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ABIERTO Comparación del crecimiento de las plantas

y potencial de remediación
de pirocarbón y desorción térmica para
suelos contaminados con petróleo crudo
Noshin Ilyas 1 *, Uzma Shoukat1, Maimona Saeed1, NosheenAkhtar1, HumairaYasmin2,
Wajiha Khan3 ySumera Iqbal4

La contaminación por petróleo crudo es una seria amenaza ambiental para el suelo y las plantas que crecen en él. Este
estudio proporciona la primera evidencia experimental para la comparación de la eficacia del pirocar (biocarbón de
pirólisis lenta), la desorción térmica y su aplicación combinada para la degradación del suelo contaminado con petróleo
crudo (0%, 10% y 20%) y el crecimiento de lechuga bajo tierra. condiciones del invernadero. Pyrochar se produjo por
pirólisis de aserrín a 350 ° C, mientras que la desorción térmica se realizó mediante pirólisis del suelo a 500 ° C. Las
incubaciones del suelo se realizaron durante 120 días. Los resultados del análisis del suelo mostraron que la eficiencia de
degradación del petróleo crudo para la aplicación combinada fue más alta (40%), mientras que el pirocar y la desorción
térmica fue del 25% y 19,6%, respectivamente. Los productos máximos de degradación del petróleo crudo se manifestaron
mediante la detección de hidrocarburos de bajo peso molecular (entre 173 y 422) en el suelo con un tratamiento de
aplicación combinado mediante análisis de cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS). La contaminación
por aceite crudo redujo significativamente la germinación y el crecimiento de las plantas de lechuga. De manera similar,
la aplicación combinada también mejoró el crecimiento de las plantas con un aumento del 24% en el porcentaje de
germinación, 35.5% en el índice de vigor de las plántulas y 27% en el índice de rapidez con un 20% de contaminación por
aceite crudo. La remediación provocó un aumento significativo en la biomasa fresca y seca (40%), el área foliar (30%), la
clorofila total (21%), el potencial hídrico (23,6%), el potencial osmótico (27%) y el índice de estabilidad de la membrana
(40%). . Además, hubo un aumento en el contenido de prolina (32%), aminoácidos totales (29%), azúcares solubles (37%),
proteínas (27%) y enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa (19%), catalasa (33%) y peroxidasa (38%). Este
estudio confirmó la eficacia del pyrochar (biochar de pirólisis lenta), la desorción térmica y su aplicación combinada para
la descontaminación del suelo con petróleo crudo a escala de laboratorio y también en la mejora de la usabilidad del suelo
mejorando la germinación y el crecimiento de la lechuga.

La liberación de aceite de petróleo en el suelo y el agua, debido a diversas actividades humanas, plantea graves amenazas a nuestro medio
ambiente. Los hidrocarburos de petróleo se consideran muy peligrosos para los organismos vivos debido a su toxicidad, mutagenicidad y
carcinogenicidad.1. La contaminación del suelo con aceite da como resultado una grave depresión del crecimiento de la mayoría de las
plantas, principalmente debido a sus efectos sobre las propiedades físicas y químicas del suelo y las relaciones entre el agua y el suelo.2.
El petróleo crudo afecta el medio ambiente al cambiar los elementos esenciales del hábitat. Para superar este problema, se
han desarrollado diferentes tecnologías de remediación de suelos como lavado de suelos con tensioactivos, tratamiento biológico,
tratamiento térmico, decapado, etc.3. El tratamiento de desorción térmica se ha considerado una de las técnicas más
prometedoras debido a sus posibles aplicaciones a una amplia gama de contaminantes orgánicos y algunos metales pesados
(Hg), convirtiéndolos en formas volátiles. Hoy en día, se realiza la pirólisis durante la cual el suelo contaminado se calienta entre
350 y 500 ° C, lo que también reduce el requerimiento de calor del 40 al 60% en comparación con otros métodos de calentamiento
convencionales.4. Según Ren et al.5, 10 min de pirólisis a 250 ° C de suelo que contenía diesel redujo los hidrocarburos de petróleo
totales de 6272 a 359 mg / kg. Sin embargo, afecta la porosidad y las propiedades del suelo, que no son fáciles de recuperar.6.

1Departamento de Botánica, PMAS-Universidad de agricultura árida, Rawalpindi, Pakistán. 2Departamento de Biociencias,

Universidad COMSATS de Islamabad (CUI), Islamabad, Pakistán. 3Departamento de Biotecnología, Universidad COMSATS de
Islamabad, Campus de Abbottabad, Pakistán. 4Departamento de Botánica, Lahore College forWomen University, Lahore, Pakistán.
* Correo electrónico: noshinilyas@yahoo.com

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Tasa de degradación (%)

Tratos 10% de contaminación por aceite 20% de contaminación por aceite

Control 11,25 ± 0,5 d 8,5 ± 0,01a

Pyrochar 25,09 ± 0,02b 16,12 ± 0,1b

Desorción térmica 19,65 ± 0,05c 14,75 ± 0,5c

Pyrochar + Desorción térmica 40,15 ± 0,1a 32,31 ± 0,02a

Tabla 1. Tasa de degradación de hidrocarburos en suelo de control, pirocáridos y remediados térmicamente. Estos datos
muestran las medias y la desviación estándar (n = 3). Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0.05)
siguiendo el orden a> b> c> d.

La pirólisis a través de la carbonización de biomasa a temperaturas de procesamiento superiores a 300 ° C en condiciones

libres de oxígeno produce pirocar. Pyrochar es una enmienda de suelo nueva y eficaz que puede mantener los nutrientes del
suelo y mejorar el secuestro de carbono. Pyrochar también muestra un gran potencial para la conservación del agua y la mejora
de la eficiencia del uso del agua en cultivos de invernadero. Pyrochar tiene un alto potencial de secuestro de carbono y actúa
como carbón activado y se puede utilizar eficazmente en procesos de biorremediación del suelo.7. Además, el pyrochar ha
mejorado las propiedades físicas y químicas y tiene el potencial de enmienda del suelo, secuestro de carbono, remediación de la
contaminación y producción de bioenergía8.
Lechuga (Lactuca sativa L.) la planta es muy sensible a los hidrocarburos del suelo.9. Las semillas de lechuga y los bioascos de crecimiento se pueden
utilizar eficazmente para la evaluación de la toxicidad del suelo debido a la contaminación.10. Los ensayos de germinación de semillas, particularmente de
lechuga, pueden predecir la fitotoxicidad de suelos contaminados.11. Marti y col.12 utilizó parámetros de crecimiento de la lechuga como indicador de la
toxicidad de las muestras de suelo.
La desorción térmica es una técnica muy eficaz para la descontaminación de suelos contaminados por petróleo, pero los tratamientos
térmicos provocan cambios en la fertilidad del suelo y los niveles de agua que pueden limitar su uso para la vegetación.4. Por el contrario, el
biocarbón tiene menos potencial de remediación pero puede cambiar las propiedades fisicoquímicas del suelo.13, mejorar la capacidad de
retención de agua del suelo14 eventualmente resultando en una mayor fertilidad del suelo15; con posibles efectos beneficiosos sobre la
productividad de los cultivos, el establecimiento y el crecimiento de las plantas13. Por lo tanto, la integración de la desorción térmica con la
enmienda de biocarbón no solo puede conducir a una mejor remediación del petróleo crudo, sino que también puede resultar eficaz para un
mejor crecimiento de las plantas. Actualmente, hasta donde sabemos, no existe un registro publicado sobre la comparación de pirocar y
desorción térmica, solos o en la aplicación combinada. En este estudio, hemos investigado la remediación de suelos contaminados con
petróleo crudo mediante la adición de pirocáridos y la desorción térmica de suelos contaminados con petróleo crudo. Se utilizaron suelos
tratados para estudiar la germinación de la lechuga y sus respuestas morfológicas, fisiológicas y bioquímicas se utilizaron como indicadores
de la toxicidad del suelo.

Resultados
La presente investigación fue diseñada para observar el potencial de remediación de una nueva técnica de aplicación combinada.
es decir, pirocar (biocarbón de pirólisis lenta); desorción térmica sola y su aplicación combinada en el suelo contaminado con
petróleo crudo. Descubrimos que esta nueva aplicación combinada fue eficaz no solo para remediar el suelo, sino que también
neutralizó la naturaleza tóxica del petróleo crudo.

Análisis de suelos. La contaminación por petróleo crudo afectó negativamente las propiedades del suelo al causar
una disminución en el pH del suelo (3% y 7% al 10% y 20% de contaminación), CE (10% y 28% al 10% y 20% de
contaminación) y la humedad del suelo. contenido (27,6% y 41,5% al 10% y 20% de contaminación). Los resultados
mostraron una reducción significativa de los nutrientes disponibles. El nitrógeno, fósforo y potasio mostraron una
reducción máxima de 29 y 40%, 7% y 15%, y trazas de cantidades al 10% y 20% de contaminación, respectivamente, en
comparación con el suelo no contaminado. Sin embargo, el carbono orgánico mejoró significativamente en dos y tres
veces, con un 10% y un 20% de contaminación. Pyrochar mejoró las características del suelo no solo bajo condiciones de
control sino también bajo contaminación por aceite. La desorción térmica tuvo poco efecto sobre las propiedades del
suelo.
Los resultados más prometedores se obtuvieron con la aplicación combinada que dio como resultado un aumento del 30% y 27,3% en el
contenido de humedad del suelo con un 10% y un 20% de contaminación, un aumento del 40% y 23% en el contenido de nitrógeno con un
10% y un 20% de contaminación, 10–3 % en contenido de fósforo y desde el nivel de trazas hasta cantidades detectables en potasio para
suelo contaminado al 10% y 20%, respectivamente (Tabla complementaria 1).

Degradación del petróleo crudo. El efecto del pirocarbón y la desorción térmica sobre la degradación de los hidrocarburos
fue significativo (p ≤ 0,5). Existe una relación inversa entre la tasa de degradación de los hidrocarburos y el nivel de contaminación
del aceite, ya que la degradación de los hidrocarburos disminuyó con un aumento de la contaminación del aceite. El tratamiento
del suelo con una aplicación combinada de pirocarbonato y desorción térmica mostró resultados más prometedores de 40,1% de
degradación de los hidrocarburos, que es 30 veces mayor en comparación con el control uno al 20% de nivel de petróleo crudo. La
adición de pirocarbono mostró un 25% de degradación de los hidrocarburos, que es 13,8 veces más en comparación con el
control. Mientras que el 19,7% de la degradación de los hidrocarburos se registró con desorción térmica en comparación con el
control. El orden de degradación de la eficacia es el tratamiento de aplicación combinado> pirocar>1). Por lo tanto, una aplicación
combinada de pirocarbono y desorción térmica es más efectiva y se sugiere como posible remediación de la contaminación por
hidrocarburos. Una relación inversa

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Tratos Tiempo de retención Área de pico (%) Compuesto Fórmula molecular MW

15,3 71.785 × 103 Éster de butildodecilo C24H38O4 390,6

Control 19.11 121,541 × 103 Éster de butiltetradecilo C26H42O4 384,59

23.18 61.452 × 103 Triacontano C30H62 422,81

11.13 75.694 × 103 9H-Flourine, 9-Metilen 2- C14H30 178

14.24 45.861 × 103 Bromotetradecano C14H29Br 276
Pyrochar 17.11 65.319 × 103 Hexdecano CdieciséisH34 226
22.44 51.823 × 103 Pirineo CdieciséisH10 202
26,42 35.481 × 103 Tridecano 1-yodo C13H29I 310
12.15 54.291 × 103 Heptadecano C17H36 240,48

16.32 47.523 × 103 Heptadecano 6,10 tetrmetil C21H44 296.16

Desorción térmica
23.45 42,156 × 103 7,9 Di-terc-butil-1-oxaspiro (4,5) C17H24O3 276
26,56 34.612 × 103 Bis (7-metiloctil) éster del ácido ftálico C26H42O4 418
10,53 58.432 × 103 Dodecano C12H26 170,33

13,4`2 42.713 × 103 Undecano 3,8 dimetilo C13H28 200,36

19.11 52,341 × 103 Dodecano 2,6,11, ácido C15H32 212

Aplicación combinada
19.45 34.267 × 103 trimetil n-hexadecónico CdieciséisH32O2 256
23.16 54.243 × 103 Hexadecano CdieciséisH34 226
26,54 45.261 × 103 Flouranthene CdieciséisH10 202

Tabla 2. Los productos finales y metabolitos del petróleo crudo producidos por degradación por pirocáridos,
sorción térmica, su aplicación combinada y suelo contaminado.

existe entre la tasa de degradación de los hidrocarburos y el nivel de contaminación del aceite, ya que la degradación de los hidrocarburos
disminuyó con un aumento en la contaminación del aceite. (Mesa1).

Análisis GC – MS. Análisis GC-MS de muestras de suelo para la identificación de compuestos que se generan después
de la degradación del petróleo crudo. Los resultados sugirieron que el petróleo crudo se degradó en el suelo mediante
diferentes tratamientos después de la prueba de 120 días. El espectrómetro de masas identificó los componentes de
hidrocarburos utilizando la biblioteca NIST. Encontramos una variedad de compuestos (alifáticos y aromáticos) con
diferentes pesos moleculares (173–422). Los datos generaron los cromatogramas de iones totales, que revelaron que las
transformaciones de los compuestos parentales (petróleo crudo) están asociadas con la producción de metabolitos. Los
metabolitos generados durante la degradación de una mezcla cuaternaria de HAP proporcionaron información útil sobre
el proceso de biodegradación. El análisis GC-MS mostró que los compuestos de alto peso molecular se degradaron,2).
Después de 120 días de prueba, los productos del suelo tratado con el tratamiento de aplicación combinado fueron
Dodecane, Undecane 3,8 dimetil, Dodecane 2,6,11, Trimetil,norte-Ácido hexadecónico, hexadecano y flouranthene. Estos
posiblemente se originaron por el efecto sinérgico del pirocar y la desorción térmica. Mientras que el pirocar y la
desorción térmica dieron como resultado la producción de un número menor de compuestos (9H-Flourine, 9-metileno, 2-
Bromotetradecane, Hexdecane, Pyrene fueron producidos por pyrochar mientras que la desorción térmica produjo
Heptadecane, Heptadecan 6,10 tetramethyl, 7, 9 Di-terc-butil-1-oxaspiro (4,5), éster bis (7-metil octil) del ácido ftálico). En
general, el análisis GC-MS mostró que el tratamiento de aplicación combinada degradaba los PAH en un número mayor
de compuestos de menor peso molecular y, por lo tanto, era más eficaz en la descontaminación.

Germinación de plantas. El efecto de la remediación del suelo a través de pirocar, desorción térmica y su aplicación
combinada había mostrado un efecto significativo (p ≤ 0.05) sobre la germinación de dos variedades de lechuga. El estrés por
aceite crudo disminuyó el porcentaje de germinación hasta en un 29,7% y un 39% en un 10% y un 20% de suelo contaminado en
comparación con el control. La aplicación de la aplicación combinada (pirocáridos y desorción térmica) resultó en
28,5% y 21,8% de aumento en el porcentaje de germinación de ambas variedades de lechuga en comparación con el estrés de
control respectivo de 10% y 20% del suelo contaminado. Hubo un aumento de 24% y 17,5% en el porcentaje de germinación por
pirocar y 19% y 12,3% por desorción térmica 10% y 20% de suelo contaminado. El índice de vigor de las plántulas también
aumentó en un 35,5% y un 28,7% mediante la remediación de pirocáridos y desorción térmica en un 20% de suelos contaminados.
Se observaron tendencias similares en el índice de prontitud (Fig. 1 complementaria).

Morfología vegetal. Planta de biomasa fresca y seca (Fig. 1) mostraron una disminución considerable (30% y 40% en 10% y
20% de suelo contaminado) y área foliar (25% y 30% en 10% y 20% de suelo contaminado). Descubrimos que el tratamiento de
aplicación combinada tuvo los resultados más pronunciados al mostrar un aumento máximo de biomasa vegetal de hasta 40%
(10% de contaminación) y 22% (20% de contaminación), respectivamente. La enmienda del suelo con pirocar ayudó a mitigar el
efecto del petróleo crudo y aumentó en un 30% y un 38% la biomasa en un 10% y un 20% del suelo contaminado. Mientras que la
desorción térmica mejoró el crecimiento en un 12% (10% de contaminación) y un 10% (20% de contaminación). Ambas variedades
se comportaron bien en respuesta al potencial de degradación del pirocar, la desorción térmica y su aplicación combinada (Fig.1).

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Biomasa fresca v1 Biomasa fresca v2 Biomasa seca v1

Biomasa seca v2 Área de hoja v1 Área de hoja v2

35 40

30 35

30

Biomasa vegetal (g)

25

25

Área de la hoja (cm2)

20
20
15
15

10
10

5 5

0 0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Figura 1. Biomasa fresca y seca y área foliar de dos variedades de lechuga que crecen en el suelo contaminado con petróleo
crudo, pirocar, desorción térmica y su aplicación combinada remediada. Detalle de los tratamientos: Donde, T0 = suelo de
control, T1 = 10% de suelo contaminado con crudo, T2 = 20% de suelo contaminado con crudo, T3 = suelo de control tratado con
Pyrochar, T4 = Pyrochar + 10% de suelo contaminado con crudo, T5 = Pyrochar + 20% de suelo contaminado con petróleo crudo,
T6 = Suelo de control de desorción térmica, T7 = Desorción térmica + 10% de suelo contaminado con petróleo crudo, T8 =
Desorción térmica + 20% de suelo contaminado con petróleo crudo, T9 = Pyrochar + Suelo de control de desorción térmica, T10 =
Pyrochar + Desorción térmica + 10% de suelo contaminado con petróleo crudo, T11 = Pyrochar + Desorción térmica + 20% de
petróleo crudo contaminado. suelo V1 = Iceberg, V2 = Boston. Estos datos muestran las medias y la desviación estándar (n = 3).

dieciséis
Chl a v1 Chl a v2 Chl b v1

14 Chl b v2 Total Chl v1 Total Chl v2

12
Clorofila (μg / ml)

10

0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Tratos

Figura 2. Clorofila a, clorofila b, y contenido total de clorofila de dos variedades de lechuga que crecen en suelo contaminado
con petróleo crudo, pirocar, desorción térmica y su aplicación combinada remedió el suelo. Estos datos muestran las medias y la
desviación estándar (n = 3). Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0.05). El detalle de los tratamientos es el
mismo que en la Fig.1.

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Agua Poten al v1 Agua Poten al v2 MSI v1 MSI v2

2 100

1.8 90

1,6 80

Índice de estabilidad de la membrana (% de edad)

-Agua poten al (barras)
1.4 70

1.2 60

1 50

0,8 40

0,6 30

0.4 20
Tratos
0,2 10

0 0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11

Figura 3. Potencial hídrico e índice de estabilidad de la membrana de dos variedades de lechuga que crecen en suelo contaminado con
petróleo crudo, pirocar, desorción térmica, y su aplicación combinada remedia el suelo. Estos datos muestran las medias y la desviación
estándar (n = 3). Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0.05). El detalle de los tratamientos es el mismo que en la Fig.1.

Fisiología de las plantas. Hubo una disminución en la clorofila a (40% y 45% de disminución con un 10-20% de contaminación,
respectivamente), clorofila b (26% y 30% de disminución con un 10-20% de contaminación, respectivamente) y clorofila total (20%).
% y 25% de disminución a 10-20% de contaminación, respectivamente) contenidos (Fig. 2), con un aumento en la concentración de
crudo en comparación con la condición de suelos no contaminados. El tratamiento de aplicación combinada (Pyrochar y desorción
térmica) mejoró el crecimiento de la planta y el contenido total de clorofila en un 21 y 17% con una contaminación del 10-20%
respectivamente, en comparación con las plantas estresadas.
De manera similar, se observó que la presencia de un 10% y un 20% de contaminación por petróleo crudo disminuyó el potencial hídrico
en una vez y media, mientras que el tratamiento de aplicación combinada mejoró el potencial hídrico en un 33.6% y
26,9% a las respectivas concentraciones de petróleo crudo bajas (10%) y altas (20%) (Fig. 3). En nuestras observaciones, pyrochar aumentó el
potencial hídrico de la hoja en un 10% y un 21% con un 10-20% de contaminación, respectivamente. Mientras que la desorción térmica
mejoró el potencial hídrico en un 24% y un 20% con un 10-20% de contaminación, el tratamiento de pirólisis remediaba el suelo y mejoraba
los parámetros de la planta, respectivamente.
Por debajo del 10% y el 20% de contaminación por petróleo crudo, el índice de estabilidad de la membrana (MSI) disminuyó a
38,4% y 40,5% en comparación con el control. La adición de pirocáridos resultó en un aumento de 32% y 21,6% en el MSI en
plantas con ambos niveles de petróleo crudo. La desorción térmica mostró un aumento de 13% y 9.5% en comparación con las
plantas estresadas, mientras que el pirocar presentó un aumento respectivo de 18% y 11%, en comparación con el control
respectivo. Ambas variedades mostraron una respuesta similar.

Bioquímica vegetal. El estrés por contaminación por aceite provocó un aumento de prolina (33% y 43% de disminución con una
contaminación del 10-20%, respectivamente), el aminoácido libre (12% y 22% de disminución con un 10-20% de contaminación,
respectivamente), proteína total (18 % y 25% disminuyen a 10-20% de contaminación, respectivamente), y el contenido de azúcar
soluble (39% y 60% disminuyen a 10-20% de contaminación, respectivamente) en ambas variedades de lechuga (Fig. 4). El
tratamiento de aplicación combinado (pirocar y desorción térmica) aumentó el contenido de prolina en un 25% y 32% con una
contaminación del 10% y 20%, respectivamente, el pirocar mostró un menor aumento en el contenido de prolina (6% bajo control,
18% al 10% de contaminación y 9% al 20% de contaminación), mientras que la desorción térmica resultó en (25% de aumento en
condiciones de control, 30% en 10% de contaminación y 28% en 10% de contaminación, con respecto al control respectivo).

Se observó un aumento significativo en el total de aminoácidos mediante el tratamiento de aplicación combinado, es decir, 29% y 16%
con 10% y 20% de contaminación, respectivamente. Pyrochar aumentó el aminoácido total en un 24% y un 13% con una contaminación del
10-20%, respectivamente, mientras que la descontaminación térmica provocó un aumento del 30% y 27% con una contaminación del 10-20%,
respectivamente.
La concentración total de azúcar soluble de las plantas de lechuga se incrementó por la aplicación combinada en un 37% y
22% con un 10% y un 20% de contaminación, respectivamente, sin embargo, el pirocar aumentó el azúcar soluble total en un 26%
y un 20% con un 10% y un 20% de contaminación. y la desorción térmica aumentó 31 y 17% al 10% y 20% de contaminación,
respectivamente.
De manera similar, el contenido total de proteína aumentó por el tratamiento de aplicación combinado en un 27% y un 19% con una
contaminación del 10% y 20%, respectivamente. Pyrochar aumentó la proteína total en un 20% y un 17% con un 10% y un 20% de
contaminación, respectivamente, y la desorción térmica aumentó y un 22% y 18% con un 10% y un 20% de contaminación, respectivamente.
Los resultados fueron significativos en ambas variedades.

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Proline v1 Proline v2 Aminoácido total v1

Aminoácido total v2 Contenido total de proteínas v2 Azúcar soluble total v1
Azúcar soluble total v2 Contenido total de proteínas v1

20 12

18
10
dieciséis

14
8
Osmolito (µg g-1 FW)

Osmolito (µg g-1 FW

12

10 6

8
4
6

4
2
2

0 0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Tratos

Figura 4. Contenido de prolina, aminoácidos totales, azúcar soluble y contenido de proteína de dos variedades de lechuga que crecen en
suelo contaminado con petróleo crudo, pirocar, desorción térmica y su aplicación combinada remediación del suelo. Estos datos
muestran las medias y la desviación estándar (n = 3). Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0.05). El detalle de los
tratamientos es el mismo que en la Fig.1.

Antioxidantes vegetales. Se registró un aumento notable de antioxidantes en condiciones de contaminación con petróleo crudo (Fig. 5
). El tratamiento de aplicación combinada (Pyrochar y desorción térmica) aumentó la actividad de superóxido dismutasa en un 140% y un
100% en las plantas de lechuga cultivadas con un 10% y un 20% de contaminación, respectivamente. Pyrochar aumentó la SOD en un 55% y
un 34%, la desorción térmica en un 82% y un 68% con un 10% y un 20% de contaminación, respectivamente. El tratamiento de aplicación
combinada (Pyrochar y desorción térmica) reduce significativamente los efectos adversos de la contaminación del petróleo crudo al
aumentar la actividad de la catalasa en un 53% y 27% en plantas cultivadas con un 10% y un 20% de contaminación, respectivamente. El
aumento de catalasa por pirocar fue de 28% y 13% y la desorción térmica de 185% y 10% al 10% y 20% de contaminación por petróleo crudo,
respectivamente. Similar, Las plantas de lechuga cuando se trataron con un tratamiento de aplicación combinado (Pyrochar y desorción
térmica) mostraron una actividad de peroxidasa pronunciada en un 49% y 46% con una contaminación del 10% y 20%, respectivamente. El
tratamiento con Pyrochar mostró un aumento significativo del 9% y 13% en las plantas tratadas al 10% y 20% de contaminación por petróleo
crudo. Considerando que, la desorción térmica aumentó la actividad de la peroxidasa en un 25% y un 20% con un 10% y un 20% de
contaminación por petróleo crudo, respectivamente. Ambas variedades de lechuga respondieron a la biorremediación.

Respuestas del mapa de calor del coeficiente de correlación de Pearson (r). Para el análisis del mapa de calor, los datos
de ambas plántulas de lechuga bajo estrés de contaminación por aceite crudo se clasificaron como degradación de hidrocarburos,
enzimas antioxidantes, contenido de clorofila, producción de osmolitos, y cada grupo mostró correlaciones positivas (Fig. 6). Un
análisis comparativo de los factores relacionados con la degradación de hidrocarburos (presentados por recuadros verdes) sugirió
que la degradación de hidrocarburos en suelo contaminado tenía una correlación positiva con las actividades de aminoácidos,
potencial osmótico, azúcares solubles, prolina, MDA, SOD, POD y CAT. . Mientras que se observó una correlación negativa entre la
clorofila total y la MSI. Estos resultados indican que la eficiencia de degradación del tratamiento de aplicación combinada
(pirocarbón y desorción térmica) para la contaminación del petróleo crudo resultó en un mejor crecimiento de las plantas de
lechuga.

Discusiones
La contaminación por petróleo crudo afecta al sector agrícola particularmente debido a la toxicidad del suelo y la reducción del crecimiento
de las plantas. El petróleo crudo causa riesgos ambientales en el sistema ecológico del suelodieciséis, por inhibición del crecimiento de las
plantas, daño a la estructura del suelo, alteración de la calidad del agua del suelo, etc.17. La presente investigación fue diseñada para observar
el potencial de remediación de una nueva técnica de tratamiento de aplicación combinada (pirocar y desorción térmica), desorción térmica
sola y pirocar solo en el suelo contaminado con petróleo. Descubrimos que estos métodos no solo son beneficiosos para remediar el suelo,
sino que también son capaces de superar la naturaleza tóxica del petróleo crudo.
Pyrochar mejoró las características del suelo no solo bajo condiciones de control (sin contaminación) sino también bajo contaminación
por aceite. La desorción térmica tuvo poco efecto sobre las propiedades del suelo. Los resultados más prometedores se obtuvieron mediante
el tratamiento de aplicación combinado. Enmiendas de suelo con tratamiento de aplicación combinado

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SOD v1 SOD v2 Catalasa V1

Catalasa V2 Peroxidasa V1 Peroxidasa V2

7 500

450
6
400

5 350

300
SOD, CAT (UE)
4

POD (UE)
250
3
200

2 150

100
1
50

0 0
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11
Tratos

Figura 5. La actividad de las enzimas antioxidantes de dos variedades de lechuga que crecen en aceite crudo contaminado,
pirocar, desorción térmica, y su aplicación combinada remedia el suelo. Estos datos muestran las medias y la desviación
estándar (n = 3). Letras diferentes muestran diferencias significativas (p <0.05). El detalle de los tratamientos es el mismo que en
la Fig.1.

0,8

0,6

0.4

0,2

- 0,2

- 0,4

- 0,6

Figura 6. Respuestas del mapa de calor del coeficiente de correlación de Pearson (r) para la degradación del petróleo crudo,
enzimas antioxidantes, contenido de clorofila, producción de osmolitos de hojas de lechuga que crecen en suelo contaminado
con petróleo crudo tratado con pirocar, desorción térmica y su aplicación combinada. Mientras queTChl Clorofila total,
MSI Índice de estabilidad de la membrana, CATL Deja catalasa, PODL Deja peroxidasa, SODL Deja superóxido dismutasa, Automóvil
club británico Amioácido, Prol Prolina, OP Potencial osmótico, Sol Azúcares solubles.

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(pirocar y desorción térmica) mejoraron las propiedades del suelo. En la desorción térmica, los contaminantes del suelo son
desorbidos, movilizados y evaporados por el aumento de temperatura (de 100 a 600 ° C). Además, la desorción térmica también
promueve la biodegradación pero disminuye la fertilidad del suelo.18. Se dispone de estudios relativamente limitados sobre la
aplicación de pirocar en la remediación de suelos contaminados con contaminantes orgánicos.19. Sin embargo, actualmente se
sabe poco acerca de los efectos de la aplicación combinada de pirocar con la técnica de desorción térmica en la remediación de
suelos contaminados con petróleo. Sin embargo, se ha observado en el presente estudio que este tratamiento de aplicación
combinada mejoró eficazmente las características del suelo tanto al 10% como al 20% de contaminación por petróleo crudo. Esto
puede deberse posiblemente a la acción sinérgica del pirocarbón y la desorción térmica bajo su aplicación combinada en pirocar.
Esto se debe principalmente a la mayor capacidad de absorción de la mayor superficie y estructura microporosa de pyrocahr.
Pyrochar mejora el contenido de nutrientes del suelo para las poblaciones microbianas y absorbe compuestos hidrofóbicos con
más fuerza. La población microbiana mejorada estimula la descomposición de los hidrocarburos absorbidos y la utiliza como
fuente de carbono y energía. Mientras que la desorción térmica acelera la degradación de los hidrocarburos. En la desorción
térmica, las propiedades del suelo cambian y este tipo de suelo no favorece el crecimiento de las plantas. Entonces, en una
aplicación combinada con pirocar y desorción térmica, el pirocar mejora el estado de los nutrientes y retiene los hidrocarburos en
su superficie para la degradación por microbios y la desorción térmica, por lo que esto no solo ayuda en la degradación sino que
también mejora el estado de los nutrientes del suelo.
El tratamiento del suelo con tratamiento de aplicación combinado (pirocar y desorción térmica) mostró los resultados más prometedores
en la degradación del petróleo crudo. Existe una relación inversa entre la tasa de degradación de los hidrocarburos y el nivel de
contaminación del aceite, ya que la degradación de los hidrocarburos disminuye con un aumento de la contaminación del aceite. Este
tratamiento degradó los contaminantes del petróleo crudo en más miembros de compuestos de bajo peso molecular en ambos niveles de
contaminación (10% y 20%). En el tratamiento de aplicación combinada, tanto las técnicas de desorción térmica como las de pirocáridos
actuaron sinérgicamente y su aplicación combinada mejoró significativamente el potencial de degradación. La desorción térmica acelera las
degradaciones, mientras que el pirocar también ha demostrado el potencial de degradación del aceite y promueve la degradación
microbiana.20. Banat21 también informó que los compuestos orgánicos en el petróleo crudo podrían ser metabolizados por microbios que
degradan el petróleo que son estimulados por la enmienda del suelo. Biorremediación de suelos contaminados con petróleo crudo
estimulando la actividad de las bacterias mediante la adición de estiércol de aves22.
La remoción de la mayoría de los n-alcanos ocurrida por pyrochar indica que tiene el potencial en la remediación del petróleo
crudo. Los resultados son consistentes con los estándares establecidos para procesos de remediación efectivos.23. Pyrochar puede
aumentar la sorción de contaminantes orgánicos24. Kang y col.18 atribuyó la sorción térmica a la degradación de PAH. Por lo tanto,
la aplicación combinada de pirocáridos y desorción térmica se puede utilizar preferentemente para suelos contaminados con
aceite para el biotratamiento. El pirocarbón mejora el estado de los nutrientes del suelo para los microorganismos.25 incluidos los
carbonos orgánicos y se une con más fuerza a los compuestos orgánicos hidrófobos (HOC), como los HAP. La técnica de desorción
térmica es una tecnología de remediación muy útil porque es altamente efectiva para descontaminar contaminantes y químicos
orgánicos. Después del tratamiento térmico, la estructura y las propiedades del suelo se vieron afectadas y la porosidad del suelo
cambia, lo que no es fácil de recuperar.6. El sinergismo del pirocarbón y la desorción térmica dio como resultado una mayor
degradación de los n-alcanos a niveles de contaminación bajos (10%) y altos (20%).
En general, la contaminación por petróleo crudo mostró efectos adversos sobre el crecimiento de las plantas de lechuga al reducir el
vigor de la planta, la biomasa, el amarillamiento y el marchitamiento de las hojas. Sin embargo, todos los tratamientos del suelo mostraron
una reducción significativa en la toxicidad del petróleo crudo y, en última instancia, una mejora en el crecimiento de las plantas de lechuga.
Un nivel más alto de contaminación (20%) tuvo reducciones más drásticas en comparación con una baja contaminación de petróleo crudo
(10%). La aplicación de un tratamiento de aplicación combinado (pirocar y desorción térmica) da como resultado una mejor germinación de
la semilla, establecimiento de la planta y crecimiento; aumentando en última instancia la productividad de los cultivos13. La pirólisis de suelos
contaminados con aceite da como resultado una mayor capacidad de intercambio, área de superficie y adiciones directas de nutrientes y, por
lo tanto, mejores promociones de crecimiento.26. La técnica de desorción térmica es una tecnología de remediación muy útil porque es
altamente efectiva para descontaminar contaminantes y químicos orgánicos. Después del tratamiento térmico, la estructura y las
propiedades del suelo se vieron afectadas y la porosidad del suelo cambia, lo que no es fácil de recuperar.6. No se dispone de información
previa sobre la respuesta de la germinación de las plantas a la aplicación de pirocáridos o su aplicación combinada con desorción térmica.
Sin embargo, nuestros resultados muestran que esta nueva técnica de tratamiento de aplicación combinada (pirocar y desorción térmica)
funcionó mejor que las técnicas de pirocar y desorción térmica, por sí solas, y por lo tanto su aplicación puede mejorar significativamente el
crecimiento de las plantas y los atributos de germinación.
Varios estudios han informado del papel de estas técnicas de remediación en la mejora del crecimiento de las plantas.27
quienes también observaron una disminución en la biomasa de la planta bajo estrés por aceite. Nuestros resultados también se relacionan
con Laird et al.28, donde el peso fresco y el peso seco aumentaron debido a la enmienda de pirocar en el suelo. Por lo tanto, el pirocar puede
reducir las pérdidas de nutrientes por lixiviación al agregar nutrientes al suelo. La pirólisis del suelo fue eficaz en la remediación del suelo y la
biomasa del suelo aumentó en comparación con las plantas impuestas por estrés18. Una aplicación combinada de estos dos tratamientos
resultó más eficaz en la mejora del crecimiento de las plantas en condiciones de contaminación por petróleo crudo. Esto puede deberse a
que, dado que es una técnica de aplicación combinada, y el efecto combinado del pirocar y la desorción térmica pueden complementarse
entre sí y, por lo tanto, resultar más eficaces.
Los contenidos de clorofila a, by total de clorofila disminuyeron con un aumento en la concentración de petróleo crudo en comparación
con las condiciones del suelo no contaminado. Baruah y col.29, Se ha informado de una disminución similar en el contenido de clorofila de las
plantas. El tratamiento de aplicación combinada (pirocáridos y desorción térmica) mejoró el crecimiento de las plantas y el contenido de
clorofila. El pirocar y la pirólisis mejoraron los pigmentos de las plantas, pero sus efectos fueron menos pronunciados. El aumento en el
contenido de clorofila podría deberse a un aumento en la absorción de nutrientes por parte de la planta y a una disminución en la absorción
de petróleo crudo.30,31. Nuestros resultados se correlacionan con Ali et al.32, quienes informaron que el petróleo crudo afecta negativamente la
relación planta-agua-suelo, resultando en clorosis. Para mantener el potencial de presión, la planta necesita reducir el potencial osmótico.33.
Aunque se prevé que el uso de pirocáridos como enmienda del suelo aumentará los nutrientes del suelo y la eficiencia del uso del agua y,
por lo tanto, la productividad de los cultivos.34. El suelo tratado con Pyrochar tenía mejores concentraciones de nutrientes y contenido de
agua y, por lo tanto, mejoró las relaciones de agua de las plantas y, en última instancia, aumentó los pigmentos fotosintéticos de las plantas.

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El estrés provoca un aumento en el contenido de prolina, aminoácidos libres, proteínas totales y azúcar soluble en ambas
variedades de lechuga. La prolina actúa como un protector osmótico del estrés en respuesta a la tolerancia al estrés ambiental.35.
En condiciones de estrés, la prolina desempeña un papel en la estabilización de membranas, proteínas y otras estructuras
subcelulares y protege la célula mediante un mayor nivel de especies reactivas de oxígeno. Ayuda a mantener el pH y la presión
de turgencia de la célula.36. Wang et al.23. Se observó un aumento significativo en el total de aminoácidos, es decir, 29% y 16% con
10 y 20% de contaminación, respectivamente. Los aminoácidos actúan como osmorreguladores en plantas en condiciones de
estrés.34. En condiciones de estrés, los azúcares altamente solubles regulan funciones fisiológicas como la fotosíntesis, la
movilización de reservas y las exportaciones, mientras que la baja concentración de azúcar promueve el almacenamiento de
carbohidratos y la senescencia.37. En los hallazgos actuales, aunque el tratamiento con pirocarbón y pirólisis térmica mejoró el
contenido de prolina, aminoácidos y azúcar soluble bajo estrés de petróleo crudo, el mayor aumento se debió al sinergismo del
biocarbón y la desorción térmica.
Los antioxidantes protegen a la célula de cualquier daño causado por el citotóxico O2, por escala su conversión a H2O2
y O2 en todos los compartimentos subcelulares. El tratamiento de aplicación combinada (pirocar y desorción térmica)
mejoró significativamente los sistemas antioxidantes de las plantas y ayudó a las plantas a prevenir daños por reactivos.
especies de oxígeno. El tratamiento con Pyrochar mostró un aumento significativo del 9% y 13% en las plantas tratadas con un
10% y un 20% de contaminación por petróleo crudo. Los procesos de remediación pueden aumentar los antioxidantes al estimular
la ingesta de nitrógeno y fósforo, que interactúan con los carbohidratos como antioxidantes no enzimáticos.38.
El análisis de correlación mostró que la degradación de hidrocarburos en suelos contaminados se correlaciona positivamente con el
crecimiento de las plantas de lechuga al regular las respuestas de defensa de las plantas, incluidas las enzimas antioxidantes y los osmolitos.
Este estudio establece la relación entre el potencial de degradación de la nueva técnica de tratamiento de aplicación combinada (pirocar y
desorción térmica) con propiedades mejoradas del suelo y, en última instancia, en el crecimiento de las plantas.

Conclusión y perspectivas de futuro

Los resultados de la presente investigación han demostrado el potencial de biorremediación de una nueva técnica de tratamiento de
aplicación combinada (pirocar y desorción térmica), para la contaminación por petróleo crudo que también mostró un potencial de
crecimiento significativo para las plantas de lechuga. Mejoró los parámetros morfológicos, fisiológicos y bioquímicos de la planta. Los
tratamientos de pirolisis térmica y de pirolisis, por sí solos, tenían sus limitaciones en términos de tasas de degradación lentas y menor
eficiencia en el crecimiento de las plantas, respectivamente. Sin embargo, la aplicación de tratamiento de aplicación combinada demostró ser
eficaz en ambos procesos y, por tanto, se puede utilizar a mayor escala en suelos donde la contaminación por petróleo crudo es un problema
grave, particularmente para la producción agrícola.

Metodología
Preparación de suelo. Se obtuvieron muestras de suelo no contaminado del área de campo experimental de PMAS-
Agriculture University, Rawalpindi, que no había tenido exposición previa a hidrocarburos. El suelo se tamizó y se dividió
en tres partes, 1/3 del suelo se mantuvo limpio y se tomó como control, la segunda fue Contaminación de petróleo crudo
bajo contaminado con 10% (p / p) y la tercera parte fue Crudo alto petróleo Contaminación contaminada con 20% de
petróleo crudo (p / p), respectivamente.
Pyrochar se produjo por pirólisis de aserrín y virutas (Dalbergia sisso L.) recogidos del local
mercado. Estos se secaron al aire y se pirolizaron a 350 ° C en un horno de mufla, luego se molieron y se pasaron a través de un tamiz de 200
µm antes de su uso. La desorción térmica se realizó mediante pirólisis del suelo. Se tomaron muestras de suelo en crisoles pesados
previamente y se pirolizaron a 500 ° C en horno de mufla con tiempo de residencia de 60 min.18.
Se llenaron macetas de barro con 10 kg de suelo y se mantuvieron al 20% de humedad mediante agua destilada.39. El
suelo se incubó durante un período de 120 días antes de la siembra. Se cultivaron dos variedades de lechuga (V1 =
Icerberg; V2 = Boston) en suelo control y suelo contaminado con 10% y 20% de aceite crudo. Se probaron tres tipos de
métodos de tratamiento; Aplicación combinada de pirocar y desorción térmica, pirocar solo y desorción térmica sola bajo
control de suelo y suelo contaminado con 10% y 20% de petróleo crudo. La lista de condiciones de prueba se ha
mencionado en la Tabla3.

Análisis de suelos. Se analizaron muestras de suelo de todos los tratamientos para determinar la capacidad de retención de agua.40. Se
utilizó pasta de suelo saturada para medir el pH y la conductividad eléctrica.41. El carbono orgánico del suelo se midió mediante el método de
oxidación de Walkley y Black42. Se utilizó el método del acetato de sodio para medir la capacidad de intercambio catiónico.43.
Análisis de la textura del suelo, macro y micronutrientes44, análisis de nutrientes disponibles45 también se hizo.

Determinación del porcentaje de biodegradación. El porcentaje de degradación del aceite se calculó utilizando la
siguiente fórmula:

Biodegradación (%) = TC - TT / TC × 100

mientras que TPH es el hidrocarburo de petróleo total, TC es el TPH en el control y TT es el TPH en el

tratamiento.

Determinación del contenido de hidrocarburos de muestras de suelo por GC – MS. Los hidrocarburos totales de
petróleo (TPH) de todas las muestras de suelo se determinaron mediante el método EPA 8015C (USEPA) con una ligera variación24.
Brevemente, la extracción se realizó utilizando diclorometano con el método de ultrasonidos y se analizó gravimétricamente. Los
extractos se transfirieron a viales de tara más cercanos a 0,0001 gy se expresaron como g TPH kg-1 suelo seco. Los compuestos
orgánicos (es decir, C10 a C28) en los extractos se cuantificaron mediante una cromatografía de gases Agilent 6890 acoplada con
espectrometría de masas de tiempo de vuelo y equipados con columna capilar de sílice.

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Variedades de lechuga / germoplasma

V1 Variedad de lechuga iceberg)

V2 Variedad de lechuga Boston

Tratos
T0 Suelo de control (suelo no contaminado) 10% de suelo

T1 contaminado con petróleo crudo 20% de suelo

T2 contaminado con petróleo crudo Pyrochar Suelo de

T3 control tratado Pyrochar + 10% de suelo contaminado

T4 con petróleo crudo Pyrochar + 20% de crudo

T5 contaminado Suelo de control de desorción térmica

T6
T7 Desorción térmica + 10% de suelo contaminado con petróleo crudo

T8 Desorción térmica + 20% de suelo contaminado con petróleo crudo

T9 Aplicación combinada de suelo de control tratado con pirocáridos y desorción térmica

T10 Aplicación combinada de pirocarbón tratado con desorción térmica + suelo contaminado con petróleo crudo al 10%

T11 Aplicación combinada de tratado con desorción térmica y pirocarbón + 20% de suelo contaminado con petróleo crudo

Tabla 3. Detalle de tratamientos y su abreviatura.

Potencial de las técnicas de remediación de los atributos de germinación de la planta de lechuga. Se realizó
un experimento de germinación en el laboratorio de fisiología de la PMAS Arid Agriculture University, Rawalpindi. Semillas de dos
variedades de lechuga (Iceberg y Boston) obtenidas del Centro Nacional de Investigación Agrícola de Islamabad, se esterilizaron
en superficie tratándolas con una solución de hipoclorito de sodio (1%) durante 5 min.46. Después de eso, las semillas se lavaron
sucesivamente con agua destilada y se colocaron en placas de Petri. Hubo un total de once tratamientos en este experimento que
se describen en la Tabla complementaria 1. Porcentaje de germinación, índice de vigor de la plántula e índice de rapidez46 se
midieron para cada tratamiento.

Potencial de las técnicas de remediación de los atributos de crecimiento de la planta de lechuga. Se llevó a cabo un
experimento con macetas en el invernadero del Departamento de Botánica, PMAS-AAUR, Rawalpindi. Se aplicó un diseño aleatorio completo
(CRD) con tres repeticiones. Los tratamientos fueron los mismos que los descritos en la sección anterior. Se sembraron siete semillas
esterilizadas de cada variedad por maceta que posteriormente fue aclarada. Las plantas se recolectaron a los 45 días de la siembra. Se
registró la biomasa fresca y seca. El área foliar se midió con la ayuda de un medidor de área foliar. Todas las muestras se recogieron en
bolsas con cierre y se almacenaron a una temperatura de -20 ° C en el congelador para realizar más ensayos bioquímicos. En los parámetros
morfológicos se analizaron longitud de raíz, longitud de brote, peso fresco / seco de brote, peso fresco / seco de raíz y área foliar.

Análisis fisiológico. Se analizó el potencial hídrico de las hojas de lechuga, utilizando la cámara de presión de
acuerdo con el protocolo de Scholander.47. Las hojas cortadas se insertaron en el portamuestras del recipiente a presión
del instrumento. La presión se acumuló gradualmente dentro del recipiente a presión hasta que la savia comenzó a salir
del extremo cortado expuesto de la hoja. La lectura en este punto correspondió a la fuerza negativa con la que se
mantuvo el agua dentro de esa muestra de hoja. Se anotó y expresó en — MPa.
El potencial osmótico se determinó optando por el procedimiento de Capell y Doerffling48. Las hojas de cada tratamiento se
colocaron en una jeringa de plástico de 3 ml y se almacenaron a -20 ° C en un congelador. Después de unos días, cuando las hojas
se congelaron, se sacaron estas jeringas y se presionaron para recolectar la savia de las hojas de las muestras descongeladas en
tubos Eppendorf. Se tomaron los 10 µL de cada muestra, las lecturas se obtuvieron mediante osmómetro de presión de vapor
(VIESCOR 5520 VX R) en mmol / kg y estos valores se convirtieron en (-MPA) con (la) ayuda de esta fórmula

Potencial osmótico = Osmolalidad (mmol) × 0,831 × 10-5T ◦K

donde T es la temperatura expresada en ° K.

Para determinar el índice de estabilidad de la membrana (MSI), Premchandra et al.49, método que se utilizó. Para ello, se lavaron
cuidadosamente discos de hojas de 100 mg primero con agua del grifo y luego con agua bidestilada. Después del lavado, los discos de hojas
se calentaron en 10 ml de agua bidestilada a 40 ° C en un baño de agua durante 30 min. Después de 30 minutos,
conductividad eléctrica (C1) de esta muestra se anotó utilizando el medidor de CE. Después de anotar la primera lectura de CE, la
misma muestra se colocó en un baño de agua a 100 ° C durante 10 min. y después de este proceso, la conductividad eléctrica (C2)
fue grabado de nuevo. Para calcular la membrana (estabilidad i) ndex se utilizó la siguiente ecuación

C1
MSI = 1- × 100
C2
Arnón50 Se optó por el método para estimar el contenido de clorofila y carotenoides de las muestras de hojas. Las
hojas se pesaron y luego se trituraron en un mortero limpio. Se añadieron 5 ml de acetona al 80% a cada muestra
triturada. A continuación, esta muestra se centrifugó y el sobrenadante se introdujo en la cubeta del espectrofotómetro.
La absorbancia del extracto se registró a diferentes longitudes de onda, es decir, 663 nm y 645 nm y 470 nm. La

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Los valores de clorofila a, b, clorofila total y carotenoides se calcularon mediante las siguientes fórmulas dadas por
Lichtenthaler y Welburn.51

Clorofila a (µg / ml) = 12,21 (A663) - 2,81 (A645)

Clorofila B (µg / ml) = 20,13 (A645)-5,03 (A663)

Clorofila total (µg / mL) = (20,2( A645) + 8.02( A66 (3)

[ ) )]
Contenido de carotenoides (µg / mL) = 1000A470 - 3.27 clorofila a -104 clorofila B /227

Análisis bioquímico. La prolina se midió siguiendo el método de Bates et al.52. El material foliar (0,1 g) se
homogeneizó con 4 mL de ácido sulfosalicílico (3,0%) con la ayuda de un mortero y mortero. Esta muestra se mantuvo
previamente durante la noche a 5 ° C. La suspensión se centrifugó a temperatura ambiente a 3000 rpm durante 5 min; El
sobrenadante se mezcló con 4 ml de reactivo de ninhidrina acético y se agitó mecánicamente y el contenido de los tubos
se calentó durante una hora a 100ºC. Luego de enfriar el contenido en los tubos y esta solución se extrajo con 4 mL de
tolueno con la ayuda de un embudo de decantación. Luego se separó la capa de tolueno y se registró su absorbancia con
un espectrofotómetro a 520 nm. La concentración de prolina de estas muestras desconocidas se calculó utilizando la
curva estándar de prolina.
La proteína soluble se determinó siguiendo el método de Lowry et al.53, utilizando albúmina de suero bovino (BSA)
como estándar. Se molieron hojas frescas (0,1 g) en 1 mL de tampón fosfato de sodio (pH 7,5) con la ayuda de un
mortero y esta mezcla se centrifugó a 3000 rpm durante 10 min. El sobrenadante (0,1 mL) se tomó en los tubos de
ensayo. Se hizo un volumen total de 1 mL con la ayuda de agua destilada. 1 ml de reactivo preparado mezclando 50 ml de
solución A (2,0 g de Na2CO3) Se disolvieron 0,4 g de NaOH (0,1 N) y 1 g de tartrato de Na-K en 100 ml de agua destilada)
y 1 mL de solución B (CuSO4.5H2Se añadió O (0,5 g) disuelto en 100 ml de agua destilada). Después de agitar durante 10 min. Se
añadió 0,1 mL de reactivo de fenol Folin (diluido con agua destilada en la proporción 1: 1). Después de 30 minutos
la absorbancia de cada muestra se registró a 650 nm después de 30 min.
Para la cuantificación de aminoácidos libres, la muestra de hoja (cada 0.5 g) se molió en 10 mL de tampón de fosfato
de potasio. La mezcla se centrifugó a 12.000 xgramo a 4 ° C. A 1 mL del sobrenadante se le añadió 1 mL de ninhidrina
(2%) y 1 mL de piridina (10%) y la mezcla se colocó en un baño de agua durante 30 min. Después de enfriar todas las
muestras, se leyó la absorbancia a 750 nm usando un espectrofotómetro54.
Dubois y col.55, el método se utilizó para estimar el contenido de azúcar de las hojas. El material de las hojas (0,5 g) se trituró
con la ayuda de un mortero y un mortero limpios, a este material se le añadieron 10 mL de agua destilada. Luego se filtró este
material homogeneizado. Se tomaron 0.1 mL del filtrado de cada muestra en el tubo de ensayo separado.
y 1 mL de (5% v / v), se añadió fenol y se dejó a temperatura ambiente durante una hora. Después de 1 h 5 mL de H2ENTONCES4
se añadió a los tubos de ensayo. Luego se anotó la absorbancia de cada muestra a 420 nm mediante un espectrofotómetro. La
Se utilizó una curva estándar de solución de glucosa de concentración conocida para estimar el contenido de azúcar de las muestras.
El extracto de enzima se preparó triturando un gramo de hoja en nitrógeno líquido. El polvo obtenido se
añadió en 10 ml de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) y se mezcló con 1 m de ácido metilendiaminotetraacético
(EDTA) y polivinilpirrolidona (PVP) al 1%. Toda la mezcla se centrifugó a 13.000 xgramo durante 20 min a 4ºC. El
sobrenadante se utilizó para el ensayo enzimático.
El contenido de catalasa (CAT) se estimó observando la degradación de H2O2 a 240 nm56. Actividad de catalasa
(U mg de proteína−1) se calculó a partir del coeficiente de absorción molar de 40 mm−1 cm−1 Para H2O2. La peroxidasa
dismutasa (POD) se determinó siguiendo el procedimiento de Rao57. La mezcla de reacción constaba de 10
μL de extracto de enzima crudo, 20 μL de guayacol 100 mM, 10 μL de 100 mMH2O2, y 160 µl de acetato de sodio
50 mM (pH 5,0). La absorbancia se registró a 450 nm.
La actividad de la superóxido dismutasa (SOD) se determinó mediante el método de Beauchamp y Fridovich58. La
mezcla de reacción (3 ml) estaba compuesta por metionina 13 mM, NBT 0,075 mM, EDTA 0,1 mM, riboflavina 0,002 mM y
0,1 ml de extracto enzimático en tampón fosfato 50 mM (pH 7,8). La mezcla en el tubo se colocó bajo luz fluorescente
durante 15 minutos, después de eso, la reacción se detuvo apagando las luces. Se usó una mezcla de reacción completa
(no irradiada) como blanco. La absorbancia se leyó a 560 nm con un espectrofotómetro. Una unidad de actividad de SOD
se definió como la cantidad de enzima, que redujo la lectura de absorbancia en un 50% en comparación con el control
(que carece de enzima).

Análisis estadístico. Se calcularon los parámetros morfológicos, fisiológicos y bioquímicos y los datos se sometieron al
análisis de varianza (ANOVA) mediante el uso del software de estadística 8.1. Los valores medios se compararon por la
diferencia mínima significativa (LSD) a P≤0.0559 Se generó un mapa de calor para el coeficiente de correlación
usando la herramienta web clustvishttps://biit.cs.ut.ee/clustvis/).

Recibido: 12 de julio de 2020; Aceptado: 18 de enero de 2021

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Referencias
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Contribuciones de autor
NI: Conceptualización, Redacción-Anteproyecto, Supervisión. EE.UU .: Investigación, redacción: borrador original. MS:
Investigación (GC-MS), Redacción: borrador original. NA: Escritura-Borrador original. HY: Redacción de análisis formal:
revisión y edición. WK: Análisis formal, redacción-revisión y edición. SI Redacción-Revisión y Edición.

Conflicto de intereses
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