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abierto Biorremediación de aceite contaminado

suelo utilizando residuos agrícolas a través
de un consorcio microbiano
chaoZhang1,2, DaojiWu1,2✉ yHuixue Ren1,2

Los desechos agrícolas, como el salvado de trigo y las aguas residuales de los cerdos, se utilizaron para la biorremediación de
suelos contaminados con aceite. Se seleccionaron dos cepas optimizadas que podrían degradar el aceite de manera eficiente. El
resultado mostró que la mejor relación entre la cepa A y la cepa B era 7: 3. El agua residual porcina podría ser un reemplazo de la
fuente de nitrógeno y el agua de proceso para la biorremediación. A continuación, se utilizó el diseño Box-Behnken para optimizar
el medio de cultivo, y el medio óptimo fue el siguiente: dosis microbiana de 97 ml / kg, salvado de trigo de 158 g / kg y aguas
residuales porcinas de 232 ml / kg. En el medio óptimo, la tasa de degradación del aceite alcanzó 68,27±0,71% después de 40 d. Las
actividades de ureasa, catalasa y deshidrogenasa en suelos contaminados con aceite aumentaron y la cantidad de microbios
aumentó significativamente con el compostaje manual. Estas investigaciones podrían sentar las bases para reducir la
contaminación de los desechos agrícolas, explorando un modelo tardío para la biorremediación de aceite suelo contaminado.

Se produce una gran cantidad de contaminantes del petróleo durante la producción, el procesamiento, el transporte y la utilización del
petróleo.1,2. Esto ha provocado una grave contaminación del suelo. Por tanto, es urgente reparar el suelo contaminado con aceite. En
comparación con la reparación física y la reparación química, la biorremediación se ha utilizado ampliamente debido a sus ventajas de buen
efecto, fácil operación, bajo costo, rápida tasa de degradación y falta de contaminación secundaria.3,4.
La biorremediación se divide en dos tipos de remediación: en el lugar y ex situ. En el lugarLas técnicas de remediación incluyen
la labranza de la tierra, la adición de microorganismos, el biocultivo y la bioventilación. Ex situ Las tecnologías de remediación
incluyen lecho prefabricado y biorreactor.5,6. Por ejemplo, Besalatpour et al.7. Usó la labranza de la tierra para remediar 500 kg de
suelo contaminado con aceite en tierras de cultivo. Después de cuatro meses, el total de hidrocarburos de petróleo disminuyó en
un 50%. La esencia de la tecnología de biorremediación es la degradación de contaminantes a través de actividades metabólicas
microbianas. La mayoría de los microorganismos utilizados en el proceso de remediación son microorganismos autóctonos.8. Para
mejorar el efecto de reparación, se introdujeron bacterias domesticadas de alta eficiencia que degradan el aceite. Wu y col.9.
reparó el suelo contaminado con 82,533 mg / kg de contenido de hidrocarburos de petróleo agregando una mezcla de bacterias
degradantes. Después de 13 semanas, el contenido de hidrocarburos de petróleo disminuyó a 47.600 mg / kg y la tasa de eliminación de
hidrocarburos de petróleo alcanzó el 42,3%. Aunque hay muchos académicos involucrados en este campo, sigue habiendo una falta de
tecnología de bajo costo y efectos positivos. Las investigaciones existentes informaron que los costosos suplementos refinados todavía eran
necesarios para la biorremediación, como la fuente de carbono refinado, la fuente de nitrógeno refinado, el agua de proceso o el agente
tensioactivo. Por lo tanto, el alto costo es el cuello de botella de la biorremediación.
Las aguas residuales porcinas incluyen principalmente orina de cerdo, estiércol de cerdo parcial y agua de lavado de cerdos.
Estos tipos de aguas residuales incluyen altas concentraciones de materia orgánica (demanda bioquímica de oxígeno 4.5-8.0g / L),
nitrógeno amoniacal (1.3-1.5 g / L) y nitrógeno total (1.6-2.2g / L)10. Es una especie de aguas residuales orgánicas de difícil
tratamiento. Si se descarga directamente en cuerpos de agua locales, causará una enorme contaminación ambiental. Tratar la
descarga de acuerdo con las normas es muy difícil y costoso. Si las aguas residuales se pueden utilizar como medio para la
remediación del suelo contaminado, no solo se puede reducir en gran medida el costo de la remediación, sino que también se
pueden reciclar las aguas residuales y se puede reducir la contaminación del medio ambiente.
Dos cepas (Bacillus subtilis CICC 21312 y Candida bombicola ATCC 22214) tenía una buena capacidad de descomposición del
aceite. En consecuencia, se utilizaron para la biorremediación de suelos contaminados con petróleo simulados en el presente
estudio. Se utilizaron aguas residuales porcinas en lugar de una fuente de nitrógeno y agua de proceso para la biorremediación.
Se determinó la proporción óptima de cepas y el medio óptimo para las cepas mixtas. Además, se estudiaron los cambios del
suelo después de la biorremediación para comprender las propiedades fisicoquímicas, las actividades enzimáticas y microbianas.

1Escuela de Ingeniería Municipal y Ambiental, Universidad Shandong Jianzhu, JiNan, 250101, China. 2Co- Centro de
Innovación de Edificios Ecológicos, JiNan, 250101, China. ✉Email: 402187730@qq.com

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Figura 1. Comparación de las tasas de degradación del aceite entre diferentes cepas y microorganismos autóctonos (▲:
A; ▼: Microorganismos autóctonos; ●: A + B; ■: B; ♦: C; ★: D); (a) Tasa de degradación del aceite (%); (B) Hidrocarburos de petróleo
totales (mg / kg).

Figura 2. Efecto de la proporción mixta (A, B) sobre la tasa de degradación del aceite.

población, que brindó referencia técnica y apoyo teórico para la aplicación de campo de la biorremediación en suelos
contaminados con petróleo de DongYing.

Resultados
comparación de las tasas de degradación del aceite entre diferentes cepas y microorganismos autóctonos. El principal
componente de los contaminantes del petróleo en el suelo son los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), sin embargo, la solubilidad de
los HAP en la solución acuosa del suelo es muy baja y los HAP pueden adsorberse en las partículas del suelo, lo que da como resultado una
biodisponibilidad deficiente. Esto retarda la tasa de biodegradación de los HAP en la interfaz sólido-líquido del suelo.11.
El tensioactivo es una especie de macromolécula con grupos hidrófilos e hidrófobos. Puede aumentar el área de contacto entre los
HAP y los microorganismos del suelo, mejorando la disponibilidad y la tasa de degradación al ondular, solubilizar y eluir.12. Sin
embargo, los tensioactivos exógenos aumentan el costo de la remediación del suelo. Por lo tanto, se seleccionó una cepa
productora de soforolípidos (cepa B) como cepa de remediación del suelo en este estudio. Al mismo tiempo, el soforolípido es
degradable y no causa fácilmente contaminación secundaria.
Con el fin de seleccionar mejores bacterias que degradan el aceite, se seleccionaron cuatro cepas para comparar. La
comparación de las tasas de degradación del aceite entre diferentes cepas y microorganismos autóctonos se muestra en la Fig.1.
Los resultados muestran que A y B tienen una alta tasa de degradación del aceite. La tasa de degradación del aceite de C y D es
relativamente baja, por lo que no se requieren más estudios. Debido a que los efectos de A y B son altos, también se investiga el
efecto sinérgico de A y B. La secuencia de la tasa de degradación del aceite de las cepas es A + B> A (30.08±1,08%)> B (21,19±
1,30%), que son superiores a los microorganismos autóctonos. Después de 40 d de cultivo de la cepa A + B, la tasa de degradación
del aceite fue de 41,12.±1,50%, mientras que la tasa de degradación del aceite de los microorganismos autóctonos después de 40
días fue de sólo 5,02±0,15%. La razón principal por la que el efecto del tratamiento de las bacterias mixtas es mejor que el de una
sola bacteria fue que la cepa B era una bacteria productora de soforolípidos, que podía degradar bien los HAP. Además, no hubo
competencia entre la cepa B y la cepa A, que podría cultivarse de forma mixta. La cepa A degrada el alcano y la cepa B degrada los
PAH. Desempeñaron un papel complementario, por lo que la tasa de degradación alcanzó el valor óptimo.

Construcción de flora dominante y determinación de la proporción óptima. Se investigó el efecto de las proporciones
mezcladas (A: B) sobre la tasa de degradación del aceite; Los resultados se muestran en la fig.2.

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Nivel

Factores -1 0 1
E: Cantidad de inoculación (mL / kg) F: 90 100 110
Salvado de trigo (g / kg) 130 150 170
G: Aguas residuales porcinas (mL / kg) 200 230 260

Tabla 1. Niveles de factores utilizados en la BBD.

Código mi F GRAMO Tasa de degradación del aceite (%)

1 -1 -1 0 52,27±0,23
2 1 -1 0 52,79±0,21
3 -1 1 0 62,57±0,21
4 1 1 0 62,78 ± 0,29
5 -1 0 -1 62.02±0,21
6 1 0 -1 51.11±0,22
7 -1 0 1 62.13 ± 0,23
8 1 0 1 57,95±0,26
9 0 -1 -1 52,95±0,26
10 0 1 -1 57,59±0,21
11 0 -1 1 52,51±0,23
12 0 1 1 59,38±0,27
13 0 0 0 67,73±0,24
14 0 0 0 63,81±0,28
15 0 0 0 66,33±0,25
dieciséis 0 0 0 65.11±0,21
17 0 0 0 62,98±0,21

Tabla 2. Matriz de diseño de experimentos BBD y resultados de la tasa de degradación del aceite.

La suma de Significar

Fuente Cuadrícula Cuadrado Valor F Problema (P)> F

Modelo 416.11 46,23 5.45 0.0180

mi 25,78 25,78 3,04 0.1248

F 126,41 126,41 14,90 0,0062

GRAMO 8,61 8,61 1.02 0.3473

EF 0,024 0,024 2.832E-003 0. 9590

P.EJ 11.32 11.32 1,33 0.2859

FG 1,24 1,24 0,15 0,7132

mi2 25.22 25.22 2,97 0.1284

F2 111,34 111,34 13.12 0,0085

83,09 83,09
9,79
GRAMO2
0.0166
Residual 59,39 8.48
4.11 0.1028
Falta de ajuste 44,84 14,95

Error puro 14.55 3,64

Cor Total 475,49

Tabla 3. ANOVA de RSM para la tasa de degradación del aceite.

Como puede verse, la proporción de cepas afectó la tasa de degradación del aceite. Una proporción demasiado baja o demasiado alta
redujo la tasa de degradación del aceite. La tasa máxima de degradación del aceite fue de 55,31±1,32% a las 7: 3.

Diseño de Box-Behnken y análisis de superficie de respuesta. El mejor nivel de los tres factores (cantidad de inoculación
de cepas mixtas, cantidad de salvado de trigo y cantidad de aguas residuales porcinas) fue determinado por BBD. Los niveles de
factor utilizados en la BBD se muestran en la Tabla1, y los resultados están en la tabla 2. La varianza para el diseño cuadrático está
en la Tabla3.
Los valores de "Prob> F" inferiores a 0.0500 indican que los términos del modelo son significativos. En este caso F, F2, y G2 son términos de modelo
significativos. La fórmula final del factor de codificación es la siguiente:

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Figura 3. Gráficos de superficie y de contorno de influencia mutua. (1) efecto de la cantidad de inoculación (MI) y salvado de trigoF); (2)
efecto de la cantidad de inoculación (MI) y aguas residuales porcinasGRAMO); y (3) efecto del salvado de trigo (F) y aguas residuales
porcinasGRAMO).

Tasa de degradación del aceite = 65,19 - 1,79 × E + 3,98 × F + 1.04 ×G - 0,078 × mi × F + 1,68 × mi ×G + 0,56 × F
×G - 2,45×mi2 - 5.14 × F2 - 4,44 ×GRAMO2 (1) donde Y es la tasa de degradación del aceite, E es la cantidad de inoculación, F es la cantidad de
salvado de trigo y G es la cantidad de aguas residuales porcinas.
Se utilizó la prueba F para juzgar la significancia de cada variable en la ecuación de regresión al valor de respuesta. Cuanto menor sea la
probabilidad de P, mayor será la variable correspondiente. El término de primer orden F (P <0.05) del modelo (1) fue significativo, mientras
que E y G (P> 0.05) no tuvieron efectos significativos. Los efectos del artículo de pedido secundario F2, GRAMO2

(P <0.05) fue significativo, y E2 (P> 0.05) no tuvo efectos significativos. No hubo diferencias significativas entre EF,
EG y FG (P> 0.05).
Estos resultados mostraron claramente que los valores experimentales tenían una distribución lineal y una buena correlación (R2 =
0,9912). Por lo tanto, el modelo podría usarse para predecir la tasa de degradación del petróleo crudo en el rango variable. La tasa máxima
de degradación del aceite de 68,22% se obtuvo con 96,53 ml / kg de inoculación, 157,85 g / kg de salvado de trigo y 232,29 ml / kg de aguas
residuales porcinas. Para validar esta predicción, se llevaron a cabo tres experimentos independientes y una tasa de degradación del aceite
de 68,27.±El 0,71% se obtuvo mediante inoculación de 97 ml / kg, 158 g / kg de salvado de trigo y 232 ml / kg de aguas residuales porcinas.

Los efectos de la cantidad de inoculación de cepas mixtas, la cantidad de salvado de trigo y la cantidad de aguas residuales porcinas
sobre la tasa de degradación del aceite fueron analizados por RSM. Como se muestra en la Fig.3, se generaron gráficos de superficie de
respuesta tridimensionales y gráficos de contorno. Esto permite estudiar la interacción de dos variables cualesquiera en la respuesta. A partir
de la observación del gráfico de superficie de respuesta de la interacción entre los dos factores, hubo una fuerte interacción entre los
factores, y se encontró que cuanto más empinada es la tendencia de la curva, más significativa es la influencia. Cuanto más suave sea la
tendencia de la curva, menor será la influencia. La forma del gráfico de contorno representa la fuerza de la interacción. La gráfica de
contorno era redonda, lo que indica que la interacción entre los dos factores era débil. Más aún, la gráfica de contorno era ovalada, lo que
indica que la interacción entre los dos factores era fuerte. Comparando los puntos y contornos más altos de la superficie de respuesta en la
Fig.3, hubo valores extremos en el rango seleccionado.

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Índice M1 M2 M3
Tasa de degradación del 0 5.02±0,27 68,27±0,71
aceite ∕% TPH / (mg · kg-1) 48763±254 46315±231 15473±99
HAP / (mg · kg-1) 10281±157 9754±118 7199±93
Alcano / (mg · kg-1) 26896±237 25021±169 18827±171
pH 8,34±0,32 7,98±0,28 7.24±0,22
Contenido de C ∕% 65,89±1,51 115,26±2.15 158,41±1,98
Contenido de N ∕% 0,59±0,02 1,43±0,05 2.02±0,05
Contenido de P ∕% 0,59±0,01 0,59±0,01 0,76±0,01
Actividad deshidrogenasa (mg · g-1· H-1) 28.01±0,84 59,89±2,74 86,62±2,44
Actividad catalasa (mg · g-1· H-1) 0,90±0,03 1,71±0,05 3,19±0,11
Actividad polifenol oxidasa (mg · g-1· H-1) 1,30±0,05 0,45±0,01 0,32±0,01
Actividad ureasa ∕ (mg · g-1· H-1) 0,031±0,001 0.041±0,001 0.072±0,002
Recuentos de bacterias ∕ (CFU•gramo-1) (1,21±0,04) × 106 (5,60±0,23) × 106 (7,30±0,70) × 107
Actinomicetos cuenta ∕ (CFU•gramo-1) (2,17±0,15) × 105 (1,23±0,04) × 106 (6,16±0,30) × 106
Recuento de hongos ∕ (CFU•gramo-1) (2,01±0,11) × 104 (7,09±0,31) × 104 (4.50±0,29) × 105

Cuadro 4. Propiedades de diferentes tipos de suelos contaminados con aceite.

Petróleo

degradación Tratando Hora

Método Presion Velocidad (%) con desperdicio (D) Referencia

Labranza de la tierra Microorganismos autóctonos 50 No 120 7

Consorcio microbiano Doce variedades de bacterias 42,3 No 91 9
Si (cerdo
Consorcio microbiano Dos variedades de bacterias 68,27±0,71% 40 Este estudio
aguas residuales)

Cuadro 5. Comparación de diferentes métodos de biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos.

comparación de las propiedades del suelo antes y después de la biorremediación. El suelo contaminado con aceite, el
suelo contaminado con aceite tratado con compostaje de aireación microbiana autóctono y el suelo contaminado con aceite tratado con un
consorcio microbiano (proporción óptima y condiciones óptimas de cultivo) se registraron como M1, M2, M3, respectivamente. Se
investigaron los cambios de las propiedades físicas y químicas del suelo, las actividades enzimáticas y la población microbiana antes y
después de la biorremediación. Los resultados se muestran en la tabla4.
Después de comparar tres tipos de muestras de suelo, M3 tuvo el mejor efecto de recuperación y la tasa de degradación del
aceite alcanzó 68.27±0,71%. La tasa de degradación del aceite de M2 fue solo 5.02±0,27%. Se pusieron grandes cantidades de
nutrientes en la muestra en el proceso de reparación de M3, por lo que el contenido de orgánicos y nitrógeno total en el suelo
mejoró enormemente, mientras que los cambios en el contenido correspondiente en M2 no fueron tan obvios como en M3.
Las actividades de la deshidrogenasa y catalasa en M3 fueron las más altas. Esto se debió a la gran cantidad de reproducción
de microorganismos del suelo durante el proceso de reparación, y el microorganismo participó en el proceso de degradación del
hidrocarburo del aceite, lo que mejoró la actividad de la deshidrogenasa y catalasa. La actividad de la ureasa en M3 fue la más
alta, lo que indica que el suelo tenía una fuerte capacidad de conversión de nitrógeno, lo que era beneficioso para el crecimiento
de microorganismos en el suelo. También proporcionó suficientes condiciones nutricionales para que el microorganismo
participara en la degradación del hidrocarburo del aceite. Sin embargo, las actividades de varias enzimas en M2 no fueron tan
obvias como las de M3.
Los recuentos de bacterias, actinomicetos y hongos en M3 fueron significativamente más altos que los de la muestra de suelo
no tratada M1 y la muestra de suelo M2 después del compostaje ordinario, que estaban cerca del número real de microbios en el
mundo natural.

Discusión
La remediación de suelos contaminados con petróleo crudo es un problema mundial. Aunque existen muchos métodos de
remediación, esta tecnología sigue siendo un método de remediación prometedor. La comparación de diferentes métodos se
muestra en la Tabla5. El orden de la tasa de degradación del aceite de los diferentes métodos consideró este estudio como mejor
que el de Besalatpour et al. que fue mejor que Wu et al. En este estudio, el tiempo de remediación fue el más corto y se resolvió el
problema de la contaminación de las aguas residuales de la pocilga. Además, tenía las siguientes ventajas: (1) El costo del
tratamiento era bajo. En el proceso de tratamiento, todos los materiales, excepto las cepas, fueron desechos. (2) El proceso podría
compensar los costos de eliminación de desechos agrícolas. (3) No se necesitaron tensioactivos químicos exógenos durante el
proceso de remediación, porque la cepa B produjo soforolípidos. (4) Las aguas residuales porcinas podrían reemplazar el agua de
proceso en la biorremediación.
La razón principal por la que no se tuvo en cuenta el efecto de la aireación en la microflora fue la siguiente: aunque muchos
microorganismos eran aeróbicos, no se les podía suministrar oxígeno en la rehabilitación de suelos contaminados con aceite.
Aumentó el costo de procesamiento a un nivel inasequible. Dos cepas altamente eficientes que degradan el aceite conservadas en
el laboratorio podrían mejorar el efecto de la biorremediación del suelo contaminado con aceite. La

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La eficiencia de recuperación de una sola cepa en un proceso de reparación de 40 días fue mucho mayor que la de los
microorganismos autóctonos. El orden de la tasa de degradación del aceite de dos cepas fue A + B> A> B. La combinación de A y B
tuvo la mejor tasa de degradación del aceite. La mejor relación (relación de masa) de las dos cepas fue 7: 3. En esta condición, la
tasa de degradación del aceite del suelo alcanzó 55,31±1,32%. Las aguas residuales porcinas podrían reemplazar la fuente de
nitrógeno y el agua de proceso para la biorremediación. El medio óptimo fue una dosis microbiana de 97 ml / kg, salvado de trigo
de 158 g / kg y aguas residuales porcinas de 232 ml / kg. En el medio óptimo, la tasa de degradación del aceite alcanzó 68,27±
0,71% después de 40 d. La fertilidad del suelo contaminado con petróleo, que fue reparado por un consorcio microbiano, aumentó
significativamente. Además, las actividades de la deshidrogenasa, peroxidasa y ureasa aumentaron y el número de microbios
aumentó significativamente. Estas investigaciones pueden sentar las bases para reducir la contaminación de los desechos
agrícolas, explorando un modelo tardío para la biorremediación de suelos contaminados con petróleo. En los experimentos
futuros, se estudiará este consorcio microbiano para reparar el suelo contaminado con aceite en otros lugares.

Materiales y métodos
Muestras de terreno. El petróleo crudo se obtuvo de la refinería DongYing, China. Los parámetros característicos del crudo fueron 18,5%
de hidrocarburo aromático policíclico y 48,4% de alcano. Se recolectaron muestras de suelo del suelo no contaminado poco profundo (5 ~ 25
cm) en DongYing, China. Las muestras de suelo se rompieron, limpiaron, mezclaron y tamizaron. De acuerdo con la relación entre el petróleo
crudo y la masa del suelo (1:20), el suelo contaminado con aceite estaba listo para su uso. A continuación, la tierra se selló en la bolsa de
papel kraft esterilizada, mantenida en almacenamiento en frío.13.

Aguas residuales porcinas. Las aguas residuales porcinas utilizadas en este estudio fueron efluentes procedentes de la granja de cerdos ZhengBang
en DongYing, China. Los parámetros característicos de las aguas residuales porcinas fueron los siguientes: 15,4±0,2 g / L de productos químicos
demanda cal de oxígeno (DQOCr), 6.5 ± Demanda bioquímica de oxígeno de 0,2 g / L (DBO5), 883 ± 12 mg / L de sólidos en suspensión
(SS), 1,1 ± 0,1 g / L de nitrógeno amoniacal (NH3-N), 1,8 ± 0,1 g / L de nitrógeno total, 40,5 ± 0,5 mg / L de fósforo total y pH de 7,5 ±
0,2. El agua residual se esterilizó en autoclave durante 20 min a 121 ° C.

Son. Bacillus subtilis X-12 (A) se compró en la Colección del Centro de Cultura Industrial de China (CICC)
como CICC 21312. Candida bombicola C-15 (B) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC)
como ATCC 22214. Las cepas se mantuvieron en medio LB o medio YPD a 4ºC. Pseudomonas aerug- inosa
A-21 (C) se compró a la CICC como CICC 10204. Arthrobacter sp.D-2 (D) se compró a la CICC como CICC
10758.

Medios de comunicación. LBmedium: extracto de levadura, 5 g / L; peptona, 10 g / L; cloruro de sodio, 5 g / L; y agar 18 g / L.

YPDmedium: extracto de levadura, 10 g / L; peptona, 20 g / L; glucosa, 20 g / L; y agar 18 g / L. Medio de
semilla: extracto de levadura, 10 g / L; peptona, 20 g / L; y glucosa, 20 g / L. Todos los medios se
esterilizaron en autoclave durante 20 min a 121 ° C.

comparación de las tasas de degradación del aceite entre dos cepas y microorganismos autóctonos. Se
activaron dos cepas en medio de siembra. La concentración de células microbianas fue de 1,5×108UFC / mL. El suelo contaminado
con aceite se empaquetó en 48 botellas cónicas (50 g cada una). Los matraces cónicos se dividieron en tres grupos, con 16
matraces en cada grupo. Luego, se agregaron 50 ml / kg de la cepa A y la suspensión de la cepa B a dos grupos y se colocaron en
la incubadora (28 ° C). Fueron regadas y aradas todos los días para mantener el contenido de agua en torno al 20%. El grupo
restante (grupo de control) no recibió suspensión de cepas para investigar el efecto de microorganismos autóctonos. Se tomaron
muestras a intervalos y se calculó la tasa de degradación del aceite por método gravimétrico para verificar la fracción de masa de
aceite en muestras de suelo.14.

Construcción de flora dominante y determinación de la proporción óptima. Se llevaron a cabo combinaciones de

dos cepas. Las bacterias mixtas de diferentes combinaciones se añadieron al suelo contaminado con aceite de acuerdo con una
cierta cantidad de inoculación, y la cantidad total de inoculación (50 ml / kg) de la suspensión de bacterias mixtas en cada grupo
fue igual. Fueron regadas y aradas todos los días para mantener el contenido de agua en torno al 20%. Después de 40 días en la
incubadora (28 ° C), se determinó la fracción de masa de aceite en las muestras de suelo y se calculó la tasa de degradación del
aceite.

Diseño de Box-Behnken y análisis de superficie de respuesta. Se seleccionaron tres factores que afectan la tasa
de degradación del aceite (cantidad de inoculación de cepas mixtas, cantidad de salvado de trigo y cantidad de aguas
residuales porcinas). Se utilizó el diseño Box-Behnken (BBD) para determinar las concentraciones óptimas de factores
utilizando el software Design-Expert (Versión 8.0.6, Stat-Ease, Inc, EE. UU.), Y para comprender la relación entre varios
factores. Los tres factores se estudiaron en tres niveles (Tabla1), y se llevaron a cabo 17 conjuntos de experimentos
(Tabla 2). Todos los experimentos se realizaron tres veces. Los valores óptimos de los factores se obtuvieron mediante el
análisis de gráficos 3D. El análisis estadístico del modelo se representó como un análisis de varianza (ANOVA).

Métodos analíticos. El pH de las muestras de suelo se midió mediante titulación potenciométrica y la relación de volumen de
agua a suelo fue de 2,5. El contenido de materia orgánica en las muestras de suelo se determinó mediante el método volumétrico
de dicromato de potasio. El contenido de nitrógeno total de la muestra de suelo se determinó mediante el método semi-micro
kjeldahl. El contenido de fósforo total en una muestra de suelo se determinó mediante el método antiespetrofotografía Mo-Sb.15.

El contenido total de hidrocarburos de petróleo (TPH) en el suelo se determinó mediante el método gravimétrico.14. La fórmula
de cálculo para la tasa de degradación del aceite fue la siguiente:

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ODR (%) = (W1 - W2) /W1 × 100% (1)

donde ODR fue la tasa de degradación del aceite (%), W1 era el contenido de hidrocarburos de petróleo en el suelo antes
degradación y W2 fue el contenido de hidrocarburos de petróleo en el suelo después de la degradación.
La cantidad de hidrocarburo aromático policíclico y alcano en el suelo se midió mediante el método gravimétrico
método14.
Nitrógeno total, fósforo total, sólido suspendido, NH3-N, DBO5, y CODCr en las aguas residuales porcinas se
midieron de acuerdo con el procedimiento descrito en los métodos estándar para el análisis de agua y
aguas residuales15.

La actividad de la deshidrogenasa se determinó usando cloruro de trifeniltetrazolio como aceptor de hidrógeno, que
se redujo para formar formazán rojo. Se determinó por colorimetría. La cantidad de formazán producida en 1 g de suelo
seco durante 6 h fue una unidad activa de deshidrogenasa. Se determinó la actividad ureasa en la muestra de suelo.
por colorimetría de reactivos de Nessler. La cantidad de NH3-El N producido en 24 h en 1 g de suelo seco fue una unidad de actividad de la
ureasa. La actividad de la polifenol oxidasa en una muestra de suelo se determinó mediante colorimetría de pirogalol. La cantidad de
El ácido gálico producido en 3 h en 1 g de suelo seco se tomó como unidad de actividad de la polifenol oxidasa. La actividad de catalasa en
una muestra de suelo se determinó mediante titulación con permanganato de potasio. La actividad enzimática se expresó por el número de
volumen de permanganato de potasio consumido en 1 g de suelo seco en 1 h.dieciséis. La cantidad de población microbiana en el suelo se
determinó por unidad formadora de colonias17.

Recibido: 17 de septiembre de 2019; Aprobado: 13 de mayo de

2020; Publicado: xx xx xxxx

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Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el State Key Laboratory of Microbial Technology (M2012-14) de la Universidad de
Shandong.

Contribuciones de autor
CZ y DJW concibieron el estudio. CZ diseñó experimentos, analizó datos y realizó experimentos con la
ayuda de H. XRCZ redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Información Adicional
Correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a DW
Información sobre reimpresiones y permisos está disponible en www.nature.com/reprints.

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