Analisis y Tecnologia de Los Alimentos m2 s3

Técnico en Análisis y
Técnico en Producción
Tecnología de los

Alimentos
Módulo
Módulo II II
Tecnología para la conservación y transformación
Procesa alimentos de leche
a base de la leche
Submódulo
Submódulo III II
Efectuaranálisis
Efectúa análisismicrobiológicos
fisicoquímicos aa leche
la leche y productos
y productos lácteos
lácteos
Versión 1.0
Junio, 2009
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Guillermina Galindo Figueroa Nayarit
Enrique Gómez Sánchez Tabasco
Víctor Hernández Coello Yucatán
Ana Isabel Soto Rojas Veracruz
Adriana García Ortiz Hidalgo
Antonio Ix Chuc Campeche
Manuel G. Méndez Monforte Yucatán
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En este módulo que actualmente cursas, aprenderás todo lo relacionado a la obtención y análisis de
alimentos procesados a base de leche, por lo tanto también deberás comprender sobre los análisis
microbiológicos necesarios e imprescindibles para el aseguramiento de la calidad de la leche y de los
productos lácteos, lo que permitirá garantizar la inocuidad, la calidad microbiológica y la aceptabilidad
de los alimentos.
Serás guiado durante el transcurso del submódulo tres para que seas capaz de realizar análisis
microbiológicos a leche y sus derivados; aprenderás sobre conteo de hongos y levaduras, coliformes
totales, coliformes fecales, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes y
mesofílicos aerobios, a leche y productos lácteos; con los datos obtenidos de los análisis podrás
realizar los reportes correspondientes.
No olvides que lo importante es que tus habilidades y destrezas se desarrollen cada vez mejor y lo
lograrás con los ejemplos, ejercicios y prácticas que te proporcionaré más adelante. Al final de todo el
seguimiento de esta guía de aprendizaje, habrás adquirido las competencias del submódulo 3, con
base en el programa de estudios.
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Técnico en Análisis y Tecnología de los Alimentos
Módulo II Procesa Alimentos a Base de Leche
Submódulo III Efectúa Análisis Microbiológicos a Leche y Productos Lácteos
Competencia 1 Competencia 2
1.-Realiza análisis microbiológicos a la 2.-Realiza análisis microbiológicos a

leche procesada de acuerdo a las derivados de la leche, de acuerdo a las
normas vigentes en la materia normas vigentes en la materia.
Atributos de la Competencia Atributos de la Competencia
• Realiza el conteo de hongos y • Realiza el conteo de hongos y levaduras.

levaduras. • Realiza la determinación de coliformes
• Realiza la determinación de coliformes totales
totales • Realiza la determinación de coliformes
• Realiza la determinación de coliformes fecales
fecales • Realiza la determinación de Salmonella
• Realiza la determinación de • Realiza la determinación de
Salmonella Staphylococcus
• Realiza la determinación de • Realiza la determinación de bacterias
Staphylococcus mesofílicas aerobias
• Realiza la determinación de bacterias • Realiza la determinación de Listeria
mesofílicas aerobias monocytogenes
• Realiza la determinación de Listeria
monocytogenes
Saberes Saberes
• Características generales de los • Características generales de los

microorganismos. microorganismos.
• Métodos de esterilización. • Métodos de esterilización.
• Preparación de medios de cultivo. • Preparación de medios de cultivo.
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• Preparación y dilución de la muestra. • Preparación y dilución de la muestra.
• Cuenta de bacterias mesofílicas • Cuenta de bacterias mesofílicas
aerobias en base a la NMX-F-253- aerobias en base a la NMX-F-253-1977.
1977. • Cuenta de microorganismos coliformes
• Cuenta de microorganismos totales en base a ala NOM-113-SSA1-
coliformes totales en base a ala NOM- 1994.
113-SSA1-1994. • Conteo de hongos y levaduras en base a
• Conteo de hongos y levaduras en la NMX-F-255-1978.
base a la NMX-F-255-1978. • Determinación de Salmonella en base a
• Determinación de Salmonella en base la NMX-F-304-1977.
a la NMX-F-304-1977. • Determinación de coliformes fecales en
• Determinación de coliformes fecales base en la NMX-F-308-1992.
en base en la NMX-F-308-1992. • Determinación de Staphylococcus en
• Determinación de Staphylococcus en base a la NMX-F-310-1978.
base a la NMX-F-310-1978. • Determinación Listeria en base a la
• Determinación de Listeria en base a la NOM-143-SSA1-1995.
NOM-143-SSA1-1995.
Actitudes: Actitudes:
• Responsabilidad • Responsabilidad
• Orden • Orden
• Limpieza • Limpieza

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Hola, soy tu amigo Microscopio y te acompañaré durante el seguimiento de esta guía de

aprendizaje!!! Estas por comenzar el tercer submódulo del módulo dos de tu formación profesional:
Efectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos. En el módulo uno: Procesa Alimentos a
Base de Frutas y Hortalizas, tuviste tu primera experiencia en lo que se refiere a este fantástico
mundo de los microorganismos y su relación con los alimentos procesados.
Los microorganismos, o microbios como se conocen comúnmente, son de interés sobresaliente en la

industria de la transformación de alimentos, ya que son causantes de enfermedades en los humanos,
al contaminar los alimentos y descomponerlos. En éste submódulo obtendrás conocimientos sobre
los patógenos que pueden contaminar la leche y los productos lácteos; aprenderás también sobre las
diferentes técnicas para la identificación de tales patógenos; vas a adquirir conocimientos de
toxicología, análisis de alimentos, microbiología de alimentos y procesos de calidad. Para que logres
los conocimientos que te acabo de mencionar, voy a guiarte a través de actividades prácticas que
incluyen desde tomar muestras, hasta realizar los análisis respectivos, todo para que logres
interpretar tus resultados y puedas realizar el reporte correspondiente. Se dice fácil, ¡¡¡pues sí, lo es!!!
Ya que para eso estoy contigo, para facilitar tu aprendizaje de manera amena y divertida.
Para que tu aprendizaje sea completo, será importante que sigas las indicaciones con orden, limpieza
y responsabilidad. Todo lo que aprendas te permitirá desarrollar los atributos de cada una de las
competencias profesionales planteadas, necesarias para que puedas laborar en el campo del control
de calidad microbiológica de la leche y los productos lácteos.
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Realiza análisis microbiológicos a la
1
leche procesada de acuerdo a las
normas vigentes en la materia
Mi palabra es la ley
Pero cómo cambia el clima
¿Puedo vivir aquí?
A que no me ves
¿Me llevas?
¿Cuánto tiempo crees que viviré?
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Conteo de hongos y levaduras
Conteo de coliformes totales y fecales
Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias
Determinación de Salmonella
Determinación de Staphylococcus aureus
Determinación de Listeria monocytogenes
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En los métodos de procesamiento de alimentos a base de leche es importante el control de calidad

por lo que debes aprender la realización de análisis fisicoquímicos y microbiológicos; éstos últimos
son necesarios e imprescindibles para el aseguramiento de la calidad de la leche y de los productos
lácteos, lo que permitirá garantizar la inocuidad, la calidad microbiológica y la aceptabilidad de los
alimentos. Para lograr lo anterior se han desarrollado técnicas para promover el crecimiento y
desarrollo de los microorganismos e identificarlos con la ayuda del imprescindible microscopio.
¿Te gustaría saber cuáles son y cómo se ejecutan dichas técnicas? Pues con esta guía podrás
lograrlo, ya que te ayudará para que de una manera práctica desarrolles habilidades y destrezas con
la finalidad de que logres desempeñarte en el área de control de calidad microbiológica en las
empresas procesadoras de lácteos.
Para apoyarte en tu aprendizaje visitarás empresas procesadoras de lácteos donde acudirás al

laboratorio de análisis microbiológicos, además realizarás los análisis correspondientes en el
laboratorio de tu escuela a los alimentos que tú mismo hayas procesado; después deberás comparar
los resultados que obtengas con los estándares de calidad que dictan las normas oficiales, para que
realices tu reporte señalando tus conclusiones, de tal manera que puedas demostrar desempeño
durante la ejecución de los análisis y tengas evidencia a través de tus reportes.
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• Realiza el conteo de hongos y levaduras.
ATRIBUTOS DE
LA • Realiza la determinación de Salmonella
COMPETENCIA • Realiza la determinación de Staphylococcus
• Realiza la determinación de bacterias mesofílicas aerobias
• Realiza la determinación de Listeria monocytogenes
Efectúa análisis microbiológicos a leche y derivados lácteos,
RESULTADO DE de acuerdo a las normas vigentes en la materia y a los
APRENDIZAJE requerimientos del sector productivo lechero, siguiendo
instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.
Encuadre grupal
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Nombre Mi palabra es la ley. No. 1
Instrucciones Revisa en el internet el contenido de las siguientes normas e identifica los

para el Alumno elementos que se te piden.
Elementos de las
Manera
NOM y NMX Analiza detenidamente cada uno de los
Saberes a Didáctica
necesarios para la elementos de las NOM y NMX.
adquirir de
realización de las
Lograrlos
prácticas.
En el módulo 1, submódulo III, realizaste prácticas para la determinación de microorganismo,

ahora deberás hacer determinaciones en leche procesada, y como ya has visto las técnicas para
la identificación de los microorganismos están desarrolladas en Normas Oficiales Mexicanas y
Normas Mexicanas, mismas que puedes consultar en el catálogo de normas del siguiente portal:
http://www.economia.gob.mx.
Tipo de Norma Oficial Mexicana o Nombre de la norma.

microorganismo Norma Mexicana
Hongos y levaduras NMX-F-255-1978 Método de conteo de hongos y levaduras

en alimentos
Coliformes NMX-F-308-1992 Cuenta de organismos coliformes fecales
Mesofílicos aerobios NMX-F-253-1977 Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias.
Staphylococcus NOM-115-SSA1-1994 Método para la determinación de

aureus Staphylococcus aureus en alimentos.
Listeria NOM-143-SSA1-1995 Método de prueba microbiológico para

alimentos.
Determinación de Listeria monocytogenes.
Salmonella NMX-F-304-1977* Método general de investigación de
Salmonella en alimentos.
*Esta última aparece en la Declaratoria de cancelación de normas mexicanas, publicada por la

Secretaría de Economía el jueves 9 de octubre de 2008 en el Diario Oficial de la Federación
(Segunda sección).
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Como podrás identificar al revisar estas normas, están formadas por las siguientes partes:
1. Nombre
2. Objetivo y campo de aplicación
3. Referencias
4. Material y equipo
5. Medios de cultivo y reactivos
6. Procedimiento
7. Interpretación de resultados
8. Bibliografía
9. Concordancia con normas internacionales
10. Fecha de aprobación y publicación
11. Firma.
¿Cuáles de estas partes nos son de utilidad para la realización de prácticas en el laboratorio y
para el reporte de resultados?
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Nombre ¿Puedo vivir aquí? No. 1
Instrucciones
Investiga y completa el siguiente cuadro
para el Alumno
Manera
Tipos de
Didáctica Investigando y analizando el contenido de las
microorganismo
Saberes a de siguientes Normas Oficiales Mexicanas:
adquirir Clasificación de los Lograrlos
NOM-065-SSA1-1993
medios de cultivo
Clasificación de medios de cultivo Características del medio Tipo de

microorganismo que
puede desarrollarse
Líquidos Estimular y promover la

selección de algún o algunos
microorganismos e impedir
que otros se multipliquen
Semisólidos
Por su
aspecto físico Sólidos Se utilizan para obtener
colonias aisladas de
microorganismos. Los medios
sólidos constituyen la mayor
parte de los medios de cultivo
que se emplean en
Microbiología.
Medios selectivos Son medios que contienen
sustancias que impiden el
desarrollo de algunos
microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el
aislamiento y recuperación del
germen o grupo de gérmenes
de interés.
Métodos selectivos de
enriquecimiento
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Medios diferenciales
Métodos para cultivar Son medios de cultivo para

gérmenes anaeróbicos aquellos gérmenes que
requieran condiciones de
anaerobiosis o de
microaerofilia.
Métodos para medir la

potencia de los
antibióticos
Medios de transporte
Medios para filtración a

través de membrana
Por su uso
Medios especiales Hongos y levaduras
para cultivo de hongos
y levaduras
Métodos especiales
para cultivo de
protozoarios
Con la información que aprendiste en el Módulo 1, con la de este ejemplo, completa el cuadro para
las siguientes pruebas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Listeria y Salmonella.
Microorganismo Método de Tiempo de Tipo de siembra Método de

enriquecimiento incubación aislamiento
Escherichia coli
Staphylococcus
aureus
Listeria
Salmonella
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Nombre ¿Me llevas? No. 1
Instrucciones Identifica las precauciones y condiciones para la toma de muestras de alimentos
para el para su análisis microbiológico.
Alumno
Manera Analizar el contenido de la Norma Oficial

Actitudes a Orden y Didáctica Mexicana NOM-F-285-1977. Muestreo y
formar responsabilidad de transporte de muestras de alimentos para
Lograrlas su análisis microbiológico.
Competencia • Toma decisiones a partir de la valoración de las consecuencias de

s Genéricas a distintos hábitos de consumo y conductas de riesgo.
Desarrollar
Manera Análisis de la Norma Oficial Mexicana NOM-F-285-1977. Muestreo y transporte

Didáctica de de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
Lograrlas
La toma de muestras es el acto de separar de una partida determinada, una muestra

representativa, a efectos de determinar mediante análisis organoléptico y/o de laboratorio la aptitud o
no del alimento puesto a consideración. En la práctica profesional de la Microbiología de Alimentos
antes de tomar las muestras hay que tener un “plan de muestreo” que es el criterio de aceptación del
punto de vista microbiológico para un determinado lote de alimento. Para elegir un plan de muestreo
se tiene en cuenta cuatro puntos:
1. La peligrosidad del microorganismo.
2. La cantidad de microorganismos presentes en el alimento.
3. Las condiciones que será sometido el alimento antes de consumir.
4. La población que va a consumir ese alimento.
Luego de esto se procede al envasado de las muestras y su transporte, los cuales tienen cada
uno sus peculiaridades, para luego pasar al análisis sanitario que es la determinación bromatológica
para establecer la calidad de aptitud o no del alimento, tendiente a preservar la salud pública o
individual del consumidor, realizado de acuerdo a la normatividad aplicable.
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Completa la tabla siguiente:
Apartado de la NOM-F-285-1977 Recomendaciones

Colectar la muestra
Muestra de alimentos envasados
Muestra de alimentos a granel o de
recipientes o piezas grandes
Muestras de alimentos perecederos
o semiperecederos
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Nombre ¡Cómo cambia el clima! No. 4
Instrucciones
Contesta el cuestionario.
para el Alumno
Clasificación de los Manera

microorganismos Didáctica
según su de
Saberes a Análisis de la lectura
adquirir comportamiento Lograrlos
frente a la
temperatura.
Bacterias Termodúricas, Termófilas y Psicrófilas.
La temperatura de la leche durante su transporte y almacenamiento es uno de los factores más

importantes que afectan el crecimiento bacteriano y por lo tanto determinan su tiempo de
conservación. Este factor influye igualmente en los tipos de micoorganismos que se desarrollan y por
ende en los cambios o tipos de descomposición que experimenta el producto.
Cuando la leche se mantiene a temperatura normal, sin refrigeración, generalmente experimenta

acidificación debido al crecimiento de bacterias lácticas (flora normal) con producción de ácido láctico
por fermentación de la lactosa, bajando el pH e inhibiendo así el desarrollo de otros micoorganismos
y ocasionando la precipitación de la caseína al acercarla a su punto isoeléctrico (ph 4.7). Estos
microorganismos reciben el nombre de mesófilos por tener temperaturas óptimas de crecimiento
entre la de un ambiente normal y la temperatura corporal.
Si la leche cruda se conserva a temperaturas de refrigeración, la velocidad de acidificación se reduce

al disminuir el crecimiento de las bacterias lácticas comunes /v.g. Lactococcus lactis), es probable
que ocurran ciertos cambios en el sabor y olor que se produzca proteólisis láctea por acción de
gérmenes capaces de crecer a temperaturas relativamente bajas. Estos microorganismos reciben la
denominación de psicrófilicos (v.g. Pseudomona fluorescens).
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Cuando la leche cruda es sometida a la pasteurización comercial, aproximadamente un 95-99% de
los microorganismos son destruidos, entre ellos todos los patógenos, pero pueden sobrevivir ciertos
gérmenes termoresistentes, no patógenos que se han clasificado en dos grupos: termofílicos que son
capaces de reproducirse a temperatura de pasteurización baja (63°C/30 min) como por ejemplo el
Lactobacillus termophilllus, y los termodúricos, que resisten la pasteurización, pero no pueden
desarrollarse a esa temperatura, presentado más bien el comportamiento mesófilo para su
crecimiento, como es el caso del Streptococcus salivarius subsp themophillus. Ambos grupos son
responsables de altas recuentos bacterianos en la leche pasteurizada.
En las industrias lácteas, los recuentos de estos grupos de micoorganismos es de interés debido a
que pueden ocasionar muchos problemas de carácter funcional. Por lo tanto, altos recuentos de ellos
deben evitarse mediante buenas prácticas de producción y procesamiento, y en caso de presentarse,
deben ponerse en evidencia las causas que las originaron y corregirse, a continuación se estudia
cada grupo en particular:
1. Bacterias termodúricas en la leche.
Las bacteroas termoduricas son microorganismos termoresistentes, generalmente mesofílicos en su

mayoría no esporulados, que frecuentemente se presentan en la leche cruda bajo malas condiciones
sanitarias o procesada en plantas mal limpiadasy saneadas y/o que utilizan malas prácgticas de
procesamiento. Se incluyen en este grupo el Strestococcus termophyllus y otros Streptococcus (S.
bovis, S. zymogenes, S liquefaciens, S. faecalis) asi como el Microbacterium lacticum, ciertos
Micrococcus y algunas especies esporuladas de género Baccillus. Cuando los establos o los
utensilios de ordeño no son bien lavados o saneados pueden darse condiciones bajo las cuales
mueren las especies o cepas microbianas más débiles, pero sobreviven aquellas más resistentes al
calor, las cuales crecen en la superficie de estos utensilios, representando una fuente de
contaminación. Otras veces suele ocurrir que una o varias vacas, frecuentemente animales viejos,
presenten como huéspedes crónicos de la ubre, especies o cepas bacterianas muy resistentes al
calor (v.g. ciertas cepas de micrococos), en estas condiciones es muy posible la contaminación de la
leche con termodúricos que luego van a contaminar el producto almacenado en la planta lechera.
Por otra parte, la contaminación con termodúricos puede ocurrir en la planta, cuando los métodos de
limpieza y saneamiento de los equipos son inadecuados o cuando se mezcla la leche cruda con el
producto pasteurizado sobrante. Una de las causas más frecuentes de contaminación con estos
microorganismos es la práctica errónea de emplear leche descremada pasteurizada para
estandarizar, o la de re-pasteurizar las leches sobrantes.
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Una vez contaminada la leche cruda con termodúricos, cualquiera que sea la causa, puede suceder
que el tratamiento térmico involucrado en la pasteurización no reduzca el número de bacterias,
determinando que el producto no cumpla las normas sanitarias para leche pasteurizada, o que se
descomponga con gran facilidad bajo condiciones deficientes de refrigeración. Para solucionar esos
problemas se debe establecer y corregir la causa de la contaminación. En tal sentido es
recomendable hacer recuentos de bacterias termodúricas en la misma planta utilizando muestras
recolectadas en diferentes etapas del procedimiento y en caso de que la planta no sea responsable,
debe hacerse análisis demuestras de cada productor hasta localizar al causante de la contaminación.
2. Bacterias termofílicas en leche.
Las bacterias termofílicas son aquellas que, además de resistir la temperatura de pasteurización baja,
son capaces de crecer a esa temperatura. Generalmente son bacilos no esporulados, aunque no
necesariamente (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus). No son patógenas pero su presencia
en la leche es indeseable porque producen acidez, sabores desagradables y tendencia de la leche a
coagular después de la pasteurización. Además, junto con los termodúricos, son responsables de
recuentos bacterianos elevados en leches pasteurizadas. Crecen bien a 55°C pudiendo hacerlo
hasta más de 70°C.
Las fuentes de contaminación con bacterias termofilicas más frecuentes son: la leche cruda obtenida
bajo condiciones sanitarias deficientes (utensilios mal lavados y saneados, agua de lavado), los
equipos de planta mal limpiados y saneados, el empleo de precalentadores, tanques de retención u
otros equipos de calentamiento o mantenimiento de la leche caliente por tiempos prolongados sin
sanearlos (3-6 horas); los filtros de tela empleados para filtrar leche caliente, cuando se usan por más
de 1-2 horas sin cambiarlos, y la práctica de re-pasteurizar la leche. La existencia de bacterias
termofílicas se pone de manifiesto cuando en las placas de agar, obtenidas en recuentos estándar,
aparecen numerosas colonias puntiformes; o por la observación de muchos bacilos grandes
coloreados en las frotis obtenidos por el método de recuento microscópico directo.
3. Bacterias psicrofílicas en la leche.
En microbiología general se define con el nombre de bacterias psicrofílicas aquellas que crecen
“mejor” a temperaturas de refrigeración. En las industrias lácteas, el término se aplica a las bacterias
que se desarrollan relativamente rápido a temperaturas por debajo de 15°C, aún cuando su
temperatura óptima está por encima de ese valor.
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Son gérmenes no patógenos, pero que al crecer lentamente a bajas temperaturas (1-10°C) ocasionan
problemas en el almacenamiento de muchos productos lácteos, originando recuentos bacterianos
elevados que a su vez determinan disminución de la calidad de la leche, y a menudo producen
sabores u olores extraños descritos corrientemente como “a sucio”, a “frutas”, “rancia”, “agrio”,
“pútrido”, etc. Tales alteraciones generalmente ocurren cuando los recuentos de estos
microorganismos llegan a 5-20 millones por mL y se deben a su acción sobre los sustratos más
importantes de la leche, especialmente sobre las proteínas y las grasas.
En estos grupos de bacterias están incluidas especies de los géneros Pseudomonas, Alcaligenes,
Flavobacterium y Acinetobacter e incluso algunas cepas de Enterobacter que pueden encontrarse en
el polvo (suelo), agua, vegetales y equipos de ordeno o de la planta mal limpiados y saneados. Se
presentan como bacilos Gram negativos, no esporulados que se destruyen fácilmente por el calor.
También se incluyen en este grupo, al menos en las industrias lácteas por los problemas que causan,
algunas especies de Stresptococcus y ciertos mohos y levaduras.
Los microorganismos psicrofílicos, invariablemente contaminan la leche cruda en la planta, ellos

constituyen parte de la flora normal de la leche cruda, al igual que los colifirmes, termodúricos y
termofílicos. Los métodos modernos de conservación de la leche cruda en tanques refrigerados a
nivel de las haciendas, favorecen el crecimiento de estos gérmenes y retardan el desarrollo de las
bacterias lácticas. Afortunadamente, bajo buenas condiciones de producción y conservaciónb no
alcanza a desarrollarse en números capaces de ocasionar los problemas mencionados y además se
destruyen por la pasteurización, con excepción de algunos estreptococos entéricos, que pueden
sobrevivir al tratamiento térmico y crecer luego a temperaturas por encima de 7°C.
La presencia de psicrófilos en productos lácteos pasteurizados no se considera normal y es indicativa

de posible contaminación post-pasteurización en equipos mal limpiados o saneados, o bien tratados
con aguas de lavado contaminadas. Por ello, el recuento de bacterias psicrofílicas en la leche
pasteurizada da información sobre la bondad del tratamiento post-pasteurización y de la vida
comercial del producto (bajo refrigeración).
La presencia de algunas bacterias psicrofílicas en la leche recién pasteurizada o de altas cuentas

después de 3-4 dias de almacenamiento, refleja deficiente limpieza y saneamiento de los equipos en
contacto con la leche después de la pasteurización. Estos resultados indican además que la leche no
podrá mantenerse por mucho tiempo sin descomponerse, es decir que su tiempo de conservación
normal (vida útil) será reducido.
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Contesta el siguiente cuestionario.
1. Menciona los grupos de micoorganismos que pueden ocasionar problemas en la producción e

industrias de la leche y derivados.
2. ¿Cuáles son las diferencias que existen entre las bacterias termodúricas, termofílicas y
psicrofílicas en lo que respecta a la temperatura óptima de crecimiento y resistencia a la
pasteurización?
3. Mencione los problemas que pueden derivarse de la presencia de bacterias termodúricas,

termofílicas y psicrofílicas en la leche y derivados.
4. ¿Cuáles son las principales especies de bacterias termodúricas, termofílicas y psicrofílicas

que pueden presentarse en la leche y derivados?
5. ¿Qué precauciones deben adpotarse en una planta lechera para evitar la contaminación con
bacterias termodúricas, termofílicas y psicrofílicas?
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Nombre A que no me ves No. 1
Analiza la siguiente información y escribe en el cuadro el nombre de la colonia

Instrucciones
que está representada en la imagen.
para el Alumno
Manera
Didáctica Investigar qué es una cepa de referencia.
Actitudes a Responsabilidad
formar de Identificar cepas al microscopio.
Lograrlas
Competencias • Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones.

Genéricas a
• Estructura ideas y argumentos de manera clara, coherente y sintética.
Desarrollar
Manera
Didáctica de Analiza el contenido de la lectura e identifica el tipo de cepa.
Lograrlas
Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos difíciles de eliminar que
colonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y
las fosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Staphylococcus aureus es un coco Gram
positivo aerobio o anaerobio que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa positivo.
Posee numerosos factores de virulencia, en su mayoría componentes de la pared celular, y una
variedad de proteínas solubles o exoproteínas que facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas
propiedades, hacen que los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que
van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como neumonías, meningitis,
intoxicaciones alimentarias, shock séptico y desórdenes autoinmunes. De gran preocupación, es el
hecho de que S. aureus sea un importante agente de infecciones nocosomiales fulminantes.

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Listeria monocytogenes, es un microorganismo que frecuentemente se encuentra en alimentos

como leche no pasteurizada, carne cruda, aves y mariscos, así como numerosas variedades
procesadas de lácteos, carne, pescado y mariscos. Los vehículos confirmados de infección incluyen
ensalada de repollo, leche chocolatada, quesos, paté, carnes frías, pollo y ostras ahumadas. Este
microorganismo es el agente causal de la enfermedad llamada listeriosis, que es una enfermedad
grave, siendo considerada actualmente la infección de origen alimentario con mayor tasa de letalidad
(20 a 30 % de los casos), teniendo costos elevados tanto desde el punto de vista médico como
dentro de la industria agroalimentaria.
Este microorganismo es relativamente resistente al ácido, por lo que es muy factible que atraviese la
barrera gástrica sin que haya un daño importante en las células. Esta observación es aplicable en
especial a recién nacidos, cuya producción de ácido en el estómago es menor que en el adulto.
Aunque el carácter patógeno de Listeria monocytogenes se conoce desde hace más de 60 años, el
mecanismo por el cual causa la enfermedad parece ser sumamente complejo. El proceso se ha
dividido en tres etapas: (a) penetración en el huésped; (b) sobrevivencia y multiplicación dentro del
huésped, y (c) invasión del tejido susceptible.
El poder patógeno de este microorganismo le permite no sólo sobrevivir a la digestión de los

macrófagos, sino destruirlos y liberarse a la circulación sanguínea.
Después de la invasión de los macrófagos, las cepas virulentas de Listeria pueden multiplicarse, y
destruir las células, y provocar septicemia. A partir de la sangre tiene acceso a todas las áreas del
cuerpo, incluidos el sistema nervioso central, el corazón, los ojos y otras localidades, así como el
feto en la mujer embarazada. De esta manera el daño se traduce en un aborto o en
meningoencefalitis.
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Ya que el organismo se encuentra muy diseminado en la naturaleza, la mejor protección son
medidas sanitarias básicas, tales como usar sólo productos lácteos pasteurizados, comer carnes
cocidas y lavarse bien las manos antes de preparar comidas. Las mujeres embarazadas y las
personas con sistemas inmunológicos debilitados deben evitar estos alimentos, al igual que los
quesos blandos y las salchichas crudas o recalentar bien las carnes frías antes de comerlas.
Además, es recomendable:
Utilizar lo antes posible todos los productos perecederos que estén precocinados o que vengan listos
para comer. Limpiar con frecuencia los refrigeradores. Mantener la temperatura del refrigerador a 4°
C o menos, esto es importante ya que el microorganismo puede desarrollarse en este
electrodoméstico. No tener alimentos destapados dentro del refrigerador, para evitar la
contaminación cruzada.

Bacterias coliformes.
Dentro del llamado “grupo coliforme” se incluyen todos los bacilos Gram negativos, aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la lactosa con producción de gas y
ácido en 48 horas, en medios de cultivo sólidos o líquidos. Los géneros que integran este grupo son
Escherichia, Enterobacter, Citrobacter y Klehsiella (Flia Enterobacteriaceae), siendo las especies más
importantes Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. El primero en particular es huésped normal
del tracto intestinal del hombre y los animales de sangre caliente, por lo cual se encuentra en grandes
cantidades en las heces, pero más frecuentemente se origina del suelo y materia vegetal en
descomposición.
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La presencia en el agua de estos microorganismos se considera inaceptable, asociándose con
contaminación fecal y por ende con la posible presencia de otros microorganismos patógenos de
origen intestinal, como por ejemplo las especies del género Salmonella productoras de la fiebre
tifoidea y disenterías bacilares.
La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes derivadas directa o

indirectamente del tracto intestinal de las vacas, animales que afortunadamente no sufren las
infecciones entéricas propias del hombre. Esta contaminación puede provenir del estiércol, polvo,
suelo, alimentos del ganado, agua, insectos (especialmente moscas) o del contacto con residuos
lácteos que quedan en utensilios de ordeño y tanques de transporte o almacenamiento, mal lavados y
saneados; donde esas bacterias pueden desarrollarse con gran facilidad. Por estas razones es
sumamente difícil producir leche cruda libre de coliformes, dándole a su presencia una significación
diferente que en el agua y aunque es indeseable, se tolera. No obstante, altas cuentas bacterianas
de colifirmes son indicativas de condiciones insanas de producción, transporte o almacenamiento y
producen defectos en la leche (sabores desagradables), razones suficientes para evitar su desarrollo,
mediante buenas prácticas de producción.
En la leche pasteurizada, a diferencia de la leche cruda, la presencia de bacterias coliformes es

inaceptable ya que a las temperaturas de pasteurización se destruyen. Por lo tanto, una prueba de
coliformes positiva en productos lácteos pasteurizados denota mala pasteurización y aunque este
hecho generalmente se descubre por la prueba de fosfatasa, la colimetría a veces resulta más
sensible. Además un resultado coliforme positivo puede indicar recontaminación post-pasteurización,
bien sea por los equipos sucios o defectuosos (escapes de leche cruda, escapes de vapor
condensado, etc) por los trabajadores (manos, ropa, etc.) o por envases mal desinfectados.
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Ahora bien, como no hay forma de establecer si los coliformes se originaron en la vaca o de un ser
humano, cuyas heces si pueden ser portadoras de otros microorganismos patógenos, la leche
pasteurizada coliforme-positiva debe rechazarse.
Las ubres de las vacas son más susceptibles a infectarse con patógenos ambientes (como los
coliformes) durante el período de seca y el período peripartal.
Mastitis crónica por E. coli
La Escherichia coli puede causar con alguna frecuencia mastitis crónica (y también subclínica) – a
veces recurrente –en ciertos establos; sobre todo si el clima es caluroso. En muchos casos la
recuperación es espontánea. Si fuese necesario tratamiento, se recomienda cefalosporinas (ceftiofur)
por vía parenteral.
Nódulos, abscesos y tractos fistulosos en la ubre
En muchos casos de mastitis crónicas se palpan y observan nódulos fibrosos y abscesos, así como la
formación de tractos fistulosos que drenan exudados – generalmente purulentos – hacia el exterior;
los que raras veces cicatrizan.
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Completa el siguiente cuadro:
Cepa vista al microscopio Microorganismo
Salmonella
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Nombre No
¿Cuánto crees que viviré? 1
.
Instrucciones Busca en el internet información relativa a la curva de crecimiento bacteriano y

para el Alumno complementa con la que se te presenta.
Manera
Actitudes a Orden y Didáctica
Búsqueda bibliográfica y en internet.
formar responsabilidad de
Lograrlas
• Expresa ideas y conceptos mediante representaciones linguiísticas,

Competencias matemáticas o gráficas.
Genéricas a
• Identifica los sistemas y reglas o principios medulares que subyacen a
Desarrollar
una serie de fenómenos.
Manera Haciendo uso del internet como herramienta didáctica para desarrollar la
Didáctica de competencia para el manejo de la información CMI.
Lograrlas
El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos están determinados por factores nutricionales y

ambientales, y en condiciones de laboratorio óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento
característica de cada especie microbiana.
Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco, experimentará un periodo de
adaptación al medio y condiciones de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial dando
lugar a una curva de tipo sigmodal que se acostumbra dividir en cuatro partes:
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A) Fase de retardo, de adaptación o fase lag
B) Fase de crecimiento exponencial o fase log
C) Fase estacionaria
D) Fase de declinación o muerte.
La forma de cada proporción de la curva y el tiempo de duración de cada fase dependerá de la

especie de microorganismo, la preparación del inoculo, la composición química del medio de cultivo y
las condiciones ambientales de incubación.
Durante la fase de adaptación no hay división celular, la célula está sintetizando nuevos
componentes, durante la fase exponencial los microorganismos que se dividen por fisión binaria lo
hacen a intervalos regulares. Finalmente el crecimiento de la población disminuye y la curva se
vuelve horizontal debido al agotamiento de nutrimentos o la acumulación de productos residuales
tóxicos hasta que la población disminuye.
En general las bacterias crecen con mayor rapidez que los micoorganismos eucarióticos y los
eucarióticos pequeños se desarrollan más rápidamente que los grandes.
El metabolismo energético también influye sobre la velocidad de crecimiento, debido a la ganancia

energética que se obtiene de cada vía catabólica de obtención de energía. Así los microorganismos
fermentadores crecerán más lentamente que los respiradores.
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La siguiente figura muestra la técnica del Recuento de microorganismos viables tras
diluciones seriadas:
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Investiga lo siguiente, en libros o haciendo uso del internet:
1. Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que
ocurren en cada una de las etapas de crecimiento?
2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la

fase lag en la curva de crecimiento? ¿Qué condiciones la incrementarán?
3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación o tiempo de generación?
4. Investiga el tiempo de duplicación para las siguientes bacterias y completa el cuadro:
Bacteria Tiempo de duplicación (en horas)

Escherichia coli
Salmonella tiphy
Staphylococcus aureus
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Nombre Conteo de hongos y levaduras No. 1
Competencia a 1. REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A LA LECHE PROCESADA DE ACUERDO

A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.
Desarrollar

Atributos de la • Realiza la determinación de coliformes fecales
• Realiza la determinación de Salmonella
competencia
• Realiza la determinación de Staphylococcus
Instrucciones
Realiza la práctica siguiendo las instrucciones.
para el Alumno
Instrucciones Realizar el conteo de mohos y levaduras en alimentos. NOM-111-SSA1-1994,

para el Bienes y Servicios. Método para la Cuenta de Mohos y Levaduras en Alimentos,
Docente atendiendo las instrucciones de tu maestro.
Recursos
materiales de Equipo de seguridad personal. Material y equipo de laboratorio. Reactivos.
apoyo
Limpieza Manera
Actitudes a Didáctica Atiende a las instrucciones de la técnica a
Orden
formar de realizar y a las de tu maestro.
Responsabilidad Lograrlas
Competencias • Administra los recursos disponibles teniendo en cuenta las restricciones

Genéricas a para el logro de sus metas.
Desarrollar
Manera Utilizando los reactivos en las cantidades adecuadas con base en la técnica,
Didáctica de empleando los materiales y equipos correctos.
Lograrlas
Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar

formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos
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sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización
en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor,
alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y
levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas
sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos
desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer
la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias
inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia
prima inadecuada
Colonias, agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.
Se entiende por:
Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un

núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La
reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.
Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se

caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se
conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se
alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares
pueden ser de queratina o celulosa. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 °C.
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
Reactivos y materiales
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique
agua debe entenderse como agua destilada.
Medios de cultivo.
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Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.
Preparación del medio de cultivo.
Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C,
acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido
tartárico por 100 mL de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con
potenciómetro. Dejar solidificar una porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido
tartárico.
Soluciones.
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
FORMULA
INGREDIENTES CANTIDADES
Fosfato de potasio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.
Llevar a 1,0 l de agua.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
Solución estéril de ácido tartárico al 10%
FORMULA
Acido tartárico 10,0 g
Agua destilada 100,0 mL
Preparación:
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de
membrana de 0,45 µm.
Materiales.
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de

algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen
total.
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Cajas Petri.
Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.

Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas,
etc.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben
esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a
121 ± 1,0°C.
Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro calibrado.
Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado
con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente
amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.
Procedimiento
Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una
pipeta estéril diferente para cada dilución.
Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño
de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es
vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
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Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de
las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie
lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fría.
Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.
Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días,
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja
muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los
conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de
3 o 4 días en los resultados del análisis.
Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para
distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.
Expresión de resultados
Cálculo del Método
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.
Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA1-
1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados.
Informe de la prueba
Informar:
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa -
dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa-
Recuerda
elaborar el reporte
del análisis realizado
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• Olvidar la indumentaria requerida para el proceso
• No limpiar el área de trabajo
• No comprobar las condiciones del equipo
• No verificar que las llaves de gas y agua estén bien cerradas
• No lavar el instrumental
• No esterilizar el material sucio y contaminado
• No separar el medio de cultivo para su desecho
• No checar el pH del medio
• No apagar los equipos que no estén usándose
• Olvidar verificar la temperatura y tiempo de esterilización
• Olvidar verificar la temperatura de incubación
• Olvidar el tiempo de incubación
• Pesar de manera equivocada los reactivos
• Olvidar rotular
Escribe en la columna de la derecha las posibles soluciones, de acuerdo a la contingencia planteada

en la columna de la izquierda.
Contingencia Posible solución

No hay agua destilada
No hay agua esterilizada
El equipo está sucio
No hay energía eléctrica
Desconoces el equipo a usar
Se descompone algún equipo
El medio está contaminado con agentes extraños
No rotulaste los cultivos
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Nombre Conteo de coliformes totales y fecales No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
Los pasos que debes realizar para durante esta práctica son:
1. Utiliza los implementos de seguridad e higiene:
• bata
• cubre boca
• cubre pelo
• guantes
2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar

3. Verifica la temperatura y/o presión de la autoclave durante el proceso de esterilización.
4. Limpia y desinfecta el área de trabajo.
5. Prepara y esteriliza los siguientes medios de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad
requeridos y el análisis a realizar
CALDO LACTOSADO (medio de enriquecimiento)
CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA (selectivo)
CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (medio de confirmación)
PREPARACIÓN
1. Disuelve los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario, el medio completo
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Ajusta el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6.9 +/- 0.2 a
25°C
3. Distribuye en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm en medio de
concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm en el medio de concentración de
1.5, cada tubo debe tener campana de fermentación.
4. Esteriliza en autoclave por 15 min a 121 +/- 1.0°C
5. Enfría rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es
claro y de color beige.
6. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán
10 mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.
7. Realiza la toma de muestras aplicando la técnica adecuada.
8. Realiza el vertido en placa y/o tubos de cultivo de acuerdo a la técnica descrita.
9. Realiza la inoculación de la muestra aplicando la técnica adecuada.
10. Toma tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración.
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11. Utiliza una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida, o 10
mL de la dilución primaria inicial en el caso de otros productos.
12. Toma tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento, usa una
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida, o 1
mL de la dilución primaria en el caso de otros productos.
13. Mezcla suavemente el inoculo con el medio.
14. Etiqueta y rotula los tubos de ensaye de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos.
15. Realiza la incubación de la muestra a analizar a 35 +/- 0.5 °C por 24 +/- 2 hrs y observar si
hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación por 48 +/- 2 hrs.
16. Verifica la temperatura de incubación.
17. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos.
18. Cuando solo una dilución muestra tres tubos positivos, elige esta y las diluciones mayores
posteriores.
19. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elige
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.
20. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y estos se encuentran en más de tres
diluciones, selecciona las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.
21. En cada caso se obtiene un número de tres cifras, que indica el número de tubos positivos
donde debes buscar el índice de número más probable NMP. La técnica de NMP puede
admitir gran cantidad de variaciones, por ejemplo, para una muestra sólida donde un NMP de
70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95 % de los casos variarán de 10 a 230
coliformes por gramo y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de
confianza son de 3.6 a 130 coliformes por gramo.
22. Compara tus resultados con los estándares permitidos.
23. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado.
Recuerda que esta práctica

la aplicarás en mantequilla, crema,
fermentados, dulces de leche,
quesos de todos tipo y helados.
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Nombre Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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NORMA MEXICANA NMX-F-253-1977.CUENTA DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS
METHOD FOR AEROBIC MESOPHYLIC BACTERIA COUNT
0 INTRODUCCION
Cuando se pretende investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica
más comúnmente utilizada es el recuento en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de
microorganismos y su fundamento consiste en contar las colonias que desarrollan en el medio de
elección después de cierto tiempo y temperatura de incubación presuponiendo que cada colonia
proviene de un microorganismo en la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de
variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La
variedad de especies y tipos diferenciales por sus distintas necesidades nutricionales, temperatura
requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas
constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, la ejecución de la técnica
cuando se siguen fielmente las condiciones que se señalan para su desarrollo puede llegar a
proporcionar resultados lo bastante reproducibles para darle significado a la prueba.
1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN.

Esta Norma establece un método para estimar la cantidad de bacterias mesofílicas aerobias en un
alimento.
2 REFERENCIAS
Para la correcta aplicación de esta norma, se deben consultar las siguientes Normas Mexicanas en
vigor:
• NMX-F-285 Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis y
• NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.
3 MATERIAL Y EQUIPO
a) Horno para esterilizar.
b) Autoclave con termómetro, o manómetro probado con termómetro de máximas.
c) Baño maría con termostato y termómetro.
d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato con vasos esterilizables.
e) Vasos esterilizables para licuadora.
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f) Balanza granataria con sensibilidad de 0.1 g.
g) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±0.5°
h) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,
espátulas.
i) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 y 1 mL graduadas en 0.1 y 0.01 mL respectivamente.
j) Frascos de dilución de vidrio para contener 99 ó 90 mL, ó tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca
para contener 9 mL de solución reguladora diluyente, en ambos casos ± 1% del volumen señalado
después de la esterilización cerrados herméticamente.
4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

a) Solución reguladora diluyente
Solución concentrada
KH2 PO4 34 gramos
Agua destilada 500 mililitros
Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con Hidróxido de Sodio IN.
Llevar a un litro con agua destilada. Esterilizar durante 20 minutos a 121°. Conservar en refrigeración.
Tomar 1.25 mL de solución concentrada y llevar a un litro con agua destilada, ésta es la solución de
trabajo. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° durante 20
minutos. El pH final debe ser 7.2.
b) Agar – Triptona - Extracto de Levadura (agar cuenta estándar)

Extracto de levadura 2.5 gramos
Triptona 5 gramos
Dextrosa (d - glucosa) 1 gramos
Agar 15 gramos
Agua destilada 1,000 mililitros
NMX-F-253-1977
Suspender 24 gramos del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.
Distribuir en volúmenes de 100 y 200 mL. Esterilizar a 1.1 kg/cm2 (121°) durante 15 minutos. El pH
final del medio debe ser 7.0 ± 0.1.
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado para algunos alimentos en particular y
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese
alimento.
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5 PROCEDIMIENTO
5.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que su inoculación, la adición de los
medios de cultivo y su rotación se pueda realizar cómoda y libremente.
Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación.
5.2 Para la preparación y dilución de la muestra seguir las indicaciones señaladas en la Norma
Mexicana NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.
5.3 Practicar las diluciones decimales que se estimen convenientes.
5.4 Transferir 1 mL ó 0.1 mL de la muestra y de cada una de las diluciones a cajas Petri estériles
evitando todo tipo de contaminación durante la maniobra y aplicando la punta de la pipeta al fondo de
la caja mientras escurre el líquido.
5.5 Agregar 12 a 15 mL. del medio de cultivo fundido y mantenido a una temperatura de 45° - 48° en
un baño de agua. Mezclarlo con la muestra (6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de
las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a delante) sobre una superficie lisa y
horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculó en el medio, cuidar que el medio no
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
5.6 El tiempo transcurrido desde el momento que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
5.7 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y a la temperatura
que se requiera, según el tipo de alimento de que se trate.
5.8 Seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 30 a 300 colonias, pues es en ellas donde
será menor el error en el recuento.
5.9 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de hongos),
incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no
se pueden distinguir las colonias de pequeñas partículas de alimento.
6 INTERPRETACION DE RESULTADOS
6.1 Con el auxilio de la lente de aumento y de la cuadrícula del contador, contar todas las colonias de
las placas seleccionadas. Si el número se estima mayor de 300, y no se dispone de placas
preparadas con las diluciones subsecuentes, contar en la mitad o en un cuarto representativo de ella,
multiplicando por 2 o por 4 el número obtenido. El fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro
contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.
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6.2 Multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de colonias por mililitro o gramo de
la muestra.
6.3 Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, utilizar la placa cuyo recuento se aproxime
más a esta cifra. Si la placa correspondiente a la primera dilución es la única que presenta colonias y
éstas son menos de 10, informar el número de colonias seguidas de la frase "en la dilución 1:10".
6.4 Debe apreciarse una razonable proporcionalidad en el número de colonias que aparezcan en las
placas de acuerdo con las diluciones utilizadas. En tanto no exista esta relación el personal del
laboratorio debe adquirir la destreza necesaria hasta conseguirlo antes de efectuar estudios que sean
válidos.
Al iniciarse en el trabajo de laboratorio es recomendable inocular las cajas correspondientes de cada

dilución por duplicado y computar las medias aritméticas.
6.5 Si todas las placas:1) no muestran colonias, 2) muestran excesiva difusión de las mismas, 3)
están contaminadas o no son satisfactorias por cualquier motivo, anotar respectivamente: 1) sin
colonias, 2) colonias difusas, 3) incluyendo por accidente de laboratorio.
6.6 Redondear la cifra obtenida en el recuento de manera que sólo aparezcan 2 dígitos significativos
al inicio de esa cifra: 128 se informa como 130; 2,417 como 2,400; 49 como 49, etc.
6.7 Informar: Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias en placas de Agar Triptona
Extracto de levadura incubadas X * horas a X*
* anotar las que correspondan a cada caso particular.
Recuerda elaborar el reporte

de la práctica.
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Nombre Determinación de Salmonella No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
4. Limpia y desinfecta el área de trabajo
5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad requeridos y el
análisis a realizar. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir
las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.
Medios de preenriquecimiento
Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenito-cistina,
Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solución A, Solución B, Solución C, Caldo de soya
tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de
potasio
Medios de aislamiento
Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para
Salmonella y Shigella (SS), Agar entérico Hektoen.
Medios para pruebas bioquímicas

Agar de tres azúcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para
Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer),
Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rápido, Caldo infusión cerebro corazón
Soluciones
Solución verde brillante al 0,1% (1:1000), Solución de yodo-yoduro, Solución salina al 0,85%,
Solución salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solución de alfa-naftol al 5%, Solución de rojo de
metilo, Solución de hidróxido de potasio al 40%, Solución de gelatinasa al 5%
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Antisueros
Antisuero polivalente somático (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi
7. Prepara la muestra a analizar.
Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella

Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de
1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.
Se recomienda una muestra de 25 g o más.
Procedimiento general para la preparación de muestras

• Pesa asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher).
• Adiciona 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a
menos que se indique otro) y licúalo si es necesario durante un minuto.
• Transfiere asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con
tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.
Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potenciómetro. Ajusta, si es necesario, a
un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezcla y cubre el
recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 ± 2 h a 35ºC.
Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto Leche en polvo,

entera, semidescremada o descremada
• Sigue el procedimiento general para el pesado de la muestra y adiciónala lentamente a un
matraz Erlenmeyer con 225 mL de solución verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo
quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60
minutos e incúbala durante 24 horas +/-2 horas a 35°C
8. Realiza la siembra de la muestra aplicando la técnica adecuada
Aislamiento de Salmonella
• Cierra firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y
agita suavemente, transfiere respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10
mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en
sustitución del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport.
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• Incuba de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo
periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios
selectivos.
• Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estríalo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),
agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos
adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo
procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 ± 2 h a 35ºC.
• Examina las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo
con las siguientes características:
a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En
algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
c) Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos
las colonias pueden aparecer completamente negras.
d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras;
con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose
posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.
Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
e) Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las
colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
Identificación bioquímica
• Selecciona al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien
aisladas.
• Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azúcar
hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por
punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.
• Almacena en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario
retomar más colonias.
• Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las
colonias que den las siguientes reacciones:
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f) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa;
en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra
a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.
g) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo
en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en
este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
• Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en
los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuación:
• Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA
típicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio
LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o
sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos
medios.
• Continúa el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta
reacciones atípicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se
obtuvo el cultivo atípico anterior y siembra las pruebas bioquímicas nuevamente.
• Continúa la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI.
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias
procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
Prueba de ureasa
Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente
positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para
comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar
24 ± 2 h a 35ºC.
Prueba de ureasa (rápida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de
cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rápida). Incuba 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de
agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Deberás retener los cultivos que den la
prueba negativa (sin cambio de color del medio).
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Identificación serológica
Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
• Coloca con asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos
secciones de una placa para aglutinación. Suspende en cada una de las gotas, una porción
del cultivo desarrollado en TSI.
• Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mézclalas con el
canto del asa o empleando aplicadores de madera.
• Agita inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un minuto.
• Observa bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.
• Considera cualquier grado de aglutinación como positiva.
• La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el
antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.
• Si observas aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con
las pruebas bioquímicas complementarias.
• Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los
más frecuentes).
• Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay
aglutinación con Vi calienta el cultivo a ebullición y repite la aglutinación con el antisuero
polivalente O.
• Si se requiere, practica el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero
polivalente H).
Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a
35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya
tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adiciona 2,5 mL de solución
salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
• Coloca 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Prepara un control de
solución salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno
formalizado. Incuba las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observa a intervalos de 15 min
por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla
de prueba pero no en el control.
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Debes interpretar como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre
aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
Pruebas bioquímicas complementarias

• Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no
concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:
• Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de
la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
Agar citrato Simmons

• Inocula por estría el tubo.
• Incuba durante 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
• Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
• Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
Medio SIM
• Inocula por punción.
• Incuba durante 24 h a 35 ± 2ºC.
Movilidad.
• Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.
• Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.
• Producción de ácido sulfhídrico.
• Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a
todo el medio.
• Prueba negativa: ausencia de color negro.
• Producción de Indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3
mL de reactivo de Kovac.
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Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
Caldo RM-VP
• Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h
para la prueba RM.
• Prueba de Voges-Proskauer (VP)
• Transfiere a un tubo un mL del cultivo de 48 h.
• Adiciona 0,6 mL de solución de alfa naftol.
• Adiciona 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%.
• Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional).
• Interpreta los resultados después de incubar durante 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura
ambiente.
• Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
• Prueba negativa: sin cambio de color.
• Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.
Prueba de rojo de metilo (RM)

• Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de
metilo. Interpreta los resultados inmediatamente.
• Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
• Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
Caldo malonato
• Inocula un tubo conteniendo el medio. Incuba durante 40 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
• Prueba positiva: desarrollo de color azul.
Caldo manitol
• Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.
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•
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las
pruebas bioquímicas convencionales.
9. Etiqueta y rotula los tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos
10. Verifica la temperatura de incubación
11. Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos
Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ ml de muestra.

12. Compara tus resultados con los estándares permitidos
13. Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado
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Nombre Determinación de Staphylococcus aureus No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
análisis a realizar.
6. Prepara la cantidad de los diferentes medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del fabricante
(Baird-Parker, solución de telurito, Emulsión de yema de huevo, Solución salina isotónica, caldo de
infusión cerebrocorazón, ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de ternera, cloruro de calcio
anhidro, solución de azul de toluidina, solución amortiguadora Tris pH 9, plasma de conejo).
8. Realiza el procedimiento aplicando la técnica adecuada
• Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la superficie
de las placas de agar Baird-Parker.
• Distribuye el inoculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en ángulo recto,
utilizando una para cada dilución.
• Debes mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.
• Voltea las placas y colócalas en incubación durante 45 a 48 h a 35ºC.
• Selecciona las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus aureus; si
no es posible, selecciona las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de
150 colonias.
• Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas y al
informe debes agregar la nota de "valor estimado".
• Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2
mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
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Página de
•
• Selecciona las colonias de acuerdo con el cuadro del anexo 15 para realizar las pruebas de
coagulasa y termonucleasa:
• Seleccionar el número de colonias y siembralas cada una en tubos con 0.5 mL de caldo de
infusión cerebro-corazón.
• Incúbalas a 35ºC durante 24 h.
• Inocula en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus
epidermidis como testigos positivo y negativo.
• Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0.3 mL de cada cultivo a
otro tubo de 10 mm x 75 mm y consérvalo para la prueba de termonucleasa. El resto del
cultivo usalo para la prueba de coagulasa.
Prueba de coagulasa
• Agrega a los 0.2 mL del cultivo anterior, 0.2 mL de plasma de conejo diluido volumen a
volumen con solución salina estéril.
• Incubalo en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay
formación de coágulo, observa a las 24 h. Considera positiva la prueba si hay formación de
coágulo.
• Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo añade una gota de cloruro de calcio al
5% a 0.5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 seg.
Prueba de termonucleasa
• Calienta durante 15 minutos 0.3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebrocorazón en baño de
agua hirviendo.
• Pasa una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio, incluye
testigo.
• Incuba a 35ºC en cámara húmeda durante 4 a 24 h. La aparición de un halo color rosa
extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva.
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9. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y
dilución con los datos correctos.
10. Realiza la incubación de la muestra a analizar.

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Nombre Determinación de Listerya monocitogenes No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar.
Reactivos
Acido acético 5 N, Acido clorhídrico 1 M, Acido sulfanílico (cristales), Alfanaftilamina,
Alfa-naftol 5% en etanol absoluto, Etanol absoluto, Granalla de zinc, Hidróxido de sodio 1 M,
Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina), Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2,
Sangre de carnero fisiológica 0,85% estéril, Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp,
Sulfato de cadmio al 20%, Zinc pulverizado, Reactivos para Tinción de Gram, Alcohol-acetona, Cristal
violeta, Oxalato de amonio, Solución de Yodo, Solución de Safranina.
Reactivos para la determinación de nitritos

Reactivo A: Alfa-naftilamina 0,5 g, Acido acético 5N 100,0 mL
Reactivo B: Acido sulfanílico 1,0 g, Acido acético 5N 125,0 mL
Reactivo C: Alfa-naftol 1,0 g, Acido acético 5N 200,0 mL
Solución de sulfato de cadmio al 20%
Medios de cultivo
Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)
Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3
Agregar en condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo
antes de su uso.
Para la preparación de un litro del medio CSTEL se deben agregar las siguientes soluciones:
acriflavina, ácido nalidíxico y solución de cicloheximida.
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Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben
emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos inmediatamente después de usarla!
Medio de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)
Medio Oxford
Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)
Agar sangre de carnero
Caldo nitratos
Medios para la prueba de movilidad: Medio de SIM, Medio MTM.
Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos

9. Realiza el vertido en placa de cultivo de acuerdo a la técnica descrita
10. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos
correctos.
Recuerda incluir en el reporte

de la práctica los estándares permitidos
para comparar tus resultados
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Página de
• Olvidar rotular


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Realiza análisis microbiológicos a 2

derivados de la leche, de acuerdo a las
normas vigentes en la materia
Importancia de diluir
Cómo diluir
Aislamiento en placa y transferencia de cultivos
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Conteo de hongos y levaduras
Conteo de coliformes totales y fecales
Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias
Determinación de Salmonella
Determinación de Staphylococcus aureus
Determinación de Listeria monocytogenes
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Los microorganismos, o microbios como se conocen comúnmente, son de interés sobresaliente en la

industria de la transformación de alimentos, ya que son causantes de enfermedades en los humanos,
al contaminar los alimentos y descomponerlos. En éste submódulo obtendrás conocimientos sobre
los patógenos que pueden contaminar la leche y los productos lácteos; aprenderás también sobre las
diferentes técnicas para la identificación de tales patógenos; vas a adquirir conocimientos de
toxicología, análisis de alimentos, microbiología de alimentos y procesos de calidad. Para que logres
los conocimientos que te acabo de mencionar, voy a guiarte a través de actividades prácticas que
incluyen desde tomar muestras, hasta realizar los análisis respectivos, todo para que logres
interpretar tus resultados y puedas realizar el reporte correspondiente. Se dice fácil, ¡pues sí, lo es!
Ya que para eso estoy contigo, para facilitar tu aprendizaje de manera amena y divertida.
Para que tu aprendizaje sea completo, será importante que sigas las indicaciones con orden, limpieza
y responsabilidad. Todo lo que aprendas te permitirá desarrollar los atributos de cada una de las
competencias profesionales planteadas, necesarias para que puedas laborar en el campo del control
de calidad microbiológica de la leche y los productos lácteos.
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ATRIBUTOS DE
LA • Realiza la determinación de Salmonella
COMPETENCIA • Realiza la determinación de Staphylococcus
Efectua análisis microbiológicos a leche y derivados lácteos,
RESULTADO DE de acuerdo a las normas vigentes en la materia y a los
APRENDIZAJE requerimientos del sector productivo lechero, siguiendo
instrucciones y procedimientos de manera reflexiva.
El facilitador realiza la presentación de la competencia a desarrollar la cual abarca la siguiente

información:
9 Aplicación de una evaluación diagnóstica
9 Resultado de aprendizaje.
9 Atributos profesionales que componen a la competencia.
9 Evidencias de desempeño y evidencias de producto a evaluar.
9 Prácticas programadas y Prácticas integradoras.
9 Normas oficiales vigentes a seguir.
9 Criterios e instrumentos de evaluación.
9 Sobre las actitudes y valores que el estudiante debe de mostrar.
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Nombre Importancia de diluir No. 6
Instrucciones Lee con atención tu guía y con la exposición de tu facilitador te darás cuenta de
para el Alumno la importancia de realizar diluciones para el análisis microbiano.
Saber la importancia
de la realización de Manera
diluciones para Pon atención a la explicación de tu facilitador
Saberes a Didáctica
investigar el y con ayuda de tu guía sabrás la importancia
adquirir de
contenido de las diluciones en los análisis microbianos.
Lograrlos
microbiano de una
muestra.
GENERALIDADES
Los microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se
encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algún
modo su sobrevivencia o desarrollo.
Los alimentos por su producción primaria, generalmente tienen una importante microbiota “normal”,
según la región y condiciones en que se producen; además, su composición tiende a conservar dicha
flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los
microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo
microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos.
Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su

manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los
microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera
sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la
aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).
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Dado el tamaño de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van
desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa
requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras
decimales para facilitar los cálculos. Lo más adecuado es preparar una dilución primaria y, a partir
de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos
diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, según la carga microbiana
esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el número de diluciones
necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e incluso a partir de los
datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra. El buen
resultado del método requiere que las fuentes de variación sean eliminadas en lo posible, por lo que
es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
FUNDAMENTO
Posteriormente a la toma de muestra y como parte del análisis, se hace una dilución primaria cuya
finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto
cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y así lograr una distribución lo más
uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al análisis. Con este
fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperación de los microorganismos presentes, para
ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el
pH favorables para iniciar la recuperación y actividad de las células microbianas presentes, así como
para favorecer aquellas que se buscan entre una población mixta.
Se pretende encontrar el número de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que
después de la incubación se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra después de realizar
tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado
puede ser la cuenta de colonias en placas o la observación de resultados proporcionales al tamaño
de la población, en el caso de tubos o matraces.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la
observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de
placas.
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NOTAS
• La técnica de dilución es la primera etapa en el análisis de la mayoría de las prácticas en las que se
determina cuantitativamente algún microorganismo o grupo microbiano; por lo tanto, continúa con la
determinación específica.
• Cuando se trabaja con alimentos líquidos, fácilmente homogenizables, que pueden distribuirse con
pipetas de 1 mL, y con bajo contenido microbiano, puede omitirse la preparación de diluciones, pero
este caso es una excepción, no la regla.
• Los diluyentes más utilizados son la solución amortiguadora de fosfatos, el agua peptonada y la
solución salina isotónica, pero pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones de
dispersar y homogenizar la carga microbiana y de facilitar la recuperación de los microorganismos en
estudio, mediante condiciones de osmolaridad, pH, etc., adecuadas para ellos; por ejemplo, para la
determinación de Vibrio cholerae, que es alcalófilo, se utiliza agua peptonada a pH 8.5.
• El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se inoculan las diluciones en los medios de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
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Nombre Cómo diluir No. 2
Consulta en las fuentes de información de tu escuela sobre la importancia que
Instrucciones
tiene diluir las muestras durante la realización de análisis microbiológicos a leche
para el Alumno procesada.
9 Orden Manera Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-
Didáctica 1994, Bienes y servicios. Preparación y
Actitudes a 9 Limpieza
formar de dilución de muestras de alimentos para su
9 Responsabilidad Lograrlas análisis microbiológico.
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de métodos

establecidos.
Competencias A) Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como

Genéricas a cada uno de sus pasos contribuye al alcance de un objetivo.
Desarrollar
E) Sintetiza evidencias obtenidas mediante la experimentación para producir
conclusiones y formular nuevas preguntas.
Manera
Siguiendo procedimientos de manera reflexiva, que a través de la
Didáctica de
experimentación obtiene evidencias
Lograrlas
Preparación de reactivos.
Solución de hidróxido de sodio 1,0 N: Disuelve 4.0 g de hidróxido de sodio y afóralo a 100 mL con
agua destilada.
Soluciones diluyentes.
Solución reguladora de fosfatos concentrada: Diluye 34.0 g de fosfato de sodio monobásico en 1.0
litro de agua destilada.
Preparación: Disuelve el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de
sodio 1,0 N y aforar a un litro con agua. Esterilízalo durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C.
Consérvalo en refrigeración, recuerda que es una solución concentrada.
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Toma 1,25 mL de la solución concentrada y llévala a un litro con agua. Esta es tu solución de trabajo.
Distribúyela en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilízala a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos.
Preparación de agua peptonada

Disuelve en 500 mL de agua destilada los siguientes ingredientes: peptona 1.0 g y cloruro de sodio 8
.5 g. Después de mezclarlos afora la solución a un litro también con agua destilada y Ajusta el pH a 7
± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuye en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera
y esterilízalas a 121 ± 1.0°C durante 15 minutos. Si este diluyente no lo usas inmediatamente,
almacénalo en lugar oscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en
condiciones tales que no se alteren su volumen o composición.
Necesitarás pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con

tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su
volumen total. También serán requeridos frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca, tubos de 16
x 150 mm con tapón de rosca, utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos,
pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc. Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las
muestras a analizar deberán esterilizarse mediante autoclave, durante 15 minutos como mínimo a
121 ± 1.0°C.
Preparación de la dilución primaria a partir de muestras líquidas:

Esta técnica la puedes utilizar para muestras de leche en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación,
etcétera); también para muestras congeladas de un alimento a base de leche originalmente líquido o
licuable, fundir por completo en baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y
homogeneizar agitando vigorosamente.
Agita la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados

en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe
encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
Siempre que la cantidad de muestra lo permita, toma alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de
10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente.
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Preparación de la dilución primaria a partir de muestras sólidas:
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8ºC
durante 18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. Pesa una cantidad de 10 u
11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de tamaño adecuado.
Adiciónale un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la
muestra.
Licua durante 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea. Permite que las
partículas grandes se sedimenten, y transfiere la cantidad deseada tomando de las capas superiores
de la suspensión. Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, puedes adicionar más
diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de
resultados.
Prepara las diluciones decimales adicionales de la siguiente manera:

Transfiere 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Mezcla cuidadosamente cada botella de diluyente
siempre de la misma manera que se describe en el punto 2. Las diluciones que trabajarás serán de la
1 a la 6.
Utiliza pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total,
escurre aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido. Mientras
se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debes apoyarla en el interior del cuello del frasco y
mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de

microorganismos esperado es:
Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta. Para la técnica de cuenta en placa, considerar
aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias en un mínimo de una de tres diluciones en
el método de cuenta de bacterias aerobias en placa.
En el caso de otros grupos microbianos, considera el número especificado de colonias en la Norma
Oficial Mexicana correspondiente. En general, las diluciones de la muestra debes prepararlas
inmediatamente antes del análisis y usarlas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos
posteriores a su preparación.
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Nombre No
Aislamiento en placa y transferencia de cultivos. 1
.
Lee detenidamente los consejos que te ayudarán para que realices las técnicas
Instrucciones de siembra, separación y aislamiento, y que con ayuda de tu facilitador te guiará
para el Alumno paso a paso.
Manera
Actitudes a Orden y Didáctica
Búsqueda bibliográfica y en internet.
formar responsabilidad de
Lograrlas
Competencias • Ordena información de acuerdo a categorías, jerarquías y relaciones.

Genéricas a
• Estructura ideas y argumentos de manera clara, coherente y sintética.
Desarrollar
Manera Tener el conocimiento completo de la técnica aséptica para efectuar el cultivo

Didáctica de de microorganismos.
Lograrlas
El empleo de microorganismos en biotecnología se fundamenta en la obtención de cultivos puros, que

están constituidos por una única especie microbiana; y en el mantenimiento de esa pureza en las
manipulaciones subsiguientes. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleva el uso de
cultivos puros.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución. El
método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se extiende o se
raya sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales quedan
separadas una de otra. Cada célula aislada crece para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o
clon) puro, puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una única célula
original.
Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo.
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1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en
placa inicial debería dar lugar al repetir la operación colonias todas del mismo tipo, y cuya
morfología concuerda con la de aislamiento inicial.
2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia debería mostrar un

único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción, como por ejemplo la tinción Gram, son
útiles para establecer que la colonia no contiene una mezcla de tipos microbianos diferentes.
Existen varios métodos para obtener un buen aislamiento en placa y cada método requiere un poco
de práctica. Es importante recordar que cuantas más células se cogen con el asa de siembra, mas
habrá de rayas (diluir) sobre la placa para obtener células aisladas. No es necesario comenzar con
una gran cantidad de inoculo en el asa de siembra. Para esta práctica, emplearemos dos protocolos
distintitos de aislamiento en placa.
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la
esterilidad de los medios y soluciones (ver el Anexo 2, Manipulación Segura de los Microorganismos).
Trabajando asépticamente, se toman prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la
contaminación de los cultivos o de las soluciones con microorganismos no deseados. La mayoría de
las placas de Petri y las botellas de cultivo de tejidos que se emplean para crecer cultivos puros de
microorganismos están fabricadas en plástico y ya vienen esterilizadas de fábrica; pero se necesita
emplear una técnica aséptica para llenar estos recipientes con un medio estéril. Una adecuada
asepsia en la técnica de transferencia protege a quien está manipulando, de la contaminación con el
cultivo, que siempre debería tratarse como un patógeno potencial. La técnica aséptica significa evitar
cualquier contacto entre el cultivo puro, el medio estéril, y las superficies estériles del recipiente de
cultivo, con microorganismos contaminantes. Para conseguir este objetivo, (1) el área de trabajo se
limpia previamente con un agente antiséptico para reducir el número de contaminantes potenciales;
(2) los instrumentos con los que se realiza la transferencia están esterilizados; por ejemplo, el asa de
siembra se esteriliza con calor en el mechero Bunsen antes y después de cada inoculación; y (3) el
trabajo se realiza rápida y eficientemente para minimizar el tiempo de exposición durante el que
podría ocurrir la contaminación del cultivo o del trabajador.
Los pasos típicos en la transferencia de un cultivo de un recipiente a otro son los siguientes: (1)
flamear el asa de siembra; (2) abrir y flamear las bocas de los tubos de cultivo; (3) recoger un poco de
cultivo crecido y transferirlo al medio fresco; (4) flamear las bocas de los recipientes de cultivo antes
de cerrarlos; y (5) volver a flamear el asa de siembra. Esencialmente se emplea la misma técnica
para inocular placas de Petri (salvo quela placa no se flamea), y también para transferir
microorganismos desde un cultivo a un porta de observación microscópica.
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Es un prerrequisito esencial el conseguir una comprensión y un conocimiento completo de la técnica
aséptica antes de ponernos a trabajar con cultivos de microorganismos. Te ahorraras una gran
cantidad de tiempo y energía, y evitaras resultados erróneos si observas unas pocas reglas sencillas
y de sentido común cuando trabajas con microorganismos:
1. Esteriliza siempre el asa de siembra por calor antes de meterla en cualquier cultivo.
2. Flamea siempre la boca del tubo de cultivo antes de meter el asa de siembra estéril. Esto
destruye cualquier célula contaminante que pueda haberse depositado inadvertidamente
cerca de la abertura del tubo durante inóculo anterior o por cualquier otro motivo.
3. Mantén todos los cultivos con sus tapas y tapones respectivos mientras no los empleas. No
depositas los tapones o las tapas de las placas de Petri sobre la mesa, ya que expones los
cultivos a una potencial contaminación. Cuando transfieres colonias desde placas de Petri,
utiliza la tapa como un escudo abriéndola solo lo suficiente para meter el asa de siembra de
manera que el medio continúe estando protegido de los contaminantes que pudieran caer
sobre la placa.
4. No permitas que los tapones de los recipientes ni las tapas de las placas de Petri toquen otra
cosa que sus recipientes de cultivo respectivos. Ello impedirá la contaminación de los cierres y
por tanto de los cultivos.
5. Utiliza los procedimientos adecuados de manipulación en la apertura y en el cierre de los
recipientes.
Con la guía de tu maestro, pon en práctica las técnicas siguientes:
1 2
4 3
Aislamiento por rayado por cuadrantes Aislamiento por rayado continúo
Fig. 1. Tipos de aislamiento en placa.
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Fig. 2. Manejo de muestras y toma del inóculo
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Fig.32. Aislamiento por agotamiento por estrías en 3 fases
Fig. 4. Prepación de un frotis bacteriano.
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Fig. 5. Tinción simple.
Preguntas
1. ¿Cómo puedes asegurar que tienes un cultivo puro de cada microorganismo en cada placa?
2. ¿Cómo emplearías la temperatura para favorecer o inhibir el crecimiento de bacterias o

levaduras?
3. ¿Por qué es una ventaja mantener el tubo de cultivo inclinado cuando se inserta el asa de
siembra?
4. ¿Para qué se flamea la boca del tubo?
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Nombre Conteo de hongos y levaduras No. 1
2.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A DERIVADOS DE LA LECHE, DE

Competencia a ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.
Desarrollar

Atributos de la • Realiza la determinación de Salmonella
competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
Los mohos y levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza y se pueden encontrar
formando parte de la flora normal de un alimento, o como agentes contaminantes y en los equipos
sanitizados inadecuadamente, provocando el deterioro fisicoquímico de éstos, debido a la utilización
en su metabolismo de los carbohidratos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos originando mal olor,
alterando el sabor y el color en la superficie de los productos contaminados. Además los mohos y
levaduras pueden sintetizar metabolitos tóxicos termoresistentes, capaces de soportar algunas
sustancias químicas, así como la irradiación y presentan capacidad para alterar sustratos
desfavorables, permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer
la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de prácticas sanitarias
inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos, así como el uso de materia
prima inadecuada
Colonias, agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.
Se entiende por:
Levaduras, son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un
núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La
reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.
Mohos, grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se
caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura filamentosa con ramificaciones, que se
conocen con el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se
alimentan por absorción pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares
pueden ser de queratina, celulosa o manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25
°C.
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
Reactivos y materiales
Reactivos
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique
agua debe entenderse como agua destilada.
Medios de cultivo.
Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.
Preparación del medio de cultivo.
Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C,
acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido
tartárico por 100 mL de medio).
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Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una
porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido
tartárico.
Soluciones.
Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)
FORMULA
Fosfato de potasio monobásico 34,0 g
Agua 1,0 l
Preparación:
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.
Llevar a 1,0 l de agua.
Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 l con agua (solución de trabajo).
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.
Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 minutos.
Solución estéril de ácido tartárico al 10%
FORMULA
Acido tartárico 10,0 g
Agua destilada 100,0 mL
Preparación:
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de
membrana de 0,45 µm.
Materiales.
Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón de
algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen
total.
Cajas Petri.
Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.
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Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas,
etc.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben
esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175°C o por 1h a 180°C o autoclave, durante 15 minutos como mínimo a
121 ± 1,0°C.
Aparatos e instrumentos
Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.
Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0°C provista con termómetro calibrado.
Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0°C.
Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado
con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0°C.
Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente
amplificador.
Registrador mecánico o electrónico.
Microscopio óptico.
Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C.
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM-110-SSA1-1994.
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.
Procedimiento
Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria,
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.
Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando una
pipeta estéril diferente para cada dilución.
Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un baño
de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es
vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de
las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie
lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fría.
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Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.
Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1°C.
Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días,
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja
muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los
conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de
3 o 4 días en los resultados del análisis.
Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente para
distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias.
Expresión de resultados
Cálculo del Método
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe.
Multiplicar por el inverso de la dilución, tomando en consideración los criterios de la NOM-092-SSA1-
1994. Método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresión de resultados.
Informe de la prueba
Informar:
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa -
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa-
Te sugiero leer el anexo 3

previo a la elaboración del reporte
de la práctica.
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Nombre Conteo de coliformes totales y fecales No. 1
Competencia a 2.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A DERIVADOS DE LA LECHE, DE

Desarrollar ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• bata
• cubre boca
• cubre pelo
• guantes

5. Prepara y esteriliza los siguientes medios de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad
requeridos y el análisis a realizar
CALDO LACTOSADO (medio de enriquecimiento)
CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA (selectivo)
CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE (medio de confirmación)
PREPARACIÓN
• Disuelve los ingredientes en 1 litro de agua, calentando si es necesario, el medio completo
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.
• Ajusta el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6.9 +/- 0.2 a
25°C
• Distribuye en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm en medio de
concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm en el medio de concentración de
1.5, cada tubo debe tener campana de fermentación.
• Esteriliza en autoclave por 15 min a 121 +/- 1.0°C
• Enfría rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es
claro y de color beige.
• Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán
10 mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.
• Realiza la toma de muestras aplicando la técnica adecuada.
• Realiza el vertido en placa y/o tubos de cultivo de acuerdo a la técnica descrita.
• Realiza la inoculación de la muestra aplicando la técnica adecuada.
• Toma tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración.
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• Utiliza una pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida, o 10
mL de la dilución primaria inicial en el caso de otros productos.
• Toma tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento, usa una
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida, o 1
mL de la dilución primaria en el caso de otros productos.
• Mezcla suavemente el inoculo con el medio.
• Etiqueta y rotula los tubos de ensaye de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos.
• Realiza la incubación de la muestra a analizar a 35 +/- 0.5 °C por 24 +/- 2 hrs y observar si
hay formación de gas, en caso contrario prolongar la incubación por 48 +/- 2 hrs.
• Verifica la temperatura de incubación.
• Realiza la lectura y registro de los resultados obtenidos.
• Cuando solo una dilución muestra tres tubos positivos, elige esta y las diluciones mayores
posteriores.
• Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elige
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.
• Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y estos se encuentran en más de tres
diluciones, selecciona las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.
• En cada caso se obtiene un número de tres cifras, que indica el número de tubos positivos
donde debes buscar el índice de número más probable NMP. La técnica de NMP puede
admitir gran cantidad de variaciones, por ejemplo, para una muestra sólida donde un NMP de
70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95 % de los casos variarán de 10 a 230
coliformes por gramo y en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de
confianza son de 3.6 a 130 coliformes por gramo.
• Compara tus resultados con los estándares permitidos.
• Realiza el lavado y esterilizado del material utilizado.
Recuerda que esta práctica

la aplicarás en mantequilla, crema,
fermentados, dulces de leche,
quesos de todos tipo y helados.
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• Olvidar rotular


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Nombre Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias No. 1

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competencia
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NORMA MEXICANA NMX-F-253-1977.CUENTA DE BACTERIAS MESOFILICAS AEROBIAS
METHOD FOR AEROBIC MESOPHYLIC BACTERIA COUNT
0 INTRODUCCION
Cuando se pretende investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica
más comúnmente utilizada es el recuento en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de
microorganismos y su fundamento consiste en contar las colonias que desarrollan en el medio de
elección después de cierto tiempo y temperatura de incubación presuponiendo que cada colonia
proviene de un microorganismo en la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de
variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En realidad esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La
variedad de especies y tipos diferenciales por sus distintas necesidades nutricionales, temperatura
requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etc., hacen que el número de colonias contadas
constituyan una estimación de la cifra realmente presente. No obstante, la ejecución de la técnica
cuando se siguen fielmente las condiciones que se señalan para su desarrollo puede llegar a
proporcionar resultados lo bastante reproducibles para darle significado a la prueba.
1 OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN.

Esta Norma establece un método para estimar la cantidad de bacterias mesofílicas aerobias en un
alimento.
2 REFERENCIAS
Para la correcta aplicación de esta norma, se deben consultar las siguientes Normas Mexicanas en
vigor:
• NMX-F-285 Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis y
• NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.
3 MATERIAL Y EQUIPO
a) Horno para esterilizar.
b) Autoclave con termómetro, o manómetro probado con termómetro de máximas.
c) Baño maría con termostato y termómetro.
d) Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato con vasos esterilizables.
e) Vasos esterilizables para licuadora.
f) Balanza granataria con sensibilidad de 0.1 g.
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g) Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±0.5°
h) Utensilios estériles para la preparación de las muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,
espátulas.
i) Pipetas bacteriológicas estériles de 10 y 1 mL graduadas en 0.1 y 0.01 mL respectivamente.
j) Frascos de dilución de vidrio para contener 99 ó 90 mL, ó tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca
para contener 9 mL de solución reguladora diluyente, en ambos casos ± 1% del volumen señalado
después de la esterilización cerrados herméticamente.
4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

a) Solución reguladora diluyente
Solución concentrada
KH2 PO4 34 gramos
Agua destilada 500 mililitros
Disolver el fosfato en agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con Hidróxido de Sodio IN.
Llevar a un litro con agua destilada. Esterilizar durante 20 minutos a 121°. Conservar en refrigeración.
Tomar 1.25 mL de solución concentrada y llevar a un litro con agua destilada, ésta es la solución de
trabajo. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° durante 20
minutos. El pH final debe ser 7.2.
b) Agar – Triptona - Extracto de Levadura (agar cuenta estándar)

Extracto de levadura 2.5 gramos
Triptona 5 gramos
Dextrosa (d - glucosa) 1 gramos
Agar 15 gramos
Agua destilada 1,000 mililitros
NMX-F-253-1977
Suspender 24 gramos del medio deshidratado en un litro de agua. Hervir hasta total disolución.
Distribuir en volúmenes de 100 y 200 mL. Esterilizar a 1.1 kg/cm2 (121°) durante 15 minutos. El pH
final del medio debe ser 7.0 ± 0.1.
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado para algunos alimentos en particular y
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese
alimento.
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5 PROCEDIMIENTO
5.1 Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que su inoculación, la adición de los
medios de cultivo y su rotación se pueda realizar cómoda y libremente.
Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación.
5.2 Para la preparación y dilución de la muestra seguir las indicaciones señaladas en la Norma
Mexicana NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológicos.
5.3 Practicar las diluciones decimales que se estimen convenientes.
5.4 Transferir 1 mL ó 0.1 mL de la muestra y de cada una de las diluciones a cajas Petri estériles
evitando todo tipo de contaminación durante la maniobra y aplicando la punta de la pipeta al fondo de
la caja mientras escurre el líquido.
5.5 Agregar 12 a 15 mL. del medio de cultivo fundido y mantenido a una temperatura de 45° - 48° en
un baño de agua. Mezclarlo con la muestra (6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de
las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a delante) sobre una superficie lisa y
horizontal hasta lograr una completa incorporación del inoculó en el medio, cuidar que el medio no
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
5.6 El tiempo transcurrido desde el momento que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
5.7 Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y a la temperatura
que se requiera, según el tipo de alimento de que se trate.
5.8 Seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 30 a 300 colonias, pues es en ellas donde
será menor el error en el recuento.
5.9 Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de hongos),
incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no
se pueden distinguir las colonias de pequeñas partículas de alimento.
6 INTERPRETACION DE RESULTADOS
6.1 Con el auxilio de la lente de aumento y de la cuadrícula del contador, contar todas las colonias de
las placas seleccionadas. Si el número se estima mayor de 300, y no se dispone de placas
preparadas con las diluciones subsecuentes, contar en la mitad o en un cuarto representativo de ella,
multiplicando por 2 o por 4 el número obtenido. El fondo de una caja Petri de 100 mm de diámetro
contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador.
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6.2 Multiplicar por la inversa de la dilución para obtener el número de colonias por mililitro o gramo de
la muestra.
6.3 Si ninguna de las placas tiene entre 30 y 300 colonias, utilizar la placa cuyo recuento se aproxime
más a esta cifra. Si la placa correspondiente a la primera dilución es la única que presenta colonias y
éstas son menos de 10, informar el número de colonias seguidas de la frase "en la dilución 1:10".
6.4 Debe apreciarse una razonable proporcionalidad en el número de colonias que aparezcan en las
placas de acuerdo con las diluciones utilizadas. En tanto no exista esta relación el personal del
laboratorio debe adquirir la destreza necesaria hasta conseguirlo antes de efectuar estudios que sean
válidos.
Al iniciarse en el trabajo de laboratorio es recomendable inocular las cajas correspondientes de cada

dilución por duplicado y computar las medias aritméticas.
6.5 Si todas las placas:1) no muestran colonias, 2) muestran excesiva difusión de las mismas, 3)
están contaminadas o no son satisfactorias por cualquier motivo, anotar respectivamente: 1) sin
colonias, 2) colonias difusas, 3) incluyendo por accidente de laboratorio.
6.6 Redondear la cifra obtenida en el recuento de manera que sólo aparezcan 2 dígitos significativos
al inicio de esa cifra: 128 se informa como 130; 2,417 como 2,400; 49 como 49, etc.
6.7 Informar: Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias en placas de Agar Triptona
Extracto de levadura incubadas X * horas a X*
* anotar las que correspondan a cada caso particular.
Recuerda elaborar el reporte

de la práctica.
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Nombre Determinación de Salmonella No. 1

Desarrollar ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
análisis a realizar. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir
las instrucciones impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.
Medios de preenriquecimiento
Agua de peptona tamponada, Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento, Caldo selenito-cistina,
Caldo tetrationato, Vassiliadis-Rappaport, Solución A, Solución B, Solución C, Caldo de soya
tripticasa, Leche descremada reconstituida, Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de
potasio
Medios de aislamiento
Agar verde brillante (VB), Agar con sulfito de bismuto, Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), Agar para
Salmonella y Shigella (SS), Agar entérico Hektoen.
Medios para pruebas bioquímicas

Agar de tres azúcares y hierro (TSI), Agar de hierro y lisina (LIA), Agar nutritivo Medio de SIM (para
Sulfuro, Indol y Movilidad), Agar citrato de Simmons, Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer),
Caldo manitol, Caldo malonato, Caldo urea, Caldo de urea rápido, Caldo infusión cerebro corazón
Soluciones
Solución verde brillante al 0,1% (1:1000), Solución de yodo-yoduro, Solución salina al 0,85%,
Solución salina formalizada, Reactivo de Kovac, Solución de alfa-naftol al 5%, Solución de rojo de
metilo, Solución de hidróxido de potasio al 40%, Solución de gelatinasa al 5%
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Antisueros
Antisuero polivalente somático (O), Antisuero polivalente flagelar (H), Antisuero Vi
Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella

Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de
1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción.
Se recomienda una muestra de 25 g o más.
Procedimiento general para la preparación de muestras

• Pesa asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para
trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher).
• Adiciona 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a
menos que se indique otro) y licúalo si es necesario durante un minuto.
• Transfiere asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con
tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada.
Mezclar bien y determinar el pH aproximado con el potenciómetro. Ajusta, si es necesario, a
un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezcla y cubre el
recipiente enroscando suavemente la tapa. Incuba durante 24 ± 2 h a 35ºC.
Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto Leche en polvo,

entera, semidescremada o descremada
• Sigue el procedimiento general para el pesado de la muestra y adiciónala lentamente a un
matraz Erlenmeyer con 225 mL de solución verde brillante al 0,1%, procurando que el polvo
quede en la superficie del líquido y se hidrate suavemente. Dejar la mezcla en reposo por 60
minutos e incúbala durante 24 horas +/-2 horas a 35°C
Aislamiento de Salmonella
• Cierra firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y
agita suavemente, transfiere respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10
mL de caldo tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en
sustitución del caldo tetrationato puedes emplear el medio Vassiliadis-Rappaport.
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•
• Incuba de 18 a 24 h a 35ºC o, para alimentos fuertemente contaminados a 42ºC por el mismo
periodo. Debes estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios
selectivos.
• Mezcla el tubo con caldo selenito cistina y estríalo en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD),
agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos
adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Realiza el mismo
procedimiento para el caldo tetrationato. Incuba las placas 24 ± 2 h a 35ºC.
• Examina las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo
con las siguientes características:
a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En
algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
b) Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.
c) Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos
las colonias pueden aparecer completamente negras.
d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras;
con o sin brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose
posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro.
Si las placas no muestran colonias típicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
e) Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las
colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
Identificación bioquímica
• Selecciona al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien
aisladas.
• Toca levemente el centro de cada colonia e inocula dos tubos, uno con agar triple azúcar
hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por
punción en el fondo. Incubar por 24 ± 2 h a 35ºC.
• Almacena en refrigeración de 5 a 8ºC las placas con medios selectivos por si es necesario
retomar más colonias.
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• Observa el crecimiento en los tubos y considera como presuntas positivas para Salmonella las
colonias que den las siguientes reacciones:
f) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa;
en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra
a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.
h) Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo
en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en
este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
• Debes retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en
los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas a continuación:
• Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA
típicos, debes trabajarlos como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio
LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o
sacarosa. Descarta solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos
medios.
• Continúa el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta
reacciones atípicas en este medio, toma colonias adicionales de las placas de donde se
obtuvo el cultivo atípico anterior y siembra las pruebas bioquímicas nuevamente.
• Continúa la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI.
Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias
procedentes de ambos medios de enriquecimiento.
Prueba de ureasa
Prueba de ureasa (convencional). Con un asa estéril, toma crecimiento del cultivo presumiblemente
positivo de cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea. Utiliza un control de medio para
comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar
24 ± 2 h a 35ºC.
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Prueba de ureasa (rápida). Toma dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de
cada tubo de medio TSI e inocula tubos de caldo urea (rápida). Incuba 2 h a 37 ± 0,5ºC en baño de
agua. Descarta todos los cultivos que den ureasa positiva. Deberás retener los cultivos que den la
prueba negativa (sin cambio de color del medio).
Identificación serológica
Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
• Coloca con asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos
secciones de una placa para aglutinación. Suspende en cada una de las gotas, una porción
del cultivo desarrollado en TSI.
• Agrega a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mézclalas con el
canto del asa o empleando aplicadores de madera.
• Agita inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un minuto.
• Observa bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.
• Considera cualquier grado de aglutinación como positiva.
• La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el
antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.
• Si observas aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con
las pruebas bioquímicas complementarias.
• Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los
más frecuentes).
• Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utiliza antisuero Vi y realiza la prueba. Si hay
aglutinación con Vi calienta el cultivo a ebullición y repite la aglutinación con el antisuero
polivalente O.
• Si se requiere, practica el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero
polivalente H).
Inocula el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a
35ºC hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya
tripticaseina e incubar por 24 ± 2 h a 35ºC (para ensayo al día siguiente). Adiciona 2,5 mL de solución
salina formalizada a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
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• Coloca 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Prepara un control de
solución salina mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno
formalizado. Incuba las mezclas en baño de agua a 48-50ºC. Observa a intervalos de 15 min
por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla
de prueba pero no en el control. Debes interpretar como negativa una prueba en la que
ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se
considera la prueba inespecífica.
Pruebas bioquímicas complementarias

• Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no
concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:
• Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de
la especie S. arizonae.
Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
Agar citrato Simmons

• Inocula por estría el tubo.
• Incuba durante 96 ± 2 h a 35 ± 2ºC.
• Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
• Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
Medio SIM
• Inocula por punción.
• Incuba durante 24 h a 35 ± 2ºC.
Movilidad.
• Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.
• Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.
• Producción de ácido sulfhídrico.
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• Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a
todo el medio.
• Prueba negativa: ausencia de color negro.
• Producción de Indol. Adiciona al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3
mL de reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

Prueba negativa: sin cambio de color.
Caldo RM-VP
• Inocula un tubo con el medio. Incuba durante 48 ± 2 h a 35 ± 2ºC para la prueba de VP y 96 h
para la prueba RM.
• Prueba de Voges-Proskauer (VP)
• Transfiere a un tubo un mL del cultivo de 48 h.
• Adiciona 0,6 mL de solución de alfa naftol.
• Adiciona 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%.
• Adiciona algunos cristales de creatinina (opcional).
• Interpreta los resultados después de incubar durante 2 h a 35 ± 2ºC o 4 h a temperatura
ambiente.
• Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
• Reincuba el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2ºC.
Prueba de rojo de metilo (RM)

• Adiciona al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de
metilo. Interpreta los resultados inmediatamente.
• Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
• Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
Caldo malonato
• Prueba positiva: desarrollo de color azul.
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Caldo manitol
• Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las
pruebas bioquímicas convencionales.
9. Etiqueta y rotula los tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos correctos
10. Verifica la temperatura de incubación
Informar: presencia o ausencia de Salmonella en __________ g o ____________ mL de muestra.

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Nombre Determinación de Staphylococcus aureus No. 1

Desarrollar ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
5. Prepara y esteriliza el medio de cultivo de acuerdo con los estándares de calidad
requeridos y el análisis a realizar.
6. Prepara la cantidad de los diferentes medios de cultivo de acuerdo a las indicaciones del
fabricante (Baird-Parker, solución de telurito, Emulsión de yema de huevo, Solución salina
isotónica, caldo de infusión cerebrocorazón, ácido desoxirribonucleico helicoidal de timo de
ternera, cloruro de calcio anhidro, solución de azul de toluidina, solución amortiguadora Tris
pH 9, plasma de conejo).
8. Realiza el procedimiento aplicando la técnica adecuada
• Utilizando diferentes pipetas de 1 mL para cada dilución, depositar 0,1 mL sobre la
superficie de las placas de agar Baird-Parker.
• Distribuye el inoculo sobre la superficie del agar con varillas estériles de vidrio en
ángulo recto, utilizando una para cada dilución.
• Debes mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido por el agar.
• Voltea las placas y colócalas en incubación durante 45 a 48 h a 35ºC.
• Selecciona las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas de Staphylococcus
aureus; si no es posible, selecciona las placas de las diluciones más altas no obstante
tengan más de 150 colonias.
• Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas también pueden ser utilizadas
y al informe debes agregar la nota de "valor estimado".
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• Las colonias típicas son negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de
1 a 2 mm y muestran una zona opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
• Selecciona las colonias de acuerdo con el cuadro del anexo 15 para realizar las
pruebas de coagulasa y termonucleasa:
• Seleccionar el número de colonias y siembralas cada una en tubos con 0.5 mL de
caldo de infusión cerebro-corazón.
• Incúbalas a 35ºC durante 24 h.
• Inocula en la misma forma cepas conocidas de Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis como testigos positivo y negativo.
• Después del periodo de incubación pasar con una pipeta de 1 mL, 0.3 mL de cada
cultivo a otro tubo de 10 mm x 75 mm y consérvalo para la prueba de termonucleasa.
El resto del cultivo usalo para la prueba de coagulasa.
Prueba de coagulasa
• Agrega a los 0.2 mL del cultivo anterior, 0.2 mL de plasma de conejo diluido volumen a
volumen con solución salina estéril.
• Incubalo en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si
no hay formación de coágulo, observa a las 24 h. Considera positiva la prueba si hay
formación de coágulo.
• Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo añade una gota de cloruro de
calcio al 5% a 0.5 mL de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en
10-15 seg.
Prueba de termonucleasa
• Calienta durante 15 minutos 0.3 mL de cultivo en caldo de infusión cerebrocorazón en
baño de agua hirviendo.
• Pasa una gota de cada cultivo por medio de una pipeta Pasteur a un orificio del medio,
incluye testigo.
• Incuba a 35ºC en cámara húmeda durante 4 a 24 h. La aparición de un halo color rosa
extendido de por lo menos 1 mm alrededor de la perforación se califica como positiva.
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9. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y
dilución con los datos correctos.

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Nombre Determinación de Listerya monocitogenes No. 1

Desarrollar

competencia
Instrucciones
para el Alumno

Recursos
apoyo
Limpieza Manera
Orden

Desarrollar
Lograrlas
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Página de
• Bata
• Cubre pelo
• Guantes
2. Lava y esteriliza los materiales de acuerdo con el análisis a realizar.
Reactivos
Acido acético 5 N, Acido clorhídrico 1 M, Acido sulfanílico (cristales), Alfanaftilamina,
Alfa-naftol 5% en etanol absoluto, Etanol absoluto, Granalla de zinc, Hidróxido de sodio 1 M,
Lactamato de glicil-glicina (anhídrido de glicina), Regulador de fosfatos glicerinado con pH 9,0 ± 0,2,
Sangre de carnero fisiológica 0,85% estéril, Sueros comerciales para tipificación de Listeria spp,
Sulfato de cadmio al 20%, Zinc pulverizado, Reactivos para Tinción de Gram, Alcohol-acetona, Cristal
violeta, Oxalato de amonio, Solución de Yodo, Solución de Safranina.
Reactivos para la determinación de nitritos

Reactivo A: Alfa-naftilamina 0,5 g, Acido acético 5N 100,0 mL
Reactivo B: Acido sulfanílico 1,0 g, Acido acético 5N 125,0 mL
Reactivo C: Alfa-naftol 1,0 g, Acido acético 5N 200,0 mL
Solución de sulfato de cadmio al 20%
Medios de cultivo
Caldo soya tripticaseína con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)
Caldo de enriquecimiento (EB) pH 7,3
Agregar en condiciones asépticas los suplementos al medio CSTEL previamente esterilizado, justo
antes de su uso.
Para la preparación de un litro del medio CSTEL se deben agregar las siguientes soluciones:
acriflavina, ácido nalidíxico y solución de cicloheximida.
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Precaución: ¡La cicloheximida es una sustancia química altamente tóxica, durante su manejo deben
emplearse guantes, lentes de protección y lavarse las manos inmediatamente después de usarla!
Medio de cloruro de litio feniletanol -moxolactam (LMP)
Medio Oxford
Agar soya tripticaseína con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL)
Agar sangre de carnero
Caldo nitratos
Medios para la prueba de movilidad: Medio de SIM, Medio MTM.
Caldo púrpura para fermentación de carbohidratos

9. Realiza el vertido en placa de cultivo de acuerdo a la técnica descrita
10. Etiqueta y rotula las cajas petri y/o tubos de cultivo de acuerdo al medio y dilución con los datos
correctos.
Te sugiero que leas
el anexo 2.
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Página de
• Olvidar rotular


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Nombre Visita a una planta procesadora de lácteos No. 1

1.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A LA LECHE PROCESADA DE ACUERDO
A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA
Competencia a
Desarrollar 2.-REALIZA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS A DERIVADOS DE LA LECHE, DE
ACUERDO A LAS NORMAS VIGENTES EN LA MATERIA.

competencia
Realiza una visita a una planta procesadora de lácteos. Atendiendo las

Instrucciones
indicaciones de tu maestro, identifica los procedimientos que se realizan en el
para el Alumno
laboratorio de control de calidad. Entrega un reporte de la visita.
Instrucciones
para el Realizar el procedimiento administrativo para la realización de la visita.
Docente
Recursos
materiales de Hojas para elaborar el reporte por equipo.
apoyo
Orden, Limpieza, Manera La realización de la práctica debe

Actitudes a Responsabilidad Didáctica desarrollarse observando los equipos, la
formar de indumentaria y las pruebas que se realizan
Lograrlas en el laboratorio de control de calidad.
Competencias Escucha, interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante

Genéricas a la utilización de medios, códigos y herramientas apropiados.
Desarrollar
Manera Aplica distintas estrategias comunicativas según quienes sean sus interlocutores,
Didáctica de el contexto en el que se encuentra y los objetivos que persigue.
Lograrlas
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La Revolución industrial originó un aumento masivo de las poblaciones, con el consiguiente aumento
de la demanda de recursos, esto conlleva que se tengan que extremar las precauciones, para evitar
microorganismos perjudiciales en el agua y alimentos y también es necesaria una mejora en la
conservación de los alimentos.
Desde antiguo se sabe que los alimentos son un excelente transmisor de enfermedades infecciosas.
Incluso hoy en día, a pesar de que existe mayor información acerca de los microorganismos y su
transmisión, aún así, la transmisión de microorganismos por alimentos representa un problema que
atender. El aumento de nuevos patógenos transmitidos por alimentos atrae a los medios de
comunicación sobre la seguridad de los alimentos, haciendo que los consumidores seamos más
conscientes de dichas transmisiones y así exigimos alimentos cada vez más seguros. Por otra parte,
el desarrollo microbiano destruye grandes cantidades de alimentos, causando problemas económicos
y una considerable pérdida de importantes nutrientes.
La pérdida de calidad de un producto, por tanto, puede ser debida a la presencia de microorganismos
patógenos o de microorganismos que alteran el producto de tal manera que lo hagan inadecuado
para el consumo. De ahí surge la necesidad de que todas las industrias conozcan la calidad
microbiológica de sus productos, a nivel de las materias primas que usan, que conozcan la calidad de
todos los procesos de elaboración y por supuesto la calidad del producto final.
Para alcanzar la calidad microbiológica es necesario aplicar pasos ordenados a través de la cadena
de producción. A lo largo de esta cadena pueden presentarse fallas que llevan a obtener un producto
con características distintas a las deseadas por el consumidor y la empresa. Por esta razón, la
garantía de esta calidad se basa en el control de la presencia y multiplicación de los microorganismos
en el nicho ecológico peculiar constituido por el sustrato que proporciona el producto y por el tipo de
ambiente en que se conserva o mantiene. Los problemas microbiológicos suelen presentarse cuando
no se alcanza el efecto deseado por el procesado o por los sistemas de conservación y esto suele ser
consecuencia de errores en la manipulación o procesado. La detección de dichos errores, su rápida
corrección y prevención en el futuro, son el principal objetivo de cualquier sistema de control
microbiológico.
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Muy bien, terminamos el submódulo 3, “Efectúa análisis microbiológicos a leche y productos lácteos”.
Para esto, fue necesario que realizaras las actividades propuestas en la Guía de aprendizaje además
de la guía de tu maestro. Fue muy importante el interés que pusiste para investigar, realizar trabajo
en equipo, y seguir las indicaciones de las prácticas en el laboratorio.

Como te habrás dado cuenta, hay aspectos que no se deben pasar por alto: el uso de la indumentaria
adecuada, la manipulación segura de los microorganismos y la elaboración de los resultados. Por lo
que es indispensable que tomes en cuenta siempre las recomendaciones de los anexos 2 y 3, que te
serán de utilidad durante todos los módulos de la carrera, demostrando en todo momento una actitud
de respecto, orden y limpieza en tus actividades.

Has realizado diferentes actividades como ejemplos, ejercicios y prácticas en donde adquiriste
conocimientos, habilidades y destrezas con los que puedes demostrar que has desarrollado las
competencias de este submódulo.
Todo lo que acabas de adquirir te facilitará la entrada en el sector laboral y/o el autoempleo, así que
no dejes escapar las oportunidades que se te presenten.
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• Guía práctica. Departamento de Producción e Industria Animal. La Universidad del Zulia. Maracaibo,
Noviembre 2003.
• Manual de Prácticas del Laboratorio de Microbiología General. Universidad Autónoma Metropolitana.
Unidad Iztapalapa. María de los Ángeles Aquiahuatl Ramos. María de Lourdes Pérez Chabela. Edición
2004.
• Microbiología de los Alimentos. Manual de Laboratorio. Juan Antonio Pereda. Gonzalo D. Librería
Norma, 2006.
• Guía Práctica para el análisis microbiológico de la leche y los productos lácteos. Editorial Acribia,
Zaragoza.
• Higiene de los alimentos, microbiología y HACCP. S.J. Forsythe y PY Hayes. Segunda Edición.
• Migración de sustancias químicas. Desde el envase al alimentos. Volúmenes I y II. D.H. Watson, M.N.
Meaj. Editorial Acribia, S.A.
• Principios de la Tecnología de lácteos. James N. Warner. AGT Editor, S.A.
• Biotecnología: Curso de prácticas de laboratorio. Jurek M. Becjer, Guy A. Caldwell. Editorial Acribia.
Normas Mexicanas y Normas Oficiales Mexicanas.
• NMX-F-255-1978-Método de conteo de hongos y levaduras en alimentos
• NMX-F-308-1992-Cuenta de organismos coliformes fecales
• NMX-F-253-1977-Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias.
• NOM-115-SSA1-1994-Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.
• NOM-143-SSA1-1995-Método de prueba microbiológico para alimentos.
• Determinación de Listeria monocytogenes.
• NMX-F-304-1977*-Método general de investigación de Salmonella en alimentos.
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Cepa: En microbiología, conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo patrimonio
genético.
Colimetría. Técnica de análisis microbiológico.
FUNGI. Este reino incluye a los hongos (fungus, hongo), seres eucarióticos y heterótrofos
absorbedores. Para alimentarse, secretan enzimas digestivas a sus alrededores; posteriormente el
hongo absorbe los productos y los asimila.
GELIFICANTE. Se les llaman también gomas hidrosolubles o hidrocoloides, son básicamente

macromoléculas que se disuelven fácilmente en el agua y el resultado es un gran aumento de la
viscosidad, estos digamos “polvos”, son los encargados de facilitar la emulsión en determinados
alimentos.
INÓCULO. Cepa.
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ANEXO 1. EJEMPLO DE GUÍA DE OBSERVACIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE DESEMPEÑOS
GUIA DE OBSERVACION: TAT-09/M2S3/ED1-1
Nombre del alumno: Campos de aplicación
Carrera: Técnico en Análisis y Tecnología de los Industria procesadora de

Alimentos leche.
Modulo II: Procesa alimentos a base de leche.

Submódulo III: Efectúa análisis microbiológicos a leche y
productos lácteos.
Evidencia por desempeño:
Evidencia de actitud asociada:
Instrucciones para el alumno:
CRITERIOS CUMPLIO
SI NO OBSERVACIONES
Observaciones
generales
Evaluó (Nombre y Firma) Lugar y fecha de la aplicación
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ANEXO 2. MANIPULACIÓN SEGURA DE MICROORGANISMOS
En muchas de las determinaciones biológicas conllevan el empleo de microorganismos vivos.

Independientemente del lugar donde se empleen estos microorganismos, es esencial que los
trabajadores de laboratorio se adhieran rígidamente a un código de prácticas microbiológico para
reducir en lo posible las infecciones de origen laboratorial.
El modo seguro de aproximación al trabajo con microorganismos vivos es hacer las siguientes
presunciones:
1. Todo microorganismo utilizado en el laboratorio es potencialmente peligroso.
2. Todo fluido del cultivo contiene organismos potencialmente patógenos.
3. Todo fluido del cultivo contiene sustancias potencialmente tóxicas.
El código de práctica del laboratorio microbiológico se basa en el deseo de que ningún

microorganismo experimental o fluido procedente de su cultivo ha de entrar en contacto con la piel, la
nariz, los ojos o la boca. hay que señalar que un porcentaje importante de las infecciones adquiridas
en el laboratorio se deben a la inhalación de aerosoles infecciosos liberados durante el trabajo en el
laboratorio. a continuación ofrecemos una lista de instrucciones que constituyen la base del código
de prácticas de un laboratorio microbiológico.
1. En todo momento has de llevar una bata de laboratorio que te cubra desde el tronco hasta el
cuello.
2. Está prohibido comer, beber o fumar en todo el laboratorio.
3. No deben existir etiquetas enmohecidas.
4. Debes evitar tocarte la cara o los ojos.
5. No debes mascar chiche ni morder lápices o bolígrafos.
6. El banco de trabajo has de mantenerlo limpio, ordenado, despejado y libre de objetos no

esenciales como libros o bolsos.
7. No deberás sacar del laboratorio ningún material sin el permiso expreso del supervisor del
laboratorio o del responsable de seguridad.
8. Todas las manipulaciones, como por ejemplo pipetear o utilizar el asa de siembra, deberías
realizarlas de modo que evites la producción de aerosoles de material contaminado.
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9. Debes emplear pipetas automáticas o pipetas con filtro, no pipetear con la boca.
10. Todas las manipulaciones debes realizarlas de una manera aséptica, utilizando pipetas
estériles con filtro, y las pipetas contaminadas deberías esterilizarlas inmediatamente
sumergíendolas totalmente en un desinfectante adecuado.
11. Debes colocar el material de vidrio contaminado y las placas de petri descartadas en
recipientes cerrados para su tratamiento.
12. Los portaobjetos usados debes colocarlos en recipientes que contengan desinfectante.
13. Debes saber que ciertos procedimientos o equipos (por ejemplo la agitación de fluidos en
matraces) producen aerosoles de materiales contaminados. siempre que sea posible debes
colocar tapas sobre los recipientes contaminados.
14. Debes comunicar cualquier accidente, incluido los cortes más mínimos, las rozaduras, los
derrames de cultivos o reactivos, al supervisor del laboratorio o al responsable de seguridad.
15. Al acabar la jornada, limpia tu banco de trabajo con su desinfectante adecuado.
16. Siempre que dejes el laboratorio, lávate las manos con un jabón germicida y sécalas con una
toalla de papel desechable. las batas de laboratorio deben guardarse o mandarse a lavar.
bajo ninguna circunstancia entres en una oficina o una zxona de descanso llevando una bata
de laboratorio potencialmente contaminada.
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ANEXO 3. REPORTE DE RESULTADOS.
LOS DIEZ MANDAMIENTOS DE LA CONSERVACION DE LOS RESULTADOS*
1. Cíñete a los hechos. No divagues ni editorialices.

2. Emplea un cuaderno de laboratorio de lomo pegado para impedir que se puedan arrancar o
poner hojas.
3. Haz dos copias de todos los apuntes, uno de ellos debería conservarse en un lugar separado
y seguro.
4. Incluye los datos e informaciones directamente en el cuaderno de laboratorio tan pronto como
sean generados. Puedes firmar y fechar cada página del cuaderno (la firma es un
procedimiento requerido en cuadernos de investigación industrial). No confíes en la memoria
ni escribas en hojas sueltas con la intención de pasarlas más tarde al cuaderno.
5. Utiliza tinta permanente, preferentemente negra, que se reproducirá satisfactoriamente en la
fotocopiadora.
6. Identifica cualquier equivocación o error, y explícalos.
7. Pega los registros en el cuaderno o consérvalos, tras identificarlos y clasificarlos
correctamente, de modo que se puedan recuperar rápidamente.
8. Utiliza términos aceptados universalmente; si es posible evita las abreviaturas, los nombres
codificados o los códigos de números.
9. Mantén el cuaderno de laboratorio limpio; evita las manchas y los vertidos.
10. Elabora una tabla de contenidos y un índice del cuaderno de laboratorio tan pronto como esté
lleno.
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Analisis y Tecnologia de Los Alimentos m2 s3

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Módulo II Procesa Alimentos a Base de Leche

Submódulo III Efectúa Análisis Microbiológicos a Leche y Productos Lácteos

1.-Realiza análisis microbiológicos a la 2.-Realiza análisis microbiológicos a

Atributos de la Competencia Atributos de la Competencia

• Realiza el conteo de hongos y • Realiza el conteo de hongos y levaduras.

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¿Puedo vivir aquí?

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Conteo de coliformes totales y fecales

Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias

Determinación de Staphylococcus aureus

Determinación de Listeria monocytogenes

En los métodos de procesamiento de alimentos a base de leche es importante el control de calidad

Para apoyarte en tu aprendizaje visitarás empresas procesadoras de lácteos donde acudirás al

Instrucciones Revisa en el internet el contenido de las siguientes normas e identifica los

En el módulo 1, submódulo III, realizaste prácticas para la determinación de microorganismo,

Tipo de Norma Oficial Mexicana o Nombre de la norma.

Hongos y levaduras NMX-F-255-1978 Método de conteo de hongos y levaduras

Coliformes NMX-F-308-1992 Cuenta de organismos coliformes fecales

Mesofílicos aerobios NMX-F-253-1977 Cuenta de bacterias mesofílicas aerobias.

Staphylococcus NOM-115-SSA1-1994 Método para la determinación de

Listeria NOM-143-SSA1-1995 Método de prueba microbiológico para

*Esta última aparece en la Declaratoria de cancelación de normas mexicanas, publicada por la

Nombre ¿Puedo vivir aquí? No. 1

Clasificación de medios de cultivo Características del medio Tipo de

Líquidos Estimular y promover la

Métodos para cultivar Son medios de cultivo para

Métodos para medir la

Medios para filtración a

Microorganismo Método de Tiempo de Tipo de siembra Método de

Manera Analizar el contenido de la Norma Oficial

Competencia • Toma decisiones a partir de la valoración de las consecuencias de

Manera Análisis de la Norma Oficial Mexicana NOM-F-285-1977. Muestreo y transporte

La toma de muestras es el acto de separar de una partida determinada, una muestra

1. La peligrosidad del microorganismo.

2. La cantidad de microorganismos presentes en el alimento.

3. Las condiciones que será sometido el alimento antes de consumir.

4. La población que va a consumir ese alimento.

Apartado de la NOM-F-285-1977 Recomendaciones

Muestra de alimentos envasados

Muestra de alimentos a granel o de

recipientes o piezas grandes

Muestras de alimentos perecederos

Clasificación de los Manera

Bacterias Termodúricas, Termófilas y Psicrófilas.

La temperatura de la leche durante su transporte y almacenamiento es uno de los factores más

Cuando la leche se mantiene a temperatura normal, sin refrigeración, generalmente experimenta

Si la leche cruda se conserva a temperaturas de refrigeración, la velocidad de acidificación se reduce

1. Bacterias termodúricas en la leche.

Las bacteroas termoduricas son microorganismos termoresistentes, generalmente mesofílicos en su

2. Bacterias termofílicas en leche.

3. Bacterias psicrofílicas en la leche.

Informar: presencia o ausencia de Salmonella en g o __ ml de muestra.