El refuerzo impulsa la rápida especiación alopátrica

Conrad J. Hoskin, Megan Higgie, Keith R. McDonald & Craig Moritz

La especiación alopátrica es el resultado del aislamiento geográfico entre

poblaciones. En ausencia de flujo genético, el aislamiento reproductivo surge de
forma gradual e incidental como resultado de la mutación, la deriva genética y los
efectos indirectos de la selección natural que impulsa la adaptación local. En cambio,
la especiación por refuerzo está impulsada directamente por la selección natural
contra la hibridación inadaptada. Esto da a los individuos que eligen los rasgos de su
propio linaje una mayor aptitud, lo que puede conducir a una rápida especiación entre
los linajes. El refuerzo de la selección natural en una población de uno de los linajes
en una zona de contacto en mosaico también podría dar lugar a la divergencia de la
población del rango alopátrico de su propio linaje fuera de la zona. Aquí
comprobamos esto con datos moleculares, cruces experimentales, mediciones de
campo y experimentos de elección de pareja en una zona de contacto en mosaico
entre dos linajes de una rana de la selva tropical. Mostramos que el refuerzo de la
selección natural ha resultado en un significativo aislamiento prematrimonial de una
población en la zona de contacto no sólo del otro linaje sino también,
incidentalmente, del rango principal estrechamente relacionado de su propio linaje.
Así, mostramos el potencial del refuerzo para impulsar una rápida especiación
alopátrica.

Aunque el papel de la selección natural reforzadora en el impulso de la especiación

alopátrica dentro de un linaje ha recibido poca atención, su papel en las etapas finales de la
especiación entre linajes hermanos divergentes ha tenido una historia larga y polémica -
algunos consideran que hay ejemplos convincentes, mientras que otros sostienen que las
pruebas empíricas no son en general concluyentes. La incertidumbre se debe a que deben
cumplirse criterios estrictos para demostrar el proceso de refuerzo de forma inequívoca: en
primer lugar, que se produzcan apareamientos heteroespecíficos en el campo; en segundo
lugar, que haya selección contra la hibridación; en tercer lugar, que el desplazamiento de un
rasgo sea percibido por el otro sexo; en cuarto lugar, que la variación del rasgo sea
heredable y responda a la selección; y, por último, que el desplazamiento no se haya
producido por otras razones, como la divergencia ecológica. Demostrar que este proceso
puede completar la especiación requiere demostrar que ha dado lugar a un aislamiento
reproductivo significativo entre los linajes. Además, las pruebas del refuerzo son más
convincentes dentro de un marco biogeográfico histórico bien corroborado.

La rana arborícola de ojos verdes Litoria genimaculata es una rana hílida que se reproduce
en los arroyos y que es común en la selva tropical en toda la región de “Trópicos Húmedos”
del noreste de Queensland, Australia. Como muchas otras especies de los Trópicos
Húmedos, L. genimaculata consiste en dos linajes altamente divergentes, el norte (N) y el
sur (S) (Fig. 1a), reflejando el aislamiento a largo plazo en los refugios de la selva tropical
del norte y del sur durante los períodos más fríos y secos de las épocas del Plioceno y del
Pleistoceno. Las selvas de los refugios del norte y del sur volvieron a conectarse hace unos
6.500 años, lo que hizo que los linajes de L. genimaculata entrarán en contacto secundario
en una zona de sutura. La zona de contacto secundario en esta especie es un mosaico que
consiste en el "contacto A" principal, así como en un segundo contacto (B) que implica a un
aislado geográfico reciente del linaje S (iS en adelante) dentro del área de distribución del
linaje N (Fig. 1b). Aquí comprobamos si se ha producido una especiación por refuerzo entre
los dos linajes en el contacto A o en el contacto B y, si es así, si esto ha impulsado
incidentalmente la especiación alopátrica entre la población iS y el área de distribución
principal del linaje S, genéticamente similar.

El análisis genético reveló que la hibridación entre los linajes se produce en el campo,
aunque es geográficamente más amplia (6,0 km frente a 0,6 km), y significativamente más
frecuente (3,1-6,8% de híbridos frente a 0-1,4%; prueba de razón de verosimilitud, LI = 8,46,
P = 0,015), en el contacto A que en el contacto B. Para que el proceso de refuerzo funcione,
debe haber selección contra la hibridación. Lo comprobamos realizando cruces
experimentales entre los linajes N y S/iS. La viabilidad de los cruces híbridos fue muy
asimétrica (prueba de cociente de probabilidad, LI = 20,73, P < 0. 001): todos los cruces que
implicaban una hembra S o iS con un macho N fracasaron en el estadio de renacuajo
temprano, mientras que todos los cruces recíprocos tuvieron éxito hasta la terminación del
experimento en el estadio de renacuajo tardío o en la metamorfosis, aunque con un
desarrollo significativamente más lento que los cruces de control dentro del linaje N (análisis
univariante de la varianza (ANOVA), F₁,₁₀= 9,526, P = 0,012). La asimetría en la viabilidad
está respaldada por el análisis genético de las zonas de contacto, que reveló que ninguno
de los híbridos portaba ADN mitocondrial (ADNmt) de S. Por lo tanto, existe una fuerte
selección contra la hibridación con hembras S o iS y una selección potencialmente leve
contra los híbridos procedentes de cruces con hembras N.

Evaluamos el desplazamiento de caracteres en la morfología y la llamada de apareamiento

en la zona de contacto. Un patrón de desplazamiento de caracteres es una firma potencial
de refuerzo, aunque también podría ser causado por otros factores. La morfología no es el
determinante directo de la elección de pareja en estas ranas; sin embargo, se evaluó para
comprobar si cualquier divergencia en este rasgo está ligada al rasgo de elección de pareja
(llamada del macho) o a la divergencia ecológica. Como se encontró para otras especies de
los Trópicos Húmedos con linajes filogeográficos divergentes, no hubo diferencia entre el
tamaño o la forma del cuerpo N y S lejos del contacto para ninguno de los sexos
(Información Suplementaria). Además, a lo largo de la zona de contacto, no hubo
diferencias entre N, S e iS para el tamaño de las hembras y la forma de los machos
(Información Suplementaria).La única diferencia morfológica detectada fue una reducción
del 20% en el tamaño medio del cuerpo de los machos de iS en el contacto B (Fig. 2). Como
la mayoría de las ranas, la elección de pareja en L. genimaculata está mediada
principalmente por la elección de las hembras de un único rasgo- la llamada del macho.Esto
hace que las ranas sean uno de los mejores grupos para estudiar el refuerzo. Un análisis de
las grabaciones de campo en la región de contacto reveló que las llamadas de los machos
N, S e iS difieren significativamente entre sí (Fig. 3). Los machos iS han divergido en
tamaño y llamada de todos los demás machos S, mientras que los machos S en el contacto
A no difieren de los que están fuera de la región de contacto (Información Suplementaria y
Figs. Suplementarias 3, 4).

Si el refuerzo está operando en este sistema, podemos hacer dos predicciones sobre el
impacto de la divergencia de llamadas en la elección de pareja. En primer lugar, las
hembras del sur deberían elegir correctamente más a menudo que las hembras del norte
porque el coste de la hibridación es mayor para ellas, y en segundo lugar, la mayor
divergencia en la llamada de los machos de iS debería resultar en un apareamiento asortivo
más fuerte en el contacto B que en el contacto A. En consonancia con estas predicciones,
las pruebas de elección de dos hembras revelaron lo siguiente: primero, las hembras del
linaje del sur (iS y S) fueron significativamente mejores en la elección de su propio linaje
que las hembras del norte (Fig. 4), y segundo, hubo un aislamiento prematrimonial
significativamente más fuerte en el contacto B que en el contacto A, hasta el punto de un
apareamiento asorta positivo altamente significativo entre los linajes en el contacto B (Fig.
4). Los resultados genéticos apoyan estos patrones en el sentido de que hay
significativamente menos híbridos en el contacto B (0-1,4%) que en el contacto A (3,1-
6,8%), y ninguno con ADNmt S. El aislamiento reproductivo casi completo en el contacto B
nos lleva a concluir que los dos linajes se han especiado en el contacto B pero no en el
contacto A.

Más arriba, hemos satisfecho cuatro de los cinco criterios de Howard para demostrar el
refuerzo, y además hemos demostrado que este proceso ha dado lugar a la especiación: la
hibridación se produce en el campo; hay una fuerte selección postcigótica contra los
híbridos; la elección de pareja en este sistema está determinada principalmente por un
único carácter genéticamente determinado, la llamada de la rana; y la divergencia en este
carácter en el contacto B ha aumentado el aislamiento prematrimonial entre los dos linajes
hasta el punto de un aislamiento reproductivo significativo. El último requisito es desentrañar
los efectos de la ecología en la divergencia de rasgos. La divergencia en el tamaño del
cuerpo y la llamada de los machos iS no parece estar relacionada con factores ecológicos
por las siguientes razones: en primer lugar, las hembras no muestran divergencia de
tamaño a lo largo de la región de contacto, y no hay divergencia en la forma de los machos,
como podría esperarse de una divergencia impulsada por la ecología; y en segundo lugar,
las distribuciones de N, S e iS no muestran ninguna relación con las características del
hábitat (para la vegetación, LI = 7. 77, P = 0,133; para el sustrato del arroyo, LI = 1,49, P =
0,837; para el flujo del arroyo, LI = 0,41, P = 0,888).

La divergencia de la llamada de iS, que ha dado lugar a la especiación de N en el contacto

B, ha conducido incidentalmente a una divergencia significativa de la llamada de iS con
respecto a la del resto del linaje del sur (Fig. 3 y Fig. Suplementaria 4). Para comprobar si
esta divergencia en la llamada ha dado lugar a un aislamiento prematrimonial, se realizaron
pruebas de elección de pareja en las que las hembras iS y S podían elegir entre la llamada
de un macho iS o S. Hubo un completo aislamiento prematrimonial: en todos los
experimentos, tanto las hembras iS como las S eligieron la llamada del macho de su propio
grupo (prueba de relación de probabilidad, LI = 19,12, P < 0,001). Esta especiación
alopátrica dentro del linaje del sur parece haber ocurrido rápidamente porque hay una
divergencia de secuencia muy baja entre iS y S y comparten haplotipos (Fig. 1). Esto
demuestra un doble papel de la selección natural en la especiación: la selección natural que
actúa directamente contra la hibridación en una zona de contacto también puede impulsar
indirectamente una rápida especiación alopátrica. Esto amplía significativamente el papel
del refuerzo de los trabajos anteriores, al mostrar, sin que medie la ecología ni las
poblaciones intervinientes, la especiación de una población de la zona de contacto, tanto de
otro linaje como de su propio linaje, como resultado del refuerzo de un rasgo de elección de
pareja. Se ha considerado que el refuerzo sólo desempeña un papel en las etapas finales
de la especiación entre linajes ya diferenciados, mientras que los presentes resultados
muestran la posibilidad de que el refuerzo sea la única causa de la especiación.
Las preguntas que surgen de esta investigación son las siguientes. En primer lugar, ¿por
qué los machos de iS son tan pequeños, dada la falta de divergencia morfológica en las
hembras de iS? Proponemos que la reducción del tamaño de los machos podría haber sido
impulsada por la selección sexual sobre la llamada de los machos de iS. Debido a la fuerte
relación entre la divergencia de la llamada y el tamaño del cuerpo en iS (Información
Suplementaria, y Fig. 5 Suplementaria), cuanto más divergente es la llamada del macho de
iS elegido por las hembras respecto a los otros grupos, más pequeño es el macho
seleccionado. En segundo lugar, dado que la penalización posterior a la hibridación por
parte del linaje del sur es la misma en ambos contactos, ¿por qué el refuerzo ha sido
efectivo en el contacto B pero no en el contacto A? La principal diferencia entre los
contactos A y B es el tamaño del rango de la población parental del linaje del sur: en el
contacto A es muchas veces mayor que la zona de contacto, mientras que en el contacto B
es de menor anchura que la zona de contacto. Nuestros datos son consistentes con la
sugerencia de que si el área de la población parental es suficientemente pequeña en
relación con el área de solapamiento y la distancia de dispersión (no medida en este
estudio), los efectos de dilución del flujo de genes de la población parental serían limitados,
y una parte suficiente de la población podría estar expuesta a la hibridación desadaptativa
como para que un rasgo reforzado pudiera extenderse por toda ella, dando lugar a la
especiación. La prevalencia de dicha especiación en la naturaleza puede estar limitada por
la probabilidad de extinción de la pequeña población en el contacto inicial.
Figura 1 | Distribución de los linajes N (sombreado pálido) y S (sombreado oscuro) de L.
genimaculata. a, La distribución de N y S y un árbol que muestra divergencia genética (porcentaje) y
el número de individuos con cada haplotipo. b, Una ampliación ampliación de la región dentro del
rectángulo en a, mostrando el contacto en mosaico entre los linajes N y S. La población iS comparte
haplotipos (con un 0,1% de divergencia neta global) con poblaciones cercanas del área de
distribución principal del linaje S (a) pero actualmente está aislada de ellas (estadística de subdivisión
poblacional Fst = 0,20, P < 0.001). Por el contrario, las poblaciones N son continuas y genéticamente
conectadas (al norte frente al sur del río Barron; Fst = - 0,01 P = 0,60) a través del contacto del
mosaico.

Figura 2 | Divergencia en el tamaño corporal de los machos en la zona de contacto del

mosaico. Los gráficos de caja muestran la mediana, los cuartiles 25 y 75, y los datos mínimos y
máximos del primer componente principal (PC1). Los números mostrados sobre los gráficos de caja
indican el número de individuos. PC1 representa el tamaño corporal y explica el 90% de la variación
entre N, iS y S. El tamaño de los machos difiere significativamente (ANOVA en PC1, F ₂,₂₄ = 35,42,
P < 0,001) porque los machos iS son significativamente más pequeños que los machos N (contraste,
F ₁,₁₆ = 20,63, P < 0,001) y los machos S (contraste, F ₁,₁₆ = 18,58, P < 0,001).

Figura 3 | Divergencia en la llamada a través de la zona de contacto del mosaico. Los gráficos
de caja muestran la mediana, los cuartiles 25 y 75, y los datos mínimo y máximo datos de la primera
variante canónica (CV1). Los números mostrados sobre los gráficos de caja indican el número de
individuos. La CV1 explica el 93,8% de la variación entre N, iS y S. La llamada difiere
significativamente entre los grupos (MANOVA sobre tres caracteres de llamada, F ₆,₁₂ = 11,28, P <
0,001), con la llamada de S difiere significativamente de la llamada N (contraste, F ₃,₆ = 12,80, P =
0,005), y la llamada iS difiere significativamente de la llamada N (contraste, F ₃,₆ = 34,67, P < 0,001)
y la llamada S (contraste, F ₃,₆ = 9,29, P = 0,011).

Figura 4 | Elección femenina de las llamadas masculinas en los contactos A y B. Las hembras del
linaje del sur (iS y S) mostraron una elección significativamente mejor, corregida por el efecto del contacto, que
las hembras de N (modelo lineal generalizado, cambio de desviación ∆dev = 4,33, grados de libertad, d.f. = 1, P
= 0,037). Además, el aislamiento prematrimonial, corregido por el linaje, fue significativamente más fuerte en
contacto B que en el contacto A (modelo lineal generalizado, ∆dev = 5,42, d.f.= 1, P = 0.020). Hay un
aislamiento prematrimonial significativo entre los linajes del norte y los linajes del sur en el contacto B (prueba
de relación de verosimilitud, LI = 12,79, P = 0,003) pero no en el contacto A (prueba de relación de
probabilidad, LI = 0,105, P = 1.000). Columnas blancas, macho N; columnas negras, macho S; columnas grises,
iS macho. Los números mostrados indican el número de hembras.

Métodos
Muestreo y análisis genéticos. Los lugares de muestreo se presentan en las Figs 1 y 2. El
muestreo en los contactos A y B consistió en transectos de arroyos y sitios dispersos que
cubren la amplitud de la zona. El material genético se tomó de las puntas de los pies. El
árbol se construyó a partir de 527 pares de bases de ADNmt CO1 (cebadores Cox y Coy)
de 141 individuos (58 N, 66 S y 17 iS) de toda el área de distribución, utilizando la unión de
vecinos con estimaciones de distancia de dos parámetros de Kimura. CO1 (secuenciación y
prueba de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) se utilizó para examinar
787 individuos de 68 lugares de 40 drenajes. La zona de contacto se caracterizó utilizando
el CO1 y dos marcadores nucleares.

Se examinaron dos loci nucleares casi diagnósticos, LITGEN02 y CRYBA, en 619

individuos: 63 N y 80 S (6 drenajes en cada uno) de fuera de la región de contacto, y 248
(13 sitios, 4 drenajes) y 228 (10 sitios, 4 drenajes) de los contactos A y B, respectivamente.
El estatus de los individuos se dedujo mediante combinación del ADNmt y la inferencia
bayesiana (con 'NewHybrid') de los genotipos nucleares. Presentamos los porcentajes de
hibridación tanto de un criterio estricto, P (desajuste del genotipo nuclear con el genotipo
mitocondrial) >0,9 y un criterio más relajado, 0,7 > P > 0,5, para identificar posibles híbridos.
Ambos criterios dieron resultados similares.

Análisis estadísticos: comentarios generales. Todos los análisis de morfología y llamada

se anidaron por drenaje. Los contrastes previstos, no ortogonales, N versus S, N frente a iS,
y S frente a iS- se utilizaron para los análisis de morfología y llamadas. Los valores de
significación se compararon con valores secuenciales de Bonferroni. Todas las tablas de
contingencia se analizaron como pruebas de independencia. Dada las relativamente
pequeñas frecuencias en algunas celdas, se realizaron pruebas exactas (test de ratio de
probabilidad).

Cruces experimentales. Los machos y las hembras grávidas se recogieron en el campo y

emparejados en el laboratorio hasta la puesta de huevos. Una vez que las crías de una
nidada alcanzaron fase 23, se colocaron dos réplicas de diez renacuajos cada una en
posiciones aleatorias bajo lámparas ultravioletas y criados en lechuga. La diferencia en la
viabilidad de los cruces entre linajes con hembras N (n = 8) y S/iS (n = 6/1) se analizó con
una prueba de razón de verosimilitud. Se utilizó un ANOVA para probar la diferencia en la
tasa de desarrollo (tiempo hasta las yemas de las extremidades posteriores, fase 26) entre
las nidadas de hembras híbridas N (n = 8) y las nidadas de control del linaje N (n = 4).

Análisis morfológicos. Las medidas tomadas fueron la longitud del hocico a la ventilación
(SVL), longitud del tarso, anchura de la cabeza y peso. Se midieron un total de 924 machos
maduros (34 cuencas) y 153 hembras maduras (23 cuencas). Para eliminar los efectos de
confusión de la altitud, se realizaron análisis de covarianza (ANCOVAs) para cada uno de
los rasgos morfológicos, seguidos de regresiones lineales de las que se tomaron los
residuos no estandarizados. Se realizaron análisis de componentes principales (ACP)
porque todos los rasgos estaban muy correlacionados. El primer componente principal
(PC1) se utilizó como medida del tamaño corporal en los ANOVAs anidados. Los demás
componentes principales se utilizaron en los análisis multivariantes de la varianza anidados
(MANOVAs) para evaluar las diferencias en la forma del cuerpo. Para maximizar la
cobertura de drenaje para los análisis de divergencia de tamaño en las hembras de la
región de contacto y en los machos de los machos en el linaje S, sólo se utilizó el SVL en
los ANOVAs anidados; la forma no se evaluó. no se evaluó la forma.

Análisis de llamadas. Se midió la duración de la llamada, la frecuencia dominante y la tasa

de notas en cuatro llamadas en cada uno de los 132 machos (19 drenajes). Para eliminar
los efectos de confusión de la temperatura del aire, se realizaron ANCOVAs sobre los tres
caracteres de llamada seguido de regresiones lineales de las que se tomaron los residuos
no estandarizados. Se realizaron MANOVAs anidados sobre los tres caracteres de llamada,
seguidos de contrastes multivariantes. Se calcularon las variantes canónicas anidadas (CV)
para la presentación y el análisis de la divergencia de llamadas frente al tamaño del cuerpo.

Elección de pareja. A las hembras grávidas se les presentaron dos llamadas grabadas en
el campo en una cámara de elección de pareja en el laboratorio. A las hembras del contacto
A (n = 22) se les presentó una llamada N y una llamada S, y a las del contacto B (n = 19) se
les presentó con una llamada N y una llamada iS. Tras un periodo de escucha de 5 minutos,
se realizó una prueba de 10 minutos. Los ensayos para evaluar el aislamiento
prematrimonial entre S (n = 8 hembras) y iS (n = 6 hembras) se realizaron de la misma
manera, excepto que algunas de las llamadas de las hembras y de los machos procedían
de fuera de la región de contacto.

La diferencia en la elección de pareja entre los linajes del sur (S e iS) y del norte (N), y la
diferencia en el aislamiento previo al apareamiento en los contactos A y B, se compararon
utilizando un modelo lineal generalizado con un error binomial especificado. El nivel de
aislamiento prematrimonial en cada contacto y el aislamiento prematrimonial entre S e iS se
analizaron con pruebas de razón de verosimilitud.

Asociación de hábitats. Tres amplias características del hábitat (vegetación de ribera,

sustrato del arroyo y flujo del arroyo) se clasificaron en categorías en cada sitio (n = 46) en
la región de contacto. La asociación entre N, S e iS y cada una de las tres características
del hábitat se evaluó mediante una prueba de relación de probabilidad.