FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y FORMALES

ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA

“AÑO DE LA UNIVERSALIZACIÓN DE LA SALUD”

“Detección y cuantificación del ARN del Sars-CoV-2 en

aguas residuales y efluentes tratados”

DOCENTE:

JANET ROSSANA ZEGARRA LÓPEZ

ALUMNOS:

● FLORES QUISPE,OSWALDO RAUL

● QUISPE CRUZ NOELIA LIBIA
● LLANOS YUFRA ANGIE KARINA

AREQUIPA-PERÚ

2021
 Detección y cuantificación del ARN del Sars-CoV-2 en
aguas residuales y efluentes tratados

OBJETIVOS

Objetivo General

● Detectar y cuantificar el ARN del Sars-CoV-2 en aguas residuales y efluentes tratados

Objetivos Específicos

● Determinar cómo se detecta el virus Sars-CoV-2 en aguas residuales y efluentes

tratados.

● Evaluar la duración de la presencia viral de Sars-CoV-2 en las aguas residuales y de

efluentes tratados.

PROBLEMÁTICA

El brote de Covid-19, causado por el nuevo coronavirus SARS-CoV-2, iniciado a finales de

2019 en Wuhan, China se ha diseminado a 203 países más. El 11 de marzo de 2020 la

Organización Mundial de la Salud (OMS) lo declaró pandemia después de la evaluación de

su nivel de propagación y gravedad. (Cucinotta et al., 2020) (Xu et al., 2020)

Existe evidencia previa de que los virus envueltos se absorben en la fracción sólida de las

aguas residuales, donde se explora el uso de lodos primarios y lodos espesados de las PTAR

para la detección de SARS-CoV-2. Esto sugiere que la incidencia de Covid-19 podría

seguirse en muestras de lodo primario y espesado adicional al uso de agua residual cruda, lo

cual puede ser particularmente útil en países donde la capacidad de pruebas clínicas es

limitada.
JUSTIFICACIÓN

Este estudio tiene relevancia porque ayudará a comprender el modo de detección y

cuantificación del ARN del SARS COV-2 en aguas residuales y efluentes tratados y su uso
como material para la vigilancia epidemiológica implementando en las autoridades locales
una herramienta para la toma de decisiones,adecuando un sistema sanitario para dar
respuestas eficientes frente a la pandemia COVID-19, proponiendo estrategias de
aislamiento/distanciamiento social, preventivo y obligatorio.

De otra parte, es importante mencionar que ayudará a combatir la enfermedad y salvar vidas
ya que la investigación se enfocará únicamente a los directivos sobre la detección y
cuantificación del ARN del Sars-CoV-2 en aguas residuales y efluentes tratados que en la
actualidad por el crecimiento poblacional y la escasez de recursos se vuelve una alternativa
modelos para poder tratar estas aguas residuales.

MÉTODO

Recoleccion de Informacion

Se obtuvo información sobre el virus SARS-CoV-2 mediante búsquedas concretas en la web,

esta consistió en una búsqueda en bases de datos como Google académico, Science, Scopus
de artículos sobre la detección y cuantificación del ARN del Sars-CoV-2 en aguas residuales
y efluentes tratados para lo cual la información más relevante se considero para poder tomarla
en cuenta en la producción del proyecto.

Recolección de Muestras

La recolección de muestras de las aguas residuales es un tema crítico. La estrategia con

respecto a la frecuencia y el tipo de muestra dependerá del objetivo para el cual se realiza la
medición. Entre los objetivos para los cuales se recomienda realizar la medición del
SARS-CoV-2 se encuentran los siguientes: i) vigilancia comunitaria de aguas residuales, para
establecer posibles niveles de alerta; ii) detección de áreas vulnerables; iii) determinación de
la carga viral en edificios con poblaciones vulnerables específicas. (OMS, 2021)

Métodos de concentración viral

Uno de los principales desafíos al establecer el monitoreo del SARS-CoV-2 en las aguas
residuales ha sido la selección de métodos para determinar la concentración del virus en las
muestras, ya que la mayoría de los métodos para medir la concentración viral en aguas
residuales se desarrollaron y validaron para virus sin envoltura. Hasta la fecha, se ha evaluado
la eficiencia de varios métodos para la recuperación de SARS-CoV-2 en estas muestras. Estos
protocolos deben llevarse a cabo en condiciones de nivel de bioseguridad 2 (BSL2, por su
sigla en inglés). Esto es, dentro de un gabinete BSL2, con protección individual adecuada,
incluidas las gafas de protección. Los rotores de la centrífuga deben ser abiertos en el
gabinete y se desinfectan después de cada uso. (Boxus et al., 2005)

Cálculo de la concentración viral de SARS-CoV-2

La concentración de SARS-CoV-2 por cada litro de agua residual se calcula tomando en

cuenta todos los volúmenes y pasos utilizados durante la concentración, la extracción de
AND y ARN, la RT-PCR y la qPCR. Además, se deben establecer claramente los límites de
detección y cuantificación, tanto del la prueba de qPCR como del método en general.

Para determinar la concentración de SARS-CoV-2 en una muestra desconocida, el número de

copias del genoma calculado antes se expresa en relación con la proporción del volumen de
muestra de aguas residuales original que se analizó en la reacción de PCR (Bustin et al.,
2010)

MARCO TEORICO

El coronavirus es un virus ARN monocatenario positivo y envuelto. Pertenece a la subfamilia

Orthocoronavirinae, con características en puntas "en forma de corona" en sus superficies.
Pertenece al género beta- coronavirus que a su vez se puede dividir en varios subgrupos. El
2019-nCoV, el SARS-CoV y el CoV similar al SARS en murciélagos pertenecen al
Sarbecovirus, mientras que el MERS-CoV al Merbecovirus. El SARS-CoV, MERS-CoV y
2019-nCoV causan enfermedades en los seres humanos, pero cada subgrupo puede tener
características biológicas y virulencia levemente diferentes; esta enfermedad es de
notificación obligatoria por parte de los entes competentes; una vez que las personas están
infectadas por el 2019-nCoV, la carga viral aumenta inicialmente y aún puede detectarse 12
días después del inicio de los síntomas dependiendo del tamizaje realizado; por lo tanto, la
infectividad de los pacientes con 2019-nCoV puede durar aproximadamente 2 semanas; sin
embargo, si existen partículas virales infecciosas de pacientes en una etapa posterior se
requiere validación por parte de personal competente. (Méndez, 2020)

Las diferentes cepas de coronavirus circulaban en el ambiente sin otorgar mayores

complicaciones de salud a las personas, referentes a manifestaciones respiratorias. En
Wuhan, China. Inicialmente se generó un brote que involucro a un mercado local, el Huanan
Seafood Market, con un significativo número de personas, al menos 41 personas. La
autoridad sanitaria local emitió una “alerta epidemiológica” y el mercado cerró el primero de
enero de 2020. Un total de 59 casos sospechosos con fiebre y tos seca fueron remitidos a un
hospital designado (el Jin Yin -tan Hospital). De los 59 casos sospechosos, 41 pacientes
fueron confirmados mediante secuenciación de próxima generación o reacción en cadena de
la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) . En los días siguientes, una
explosión de casos se extendió desde Wuhan a toda la provincia de Hubei. Posteriormente,
muchas ciudades y provincias fueron atacadas por este virus. ( Méndez, 2020)

Ensayo RT-PCR para detectar SARS-CoV-2

La RT-PCR es una técnica de laboratorio que permite la identificación, detección y

cuantificación de ARN, utilizando este como molde para sintetizar ADN complementario
(ADNc), el cual a su vez constituye la plantilla para una reacción de PCR en tiempo real. El
aumento exponencial en las copias de ADN se ve reflejado en la aparición de fluorescencia
cuya intensidad es directamente proporcional a la cantidad de ARN en la muestra, haciendo
que esta reacción sea altamente sensible aún a bajas concentraciones de ácidos nucleicos
virales. (Cuadra et al.,2021)

Los genes de coronavirus anotados hasta ahora incluyen: ORF1 que comúnmente es
representado en secciones a y b, N (nucleocápside), M (membrana), E (envoltura viral), S
(espiga viral), y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP- por sus siglas en inglés),
presente en el ORF1b1. Los científicos enfatizan que la selección de estos blancos genómicos
para pruebas RT-PCR se debe a que son regiones persistentes en los coronavirus, pero con
ciertas porciones específicas para SARS-CoV-2; lo que permite entregar resultados
consistentes a medida que la pandemia progresa e intrínsecamente mientras el virus sufre
mutaciones. En toda metodología analítica, especialmente en estos casos de detección de
patógenos relevantes, es importante considerar aspectos como la sensibilidad, especificidad y
límite de detección (LD). (Cuadra et al.,2021)
Presencia del SARS-CoV-2 en aguas residuales

El SARS-CoV-2 ha sido detectado en diferentes países, siendo el primero Holanda. También

ha sido hallado en Australia, Estados Unidos, Francia e Italia, en aguas residuales crudas(sin
tratar) provenientes tanto de áreas de alta circulación como de baja circulación del virus. Con
el auxilio de técnicas moleculares se ha detectado en aguas crudas una concentración de hasta
10 6 copias por litro. Mientras que en aguas residuales tratadas la cifra ha sido de 10 5 copias
por litro. ( Barreto, 2020)

Métodos empleados para la detección del SARS-CoV-2 en aguas residuales

El SARS-CoV-2 es un virus recubierto por una envoltura lipídica, en la envoltura vírica se

encuentran al menos tres estructuras proteicas: proteína M de membrana, proteína E cuya
función principal es el ensamblaje viral, y la glicoproteína S en las espículas.

Actualmente el diagnóstico clínico del virus SARS-CoV-2 se realiza con técnicas de RT-PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa) en tiempo real. Se
recomienda hacerlo de forma secuencial. En primer lugar se utiliza una técnica de cribado
para uno de los dos genes: el E o el N al nuevo coronavirus si resulta positiva se realiza una
nueva RT-PCR de confirmación, frente a un fragmento genómico específico del COVID-19,
como es el gen RdRp (de la RNA polimerasa RNA-dependiente). A favor de la técnica
RT-PCR se señalan el buen desempeño analítico, los bajos límites de detección, el amplio
rango lineal de cuantificación y la excelente precisión. A estas ventajas se unen la rapidez,
amplia variedad de plataformas de amplificación y mínimo riesgo de contaminación.
(Barreto, 2020)

No existe hasta el momento un método estandarizado para la determinación del SARS-CoV-2

en aguas residuales, pese a su confirmación en las mismas, como se expresó antes. Primero se
concentra el virus, para incrementar la sensibilidad de su detección en dicho medio,
realizando una separación de fases, por diferentes métodos: la extracción directa del ARN
mediante membranas electronegativas, la ultrafiltración, el método de polietilenglicol (PEG
8000) el PEG/dextrana. Se afirma que es limitada la información científica disponible para la
recuperación de virus recubiertos con los métodos de concentración existentes, con particular
énfasis en el SARS-CoV-2, por lo que habrá que evaluar las eficiencias de recuperación para
determinar cuáles son más efectivas. (Barreto, 2020)

El estudio de aguas residuales puede proporcionar una herramienta alternativa y posiblemente

temprana para detectar patógenos en poblaciones cuando las investigaciones en humanos son
difíciles por razones logísticas, éticas o económicas (Wurtzer et al., 2020), es por ello, que la
detección en tiempo real de genomas virales permite predecir y monitorear la circulación del
SARS-CoV-2 en entornos clínicos y estudiar a la población humana urbana (Bertrand et al.,
2021). Los pacientes con 10 síntomas leves o con sospechas de tener el virus se quedan en
casa para evitar una ocupación alta en las Unidades de Cuidado Intensivo (UC), de esta
manera, las personas asintomáticas presentan infecciones potenciales que no se notifican
como casos prioritarios. Por otro lado, el ARN del SARS-CoV-2 se puede detectar en las
heces de algunos individuos asintomáticos, levemente y presintomáticos. La diseminación
fecal del virus alcanza su punto máximo en el período sintomático y puede persistir durante
varias semanas (Barreto, 2020)

Prevalencia del virus en aguas residuales

Existen escasos datos de prevalencia del virus en aguas residuales, y los factores que influyen
en su desactivación en las mismas, constituyendo este un elemento importante para la
evaluación de riesgo para la salud humana. Algunos resultados indican la influencia de la
temperatura del agua en la persistencia del SARS-CoV-2, siendo esta menor a 20 ᵒC que a 4
ᵒC, pero se requiere investigar su persistencia relacionándola con las condiciones climáticas y
estacionales. Tampoco existen resultados de investigaciones que demuestran la presencia de
SARS-CoV-2 en aerosoles de instalaciones de aguas residuales, pero se demostró, a escala de
laboratorio, que este virus puede mantenerse activo en aerosoles hasta 16 h

Hay evidencias de que los virus de esta familia son inestables en el ambiente y que son más
susceptibles a oxidantes como el cloro, al pH y a la temperatura, que la mayoría de los virus
entéricos sin envoltura. No obstante, es necesario demostrar la efectividad de las operaciones
y procesos de tratamiento de aguas residuales, individual y colectivamente, en la
desactivación del virus, aunque los procesos de desinfección han sido efectivos en su
inactivación. (Iglesias et al., 2021)

Vigilancia epidemiológica de SARS-CoV-2 basada en aguas residuales

Nueve artículos revisados por pares en China,21 Australia,28 España24,26 e Italia22,29

Estados Unidos,30,31 Japón,26 Holanda32 y 11 reportes no revisados por pares (preprints)
del año 2020, en Estado Unidos,33,34 España,24,35 Francia,23,36 en Turquía,37,38 China,27
Israel,39 y Pakistán,40 reportaron la presencia y cuantificación del ARN de SARS-CoV-2
mediante la técnica de RT-PCR o RT-qPCR en muestras compuestas o instantáneas de aguas
residuales crudas de PTAR. (Cruz, et al., 2021)

RESULTADOS ESPERADOS

La búsqueda realizada en diferentes fuentes bibliográficas ayudarán a determinar la detección

y cuantificación del virus SARS COV - 2 en aguas residuales y efluentes. A su vez, sería de

gran utilidad la genotipificación de las muestras de ARNs positivas para poner en evidencia

la co-circulación de distintas variantes genómicas del SARS-CoV-2 en las muestras de

estudio generando a través de esto un proceso de vigilancia epidemiologic. Otro resultado

espero de importancia sería evaluar la duración de la presencia viral en las aguas residuales

analizadas.

CRONOGRAMA

Tabla 1. Actividades programadas para presentación de proyecto.

Actividades Duración (Días) Inicio Fin

Determinación de 5 25/10/2021 29/10/2021

tema de proyecto
 Planteamiento de 5 25/10/2021 29/10/2021
objetivos

Recolección de 20 29/10/2021 19/11/2021

Información

Presentación de 5 01/11/2021 05/11/2021

anteproyecto

Análisis de datos 10 15/12/2021 25/12/2021

Presentación de 5 25/12/2021 30/12/2021

proyecto final

Tabla 2. Actividades programadas por semana en la presentación del proyecto.

Actividades
Semanas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 1
0 1 2 3

Determinación de tema
de proyecto

Planteamiento de
objetivos

Recolección de
Información

Presentación de
anteproyecto
Obtención de muestras
de aguas residuales y
efluentes

Extracción de ARN
para detección de
SARS-CoV-2

Cuantificación de
SARS-CoV-2 en aguas
residuales y efluentes

Análisis de datos

Presentación de
proyecto final

BIBLIOGRAFÍA

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