BASE ESTRUCTURAL PARA EL RECONOCIMIENTO DEL SARS-COV-2 POR EL

ACE2 HUMANO DE LONGITUD COMPLETA

Renhong Yan 1,2 , Yuanyuan Zhang 1,2 *, Yaning Li 3 *, Lu Xia 1,2 , Yingying Guo 1,2 ,
Qiang Zhou 1,2 †

1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, Institute of Biology, Westlake Institute for Advanced Study,
18 Shilongshan Road, Hangzhou 310024, Zhejiang Province, China. 2School of Life Sciences, Westlake University, 18
Shilongshan Road, Hangzhou 310024, Zhejiang Province, China. 3Beijing Advanced Innovation Center for Structural
Biology, Tsinghua-Peking Joint Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084,
China.

*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo. †Autor correspondiente. Correo electrónico:
zhouqiang@westlake.edu.cn

La enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) es el receptor celular del coronavirus del

SARS (SARS-CoV) y el nuevo coronavirus (SARS-CoV-2) que está causando la grave
epidemia COVID-19. Aquí presentamos estructuras cryo-EM de ACE2 humano de longitud
completa, en presencia de un transportador de aminoácidos neutro B0AT1, con o sin el dominio
de unión al receptor (RBD) de la glucoproteína de pico de superficie (proteína S) de SARS-
CoV-2 , ambos con una resolución general de 2.9 Å, con una resolución local de 3.5 Å en la
interfaz ACE2-RBD. El complejo ACE2-B0AT1 se ensambla como un dímero de heterodímeros,
con el dominio tipo Collectrin (CLD) de la homo-dimerización mediadora de ACE2. El RBD es
reconocido por el dominio de peptidasa extracelular (PD) de ACE2 principalmente a través de
residuos polares. Estos hallazgos proporcionan información importante sobre la base molecular
del reconocimiento y la infección por coronavirus.

El SARS-CoV-2 es un virus de ARN de cadena positiva que causa el síndrome respiratorio

severo en humanos. El brote resultante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha
surgido como una epidemia grave, que cobró más de dos mil vidas en todo el mundo entre
diciembre de 2019 y febrero de 2020 (1, 2). El genoma del SARS-CoV-2 comparte
aproximadamente el 80% de identidad con el del SARS-CoV y es aproximadamente el 96%
idéntico al Bat coro-navirus BatCoV RaTG13 (2).

En el caso del SARS-CoV, la glucoproteína espiga (proteína S) en la superficie del virión media
en el reconocimiento del receptor y la fusión de la membrana (3, 4). Durante la infección viral,
la proteína S trimérica se escinde en las subunidades S1 y S2 y las subunidades S1 se liberan
en la transición a la conformación posterior a la fusión (4–7). S1 contiene el dominio de unión al
receptor (RBD), que se une directamente al dominio de peptidasa (PD) de ACE2 (8), mientras
que S2 es responsable de la fusión de la membrana. Cuando S1 se une al receptor del
huésped ACE2, otro sitio de escisión en S2 queda expuesto y es cortado por las proteasas del
huésped, un proceso que es crítico para la infección viral (5, 9, 10). La proteína S del SARS-
CoV-2 también puede explotar ACE2 para la infección del huésped (2, 11-13). Una publicación
reciente informó la estructura de la proteína S del SARS-CoV-2 y mostró que el ectodominio de
la proteína S del SARS-CoV-2 se une a la PD de ACE2 con un Kd de ~ 15 nM (14).

Aunque ACE2 es secuestrado por algunos coronavirus, su función fisiológica primaria es la

maduración de la angiotensina, una hormona peptídica que controla la vasoconstricción y la
presión arterial. ACE2 es una proteína de membrana tipo I expresada en pulmones, corazón,
riñones e intestino (15-17). La disminución de la expresión de ACE2 se asocia con
enfermedades cardiovasculares (18-20). El ACE2 de longitud completa consta de un PD de N-
terminal y un dominio similar a Collectrin (CLD) de C-terminal que termina con un solo hélice
transmembrana y un segmento intracelular de ~ 40 residuos (15, 21). La PD de ACE2 escinde
la angiotensina (Ang) I para producir Ang-(1-9), que luego es procesada por otras enzimas para
convertirse en Ang-(1-7). ACE2 también puede procesar directamente Ang II para dar Ang-(1-7)
(15, 22).

Las estructuras de la ACE2-PD en forma de garra sola y en complejo con la RBD o la proteína
S del SARS-CoV han revelado los detalles moleculares de la interacción entre la RBD de la
proteína S y la PD de la ACE2 (7, 8, 23, 24 ) La información estructural sobre ACE2 está
limitada al dominio PD. El single-TM de ACE2 hace que sea difícil determinar la estructura de la
proteína de longitud completa.

ACE2 también funciona como la chaperona para el tráfico de membrana del transportador de
aminoácidos B0AT1, también conocido como SLC6A19 (25), que media la absorción de
aminoácidos amino neutros en las células intestinales de una manera dependiente de sodio.
Las mutaciones en B0AT1 pueden causar el trastorno de Hartnup, una enfermedad hereditaria
con síntomas como pelagra, ataxia cerebelosa y psicosis (26-28). Se han determinado las
estructuras para los miembros de la familia SLC6 dDAT (transportador de dopamina
Drosophila) y SERT humano (transportador de serotonina, SLC6A4) (29, 30). No está claro
cómo ACE2 interactúa con B0AT1. El mecanismo de tráfico de membrana para ACE2 y B0AT1
es similar al complejo LAT1-4F2hc, un gran complejo transportador de aminoácidos neutros
que requiere 4F2hc para su localización en la membrana del plasma (31). Nuestra estructura
de LAT1-4F2hc muestra que la carga LAT1 y la chaperona 4F2hc interactúan a través de
dominios extracelulares y transmembrana (32). Razonamos que la estructura del ACE2 de
longitud completa puede revelarse en presencia de B0AT1.

Aquí informamos la estructura cryo-EM de la longitud completa complejo ACE2-B0AT1 humano

con una resolución general de 2.9 Å y un complejo entre el RBD del complejo SARS-CoV-2 y
ACE2-B0AT1, también con una resolución general de 2.9 Å y con una resolución local de 3.5 Å
en la interfaz ACE2-RBD . El ACE2-B0AT1 existe como un dímero de heterodímeros. La
alineación estructural del complejo ternario RBD-ACE2-B0AT1 con la proteína S del SARS-
CoV-2 sugiere que dos trímeros de la proteína S pueden unirse simultáneamente a un
homodímero ACE2.

Determinación estructural del complejo ACE2-B0AT1

Los ACE2 y B0AT1 humanos de longitud completa, con las etiquetas Strep y FLAG en sus
respectivos terminales N, se coexpresaron en células HEK293F y se purificaron mediante
cromatografía de resina de afinidad en tándem y de exclusión por tamaño. El complejo se eluyó
en un único pico monodisperso, lo que indica una alta homogeneidad (Fig. 1A). Los detalles de
la preparación de la muestra de crio, la adquisición de datos y la determinación estructural se
dan en la sección Materiales y métodos del material complementario. Se obtuvo una
reconstrucción 3D con una resolución general de 2.9 Å a partir de 418,140 partículas
seleccionadas. Esto reveló de inmediato el dímero de la arquitectura de los heterodímeros (Fig.
1B). Después de aplicar el refinamiento enfocado y la expansión de simetría C2, la resolución
de los dominios extracelulares mejoró a 2.7 Å, mientras que el dominio TM permaneció a una
resolución de 2.9 Å (Fig. 1B, figs. S1 a S3, y tabla S1).

La alta resolución admite la construcción de modelos confiables. Para ACE2, las cadenas
laterales podrían asignarse a los residuos 19-768 que contienen la PD (residuos 19-615) y la
CLD (residuos 616-768) que consta de un pequeño dominio extracelular, un conector largo y la
hélice TM simple ( Fig. 1C). Entre el PD y el TM hay un dominio de pliegue similar a la
ferredoxina, nos referimos a esto como el dominio del cuello (residuos 616-726) (Fig. 1C y fig.
S4). La homo-dimerización está completamente mediada por ACE2, que está emparedada por
B0AT1. Tanto el dominio PD como el dominio del cuello contribuyen a la dimerización, mientras
que cada B0AT1 interactúa con el cuello y la hélice TM en el ACE2 adyacente (Fig. 1C). La
región extracelular está altamente glicosilada, con 7 y 5 sitios de glicosilación en cada
monómero ACE2 y B0AT1, respectivamente.

Durante la clasificación, se procesó otro subconjunto con 143.857 partículas a una resolución
general de 4,5 Å. Si bien el dominio del cuello aún se dimeriza, las PD se separan entre sí en
esta reconstrucción (Fig. 1D y Fig. S1, H a K). Por lo tanto, definimos las dos clases como las
conformaciones abiertas y cerradas. La comparación estructural muestra que los cambios
conformacionales se logran mediante la rotación de los dominios PD, con el resto del complejo
casi sin cambios (película S1).

Interfaz de homodímero de ACE2

La dimerización de ACE2 está mediada principalmente por dominio del cuello, y la PD

contribuye con una interfaz menor (Fig. 2A). Nos referiremos a los dos protómeros ACE2 como
A y B, con residuos en el protómero B marcado como residuo. Extensas interacciones polares
se asignan a la interfaz entre la segunda (residuos 636-658) y la cuarta (residuos 708-717)
hélices del dominio del cuello (Fig. 2B). Arg652 y Arg710 en ACE2-A forman interacciones
catión-π con Tyr641 'y Tyr633' en ACE2-B. Mientras tanto, Arg652 y Arg710 están
respectivamente unidos por hidrógeno (enlace H) a Asn638 'y Glu639', que también interactúan
con Gln653, al igual que Asn636 '. Ser709 y Asp713 de ACE2-A están unidos por H a Arg716 '.
Esta extensa red de interacciones polares indica la formación estable de dímeros.

La interfaz del dímero PD parece mucho más débil con solo un par de interacciones entre
Gln139 y Gln175 '(Fig. 2C). Gln139 está en un bucle que se estabiliza mediante un enlace
disulfuro entre Cys133 y Cys141, así como múltiples interacciones polares intra-bucle (Fig. 2C).
La interacción débil es consistente con la capacidad de transición a la conformación abierta, en
la cual la interfaz entre los dominios de Neck permanece igual mientras que los PD están
separados unos de otros por ~ 25 Å (Fig. 2D y película S1).

Estructura general del complejo RBD-ACE2-B0AT1

Para obtener información sobre la interacción entre ACE2 y el SARS-CoV-2, compramos 0.2
mg de RBD-mFc recombinantemente expresado y purificado del SARS-CoV-2 (por simplicidad,
lo llamaremos RBD) de Sino Biological Inc. , lo mezcló con nuestro complejo ACE2-B0AT1
purificado en una relación estequiométrica de ~ 1.1 a 1, y procedió a la preparación de
criorejilla y al envejecimiento. Finalmente, se obtuvo una reconstrucción EM 3D del complejo
ternario.

A diferencia del complejo ACE2-B0AT1, que tiene dos conformaciones, "abierto" y "cerrado",
solo se observó el estado cerrado de ACE2 en el conjunto de datos para el complejo ternario
RBD-ACE2-B0AT1. La estructura del complejo ternario se determinó a una resolución general
de 2,9 Å a partir de 527.017 partículas seleccionadas. Sin embargo, la resolución para el
complejo ACE2-B0AT1 fue sustancialmente mayor que la de los RBD, que están en la periferia
del complejo (Fig. 3A). Para mejorar la resolución local, se aplicó un refinamiento enfocado, lo
que nos permitió alcanzar una resolución de 3.5 Å para el RBD, lo que permite un modelado y
análisis confiables de la interfaz (Fig. 3, figs. S5 a S7 y tabla S1) .

Interfaz entre RBD y ACE2

Como se esperaba, cada PD acomoda un RBD (Fig. 3B). La interfaz general es similar a la
existente entre el SARS-CoV y ACE2 (7, 8), mediada principalmente por interacciones polares
(Fig. 4A). Una región de bucle extendido del RBD abarca la hélice α1 en forma de arco del
ACE2-PD como un puente. La hélice α2 y un bucle que conecta las cadenas antiparalelas β3 y
β4, denominadas Loop 3-4, de la EP también contribuyen de manera limitada a la coordinación
de la RBD.
El contacto se puede dividir en tres grupos. Los dos los extremos del "puente" interactúan con
los extremos amino (N) y carboxilo (C) de la hélice α1, así como con pequeñas áreas en la
hélice α2 y el Loop 3-4. El segmento medio de α1 refuerza la interacción al enganchar dos
residuos polares (Fig. 4A). En el extremo N de α1, Gln498, Thr500 y Asn501 del RBD forman
una red de enlaces de hidrógeno (enlaces H) con Tyr41, Gln42, Lys353 y Arg357 de ACE2
(Fig. 4B). En el medio del "puente", Lys417 y Tyr453 del RBD interactúan con Asp30 e His34
de ACE2, respectivamente (Fig. 4C). En el C ter-menos de α1, Gln474 de RBD está unido por
H a Gln24 de ACE2, mientras que Phe486 de RBD interactúa con Met82 de ACE2 a través de
las fuerzas de van der Waals (Fig. 4D).

Comparación de las interfaces SARS-CoV-2 y SARS-CoV con ACE2

La superposición de la RBD en el complejo de SARS-CoV (SARS-CoV-RBD) y ACE2-PD

(código PDB: 2AJF) con la RBD en nuestro complejo ternario muestra que el SARS-CoV-2
RBD (SARS-CoV-2 -RBD) es similar al SARS-CoV-RBD con una desviación cuadrática media
de raíz (RMSD) de 0.68 Å sobre 139 pares de átomos de Cα (Fig. 5A) (8). A pesar de la
similitud general, se encuentran varias variaciones de secuencia y desviaciones
conformacionales en sus respectivas interfaces con ACE2 (Fig. 5 y Fig. S8). En el extremo N
de α1, se observan las siguientes variaciones, Arg426 → Asn439, Tyr484 → Gln498 y Thr487
→ Asn501, en posiciones equivalentes entre SARS-CoV-RBD y SARS-CoV-2-RBD (Fig. 5B) .
Se observan más variaciones en el medio del puente. La alteración más destacada es la
sustitución de Val404 en el SARS-CoV-RBD con Lys417 en el SARS-CoV-2-RBD. Además,
desde SARS-CoV-RBD a SARS-CoV-2-RBD, la sustitución de los residuos de la interfaz,
Tyr442 → Leu455, Leu443 → Phe456, Phe460 → Tyr473 y Asn479 → Gln493, también
pueden cambiar la afinidad por ACE2 (Fig. . 5C). En el término C de α1, Leu472 en el SARS-
CoV-RBD es reemplazado por Phe486 en el SARS-CoV-2-RBD (Fig. 5D).

Discusión

Aunque ACE2 es un chaperón para B0AT1, nuestro enfoque está en ACE2 en este estudio.
Con la estabilización por B0AT1, dilucidamos la estructura del ACE2 de longitud completa.
B0AT1 no participa en la dimerización, lo que sugiere que ACE2 puede ser un homodímero
incluso en ausencia de B0AT1. Un examen más detallado sugiere que un ACE2 dimérico
puede acomodar dos trímeros de proteína S, cada uno a través de un monómero de ACE2 (fig.
S9). La estructura trimérica de la proteína S del SARS-CoV-2 se informó recientemente, con un
RBD en conformaciones "arriba" y dos en "abajo" (código PDB: 6VSB) (14). La PD choca con el
resto de la proteína S cuando el complejo ternario está alineado con el RBD de la conformación
"descendente". No hay conflicto cuando el complejo se superpone al RDB "arriba", con un
RMSD de 0.98 Å sobre 126 pares de átomos de Cα, lo que confirma que se requiere una
conformación "arriba" de RDB para unirse al receptor (fig. S9) ( 14).

La escisión de la proteína S del SARS-CoV se ve facilitada por la catepsina L en los

endosomas, lo que indica un mecanismo de endocitosis mediada por receptores (10). Se
requiere una caracterización adicional para examinar las interacciones entre ACE2 y la
partícula vi-ral, así como el efecto de los cofactores en este proceso (25, 33). Queda por
investigar si existe agrupación entre las proteínas diméricas ACE2 y triméricas S, lo que puede
ser importante para la invaginación de la membrana y la endocitosis de la partícula viral, un
proceso similar a otras endocitosis mediadas por receptores.

La escisión del segmento C-terminal, especialmente los residuos 697 a 716 (fig. S4), de ACE2
por proteasas, como la proteasa transmem-brana serina 2 (TMPRSS2), mejora la entrada viral
impulsada por la proteína S (34, 35). Los residuos 697-716 forman la tercera y cuarta hélices
en el dominio del cuello y se asignan a la interfaz dimérica de ACE2. La presencia de B0AT1
puede bloquear el acceso de TMPRSS2 al sitio de corte en ACE2. La expresión distribución de
ACE2 es más amplia que B0AT1. Además de los riñones y el intestino, donde B0AT1 se
expresa principalmente, ACE2 también se expresa en los pulmones y el corazón (27). Queda
por probar si B0AT1 puede suprimir la infección por SARS-CoV-2 al bloquear la escisión de
ACE2. Se han informado infecciones entéricas para el SARS-CoV, y posiblemente también
para el SARS-CoV-2 (36, 37). También se ha demostrado que B0AT1 interactúa con otro
receptor de corona-virus, la aminopeptidasa N (APN o CD13) (38). Estos hallazgos sugieren
que B0AT1 puede desempeñar un papel regulador para las infecciones entéricas de algunos
coronavirus.

La comparación de las interfaces de interacción de SARS-CoV-2-RBD y SARS-CoV-RBD con

ACE2 revela algunas variaciones que pueden fortalecer las interacciones entre SARS-CoV-2-
RBD y ACE2, y otras que probablemente reduzcan la afinidad en comparación con el SARS-
CoV-RBD y ACE2. Por ejemplo, el cambio de Val404 a Lys317 puede resultar en una
asociación más estrecha debido a la formación de puentes de sal entre Lys317 y Asp30 de
ACE2 (Figs. 4C y 5C). El cambio de Leu472 a Phe486 también puede hacer un contacto más
fuerte de van der Waals con Met82 (Fig. 5D). Sin embargo, el reemplazo de Arg426 a Asn439
parece debilitar la interacción al perder un importante puente de sal con Asp329 en ACE2 (Fig.
5B).

En resumen, nuestro trabajo estructural revela las estructuras de alta resolución de ACE2 de
longitud completa en un ensamblaje dimérico. Al acoplar el trímero de proteína S en la
estructura del dímero ACE2 con RBD de la proteína S unida, se sugiere la unión simultánea de
dos trímeros de proteína S a un dímero ACE2. El diseño racional basado en la estructura de los
aglutinantes con afinidades mejoradas para ACE2 o la proteína S de los coronavirus puede
facilitar el desarrollo de ligandos señuelo o anticuerpos neutralizantes para la supresión de la
infección viral.

Consecuencias (no en el artículo sino derivadas del mismo):

(1) Los pacientes con diabetes tipo I o II, e hipertensos tienen sobreexpresión de ACE2.

(2) La expresión de ACE2 se incrementa con tiazolidinodionas para diabetes, inhibidores ACE
(priles) para hipertensión, bloqueadores Angiotensina II (sartanes), e IBUPROFENO. Esos
fármacos incrementan el ACE2 y abren las puertas a la expansión del virus.

(3) Pacientes hipertensos con COVID-19 deberían controlar su hipertensión con bloqueadores
de los canales de calcio (dipinos), que no incrementan el ACE2.

(4) No obstante el documento técnico del ministerio indica que:

Pag 10: Se ha observado que los casos graves de COVID-19 presentan niveles de
Angiotensina II muy elevados. Y el nivel de Angiotensina II se ha correlacionado con la carga
viral de SARS-CoV-2 y el daño pulmonar. Este desequilibrio del sistema renina-angiotensina-
aldosterona podría estar en relación con la inhibición de la ACE2 por parte del virus (59). Este
mismo efecto ya fue observado en el brote producido por SARS en 2003 (60,61).

Pag.16: Por otra parte, la reducción de los receptores ACE 2 y los altos niveles de Angiotensina
II se relacionan con la insuficiencia respiratoria y el distress respiratorio agudo (58). En los
casos graves de COVID-19, se han observado mayores niveles de Angiotensina II, lo que
puede estar en relación con la inhibición por parte del virus de la ACE 2. Este efecto ya
observado en otras infecciones que usan el mismo receptor, el SARS-CoV en 2003 y la
encefalitis por virus de la fiebre del Nilo occidental sugiere que el tratamiento con ARA II podría
resultar beneficioso en los casos graves de COVID-19.