacarosa en vez de Tos 10 g de lactosa. 3.34 Caldo Glucosa=Tamponado (caldo. MR-VP) Proteosa peptona 79 Glucosa Sg Fosfato dipotésico (KHPO , 5g Agua destilada 1.000 em? ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.12 Se disuelven los ingredientes en 800 cm? de agua con calentamiento suave, se filtra, se enfria @ 20°C y se diluye a un litre. Se distribuye en porciones de 10 em? en tubos de ensayo y se es- teriliza en autoclave « 121°C durante 12.4 15 min; la exposicién mé ‘imo al calor deberd ser de 30 min o menos. E! pH final debe ser 6,9 40,2. 3.35 Soluciénde a¢-noftol. Se prepara disolviendo 5g de << naftol en 100 cm? de alco- Fol absolute. 3.36 Solucién ol 40% se Teva a Un volumen fin 3.37 Creating le KOH. Se prepara disolviendo 40 g de KOH en agua destilada y Te 100 em? 3.38 __Indicador Rojo de Mettio. Se prepara disolviendo 0, 10 g de rojo de metilo en 300 cm3 de alcohol etilico al 95% (v/v) y se Heva a un volumen final de 500 cm3 con agua destilada. 3.39_ Agar Citrato de Simmon Citrato de sodio 2,09 Cloruro de sodio 5,09 Fosfato dipotdsico (KHPO 4) 1,09 Fosfato de amonio (NH4H»PO4) 1,09 Sulfato de megnesio (MgSO 4) 0,2¢ Azul de bromotimol 0,08 g Agar 15,09 ‘Agua destilada 1/000, 0 em? Se disuelven los ingredientes calentando suavemente y con agitacién ocasional, se hierve du~ tante 1 « 2 min hasta que los ingredientes se disuelvan. Se distribuye en tubos de ensayo de 13 mm 6 16 mm x 150 mm, Ilenéndolos hasta un tercio de su capacidad y se taponan o atornillan las tapas de manera tal que se mantengan las condiciones aerdbicas durante su uso. Se esteriliza en autoclave a 121°C durante 15 min y, antes que el me dio se solidifique, se colocan los tubos en posicién inclinaca de manera que se formen fondos — de 2 6 3 cm de profundidad respectivamente, ségGn el diémetro del tubo, y planos inclinados adecuados de 4 5 cm respectivamente. EI pH final debe ser 6,9 £0, 2. 3.40____ Medio pora Ia prueba de movilidad (med Extracto de carne Peptona o gelisato Cloruro de sodio Agar Agua destilada 1000 cin? ContinGaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.i3 Se disvalven los ingredientes calentando suevemente con agitacién ocasional, se hierve duron= fe 1.4 2 min par disolucién completo; se dictribuye en porciones de 8 em} en envases con tepa atomillada cerrando ésia en forma fioja Se esterilize en autoclave a 121°C durante 15 min, se cierra la tapa herméticamente y se almacena, El pH final debe ser 7,440, 2. H, para valores entre 6 y 8 con graduaciones @ cada 0, 4 uni= ‘de color. 4, APARATOS 4d Balanza analitica de precisién, que oprecie 0,1 mg. Balanza de laboratotio, de 20009 de copacidad, que aprecie 0,1 g 43 Mezclador mecénico, (licuadora), capaz de desarrollar una velocidad de 838 rad/s WOOT rpm) 44 Voio mezclador, esterilizado 45 Agitodor de tubos, tipo Vortex 46 Fraseos de boca ancha con tapa atornillada, de 500 em°, u otro envase apropiado. 7____Cucharas estériles, para transferir muestras de alimentos. AB Incubadoras, regulades a 25 2 1°C y 35 £1°C, respectivamente. Mechero, Fischer 0 Bunsen AMO Pipetas esterilizadas, de 1 y 1,1 cm? con graduaciones a cada 0,01 cm? A.11___ Fipetas esterilizadas, de 5;10; y 11,0 em? con graduaciones a cada 0,1 em? 4,12 Asa circular, de aproximadamente 3 mm de diémetro, de alambre de nicrén 4.13 __Asa en punta o guia pare inoculor, de olambre de nicrén 414 Varilla de vidrio estéril, para rayado en estrfas 4.15 Placas de petri esterilizadas, de vidrio 0 de pléstico, de 15 mm x 100 mm. 46 __Tubos de ensayo esterilizados, de 16 mmx 150 mm y de 20 mmx 150 mm. 4,17 ___Tubos de ensayo serolégicos, de 10 mm x 75 mm 6 de 13 mm x 100 mm. 418 Bafos de agua, regulados a 37 £0,5°C; @ 48-50°C y a 100°C ContingeCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.14 419 \émpara, para observar reacciones serolégicas 4,20 Autoclave 4,2\___ Instrumental de laborat 5. PREPARACION DE LA MUESTRA Si la muestra corresponde o producto congelado se debe descongelar una porcién apropiads, en la forma més répida posible, colocando la muestra @ una temperatura inferior a 45°C durante 15 min o menos, 0 bien durante toda fa noche a una temperatura entre 2 y 5°C. 6 PROCEDIMIENTO 6.1____Siembra en medio de enriquecimiento no selective 6.1.1 En forma aséptica se peson 25g de la muestra y se tronsfleren asépticamente al vaso mozclador esterilizado; se agregan 225 cm? de caldo lactosado estéril (véase 3.1) y se mezcla durante 2 min a 838 rad/s (8 000 revoluciones por minuto). 61.2 Se transfiere asépticamente la mezcla homogeneizada a un frasco de boca ancha es= terilizado (véase 4.6), se aprieta la topa del frasco y se deja en repose durante 60 mina tem= peratura ambiente; Ivego se mezcla bien con movimiento rotatorio, se abre asépticamente, se determina el pH con papel indicador (véase 3.41) y se ajusta ef mismo a 6,8 + 0,2 si fuera necesario. 6.1.3 Se tapa completamente el frasco, se mezcla bien, Ivego se afloja la tapa déndole solo 1/4 de giro y se coloca en la incubadora a 35°C durante 24 + 2h. 6.2 Siembra en m 5 de enriquecimiento selectivos 6.2.1 Se retira la muestra de la incubadora, se cierra herméticamente la tapa del frasco y se agita suayemente; con una pipeta estéril se transfiere 1 cm® de la mezcla a un tubo que con- tenga 10 cm® de caldo selenito~cistina (véase 3.2) previamente esterilizado y se incuba a 35 durante 24 £ 2h, 6.2.2 Por aparte se inocula 1 em? de lc mezcla en otro tubo que contenga 10 em de cal- do tetrationato (véase 3.3) y también se incuba a 35°C durante 24 * 2h, 6.3 Aislamiento de Salmonella 6.3.1 Conel asa circular de 3 mm se toma una porcién del cultivo en caldo selenito~ a y se siembra sobre la superficie de coda una de las siguientes placas con agar selectivo: 4) agar sulfito de bismuto (véase 3, 4); b) agar xilosa lisina desoxicolato (véase 3.5); y ¢) agar 70 Hektoen (véase 3.6); la siembra debe efectuarse por estrias para obtener colonias se- ContinéaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.15 6.3.2 Por aparie se hacen las mismas siembras con porciones del caldo tetrationato. 6.3.3 Se incuban las 6 placas @ 35°C durante 24 * 2h; transcurrido el perfodo de incubacién se examinan las placas pora detector la presencia de colonics presuntivas de Salmonella, kasén dose en las siguientes caracteristicas: ©) Agarsulfite de bismuto. Las colonios tpicas de Selmonella, tienen una coloracién que va desde color castaf oscuro a un color negro azabache, algunas veces con un brillo metéli~ co. El medio circundante es generalmente castafis al principio pero después puede tornarse negro conforme avanzo el periodo de incubecién, produciendo el efecto llamado “halo”. Algunas cepas pueden producir colonias verdes con o sin formacién de un ligero halo. Nota: Si en las placs con agar sulfite de bismuto no se desarrollan colonias tYpicas o pre= Zuntivos de Salmonella ni ningGn otro desarrollo, se las debe incubar durante 24h adiciona - les y luego Se exominai nun nvevamente. b) Agar xilosa_lising desoxicolate. Colonias de color rosado con o sin un centro negro; muchos culfivos de Salmonella pueden tener centros negros, grandes y brillantes, o pueden presentar se como colenias casi completamente negras. Cultivos de Salmonella lactosa-positiva pue~ den producir colonias amarillas con o sin centros negros. ¢) Agar entérico Hektoen. Colonias con une coloracién azul verdoso.a azul,con o sin centros negros; muchos cultivos de Salmonella pueden tener centros negros, grandes y brillantes © pueden presentarse como colonias cosi completamente negras. En forma no tTpiea unos pocos culti 108 de Salmonella producen colonies amarillas con o sin centros negros. 6.3.4 De cada placa con agar selectivo, se seleccionan dos 0 mas colonias tipicas © presun tivas de Salmonella, si estén presentes, y se inoculan en agar TSI (véase 3.7) y en agar LIA ~ (véase 3.8), en Te forma indicada a continvacién: utilizando el asa en punta, previamente es terilizada, se toca suavemente el centro mismo de le colonia seleccionada y se inocula el agar TSI rayando Ia superficie inclinada y luego picando el fondo del medio; a continuacién, y sin flamear el asa, se inocula el agar LIA picando 2 veces el fondo. Nota. La descarboxilacién de la lisina es une reaccién estrictamente angerébica, por fo cual @ necesario que el plano inclinado del ager LIA tenga un fondo profundo (aproximadamente 4cm) 6.3.5 Se incuban los tubos de agar TS] a 35°C durante 24+ 2h, y los tubos de agar LIAa la misma temperatura durante 48 * 2h; los tubos deben taparse en forma floja para mantener las condiciones aerébicas durante la incubacién con el objeto de prevenir la produccién excesiva de HS. 6.3.6 Los cultivos tipicos de Salmonella en el agar TS! producen un plano inclinado alca- lino de color rojo y un fondo écido de color amarillo, con o sin produccién de Hy$ (la pro~ duccién de HpS se evidencia por un ennegrecimiento de! ager). En el agar LIA los cultivos tipicos de Salmonella producen una reaccién alcalins de color pGrpura en el fondo del tubo; solamente cuando el fondo del tubo presenta una clara coloracién amarilla se debe considerar &sta como una reeccién écida negative. Contin6éaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.16 Nota. Los cultivos en agar LIA que producen cambios de color en el fondo del tubo no deben ser elimminados solamente por este hecho, ya que muchos cultivos de Salmonella producen HyS en dicho agar. [a 6.3.7 Se vuelven a examinar las placas conegar sulfite de bismuto, incubadas durante 24h adicionales (48h en total), vedse nota al numeral 6.3.3 (a), y se leva a cabo el procedim to descrito desde 6.3.44 6.3.6 inclusive. 6.3.8 Se separan todos los cultivos en agar TSI y en agar LIA que presenten un desarrollo presuntamente positive para Salmonella (véase 6.3.6), y se ensayan para una identificacién bio qutmica. Note 1. No se deben excluir los cultivos que se presenten como negatives para Solmonella en ‘elagat TSI, si su reaccién en agar LIA es tipica de Salmonella; dichos tubos deben tralarse co- mo cultivos presuntamente positives y deben ser sométidos @ ulfericres ensayos de identificacién bioquimicos. Noto 2. El agar LIA es particularmente étil er la deteccién de Salmonella arizonae y cepas iio caracterfsticas de Salmonella que utilizan lactosa y/o sacarosa,———— 6.3.9 Se deben realizar ensayos de identificacién bioquimica e identificacién serolégica en la forma siguient 4a) En tres cultivos presuntives en agor TSI obtenides a partir del caldo selenito, y en tres cul= tivos presuntivos en agar TSI obtenidos @ partir de caldo tetrationato. b) Sino se han aislado tres cultivos presuntamente positives en agar TS! o partir de unc serie de placas con agar selectivo, se deben ensayar, tanto bioquimica como seroléaicamente, otros cultivos presuntamente positivos en agar TS! que se hayan podido aislar, Se deben examinar como minimo 6 cultivos en agar TSI por cada 25g de muestra ensayada. Si el agar TS! no diera reaccién tipica de Salmoneilo, se deben selecctonar colonias adicionales a partir del agar selectivo que no dié cultivos presuntamente positives. 4 Identificacién de Salmonella 6.4.1 Cultivos mezelados 6.4.1.1 Si los cultivos en agar TSI (véase 6.3.4) se desarrollan como cultives mezclados, se debe inocular el cultivo en la superficie de placas que contengan agar MacConkey (véase 3,9) © agar entérico Hektoen (véase 3.6) o bien,agar xilosa lisine desoxicolato (véose 3.5). 6.4.1.2. Se incuban las placas a 35°C durante 24 * 2h y luego se examinan los placas para detector la presencia de colonias presuntivas de Salmonella, basdndose en las siguientes co- racteristicas: cas aparecen transparentes e incoloras, algunas veces @) Agar MacConkey. Colonias ti “on un centro oscuro, ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.17 b) Agar entérico Hi ktoen, véase 6.3.3 (c) c) Agar xilosa lisina desoxicolato, véase 6.3.3 (b) 6.4.1.3 Si se desarrollan colonics presuntives de Salmonella, se seleccionan como mfnimo 2 colonias y se inoculen tubos conteniendo agar TS! y agar LIA con plano inclinado, en la forma descrita en 6.3.4 y se continGa con el procedimiento descrito a partir de 6.3.5 en adelante, 6.4.2 Cul (05 puros 6.4.2.1 Prueba de ureasa ( convencional ) @) Con un asa en penta esterilizada se inoculan tubos que contienen caldo de urea (véase 3.10) con cada cultive presuntamente positivo desarrollade en agar TSI. b) Se incuban los tubos o 35°C durante 24 £ 2h y luego se examinan: la reaccién es positiva cuando el caldo de urea toma coloracién rojo pérpura y es negativa cuando el caldo perma nece sin cambio de color. Nota. Ya que tubos no inoculados de caldo de urea desarrollan ocasionalmente una colora- Gin rojo porpura (enscyo positive) durante el reposo, se debe incubar un tubo no inoculado de este caldo como un control. c) Se descartan los tubos que dieron reaccién positiva y se conservan los tubos con reaccién negativa para ensayes adicionales. 6.4.2.2 Prueba de urecsa opcional (répida) 4) Con un ase circular de 3 mm se tronsfieren a tubos que contienen caide de urea répido (véa se 3,11), 2 porciones de cada cultivo presuntamenie positivo desarrollado en agar 751, b) Se incuban los tubos en el batio de cgua a 37 +0,5°C durante 2h, y se examinan: los tukos ‘en que no hubo cambio de coloracién, corresponden a reaccién negativa. s) Se descartan los tubos con reaccién positive y se conservan los tubos con reaccién negative gi para ensayos adicionales. 6.4.2.3 Prueba serolégica de antigeno flagelor (H). Si los cultivos presuntamente positivos en agar TS! son muy numerosos y se considera necesario reducir este nGmero antes de proceder con otros ensayos bioguimnicos, se debe realizar una prueba cerolégica separatotia con antTgeno fla gelor (H). A estas aituras del procedimiento, esta prueba separatoria ("'screening test"), es — opcional; si Gnicamente se tienen relativamente pocos cultivos presuntamente positives, se pro cede directamente como se indica en 6,4,2.5, en caso contrario se procede en la forma siguien te: 6,4,2.3.1 El cultive de cada ager TSI que results negative con le prueba de ureasa (véase 6.4. 2.ly 6.4.2.2) se inocula en un tubo conteniendo 5 em? de uno de los siguientes caldos de cul- tivo: ContingaCOGUANOR NGO 25 015 43 p.18 2) Caldo de infu que ocurra un desarrollo o bien oraz6n (véase 3,12), se incuba « 35°C durante 4a éh, hasta ble; este cultivo es pare realizar la prueba en el mismo dia, b) aldo de tripticasa soya ~triptosa (véase 3.13), se incuba a 35°C durante 24 2h; este cul- fivo es para realizar la prueba al dia siguiente. 6,4.2.3.2 A cada tubo incubade segin el paso anterior, se agregan 2,5 em de la solucién sali - ra fisiolégica formalinizada (véase 3.14) 6.4.2.3.3 Se seleccionan dos cultivos de caldo formalinizado y se ensayan con antisuere poliva lente flagelor (H) para Salmonella, en la forma siguiente: @) En un tubo de ensayo serolégico (véase 4,17) se coloca 0,5 em? del antisuero aproptadamen te diluido — b) Se agregan 0,5 em? del antfgeno que se esté ensayando (6.4.2.3 (b)). ¢) Se prepara un control saline mezclando 0,5 em3 de la solucién salina fisiolégica formalint = zado con 0,5 em del antigeno. d) Se incubsn las mezclas en el batio de agua regulade ¢ 48-50°C durante 1h; se okserva cade mezcla a intervalos de 15 min y se lee e! resultado final transcurrida le hora de incubscién. ~ El resultado es positive si se produce aglutinacién en la mezela de ensayo pero no en Teontrol; ~ El resultado es negativo si no hay aglutinacién en la mezcla de ensayo ni en el control; y Se designa como resultado no espectfico cuando tanto en la mezcla de ensayo como en el control se produce aglutinacién; Tos cultivos que dan un resultado no especifico, se deben ensayar con antisuero Spicer-Edwards, véase 6.4.2.4, 6.4.2.4 Prueba serolégica de Spicer -Edwards. Esta prueba puede ser usada en reemplozo de la prueba serolégica de antigeno flagelar (H) (prueba separatoria o "screening test"); también puede ser usada en aquellos cultivos que sometides ¢ la prueba serolégica de antigeno flagelar (H) dieron resultado no especifico, a) Lo prueba se realiza en la forma indicada en 6,4.2.3.3 (a) a (d), usando antisuero flogelar (H) Spicer-Edwards en reemplazo del antisvero polivatente flagelar (H) para Salmonella. b) Cada tubo que resulte positive para esta prueba debe someterse a los ensayos bioquimicos odicionales indicados en 6.4.2.5.1, 6.4,2.5.2 y 6.4.2.5.3. ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.19 ©) Si ambos cultivos de caldo formalinizado son negatives se debe realizar ensayos serolégicos en cuatro cultivos adicionales. Si es posible, se obtienen dos cultivos positivos para ensa~ yos bioquimicos adicionales; véase 6.4.2.5.1, 6.4.2.5.2 y 6.4.2.5.3, d) i todos los cultivos en TSI que dieron prueba negativa a la ureasa, dan también resultados negatives para la prueba serolégica flagelar (H); se deben realizar en cada uno de ellos, las pruebas biequtmicas adicionales indicadas en 6.4.2.5.1, 6.4.2.5.2 y 6.4.2.5.3, 6.4.2.5 Cultivos con resultado negativo en la prueba de ureasa. Estos cultivos se deben so- meter a las siguientes pruebas bioquimicas y serolégicas adicionales. 6,4.2.5,1 Caldo de lisina decarboxilasa, (véase 3.17) a) Se inocula el caldo con una pequefa cantidad del cultive desarrollado en el agar TS! que resulté presuntivo para Salmonella b) Se tapa el tubo en forma hermética y se incuba a 35°C durante 96 + 2h, pero examinén dolo intervalos de 24h. = ~ La Salmonella causa una reaccién alealina, evidenciada por una coloracién pér- pura en fodo el medio. ~ la prieba es negativa cuando todo el medio toma coloractén amarilla. ~ Si el medio se presenta coloreado pero no en rojo ni en amarillo, se agregan unas gotas de la soluctén al 0,2% de ptrpura de bromocresol (véase 3.18) y se vuelven a leer las reacciones de los tubos. -2 Caldo rojo fenol dulcitol, (véase 3.19) 0 caldo base pérpura con 0,5% de duleitol, (véase 3.20) a) Se inocula el caldo con una pequefa cantidad del cultivo desarrollado en el agar TS! b) Se tapa el tubo en forma floja y se incuba a 35°C durante 48 + 2h, pero haciendo un mer examen después de 24h, ~ La mayorta de los cultivos de Salmonella dan prueba positiva evidenciada por la formacién de gas en el interior del tubo de fermentacién y un medio de pH dcido y color amarillo. La produccién Gnicamente de écido ya se interpreta como una reaccién positive. ~ la prueba negativa se reconoce por la falta de formacién de gas en el interior del tubo de fermentacién y un medio de color rojo cuando se usa rojo fenol como indi~ cador,o de color pirpura cuando se usa pirpura de bromecresol como indicador. 6,4,2.5.3 Caldo triptofane, (véase 3.21) a) Se inocula el caldo con una pequefa cantidad del cultive desarrollado en el agar TS! ContingaCOGUANOR NGO 35 015 h3 p.20 b) Se incuba a 35°C durante 24 + 2h y Ivego se procede en la forma siguiente: i) Caldo KCN, (véase 3,22) Con el asa circular de 3 mm se transfiere una porcién del cultive desarrollado en el caldo triptofane al caldo KCN, Se calienta el borde del tubo con el objeto de ob= tener un buen selio cuando el tubo sea tapado con el corcho recubierte con parafina: se incuba a 35°C durante 48 * 2h pero haciendo un primer examen después de 24h, Se interpreta el resultado como positive cuando hay turbidez del medio; lo meyorta de las cepas de Salmonella no se desarrollan en este medio lo cual se evidencia por la falta de turbidez. ii) Caldo malonate, (véase 3.23) Con el asa circular de 3 mm se transfiere una porcién del cultivo desarrollado en el caldo triptofano al caldo malonato. Se incuba a 35°C durante 48 2h pero haciendo vn primer examen después de 24h; la mayor parte de los cultivos de Salmonella dan un resultado negative evidenciado por un color verde o por ningén cambio de color en el medi Nota. Ya que tubos no inoculades de caldo malonate desarrollan ocastonalmente una colcracién azul (ensayo positive) durante el reposo, se debe incubar un tubo no ino= cviade de este caldo como un control. Prueba de Indol Se transfieren 5 cm? del cultivo en caldo de triptofano luego del perfodo de incuba - cidn, a un fubo de ensayo vacto y se agrega 0,2 4 0,3 em? del reactivo Kovacs (véa~ se 3.24); la mayor parte de los cultivos de Salmonella dan un resultado negutivo evi- denciado por la ausencia de color rojo oscuro en la superficie del caldo, Los resulta~ dos intermedios con una coloracién que varfa de naranja a rosada se registran como 6.4.2.6 Si anteriormente no se Ilevé a cabo la prueba serolégica de antTgeno flagelar (H) (véa se 6,4,2,3), ni ta prueba serolégica de Spicer Edwards (véase 6.4.2.4), como pruebas separato= rias ("screening test"), entonces en este momento se pueden llevar a cabo cualquiera de estas dos pruebas serolégicos, ive cualquier cultive que muestre cualquie= 6.4.2.7 Se deben descartar como Salmonella ne: ra de las dos posibilidades indicadas a continuacién: 0) Un resultado positive para la prueba de Indol (6,4.2.5.3 (b) iii), y un resultado negativo pa- ta la prueba serolégica de antigeno flagelar (H) (6.4.2.5 y 6.4.2.4) o bien, b) Un resultado positive para la prueba con KCN (6,4,2.5.3 (b) i),y un resultado negative pare la prueba con lisina decarboxilase (6.4.2.5.1) ContinéaCOGUANOR NGR 35 015 b3 p.2i 6.428 — Pruebas serolégicas de antigeno somatic (O}, Se pre-ensayan todos los enticueros para Salmonelié con cultivos conocidos. 6.4.2.8.1 Prueba de antigeno polivalente somatico (O) ©) Con un lapiz de cera se marcan 2 secciones rectongulares de 1 cm x 2 em cada una, en el interior de una placa de petri b) Utilizando el asa circular de 3 mm se toma una porcién,equivalente o la mitad'de su seccién circular,del cultivo desarrollade en agor TS! lvego de 24a 48h de incubacién, y se colo- ca sobre la placa en la porcién més alta de cada seccién rectangular marcada con el lapiz. ¢) Se agrega una gota de solucién salina (véase 3.25) en la parte inferior de solo una de las secciones y se emulsifiea el cultivo en Ia solucién salina con el asa circular esterilizada © con el asa en punta esterilizada. d) Se agrega 1 gota del antisuero polivalente somético (O) para Salmonella a la otra seccién solamente, y se mezcla con el asa previamente esterilizada. ¢) Se mueven las mezclas con un movimiento hacia atras y hacia adelante durante 1 min y lue~ go se observon contra un fondo oscuro y con buena iluminacién; se considera como reaceién positiva cualquier grado de aglutinacién. f) Se clasifican los resultados de esta prueba como se indica a continuacién: - Positiva: aglutinacién en el antisuero pero no en el control salino ~ Negativa: ni el antisuero ni el control saline presenten aglutinacién = No especifica: aglutinacién tanto en el antisuero como en el control salino; en este a:0 se deben realizar ensayos bioquimicos y serolégicos adicionales 6.4,2.8.2 Pruebas para los grupos de antfgenos sométicos (O) ©) Se procede en la misma forma descrita anteriormente en 6.4.2.8. (a) a (F) con le diferencia que en vez del antisuero polivelente somético (O) para Salmonella, se usan antisveros in= dividvales del grupo somético (O), ineluyendo el antisuero Vi st estuviera disponible. b) Los cultivos que dan una aglutinacién positiva con cualquier antisvero somético (O) indivi= dual, se registran como positives para ese grupo. ¢) Los cultivos que no reaccionan con ningGn antisuero somético (O) individual, se registran como negatives para ese grupo. 6.4.2.8.3 Pruebas para el antigeno somético (O) Vi. Los cultives que anteriormente dieron teaccién de"aglutinacién positiva para ef antisuero Vi se pueden ensayar en la forma siguiente para una identificacién més completa. Contingaa) b) COGUANOR NGR 35 015 43 p.22 En 1 cm? de solueién salina fisiolégica (véase 3.25) se suspende y emulsifica suficiente con fidad del cultivo desarrollado sobre el plano inclinado de agar TS! para hacer una suspen= sién espesa; se coloca la suspensién en un bafio de agua hirviendo durante 200 30 min y luego se deja enfriar. Se ensaya nuevamente la suspensién calentada, en lo forma indicada en 6.4.2.8.1 (a) a (f) pero usando antisueros sométicos del grupo D, C) y Vi. ¢) Los cultivos V; positivos que reac nan con antisuero del grupo sométice D son probablemen te Salmonella typhi, y los cultivos Vi positivos que reaccionen con el ai méfico C; son probablemente Salmonella paratypht dos como Salmonella sp. deben tener Tas caracteriéticas de Salmonella descritas en la tabla. d) Los cultivos calentados Vi positivos los cuales no reaccionan con ningGn suero somético individual pero de nuevo reaccionan con a1 ero Vi no son Salmonella . Tabla 1. Reacciones bioqutinicas y serolégicas de Salmonella Reaccién de Eneayo 0 sustrato Positive Negativa Salmonella ~ | Glucosa TS! Fondo amarillo | Fondo rojo + HyS TSI Ennegrecimiento | No ennegrecimiento + Ureasa Color pérpura- | NingGn cambio de color - rojo Caldo lisina decarboxila sa ~ ] Color pérpurs | Color amarillo + Caldo rojo fenol dulci_ | Gas; color ema- | Gas ausente; ningdn tol ~ | illo cambio de color +(2) Calde KCN Turbidez Sin turbidez - Caldo malonato Color azul NingGn cambio de color -@) Prueba de Indol Superficie color | Superficie color amar violeta He - Ensayo flagelar poliva= lente Aglutinacién Sin aglutinacién + Ensayo somético poliva lente “| Aglutinacién Sin aglutinacién + Caldo rojo fenol Icctosa | Gas; color ama= | Ges ausente; ningGn Fillo cambio de color -@) Continga ero del giupo so C, Para que estos cultivos sean clasificaCOGUANOR NGR 35 015 3 p.23 Tebla 1 Reacciones bioguimicas y serolégices de Saimonellc (conciusisn) Reaccidn de Encayo 0 sustrato Posttiva | Negativa Salmonella (1) Caldo rojo fenol sacarosa_| Gas; color ama~ | Gas ausente; ningdn rillo cambio de color - Prueba Voges-Proskaver | Color rosadoa | Ningtin cambio de rojo color - Prueba rojo de metilo | Color rojodifuso | Color amarillo difuso + Citrato de Simmon Crecimiento; co= | Sin crecimiento; nin= for azul gin cambio de color v (4) (1) + = 90%0 mds positive en uno o dos dias (1) = = 90% 0 més negativa en uno © dos dias (2) = La mayorfe de cultivos de S. arizonae son negativos (3) = La mayorta de cultivos deS.arizenae_son positives (4) = Variable 6.4.2.9 Ensayos biogutmicos adicionales. Si un cultivo no pudo ser identificado ya sea co- mo Salmonella © como Salmonella -negativo, sobre la base de los encayos bioguTmicos y serolé cos precedentes (véase Tabla 1), se efectGan uno o més de los siguientes ensayos kiogutmicos adicionales. 6.4.2.9.1 Caldo rojo fenol lactosa_(véase 3.30) 0 caldo pérpura lactosa (véase 3.31) 9) Se inocula el caldo con una pequefa cantidad de cultive desarrollado en el agar TSI, incu bado de 24a 48h, que no se pudo identificar. ~ b) Se incuba 35°C durante 48 + 2h, pero haciendo un primer examen a las 24h, ~ La reaccién positiva se evidencia por la produccién de deide con coleracién emarilla y produccién de gas en el interior del tubo, de fermentacién; la produccién éinicamente de &cido ya se interpreta como una reaccién positiva. La mayorta de los cultivos de Sa la don reaccién negativa a esta prueba. mon’ ~ Le teaccién negativa se evidencia por la no formacién de gas en el interior del tubo de fermentacién y por un medio de coler rojo cuando se usa indicador rojo fenol,o un me= dio de color pérpura cuando se usa pOrpura de bromocresol como indicador; la mayorfa de los cultivos de Salmonella dan reaccién negativa c esta prueba . ¢) Se descartan como Salmonella -negotivo los cultives que dieron reaccién positiva a la prue ba de lactosa excepivando: ~ Los cultivos que dieron planos inclinasos écidos en el agar TSi y reacciones positives en el agar LIA; ContingaCOGUANOR NGR 35 015 h3 p.24 ~ Los cultivos que dieron reacciones pos! is en el caldo malonato. Nota. Se deben efectuar ensayos ulteriores sobre estos cultivos para determinar si ellos Gorresponden a Salmonella arizonae. 6.4,2.9.2 Caldo rojo fenol sacarosa (véase 3.32) 0 celdo pérpura sacarosa_(véase 3.33) @) Se sigue el procedimiento descrito en 6.4.2.9.1 (a) y (b) b) Se descartan como Salmonella negativos los cultivos que dieron reaccién positiva o la prue ba do sacarosa, excepto aquellos que dieron plano inelinado écido en el agar TSI y reaceyén positiva en el egar LIA. 6.4.2.9.3 Caldo glucosa tamponade (caldo MR-VP), (véase 3.34). Se inocula el medio con una pequefa cantidad de cada culfivo que no pudo ser identificado como presuntivo para Salmonella en el agar TSI, y se incuba a 35°C durante 48 * 2h, Luego se realiza la prueba de Voges-Pros= kaver (prueba VP) en la forma siguiente: a) A un tubo de ensayo se transfiere 1 cm? del cultivo incubado 48h, se agregan 0,6 em*de solucién de ecnaftol (véase 3.35) y se agita bien. b) Se agtegan 0,2 cm de solucién al 40% de KOH (véase 3.36) y se cgita; opeionalmente se adicionan unos poces eristales de creating para acelerar la reaccién y se lee el resultado luego de 4h. ~ la prueba es positiva si se desarrolia un color rosado a rojo rubf'a través de! medio. ~ La prueba es negativa si no se desarrolla una coloracién rosada a rojo rubia través del medio; la mayoria de los cultivos de Salmonella dan una reaccién negativa a esta prueba ¢) Se incuban los remanentes del medio MR-VP « 35°C durante 48h adicionales, y luego se Heva a cabo la prueba del rojo de metilo indicada a continuacién. 4) Prueka del rojo de metilo, A los remanentes del medio MR-VP incubados durante 96h, se Tes agregan 5 a 6 gotas del indicador rojo de metilo (véase 3.38) y se len los resultados inmediatamente, ~ la prucha es positiva si se desarrolla un color rojo difuso en el medio; la mayorfa de los cultivos de Salmonella dan un resultado positive a esta prueba. ~ La prueba es negative si se desarrolla un claro color amarillo en el medio. @) Se descartan como Salmonella negatives los eultives que dan un ensayo positive para la prue ba con KCN y para Ta prueba VP, y un resultado negativo para la prueba de rojo de metil 6.4.2.9.4 A mon, (véase 3.39) @) Empleando un asaen punta que contenga cultivo no identificado en agar TSI, se inocula'el agar citrate de Simmon rayando el plano inclinado y picando el fondo del tubo. Conting: 8COGUANOR NGR 35 015 h3 p.25 b) Se incuba a 35°C durante 96 £ 2h, pero se examina @ intervalos de 24h, ~ la prueba es positiva si hay crecimiento del cultivo, generalmente acompafado de un de color deT verde al azul; Iz mayorta de los cultivos de Samonella son citrato= positives. [hae ~ la prueba es negativa si no hay crecimiento del cultive ni cambio de color 6.42.10 Tratamiento de los cultivos que dieron un resultado negative con la prueba de antf= geno flagefer (H). “37 las reacciones bioquimicas de un determinado ‘cultivo negative para el ‘antigeno flagelar (H), son tales que se considera firmemente como Salmonella presuntiva, sien do posible que la aglutinacién flagelar negativa haya sido causada Por organismos no méviles © por un desarrollo insuficiente del antfgeno flagelar, entonces se procede como sigue: 6.4,2.10.1 Prueba de mo ‘lidad ©) Usando una pequeria cantidad del cultive desarrollado en agar TSI, se inocula el medio para la prueba de movilidad (véase 3.40) en una placa de Petri, picdndolo solo una vez aprox! madamente a 10 mm del borde de la placa y a una profundidad de 2a 3 mm; no se debe pi car el fondo de le placa o inocular ninguna otra porcién, ) Se incuba a 35°C durante 24h, se examina la placa y si los organismos han migrado 40 mm © mas, sé procede a un nuevo ensayo como se indica a continuacién, 1) Con el asa circular se transfiere una porcién del cultivo que migré més lejos, al caldo tripticasa soya-triptosa, véase 3.13; y ii) Se repite la prueba serolégica de antigeno polivalente flagelar (H), (véase 6. 2.3) o bien la prucka serolégica de Spicer-Edwards, (véass 6.4,2.4) ©) Si los cultivos no son méviles después de las primeras 24h, se los incubs 35°C durante un Perfodo adictonal de 24h y si aGn no hay movilidad, se los incuba hasta 5 dias a 25°C; se clasifican los cultivos como no méviles si aGn después de los ensayos anteriores el resultedo es negativo, 7. EXPRESION DE LOS RESULTADOS Los resultados se expresan de acuerdo a las siguientes posibilidades: 71 jespués de realizar las diferentes operaciones descritas en la presente norma no se detecta Salmonella, se informard en la forma siguiente: "No se encontré Salmonella en25g de material examinado." Contin6a: COGUANOR NGR 35 015 h3 p.26 72 Si se detecta Salmonella, se informard en la forma sigulente: "Se encontré Salmone= Ia en 25 g de material examinado™, 7.3 Si se realizé tipificacién serolégica, se informaré en lo forma siguiente: “La Salmo= nella identificada pertenece a los siguientes tipos.e..ssu-" 8 INFORME DEL ENSAYO Enel informe del ensayo debe indicarse lo siguiente: 8. Los métodos usados y el resultedo final. ‘ 4 82 Cualquier condicién no especificada en esta norma o sefalada como opctonal, ast como cualquier circunstancia que pueda haber influido en el resultado. 8.3 El nombre exacto del centro de referencia que ayudé a identificar las cepas de Salmonella, si las hubo. 8.4 Todos los detalles necesa 5 que permitan la completa identificacién de la muestra. % CORRESPONDENCIA, Para la preparacién de la presente norma se ha tenido en cuenta lo siguiente : a) El método "Aislamiento e Identificacién de Salmonella", descrito en el'Bacteriological Analytical Manual, Food and Drug Administration, Bureau of Foods, Division of Micro- biology" Agosto 1978; y b) Los métodos 46.054 a 46.067 descritos en "Official Methods of Analysis of the Asso of Official Analytical Chemists", 13a. Edicién 1980,