s41598 019 56099 6.en - Es

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abierto La bioaumentación no logró mejorar

biorremediación de petróleo en tres suelos
muestras de tres diferentes

continentes
Samir S. Radwan 1,2 *, DinaM.Alabama-METROAilem1 * yMayada K. Kansour1
Las muestras de suelo de Kuwait, Líbano, Egipto y Alemania estaban contaminadas con un 3% de petróleo crudo. Se
dejó una serie de muestras sin bioaumentar, otras se bioaumentaron con suelo del desierto de Kuwait con una larga
historia de contaminación por hidrocarburos y otras con material bioincrustante marino kuwaití. En las muestras de
Kuwait, Egipto y Alemania, la bioaumentación no mejoró la remoción de petróleo, mientras que sí lo hizo en la muestra
del Líbano. Los taxa de los lotes bioaumentados de suelo desértico, pero ninguno de los de los bioaumentados con
material bioincrustante, logró colonizar el cuatro suelos estudiados. Se monitoreó la dinámica de las comunidades
hidrocarbonoclasticas durante la biorremediación. Estas comunidades diferían en composición, no solo según el tipo de
suelo, sino también por el mismo suelo; en varias fases de la biorremediación. Aunque cada suelo parecía tener su
microflora característica, todos eran similares en albergar actinomicetos y pseudomonas inferiores y superiores,
además de muchos otros taxones. Ninguno de los taxones prevaleció en todas las fases de la biorremediación. El
aislado más poderoso en la remoción de aceite; estabaRhodococcus erythropolis (Alemania), y la más débil fue
Arthrobacter phenanthrenivorans (Líbano) Los aislados hidrocarbonoclasticos puros toleraron concentraciones de
aceite inusualmente altas, hasta un 30%.
Se están produciendo, procesando y utilizando cantidades cada vez mayores de petróleo crudo en todo el mundo como fuente de energía.
Según estimaciones anteriores, entre el 0,08 y el 0,4% del petróleo mundial se derrama contaminando el medio marino.1. Dado que las
estimaciones anteriores son cada vez más altas, y también que los ecosistemas terrestres y atmosféricos reciben una gran proporción de la
contaminación por petróleo, el petróleo crudo derramado y sus productos procesados a nivel mundial representan un gran peligro
ambiental. Se sabe que el petróleo y los productos derivados del petróleo son lentamente biodegradables.2 y muchos hidrocarburos
constituyentes, especialmente los poliaromáticos, son tóxicos, cancerígenos o genotóxicos.3,4.
Los enfoques de remediación química y física no suelen ser rentables5, y no siempre son seguros para el medio
ambiente. Por el contrario, la tecnología de biorremediación6,7 supera estas desventajas, haciendo uso del potencial de
biodegradación de los microorganismos hidrocarbonoclásticos naturales en la digestión de contaminantes de
hidrocarburos y aceites.
Para la biorremediación, se conocen dos enfoques distintos. La primera es la bioaumentación (también llamada siembra o
inoculación). En este enfoque, los microorganismos hidrocarbonoclasticos exógenos se introducen en el sitio contaminado.8,9. El
segundo enfoque es la bioestimulación. Implica potenciar las actividades hidrocarbonoclásticas de los microorganismos que ya
habitan el sitio contaminado mediante gestiones específicas.6,10,11. Por lo tanto, la bioaumentación, pero no la bioestimulación,
implica la adición de más grupos de genes a los ya existentes.12, y los microorganismos recién introducidos tienen que resistir el
estrés competitivo ejercido por los microorganismos nativos13. Si esto fallara, la actividad de biorremediación no mejoraría o
incluso podría inhibirse. En una publicación anterior, nuestro grupo demostró que el hidrocarburo-clástico bioaumentado
Arthrobacter cepas importadas de Alemania no colonizaron los suelos kuwaitíes contaminados por petróleo, mientras que
Arthrobacter las cepas las colonizaron con éxito14.
Una pregunta que aún debe responderse está relacionada con qué microorganismos son los mejores para la bioaumentación
de ambientes aceitosos. Los estudios en este campo son numerosos; Se suelen utilizar cultivos simples o mixtos de
microorganismos hidrocarbonoclasticos o productos naturales ricos en ellos.15. Hay cocteles de hidrocarbonoclastico
1Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias, Universidad de Kuwait, PO Box 5969, Safat, 13060, Kuwait.
2Dirección
actual: Von EinemStr. 25, 48159, Münster, Alemania. *Email:samir.radwan@ku.edu.kw; dina.almailem @
ku.edu.kw
INFORMES CIENTÍFICOS | (2019) 9: 19508 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-56099-2 1

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Muestra UFC×105 gramo-1 Especies constituyentes % del total

Tierra
Rhodococcus jostii 61,9

Streptomyces griseoflavus 14,2
Kuwait 18±0,9
Streptomyces pluripotens 12,5
Pseudomonas composti 11,4
Sphingomonas kyeonggiensis 53,7
Streptomyces bambusae 31,7
Streptomyces racemochromogenes 5.5
Líbano 15±0,7 Rhodococcus globerulus 2.8
Saccharothrix saharensis 2.8
Saccharomonospora azurea 2.1
Arthrobacter agilis 1.4
Nocardia neocaledoniensis 35,7
Egipto 3±0,1
Streptomyces scopiformis 17,9
Streptomyces bambusae 10,7
Microbacterium ginsengiterrae 35,7
Streptomyces bambusae 31.0
Rhodococcus tukisamuensis 11,9
Alemania 13±0,6 Nocardia fluminea 9.5
Psychrobacter muriicola 7.1
Salinicoccus hispanicus 4.0
Materiales de bioaumentación
Pseudoxanthomonas japonensis 66,0

Suelo aceitoso del desierto 5±0,2 Pseudomonas hunanensis 20,7
Bosea massiliensis 13,3
Pontibaca metilaminivorans 44,8
Planococcus maritimus 28,1
Material de bioincrustación marina 264±14
Pseudoalteromonas undina 27,0
Pseudoalteromonas atlantica 0,1
Tabla 1. Comunidades bacterianas hidrocarbonoclasticas en las muestras de suelo prístino y los materiales de bioaumentación.
Los valores son medias de 3 determinaciones repetidas±Desviación Estándar. En cada caso se realizaron cinco aislamientos
representativos.
microorganismos disponibles comercialmentedieciséis,17. En los últimos años, el término bioaumentación autóctona (ABA),
acuñado por Ueno18, se ha vuelto popular y en el que solo los organismos autóctonos del sitio contaminado se utilizan
para una biorremediación exitosa11,19,20. Los habitantes autóctonos son aquellos perfectamente adaptados al entorno y
que, por tanto; contribuir significativamente a las actividades bioquímicas allí21. Los habitantes alóctonos están presentes
transitoriamente en el medio ambiente, que no es su hábitat natural. Por lo tanto, no se usan para bioaumentación
porque solo realizan actividades bioquímicas limitadas, solo las suficientes para que sobrevivan.
Con estos hechos en mente, recolectamos muestras de suelo de 3 continentes diferentes, las contaminamos con aceite y las
bioaumentamos con materiales locales kuwaitíes ricos en microorganismos hidrocarbonoclasticos. Se utilizaron muestras no
bioaumentadas como controles. Durante 6 meses, se monitoreó el destino del petróleo y la dinámica de la población microbiana
en estos suelos. También estudiamos la capacidad de colonización de cultivos bacterianos puros que aislamos de los materiales de
bioaumentación en las muestras de suelo tratadas, así como la tolerancia al aceite y el consumo de aceite por aislamientos
representativos. Los objetivos eran investigar la viabilidad de la bioaumentación como un enfoque de biorremediación y
profundizar nuestra comprensión de los términos bioaumentación autóctona y alóctona.
Resultados
Comunidades microbianas hidrocarbonoclasticas en los suelos prístinos y bioaumentación mate-
riales. Mesa 1 presenta los resultados del análisis de las bacterias hidrocarbonoclasticas en las cuatro muestras de suelo prístino
(sin aceite añadido) estudiadas y los dos materiales de bioaumentación. Las unidades formadoras de colonias (UFC), contadas con
un medio mineral sólido con vapor de aceite como única fuente de carbono y energía.22, osciló en números entre 3±0,1×105 gramo-1
para la muestra egipcia y 18±0,9×105 gramo-1 para la muestra de Kuwait. Los números de UFC para los dos materiales de
bioaumentación estudiados de Kuwait fueron 5±0,2×105 gramo-1 para el suelo aceitoso del desierto y 264±14×105 gramo-1 para el
material bioincrustante marino.
Cada una de las cuatro muestras de suelo estudiadas y los dos materiales de bioaumentación tenían su composición de
comunidad microbiana característica. Por lo tanto, la prístina muestra de suelo kuwaití contenía como predominante

Figura 1. Remoción de petróleo crudo en cuatro muestras de suelo no bioaumentado y bioaumentado durante la
biorremediación a escala de banco. Cada valor fue la media de tres réplicas paralelas.
bacterias hidrocarbonoclasticas Rhodococcus jostii y Streptomyces griseoflavus, la muestra libanesa, Sphingomonas

kyeonggiensis y Streptomyces bambusae, la muestra egipcia, Nocardia neocaledoniensis, Sphingomonas kyeonggiensis
y 2 Streptomyces spp. y la muestra alemana, Microbacterium ginsengiterrae y Streptomyces bambusae. Es de destacar
que cada una de las cuatro muestras contenía Streptomyces especie como socio hidrocarbonoclástico predominante.
Sphingomonas kyeonggiensis, una de las dos especies predominantes en las muestras libanesa y egipcia, apareció como
una especie menor en la muestra alemana, pero no se detectó en la muestra kuwaití. Similar,Streptomyces bambusae,
una de las especies dominantes en las muestras libanesa y alemana se presentó como constituyente menor en la
muestra egipcia y estuvo ausente en la muestra kuwaití. Las comunidades bacterianas en los dos materiales de
bioaumentación eran bastante diferentes en composición entre sí y de las cuatro muestras de suelo estudiadas.
biorremediación de petróleo en muestras de suelo no bioaumentado y bioaumentado. Figura 1 muestra que el

petróleo crudo que se había mezclado con las cuatro muestras de suelo se biodegradó gradualmente a lo largo de los 6 meses de
biorremediación. El análisis de covarianza (ANCOVA) mostró que en todos los casos, el tiempo fue un predictor significativo del
consumo de aceite. En el suelo de Kuwait, las medias de los valores de consumo de aceite no fueron significativamente diferentes
entre las muestras no bioaumentadas y bioaumentadas mientras se controlaba el efecto de la covariante (tiempo). Lo mismo
ocurrió con el suelo egipcio. Sólo en el suelo libanés, las formas de consumo de aceite en ambas muestras bioaumentadas fueron
significativamente diferentes de las del control no bioaumentado, pero los derrames no. Para el suelo alemán, la bioaumentación,
especialmente con material bioincrustante, redujo significativamente los valores de biodegradación del aceite en comparación con
el control no bioaumentado. Los valores P y las estadísticas F, etc., están disponibles en la salida de la Tabla S1 en el Archivo
complementario. También están disponibles las correspondientes parcelas ANCOVA. La trama fue producida por el paquete R
"HH" (3.1.37) con la funciónancovaplotFig. S1).
Figura 2 ilustra los cambios en el número de UFC en las muestras estudiadas durante la biorremediación. Comparando los
números de CFU en las muestras de suelo prístino sin adición de aceite (en la Tabla1) con los números en los lotes no
bioaumentados tratados con aceite en el tiempo cero (Fig. 2) revela que la mera presencia de petróleo aumentó instantáneamente
el número de bacterias hidrocarbonoclásticas en 18, 35, 3 y 6 veces en los suelos kuwaitíes, libaneses, egipcios y alemanes,
respectivamente. Los números en todas las muestras disminuyeron significativamente (ANOVA, n = 5,P <0.05) durante los
primeros 2 meses de biorremediación pero aumentó significativamente (ANOVA, n = 5, P <0.05) en el tercer y cuarto mes
cronológicamente con las tasas máximas de remoción de aceite (ANOVA, n = 5, P <0,05). Durante los últimos 2 meses de
biorremediación, el número de UFC disminuyó significativamente en todas las muestras (ANOVA, n = 5,P <0,05).
Efectos de tratamientos específicos en estructuras de comunidades bacterianas enteras durante la biorremediación.

ción. Figura 3 presenta una gráfica de escala multidimensional no métrica (nMDS) que muestra similitudes porcentuales
de la abundancia de las comunidades bacterianas. Mesa2 resume el análisis de los resultados de similitud entre los
suelos de control no bioaumentados por un lado y los suelos bioaumentados con suelo desértico aceitoso y material
bioincrustante por otro lado. En todo el conjunto de datos, hubo cierta separación por ubicación que fue
estadísticamente significativa (ANOSIM, R = 0.355, P = 0.001). No hubo diferencias significativas entre las muestras de
control de ninguno de los países estudiados y las bioaumentadas con suelo desértico aceitoso; sin embargo, hubo una
diferencia débil pero estadísticamente significativa con los suelos bioaumentados con material bioincrustante en los
suelos alemán, kuwaití y libanés; con una variación más débil y menos significativa en el suelo egipcio. Mesa2 incluye el
análisis detallado de similitudes (ANOSIM).
Dinámica de especies bacterianas durante la biorremediación de los cuatro suelos estudiados. Las Figuras
S2-S5 del Archivo Complementario muestran la composición de las comunidades hidrocarbonoclasticas así como su
rotación en relación a su origen, bioaumentación y tiempo. Escaneando los gráficos en las Figs. S2 – S5 de arriba a abajo
revela los efectos del tiempo y de izquierda a derecha, los efectos de los tratamientos de bioaumentación. El efecto del
origen microbiano se revela al comparar las 4 cifras juntas. En este contexto, la diferenciación entre

Figura 2. Cambios en el número de UFC de bacterias hidrocarbonoclasticas en las cuatro muestras de suelo durante la
biorremediación de petróleo a escala de laboratorio. Cada valor fue la media de cinco réplicas paralelas.
Figura 3. Gráfico de nMDS que muestra el porcentaje de similitudes de la abundancia de las comunidades bacterianas estudiadas. Los
colores representan los países de origen (azul claro, Kuwait; rojo, Líbano; verde, Egipto; azul oscuro, Alemania). Las formas representan
tratamientos (X, control; cuadrado, suelo del desierto de Kuwait; triángulo, material de bioincrustación). Los datos se sometieron a una
matriz de similitud de Bray Curtis, trazo MDS 2D tensión 0.1.
las cepas nativas e inoculadas pueden deducirse de las Figs. S2-S5 comparando las identidades microbianas en las
muestras bioaumentadas y no bioaumentadas en el tiempo cero.
Dinámica de las bacterias en el suelo de Kuwait. En los lotes no bioaumentados del suelo kuwaití en el momento cero,
las bacterias predominantes fueron Rhizobium alkalisoli (cepa, s.1) y, aunque en menor medida, Pseudoxanthomonas japonensis (
s.3) (Fig. S2). Un mes despues,Sphingopyxis fribergensis (s.21) asumió el predominio junto con Pseudomonas aeruginosa (s.14).
Ninguno de los taxones se registró en el momento cero. Después de 2 meses, otro grupo
vz Sagittula stellata (s.36), Pseudoxanthomonas japonensis (s.3) y Pseudoxanthomonas mexicana (s.4) predominaba; la
segunda especie se registró en el momento cero. En los meses 3, 4, 5 y 6, durante los cuales la mayor parte del aceite

Origen de la muestra Bioaumentado con R valor Significado

Suelo aceitoso del desierto -0.071 0,79
Kuwait (control)
Material bioaumentado 0.328 0,006
Suelo aceitoso del desierto 0,06 0,67

Líbano (control)
Material bioaumentado 0,298 0,002
Suelo aceitoso del desierto 0,024 0,35

Egipto (control)
Material bioaumentado 0,132 0,098
Suelo aceitoso del desierto -0.104 0,85

Alemania (control)
Material bioaumentado 0.302 0,003
Tabla 2. Análisis de resultados de similitud entre controles no bioaumentados y muestras bioaumentadas con suelo desértico
aceitoso y material bioincrustante.
ha sido eliminado, Pseudoxanthomonas japonensis (s.3), Xanthobacter flavus (s.46), Lacibacterias quatil (s.49) y
Bacillus thioparans (s.28) predominaron, respectivamente.
En los lotes bioaumentados de suelo aceitoso, prevalecieron patrones de predominio bastante similares a los de los
lotes no bioaumentados en el tiempo cero y después de 1, 2, 4 y 6 meses. Después de 3 meses,Kocuria polaris (s.40)
predominó y después de 5 meses, Pseudomonas mendocina (s.15) y Mycobacterium vanbaalenii (s.33) prevaleció. En los
lotes de biofouling-material bioaumentado, hubo similitudes en los patrones de predominio, pero solo en el tiempo cero
y después de 5 y 6 meses de biorremediación. Entre los meses 1 y 4, especies pertenecientes al género
Pseudomonas, Sphingopyxis, Mycobacterium y Tistrella predominó.
Dinámica de bacterias en suelo libanés. En la muestra no bioaumentada en el tiempo cero, Arthrobacter

phenanthrenivorans (s.1) y A. ginsengisoli (s.2) predominaba (Fig. S3 en el Archivo Complementario). Después de un mes,
Sphingobium quisquiliarum (s.15), y después de dos meses, las 3 especies Cellulomonas massiliensis (s.38),
Actinotalea ferrariae (s.36) y Azospirillum doebereinerae (s.19) prevaleció. Después de 3 y 4 meses,Pseudomonas
hunanensis (s.32) asumió el predominio absoluto. Después de 5 meses;Actinotalea ferrariae (s.36) y
Roseomonas aestuarii (s.45) y después de 6 meses; Pseudomonas benzenivorans (s.34), fueron las cepas más
dominantes.
Los lotes de suelo aceitoso-desértico bioaumentado también mostraron patrones de predominio similares a los de
los lotes sin bioaumentar. Por otro lado, las muestras bioaumentadas de material de bioincrustación marina exhibieron
en la mayoría de las fases de biorremediación patrones de predominio bastante diferentes (con la única excepción de los
lotes de 5 meses). Así, las especies marinasPsychrobacter piscatorii (s.8) yMarinobacter adhaerens (s.10) prevaleció en el
tiempo cero. Después de un mes,Actinotalea ferrariae (s.36) predominaba. Después de dos, tres y cuatro meses,
Georgenia daeguensis (s.42), Tessaracoccus oleiagri (s.47) y Papilomatosis de Dietzia (s.41) prevalecieron,
respectivamente. En los últimos meses, 5 y 6,Actinotalea ferrariae (s.36) retomó el predominio. Es de destacar que esta
última cepa fue uno de los taxones predominantes en los lotes bioaumentados de suelo desértico aceitoso y no
bioaumentado.
Dinámica de bacterias en suelo egipcio. En el lote no bioaumentado en el momento cero, 3 taxones,

Arthrobacter flavus (s.1), Streptomyces lateritius (s.7) y Nocardioides luteuss.4) prevaleció (Fig. S4 en el archivo
complementario). Un mes despues,Paenibacillus lautus (s.15) y Pseudomonas knackmussii (s.26) predominó.
Después de dos meses, las 3 pseudomonas,P. monteilii (s.30), P. benzenivorans (s.31) y P. knackmussii (s.26)
asumió el predominio. Al tercer mes, otras 3 cepas,Mycobacterium vanbaalenii (s.38), Zavarzinia compransoris (
s.43) y Streptomyces griseoflavus (s.11) predominó. En el mes 4,Mycobacterium vanbaalenii
(art. 38) junto con Pseudomonas hunanensis (s.32) también prevaleció. En los últimos dos meses,Zavarzinia compran-
soris (s.43), junto con Pseudomonas spp., predominó de nuevo.
Las cepas predominantes en los lotes no bioaumentados también prevalecieron en los lotes bioaumentados de suelos
desérticos aceitosos: después de un mesPseudomonas knackmussii, s.26), cuatro meses (Mycobacterium vanbaalenii, s.38), cinco
meses (Pseudomonas aeruginosa, s.33) y seis meses (Zavarzinia compransoris, s.43). Por otro lado, los lotes bioaumentados de
material bioincrustante marino mostraron patrones de predominio bastante diferentes. Por lo tanto,
Arthrobacter phenanthrenivorans (s.2), Streptomyces leeuwenhoekii (s.8), Bacillus cavernae (s.20) y Psychrobacter
pacificensis (s.22) prevaleció en el momento cero, Pseudomonas aestusnigri (s.29), Algoriphagus olei (s.36) y Citreicella
marina (s.37) después de un mes, Actinotalea ferrariae (s.42), Pseudomonas knackmussii (s.26) y Streptomyces atrovirens
(s.12) después de dos meses, Mycobacterium vanbaalenii (s.38) y Pseudomonas aeruginosa (s.33) después de tres meses,
Pseudomonas songnenensis (s.27), Gracilibacillus ureilyticus (s.46) yMarinobacter algicola (s.24) después de cuatro
meses, Kocuria dechangensis (s.47), Pseudomonas aeruginosa (s.33) y Streptomyces leeuwenhoekii
(s.8) después de cinco meses y Bacillus oceanisediminis (s.21), Actinotalea ferrariae (s.42) y Streptomyces leeuwenhoekii
(s.8) después de seis meses.
Dinámica de bacterias en suelo alemán. En el lote no bioaumentado en el momento cero, Rhodopseudomonas

pseudopalustris (s.1) y Sphingomonas kyeonggiensis (s.2) fueron predominantes (Fig. S5 en el Archivo Complementario).
Un mes despues,Xanthobacter flavus (s.23), Acidovorax facilis (s.24) y Rhodococcus erythropolis (s.7) prevaleció. Después
de dos meses,Xanthobacter flavus (s.23) y Nocardia flumineas.3) predominaba. Después de tres meses,
Rhodococcus erythropolis (s.7) asumió el predominio y fue reemplazado por Zavarzinia compransoris (s.32)

Figura 4. Las concentraciones de aceite más altas toleradas por los aislamientos bacterianos hidrocarbonoclásticos de los cuatro
suelos estudiados (aislamientos 1–11) y los dos materiales de bioaumentación (aislamientos 12–15). 1,Rhodococcus jostii;
2, Streptomyces griseoflavus; 3, Streptomyces bambusae; 4, Nocardia neocaledoniensis; 5, Sphingomonas
kyeonggiensis; 6, Microbacterium ginsengiterrae; 7, Rhizobium alkalisoli; 8, Arthrobacter flavus; 9,
Arthrobacter phenanthrenivorans; 10, Arthrobacter ginsengisoli; 11, Rhodopseudomonas pseudopalustris; 12,
Pseudoxanthomonas japonensis; 13, Pseudomonas hunanensis; 14, Pontibaca methylaminivorans; 15, Planococcus maritimus.
Tenga en cuenta que esos organismos se distribuyen más ampliamente en las muestras estudiadas que en las fuentes
especificadas en la figura (para esto, véanse las Figs. S2-S5).
después de cuatro meses. Después de cinco meses, esta última especie compartió el predominio junto conRhodococcus
erythropolis (s.7), Streptomyces yaanensis (s.13) y Rhodococcus pedocola (s.10).
Las cepas predominantes en los lotes no bioaumentados también prevalecieron en los lotes bioaumentados de suelo aceitoso-
desértico en el tiempo cero y después de 2, 3, 4 y 6 meses. En los lotes de biofouling-material marino bioaumentado, el patrón de
predominio fue bastante diferente.Rhodococcus erythropolis (s.7) prevaleció durante el período de biorremediación de 6 meses
junto con otras especies: Microbacterium ginsengiterrae (s.15) y Paracoccus carotinifaciens
(s.20) en el momento cero, Mycobacterium hackensackense (s.18) y Pseudomonas knackmussii (s.27) después de un mes
yMicrobacterium schleiferi (s.16), Mycobacteriumhackensackense (s.18) y Gordonia amicalis (s.29) después de dos meses.
Del mes 3 al mes 6,G. amicalis (s.29) y Rhodococcus erythropolis (s.7) compartió el predominio junto con otras cepas:
Mycobacterium hackensackense (s.18) y Pseudomonas knackmussii (s.27) en un mes
3, Gordonia amicalis (s.29) y Zavarzinia compransoris (s.32) en el mes 4, Mycobacterium smegmatis (s.19) y
Pseudomonas songnenensis (s.28) en el mes 5 yMycobacteriumhackensackense (s.18) y Pseudomonas knack-
mussii (s.27) en el mes 6.
Las figuras S2-S5 en el archivo complementario revelan varias especies bacterianas que eran de ocurrencia común en más de
una de las cuatro muestras de suelo estudiadas. Así, el suelo libanés albergaba 9 especies que se encontraban en el suelo kuwaití
(cepas 7, 12, 16, 17, 20, 33, 34, 43, 44). El suelo egipcio contenía 21 especies que existían también en los otros suelos (cepas 8, 12,
14, 16, 17, 27, 33, 46, 48, 52, 53, 55, 61, 62, 70, 71, 74, 75 79, 80, 88). El suelo alemán albergaba 12 especies que también habitaban
los otros 3 suelos (cepas 6, 43, 46, 61, 62, 71, 74, 75, 79, 88, 96, 105). La Fig. S5 en el archivo complementario presenta gráficos
microscópicos típicos de los 18 aislamientos predominantes de las muestras de suelo estudiadas.
Colonización del suelo por bacterias que habitan los materiales de bioaumentación. Células de las 3 culturas
puras de Pseudoxanthomonas japonensis, Pseudomonas hunanensis y Boseamassiliensis (del suelo aceitoso del desierto de
Kuwait) colonizaron eficazmente las muestras de suelo prístino cuando se inocularon como suspensiones en agua estéril. Por lo
tanto, el total de UFC deP. japonensis en el suelo bioaumentado varió en números entre 0,6 y 1,3×106gramo-1, de P. hunanensis
superó 6×106gramo-1 y de B. massiliensis entre 2 y 4×106gramo-1. Por otro lado, las células de las tres cepas probadas, Planococcus
maritimus, Pseudoalteromonas undina y Pontibaca metilaminivorans (del material marino-bioincrustante) fracasó completamente
en colonizar las muestras de suelo prístino.
Tolerancia al aceite y consumo de aislados puros representativos. Debido a la extensa configuración experimental,
este estudio se realizó en cepas representativas que habían sido aisladas de las muestras de suelo prístino y biorremediadas y de
los materiales de bioaumentación. Figura4 muestra las concentraciones de petróleo crudo más altas toleradas por las cepas
individuales probadas. Rhizobiumalkalisoli, que predominó en los lotes de suelo kuwaití en el momento cero, toleró sólo hasta un
1%, p / v, de aceite. Todas las demás cepas tenían un potencial de tolerancia al aceite mucho mayor. Las cepas de bioaumentación
del suelo aceitoso del desierto (material de bioaumentación),Pseudoxanthomonas japonensis y Pseudomonas hunanensis (que
ocurrió también en muchos de los lotes de muestras de suelo, ver Figs. S2 – S5

Figura 5. Perfiles de GLC de petróleo crudo recuperados de cultivos de aislados puros que crecieron durante 10 días en un medio
mineral que contenía 0.3% de aceite. (a) petróleo crudo en el tiempo cero, (B) aceite recuperado deRhizobium alkalisoli lote de
cultivo,C) aceite recuperado deXanthobacter flavus lote de cultivo,D) aceite recuperado dePseudomonas hunanensis
lote de cultivo,mi) aceite recuperado dePapilomatosis por Dietzia lote de cultivo,F) aceite recuperado deArthrobacter
phenanthrenivorans lote de cultivo,gramo) aceite recuperado deArthrobacter flavus lote de cultivo,h) aceite recuperado de
Mycobacterium vanbaalenii lote de cultivo,I) aceite recuperado deRhodococcus erythropolis lote de cultivo,j)
aceite recuperado deMicrobacterium ginsengiterrae lote de cultivo,k) aceite recuperado deZavarzinia compransoris
lote de cultivo,l) aceite recuperado dePseudoxanthomonas japonensis lote de cultivo. Tenga en cuenta que esos aislamientos tienen una
amplia distribución entre las muestras estudiadas (véanse las figuras S2-S5). Los valores de los perfiles individuales son los de los valores de
consumo de aceite; eran medios de 3 réplicas,±valores de desviación estándar.
en el archivo complementario) toleraron hasta un 6 y 7% de aceite, respectivamente, mientras que Pontibacametilaminivorans del material
biofouling marino tolerado hasta un 5% de aceite. Siete de las cepas probadas que también se distribuyeron ampliamente en las cuatro
muestras de suelo estudiadas toleraron hasta un 30% de aceite, la concentración más alta probada en este experimento.
Los perfiles típicos de GLC de aceite residual en cultivos de 10 organismos representativos que también fueron de
amplia distribución en las muestras de suelo estudiadas mostraron que los taxones probados variaban en su potencial
de consumo de aceite (Fig. 5). El menor potencial de consumo del 18,3% fue el deArthrobacter phenanthrenivorans, que
habitaba suelos libaneses y egipcios. El mayor potencial de consumo del 90,6% fue el deRhodococcus erythropolis
que predominó en la muestra de suelo alemán en todas las etapas de autolimpieza y biorremediación. Las cepas
restantes consumieron entre el 35 y el 60% del aceite. La distribución de esas cepas probadas en los diversos lotes de
biorremediación se ilustra en las Figs. S1 – S4 en el archivo complementario.
Discusión
En la literatura, todavía hay mucha contradicción con respecto a la efectividad de la bioaumentación en la lucha contra los derrames de
petróleo ambientales. Por ejemplo, algunos autores informaron que la inoculación de microorganismos adecuados en un sitio no es garantía
de una eliminación exitosa de contaminantes.23. Por otro lado, se informó que los hidrocarburos que contaminan las aguas residuales se
eliminaron drásticamente en respuesta a la bioaumentación del agua con un consorcio de bacterias.12.
Se sabe que los microorganismos inoculados se enfrentan a una dura competencia con la microflora nativa durante la colonización de un
medio ambiente, y en consonancia con esto, los intentos intensivos en el último siglo para inocular Azotobacter en el suelo como sustituto de
los fertilizantes nitrogenados químicos constantemente fallaron24.
Las comunidades bacterianas en este trabajo se estudiaron mediante un enfoque dependiente del cultivo en un medio con
vapor de aceite como única fuente de carbono. Aunque se sabe que este enfoque captura solo una pequeña parte de la
comunidad total, proporcionó la valiosa ventaja de capturar solo microorganismos hidrocarbonoclasticos. Un método
independiente de la cultura no proporcionaría esta ventaja. Por lo tanto, los aislamientos reportados en este estudio deben
considerarse como representantes predominantes de las comunidades bacterianas hidrocarbonoclasticas en las muestras
estudiadas.
El principal hallazgo del estudio actual es que las comunidades bacterianas hidrocarbonoclásticas nativas en tres muestras de
suelo de tres continentes diferentes produjeron una remoción de petróleo igual o mejor que cuando las muestras se habían
bioaumentado con suelo del desierto de Kuwait con una larga historia de contaminación por petróleo (autóctona bioaumentación)
o con un material de bioincrustación marina (bioaumentación alóctona). Un resultado bastante similar se describió en un estudio
reciente.25. La única excepción fue la muestra de suelo del Líbano. Un análisis cuidadoso de los resultados en las Figs.3
y S2-S5 en el archivo complementario muestra que esta muestra exhibió cierta "singularidad", lo que la hace bastante diferente de
las otras tres muestras. Por lo tanto, alrededor del 42% de los taxones hidrocarbonoclasticos que lo constituyen (Fig. S3) no
aparecieron en ninguna de las otras 3 muestras cuyos taxones "únicos" formaron solo alrededor del 24, 8 y 24% del total de
taxones en suelos de Kuwait, Alemania, respectivamente. Los aislados "únicos" del suelo del Líbano comprendían muchos
microorganismos acuáticos, p. Ej.Aquabacterium, Arcticibacter, Oceanobacillus e incluso un Escherichia sp. (cual

también es hidrocarbonoclastica26). Además, la lista de suelo libanés era la única libre de Bacillus spp. y era más
pobre que los demás en Streptomyces spp. y las nocardioformasNocardia, Nocardiopsis y Rhodococcus).
Aún más digno de mención es que el suelo libanés albergó durante la biorremediación los taxones hidrocarbonoclasticos
con el potencial de remoción de petróleo más débil. Por lo tanto, en el momento cero de la biorremediación, hubo dos
Arthrobacter especies que forman juntas> 96% del total de bacterias hidrocarbonoclásticas en el suelo libanés no
bioaumentado (Fig. S3). El más dominante;A. fenantrenivorans tenía el potencial de consumo de aceite más bajo de solo
18,3% (Fig. 5). Los organismos correspondientes en las muestras de Kuwait, Egipto y Alemania fueronRhizobium alkalisoli
(con 35,3% de consumo) y Rhodopseudomonas pseudopalustris (sin consumo de aceite medido). En el mes 3 (y
posteriores), cronológicamente con el consumo de aceite más efectivo, la cepa predominante en la muestra libanesa fue
Pseudomonas hunanensis (30,7% de consumo), mientras que en suelo kuwaití, Pseudoxanthomonas japonensis (32,9%
de consumo) y Xanthobacter flavus (36,8% de consumo), en suelo egipcio, Mycobacterium vanbaalenii (50,7% de
consumo) y Zavarzinia compransoris (52,2% de consumo) y en suelo alemán,
Rhodococcus erythropolis (90,6% de consumo) y Zavarzinia compransoris (52,2% del consumo) predominó. Estos hechos indican
que la remoción de aceite por la microflora nativa del suelo libanés fue débil y necesitaba una bioaumento para ser mejorada. El
hecho de que la mayoría de los aislamientos toleraran hasta> 30% de petróleo crudo significa que los derrames de petróleo
severos serían bien tolerados por las comunidades microbianas hidrocarbonoclasticas nativas del suelo. Incluso un crecimiento
débil permitiría a las cepas sobrevivir en ambientes sobresaturados de aceite. En este contexto, este ensayo se realizó en cultivos
líquidos. Las propiedades físico-químicas del aceite en una matriz de sedimento (en el suelo) son diferentes de las que se
encuentran a lo largo de la interfaz agua-aceite, sin embargo, los resultados registrados aquí pueden ser útiles para concluir que
los aislamientos tenían cierto grado de tolerancia al aceite.
Otro punto importante que se debe abordar es por qué la remoción de aceite en muchos de los lotes de suelo estudiados fue
más efectiva en las muestras de suelo aceitoso-desértico bioaumentado que en aquellas aumentadas con el material marino-
bioincrustante. Aparentemente, esto se debe a que el primero pertenece a la denominada bioaumentación autóctona, mientras
que la segunda es en realidad una especie de bioaumentación alóctona. Los microorganismos bioaumentados en el primer caso
probablemente ya estaban adaptados a los parámetros físico-químicos terrestres, mientras que en el último caso los
microorganismos estaban más adaptados a los parámetros físico-químicos marinos. Este estudio proporcionó evidencia
experimental para eso. La primera son las sorprendentes similitudes en la composición de la comunidad bacteriana entre los lotes
bioaumentados del suelo no bioaumentado y el suelo aceitoso del desierto (pero no los materiales bioincrustantes) durante varias
fases de la biorremediación. La segunda es que las especies puras predominantes en el suelo aceitoso del desierto, pero no las del
material de bioincrustación marina, lograron colonizar eficazmente las muestras de suelo estudiadas.
El último punto que se debe abordar es por qué el número de bacterias en las muestras de suelo estudiadas aumentó
instantáneamente en el tiempo cero en respuesta a la adición de aceite. Obviamente, este aumento se debió a factores físicos, no
a la propagación celular que habría necesitado varios días para que se produjera. Es bien sabido que las envolturas de muchas
especies bacterianas hidrocarbonoclasticas son hidrofóbicas.27,28. En el suelo, sus células parecen estar inmovilizadas en núcleos
hidrófilos, y la adición de aceite probablemente resulte en su liberación inmediata.
En conclusión, la biorremediación de hidrocarburos derramados en el suelo debería, por regla general, depender de la
microflora autóctona cuyas actividades pueden ser bioestimuladas optimizando los parámetros físico-químicos predominantes.
Los resultados de este estudio desafían la bioaumentación como un enfoque factible para mejorar la biorremediación del
petróleo. El hecho de que las comunidades microbianas varíen dramáticamente en composición no solo entre los diferentes
suelos, sino también para el mismo suelo en diferentes fases de biorremediación, hace imposible decidir qué taxón (taxa) sería la
opción más apropiada para el bioaumentamiento.
Métodos
Muestras de suelo y materiales de bioaumentación. Se recolectaron muestras de suelo prístino en contenedores estériles de
Kuwait-Asia (una muestra de suelo del desierto del área de Al-Ahmadi, 33 km al sur de la ciudad de Kuwait), Líbano-Asia (una muestra de
suelo de jardín del área de Al-Janoub, 120 km al sur de Bierut), Egipto -África (una muestra de suelo de jardín de una aldea, 120 km al norte
de El Cairo) y Alemania-Europa (una muestra de suelo de campo de girasoles en Münster / Westf, 850 km al oeste-sur de Berlín). Se
recolectaron dos muestras ambientales ricas en bacterias hidrocarbonoclasticas como materiales de bioaumentación. La primera fue una
muestra de suelo desértico (de un campo petrolífero en Kadma, 40 km al norte de la ciudad de Kuwait) y la segunda fue un material biológico
marino (del área de Al-Khiran, 70 km al sur de la ciudad de Kuwait). Ambas muestras se habían utilizado anteriormente en nuestro
laboratorio en experimentos de bioaumentación.29,30.
Configuración experimental. Para los experimentos de biorremediación a escala de banco, se suspendieron alícuotas de 100 g de los
suelos prístinos en 100 porciones de agua estéril en matraces cónicos y se mezclaron con porciones de 3 g de petróleo crudo ligero de
Kuwait. Los materiales de bioaumentación se homogeneizaron primero en volúmenes calculados de agua estéril y se inocularon volúmenes
iguales de homogeneizado equivalentes a 5 g del material en los matraces. La configuración también incluía un matraz no bioaumentado. Se
prepararon tres réplicas en todo momento. Los matraces se sellaron y se incubaron en condiciones ambientales (aproximadamente 27 ° C).
En el tiempo cero y mensualmente (hasta 6 meses), se recolectaron matraces por triplicado para análisis microbiológico y medición del
consumo de aceite.
Análisis microbiológico. Para el recuento de bacterias hidrocarbonoclásticas se utilizó el método de enchapado en un medio
mineral con vapor de aceite como única fuente de carbono.22. Se suspendió un gramo de suelo en 99 ml de agua esterilizada dando
la suspensión madre (10-2) a partir de la cual se prepararon series de diluciones. Se esparcieron alícuotas, 0,1 ml de cada dilución,
sobre el medio mineral sólido en placas de Petri y se dispuso de vapor de aceite crudo como única fuente de carbono y energía a
partir de 3 ml de papeles de filtro impregnados en aceite fijados en las tapas de las placas. Los platos se sellaron con cinta de
celofán y se incubaron a 30 ° C durante 12 días. Se prepararon cinco placas paralelas para cada dilución. Se contaron las unidades
formadoras de colonias (UFC). Las cepas en las placas replicadas agrupadas se categorizaron según su morfología de colonias y
células y se contaron; se aislaron, purificaron y mantuvieron colonias representativas en el medio anterior que contenía 1% de
aceite crudo. Los aislados se subcultivaron cada dos semanas.

Para la caracterización de los aislados, se secuenciaron sus genes de ARNr 16S y las secuencias se compararon con las de las
cepas tipo en GenBank. Para extraer el ADN genómico total, se homogeneizaron 300 mg de biomasa bacteriana fresca de 36
horas en 100µl de reactivo de preparación de muestras PrepManUltra (Applied Biosystems, EE. UU.) y 200µl agua molecular
(Sigma, Reino Unido). La mezcla se incubó en un baño de agua durante 10 min a 100 ° C, se enfrió durante 2 min y luego se
centrifugó a 14.000×gramo durante 3 minutos para recoger el sobrenadante que contiene ADN. Los genes de ARNr 16S se
amplificaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La mezcla de reacción contenía perlas de PCR puReTaq Ready-
To-Go (Amersham Biosciences, Reino Unido), 1µl (25 ng) de plantilla de ADN y 1µl cada una de las combinaciones de imprimación
universal GM5F (50-CCTACGGGAGGCAGCAG-30) y 907R (50-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-30)31. El volumen de reacción se completó
hasta 25µl con agua molecular. La amplificación se realizó en un termociclador Veriti (Applied Biosystems, EE. UU.) Mediante PCR
de contacto en el que la desnaturalización inicial fue a 95 ° C durante 5 minutos, y la temperatura de hibridación comenzó a 65 ° C
y disminuyó 1 ° C en cada ciclo para 55 ° C; Se llevaron a cabo 15 ciclos adicionales a esta temperatura. Los productos de PCR se
purificaron utilizando un kit de purificación de PCR rápida QIA (Qiagen, EE. UU.) Para eliminar la polimerasa Taq, los cebadores y
los dNTP. La secuenciación parcial del gen de ARNr 16S se realizó usando un kit Terminator versión BigDye (Applied Biosystems,
EE. UU.); Se agregaron 20 ng de la plantilla de ADN a 2µl de un terminador Big Dye v 3.1 y 2µl de Big Dye Terminator v 1.1, v 3.1
búfer de secuenciación 5X; lµSe añadió 1 l de 907R o GM5F a la mezcla, y el volumen final se llevó a 10µl con agua molecular. El
etiquetado se completó en un termociclador Veriti (Applied Biosystems, EE. UU.) Utilizando un ciclo de 96 ° C durante 1 min, luego
25 ciclos de 1 min a 96 ° C, 5 sa 50 ° C y 4 min a 60 ° C. Las muestras de ADN molde puro se procesaron en un analizador genético
3130xl (Applied Biosystems, EE. UU.). Se utilizó el software de análisis de secuenciación versión 5.2 (Applied Biosystems, EE. UU.)
Para analizar los resultados. Las secuencias se sometieron a un análisis básico de la herramienta de búsqueda de alineación local
con la base de datos GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI; Bethesda, MD, EE. UU.)32.
Las 149 cepas bacterianas hidrocarbonoclasticas que se han aislado en este estudio se enumeran en la Tabla S2
(archivo complementario), que incluye datos relacionados con la secuenciación de su ADNr 16S y sus números de acceso
en GenBank. La tabla también muestra que las similitudes de secuencia de todas las cepas con las de las cepas tipo
estaban entre el 99 y el 100%.
Para visualizar, comparar e interpretar las estructuras de las comunidades bacterianas de las diferentes muestras de suelo, se
analizaron las abundancias relativas de las comunidades utilizando el software Primer 6.33. En Primer 6, se creó una matriz de
semejanza basada en el índice de semejanza de Bray Curtis a partir de la abundancia relativa34. Se realizó una escala
multidimensional no métrica (MDS) en la matriz de semejanza, que muestra las similitudes relativas entre las comunidades como
distancia (es decir, cuanto más cercanas son dos muestras, más similar es la comunidad). Se utilizaron gráficos 2DMDS con un
valor de tensión inferior a 0,2 ya que se consideró que tenían información precisa. Los análisis de Análisis de Similitud (ANOSIM) se
realizaron en la matriz de semejanza para probar hipótesis específicas formadas a partir de la interpretación de las gráficas de
MDS.
Medida del consumo de aceite. Se recolectaron cultivos por triplicado en el momento cero y mensualmente durante 6
meses. El aceite residual se recuperó mediante extracción con tres porciones sucesivas de 15 ml de pentano. El volumen del
extracto combinado se hizo a 50 ml con pentano y 1µSe analizó mediante cromatografía de gas líquido (GLC). El consumo de
hidrocarburos se expresó en términos de porcentaje de la reducción total del área de los picos en función de las áreas de los picos
de los controles (matraces de tiempo cero). La CLG se realizó con un instrumento Chrompack (NJ, EE. UU.) CP-9000 equipado con
un FID, una columna capilar WCOT de sílice fundida CP-Sil y un programa de temperatura de 45 a 310 ° C, aumentando la
temperatura a una velocidad de 10 ° Cmin-1.
Colonización de suelos con aislados puros bioaumentados. Porciones de suelo prístino, 50 g, se humedecieron con
alícuotas de 50 ml de agua estéril y cada una se inoculó con 1 ml de un inóculo común del organismo probado que contenía
aproximadamente 109 células. Los cultivos se incubaron a 30ºC durante 5 días y los microorganismos constituyentes se sembraron
en placa como se describe anteriormente. También se sembraron en placa cultivos puros de los organismos probados. Se
reconocieron y contaron las colonias en las placas de suspensiones de suelo que eran idénticas a las de los cultivos puros en placa
en características microscópicas y de tinción.
La concentración de aceite más alta tolerada por los aislados. Los organismos probados se inocularon en medio mineral.
22 alícuotas que contienen cantidades crecientes de 0,5 hasta 30%, p / v, de petróleo crudo. Los cultivos se agitaron eléctricamente
en; 120 rpm durante 24 ha 30 ° C. Se esparció un asa del cultivo en agar nutritivo convencional para probar la viabilidad celular.
Después de la incubación durante 5 días a 30 ° C, se examinó el crecimiento de los cultivos y; vigor, y se registró la concentración
de aceite más alta tolerada.
Análisis estadístico. Se realizaron determinaciones por triplicado para cada análisis y los valores medios,±Los valores
de la desviación estándar se calcularon utilizando Microsoft Excel 2007. Se utilizó el Paquete Estadístico para Ciencias
Sociales, versión 12, para evaluar el grado de significancia. El análisis de varianza (ANOVA) se utilizó para diferenciar
entre las medias de los parámetros probados. Se realizó un análisis de covarianza (ANCOVA) en sitios individuales con
tiempo como covariable, consumo de aceite como variable dependiente y tratamiento como variable dependiente
categórica utilizando el entorno estadístico R (3.6.1) adoptando la fórmula general aov (Oil_consumption ~ Tiempo
* Treratment, dat = Site_data). Los resultados del estudio nMDS se sometieron a la matriz de similitud de Bray Curtis,
Trazar MDS 2D estrés 0.1.
Recibido: 19 de julio de 2018; Aprobado: 30 de noviembre de

2019; Publicado: xx xx xxxx

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Agradecimientos
El trabajo fue apoyado por la Universidad de Kuwait, Research Grant RS 01/16. Agradecemos a la Unidad Nacional de
Investigación y Servicios Ambientales (NUERS), Proyecto No. SRUL01 / 13 por proporcionar instalaciones para el análisis
de GC y al Proyecto de Instalación General GS01 / 02 para las instalaciones de análisis genético. También se agradece al
profesor Michael J. Danson, Universidad de Bath, Departamento de Biología y Bioquímica por la edición de idiomas, Dr.
Stephen Archer, Yale-NUS College, Universidad Nacional de Singapur, Singapur 138527, Departamento de Ecología
Aplicada, Universidad de Auckland de Tecnología, Auckland 1142, Nueva Zelanda, Sr. Kevin C. Lee, Instituto de Ecología
Aplicada, Nueva Zelanda, Universidad Tecnológica de Auckland, Auckland, Nueva Zelanda y Dr. Hassan Al-Haddad,
Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias,
Contribuciones de autor
SSR yD.MA concibieron y diseñaron el estudio e interpretaron los datos. MKK hizo el trabajo experimental.
SSR escribió el manuscrito y DMA lo revisó.

conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Información Adicional
Información suplementaria está disponible para este documento en https://doi.org/10.1038/s41598-019-56099-2.
Correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a SSR o DMA-M.

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Muestra UFC×105 gramo-1 Especies constituyentes % del total

Rhodococcus jostii 61,9

Pseudoxanthomonas japonensis 66,0

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bacterias hidrocarbonoclasticas Rhodococcus jostii y Streptomyces griseoflavus, la muestra libanesa, Sphingomonas

biorremediación de petróleo en muestras de suelo no bioaumentado y bioaumentado. Figura 1 muestra que el

Efectos de tratamientos específicos en estructuras de comunidades bacterianas enteras durante la biorremediación.

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Origen de la muestra Bioaumentado con R valor Significado

Suelo aceitoso del desierto 0,06 0,67

Suelo aceitoso del desierto 0,024 0,35

Suelo aceitoso del desierto -0.104 0,85

Dinámica de bacterias en suelo libanés. En la muestra no bioaumentada en el tiempo cero, Arthrobacter

Dinámica de bacterias en suelo egipcio. En el lote no bioaumentado en el momento cero, 3 taxones,

Dinámica de bacterias en suelo alemán. En el lote no bioaumentado en el momento cero, Rhodopseudomonas

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Recibido: 19 de julio de 2018; Aprobado: 30 de noviembre de

INFORMES CIENTÍFICOS | (2019) 9: 19508 | https://doi.org/10.1038/s41598-019-56099-2 9

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© El autor (es) 2019

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