Transcripción

reversa
Varias ADN polimerasas en procariontes (I, II y III, en E. coli)
y eucariontes (α,β,γ,δ y ε).

Algunas poseen varias actividades:

Polimerización 5’→3’
Degradación 5’→3’
Degradación 3’→5’
Técnicas empleadas para la cuantificación del ARNm

• Norther blot
• qPCR
• Serial analysis of gene expression (SAGE)
• Differential display (DD)
• RNA arbitrarily primer (RAP)-PCR
• Restriction endonucleolytic analysis of differentially
expressed sequences (READS)
• Amplified restriction fragment-length polymorphism
(AFLP)
• Suppression subtractive hybridization (SSH)
• Microarrays
• RNA-seq
Cuando se realiza qPCR, se usa una molécula fluorescente (reportero) como una medida
indirecta de la cantidad de ácido nucleico presente durante cada ciclo de amplificación. El
aumento de la señal fluorescente es directamente proporcional a la cantidad de
moléculas de producto de PCR (amplicones) que se acumulan exponencialmente durante
las fases repetitivas de la reacción

Es una técnica de cuantificación de RNA (cDNA) o DNA a partir de las señales de

fluorescencia que se emiten en la reacción, se cuantifica el ciclo en que la reacción
comienza a ser exponencial.
• Fluoróforos con afinidad a ADN

• Sondas especificas
Fluoróforos con afinidad a ADN
• SYBR Green en PCR presenta poca inhibición de la
reacción y una mayor sensibilidad de detección en
comparación con el bromuro de etidio.
1. SYBR se une inmediatamente a todo el ADN bicatenario
presente en la muestra

2. Durante la PCR, la ADN polimerasa amplifica la secuencia

diana que crea los productos de PCR

3. El SYBR luego se une a cada nueva copia de ADN bicatenario

4. A medida que avanza la PCR, se crea más producto de PCR. El

colorante SYBR® se une a todo el ADN bicatenario, por lo que
el resultado es un aumento en la intensidad de fluorescencia
proporcional a la cantidad de producto de PCR producido.
La principal desventaja es que puede generar señales falsas positivas; es decir, debido a que
el SYBR se une a cualquier ADN bicatenario, también puede unirse a secuencias de ADN
inespecíficas. Por lo tanto, es extremadamente importante tener oligos bien diseñados que
no amplifiquen secuencias diferentes, y que se realice un análisis de la curva melt.
Sondas específicas
Cuando el reportero y el apagador se encuentran próximos, el apagador absorbe
toda la fluorescencia del reportero. Cuando este par de moléculas se separa, la
fluorescencia del reportero no puede ser absorbida por el apagador y en
consecuencia puede ser detectada por el fotodetector
• Las sondas se pueden etiquetar con reporteros diferentes y distinguibles, lo que
permite la amplificación y detección de dos secuencias distintas en un tubo de
reacción
• Se elimina el procesamiento posterior a la PCR, lo que reduce la mano de obra del
ensayo y los costos de material.
Diseño de una sonda para qPCR

• La sonda debe estar muy cerca del cebador (F o R), pero no

debe solaparse con un sitio de unión del cebador en la misma
cadena, longitud: 20-30 bases

• Las sondas deben tener una Tm 6–8 ° C más alta que los
cebadores. Si la temperatura de fusión es demasiado baja, el
porcentaje de sonda unida al objetivo será bajo

• Contenido de GC de 35-65%

• Evitar G en el extremo 5´
Quencher

• Los "apagadores" tradicionales absorben

ampliamente y no emiten luz, lo que permite
el uso de múltiples reporteros con el mismo
apagador. Esta característica permite opciones
ampliadas para ensayos multiplex.

• Reducen las señales cruzadas, simplificando la

detección de fluorescencia del reportero

• Ejemplos de apagadores oscuros incluyen

Black Hole Quenchers y Iowa Black FQ y RQ.
Si en un ensayo dúplex empleamos una sonda marcada con FAM (emite a baja longitud de
onda) y una sonda marcada con Cy5 (emite a longitud de onda alta), tenemos que
asegurarnos que el quencher absorva en el rango de longitud de los reporteros
Inicialmente, la fluorescencia permanece en niveles de fondo, y los aumentos en la
fluorescencia no son detectables (ciclos 1-18) a pesar de que el producto se acumula
exponencialmente. Finalmente, se acumula suficiente producto amplificado para
producir una señal de fluorescencia detectable. El número de ciclo en el que esto
ocurre se llama ciclo de cuantificación o Cq
El valor Ct (por sus siglas en inglés threshold cycle) indica umbral, es
decir el ciclo en el que se inicia la fase exponencial de la PCR. El
umbral debe estar por arriba de la fase de ruido
EVALUACIÓN DE UN FÁRMACO SOBRE LA EXPRESIÓN DE UN GEN DE INTERÉS
Análisis de la expresión génica:
normalización con un gen constitutivo
DETERMINACIÓN DEL GEN DE REFERENCIA
EXPRESIÓN DE DOS GENES EN CONTROL vs TRATADO
Considerar

Sub-muestreo