ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL

Dr. José Alfredo Cruz Monzón

ingquimico33@hotmail.com

Introducción a la Cromatografía Liquida

de Alta Eficiencia ( HPLC )
Solventes en HPLC
Su uso correcto es de suma importancia pues sus propiedades deben mantenerse en límites estrechos de
aceptabilidad.
Asimismo, dichas propiedades influyen en la elección del solvente y en la preparación de la muestra.

Características:
• Pureza
• Viscosidad
• Índice de refracción
• Punto de ebullición
• Toxicidad
• Transparencia UV/UV-Cutoff
• Solubilidad
La elección final del solvente más adecuado se basará en los siguientes principios básicos:
a. Compatibilidad con el detector b. Polaridad y Selectividad c. Seguridad

Algunas propiedades
que caracterizan a los
solventes a utilizar
como fase móvil
Compatibilidad de la Fase Móvil con la detección

1. Detección UV
A la λ seleccionada para la muestra, se
recomienda:

Abs (Fase móvil) < 0,2 AU.

A menores absorbancias se mejora la

precisión y la elución por gradiente.

Absorbancias mayores, pueden ser

aceptables en algunas separaciones
isocráticas.

La desgasificación ayuda a reducir la Abs

en un 30% (entre 200 y 240 nm), por el
menor contenido de O2 disuelto y será
mas notable en solventes más polares
como el THF o el IPA.
Tabla 1. Absorbancia UV en función de la longitud de onda para diversos
solventes y tampones usados en RPC
El agua no absorbe a 200 nm o por encima.

La absorbancia de las fases móviles con

agua será la misma que la del solvente puro
multiplicada por la fracción de volumen (f)
del solvente B.

Por ejemplo a 220 nm fases móviles con un

25% de los solventes listados de la Tabla 2
tendrán absorbancias de: Acetonitrilo 0.00
AU, Metanol 0.06 AU, THF 0.17 AU, IPA 0.05
AU.

Tabla 2. Propiedades de diversos solventes utilizados para HPLC

2. Detección por Índice de Refracción

En condiciones isocraticas:
- Selección de eluyentes no resulta
crítica.
- La sensibilidad se puede incrementar
con fases móviles cuyo Índice de
Refracción (IR) sea lo más diferente
posible que el de los componentes de
la mezcla

Los detectores de IR no pueden

utilizarse en condiciones de gradiente
por la gran diferencia de respuesta
que pueden tener el solvente A y B.

Tabla 2. Propiedades de diversos solventes utilizados para HPLC

3. Polaridad y Selectividad
Las propiedades de los solventes,
afectan la fuerza, selectividad y
solubilidad.

La “Selectividad Normalizada”
incluye tres contribuciones a la
interacción soluto - solvente:

1. La Acidez del P.H

2. La Basicidad del P.H.
3. La Dipolaridad.

Tabla 3. Polaridad y selectividad de solventes utilizados en HPLC

 Tabla Transparencia de solventes en zona UV ( UV Cutoff)

Cada solvente tiene una longitud

de onda de corte de absorbancia
UV-vis.
Corte del solvente (UV cut off):
longitud de onda en donde el
solvente absorbe toda la luz.

Para elegir un solvente,

considerar su punto de corte de
absorbancia para que no
coincida con el del analito en
investigación

Si están cerca: elegir un solvente

El UV Cut off es la longitud de onda en la cual la absorbancia es igual diferente, porque es difícil
a 1, medido en una celda de 1 cm usando aire como referencia determinar si la absorbancia
proviene de su analito o
solvente.
Consideraciones en la preparación de Fase móvil

1. Medir utilizando adecuadamente el material volumétrico para cada

solvente.
2. De ser necesaria la mezcla de solventes, es preferible no aforar, sino
mezclar directamente los volúmenes.
3. Si se requiere adicionar buffer y aditivos, pero no olvidar lavar la
columna, dejándola libre de sales.
4. Filtrar la fase móvil, con filtro de membrana de 0,45 µm para
retener material biológico
5. Desgasificar la fase móvil.
 Filtros para muestras
1. Nylon : Son de naturaleza hidrofobica, permite trabaja con
muestras en fase acuosa o solvente orgánico. Son autoclavables a
121°C en un rango de pH entre 3 y 13. No trabaja con acidos
concentrados
2. Politetrafluoroetileno (PTFE): es membrana hidrofobica altamente
resistente a solventes, acidos y bases. Generalmente se usa en
muestras no acuosas. Rango de pH entre 1 – 14
3. Acetato de celulosa: Buen filtro para muestras biológicas acuosas
con retención baja de proteínas. Rango de pH entre 4 – 8.
4. Polifluoruro de vinilideno (PVDF): Material altamente resistente a
solventes. De baja retención de proteínas.
Rango de pH entre 2 – 12
5. Membrana Ultrafiltro: Permite filtrar muestras biológicas
6. Nitrocelulosa: material de lata retención de proteínas
7. Extracción en fase solida: Son cartuchos para pre cromatografía
Preparación de muestra

Disolver la muestra en la fase móvil o en un solvente mas débil que la fase móvil
El volumen de inyección de muestra debe ser el menor posible.
Normalmente se requieren volúmenes de 5 uL, pero depende del tipo de pico obtenido para decidir si se
toma un volumen mayor o menor
Manejo y Almacenamiento de Columna cromatogràfica

• No someter la columna a stress físico.

• Cerrar ambos extremos para que no se elimine o evapore el solvente
• Evitar almacenarla conteniendo fase acuosa, es preferible en solvente organico
• Si se usan buffer, lavarla completamente pasando agua ultrapura, antes de almacenarla
• Fíjese bien cómo la coloca, ya que tiene una dirección establecido del sentido que circula la fase
móvil.
• Preferible almacenarla a 4°C para evitar evaporaciones del solvente.
¿Qué se requiere para trabajar con la columnas cromatogràficas?

1. Conectores adecuados, para

evitar fugas

2. Herramientas adecuadas

3. Guarda columnas para la protección

Cambio de columnas cromatograficas en sistema HPLC
Es una operación muy común, de acuerdo al analito a determinar. Es adecuado considerar:
1. Abrir la cubierta del calentador, donde se encuentra la columna cromatogràfica
2. Detener lentamente el caudal de fase móvil para evitar perturbación de la línea base.
3. Desenroscar (usando una pequeña llave) ambas férulas (conectores), de la columna.
4. Con sumo cuidado, retirar ambos extremos.
5. Colocar los tapones de cierre a la columna para evitar evaporaciones del liquido en su interior.
6. Ubicar el capilar desenroscado en un vaso vaso.
7. Abril la llave de purga y circular la nueva fase móvil a utilizar.
8. Cerrar la purga y esperar que el liquido emerja por el capilar al vaso.
9. Detener la fase móvil y conectar la nueva columna a utilizar.
10.Dejar circular la nueva fase móvil a incrementos de 0,20 mL/min.
11.Alcanzada el caudal requerido, verificar todo el sistema, sobre todo
fugas de fase móvil por columna y presión alcanzada.
12.Seguir con el procedimiento planificado de análisis
Como equilibrar la columna cromatogràfica

Equilibrar con la fase móvil

No someter a alta presión a la columna
Equilibrar las columnas para fase reversa con 5 a 10 volúmenes
Asegurar que los resultados son reproducibles
Documentar la columna cromatografica
Las columnas nueva deberá ser entregadas con su respectivo certificado de eficiencia
Cada uso adicional se debe documentar, incluyendo información como:
- Presión
- Fase móvil utilizada
- Temperatura
- Tipo de muestra
- Condiciones de almacenamiento (solvente residual)

De acuerdo al historial registrado se puede

comprobar el funcionamiento y
comportamiento ante una mezcla de solventes
o muestras
 Cuidados de la columna cromatogràfica
• Luego de cada uso, lavar la columna con el solvente adecuado, considerando de que si se usan sales
deben quedar libres del mismo usando agua ultrapura.
• Nunca guardar la columna con el 100% de agua por cuanto pueden desarrollar microorganismos y con
ello dañar la columna.

• Si no se va a utilizar, no abrir la columna innecesariamente.

• Nunca forzar la columna con volúmenes muy altos: puede
desplazar el relleno empacado.
• Las columnas de silica o con fasses ligadas nunca deben ser
sometidas a altas temperaturas
• Revise el pH de trabajo de la columna, para utilizar una
fase móvil apropiada
Comprobación – verificación del Sistema Cromatogràfico
Antes de iniciar el trabajo en el instrumento es recomendable comprobar el sistema completo, utilizando
una muestra y un método normalizado.

Recomendable realizar lecturas de analito pre-establecido ( al menos 03 replicas), usando un solución

patrón comercial, el será el cromatograma inicial y con el cual cada cierto tiempo se verifica la precisión y
repetibilidad del mismo analito en el tiempo

Para la verificación del sistema completo, considere:

- El sistema debe ser purgado de la fase móvil anterior y luego primado con la fase móvil a utilizar.
- La columna debe ser estabilizada con la fase móvil hasta señal constante del detector
- Verificar que la columna no presente fugas por un mal acople de conectores.
- Verificar las condiciones del análisis como son volumen de inyección, caudal de fase móvil,
temperatura del calentador, etc
Inyecciòn de muestra de prueba

• Definido el analito a utilizar (normalmente para efectos de prueba se usa patrón de cafeína), realizar al
menos 03 inyecciones a las condiciones establecidas del método normalizado.
• Comprobar constancia de los principales parámetros utilizando herramientas estadisticas.
• Con los cromatogramas obtenidos realizar la pruebas de adecuabilidad del sistema cromatogràfico.
Gracias