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Cuatro años más tarde Helmholtz abandonó la Pépinière como doctor en anatomía para
realizar prácticas en el hospital de la Charité. En 1841 empezó una tesis doctoral bajo la
dirección de Müller. Estudiaría la estructura del sistema nervioso en los invertebrados. Así
descubrió que las fibras nerviosas surgen de unas células, anteriormente identificadas por
Christian Gottfried Ehrenberg.
En 1843 fue destinado al hospital de Potsdam, donde trabajó durante cinco años. Pudo
compatibilizar su trabajo con las investigaciones, ya que tenía bastante tiempo libre.
Habilitó un barracón para transformarlo en laboratorio. Allí realizó investigaciones sobre la
producción de calor durante la contracción muscular. Demostró que el calor no era
transportado por la sangre o por los nervios, sino que era producido en los propios
músculos. Dedujo un equivalente mecánico del calor, incorporado en su disertación de
1847, Über die Erhaltung der Kraft (Sobre la conservación de la energía). Esto significaba
que no existían "fuerzas vitales" para mover un músculo. Helmholtz rechazó la tradición
especulativa de la filosofía natural, paradigma dominante entonces en la fisiología alemana.
Tras esto, pudo abandonar el ejército y empezar a enseñar anatomía en la Academia de las
Artes de Prusia gracias a la ayuda que le proporcionó Alexander von Humboldt.