Laboratorio Microbiología (BTAB8041)

2021

Departamento de Biotecnología
Facultad de Ciencias Naturales, Matemática y del Medio Ambiente
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS N°3-4
 Factores que Condicionan el Crecimiento Microbiano

Introducción
● Cuantificación de microorganismos

El tamaño de una población microbiana es producto del crecimiento microbiano utilizando

determinadas fuentes de carbono y energía. Este se define como el incremento en el
número de células en una población o el incremento de la masa celular. Debido a esto, es
importante distinguir entre el crecimiento de células individuales y el crecimiento de
poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeño tamaño no se hacen
estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones.

El conocer la cantidad de microorganismos presentes en muestras de alimentos, agua y

productos farmacéuticos puede ser utilizado para tomar decisiones si se aceptan o
rechazan lotes o partidas de estos productos. En cambio, en el área de investigación el
conocer la cantidad de microorganismos, puede servir para estimar el crecimiento de una
especie determinada bajo ciertas condiciones de estudio u obtener la cantidad de células o
biomasa necesaria para aplicar técnicas de extracción de constituyentes celulares (ADN,
proteínas, etc). Al mismo tiempo, puede ser necesario determinar la masa celular.

Existen diversas técnicas para determinar el tamaño de la población microbiana presente en

una muestra determinada (suspensión microbianas, agua, suelo y alimentos), adecuados
para diferentes organismos (bacterias, levaduras, algas). Los métodos se pueden clasificar
en directos y en indirectos, en función de que cuenten microorganismos o calculen otros
parámetros a partir de los cuales se puede inducir la magnitud de la población microbiana.

Métodos para medir el número de individuos en una población

Recuento directo al microscopio: Se realizan principalmente observaciones en fresco y para
ello se utilizan cámaras de conteo especiales (cámara de Petroff-Hauser, Cámara de
Neubauer o Hemacitómetro) que consisten básicamente en una retícula de superficie
conocida grabada sobre una placa de vidrio, similar a un portabjetos. Se coloca una gota de
la muestra sobre ella y se la cubre con un vidrio similar a un cubreojetos convencional; de
este modo se puede contar el número de células en la retícula bajo el microscopio.
Multiplicando este valor por un factor de conversión, calculado en función del volumen
alojado en la cámara, se puede estimar el número de bacterias por mililitro de muestra. Este
método es tedioso pero es una forma rápida de estimar la carga microbiana de una
muestra. A pesar de ello el método tiene algunas limitaciones: a) No se distinguen células
muertas y vivas; b) las células pequeñas son difíciles de ver bajo el microscopio; c) poca
precisión.

Contadores electrónicos de partículas Coulter: El fundamento del método, es la interrupción

de corriente por el paso de una célula. Con esta metodología se requieren muestras
totalmente puras, pues cada partícula presente que no sea una célula, es registrada por el
equipo o puede ser la causante de un daño del mismo. El registro de los individuos se
realiza, haciendo pasar la suspensión microbiana a través de un tubo capilar entre dos polos
de una corriente eléctrica; cada vez que por un orificio pasa una partícula (célula), se
interrumpe la corriente y esta información es
colectada por un dispositivo electrónico que
detecta el número y el tamaño de las partículas
que van pasando y de esta manera se
determina la población de células.

Recuento en placa estándar o recuento de

microorganismos viables: Con este método se
puede establecer el número de células viables;
esto se logra sembrando diluciones de las
muestras que contienen los microorganismos
en medios de cultivos sólidos dispensados en
cajas Petri, incubando y posteriormente
realizando el conteo de las colonias visibles (la
metodología puede ser aplicada en la
superficie del agar o dentro del agar). Estas colonias a su vez, son multiplicadas por el factor
inverso de la dilución (o diluciones). Con esta metodología y con el objetivo de reducir el
error estadístico, se recomienda realizar suficientes réplicas de las mismas diluciones, así
como, de las diferentes diluciones a utilizar. El recuento en placa se puede realizar mediante
dos métodos: a) Método de extensión, en el cual el volumen o alícuota de cada dilución que
se puede depositar sobre la placa con medio de cultivo no debe ser superior a 0,5 mL e
idealmente 0,1 m, la alícuota se extiende con la ayuda de un rastrillo; b) Método de vertido,
en las placas estériles se deposita 1 mL de la dilución y posteriormente se vierte
aproximadamente 20 mL del medio de cultivo apropiado que se encuentra a 45 ºC a 50 ºC.
Para lograr la mezcla de la alícuota con el medio de cultivo, antes que se enfríe, se debe
rotar 20 veces en el sentido de las manecillas del reloj y 20 veces en el sentido contrario,
luego de solidificado se lleva a incubación. Adicionalmente, el conteo y cálculo de la
población de viables, se debe realizar en cajas que contengan entre 30 y 300 colonias. En
este tipo de conteo de viables, las colonias no siempre han de proceder de una sola célula,
dado que algunas bacterias pueden formar agrupaciones y estas serán las que darán origen
a la colonia; por lo anterior, los reportes de esta metodología se refieren a “unidades
formadoras de colonia” o UFC; unidad que, corresponde como mínimo a una bacteria
formando una colonia, así como, también a un grupo de estas que han sido las formadoras
de la misma.

Técnica recuento por filtración en membrana: Se usa para

suspensiones diluidas de bacterias o muestras de agua. Se
hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una
membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un
diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el
tránsito de sustancias, 0,2-0.45 µm). Posteriormente, el filtro
se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo
sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las
células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciendo
la concentración original de células viables en función del
volumen de suspensión o agua que se hizo pasar por el
filtro.

Método de número más probable (NMP): Se basa en la determinación de presencia o

ausencia (positivos o negativos) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particulares de microorganismos
presentes en muestras de agua,
suelo o alimento. Por lo tanto, un
requisito importante de este método
es la necesidad de poder reconocer
un atributo particular de la población
en el medio de crecimiento a
utilizarse (Ej: fermentación de
lactosa). El estimado de densidad
poblacional se obtiene del patrón de
ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística. Algunas de las ventajas del NMP
son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a
un proceso (selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de
organismos coliformes presentes en el agua, (ii) provee una recuperación uniforme de las
poblaciones microbianas de agua, suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos
vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los
métodos tradicionales recuento en placa.

Métodos para medir densidad celular en una población:

En estudios relacionados con la bioquímica de los procesos de crecimiento, se prefiere

determinar la masa de la población más que el número de células presentes. La masa se
puede establecer directamente determinando el peso seco o húmedo de la muestra.
También se puede determinar el contenido de nitrógeno o el contenido de proteínas o de
ADN.
Otra forma de estimar la masa celular de una manera indirecta es determinando la actividad
metabólica de la célula por ejemplo determinando el consumo de oxígeno o producción de
dióxido de carbono. Asumiendo que la cantidad del producto metabólico está en proporción
directa al número de bacterias presentes en la población.

-Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de
la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes
volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el
espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida
puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas
puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la
forma y deformación celular.

-Peso Seco: Es una manera indirecta de estimar la carga microbiana de una muestra. El
peso neto se puede medir centrifugando una alícuota de la muestra y pesando
posteriormente el depósito de células obtenido. Este método se usa más frecuentemente a
escala industrial donde los volúmenes de muestra y las densidades microbianas son mucho
mayores.

-Determinación de nitrógeno: Permite determinar indirectamente la masa de una población

bacteriana. Existen diferentes técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que
contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse
el nitrógeno no proteico mediante el NO2- , NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante
absorción en UV o el nitrógeno total mediante la digestión de Kjeldahl.

-Determinación de ácidos nucleicos: Es una técnica que permite determinar indirectamente

la masa de una población bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado
ácido nucleico (generalmente ADN) y a partir de este dato se estima la masa de la
población.

Métodos indirectos para determinar tamaño de una población microbiana

Método espectrofotométrico: Se basan en la existencia de una

relación directa entre el número total de microorganismos
presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la
determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante
espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de
absorbancia.
 Las soluciones diluidas de diferentes tipos de
bacterias, independientemente del tamaño
celular, tienen casi la misma absorbancia por
unidad de concentración de peso seco. Esto
quiere decir que en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al
peso seco, independientemente del tamaño
celular del microorganismo.

Sin embargo
se encuentran
absorbancias
muy diferentes
por UFC (unidades de formación de colonias) cuando los
tamaños de las células bacterianas son muy diferentes. Por
esta razón, para estimar el número de microorganismos
totales o viables de una suspensión bacteriana se debe
realizar una “curva de calibración” con cada tipo de
microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar
Absorbancia (densidad óptica) con el número de
microorganismos totales. Los métodos
espectrofotométricos son rápidos, pero de baja sensibilidad y presentan problemas de
calibración (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partículas.

● Cinética de crecimiento microbiano

Las células de los microorganismos
crecen atravesando varias fases: lag
o latencia, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte.
Cuando un cultivo bacteriano es
inoculado en un medio de cultivo
fresco, entran en fase de latencia
breve donde están bioquímicamente
activos pero no se dividen. La fase
de latencia (lag) es la fase inicial del
crecimiento, cuando el número de
células permanece relativamente
constante previo al aumento rápido
crecimiento y que se conoce como
tiempo de adaptación. Durante esta
fase las células individuales están
metabólicamente activas, en preparación para la división celular. Las células generalmente
activan las vías metabólicas para formar los nutrientes esenciales para iniciar el crecimiento
activo. La duración y extensión de esta fase depende de la población inicial y de factores
intrínsecos (propios del medio como pH, concentración de sales, nutrientes) y factores
extrínsecos (factores ambientales como: temperatura, tensión de oxígeno). Cuando las
células están metabólicamente activas, se replica el material genético y rápidamente
comienza la división celular. Esta segunda fase se denomina fase exponencial o fase Log.
Este es el período en el cual las células crecen rápidamente y el tiempo que requiere para
duplicar el número de células se conoce como tiempo de generación. Los factores más
importantes que influyen en la fase exponencial son el microorganismo, el medio de
crecimiento y la temperatura. La tercera fase en el crecimiento de las bacterias es la fase
estacionaria donde el metabolismo disminuye y se detiene la división celular. Los factores
que causan que la célula entre en la fase estacionaria están relacionados a cambios en el
ambiente producto de la alta densidad celular. Finalmente, después de un tiempo la célula
entra en fase de muerte donde va perdiendo viabilidad a medida que transcurre el tiempo.

Parámetros de crecimiento:

Durante el crecimiento exponencial (fase Log), las células se dividen y doblan su número a
intervalos regulares. La velocidad de crecimiento es constante y la población es más
uniforme desde el punto de vista químico y propiedades físicas. Esta fase se caracteriza por
su duración, por el tiempo medio de generación o duplicación (g) (tiempo necesario para
que la población doble su tamaño) y por la velocidad específica máxima de crecimiento o
constante de velocidad de crecimiento (abreviada como k o µ). La constante de velocidad
representa la proporción en la que aumenta la población por unidad de tiempo,
frecuentemente se expresa el crecimiento como generaciones por hora.

Durante el crecimiento exponencial la velocidad de

crecimiento (dN/dt) es constante a lo largo del tiempo:

dN/dt =µ*N

El incremento del número de células (dN) por unidad de

tiempo (dt) es proporcional al número de células
presentes en el cultivo (N). A la constante de
proporcionalidad (µ) se le denomina tasa de crecimiento.

Integrando la ecuación anterior durante el tiempo de

cultivo, se transforma en la siguiente función exponencial:
N = N0 eµt

La transformación de esta ecuación en una recta (tomando logaritmos) rinde lo siguiente:

lnN = lnN0 + µt

esto es: el incremento del logaritmo del número de células aumenta linealmente con el
tiempo siendo la constante de proporcionalidad µ. La constante de crecimiento “µ” se puede
estimar de la pendiente que se obtiene al representar el logaritmo natural (ln) del número de
células frente al tiempo. Si se emplea logaritmo en base 10 (log10) en lugar de ln, la
pendiente es 2.3 veces más pequeña que la constante de crecimiento real.

Si el tiempo de duplicación o generación (g) es cuando N =2N 0 y como el número de células

en un tiempo t es:

N = N0 eµt

entonces:

2N0 = N0 eµg μ = ln2/g y, por consiguiente, g = ln2/μ.

Es decir, que hay una correlación inversa entre el valor de la tasa de crecimiento (μ) y el
tiempo de generación (g).

Estas ecuaciones nos permiten predecir cuál será el número de células, masa celular, etc.
después de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos μ; o bien, poder calcular la tasa de
crecimiento μ a partir de medidas experimentales del incremento en el número de células,
biomasa, etc.

● Factores que Condicionan el Crecimiento Microbiano

El crecimiento microbiano se ve condicionado por factores fisicoquímicos del medio de
crecimiento (intrínsecos), como son el pH, la concentración de NaCl y actividad de agua.
Al mismo tiempo, el crecimiento se ve afectado por los factores ambientales (extrínsecos)
como son la temperatura, tensión de oxígeno, humedad y diferentes tipos de
radiaciones.
La temperatura es uno de los factores
más importantes que influyen en la
actividad de las enzimas bacterianas. A
diferencia de los animales de sangre
caliente, las bacterias carecen de
mecanismos que permitan conservar o
disipar el calor generado por el
metabolismo y por lo tanto sus sistemas
enzimáticos son directamente afectados
por la temperatura ambiente. Las
enzimas tienen temperaturas mínima,
óptima y máxima. A la temperatura
óptima las reacciones enzimáticas tienen
lugar a velocidad máxima. Por debajo del
mínimo y por encima de las temperaturas
máximas las enzimas se vuelven
inactivas. En algún punto por encima de
la temperatura máxima, se producirá la
destrucción de las enzimas y el colapso de la membrana citoplasmática. Las bajas
temperaturas son menos dañinas para las enzimas y proteínas en general.

Además de la temperatura, la
concentración de iones de hidrógeno
del medio ambiente ejerce una
importante influencia en el
crecimiento de un microorganismo.
La concentración de los iones de
hidrógeno (pH), limita la actividad de
las enzimas. Como en el caso de la
temperatura, existe para cada
organismo una concentración óptima
de iones de hidrógeno en la que
crece mejor. Los rangos de pH en los
cuales pueden crecer (mínimos,
óptimos y máximos) son definidos
manteniendo los otros factores
ambientales constantes. Si se varía
la composición del medio,
temperatura de incubación, o la presión osmótica, los requisitos de iones de hidrógeno
pueden ser diferentes.

Adicionalmente, la concentración de NaCl puede ser un factor limitante en el crecimiento

de determinados microorganismos. Para esto ciertos microorganismos captan o sintetizan
moléculas denominadas solutos compatibles que no inhiben los procesos celulares de
manera significativa y ayudan a mantener el equilibrio osmótico.

El requerimiento de oxígeno es otro de los

parámetros importantes en el crecimiento
microbiano, y va desde microorganismos en los
que es absolutamente esencial la presencia de
oxígeno hasta los que la sola presencia de esta
molécula es letal.
Finalmente, el conocer los factores que condicionan el crecimiento microbiano, nos ayuda a
controlar el crecimiento de los microorganismos para posteriores aplicaciones prácticas,
como realizar tratamientos de alimentos para eliminar microorganismos potencialmente
patógenos. Para controlar el crecimiento de los microorganismos se emplean principalmente
procedimientos físicos (calor, radiaciones), filtraciones y métodos químicos
(desinfectantes, antisépticos y antibióticos).
Práctico 3 (20/10/2021)

Cultivo de microorganismos en diferentes condiciones de crecimiento

Objetivos

1. Identificar determinados factores que condicionan el crecimiento microbiano.

2. Identificar cómo diferentes microorganismos son influenciados por factores
intrínsecos y extrínsecos.

Procedimiento
En la siguiente actividad práctica se cultivarán distintas especies bacterianas para observar
el efecto de diferentes factores sobre su crecimiento. Se sembraran cepas de
Staphylococcus aureus, Pseudomonas y Escherichia coli en tubos con caldo nutritivo.

1. Efecto de la temperatura sobre el crecimiento

● Sembrar por cada cepa tres tubos con caldo nutritivo.

● Rotular los tubos con las temperaturas de incubación (4°C, 28 °C y 37°C).
● Incubar los tubos a 4°C, 28 °C y 37°C respectivamente, por 48 horas.

2. Efecto del pH sobre el crecimiento:

● Sembrar por cada cepa los tubos de caldo nutritivo con pH 3.5, 5.5, 7 y 9.
● Rotular apropiadamente.
● Incubar a 37°C por 48 horas.

3. Efecto de la concentración de NaCl

● Sembrar las cepas en medio de cultivo sólido que contiene diferentes
concentraciones de NaCl: 0.5 %, 5%, 10% y 20%.
● Rotular apropiadamente.
● Incubar a 37°C por 48 horas.

4. Efecto de la radiación UV (experiencia demostrativa)

● Se les expondrán cepas sembradas en medio de cultivo sólido y expuestas a
radiación ultravioleta por 1, 5, 10, 20 y 30 minutos, incubadas a 37°C por 48 horas

5. Efecto de presencia de antibióticos mediante antibiograma

● Cultivar cepas en medios de cultivo sólido
● Depositar los sensidiscos con diferentes concentraciones de antibióticos.
● Rotular apropiadamente.
● Incubar a 37°C por 48 horas.
Práctico 4 (22/10/2021)

Cuantificación del crecimiento microbiano

Objetivos

1. Evaluar el efecto de distintos factores sobre el crecimiento microbiano.

2. Observar el comportamiento de diferentes especies bacterianas con estos factores.

Procedimiento

La concentración de células en un cultivo puede ser estimada con un espectrofotómetro a

600 nm. Utilizaremos una relación aproximada entre densidad óptica (DO) medida en
espectrofotómetro y concentración de células bacterianas:

1 unidad de DO equivale aproximadamente a 5 × 108 células /ml.

Se cuantificará el crecimiento bacteriano en los ensayos 1 y 2. En los ensayos 3, 4 y 5 se

observará el resultado directamente en las placas de agar.

Para el informe
● En cada ensayo, comparar los resultados obtenidos para las cepas sembradas.
● Discutir los resultados