TERAPIA GÉNICA

La terapia génica se define como el tratamiento o prevención de la enfermedad

mediante la transferencia de material genético. Los primeros estudios clínicos
comenzaron en 1990, y en la actualidad se considera una auténtica revolución en
medicina. Hay más de 300 protocolos clínicos que están en fase I-III, y sus principales
aplicaciones se centran en el tratamiento de cáncer, los trastornos monogenéticos
heredados (como la fibrosis quística), y las enfermedades infecciosas (como VIH).

Las ventajas de esta aproximación terapéutica son muy numerosas:

- Persigue tratar las causas, en lugar de los síntomas, de las enfermedades
- El tratamiento es individualizado
- Sus efectos pueden ser localizados.
- Efecto prolongado tras la administración de una dosis única

Cuando el ADN se introduce en la célula huésped, el proceso se denomina

transfección, y el gen insertado transgen. El procedimiento se puede hacer in vivo, ex
vivo (se extraen células del paciente, se introduce el gen de interés y luego se insertan
de nuevo), o in vitro. Una vez dentro de la célula, el transgen puede integrarse en el
ADN o permanecer fuera (episomal). Una vez incorporado a la célula, la expresión del
gen extraño suele ler larga, aunque puede complicarse por la activación de
protoncogenes.
En la mayoría de los casos el procedimiento implica introducir un gen en el
organismo. Los trabajos dirigidos a reemplazar o anular un gen defectuoso son más
complicados, aunque se han hecho estudios con oligonucleótidos antisense. Se trata de
cadenas de ácidos nucleicos complementarios con secuencias relevantes de ADN o
ARN, que al hibridizarse con ellas bloquean su replicación, transcripción o traducción
del ARNm.

Existen varios métodos para introducir transgenes, y cada uno de ellos presenta
ventajas e inconvenientes. Estos métodos se clasifican en tres tipos: vectores virales,
vectores no virales y métodos físicos. La primera generación de vectores produjo
resultados frustrantes que no se correspondían con las expectativas puestas en la
terapia génica. Hoy en día los procedimientos han mejorado bastante, sobre todo en
relación con la especificidad y eficiencia de la transferencia, la duración de la
expresión, la reducción de la respuesta inmunológica y la mejora en las condiciones de
manufactura.

Vectores virales

Los vectores virales son virus alterados que no pueden replicarse, en los cuales
se introduce el transgen acompañado a veces de un promotor específico que regula la
localización exacta en la cual el gen se va a expresar. El problema de todos ellos es su
toxicidad, la generación de reacciones inflamatorias e inmunológicas y el tamaño
limitado de la transfección.

1.- Adenovirus (Ad)

Los Ad contienen cadenas dobles de ADN que entran en la célula por

endocitosis a través de receptores (se localizan episómicamente). Estos virus no
pueden replicarse y tienen reducido su potencial oncogénico. Los primeros vectores

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carecían de dos genes virales tempranos, el E1A y el E1B, y administraban el transgen
junto con muchos genes virales residuales, lo que producía una reacción inmune que
silenciaba la expresión del gen de interés. Otras variantes carecen del E3 (segunda
generación), que inhibe la citolisis (destrucción celular) de las células infectadas. La
tercera generación carece del E4, que está implicado en la transformación oncogénica.
En los últimos estudios se están empleando vectores que carecen por completo de
todas las secuencias de codificación viral, lo que reduce significativamente su toxicidad.
El promotor más frecuentemente utilizado con el adenoviruse es el virus
derivado del citomegalovirus. Se trabaja también con el virus del herpes simplex
(HSV), aunque en este caso se hace in vitro porque in vivo hay un alto riesgo de
reacciones inmunológicas y citotoxicidad. Estos vectores se han empleado con
promotores celulares específicos.

Ventajas:
- Son bastante exitosos in vivo
- Los vectores pueden aplicarse en células en proliferación o postmitóticas
- La expresión del transgen suele ser elevada

Inconvenientes:
- La expresión del transgen suele ser transitoria (desaparece en dos
semanas), por lo que puede ser útil en enfermedades agudas, aunque no
en crónicas.
- Suele producir respuestas inflamatorias, inmunológicas, y a veces
reacciones oncogénicas

Aplicaciones:
- Tratamiento local del cáncer : transferencia del gen de la p53, que induce la
muerte de células tumorales.

2.- Retrovirus (Rv)

A diferencia de los Ad, los vectores retrovirales se transfieren integrando el

transgen en el cromosoma de la célula diana, lo que conduce a una expresión más
prolongada del mismo. El Rv penetra en el núcleo sólo durante la mitosis, por lo que la
transfección se limita a células en proliferación. Se trata de virus de ARN que se
replican a través de un ADN intermedio sintetizado por transcripción viral inversa.
Recientemente la técnica ha mejorado empaquetando el Rv en proteínas
procedentes de otros virus, como el de la estomatitis vesicular, lo que produce mayor
resistencia a la inactivación y una transfección más eficiente. También se han
desarrollado vectores virales basados en lentivirus (como el VIH), capaces de integrar
la transfección en células postmitóticas y en proliferación. Estos vectores son los
candidatos a ser utilizados en células como las neuronas.

Ventajas:

- La expresión es más prolongada, por lo que puede ser de utilidad en el

tratamiento de enfermedades crónicas (días o semanas)
- La respuesta inmunogénica es menor en comparación con el Ad, porque no
expresan genes virales residuales
- Se requiere una menor cantidad de virus para realizar la transfección

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Inconvenientes:

- Puede producirse una reducción en la efectividad de la transfección a dosis

repetidas por respuesta de las células T (lo que se ha observado incluso en
pacientes con SIDA).
- Se utilizan sobre todo ex vivo, porque in vivo la transferencia suele ser más
ineficaz y el transgen es rápidamente inactivado

Aplicaciones:
- Se han inyectado vectores de VIH en el estriado y el hipocampo de rata,
donde se ha observado una expresión estable del transgen en las
neuronas, en ausencia de citotoxicidad y cambios en la respuesta inmune.
- Los lentivirus puede producir transferencia en células madre
hematopoiéticas quiescentes.

3.- Adenovirus asociados (AAV)

Se trata de AD capaces de integrarse en el cromosoma de la célula humana,

particularmente en un lugar del cromosoma 19. Son vectores derivados de parvovirus
defectuosos y no patógenos, en los que se ha suprimido todo el ADN viral excepto las
secuencias que codifican los genes implicados en los procesos de transducción.

Ventajas:
- Parecen dar lugar a una expresión sostenida del transgen in vivo (incluso
dos años después de su administración en ratones), por lo que pueden ser
útiles en el tratamiento de las enfermedades crónicas
- Se pueden aplicar en células en proliferación y postmitóticas

Inconvenientes:
- Aunque los datos sobre inmunogenicidad son limitados, parece que el 32%
de los humanos adultos poseen anticuerpos preexistentes que neutralizan la
transfección in vitro. En ratones las dosis repetidas pueden ver reducida su
eficacia por un proceso de generación de anticuerpos neutralizantes.
- Tamaño limitado del inserto
- Altos costes de manufactura y complejidad en su elaboración.
- Baja transducción e integración genómica
- Necesidad de utilizar “virus de ayuda”, como Ad o HSV

Aplicaciones:
- Corrección de la hemofilia en perros tras la administración de una única
inyección de un vector que expresa el gen del factor de coagulación IX.
- Tratamiento de otras enfermedades crónicas, como la anemia.
- Se está utilizando para la corrección de genes defectuosos, utilizando AAV
con recombinación homóloga, y oligonucleótidos quiméricos (cadenas
dobles de ADN-ARN).
- Hay bastantes estudios en SN, donde parece que las neuronas pueden
captar de forma exclusiva el virus (por ejemplo, solo en neuronas
hipocampales). La duración de la expresión de transgen es larga. El
promotor que se utiliza para que la expresión se limite al SNC es el
citomegalovirus. También se han usado promotores específicos para la
expresión de factor de crecimiento derivado de las plaquetas en el cerero

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 (PDGF). Se trabaja con tetraciclina para controlar temporalmente la
expresión del transgen.

Vectores no virales

En este caso se aplica el ADN directamente o utilizando un sistema de

aplicación sintético. El problema de la mayoría de ellos es que no producen
transferencia del gen in vivo, aunque sí in vitro. Además, la expresión del gen suele ser
baja y transitoria. Los procedimientos más utilizados son los siguientes:

1.- “Naked” ADN (ADN desnudo)

Este procedimiento produce transferencia de genes en tejidos tras su inyección

local in vivo, sobre todo en músculo y piel. No se conoce muy bien cómo el ADN es
captado por la célula, aunque se ha observado que la expresión del transgen puede
durar varios meses en músculo de ratón, y días en la piel.

Ventajas:
- El riesgo de respuesta inmunológica es casi nulo
- La manufactura es barata y fácil (se hace con bacterias)
- Podría ser de utilidad en el tratamiento de enfermedades crónicas

Inconvenientes:

- No funciona ex vivo o in vitro

- Su eficacia es mucho menor que los Ad y los AAV
- La expresión del transgen en la mayoría de los tejidos es de corta duración

Aplicaciones:

- Su principal aplicación tiene que ver con el desarrollo de vacunas. Se ha

inyectado intramuscularmente el ADN que codifica el gen del agente
causante de la malaria (plasmodium falciparum), lo que produce respuestas
celulares y humorales dirigidas al parásito.
- Se ha inyectado ADN que codifica factores angiogénicos en músculos de
pacientes que padecen enfermedad vascular isquémica.

2.- Lípidos catiónicos

Los lípidos catiónicos se unen al ADN por interacción electrostática, evitando su

degradación.

Ventajas:

- Bajo riesgo de respuesta inmunológica

- Transfección eficiente ex vivo

Inconvenientes:

- Inestabilidad
- Inactivación en la sangre
- Baja eficacia de la transfección

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 - Pobre “targetting”

Aplicaciones:
- Se ha obtenido transfección de células endoteliales en los pulmones tras la
inyección de ADN en la vena de la cola de ratones con fibrosis quística. En
humanos, sin embargo, la expresión del gen del receptor transmenbrana de
la fibrosis quística fue reducido.
- Tratamiento del cáncer por efecto directo o destrucción inmunológica de las
células tumorales

3.- Partículas condensadas de ADN

El procedimiento antes descrito mejora cuando se emplean polímeros catiónicos

(liposomas), para hacer compacto o condensar el ADN antes de mezclarlo con el
componente lipídico. Esto le protege de la degradación y facilita la captación celular
por endocitosis. Los polímeros más utilizados son: polilisina, oligopéptidos de longitud
definida, iminapolietileno

Ventajas:
- Fácil manufactura
- Baja reacción inmunológica
- Transfección efectiva in vitro

Inconvenientes:
- Pocos estudios ex vivo
- Ausencia de estudios clínicos

Métodos físicos

1.- Inyectores

Existen diversos procedimientos de inyección libre de aguja: gene gun (que

utiliza partículas de oro para administrar el ADN en el citoplasma), intraject o jet-gun
–pistola de chorro- (que utiliza líquido bajo alta presión para administrar el ADN en el
líquido intersticial).

Ventajas:
- Se necesita menos dosis de ADN que con la técnica de ADN desnudo
- Baja respuesta inmune
- Posibilidad de utilizarlos para desarrollar vacunas

Inconvenientes:
- Aún están en fase de desarrollo
- La ténica de jet-gun genera respuesta inmune

Aplicaciones:
- Desarrollo de vacunas para la prevención de enfermedades infecciosas

2.- Electroporación

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 La aplicación de un campo eléctrico para efectuar la transfección de células in
vitro ha sido un importante método de investigación durante muchos años, y se cree
que funciona produciendo áreas transitorias de ruptura de la membrana, a través de
las cuales el ADN penetra en el citoplasma.

Ventajas:

- Podría ser útil para transferir células madre en aplicaciones ex vivo, con
inserción cromosómica del transgen
- Esta aproximación mejora la transfección en piel y en tumores, en el ratón

Inconvenientes:

- El procedimiento deja a la mayoría de las células inviables

- Aún está en fase de desarrollo

Uso de terapia génica en trastornos del SNC

La utilización de la terapia génica en trastornos del SNC ofrece muchas

posibilidades, si bien se enfrenta en la actualidad a algunos problemas que hacen que
su aplicación haya sido hasta el momento limitada:

- Aunque permite hacer tratamientos dirigidos a células específicas con

localizaciones concretas en el cerebro, a menudo el número de células que
expresan el transgen es demasiado limitado (por ejemplo, cuando se trata
de afectar a células neoplásicas).
- Los vectores virales son partículas muy grandes que no atraviesan la BHE,
y que por tanto deben administrarse mediante craneotomía y
procedimientos invasivos.
- La duración de los efectos de la terapia es limitada, lo que supone
problemas para el tratamiento de enfermedades crónicas, como las
degenerativas.
- El tratamiento debe ser capaz de expresar el transgen en células
postmitóticas, como las nerviosas.
- Suelen aparecer reacciones tóxicas: esplenomegalia (hipertrofia del bazo),
hiperplasia linfoide, infiltración mononuclear en varios tejidos, degeneración
hepatocelular y de tubos renales, etc.
- Puede haber procesos de neuroplasticidad compensatoria que silencien os
efectos de la terapia
- Un problema adicional tiene que ver con la ausencia de modelos animales
que reproduzcan en toda su extensión las patologías neurológicas que se
pretenden tratar mediante terapia génica (por ejemplo, Alzheimer).
- Muchos de los trastornos que afectan a la función cerebral tienen una causa
desconocida (por ejemplo, los trastornos psiquiátricos), tienen un origen
poligénico, o son el resultado de la interacción entre genes y ambiente. Por
eso, la especificidad de la terapia génica puede ser una seria limitación en
estos casos.
- Por ahora no hay perspectivas claras de aplicación de terapia génica en
trastornos psiquiátricos (mirar Lesch, 1999), sólo propuestas teóricas.

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 Las principales aplicaciones de la terapia génica en neurobiología han sido el
tratamiento de tumores cerebrales, de enfermedades neurodegenerativas (sobre todo
Parkinson), de alteraciones cerebrovasculares, y de infecciones. Algunos ejemplos son
los siguientes:

1.- Karle et al. Indujeron un estado epiléptico administrando un oligo sintético contra la
subunidad gamma-2 del receptor GABA.

2.- El empleo de un oligo (ODN) contra uno de los subcomponentes del receptor de
neuropéptido Y tipo 1 produjo un cuadro de ansiedad.

3.- Trastornos cerebrovasculares. El empleo de un ODN contra el receptor NMDA tipo 1

redujo el volumen de infarto en ratas tras la oclusión de la arteria cerebral media. Se
ha administrado un Ad que codifica la beta-galactosidasa intracerebroventricularmente,
lo que produce la expresión del gen en vasos sanguíneos y tejido perivascular. Cuando
el Ad se administró en el líquido cefalorraquídeo en perros que sufrían hemorragia
subaracnoidea, también se observó una expresión marcada del transgen. Se ha
aplicado la técnica ex vivo en monos y conejos, comprobándose la expresión de
transgen en vesículas arterioscleróticas. Ooboshi et al (2000) han utilizado este
procedimiento para transferir el gen que codifica la óxido nítrico sintasa endotelial. Este
tratamiento hace que aumente la respuesta a la Ach y mejora la función endotelial.

4.- Aplicación en tumores cerebrales. El glioblastoma fue el primer cácer tratado con
terapia génica en humanos usando la técnica in vivo, hace 8 años. Las estrategias
actuales dirigidas al tratamiento de los tumores pueden dividirse en cinco tipos:

(a) Terapia génica suicida, que consiste en transferir un gen en las células tumorales
que las hace vulnerables a drogas que destruyen el tumor
(b) Terapia inmunogenética, dirigida a activas el sistema inmunológico contra las
células cancerígenas.
(c) Terapia con virus oncolíticos, que al replicarse destruyen las células tumorales.
(d) Transferencia de genes supresores del tumor, que inducen apoptosis (como el gen
de la proteína p53, conocida como “el guardián del genoma”).
(e) Terapia antisense, con ODN o ADNc.

Los principales incovenientes de la terapia génica son, en este contexto, los siguientes:
- Ausencia de administración del agente terapéutico en células tumorales
profundamente invasivas
- Ausencia de especificidad celular
- Repuesta inmune potencialmente patológica al virus o el agente terapéutico
transferido
- Efecto transitorio del gen
- Penetrancia limitada en el SNC
- Etiología multigenética de los tumores, por lo que éstos son muy complejos
en términos de patogénesis.

5.- Enfermedad de Parkinson. Pesiguen proteger o restaurar a las células

dopaminérgicas, algo que no logran los tratamientos convencionales. Kordower et al.
han desarrollado una terapia génica que restaura la función y salva a las células de la
degeneración en un modelo animal de parkinson inducido por MPTP (en primates).

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Esta terapia se basa en el uso de factores de crecimiento nervioso, cuyos genes se
administran con lentivirus. Se sabe que la administración intracerebral de estos
factores de crecimiento no ha sido exitosa en humanos. En este trabajo se administró,
en neuronas de la sustancia negra y en terminales de DA en el estriado, el transgen
del factor neurotrófico derivado de las células gliales (GDNF). El tratamiento produjo
una marcada mejoría funcional en el 75% de los animales supervivientes, y un claro
aumento en los niveles centrales de DA (por ej. tirosina-hidroxilasa), lo que sugiere
que la terapia produjo la supervivencia y restauración de las neuronas dopaminérgicas.
La duración de estos efectos fue de 8 meses. También se han hecho trabajos con AAV.
Se han utilizado células madre (o “marrow”), a las que se introduce el transgen del
GDNF y luego se trasplantan al cerebro. Las células madre pueden ser vehículos
efectivos para la transferencia de productos genéticos en el cerebro. (Park et al.,
2001). Hay muchos estudios de Parkinson utilizando células madre y bone marrow.

6.- Enfermedad de Alzheimer. Se sabe que la administración intracerebral del factor de

crecimiento nervioso (NGF), o el trasplante de fibroblastos que lo producen, puede
invertir los déficits de memoria y la neurodegeneración en animales viejos. Klein et al
(2000) han utilizado un vector viral adenoasociado en células del prosencéfalo basal
(septum) de ratas para que éstas expresen NGF. El procedimiento se realizó a los 3
meses de edad, y la expresión se mantuvo durante 9 meses. A los 12 meses de edad,
las ratas controles mostraron un deterioro en la ejecución de la prueba de Morris,
mientras que las ratas experimentales no mostraron dicho deterioro. Además, se
observó un aumento en el tamaño de las neuronas colinérgicas del septum medial del
34%. La principal ventaja de esta aproximación génica consiste en poder administrar el
NGF sólo en las células que participan en procesos de memoria, ya que la inyección
inespecífca de esta sustancia tiene numerosos efectos secundarios (pérdida de peso en
la rata, dolor de espalda en el hombre).
La expresión de la proteína Par-4 está elevada en neuronas de pacientes que
padecen procesos degenerativos (Parkinson, Alzheimer, Huntington, ELA, encefalitis
por VIH). Esta elevación parece afectar a la proteína TAT, liberada por la producción
de Par-4. Se ha observado in vitro que el empleo de un ODN contra Par-4 protege de
la apoptosis a neuronas del hipocampo expuestas a Tat. Se trabaja para desarrollar
ODN contra la acetilcolinesterasa, lo que podría ser beneficioso para el tratamiento de
la enfermedad de Alzheimer.
Hay estudios sobre envejecimiento y células madre (Rao y Mattson, 2001).

8.- Enfermedades de la médula espinal. El uso de AAV puede promover la

supervivencia de las células, permitiendo su regeneración y crecimiento cuando se
transfiere el gen del factor de crecimiento BDNF.

9.- Enfermedades desmielinizantes. Se han hecho trabajos en modelos animales de

encefalomielitis y esclerosis múltiple. Se ha comprobado que el uso de AAV que
expresan catalasa, inyectados en el nervio óptico, reduce la desmielinización y otros
índices de patología asociada con la enfermedad.

10.- Modificación de líneas germinales. Estas aproximaciones son muy lentas y

complejas, porque la modificación de ADN de la línea germinal puede ser letal o
producir perturbaciones en el desarrollo.